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図面 (6)

課題・解決手段

重鎖相補性決定領域(CDR)1〜3がそれぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3がそれぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片; 重鎖CDR1〜3がそれぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸欠失置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3がそれぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、KK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片;又は 重鎖CDR1〜3がそれぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、KK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片。

概要

背景

Kitakyushu lung cancer antigen−1(KK−LC−1)は、様々な癌に発現するマーカーとして使用できることが明らかになりつつある(例えば、特許文献1を参照)。したがって、KK−LC−1を簡便に検出することができる技術を開発することは重要である。

概要

重鎖相補性決定領域(CDR)1〜3がそれぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3がそれぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片; 重鎖CDR1〜3がそれぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸欠失置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3がそれぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、KK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片;又は 重鎖CDR1〜3がそれぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、KK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片。

目的

本発明は、KK−LC−1を簡便に検出する技術を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

以下の(i)〜(iii)のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片。(i)重鎖相補性決定領域(CDR)1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片(ii)重鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸欠失置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Kitakyushulungcancerantigen−1(KK−LC−1)タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片(iii)重鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、KK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片

請求項2

固定された生体試料中のKK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、請求項1に記載のモノクローナル抗体又はその断片。

請求項3

前記生体試料架橋固定剤で固定されている、請求項2に記載のモノクローナル抗体又はその断片。

請求項4

前記架橋固定剤が、ホルムアルデヒドパラホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドである、請求項3に記載のモノクローナル抗体又はその断片。

請求項5

配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。

請求項6

配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。

請求項7

受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。

請求項8

請求項1〜7のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片を備える、癌の検出キット

請求項9

請求項1〜7のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸

請求項10

固定された生体試料に、請求項1〜7のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片を反応させる工程を備える、癌の検出方法

請求項11

受託番号がNITEBP−02527である、ハイブリドーマ細胞株。

請求項12

生体試料中のKK−LC−1タンパク質を検出する方法であって、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその部分ペプチドを検出する工程を備える方法。

請求項13

前記部分ペプチドが、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項12に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、モノクローナル抗体及びその使用に関する。より具体的には、モノクローナル抗体又はその断片、癌の検出キット、癌の検出方法、及びハイブリドーマ細胞株に関する。本願は、2017年11月14日に、日本に出願された特願2017−218872号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

背景技術

0002

Kitakyushu lung cancer antigen−1(KK−LC−1)は、様々な癌に発現するマーカーとして使用できることが明らかになりつつある(例えば、特許文献1を参照)。したがって、KK−LC−1を簡便に検出することができる技術を開発することは重要である。

先行技術

0003

特許第6028253号公報

発明が解決しようとする課題

0004

本発明は、KK−LC−1を簡便に検出する技術を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0005

本発明は以下の態様を含む。
[1]以下の(i)〜(iii)のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片。
(i)重鎖相補性決定領域(CDR)1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片
(ii)重鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸欠失置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、KK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片
(iii)重鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、KK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片
[2]固定された生体試料中のKK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、[1]に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
[3]前記生体試料架橋固定剤で固定されている、[2]に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
[4]前記架橋固定剤が、ホルムアルデヒドパラホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドである、[3]に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
[5]配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有する、[1]〜[4]のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
[6]配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有する、[1]〜[5]のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
[7]受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生される、[1]〜[6]のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
[8][1]〜[7]のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を備える、癌の検出キット。
[9][1]〜[7]のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸
[10]固定された生体試料に、[1]〜[7]のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を反応させる工程を備える、癌の検出方法。
[11]受託番号がNITE BP−02527である、ハイブリドーマ細胞株。
[12]生体試料中のKK−LC−1タンパク質を検出する方法であって、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその部分ペプチドを検出する工程を備える方法。
[13]前記部分ペプチドが、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、[12]に記載の方法。

発明の効果

0006

本発明によれば、KK−LC−1を簡便に検出する技術を提供することができる。本発明により、例えば、免疫組織染色によりKK−LC−1の発現を検出することが可能になる。また、抗KK−LC−1モノクローナル抗体は半永久的に供給することが可能であり、診断薬として好適に用いることができる。

図面の簡単な説明

0007

実験例2の結果を示すグラフである。
(a)〜(d)は、実験例3における免疫組織染色の結果を示す写真である。
(a)〜(d)は、実験例4における免疫組織染色の結果を示す写真である。
(a)〜(c)は、実験例5における免疫組織染色の結果を示す写真である。
(a)及び(b)は、実験例6における免疫組織染色の結果を示す写真である。
実験例8におけるエピトープマッピングの結果を示すグラフである。

0008

[モノクローナル抗体又はその断片]
1実施形態において、本発明は、固定された生体試料中のKK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片を提供する。このようなハイブリドーマ細胞株を取得することは困難であったが、実施例において後述するように、発明者らは、固定された生体試料中のKK−LC−1タンパク質に反応することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を樹立することに成功した。KK−LC−1タンパク質のNCBIアクセッション番号はNP_001017978.1であり、そのアミノ酸配列を配列番号86に示す。

0009

本明細書において、モノクローナル抗体の断片としては、従来知られている抗体断片が挙げられ、より具体的には、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等が挙げられる。

0010

本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、動物を免疫して得られたものであってもよいし、ファージライブラリ等を用いたスクリーニングにより得られたものであってもよい。また、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、後述するバイブドーマ株から産生されたものであってもよいし、遺伝子組換え体であってもよい。遺伝子組換え体の宿主は、特に限定されず、例えば、大腸菌酵母等の微生物昆虫細胞植物細胞動物細胞等であってもよい。

0011

本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、例えば免疫組織染色に好適に用いることができる。従来、免疫組織染色に用いることができる抗KK−LC−1モノクローナル抗体は存在しなかった。本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、半永久的に供給することが可能であり、品質管理も容易であるため、例えば診断薬として好適に用いることができる。

0012

本実施形態において、固定された生体試料とは、架橋固定剤で固定された生体試料であることが好ましい。すなわち、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片が検出対象とするKK−LC−1タンパク質は、架橋固定剤で固定された生体試料中に存在するものであることが好ましい。本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、このような生体試料中のKK−LC−1タンパク質であっても良好に反応することができる。上述したように、従来、固定された生体試料の免疫組織染色に用いることができる抗KK−LC−1モノクローナル抗体は存在しなかった。ここで、架橋固定剤としては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等が挙げられる。

0013

本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたものであることが好ましい。なお、受託番号がNITE BP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体又はその断片は、固定された生体試料中のKK−LC−1タンパク質のみならず、固定されていない生体試料中のKK−LC−1タンパク質に対しても結合性を有する。

0014

本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有するものであることが好ましい。実施例において後述するように、受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体は、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有する。

0015

本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有するものであることが更に好ましい。実施例において後述するように、発明者らは、エピトープマッピングにより、モノクローナル抗体が認識するエピトープを特定した。その結果、受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体が、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する結合性を有することが明らかとなった。なお、後述するように、このモノクローナル抗体は、配列番号12に記載のアミノ酸配列において、C末端セリン残基N末端アスパラギン残基、N末端のアスパラギン残基及びN末端から2番目リジン残基が欠失したペプチドに対しても結合性を有する可能性がある。

0016

本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、以下の(i)〜(iii)のいずれかであってよい。
(i)重鎖相補性決定領域(CDR)1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片。
(ii)重鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、KK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片。
(iii)重鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列からなり、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片と競合し、KK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片。

0017

配列番号2〜4は、それぞれ、受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体の重鎖CDR1〜3のアミノ酸配列である。また、配列番号5〜7は、それぞれ、受託番号がNITE BP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体の軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列である。

0018

すなわち、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体と同一の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3を有していてもよい。

0019

あるいは、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、固定された生体試料中のKK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する限り、受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3に対して、変異を有する重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3を有していてもよい。

0020

すなわち、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、重鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。

0021

ここで、1若しくは数個とは、例えば1〜10個であってもよく、例えば1〜5個であってもよく、例えば1〜3個であってもよい。

0022

本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号9に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するものであってもよい。

0023

あるいは、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片は、受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体又はその断片と競合し、KK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する、モノクローナル抗体又はその断片であってもよい。

0024

ここで、対象の抗体が競合するとは、例えば、KK−LC−1タンパク質に、受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体を反応させた後に、対象の抗体を反応させた場合に、受託番号がNITE BP−02527であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体とKK−LC−1タンパク質との結合を少なくとも一部解離させて、KK−LC−1タンパク質と結合することを意味する。

0025

ここで、少なくとも一部とは、上記のKK−LC−1タンパク質のモル数の10%以上であってもよく、30%以上であってもよく、50%以上であってもよく、70%以上であってもよく、90%以上であってもよい。

0026

本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片はヒト型化されていてもよい。ヒト型抗体としては、キメラ抗体ヒト化抗体、完全ヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、可変領域が非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域の少なくとも一部がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、ヒト化抗体とは、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域のみが非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域及びフレームワーク領域がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、完全ヒト抗体とは、相補性決定領域を含めて全体がヒト由来の抗体を意味する。モノクローナル抗体又はその断片が、ヒト型抗体又はその断片であれば、ヒトに投与しても免疫原性が低いため、アナフィラキシーショック等の副作用を抑制することができる。したがって、本実施形態のモノクローナル抗体又はその断片がヒト型抗体又はその断片であれば、ヒトに投与することができる。

0027

[核酸]
1実施形態において、本発明は上述したモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸を提供する。

0028

本実施形態の核酸は、重鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号2〜4のアミノ酸配列又は配列番号2〜4のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号5〜7のアミノ酸配列又は配列番号5〜7のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、固定された生体試料中のKK−LC−1タンパク質に対する結合性を有するモノクローナル抗体又はその断片をコードするものであることが好ましい。

0029

本実施形態の核酸は、重鎖可変領域遺伝子の塩基配列が配列番号10の塩基配列を有し、軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列が配列番号11の塩基配列を有するものであってもよい。あるいは、本実施形態の核酸は、コードするモノクローナル抗体又はその断片が固定された生体試料中のKK−LC−1タンパク質に対する結合性を有する限り変異を有していてもよい。

0030

すなわち、本実施形態の核酸は、重鎖可変領域遺伝子の塩基配列が、配列番号10の塩基配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは99%以上の配列同一性を有し、軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列が、配列番号11の塩基配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは99%以上の配列同一性を有するものであってもよい。

0031

ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基塩基数を算出し、下記式(1)にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性(%)=一致した塩基数/対象塩基配列の総塩基数×100 (1)

0032

本実施形態の核酸はベクターに含まれていてもよい。また、当該ベクターは上述したモノクローナル抗体又はその断片を発現可能な発現ベクターであってもよい。また、上記のベクターは、例えば、大腸菌、酵母等の微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞等の宿主に導入されていてもよい。すなわち、1実施形態において、本発明は、上記のベクターが導入された宿主を提供する。

0033

[癌の検出キット]
1実施形態において、本発明は、上述したモノクローナル抗体又はその断片を備える、癌の検出キットを提供する。本実施形態のキットによれば、固定された生体試料の免疫組織染色により、簡便に癌を検出することができる。固定された生体試料としては、上述したものと同様のものが挙げられ、例えば固定された組織薄切切片であってもよい。

0034

本実施形態のキットが検出対象とする癌としては、例えば、胃癌肺癌乳癌大腸癌食道癌膵臓癌胆道癌胆嚢癌十二指腸癌、大腸癌、肝癌脳腫瘍子宮癌卵巣癌白血病骨肉腫中皮腫精巣腫瘍消化管間質腫瘍等が挙げられる。

0035

[癌の検出方法]
1実施形態において、本発明は、固定された生体試料に、上述したモノクローナル抗体又はその断片を反応させる工程を備える、癌の検出方法を提供する。本実施形態の検出方法は、癌に罹患しているか否かを診断するためのデータ収集方法であるということもできる。なお、データ収集方法は医師が判断する工程を含まない。

0036

本実施形態の検出方法により、固定された生体試料中にKK−LC−1タンパク質が検出された場合、当該生体試料が由来する患者には、KK−LC−1を標的とした癌治療の適用が有効であると判断することができる。

0037

本実施形態の方法が検出対象とする癌としては、例えば、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、脳腫瘍、子宮癌、卵巣癌、白血病、骨肉腫、中皮腫、精巣腫瘍、消化管間質腫瘍等が挙げられる。

0038

本実施形態の方法により、簡便に癌を検出することができる。本実施形態の方法は、上述したモノクローナル抗体又はその断片により実現可能となったものである。

0039

[ハイブリドーマ細胞株]
1実施形態において、本発明は、受託番号がNITEBP−02527である、ハイブリドーマ細胞株を提供する。本実施形態のハイブリドーマ細胞株を培養することにより、上述したモノクローナル抗体を製造することができる。また、製造したモノクローナル抗体をペプシンパパインで切断すること等により、抗体断片を得ることができる。

0040

[生体試料中のKK−LC−1タンパク質を検出する方法]
1実施形態において、本発明は、生体試料中のKK−LC−1タンパク質を検出する方法であって、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその部分ペプチドを検出する工程を備える方法を提供する。また、上記の部分ペプチドは、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。本実施形態の方法によれば、固定された生体試料中のKK−LC−1タンパク質であっても検出することができる。

0041

ところで、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号86にアミノ酸配列を示すKK−LC−1タンパク質の第89〜100番目のアミノ酸に相当する。また、KK−LC−1タンパク質の第80〜101番目のアミノ酸からなるペプチドは、血液中分泌されることが知られている。したがって、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出することにより、血液中に分泌されたKK−LC−1タンパク質の部分ペプチドを検出することができる。

0042

[その他の実施形態]
1実施形態において、本発明は、患者由来の固定された生体試料に、上述したモノクローナル抗体又はその断片を反応させる工程と、前記生体試料中にKK−LC−1タンパク質が検出された場合に、前記患者にKK−LC−1を標的とした癌治療を適用する工程と、を含む、癌の治療方法を提供する。

0043

KK−LC−1を標的とした癌治療としては、例えば、KK−LC−1タンパク質を癌抗原として用いた癌免疫療法細胞膜上に発現したKK−LC−1タンパク質を標的とする分子標的治療等が挙げられる。上記分子標的治療は、KK−LC−1タンパク質を認識する抗体医薬を用いた治療であってもよい。

0044

[実験例1]
(ハイブリドーマ細胞株の樹立)
配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するペプチドでマウスを免疫し、約30クローンのハイブリドーマ細胞株を樹立した。

0045

[実験例2]
ELISA法によるモノクローナル抗体の反応性の確認)
免疫したペプチドを抗原としたELISA法により、モノクローナル抗体の反応性を確認した。具体的には、まず、96ウェルプレートに、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを固定化した。また、対照として、ペプチドを固定化せず、ブロッキングのみ行った96ウェルプレートを用いた。ブロッキングにはスキムミルク溶液を使用した。

0046

続いて、96ウェルプレートをブロッキングし、樹立した各ハイブリドーマ細胞株の培養上清を添加して反応させた。また、比較のために、ノーマルマウス血清を反応させたウェルも用意した。続いて、未反応のモノクローナル抗体を洗浄除去し、抗マウス次抗体を反応させて発色基質を添加し、発色させた。続いて、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を測定した。

0047

図1は、ELISA法によるモノクローナル抗体の反応性を測定した結果を示すグラフである。図1中、横軸はハイブリドーマ細胞株のクローン名を示す。クローン名「34B3」が、受託番号がNITEBP−02527であるハイブリドーマ細胞株である。

0048

その結果、ELISA法においてKK−LC−1タンパク質との反応性を示すモノクローナル抗体が多数得られたことが確認された。

0049

[実験例3]
(免疫組織染色によるモノクローナル抗体の反応性の確認1)
作製したモノクローナル抗体を用いて、ホルムアルデヒド固定された、精巣腫瘍患者の正常領域及び腫瘍領域組織切片胃癌患者胃組織の正常領域及び腫瘍領域の組織切片を染色した。その結果、樹立した約30クローンのハイブリドーマ細胞株のうちの1クローンが産生するモノクローナル抗体のみが、オートクレーブによる賦活化の下処理を行なった免疫組織染色においてKK−LC−1タンパク質を染色することができることが明らかとなった。

0050

免疫組織染色においてKK−LC−1タンパク質を染色することができるモノクローナル抗体を産生したハイブリドーマ細胞株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構(千葉県木更津市かずさ足2−5−8)に国内寄託した(受託日:2017年8月3日、受託番号:NITEP−02527、細胞名「277 34B3 20170123」)。その後、当該ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITE P−02527)を、国際寄託へと移管した(国際受託当局:独立行政法人製品評価技術基盤機構(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)、受託日:2018年10月10日、受託番号:NITE BP−02527、細胞名「277 34B3 20170123」)。

0051

図2(a)〜(d)は、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から得られたモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色の結果を示す写真である。いずれも倍率は400倍であった。

0052

図2(a)は精巣腫瘍患者の正常領域の組織切片の染色結果を示す写真である。また、図2(b)は精巣腫瘍の一種であるセミノーマの組織切片の染色結果を示す写真である。また、図2(c)は胃癌患者の胃組織の正常領域の組織切片の染色結果を示す写真である。図2(d)は胃癌患者の胃組織の腫瘍領域の組織切片の染色結果を示す写真である。

0053

その結果、いずれの組織切片の染色においても、KK−LC−1タンパク質が染色されたことが確認された。この結果から、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から得られたモノクローナル抗体が、固定された生体試料中のKK−LC−1タンパク質に対する結合性を有していることが明らかとなった。なお、本実験例で使用した胃癌患者の腫瘍領域及び正常領域のいずれの組織においても、KK−LC−1遺伝子の発現は陽性であった。

0054

また、以上の結果から、ELISA法において反応性が高いモノクローナル抗体であっても、免疫組織染色で反応性を示すとは限らないことが明らかとなった。

0055

[実験例4]
(免疫組織染色によるモノクローナル抗体の反応性の確認2)
ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から得られたモノクローナル抗体の反応性を検討した。具体的には、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITE BP−02527)から得られたモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITE BP−02527)の樹立時にマウスの免疫に用いたペプチドで吸収した後、実験例3と同様にして免疫組織染色を行い、反応性を検討した。また、比較のために、吸収操作に供していないモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色も行った。

0056

モノクローナル抗体の吸収操作には、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを0.05mg/mLの終濃度で使用した。また、吸収操作は4℃で一晩行った。

0057

図3(a)〜(d)は、免疫組織染色の結果を示す写真である。いずれも倍率は200倍であった。図3(a)及び(b)は胃癌患者の胃組織の腫瘍領域の組織切片の染色結果を示す写真である。図3(a)は吸収操作を行っていないモノクローナル抗体を用いた免疫染色の結果である。また、図3(b)は吸収操作後のモノクローナル抗体を用いた免疫染色の結果である。

0058

また、図3(c)及び(d)は胃癌患者の胃組織の正常領域の組織切片の染色結果を示す写真である。図3(c)は吸収操作を行っていないモノクローナル抗体を用いた免疫染色の結果である。また、図3(d)は吸収操作後のモノクローナル抗体を用いた免疫染色の結果である。

0059

その結果、吸収操作を行ったモノクローナル抗体ではKK−LC−1に対する反応性が消失することが明らかとなった。この結果は、作製したモノクローナル抗体が、KK−LC−1に対する特異的な反応性を有することを示す。なお、本実験例で使用した胃癌患者の腫瘍領域及び正常領域のいずれの組織においても、KK−LC−1遺伝子の発現は陽性であった。

0060

[実験例5]
(免疫組織染色によるモノクローナル抗体の反応性の確認3)
ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から得られたモノクローナル抗体の反応性を更に検討した。具体的には、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITE BP−02527)から得られたモノクローナル抗体を用いて、実験例3と同様にして免疫組織染色を行い、反応性を検討した。ここで、組織切片として、胃癌患者の胃組織の正常領域及び腫瘍領域であって、KK−LC−1遺伝子の発現が陰性であった試料を用いた。

0061

図4(a)〜(c)は、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から得られたモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色の結果を示す写真である。いずれも倍率は400倍であった。

0062

図4(a)は胃癌患者の胃組織の正常領域であって、KK−LC−1遺伝子の発現が陰性であった組織切片の染色結果を示す写真である。また、図2(b)及び(c)は胃癌患者の胃組織の腫瘍領域であって、KK−LC−1遺伝子の発現が陰性であった組織切片の染色結果を示す写真である。

0063

その結果、いずれの組織切片の染色においても、KK−LC−1タンパク質は検出されなかった。この結果は、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から得られたモノクローナル抗体が、固定された生体試料中のKK−LC−1に対する特異的な反応性を有することを更に支持するものである。

0064

[実験例6]
(免疫組織染色によるモノクローナル抗体の反応性の確認4)
ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から得られたモノクローナル抗体の反応性を、市販の抗KK−LC−1ポリクローナル抗体型式「HPA004773」、シグマアルドリッチ社)の反応性と比較した。

0065

具体的には、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から得られたモノクローナル抗体(培養上清を1/80希釈したもの)及び市販の抗KK−LC−1ポリクローナル抗体(型式「HPA004773」、シグマアルドリッチ社、1/50希釈したもの)を用いて、実験例3と同様にして免疫組織染色を行い、反応性を検討した。ここで、組織切片として、KK−LC−1遺伝子が強く発現している精巣試料を用いた。

0066

図5(a)及び(b)は、免疫組織染色の結果を示す写真である。いずれも倍率は400倍であった。図5(a)はハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から得られたモノクローナル抗体を用いた染色結果を示す写真である。また、図5(b)は市販の抗KK−LC−1ポリクローナル抗体(型式「HPA004773」、シグマアルドリッチ社)を用いた染色結果を示す写真である。

0067

その結果、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から得られたモノクローナル抗体では、固定された生体試料中のKK−LC−1を良好に検出できたのに対し、市販の抗KK−LC−1ポリクローナル抗体では、固定された生体試料中のKK−LC−1を染色できないことが明らかとなった。この結果は、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITE BP−02527)から得られたモノクローナル抗体の有用性を示すものである。

0068

[実験例7]
(モノクローナル抗体の塩基配列及びアミノ酸配列の同定)
ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)から全RNAを調製し、逆転写してcDNAを調製した。続いて、定法により、抗体重鎖可変領域遺伝子及び抗体軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列をシークエンスした。

0069

同定された重鎖可変領域遺伝子の塩基配列を配列番号10に示し、軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列を配列番号11に示す。また、塩基配列から推定される重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号8に示し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号9に示す。

0070

また、重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号2に示し、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号3に示し、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号4に示す。また、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号5に示し、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号6に示し、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号7に示す。

0071

[実験例8]
(モノクローナル抗体が認識するエピトープの解析
エピトープマッピングにより、ハイブリドーマ細胞株(受託番号:NITEBP−02527)が産生するモノクローナル抗体の抗原を特定した。具体的には、まず、KK−LC−1タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、N末端側の位置を1アミノ酸残基ずつずらした73種類の15アミノ酸残基のペプチドを合成し、ペプチドアレイを作製した。73種類のペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号13〜85に示す。

0072

続いて、このペプチドアレイにモノクローナル抗体を反応させ、反応性を有するペプチドを特定した。モノクローナル抗体は1/100及び1/500に希釈し、それぞれ反応させた。

0073

図6はエピトープマッピングの結果を示すグラフである。その結果、モノクローナル抗体が、LSMVENKLVELEHTL(配列番号63)〜VELEHTLLSKGFRGA(配列番号71)付近のペプチドに結合性を有することが明らかとなった。

実施例

0074

モノクローナル抗体が結合したペプチドに共通するアミノ酸配列を特定した結果、このモノクローナル抗体のエピトープはNKLVELEHTLLS(配列番号12)であることが明らかとなった。なお、配列番号12に記載のアミノ酸配列の全体がモノクローナル抗体との結合に必須であるか否かを決定するためには、更なる検討が必要である。すなわち、このモノクローナル抗体は、配列番号12に記載のアミノ酸配列において、C末端のセリン残基が欠失したペプチド、N末端のアスパラギン残基が欠失したペプチド、及び、N末端のアスパラギン残基及びN末端から2番目のリジン残基が欠失したペプチドに対しても結合性を有する可能性がある。

0075

本発明によれば、KK−LC−1を簡便に検出する技術を提供することができる。本発明により、例えば、免疫組織染色によりKK−LC−1の発現を検出することが可能になる。また、抗KK−LC−1モノクローナル抗体は半永久的に供給することが可能であり、診断薬として好適に用いることができる。

0076

NITEBP−02527

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