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技術 敗血症診断薬

出願人 国立大学法人千葉大学
発明者 中田孝明橋田知明
出願日 2017年11月9日 (2年5ヶ月経過) 出願番号 2018-550241
公開日 2019年10月3日 (7ヶ月経過) 公開番号 WO2018-088455
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード システム経路 腎代替療法 急性腎傷害 法定代理人 質量データ ICU 膜検体 透析液流量
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年10月3日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (2)

課題・解決手段

新たな敗血症診断に有用なバイオマーカーを開発し、診断薬及び診断手法の提供。敗血症診断の目的で、血液試料中カルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分の測定法

概要

背景

敗血症は、感染に対する宿主生体反応調節不全により、生命脅かす臓器機能障害(organ dysfunction)を呈する疾患であり、その死亡率は依然として高い。感染に起因するもしくは宿主に起因する産物が刺激となり、自然免疫応答から様々なhumoral mediaterが放出され敗血症を引き起こすと言われている。そこで、mediater吸着能を有する膜素材を用いた血液浄化法が敗血症に施行され、臨床的効果を発揮してきた(非特許文献1〜4)。

今まで、TNF、IL−6、IL−8などのサイトカイン血液浄化膜通過後に濃度低下することは報告されてきた(非特許文献1〜4)。しかしそれらは、特定の物質に限定されており、膜へ吸着した物質の解析も、血液浄化膜前後の血中濃度差を測定した間接的なものであり十分ではなかった。

また、急性腎傷害(Acute kidney injury, AKI)の中でも、敗血症性腎傷害早期診断早期治療が重要であるにも関わらず、敗血症性腎傷害を診断するバイオマーカーは報告がない。

概要

新たな敗血症の診断に有用なバイオマーカーを開発し、診断薬及び診断手法の提供。敗血症診断の目的で、血液試料中カルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分の測定法

目的

本発明の課題は、新たな敗血症の診断に有用なバイオマーカーを開発し、診断薬及び診断手法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
- 件
牽制数
- 件

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請求項1

請求項2

血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する請求項1記載の測定法。

請求項3

急性腎傷害患者における敗血症診断の目的である請求項1又は2記載の測定法。

請求項4

血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分を測定することを特徴とする敗血症の診断方法

請求項5

血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する請求項4記載の診断方法。

請求項6

急性腎傷害患者における敗血症の診断である請求項4又は5記載の診断方法。

請求項7

血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分の測定試薬を含有する敗血症診断薬。

技術分野

0001

本発明は、敗血症診断方法及び診断試薬に関する。

背景技術

0002

敗血症は、感染に対する宿主生体反応調節不全により、生命脅かす臓器機能障害(organ dysfunction)を呈する疾患であり、その死亡率は依然として高い。感染に起因するもしくは宿主に起因する産物が刺激となり、自然免疫応答から様々なhumoral mediaterが放出され敗血症を引き起こすと言われている。そこで、mediater吸着能を有する膜素材を用いた血液浄化法が敗血症に施行され、臨床的効果を発揮してきた(非特許文献1〜4)。

0003

今まで、TNF、IL−6、IL−8などのサイトカイン血液浄化膜通過後に濃度低下することは報告されてきた(非特許文献1〜4)。しかしそれらは、特定の物質に限定されており、膜へ吸着した物質の解析も、血液浄化膜前後の血中濃度差を測定した間接的なものであり十分ではなかった。

0004

また、急性腎傷害(Acute kidney injury, AKI)の中でも、敗血症性腎傷害早期診断早期治療が重要であるにも関わらず、敗血症性腎傷害を診断するバイオマーカーは報告がない。

先行技術

0005

Ther Apher 2001, 5(4): 306-314
Transfus Apher Sci 2006, 35(3): 253-264
Blood Purif 2011,31(1-3): 18-25
Blood Purif 2012, 34(2): 164-170

発明が解決しようとする課題

0006

本発明の課題は、新たな敗血症の診断に有用なバイオマーカーを開発し、診断薬及び診断手法を提供することにある。

課題を解決するための手段

0007

そこで本発明者は、血液浄化法を施行した敗血症患者と非敗血症性急性腎傷害患者において、血液浄化膜に吸着した物質を溶出分離し、プロテオミクスの手法により解析を行った。その結果、従来、敗血症との関連性が全く知られていなかった2種の物質が、敗血症患者の血液中に有意に高濃度で存在し、敗血症の診断マーカーとして有用であることを見出し、本発明を完成した。

0008

すなわち、本発明は、次の〔1〕〜〔7〕を提供するものである。

0009

〔1〕敗血症診断の目的で、血液試料中カルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分の測定法
〔2〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する〔1〕記載の測定法。
〔3〕急性腎傷害患者における敗血症診断の目的である〔1〕又は〔2〕記載の測定法。
〔4〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分を測定することを特徴とする敗血症の診断方法。
〔5〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する〔4〕記載の診断方法。
〔6〕急性腎傷害患者における敗血症の診断である〔4〕又は〔5〕記載の診断方法。
〔7〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ1及びロイシンリッチα−2−グリコプロテインから選ばれる成分の測定試薬を含有する敗血症診断薬。

発明の効果

0010

血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ1又はロイシンリッチα−2−グリコプロテインの濃度又は活性が高い患者は敗血症であると診断できる。また、腎傷害患者のうち、カルボニックアンヒドラーゼ1又はロイシンリッチα−2−グリコプロテインの濃度又は活性が高い患者は敗血症であると診断できる。敗血症であることが早期に診断できれば、適確な治療指針の策定が可能となる。

図面の簡単な説明

0011

敗血症患者(Sepsis)及び非敗血症患者(Non−Sepsis)のカルボニックアンヒドラーゼ1(CA1)、ロイシンリッチα−2−グリコプロテイン(LRG1)、及びシスタチンC(Cystatin C)の濃度差を示す。

0012

本発明の敗血症診断マーカーは、カルボニックアンヒドラーゼ1(CA1)及びロイシンリッチα−2−グリコプロテイン(LRG)から選ばれる成分である。
CA1は、生体中で、二酸化炭素炭酸水素イオンとを相互交換することで、血液や他の組織の酸−塩基平衡を維持し、組織から二酸化炭素を運び出す補助をする酵素である。CA1活性や濃度は、鉄欠乏性貧血、respiratory distress syndrome、甲状腺機能亢進症・低下症等のマーカーとして有用であることが知られているが、敗血症との関係については知られていない。
LRGは、特発性正常圧水頭症糖尿病膵がんなどで上昇することは知られているが、敗血症との関係については知られていない。

0013

本発明においては、血液試料中のCA1又はLRGの濃度又は活性を測定する。

0014

血液試料としては、被検者から採取した血液試料であればよいが、血清血漿を用いるのが簡便性の点で好ましい。また、腎傷害患者を対象とする場合には、血液浄化法施行後の血液浄化膜に吸着した成分を測定対象とすることができる。ここで、血液浄化法としては、血液透析血液濾過透析腹膜透析血漿交換等が挙げられるが、これらのいずれも使用できる。

0015

血液試料中のCA1又はLRGの測定手段としては、プロテオミクス解析手段による質量分析が挙げられるが、それぞれの成分の特異的測定手段を用いてもよい。例えば、CA1の場合には、キャピラリー電気泳動・質量分析、液体クロマトグラフィー・質量分析の他、炭酸脱水素活性測定法加水分解酵素活性測定法(WO2005/098026等)、免疫学的測定法ELISARIAなど)等が挙げられる。また、LRGの場合には、キャピラリー電気泳動・質量分析、液体クロマトグラフィー・質量分析の他、ELISA、ラテックス凝集法等の免疫学的測定法が挙げられる。

0016

血液試料中のCA1又はLRGの活性又は濃度は、敗血症患者において健常者に比べて有意に高い値を示す。また、腎傷害患者のうち、非敗血症性腎傷害患者に比べて、敗血症性腎傷害患者において有意に高い値を示す。従って、CA1又はLRGは、敗血症の診断マーカー、腎傷害患者における敗血症性腎傷害の診断マーカーとして有用である。例えば、敗血症診断の目的で、血液試料中のCA1又はLRGの活性又は濃度を、敗血症性腎傷害患者及び健常者または非敗血症性腎傷害患者における活性または濃度に基づいて決定した閾値と比較することができる。上記閾値は、定法、例えば、敗血症性腎傷害患者のデータや、健常者または非敗血症性腎傷害患者のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたROC(Receiver Operating Characteristic)曲線を用いて算出することができる。

0017

本発明の敗血症診断薬は、血液試料中のCA1又はLRGの測定試薬を含有する。CA1又はLRGの測定試薬としては、例えばキャピラリー電気泳動・質量分析、液体クロマトグラフィー・質量分析に用いる試薬、炭酸脱水素活性測定試薬、加水分解酵素活性測定試薬、免疫学的測定試薬(ELISA、RIA、ラテックス凝集等)が挙げられる。また、これらの測定試薬には、前記測定試薬の他、各マーカーの標準品測定用プロトコールを含めることができ、測定キットとして供給することもできる。

0018

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

0019

実施例1
A.方法
(1)患者
この研究は千葉大学医学部付属病院で行われた。本研究では、2012年6月から2014年3月の間にICU入室した持続腎代替療法を受けた急性腎傷害(Acute kidney injury, AKI)20人の患者を研究対象とした。20人の患者のうち、10人は、敗血症(ACCP/SCCM基準による)患者であり、残り10人は非敗血症患者であった。千葉大学大学院治験審査委員会は、この研究を承認した。書面によるインフォームドコンセントは患者やその法定代理人から入手した。

0020

(2)検体採取
ポリメタクリレート血液浄化膜は、(Hemofeel CH−1.0,Toray Medical Co.Ltd.,Tokyo,Japan)は、上記の10人の患者(敗血症のn=5、非敗血症のn=5)から血液浄化法を施行した最初の日に収集した(施行条件は血流量120mL/分、濾過流量を500mL/h、透析液流量1000mL/h)。使用後の血液浄化膜は、生理食塩水1Lで洗浄した。そして筐体を切断し、中空糸膜を取り出した。中空糸膜は一定の大きさに切断し(長さ5cm、厚さ1cm)、水分除去の為、50mLチューブ遠心分離(5分間、2000rpm)し、−80℃で保存した。ICU入院時の血清検体は、20人の患者から採取し、−80℃で保存した。

0021

(3)血液浄化膜からの溶出及び単離
マイクロチューブに、冷凍保存した膜検体サンプルバッファー(62.5mM Tris,2%SDS,20%Glycerol,0.01%Bromophenol Blue,pH6.8/BIORAD社)1mL入れ、97℃、5分間加熱し、その抽出液を採取した。その抽出液を、5μLずつwellに注入し、150V、90minで電気泳動し、SDS−PAGE行った。使用するゲルは2〜100KDaをより詳細に分離出来る低分子用ゲル(DRC PerfectNTGel NTH−7G6HP)を用いた。泳動後のゲルはCBB染色を行い可視化した。

0022

(4)消化及び蛋白質同定
SDS−PAGEによる分離後可視領域および可視化されていない部位を、ゲル内トリプシン消化のために1mm2切片に切断した。Proteomics 2005,5(4):1113−1124の記載に従ってゲル内トリプシン消化を行った。プロテオーム解析に先立ち、消化されたペプチド脱塩し、選択的にC18−StageTips(Nat Protoc 2007,2(8):1896−1906)で強化した。濃縮されたサンプルは、Ultimate 3000(DIONEX、CA、USA)に取り付けた、トラップカラム(C18、0.3×5mm、DIONEX、CA、USA)、および分析カラム(C18、0.075×120mm、Nikkyoテクノス、東京、日本)に注入した。移動相の流量は、300nL/分とした。移動相の溶媒組成物は、120分サイクルで以下の様にプログラムされたものである。

0023

120−min cycles with varying mixing ratios of solvent A(2%v/v CH3CN and 0.1%v/v HCOOH)to solvent B(90%v/v CH3CN and 0.1%v/v HCOOH):5−10% B5min,10−13.5% B35min,13.5−35% B65min,35−90% B4min,90% B0.5min,90−5% B0.5min,5% B10min.

0024

精製されたペプチドはハイブリッドイオントラップフーリエ変換質量分析計であるLTQ−Orbitrap XL(Thermo Scientific,San Jose,CA,USA)にHPLCから取り込まれた。Proteome Discoverer search engine(version 2.2.6,Matrixscience,London,UK)は、ペプチドの質量及びタンデム質量スペクトルからタンパク質を同定するために使用した。ペプチド質量データは、UniProtKBHomo sapiens database(SwissProt 2014,20268 entries)で検索した。データベース検索パラメータは以下の通りであった。peptide mass tolerance,2ppm;fragment tolerance,0.6Da;enzyme was set to trypsin,allowing up to one missed cleavage;variable modifications,methionine oxidation.

0025

(5)ウエスタンブロット分析
プロテオーム解析で同定された3タンパク質(カルボニックアンヒドラーゼ[CA1]、ロイシンリッチα−2−グリコプロテイン[LRG1]、シスタチンC[CysC])の血中濃度を、AKI患者で測定した。測定はWestern Blot法で行った。この実験はtechnical duplicateで行った。

0026

(6)統計学的分析
タンパク質同定の基準は、alse discovery rate(FDR)<1%と設定した。FDRは、The FDR was estimated by searching against a created by the supplied by Matrix ScienceのMascot Perl programによって作成されたrandomized decoy databaseで推定した。ベースライン特性と結果の違いは、Fisher’s exact testとMann−Whitney U testにて解析した。敗血症群と非敗血症群の機能分類は、chi−square testにて解析した。敗血症および非敗血症群とのCA1、LRG1及びCysの血中濃度の差は、Mann−Whitney U testにて解析した。P値<0.05を有意とみなした。解析はSPSS(SPSS,version 20,Chicago,IL)統計ソフトウェアを使用した。

0027

B.結果
敗血症患者5例の膜検体と、非敗血症患者5例の膜検体を前述の方法で溶出分離・質量解析した。敗血症群では429種類、非敗血症群では357種類のタンパク質を同定した。
敗血症群と非敗血症群で同定されたタンパク質の機能分析の比較した(表1)。敗血症群において「免疫系システム経路」及び「生物学的接着」を有意に認めた(P<0.05)。「代謝経路」と「刺激に対する反応」は両群ともに認めた。

0028

0029

429種類のタンパク質のうち197種類が、敗血症群のみで同定された。さらに197種類のうち、9種類のタンパク質が、全ての検体(5敗血症患者)において同定された。9種類のタンパク質のうち、6種は既に敗血症との関連が報告されていた(表2)。
一方で、CA1、LRG1、CysCの3種類のタンパク質は敗血症との関連が報告されていなかった(表3)。

0030

0031

実施例

0032

そこでこれらの3つのタンパク質に着目し、ウェスタンブロット法を使用して、敗血症群と非敗血症群の血中濃度について解析した(図1)。図1よりCA1及びLRG1は、両群間有意差を認めた(LRG1;P=0.0040,CA1;P=0.015)。CysCは、両群間に有意差は認めなかった(CysC;P=0.35)。
以上の結果から、CA1及びLRG1は、敗血症の診断マーカーとして有用であることが判明した。これらの2成分は、特に急性腎傷害の原因としての敗血症の早期診断、治療に有効なバイオマーカーであると考えられた。

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