技術 エネルギー消費促進用組成物

0001

本発明は、エネルギー消費促進剤及びエネルギー消費促進用組成物に関する。該エネルギー消費促進剤及びエネルギー消費促進用組成物は、医薬品、飲食品、又は飼料として利用することができる。

0002

近年、食生活の欧米化による脂質摂取量増加と同時に、運動不足等による肥満が問題となっている。肥満とは、体脂肪が過剰に蓄積し、過体重になった状態であり、糖尿病をはじめとした生活習慣病を引き起こす危険因子となる。
肥満は、エネルギー摂取量と消費量のバランスが崩れ、消費量よりも摂取量が上回ることで起こるとされている。肥満をはじめとしたメタボリックシンドロームの予防、改善には身体活動量を増やすことにより、エネルギー消費量を増加させることが有効と考えられている。
主にエネルギー消費は、基礎代謝の他、食事に起因する食事誘発性熱産生、身体活動起因する熱産生に分けられる。身体活動に起因する熱産生は、スポーツ等の運動による熱産生と、それ以外の日常的な身体活動に起因する非運動性活動熱産生（Ｎｏｎ Ｅｘｅｒｃｉｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ：ＮＥＡＴ）からなる（非特許文献１）。更に、運動によるエネルギー消費は、運動中に限らず、運動終了後においてもエネルギー消費量の増加が継続することが知られている。
これまでにエネルギー消費を促進させる成分として、交感神経活性化作用を有するカフェイン等が報告されている（非特許文献２）。しかし一方で、カフェインの摂取によって血圧の上昇が引き起こされる可能性が報告されており(非特許文献３)、安全性や刺激性の観点からその実用性が限定される。

0003

ところで、乳などに由来するカゼインを加水分解して得られるカゼイン加水分解物は、血中コレステロールや血中中性脂肪を低減させる作用や、脂質代謝改善作用等を有することが知られている（特許文献１〜３）。
また、遊離アミノ酸が５０質量％程度のカゼインの加水分解物が、脂質利用量を増加させるものの、エネルギー消費量には影響を与えないことが報告されている（非特許文献４）。
また、カゼイン加水分解物に含まれるＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチドが、アンジオテンシン変換酵素阻害作用及びブラジキニン不活性化抑制作用を有し、血圧降下に有効であることも知られている（特許文献４）。
また、乳清タンパク質を加水分解して得られる乳清タンパク質加水分解物は、消化管ホルモンＧＬＰ−２分泌促進作用やシステインプロテアーゼ阻害作用、インターロイキン−１８誘導作用等を有することが知られている（特許文献５〜７）。

0004

特許３９２０９３３号
特許５９７２２３５号
国際公開２００７／１４２２３０号パンフレット
国際公開２００３／０４４０４４号パンフレット
特許４２１９７０７号
特開２００５−１３９０８４号公報
特開２００９−１３７９８２号公報

0005

Levine JA，J．Intern．Med．2007 262(3) 273-287
Dulooo AG.et al., Am. J. Clin. Nutr. 1989 49(1) 44-50
Nurminen ML.et al., Eur J Clin Nutr. 1999 53(11) 831-9
Lillefosse et al., J. Nutrition, 2013 143(9) 1367-1375

0006

本発明は、エネルギー消費を促進させることが可能な技術を提供することを目的とする。

0007

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、特定の乳タンパク質分解物が、優れたエネルギー消費促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

0008

すなわち、本発明は、平均分子量が２２０ダルトン以上かつ１０００ダルトン以下である乳タンパク質分解物を有効成分として含有する、エネルギー消費促進剤又はエネルギー消費促進用組成物である（以降、「本発明のエネルギー消費促進用組成物」とも記す）。なお、本発明において組成物及び剤の用語は、同一の意味である。
本発明の一形態においてエネルギー消費促進用組成物は、好ましくは体温上昇用に用いられる。
また、本発明の一形態においてエネルギー消費促進用組成物は、運動後に摂取されることが好ましい。
また、本発明の一形態において、前記乳タンパク質はカゼイン又は乳清タンパク質であることが好ましい。
また、本発明の好ましい一形態において、前記乳タンパク質分解物は、タンパク質分解酵素による加水分解物である。
また、本発明の一形態において、前記乳タンパク質分解物は、少なくともＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏからなるペプチドを含むことが好ましい。
また、本発明の好ましい一形態において、前記エネルギー消費は、基礎代謝、食事誘発性熱産生、非運動性活動熱産生、及び運動による熱産生からなる群より選ばれるものに起因する。

0009

また、本発明のエネルギー消費促進用組成物は、エネルギー消費機能低下の治療及び／又は予防用、あるいはエネルギー消費促進用の医薬品の態様であることが好ましい。

0010

また、本発明の別の態様は、平均分子量が２２０ダルトン以上かつ１０００ダルトン以下である乳タンパク質分解物を有効成分として含有する、エネルギー消費促進用の飲食品組成物である。
また、本態様の飲食品組成物は、好ましくは体温上昇用に用いられる。
また、本態様の飲食品組成物は、運動後に摂取されることが好ましい。
また、本態様の飲食品組成物において、前記乳タンパク質はカゼイン又は乳清タンパク質であることが好ましい。
本態様において好ましくは、前記乳タンパク質分解物は、タンパク質分解酵素による加水分解物である。
また、本態様において、前記乳タンパク質分解物は、少なくともＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏからなるペプチド、又は該配列を含むペプチド（以降「ＭＫＰペプチド」とも記す）を含むことが好ましい。なお、前記Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏを含むペプチドとは、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏの配列を含み、そのＣ末端及び／又はＮ末端側に１又は複数個の任意のアミノ酸が付加したものをいう。ここで複数個とは、好ましくは２〜１０個をいうが特に限定されない。
本態様において好ましくは、前記エネルギー消費は、基礎代謝、食事誘発性熱産生、非運動性活動熱産生、及び運動による熱産生からなる群より選ばれるものに起因する。

0011

本発明によれば、安全性が高いエネルギー消費促進用組成物が提供される。本発明のエネルギー消費促進用組成物は、医薬品又は飲食品組成物に含有させることができ、エネルギー消費機能低下の治療、改善及び／又は予防やエネルギー消費の促進、運動後のエネルギー消費機能の改善、及び／又は増大に有効である。

0012

運動後にカゼイン分解物を摂取したときのエネルギー消費量の経時変化を表すグラフ。
安静時にカゼイン分解物を摂取したときのエネルギー消費量の経時変化を表すグラフ。
安静時にカゼイン分解物、乳清タンパク質分解物、又はＭＫＰペプチドを摂取した６０分間のエネルギー消費量を表すグラフ。

0013

次に、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。

0014

＜エネルギー消費促進用組成物＞
本発明のエネルギー消費促進剤及びエネルギー消費促進用組成物は、平均分子量が２２０ダルトン以上かつ１０００ダルトン以下である、乳タンパク質分解物を有効成分として含有する。

0015

本発明における乳タンパク質分解物の平均分子量は、前述の通り２２０ダルトン（以下、「Ｄａ」）以上１０００Ｄａ以下であるが、好ましくは２５０Ｄａ以上かつ４００Ｄａ以下であり、より好ましくは３００Ｄａ以上かつ３９０Ｄａ以下である。
なお、本発明において、カゼインの加水分解物を利用するときには、より好ましくは３５０〜３９０Ｄａの平均分子量のものを用いることが好ましく、乳清タンパク質の場合は３６０〜４００Ｄａの平均分子量のものを用いることが好ましい。
なお、非特許文献４のカゼイン加水分解物の平均分子量は、本発明におけるものよりも小さいと推測される。

0016

本発明における乳タンパク質分解物の平均分子量は、以下の数平均分子量の概念により求めるものである。
数平均分子量（Number Average of Molecular Weight）は、例えば文献（社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第１１６〜１１９頁、株式会社東京化学同人、１９７８年）に記載されているとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。
すなわち、タンパク質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、タンパク質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量（以下、Ｍｎと略記することがある。）は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖ｉの分子量がＭｉであり、その分子数をＮｉとすると、次の式により定義される。

0017

0018

本明細書において、乳タンパク質分解物の平均分子量は、以下の方法で測定及び算出したものをいう。すなわち、高速液体クロマトグラフィーを使用して、ポリヒドロキシエチル・アスパルタミド・カラム（Poly Hydroxyethyl Aspartamide Column：ポリ・エル・シー（Poly LC）社製；直径4.6×200mm）を用い、20mM塩化ナトリウム、50mMギ酸により溶出速度0.4mL／分で溶出する（宇井信生ら編、「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、化学増刊第１０２号、第２４１頁、株式会社化学同人、１９８４年）。検出は、ＵＶ検出器（島津製作所社製）を使用して行い、ＧＰＣ分析システム（島津製作所社製）によりデータ解析して数平均分子量を算出する。なお、分子量算出のための標品は、分子量が既知のタンパク質及び／又はペプチドを適宜用いればよい。

0019

タンパク質分解物には、一般に製造過程において遊離アミノ酸が含まれる。本発明における乳タンパク質分解物のアミノ酸遊離率は、好ましくは４０質量％以下であり、より好ましくは３５質量％以下であり、さらに好ましくは１５質量％以下であり、特に好ましくは１０質量％以下である。

0020

本明細書において、アミノ酸遊離率は、乳タンパク質分解物全体に対する遊離アミノ酸量の割合であり、以下の方法で測定・算定することができる。
トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミノ酸については、試料を６規定の塩酸で１１０℃、２４時間加水分解し、トリプトファンについては、水酸化バリウムで１１０℃、２２時間アルカリ分解し、システイン及びメチオニンについては、過ギ酸処理後、６規定の塩酸で１１０℃、１８時間加水分解し、それぞれアミノ酸自動分析機（日立製作所製、８３５型）により分析し、アミノ酸の質量を測定する。
上記の方法により試料中の各アミノ酸の組成を測定し、これを合計して試料中の全アミノ酸の質量を算出する。次いで、スルホサリチル酸で試料を除蛋白し、残留する各遊離アミノ酸の質量を上記の方法により測定し、これを合計して試料中の全遊離アミノ酸の質量を算出する。これらの値から、試料中の遊離アミノ酸含有率を次式により算出する。
アミノ酸遊離率（質量％）＝（全遊離アミノ酸の質量／全アミノ酸の質量）×１００

0021

上記のような乳タンパク質分解物は、通常は乳タンパク質を分解処理、好ましくは加水分解することにより好適に取得できる。乳タンパク質の分解処理としては、特に限定されないが、例えば酵素処理、酸処理、アルカリ処理、熱処理等が挙げられ、これらの２種以上の処理を適宜組み合わせてもよい。

0022

本明細書において乳タンパク質分解物は、特に限定されないがカゼイン分解物又は乳清タンパク質分解物が好ましい。
カゼイン分解物を取得するにあたり出発原料となるカゼインは、例えば、市販品の各種カゼイン；ミセラーカゼイン；乳酸カゼイン、塩酸カゼイン等の酸カゼイン；ナトリウムカゼイネイト、カリウムカゼイネイト、カルシウムカゼイネイト等のカゼイネイト等から選ばれる１種のもの又は２種以上の混合物が挙げられる。当該混合物は任意の割合で混合すればよい。
乳清タンパク質分解物を取得するにあたり出発原料となる乳清タンパク質は、特に限定されないが、市販の各種乳清タンパク質、例えば、乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）等が好ましい。また、牛乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳から乳清蛋白質を常法により精製することもできる。
また、前記カゼイン又は乳清タンパク質は、牛乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳等から公知の方法によって単離されたカゼイン又は乳清タンパク質であることが好ましい。

0023

以下に乳タンパク質分解物の好適な取得方法を説明するが、特にこれに限定されるものではない。
原料乳タンパク質を水又は温湯に分散し、溶解して乳タンパク質水溶液を調製する。当該乳タンパク質水溶液の濃度は、特に限定されないが、通常、タンパク質濃度として２質量％以上、さらに好ましくは５〜１５質量％程度の濃度範囲に設定するのが好適である。
さらに、前記乳タンパク質水溶液を、ナトリウム型又はカリウム型陽イオン交換樹脂（好適には強酸性陽イオン交換樹脂）を用いたイオン交換法、電気透析法、限界濾過膜法、ルーズ逆浸透膜法等で脱塩し、適宜ｐＨ調整やカルシウム濃度調整を行うのが好適である。脱塩の際には、カラム式やバッチ式の何れを採用してもよい。また、乳タンパク質水溶液を、脱塩前等に適宜、加熱殺菌をおこなってもよい。

0024

次いで、前記乳タンパク質水溶液を、加水分解処理する。当該加水分解処理として、例えば酵素処理、酸処理、アルカリ処理、熱処理等が挙げられ、これらの２種以上の処理を適宜組み合わせてもよい。
本開示のタンパク質分解酵素は、例えば、植物由来、動物由来、微生物由来等が挙げられ、これらから１種又は２種以上組み合わせて使用できる。当該タンパク質分解酵素としては、エンドプロテアーゼが好適である。
前記エンドプロテア−ゼとしては、例えば、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼが挙げられ、これらを１種又は２種以上選択して用いることができる。このうち、セリンプロテアーゼ及び/又はメタロプロテアーゼを用いるのが好適である。
また、プロテアーゼは、アルカリ性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ及び酸性プロテアーゼに分類される。このうち中性プロテアーゼを用いるのが好適である。

0025

前記タンパク質分解酵素は、市販品を用いることができる。前記タンパク質分解酵素として、例えば、ビオプラーゼ（長瀬生化学工業社製）、プロレザー（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＳ（天野エンザイム社製）、ＰＴＮ６．０Ｓ（ノボザイムズ社製）、サビナーゼ（ノボザイムズ社製）、ＧＯＤＯ Ｂ．Ａ．Ｐ（合同酒精社製）、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製）、ＧＯＤＯ Ｂ．Ｎ．Ｐ（合同酒精社製）、ニュートラーゼ（ノボザイムズ社製）、アルカラーゼ（ノボザイムズ社製）、トリプシン（ノボザイムズ社製）、キモトリプシン（ノボザイムズ社製）、スブチリシン（ノボザイムズ社製）、パパイン（天野エンザイム社製）、ブロメライン（天野エンザイム社製）等が挙げられ、これらから１種又は２種以上の酵素を選択して用いてもよい。
これらのうち、スブチリシン（subtilisin：例えば、ビオプラーゼ）、トリプシン（trypsin：例えばＰＴＮ６．０Ｓ）、及びバシロシン（bachillolysin：例えばプロテアーゼＮ）から選ばれる１種又は２種以上の中性プロテアーゼが好ましく、より好ましくはこれら３種を組み合わせて用いる。

0026

前記乳タンパク質に対するエンドプロテア−ゼの使用量は、特に限定されず、基質濃度、酵素力価、反応温度及び反応時間等により適宜調整すればよいが、一般的には、乳タンパク質中のタンパク質１ｇ当り２，０００〜１１，０００活性単位の割合で添加することが好ましい。
前記タンパク質分解酵素による加水分解条件を適宜調整することにより、本発明に係る特定の平均分子量の範囲の乳タンパク質分解物を得ることができる。

0027

前記タンパク質分解酵素による加水分解前に、前記原料乳タンパク質溶液のｐＨを、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム等の食品上使用可能な塩類を用いて、使用酵素の至適ｐＨに調整することもできる。前記原料乳タンパク質溶液のｐＨは、好ましくは５〜１０、より好ましくは７〜１０に調整する。

0028

前記タンパク質分解酵素の反応温度は、使用酵素の最適温度の範囲で行うことが望ましく、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは４０〜６０℃で行う。
前記タンパク質分解酵素の反応保持時間は、前記特定の非タンパク態窒素比率になるように適宜調整すればよく、例えば０．５〜２４時間で行うことが可能であり、好ましくは１〜１５時間、より好ましくは３〜１０時間である。
前記タンパク質分解酵素による加水分解は、当該酵素を加熱して失活させて終了させればよい。例えば、１００℃以上（好適には１１０〜１３０℃）で失活させる場合には１〜３秒間、１００℃未満６０℃以上で失活させる場合には３〜４０分間で行うことが好適である。
加水分解終了後、必要に応じて分解液のｐＨを、好ましくは６〜８、より好ましくは７．０±０．５、さらに好ましくは７．０±０．３とするのが好適である。

0029

なお、本発明に係る乳タンパク質分解物の製造において、カルシウム濃度未調整の溶液を加水分解した場合には、得られた分解液を、前記のような脱塩処理し、カルシウム濃度を調整してもよい。次いで、常法により加熱して酵素を失活させる。反応加熱温度と反応保持時間は使用した酵素の熱安定性を配慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができる。加熱失活後、常法により冷却し、そのまま利用することもでき、必要に応じて濃縮して濃縮液を得ることもでき、更に濃縮液を乾燥し、粉末製品を得ることも可能である。

0030

また、前記乳タンパク質水溶液を酸処理又はアルカリ処理にて加水分解する際には、乳タンパク質水溶液のｐＨを調整して処理すればよい。当該ｐＨ調整による処理の場合には、乳タンパク質水溶液のｐＨが、好ましくはｐＨ５以下又はｐＨ９以上であり、より好ましくはｐＨ４以下又はｐＨ１０以上である。このようにｐＨ処理された水溶液は、室温にて数分以上、好ましくは５分〜１時間、放置又は撹拌することによって、酸処理又はアルカリ処理の加水分解物を得ることができる。ここで、「室温」とは、４〜４０℃程度であるが、１０〜３０℃が好適である。
また、前記乳タンパク質水溶液を、熱処理にて加水分解してもよい。この乳タンパク質水溶液は、ｐＨ未調整でもよく、またｐＨ調整（具体的には、酸性（ｐＨ５以下）、中性（ｐＨ６〜８）、アルカリ性（ｐＨ８以上））してもよい。熱処理は、４〜１００℃程度で、上記酸アルカリ処理のような条件にて行えばよい。

0031

得られた乳タンパク質加水分解物は、未精製のままの状態で使用しても効能を発揮することが可能であるが、さらに、適宜公知の分離精製を行ってもよい。例えば、得られた乳タンパク質加水分解物に対して分子量分画を行い、本発明に係る平均分子量及びアミノ酸遊離率の範囲を満たす乳タンパク質分解物を得ることができる。
分子量分画として、例えば、限外濾過、ゲル濾過等の方法が採用でき、これにより不要な分子量のペプチドや遊離アミノ酸の除去率を高めることができる。
限外濾過の場合には、所望の限外濾過膜を使用すればよく、ゲル濾過の場合には、所望のサイズ排除クロマトグラフィーに用いるゲルろ過剤を使用すればよい。
さらに、脱塩や不純物を除去したり、純度を高めたりするために、公知の分離精製方法（例えば、イオン交換樹脂等）を用いてもよい。

0032

本発明において乳タンパク質分解物は少なくともＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏのアミノ酸配列からなるトリペプチド又は前記配列を含むペプチド（総称して、「ＭＫＰペプチド」という）を含むことが好ましい。前記ここで前記ＭＫＰペプチドはその塩類の形態で含まれていてもよい。なお、Ｍｅｔはメチオニン残基を、Ｌｙｓはリジン残基を、Ｐｒｏはプロリン残基をそれぞれ示す。
本発明においてＭＫＰペプチドは、大豆、卵、小麦、大麦、米、じゃが芋、さつま芋、えんどう豆、トウモロコシ、畜肉、魚肉、魚介などに由来するタンパク質を分解処理して取得したものであってもよいし、該分解処理物からＭＫＰペプチドをさらに単離・精製したものであってもよいし、化学合成又は生合成によりＭＫＰペプチドを取得したものであってもよい。
なお、本明細書において有効成分として「乳タンパク質分解物」というときは、上記の如く乳以外に由来するタンパク質を分解処理して得たＭＫＰペプチドや、化学合成又は生合成により得たＭＫＰペプチドをも含む概念とする。

0033

なお、本発明においてＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏのアミノ酸配列を含むペプチドとは、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏの配列のＮ末端又はＣ末端にペプチド残基が１又は複数個の任意のアミノ酸が付加したものをいい、より具体的には１〜１０残基、望ましくは１〜５残基、さらに望ましくは１〜３残基付加したペプチドであって、かつエネルギー消費の促進作用を有する配列が望ましい。例えば、配列番号１〜４に記載された配列が好適に挙げられるが、これらに限らない。

0034

本発明において、乳タンパク質加水分解物中のＭＫＰペプチドの含有率は特に限定されないが、その下限値は、本発明の効能をより良好に発揮させる観点から、好ましくは０．００１質量％以上であり、０．００５質量％以上であり、より好ましくは０．０１質量％以上であり、その上限値は、本発明の分解物の製造効率の観点から、好ましくは１質量％以下であり、より好ましくは０．５質量％以下であり、さらに好ましくは０．２質量％以下であり、よりさらに好ましくは０．１質量％以下である。当該ＭＫＰペプチドの含有率 として、より好ましくは０．００１〜１質量％、さらに好ましくは０．００５〜０．５質量％、よりさらに好ましくは０．０１〜０．１質量％である。

0035

なお、本発明において、ＭＫＰペプチド含有量は、下記の方法にて測定できる。
（ａ）試料粉末を、１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、０．２％ギ酸水溶液に希釈溶解し、１０分間超音波破砕したのち、０．２２μｍ口径のＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でろ過して粉末溶液を調製し、下記測定条件によるＬＣ／ＭＳ分析を実施する。一方、ＭＫＰペプチドの化学合成標準ペプチド（ペプチド研究所社製）の溶解液を濃度別に数点調製し、下記測定条件によるＬＣ／ＭＳ分析を実施し、検量線を作成する。
前記粉末溶液の分析におけるピークのうち、標準ペプチドと分子量及びリテンションタイムが一致するものを、標準ペプチドと同一の配列として同定する。標準ペプチドのピーク面積と資料粉末のピーク面積を対比することにより、前記粉末溶液中にＭＫＰペプチドの含有量を求める。

0036

（ｂ）ＭＫＰペプチド含有量（ｍｇ／カゼイン加水分解物１ｇ）
ＭＫＰ含有量（ｍｇ／カゼイン加水分解物１ｇ）＝〔得られたカゼイン加水分解物中のＭＫＰペプチド測定値（ｍｇ）〕／〔得られたカゼイン加水分解物の質量（ｇ）〕
〔得られたカゼイン加水分解物中のＭＫＰペプチド測定値（ｍｇ）〕は、下記「ＬＣ／ＭＳ」による、試料中のＭＫＰペプチドの測定値である。

0037

（ｃ）ＬＣ／ＭＳ使用機器
質量分析計：ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）。
高速液体クロマトグラフ：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ （島津製作所社製）、カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ３００ Ｃ１８ φ２．１ ｍｍ×２５０ ｍｍ，３．５ μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）。

0038

（ｄ）ＬＣ／ＭＳ測定条件
移動相Ａ：０．２重量％ギ酸−水溶液
移動相Ｂ：０．２重量％ ギ酸−アセトニトリル溶液
タイムプログラム：２％Ｂ（０．０分）−２５％Ｂ（５．０分）−６５％Ｂ（５．１分）−６５％Ｂ（１０分）−８５％Ｂ（１０．１分）−８５％Ｂ（１３．０％）−２％Ｂ（１３．１分）−ＳＴＯＰ（３０．０分）。
試料注入量：１０μＬ、カラム温度：４０℃、液体流量：２００μＬ／ｍｉｎ
分析モード：ＳＲＭ測定。
Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｍａｓｓ：ｍ／ｚ＝２６０．１０（Ｐａｒｅｎｔ ｍ／ｚ ＝ ３７５．２１）

0039

本発明に係る乳タンパク質分解物は、エネルギー消費の促進作用を有する。
エネルギー消費量は、間接熱量測定法によりエネルギー消費量を求めることができる。エネルギー消費量の算出にはTadaishi et al.PLoS One. 2011 6(12) e28290.（文献名等）2011ら の方法に従って、以下の式を用いることにより求めることができる。
エネルギー消費量（ｃａｌ／ｍｉｎ）＝３．９１ ＶＯ２（ｍｌ／ｍｉｎ）＋１．１０ＶＣＯ２（ｍｌ／ｍｉｎ）

0040

本発明において、エネルギー消費とは、特に限定されないが、基礎代謝によるエネルギー消費と、食事に起因する食事誘発性熱産生によるエネルギー消費、日常的な身体活動に起因する非運動性活動熱産生によるエネルギー消費、及び運動に起因する熱産生とを含むものと考えられる。
なお、本明細書において運動とは、健康のため、体を鍛えるため、楽しみのために計画的・意図的に実施するスポーツ、ウォーキング、ジョギング等の活動であり、身体活動とは、労働、家事、通勤・通学、趣味等の運動を除く日常の生活における身体活動を指す。
また、本発明において、エネルギー消費の促進とは、通常のエネルギー消費レベルから増強させてエネルギー消費量を増大させること、諸々の原因により低下したエネルギー消費レベルを回復させてエネルギー消費量を通常又はそれ以上にまで増大させること、及び／又は、運動後に増加するエネルギー消費をさらに促進させることを含む。
したがって本発明に係る乳タンパク質分解物は、エネルギー消費の促進用途や、エネルギー消費機能低下の治療、改善及び／又は予防用途のために用いることができる。さらに、エネルギー消費機能の向上、エネルギー消費機能低下に関わる様々な状態や疾患の制御、例えば免疫力向上、体力向上、血流改善、疲労改善、肥満の予防及び／又は改善、ダイエット、メタボリックシンドロームの予防及び／又は改善、糖尿病等の生活習慣病の予防及び／又は改善について効果を期待できる。

0041

さらに本発明に係る乳タンパク質分解物は、運動後に増加するエネルギー消費をさらに促進できるので、運動時及び／または運動後に投与することにより、運動後に増加するエネルギー消費をさらに増加させることが可能である。したがって全身の発汗向上、身体の温熱効果向上、新陳代謝の促進等が期待でき、肥満予防、ダイエット、メタボリックシンドロームの予防、改善について効果を期待できる。

0042

一般に、エネルギー消費量の大部分は熱として失われることから（井上芳光、近藤徳彦編集「体温II−体温調節システムとその適応」有限会社NAP社）、本発明に係る乳タンパク質分解物は、体温上昇、特に深部体温上昇の効果が得られる。したがって、本発明のエネルギー消費促進用組成物は、体温上昇のために用いることができる。
本発明に係る乳タンパク質分解物は、体温の上昇作用を有するので、生体の体温を正常な状態に戻す、またはより高めることによる体温低下の予防や改善、末梢血流の改善、発汗作用の亢進、体感作用が期待される。また、持続する低体温状態を原因とする低血圧、内臓機能低下（便秘・下痢）、免疫力低下、血行不良（冷え・肩こり・腰痛・関節痛）、睡眠障害、新陳代謝低下（肥満）疾患等の治療や改善や予防に用いることができる。

0043

なお、好ましくは、本発明に係る乳タンパク質分解物の使用目的からは、血中コレステロールや血中中性脂肪を低減させる目的や、脂質代謝を改善させる目的で用いる態様を除く。

0044

前述した疾患又は状態に対する本発明のエネルギー消費促進剤及び組成物の適用は、適用対象であるヒト又はヒト以外の動物（特に、哺乳動物）に対するものとすることができる。また、その適用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。なお、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
すなわち、本発明の別の態様は、本発明のエネルギー消費促進剤及び組成物を対象に投与する工程を含む、エネルギー消費を促進する方法である。さらには、エネルギー消費を促進することにより、前述した疾患又は状態を治療、改善及び／又は予防する方法であってもよく、また、対象の体温を上昇させる方法であってもよい。

0045

本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転；疾患、症状又は状態の悪化の防止、遅延若しくは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、適用対象における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、或いは適用対象の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。

0046

本発明は、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び／又は改善用組成物の製造における、乳タンパク質分解物の使用とも言うことができる。
本発明は、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び／又は改善のために用いられる、乳タンパク質分解物とも言うことができる。
本発明は、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び／又は改善における、乳タンパク質分解物の使用とも言うことができる。
本発明は、乳タンパク質分解物を、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び／又は改善が必要な対象に投与することを含む、エネルギー消費低下により引き起こされる疾患を予防及び／又は改善する方法とも言うことができる。

0047

本発明は、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び／又は改善用組成物の製造における、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドの使用とも言うことができる。
本発明は、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び／又は改善のために用いられる、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドとも言うことができる。
本発明は、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び／又は改善における、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドの使用とも言うことができる。
本発明は、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏからなるペプチド、又は前記アミノ酸配列を含むペプチドを、エネルギー消費機能低下により引き起こされる疾患の予防及び／又は改善が必要な対象に投与することを含む、エネルギー消費低下により引き起こされる疾患を予防及び／又は改善する方法とも言うことができる。

0048

本発明のエネルギー消費促進剤又は組成物は、上述のようなエネルギー消費の促進及び／又はエネルギー消費機能低下が関与する疾病、疾患や症状のための、又はエネルギー消費の促進及び/又はエネルギー消費機能低下等の予防、改善及び／又は治療のための、ヒト用若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、皮膚外用剤、化粧品及び食品等の有効成分としてこれらに配合して使用可能である。また、本明細書に係る乳タンパク質分解物は、これら各種製剤の製造のために使用可能である。
本発明のエネルギー消費促進用組成物における乳たんぱく質分解物の含有量は、最終組成物に対し、０．００１〜１００質量％に設定することができる。
また、本発明のエネルギー消費促進用組成物におけるＭＫＰペプチドの含有量は、最終組成物に対し、０．００００１〜１質量％に設定することができる。
なお、本明細書において、最終組成物とは、対象者に投与するとき又は対象者が摂取するときの組成物のことをいう。
本発明では、対象者に対する乳たんぱく質分解物の使用量は、好ましくは、０．０００１〜１ｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは０．０００５〜０．５ｇ／ｋｇ体重／日、さらに好ましくは０．０００１〜０．１ｇ／ｋｇ体重／日である。

0049

＜医薬品＞
本発明のエネルギー消費促進用組成物は、医薬品の態様とすることが好適である。その場合、経口投与剤や非経口投与剤等とすることができる。
本発明のエネルギー消費促進用組成物の一態様である医薬品組成物は、経口投与及び非経口投与の何れでもよいが、経口投与が望ましい。非経口投与として、静注、直腸投与、吸入等が挙げられる。かかる医薬品は、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤等に製剤化することができる。
製剤化に際しては、本明細書に係る乳タンパク質分解物の他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、公知の又は将来的に見出される上述のエネルギー消費促進作用等を有する薬、脂質代謝異常改善薬、高脂血症治療薬などを併用することも可能である。
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。

0050

賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。

0051

結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。

0052

崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。

0053

滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。

0054

安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。

0055

矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤等が挙げられる。

0056

本発明の医薬品組成物を摂取するタイミングは、特に限定されないが、例えば食前２時間〜食後２時間の範囲内で摂取又は投与することが好ましく、食前１時間〜食後１時間がより好ましい。また、摂取前後の状態は、運動または安静のいずれでもよい。さらに本発明のエネルギー消費促進剤は運動前の１時間〜運動後1時間の範囲内で摂取又は投与することが好ましく、特に運動開始直前〜運動終了直後に摂取又は投与することが好ましい。

0057

＜飲食品組成物＞
本発明のエネルギー消費促進剤又は組成物を食品に配合する場合には、上述のエネルギー消費の促進及び／又はエネルギー消費機能低下によって引き起こされる各種疾患等の予防、改善又は治療用途が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。また、本明細書に係る乳タンパク質分解物は、これら食品等の製造のために使用可能である。

0058

かかる「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本発明の「表示」行為に該当する。
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。

0059

一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。

0060

また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、医薬部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、若しくは機能性表示食品に係る制度、又はこれらに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。具体的には、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示、科学的根拠に基づいた機能性の表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法に規定する特別用途表示の許可等に関する内閣府令（平成二十一年八月三十一年内閣府令第五十七号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
かかる表示としては、例えば、運動中及び／又はダイエット中である人を対象として、「エネルギー消費を向上させたい方」、「代謝を向上させたい方」、「体脂肪を減らしたい方」等と表示することが挙げられる。
または、高齢者及び/又は免疫力が低下した人、基礎代謝能力が低下した人を対象として、「基礎代謝の低下が気になる方」「体をあたためたい方」「冷え症の方」「疲労を感じている方」等と表示することが挙げられる。

0061

また、本明細書に係る乳タンパク質分解物を有効成分として飲食品中に含有させ、本明細書に係る乳タンパク質分解物及びこれを有効成分として含有する上述の各種製剤の一態様として、上述のエネルギー消費促進作用等を有する食品として加工することも可能である。

0062

このような食品として、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食、飼料（ペット用を含む）等のほか、例えば、小麦粉製品、即席食品、農産加工品、水産加工品、畜産加工品、乳・乳製品、油脂類、基礎調味料、複合調味料・食品類、冷凍食品、菓子類、飲料類、これら以外の市販食品等が挙げられる。
前記小麦粉製品として、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等が挙げられる。
前記即席食品類として、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
前記農産加工品として、 農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等が挙げられる。
前記水産加工品として、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。
前記畜産加工品として、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
前記乳・乳製品として、加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等が挙げられる。
前記油脂類として、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
前記基礎調味料として、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられる。
前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。 例えば、前記冷凍食品として、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
前記菓子類として、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
前記飲料類として、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
上記以外の市販食品として、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等が挙げられる。

0063

本発明に係るエネルギー消費促進剤、並びにこれを含有する医薬品及び飲食品組成物における、本明細書に係る乳タンパク質分解物の含有量は、剤又は組成物の最終物に対し、少なくとも０．００１質量％であることが好ましい。
本明細書に係る乳タンパク質分解物の摂取量又は投与量は、年齢、症状等により異なるが、通常、０．００１ｇ〜０．５ｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．００６ｋｇ〜０．３３４ｇ／ｋｇであり、さらに好ましくは０．０１５ｇ〜０．１６７ｇ／ｋｇ体重であり、特に好ましくは０．０３ｇ〜０．１ｇ／ｋｇ体重であり、１日１回から３回に分けて投与してもよい。
本明細書に係るＭＫＰペプチドの摂取量又は投与量は、年齢、症状等により異なるが、通常、０．４μｇ〜２００μｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは２．４μｇ〜１３０μｇ／ｋｇであり、さらに好ましくは６μｇ〜６６．８μｇ／ｋｇ体重であり、特に好ましくは１２μｇ〜４０μｇ／ｋｇ体重であり、１日１回から３回に分けて投与してもよい。

0064

なお、前記乳タンパク質分解物はタンパク質であることから、１日のタンパク質摂取量と前記乳タンパク質分解物摂取量の比からヒトへの投与の際の用量を推測することができる。
乳タンパク質分解物のマウスへの投与量（タンパク質換算量）は、マウスの体重を２２ｇとして算出すると約１１〜２２ｍｇ／個体であり、接餌量を３．５ｇ／日、餌に対するタンパク質量を２０．７％として算出すると、食餌によって摂取するタンパク質の約１．５〜３．０質量％に相当する。これをヒトに換算した場合、一日のタンパク質摂取量を成人男性６０ｇ、成人女性５０ｇとして算出すると、成人男性約０．９〜１．８ｇ、成人女性約０．７５〜１．５ｇとなる。

0065

以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

0066

＜１＞乳タンパク質分解物の取得
（１）カゼイン分解物の取得
市販のカゼイン（ニュージーランドデーリーボード製）１００ｇに水９００ｇを加え、よく分散させ、水酸化ナトリウムを添加して溶液のｐＨを７．０に調整し、カゼインを完全に溶解し、濃度約１０質量％のカゼイン水溶液を調製した。該カゼイン水溶液を８５℃ で１０分間加熱殺菌し、５０℃に温度調整し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを９．５ に調整した後、ビオプラーゼｓｐ−２０（長瀬生化学工業社製）１００，８００活性単位（タンパク質１ｇ当り１，２００活性単位）、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製）１６８，０００活性単位（タンパク質１ｇ当り２，０００活性単位）、及びＰＴＮ６．０Ｓ（ノボザイムズ・ジャパン社製）５８８，０００活性単位（タンパク質１ｇ当り７，０００活性単位）を添加して、加水分解反応を開始した。カゼインの分解率が２４．１％に達した時点で、８０℃で６分間加熱して酵素を失活させて酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。この加水分解液を分画分子量３，０００の限外ろ過膜（旭化成社製）で限外ろ過し、濃縮後凍結乾燥し、凍結乾燥品を得た。
得られた加水分解物の分子量及び遊離アミノ酸量を前述の方法にて測定したところ、平均分子量は３６０Ｄａ、アミノ酸遊離率は１０質量％以下、分子量２００〜５００のペプチドが５３質量％含まれているカゼイン加水分解物を得た。

0067

（２）乳清タンパク質分解物の取得
市販の牛乳乳清タンパク質濃縮物２．６ｋｇ（ミライ社製。タンパク質当量として２ｋｇ）を脱イオン水１８ｋｇに溶解し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を使用して、ｐＨを７．２に調整し、タンパク質濃度約１０％の乳清タンパク質水溶液２０．６ｋｇを調製した。該乳清タンパク質水溶液をプレート式熱交換器を使用して８０℃で６分間加熱殺菌し、液温を５３℃に調整し、１０％水酸化カリウム水溶液を使用して、ｐＨを９．０に調整し、エンドプロテアーゼであるＰＴＮ６．０Ｓ（ノボザイムズ社製）、プロテアーゼＮアマノ（天野エンザイム社製）、及びアルカラーゼ２．４Ｌ（天野エンザイム社製）をそれぞれタンパク質１ｇ当たり５０００活性単位、２０００活性単位、及び５００活性単位の割合で添加し、タンパク質加水分解反応を開始した。１０時間経過し、分解率が２０％となった時点で、１２０℃で３秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
この加水分解液を、孔径０．４５μｍの精密濾過膜（ミリポア社製）により膜分画し、透過画分としてタンパク質加水分解物水溶液約１８ｋｇを得た。該タンパク質加水分解物水溶液の液温を５５℃に調整し、エキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野エンザイム社製）をタンパク質当量１ｇ当たり５００活性単位の割合で添加し、第二のタンパク質加水分解反応を開始した。１０時間経過し、分解率を７％増加し、かつ最終的な分解率が２７％となった時点で、プレート式熱交換器を使用して１２０℃で３秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
得られた乳清加水分解物の分子量及び遊離アミノ酸を前述の方法にて測定したところ、平均分子量は３６０Ｄａ、アミノ酸遊離率は１２質量％以下、分子量２００〜５００のペプチドが４５質量％含まれていた。

0068

（３）ＭＫＰペプチドの取得１
市販のカゼイン（ニュージーランドデーリーボード製）１００ｇに水９００ｇを加え、よく分散させ、水酸化ナトリウムを添加して溶液のｐＨを７．０に調整し、カゼインを完全に溶解し、濃度約１０％のカゼイン水溶液を調製した。該カゼイン水溶液を８５℃で１０分間加熱殺菌し、５０℃に温度調整し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを９．５に調整した後、ビオプラーゼｓｐ−２０（長瀬生化学工業社製）１００，８００活性単位（タンパク質１ｇ当り１，２００活性単位）、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製）１６８，０００活性単位（タンパク質１ｇ当り２，０００活性単位）、及びＰＴＮ６．０Ｓ（ノボザイムズ・ジャパン社製）５８８，０００活性単位（タンパク質１ｇ当り７，０００活性単位）を添加して、加水分解反応を開始した。カゼインの分解率が２４．１％に達した時点で、８０℃で６分間加熱して酵素を失活させて酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。この加水分解液を分画分子量３，０００の限外ろ過膜（旭化成社製）で限外ろ過し、濃縮後凍結乾燥し、凍結乾燥品８５ｇを得た。

0069

上記で得たカゼイン加水分解物に対して逆相ＨＰＬＣによる分離を行った。ＨＰＬＣ条件は以下に示す条件１の通り。
［ＨＰＬＣ条件１］
カラム：カプセルパックＣ１８（ＵＧ１２０、５μｍ）２０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ（資生堂）
検出：ＵＶ２１５ｎｍ
流速：１６ｍｌ／分
溶離液Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む１％アセトニトリル水溶液
溶離液Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含む２５％アセトニトリル水溶液
溶離液Ａ１００％から、４０分後に溶離液Ｂ１００％になるような直線グラジエント条件で、加水分解物を分離した。

0070

リテンションタイム２２分に溶出された画分に含まれるペプチドを精製するため、さらに下記条件２によるＨＰＬＣによる分離を行った。
［ＨＰＬＣ条件２］
カラム：カプセルパックＣ１８（ＵＧ３００、５μｍ）２．０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ（資生堂）
検出：ＵＶ２１５ｎｍ
流速：０．２ｍｌ／分
溶離液Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む１％アセトニトリル水溶液
溶離液Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含む１０％アセトニトリル水溶液
溶離液Ａ１００％から１５分後に溶離液Ｂ１００％になるような直線グラジエント条件で、リテンションタイム１３分のピークに含まれるペプチドを凍結乾燥した。
なお、該凍結乾燥品は、特許文献４に記載される通り、Ｈ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨの構造を有するトリペプチド（ＭＫＰペプチド）を含むことが確認された。
該凍結乾燥品８５ｇ中のＭＫＰペプチド含有量は４３．５ｍｇであった。

0071

（４）ＭＫＰペプチドの取得２
ペプチドシンセサイザー（Ｍｏｄｅｌ４３３Ａ型、アプライドバイオシステムズ社） を使用し、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ（アプライドバイオシステムズ社）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（アプライドバイオシステムズ社）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ Ｒｅｓｉｎ（ 渡辺化学工業（株））を原料に用いて、固相合成法によりトリペプチドＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏを合成した。操作はアプライドバイオシステムズ社のマニュアルに従って行った後、脱保護した。このペプチドは、前述のＨＰＬＣ条件１で精製し、精製物について質量分析によりＭＫＰペプチドであることを確認した。

0072

＜２＞乳タンパク質分解物の投与
以下の実施例により、乳タンパク質分解物のエネルギー消費促進作用を検討した。
（１）運動後の投与
雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１６時間絶食させた後に、１５ｍ／分で６０分間のトレッドミル走行を行わせた。その後、３群に分け（各群ｎ＝８）、糖質及びカゼイン加水分解物（Ｇｌｕ＋Ｐｅｐ、１．５ｍｇ＋０．５ｍｇ／ｇ体重）、糖質及びカゼイン加水分解物と同組成のアミノ酸混合物（Ｇｌｕ＋ＡＡ、１．５ｍｇ＋０．５ｍｇ／ｇ体重）、又は糖質のみ（Ｇｌｕ、１．５ｍｇ／ｇ体重）を各群に経口投与した。カゼイン加水分解物と同組成のアミノ酸混合物は、カゼイン加水分解物を全てアミノ酸まで分解した際のアミノ酸組成に合わせて20種の結晶アミノ酸を混合、調製した。なお、糖質としてはグルコースを用い、カゼイン加水分解物は前述の＜１＞で調製したものを用いた。投与３０分後から投与１２０分まで、呼気ガスを連続的に採取し、呼気中の酸素濃度、二酸化炭素濃度から、間接熱量測定法によりエネルギー消費量を求めた。なお、エネルギー消費量の算出にはTadaishi et al.PLoS One. 2011 6(12) e28290.らの方法に従い、以下の式を用いた。
エネルギー消費量（ｃａｌ／ｍｉｎ）＝３．９１ ＶＯ２（ｍｌ／ｍｉｎ）＋１．１０ＶＣＯ２（ｍｌ／ｍｉｎ）
また、統計処理には、二元配置分散分析およびTukeyのHSD検定を用いた。エネルギー消費量の測定結果を図１に示す。糖質のみを投与した群、並びに糖質及びアミノ酸混合物を投与した群と比較して、糖質及びカゼイン加水分解物を投与した群では、エネルギー消費量が有意に高値を示した（ｐ＜０．０１）。この結果から、運動後のカゼイン加水分解物の摂取は、同組成のアミノ酸摂取と比較してエネルギー消費量を増大させる効果を有することがわかる。

0073

（２）安静時の投与１
雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１時間絶食させた後に、４群に分け（各群ｎ＝７）、カゼイン加水分解物（Ｐｅｐ）、カゼイン（Ｃａｓ）、カゼイン加水分解物と同組成のアミノ酸混合物（ＡＡ）、又は水（Ｗａｔｅｒ）を各群に１．０ｍｇ／ｇ体重ずつ経口投与した。なお、カゼイン加水分解物は前述の＜１＞で調製したものを用い、カゼインは＜１＞で加水分解する前の原料を用いた。投与５分後から投与１２０分までのエネルギー消費量を前述の（１）と同様に求めた。また、統計処理には（１）と同様に、二元配置分散分析およびTukeyのHSD検定を用いた。
エネルギー消費量の測定結果を図２に示す。水、及びアミノ酸混合物を投与した群と比較し、カゼイン加水分解物の摂取は、エネルギー消費量が有意に高値を示した（ｐ＜０．０１）。また、カゼインを投与した群との比較においても、カゼイン加水分解物を摂取した群ではエネルギー消費量が高値を示した（ｐ＜０．０５）。この結果から、カゼインをタンパク質やアミノ酸の状態で摂取することと比較し、カゼインを加水分解したカゼイン加水分解物の状態で摂取することによって、効率的にエネルギー消費を促進させることがわかる。

0074

（３）安静時の投与２
雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを実験動物に用い、安静、カゼイン加水分解物、ＭＫＰペプチド、乳清タンパク質加水分解物投与群の４群に分けた。マウスに１時間の絶食をさせた後に、カゼイン加水分解物及び乳清タンパク質加水分解物はそれぞれ１．０ｍｇ／ｇ体重、ＭＫＰペプチドは０．４μｇ／ｇ体重を経口投与し、エネルギー消費量を測定した。実験に用いたマウスは、各群ｎ＝１２とし、ランダム化クロスオーバー試験にて実施した。
なお、カゼイン加水分解物、乳清タンパク質加水分解物は、前述の＜１＞（１）〜（２）で調製したものを、ＭＫＰペプチドは合成ペプチドをペプチド研究所より購入し用いた。投与から６０分間のエネルギー消費量を求めた。
投与後６０分間のエネルギー消費量の平均値を図３に示す。安静群と比較し、カゼイン加水分解物、ＭＫＰペプチド、および乳清タンパク質加水分解物の全ての群でエネルギー消費量が高値を示した。これらの結果から、乳タンパク質を構成するカゼインおよび乳清タンパク質の加水分解物、またはＭＫＰペプチドを摂取することにより、エネルギー消費量が高まることが分かる。

0075

＜製造例１＞
牛乳又は脱脂乳に、実施例１で製造されたカゼイン加水分解物並びにスクラロース（三栄源エフエフ社製）及び希少単糖（商品名：レアシュガースウィート（松谷化学工業社製））を配合し、（Ａ）乳タンパク質３．５質量％以上、（Ｂ）乳脂肪３．５質量％以下、（Ｃ）炭水化物５．０質量％以上、及び（Ｄ）カルシウム０．１５質量％以上を含むように調乳液を調製する。
当該調乳液と乳酸菌及びビフィズス菌を均一に混合した混合物を発酵させる。これにより、カゼイン加水分解物及び難消化性デキストリンを含むエネルギー消費用組成物（発酵乳）を得る。当該発酵乳には、（Ｅ）実施例１のカゼイン加水分解物０．３〜０．８質量％、（Ｆ）難消化性デキストリン４〜８質量％、（Ｇ）スクラロース０．０５〜０．０２質量％、（Ｈ）Ｄ−プシコース及びＤ−アロース０．０５〜０．１質量％、及び（Ｉ）ラクチュロース１〜４質量％が含まれる。
カゼイン加水分解物の摂取量が、０．０００１〜１ｇ／ｋｇ体重／日、になるように、本発明のエネルギー消費用組成物を毎日継続して摂取する。これにより、エネルギー消費促進効果が期待できる。

0076

＜製造例２＞
表１に示す各成分（粉末）を混合して、エネルギー消費用組成物の粉末を得る。当該粉末は、サプリメントとして使用することができ、また水と混合することで飲料とすることができる。また、当該粉末は、カブセル容器に充填又はカプセル皮膜することで、エネルギー消費用のカプセル剤とすることができる。当該粉末は、圧縮成形することで、エネルギー消費促進用の錠菓とすることができる。当該粉末により、エネルギー消費促進の効果が期待できる。なお、当該粉末の原料のカゼイン分解物として、実施例１のカゼイン加水分解物を使用することができる。

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