技術 アスタチン溶液及びその製造方法

0001

本発明は、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度で含む溶液及びその製造方法に関する。

0002

甲状腺がん、甲状腺機能亢進症（バセドウ氏病等）等の甲状腺疾患の治療としてヨウ化ナトリウム（Ｎａ１３１Ｉ）を用いたラジオアイソトープ（ＲＩ）内用療法が汎用されている。甲状腺はナトリウム・ヨウ素共輸送体（ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ（以下、ＮＩＳと略称する））を介してヨウ化物イオンを取り込むので、Ｎａ１３１Ｉを投与するとヨウ化物イオン（１３１Ｉ−）は甲状腺及び甲状腺がんに特異的に集積し、放出するβ線で患部を体内から照射して治療することができる。しかしながら、Ｎａ１３１Ｉを用いた内用療法では、患者には入院が必要であり、放射線管理のための特殊な病室に隔離され、再発に伴う複数回投与や薬剤耐性の出現に伴う治療中止が課題になっている。これらの問題は１３１Ｉが放出するβ線の細胞殺傷能力が十分でないことが要因のひとつであると考えられる。
一方、アスタチン−２１１（２１１Ａｔ）は、β線より高い細胞殺傷能力があるα線を放出するＲＩであり、２１１Ａｔ標識化合物またはアスタチン化物イオン（２１１Ａｔ−）を用いたＲＩ内用療法の開発が期待されている。

0003

特許文献１は、ハロゲン化合物を含む組成物を開示し、ハロゲン化合物のうち１つとしてアスタチンを挙げている。しかし、アスタチン溶液やその製造方法は具体的に開示していない。
非特許文献１は、ラットにおいて２１１Ａｔ投与後の生体内分布及び線量を測定した実験結果を開示している。２１１Ａｔは、２０９Ｂｉ（α，２ｎ）２１１Ａｔ反応で製造したことを記載しているが、製造工程で還元剤を添加することは記載していない。
非特許文献２は、ヨウ化ナトリウム共輸送体を発現しているグリオーマ細胞に対するアスタチン化物のインビトロ細胞毒性を測定した実験結果を開示している。２１１Ａｔは、２０９Ｂｉ（α，２ｎ）２１１Ａｔ反応で製造し、単離した後、Ｎａ２ＳＯ３を添加したことを記載している。しかし、該文献では、還元剤の添加による放射化学的純度に対する効果は検討されていない。
非特許文献３は、胃がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、大腸がん、卵巣がん等で、ＮＩＳの発現が認められることを記載している。

0004

特表２０１７−５０７９２９号公報

0005

Spetz J, et al., Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, Volume 28, Number 9, 2013, 657-664
Carlin S, et al., The Journal of Nuclear Medicine, Vol. 44, No. 11, November 2003, 1827-1838
Atsushi Shiozaki, et al., Functional analysis and clinical significance of sodium iodide symporter expression in gastric cancer, Gastric Cancer, https://doi.org/10.1007/s10120-018-0874-2, published online: 06 September 2018

0006

本発明は、甲状腺疾患等の治療のためのＲＩ内用療法等に用いることができるアスタチン溶液およびその製造方法の提供を課題とする。

0007

２１１Ａｔは、一般に、核反応により製造することができる。例えば、サイクロトロン等の加速器で加速したヘリウムをターゲット物質であるビスマス−２０９（２０９Ｂｉ）に照射し、２０９Ｂｉ（α，２ｎ）２１１Ａｔの核反応により、ターゲット物質中に２１１Ａｔを製造し、２１１Ａｔをターゲット物質から分離するために加熱蒸散させて水等の溶剤に溶解し、２１１Ａｔ溶液として得る製造方法が知られている。
ところが、本発明者らが、鋭意研究を重ねたところ、上記のような従来の方法で製造した２１１Ａｔ溶液は、放射化学的純度が低く（後述の試験例１参照）、かかる放射化学的純度が低い２１１Ａｔ溶液は、ラットを用いたインビボの実験において甲状腺への放射能集積が弱い（後述の試験例７参照）という新知見を得た。
本発明者らは、該知見に基づきさらに検討したところ、２１１Ａｔ溶液に、還元剤を添加することで、高い放射化学的純度の２１１Ａｔ溶液を製造できること、さらに、該方法で製造した高い放射化学的純度の２１１Ａｔ溶液は、従来の方法で製造したものに比較して、投与後の甲状腺への放射能集積が増強することを見出して、本発明を完成させた。

0008

すなわち、本発明は、下記を提供する。
［１］核反応によって得られた２１１Ａｔを原料として、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を含む溶液を製造する方法であって、
２１１Ａｔに由来する不純物を含む溶液に、還元剤を添加する工程を含む、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度で含む溶液の製造方法。
［２］還元剤が、生理的に許容される還元剤である、上記［１］記載の方法。
［２−１］還元剤が、有機還元剤または無機還元剤である、上記［２］記載の方法。
［２−２］無機還元剤が、硫酸鉄（ＩＩ）である、上記［２−１］記載の方法。
［３］還元剤が、生理的に許容される有機還元剤である、上記［１］記載の方法。
［４］還元剤が、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩、システイン、グルタチオンおよび硫酸鉄（ＩＩ）からなる群から選択される還元剤である、上記［１］記載の方法。
［５］還元剤が、アスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウムである、上記［１］記載の方法。
［６］さらに、ｐＨ調節剤または緩衝液を添加して中性または弱アルカリ性に調節する工程を含む、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を、３０％以上の放射化学的純度で含む溶液。
［８］上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法により製造された、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度で含む溶液。

0009

本発明の製造方法によれば、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度で含む溶液を製造することができる。
本発明の製造方法により製造される２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度で含む溶液は、甲状腺疾患の治療のためのＲＩ内用療法等に有用である。
本発明の製造方法により製造される２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度で含む溶液は、胃がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、大腸がん、卵巣がん等で、ＮＩＳの発現が認められるものの治療のためのＲＩ内用療法等に有用である。

0010

図１は、試験例１の結果を示す。
図２は、試験例２の結果を示す。
図３は、試験例３の結果を示す。
図４は、試験例４の結果を示す。
図５は、試験例５の結果を示す。
図６は、試験例６の結果を示す。
図７は、試験例８の結果を示す。
図８は、試験例９の結果を示す。
図９は、試験例１０の結果を示す。
図１０は、試験例１１の結果を示す。
図１１は、試験例１２の結果を示す。

0011

以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度で含む溶液の製造方法に関する。
本発明の方法は、２１１Ａｔに由来する不純物を含む溶液（例えば、水溶液、アルコール溶液（例えば、エタノール溶液）、アルコール水溶液（例えば、エタノール水溶液））（以下、２１１Ａｔ原液という。）に、還元剤を添加する工程を含むことを特徴とする。
本明細書において、２１１Ａｔに由来する不純物とは、目的化合物である２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）以外の、２１１Ａｔに由来する化合物をいう。２１１Ａｔに由来する不純物としては、例えば、アスタチンの酸化物（Ａｔ＋、ＡｔＯ−、ＡｔＯ２−、Ａｔ（ＯＨ）、Ａｔ（ＯＨ）２−）が挙げられる。
本発明において、２１１Ａｔ原液に含まれる２１１Ａｔに由来する不純物の含有量は特に限定されず、溶液全体の放射能に対する２１１Ａｔに由来する不純物の放射能が０％を超えて１００％までのものを、本発明の２１１Ａｔ原液として用いることができる。
従来の方法（例えば、後述の参考例１記載の方法）で得られた２１１Ａｔ溶液（例えば、２１１Ａｔ水溶液）は、２１１Ａｔに由来する不純物を多く含んでおり、本発明の方法において２１１Ａｔ原液として用いることができる。
２１１Ａｔに由来する不純物は、例えば、後述の試験例１に記載の薄層クロマトグラフ法、またはこれに準じた方法により確認することができる。

0012

本発明の方法において用いる還元剤としては、生理的に許容される還元剤が好ましい。本発明において、生理的に許容されるとは、生理的に低毒性または無毒性であることをいう。
本発明の方法において用いる生理的に許容される還元剤としては、例えば、有機還元剤（例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩（例えば、アスコルビン酸とアルカリ金属またはアルカリ土類金属との塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム））、システイン、グルタチオン、ゲンチジン酸、グルコース等）、無機還元剤（例えば、硫酸鉄（ＩＩ））が挙げられ、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩（例えば、アスコルビン酸とアルカリ金属またはアルカリ土類金属との塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム））、システイン、グルタチオンが好ましく、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩（例えば、アスコルビン酸とアルカリ金属またはアルカリ土類金属との塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム））がより好ましく、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウムが特に好ましい。

0013

本発明の方法において、還元剤の使用量は、２１１Ａｔに由来する不純物を含む溶液（すなわち、２１１Ａｔ原液）に対して、最終濃度が通常０．１〜３０重量％（ｗ／ｖ％）、好ましくは０．２〜１０重量％、より好ましくは０．５〜５重量％になる量である。
本発明の方法において、還元剤の使用量は、２１１Ａｔに由来する不純物を含む溶液（すなわち、２１１Ａｔ原液）の２１１Ａｔ放射能１ＭＢｑに対して、通常０．１〜１００μｍｏｌ、好ましくは０．２〜５０μｍｏｌ、より好ましくは１〜１２μｍｏｌである。
本発明の方法においては、還元剤を添加し、混合することで、目的の２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度（例えば３０％以上）で含む溶液（例えば、水溶液、アルコール溶液（例えば、エタノール溶液）、アルコール水溶液（例えば、エタノール水溶液））を得ることができる。還元剤は予め溶剤（例えば、水）に溶解して、還元剤溶液（例えば、水溶液）として添加してもよい。混合は公知の方法で行うことができる。溶液に窒素またはアルゴン等の不活性ガスを通気し、空気や酸素との接触を遮断して混合すると還元剤の効力がより高く発揮される。
還元剤の添加、混合は、室温下で行われ、具体的には０〜４０℃、好ましくは１５〜３０℃で行われる。混合時間は、例えば、５分〜２時間、特に、１０〜３０分間である。
目的の２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）の生成は、薄層クロマトグラフ法で確認できる。

0014

本発明の方法において、さらに、ｐＨ調節剤または緩衝液を添加して中性または弱アルカリ性に調節する工程を含むことが好ましい。中性または弱アルカリ性に調節することでアスタチンの揮発、蒸散、酸化物の生成を防止することができる。該工程は公知の方法で行うことができる。ｐＨ調節剤は予め溶剤（例えば、水）に溶解して、ｐＨ調節剤溶液（例えば、水溶液）として添加してもよい。
本明細書において、中性または弱アルカリ性とは、通常ｐＨ５〜ｐＨ１０、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ９、より好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ８．５の範囲である。
用いる還元剤によって溶液が中性または弱アルカリ性になる場合は、ｐＨ調節剤または緩衝液の添加は不要である。

0015

本発明の方法において、ｐＨ調節剤または緩衝液は、医薬製剤に一般的に用いられるｐＨ調節剤または緩衝液を用いることができる。例えば、炭酸水素ナトリウム、塩酸、水酸化ナトリウム等のｐＨ調節剤、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が挙げられ、炭酸水素ナトリウムが好ましい。
本発明において、ｐＨ調節剤または緩衝液の使用量は、中性または弱アルカリ性に調節することができる量を適宜選択することができる。

0016

本発明の方法において、還元剤を添加する工程、ｐＨ調節剤または緩衝液を添加して中性または弱アルカリ性に調節する工程の順は特に限定されない。また、還元剤とｐＨ調節剤または緩衝液を同時に添加してもよい。アスタチンの揮発リスクの防止の点からは、ｐＨ調節剤または緩衝液を添加して中性または弱アルカリ性に調節する工程の後に、還元剤を添加する工程を行うことが好ましい。

0017

本発明の方法においては、上記した還元剤、ｐＨ調節剤、緩衝液の他にも、医薬製剤で一般に用いられる添加剤（例えば、注射用水、生理食塩水、アルコール等の溶剤、等張化剤、界面活性剤、甘味料、香料、着色剤、安定化剤、賦形剤）を添加する工程を含んでいてもよい。これら添加剤は、医薬製剤において慣用の量が用いられる。

0018

本発明の方法によって、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度（例えば、３０％以上）で含む溶液（例えば、水溶液、アルコール溶液（例えば、エタノール溶液）、アルコール水溶液（例えば、エタノール水溶液））を製造することができる。

0019

本明細書において、放射化学的純度とは、溶液中の２１１Ａｔ総放射能に対する２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）の放射能の割合（％）である。
本発明の方法によって得られる２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を含む溶液の放射化学的純度は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％である。
本発明における放射化学的純度は、例えば、後述の試験例１、試験例８に記載の薄層クロマトグラフ法、またはこれに準じた方法により確認することができる。

0020

本発明の方法の態様としては、例えば、以下が挙げられる。
（１）２１１Ａｔ溶液（２１１Ａｔ原液）に、還元剤（例えば、アスコルビン酸）、ｐＨ調節剤（例えば、炭酸水素ナトリウム）、及び必要により注射用水を加え、混合して、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度で含む溶液を得る。
（２）２１１Ａｔ溶液（２１１Ａｔ原液）に、還元剤（例えば、アスコルビン酸ナトリウム）、及び必要により注射用水を加え、混合して、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度で含む溶液を得る。

0021

本発明はまた、上記した本発明の製造方法により得られる、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度（例えば、３０％以上）で含む溶液（例えば、水溶液、アルコール溶液（例えば、エタノール溶液）、例えばアルコール水溶液（例えば、エタノール水溶液））（以下、本発明の高純度２１１Ａｔ−含有溶液と記載する場合がある。）に関する。放射化学的純度の定義、好ましい範囲は上記と同様である。
本発明の高純度２１１Ａｔ−含有溶液は、製造工程で添加した還元剤、ｐＨ調節剤、緩衝液等が含まれていてもよく、これらを分離せずにそのまま対象に投与することができる。また、本発明の高純度２１１Ａｔ−含有溶液は、さらに医薬製剤で一般に用いられる添加剤を含んでいてもよい。

0022

本発明の高純度２１１Ａｔ−含有溶液は、ヒト及び哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、サル）に対して、例えば、甲状腺疾患（例えば、甲状腺がん、甲状腺機能亢進症（バセドウ氏病）等）、甲状腺がん転移巣の治療、診断（特にＲＩ内用療法）に用いることができる。本発明の高純度２１１Ａｔ−含有溶液は、甲状腺がん以外であっても、ＮＩＳが著明に発現しているがん（例えば、胃がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、大腸がん、卵巣がん等）の治療、診断（特にＲＩ内用療法）にも用いることができる。
本発明の高純度２１１Ａｔ−含有溶液を用いるＲＩ内用療法では、患者に投与後、患部に集積した２１１Ａｔが放出するα線の照射により患部を治療することができる。
本発明の高純度２１１Ａｔ−含有溶液は、経口的、または非経口的（静脈内注射、点滴等）に、安全に投与することができる。

0023

本発明の高純度２１１Ａｔ−含有溶液の投与量は、投与対象、投与経路、疾患等により異なる。例えば、成人に対し、甲状腺がんの治療に用いる場合、２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）の投与量が、１ＭＢｑ〜２０ＧＢｑである。

0024

以下、実施例、試験例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例中、溶液中の成分濃度を示す％は、重量％（ｗ／ｖ％）を示す。

0025

参考例１：２１１Ａｔ水溶液の調製
サイクロトロンで加速したヘリウム（２８ＭｅＶ，１−２μＡ）をターゲット物質であるビスマス−２０９（２０９Ｂｉ）に照射し、２０９Ｂｉ（α，２ｎ）２１１Ａｔの核反応により、ターゲット物質中にアスタチン−２１１（２１１Ａｔ）を製造した。照射後、ターゲット物質は電熱器内で８００℃に加熱して溶解し、ターゲット物質から蒸散する２１１Ａｔを小量の水（０．１〜２ｍＬ）に溶解して２１１Ａｔ水溶液を調製した。この２１１Ａｔ水溶液の調製時の放射能は５〜２５ＭＢｑであった。

0026

参考例２：炭酸水素ナトリウム添加２１１Ａｔ水溶液の調製
参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液０．１ｍＬ（１４ＭＢｑ）に注射用水０．５ｍＬおよび７％炭酸水素ナトリウム水溶液０．８ｍＬを順に加え、室温で３０分間混合して、炭酸水素ナトリウム添加２１１Ａｔ水溶液（ｐＨ７．５−９．０）を調製した。

0027

実施例１：０．９％アスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液の調製
参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液０．１ｍＬ（２５ＭＢｑ）に注射用水０．５ｍＬ、７％炭酸水素ナトリウム水溶液０．８ｍＬおよび２％アスコルビン酸水溶液１．２ｍＬを順に加え、室温で３０分間混合して、０．９％アスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液（ｐＨ７．５−９．０）を調製した。

0028

試験例１：放射化学的純度の分析
実施例１で調製した０．９％アスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液、参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液、参考例２で調製した炭酸水素ナトリウム添加２１１Ａｔ水溶液、および比較対照としてＮａ１２３Ｉ水溶液（富士ＲＩファーマ社製）の放射化学的純度を、薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ）により、以下の方法で分析した。
各試料は、薄層板（Ｇ６０、メルク社製）の原線（Ｏｒｉｇｉｎ）に２μＬ塗布し、アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（６７：３３：０．５）混合溶液を展開溶媒として展開し、イメージングプレート（ＢＡＳ ＩＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に露光したのち、バイオイメージング装置（ＴＹＰＨＯＯＮ７０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で薄層板上の放射能の分布割合（％）を測定した。結果を図１に示す。
実施例１の０．９％アスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液（図１中（ａ））では、Ｒｆ＝０．８２の位置に２１１Ａｔ−アスタチン化物イオン（２１１Ａｔ−）に相当する放射能スポットが放射化学的純度１００％で検出された。この放射能スポットが２１１Ａｔ−であることは、同条件で実施したＮａ１２３Ｉ水溶液の１２３Ｉ−ヨウ化物イオン（１２３Ｉ−）の放射能スポット（図１中（ｄ）のＲｆ値＝０．８６）から類推して妥当であると判断した。これに対して、参考例１の２１１Ａｔ水溶液（図１中（ｂ））および参考例２の炭酸水素ナトリウム添加２１１Ａｔ水溶液（図１中（ｃ））では、２１１Ａｔ−の放射化学的純度はいずれも２０％以下で、大部分の放射能は原点付近や溶媒先端（Ｆｒｏｎｔ）付近に複数の放射性不純物として検出された。以上の結果から、２１１Ａｔ水溶液にアスコルビン酸を添加すると、高純度の２１１Ａｔ−が生成することが示された。

0029

実施例２〜５：０．２５〜２％アスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液の調製
参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液０．１ｍＬに、適量の注射用水、７％炭酸水素ナトリウム水溶液および４％アスコルビン酸水溶液を加え、室温で３０分間混合して、最終濃度が０．２５％（実施例２）、０．５％（実施例３）、１％（実施例４）または２％（実施例５）のアスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液（ｐＨ７．５−９．０）をそれぞれ調製した。２１１Ａｔの最終放射能濃度はいずれも１０ＭＢｑ／ｍＬに統一した。

0030

試験例２：アスコルビン酸濃度（０．２５〜２％）の効果の検討
実施例２〜５のアスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液の放射化学的純度を、試験例１と同様の方法で、ＴＬＣにより分析した。結果を図２に示す。
アスコルビン酸無添加時（試験例１の２１１Ａｔ水溶液）は２１１Ａｔ−の放射化学的純度が２０％であったのに対し、アスコルビン酸濃度が０．２５％のときは２１１Ａｔ−の放射化学的純度が５３．８％に増加し、更にアスコルビン酸濃度が０．５％以上のときは２１１Ａｔ−の放射化学的純度が９５％以上であった。

0031

実施例６：１％アスコルビン酸ナトリウム添加２１１Ａｔ水溶液の調製
参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液０．１ｍＬ（２ＭＢｑ）に２％アスコルビン酸ナトリウム水溶液０．１ｍＬを加え、室温で３０分間混合して、１％アスコルビン酸ナトリウム添加２１１Ａｔ水溶液（ｐＨ５−７）を調製した。

0032

試験例３：放射化学的純度の分析
実施例６の１％アスコルビン酸ナトリウム添加２１１Ａｔ水溶液の放射化学的純度を、試験例１と同様の方法で、ＴＬＣにより分析した。結果を図３に示す。
２１１Ａｔ−（Ｒｆ＝０．９３）の放射化学的純度は９２．４％であった。アスコルビン酸ナトリウムは、アスコルビン酸と同様に高純度の２１１Ａｔ−を生成させるのに有効であることがわかった。

0033

実施例７：１％システイン添加２１１Ａｔ水溶液の調製
参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液０．１ｍＬ（４ＭＢｑ）に、注射用水０．０５ｍＬ、７％炭酸水素ナトリウム水溶液０．１ｍＬおよび２％システイン水溶液０．２５ｍＬを加え、室温で３０分間混合して、１％システイン添加２１１Ａｔ水溶液（ｐＨ７−９）を調製した。

0034

試験例４：放射化学的純度の分析
実施例７の１％システイン添加２１１Ａｔ水溶液の放射化学的純度を、試験例１と同様の方法で、ＴＬＣにより分析した。結果を図４に示す。
２１１Ａｔ−（Ｒｆ＝０．８９）の放射化学的純度は１００％であった。システインは、アスコルビン酸と同様に高純度の２１１Ａｔ−を生成させるのに有効であることがわかった。

0035

実施例８：１％グルタチオン添加２１１Ａｔ水溶液の調製
参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液０．１ｍＬ（４ＭＢｑ）に、注射用水０．０５ｍＬ、７％炭酸水素ナトリウム水溶液０．１ｍＬおよび２％グルタチオン水溶液０．２５ｍＬを加え、室温で３０分間混合して、１％グルタチオン添加２１１Ａｔ水溶液（ｐＨ７−９）を調製した。

0036

試験例５：放射化学的純度の分析
実施例８の１％グルタチオン添加２１１Ａｔ水溶液の放射化学的純度を、試験例１と同様の方法で、ＴＬＣにより分析した。結果を図５に示す。
２１１Ａｔ−（Ｒｆ＝０．９３）の放射化学的純度は８６．２％であった。グルタチオンは、アスコルビン酸と同様に高純度の２１１Ａｔ−を生成させるのに有効であることがわかった。

0037

試験例６：正常ラットのプラナー・イメージング
低ヨード食を２週間給餌した正常ラット（Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔ、雄、３ヶ月齢）を実験に供した。このラットをイソフルランで麻酔し、実施例１で調製した０．９％アスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液（約３ＭＢｑ／匹）を尾静脈内に投与した（ｎ＝３）。また対照群として同様に処置したラットに参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液（約５ＭＢｑ／匹）を投与した（ｎ＝３）。ラットは、投与後３０分、３時間、６時間および２４時間点で麻酔し、ガンマカメラ（シーメンス社製、Ｅ．ＣＡＭ）によりプラナー像（平面像）を撮像した。撮像時間は、投与後３０分〜６時間点の場合は１０分間、投与後２４時間点の場合は２０分間とした。図６にプラナー・イメージングの結果を示す。
図６において、上段（ａ）のアスコルビン酸群（０．９％アスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液投与群）では、下段（ｂ）の対照群（２１１Ａｔ水溶液投与群）に比べて、被験液の投与後早期（３０分点）から甲状腺に強い放射能集積を認め、２４時間点まで経時的に放射能集積が増強した。甲状腺以外では、胃への集積と尿路系（膀胱）への排泄が示された。（ｂ）の対照群では、甲状腺の放射能集積はやや弱く、胃に放射能が滞留する様相が示された。以上の結果から、アスコルビン酸の添加により高純度に調製された２１１Ａｔ−水溶液をラットに投与すると、甲状腺への放射能集積が増強され、一方、胃への非特異的な集積が低減されることが示唆された。

0038

試験例７：正常ラット体内分布試験
試験例６で述べた投与後２４時間点の撮像を終了した後、アスコルビン酸群（０．９％アスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液投与群）および対照群（２１１Ａｔ水溶液投与群）のラットを解剖し、甲状腺、胃およびその他主要臓器を摘出した。摘出した各臓器は、微量天秤で湿重量を測定し、ガンマカウンタ（パーキンエルマー社製、２４８０ＷＩＺＡＲＤ２）で放射能を測定した。表１に正常ラット体内分布試験結果（臓器重量当たりの放射能カウント）を示す。いずれの群でも、甲状腺の放射能カウントは、他の臓器よりも１０倍以上大きかった。また、アスコルビン酸群の甲状腺の放射能カウントは、対照群の甲状腺の放射能カウントよりも約４倍大きかった。一方、胃、脾臓および肝臓の放射能カウントは、アスコルビン酸群よりも対照群のほうが大きかった。
表１の値から甲状腺とその他臓器の単位重量当たりの放射能カウント比を算出した結果を表２に示す。アスコルビン酸群および対照群のいずれも甲状腺とその他主要臓器の放射能カウント比は１９．３倍〜２７５５．６倍の高い値を示した。さらに、甲状腺／胃比は、アスコルビン酸群のほうが対照群より４．９倍高かった。以上の結果から、アスコルビン酸の添加により高純度に調製された２１１Ａｔ−水溶液をラットに投与すると、甲状腺への放射能集積が増強され、胃やその他臓器への非特異的な集積が低減されることが示唆された。すなわち、アスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液は、甲状腺がんの治療効果を高めると共に、胃を始めとするその他臓器への被曝を低減させ、より安全に治療を行えることが示唆された。

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実施例９〜１２：還元剤添加２１１Ａｔ水溶液の調製
参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液を水で希釈して調製した粗精製２１１Ａｔ水溶液０．１ｍＬ（約１ＭＢｑ）に２％の還元剤（アスコルビン酸、システイン、グルタチオン又は硫酸鉄（ＩＩ））水溶液０．１ｍＬを加え、室温下で１時間混合して、還元剤の最終濃度が１％の、アスコルビン酸添加２１１Ａｔ水溶液（実施例９）、システイン添加２１１Ａｔ水溶液（実施例１０）、グルタチオン添加２１１Ａｔ水溶液（実施例１１）、硫酸鉄（ＩＩ）添加２１１Ａｔ水溶液（実施例１２）を調製した。

0042

試験例８：放射化学的純度の分析：種々の還元剤添加の効果
粗精製２１１Ａｔ水溶液、及び実施例９〜１２で調製した還元剤添加２１１Ａｔ水溶液を、ＴＬＣ（薄層板：シリカゲルＧ６０Ｆ２５４（メルク製）、溶媒：アセトニトリル・水・トリフルオロ酢酸（６７／３３／０．１））で分析した（図７）。２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）の放射化学的純度は、アスコルビン酸を用いたときが最も高く（９５．７％）、次いでシステイン、グルタチオン、硫酸鉄（ＩＩ）の順だった。

0043

試験例９：Ｋ１細胞（ヒト甲状腺がん細胞）およびＫ１−ＮＩＳ細胞（ＮＩＳ発現Ｋ１細胞）による２１１Ａｔの細胞内取り込み量の比較
９６穴プレートにＫ１細胞（ヒト甲状腺がん細胞）およびＫ１−ＮＩＳ細胞（ＮＩＳ発現Ｋ１細胞）をそれぞれ１ｘ１０５個ずつ播き、２１１Ａｔ水溶液１０μＬ（約１０ｋＢｑ）を添加した。この細胞を３７℃で５分、３０分及び６０分培養した後、０．１Ｎ ＮａＯＨで細胞を溶解して細胞内の放射能をガンマカウンター（2480 Wizard2, Perkin Elmer）で測定した。タンパク量はＢＣＡプロテイン定量キット（富士フィルム）およびプレートリーダー（Thermo Fisher）で測定した。図８に示すように、２１１ＡｔはＫ１−ＮＩＳ細胞内に取り込まれたが、Ｋ１細胞には取り込まれなかった。２１１Ａｔは、ＮＩＳを介して特異的に細胞に取り込まれることが示された。

0044

試験例１０：甲状腺がん細胞（Ｋ１−ＮＩＳ）による２１１Ａｔ−ＡＡ（＋）及び２１１Ａｔ−ＡＡ（−）の経時的な取り込み量の変化
参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液を水で希釈してアスコルビン酸未添加アスタチン水溶液（２１１Ａｔ−ＡＡ（−），１ＭＢｑ／ｍＬ）を調製した。また参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液を水で希釈し、さらにアスコルビン酸を最終濃度が１％になるように加えてアスコルビン酸添加アスタチン水溶液（２１１Ａｔ−ＡＡ（＋），１ＭＢｑ／ｍＬ）を調製した。
９６穴プレートにＫ１−ＮＩＳ細胞（ＮＩＳ発現Ｋ１細胞）を１ｘ１０５個ずつ播き、アスコルビン酸添加アスタチン水溶液（２１１Ａｔ−ＡＡ（＋））又はアスコルビン酸未添加アスタチン水溶液（２１１Ａｔ−ＡＡ（−））１０μＬ（約１０ｋＢｑ）を添加した。この細胞を３７℃で５分、３０分又は６０分培養した後、０．１Ｎ ＮａＯＨで細胞を溶解して細胞内の放射能をガンマカウンター（2480 Wizard2,Perkin Elmer）で測定した。タンパク量はＢＣＡプロテイン定量キット（富士フィルム）およびプレートリーダー（Thermo Fisher）で測定した。図９に示すように、２１１Ａｔ−ＡＡ（＋）のＫ１−ＮＩＳ細胞内への取り込み量は経時的に増加し、ＡＡ（−）の細胞取り込み量の約２倍に達した（６０分後）。すなわち２１１Ａｔ水溶液にアスコルビン酸を添加すると、細胞の２１１Ａｔ取り込み量が増加することが示された。

0045

試験例１１：２１１Ａｔ−ＡＡ（＋）による甲状腺がん細胞（Ｋ１−ＮＩＳ）移植マウスのＳＰＥＣＴイメージング
参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液を水で希釈し、さらにアスコルビン酸を最終濃度が１％になるように加えて２１１Ａｔ−ＡＡ（＋）水溶液を調製した。
ＳＣＩＤマウスの皮下にＫ１−ＮＩＳ細胞１ｘ１０７個を注入して甲状腺がん移植マウスを作製した。このマウスに２１１Ａｔ−ＡＡ（＋）水溶液１ＭＢｑを静注し、３時間後および２４時間後にＳＰＥＣＴカメラ（E-cam, Siemens）で撮像した。腫瘍部位は、いずれの時間点においても明瞭に描出された（図１０）。腫瘍部位の放射能集積率は２２．５±１０．４％（３時間後）および１２．９±６．８％（２４時間後）であった。また胃にも弱い生理的な放射能集積が認められた。本結果は、２１１Ａｔ−ＡＡ（＋）が甲状腺がんを始めとするＮＩＳ発現腫瘍の診断および治療に有用であることを示唆するものである。

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試験例１２：２１１Ａｔ−ＡＡ（＋）水溶液による甲状腺がん細胞（Ｋ１−ＮＩＳ）移植マウスの治療：０．１ＭＢｑ、０．４ＭＢｑおよび１ＭＢｑの１回静注後の経時的な腫場サイズ変化と体重変化
参考例１で調製した２１１Ａｔ水溶液を水で希釈し、さらにアスコルビン酸を最終濃度が１％になるように加えて２１１Ａｔ−ＡＡ（＋）水溶液を調製した。
ＳＣＩＤマウスの皮下にＫ１−ＮＩＳ細胞１ｘ１０７個を注入して甲状腺がん移植マウスを作製した。このマウスに２１１Ａｔ−ＡＡ（＋）水溶液０．１ＭＢｑ、０．４ＭＢｑおよび１ＭＢｑを１回静注し、腫瘍サイズと体重の変化を６０日間にわたり計測した（ｎ＝６）。図１１ａ（図１１左図）に示すように、無処置群（ｃｏｎｔｒｏｌ）では腫瘍サイズが経時的に増加したが、２１１Ａｔの１ＭＢｑ静注群では、約４０日間にわたり腫瘍の縮小又は増殖抑制効果が示された。また腫瘍の増殖抑制効果は、２１１Ａｔの放射能量に依存した。図１１ｂ(図１１右図）に示すように、１ＭＢｑ静注群では初期に一過性の体重減少を認めたが、その後回復した。０．１ＭＢｑ群および０．４ＭＢｑ群の体重は、対照群に比べて大きな差異を認めなかった。

0047

本発明によれば、甲状腺疾患等の治療のためのＲＩ内用療法等に有用な２１１Ａｔ−（アスタチン化物イオン）を高い放射化学的純度で含む溶液を提供できる。

0048

本出願は、日本で出願された特願２０１７−２５５１０９を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。