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技術 試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法及びペリオスチン測定の感度の改善方法

出願人 株式会社シノテスト国立大学法人佐賀大学
発明者 出原賢治高井雅之小野純也
出願日 2017年8月9日 (2年7ヶ月経過) 出願番号 2018-533530
公開日 2019年9月12日 (6ヶ月経過) 公開番号 WO2018-030456
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 被測定量 反応促進物質 洗浄分離 自然凝集 間接凝集反応 ソースバンク 希釈処理 汎用自動分析装置
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (2)

課題

試料に含まれるペリオスチン抗原抗体反応等を利用した測定における、感度が改善された高感度なペリオスチン測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、及びペリオスチン測定方法、並びに試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法を提供する。

解決手段

ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものである。

概要

背景

ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質であり、そのN末端側よりC末端側にかけて順に、EMI領域、R1領域、R2領域、R3領域、R4領域及びC末端領域よりなるものであるが、本発明者の一人である出原は、このペリオスチン遺伝子発現レベルの測定がアレルギー性疾患検査方法として有用であることを見出して、アレルギー疾患の検査方法の発明を完成させた(特許文献1及び非特許文献1参照。)。
また、出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることを見出した(特許文献2参照。)。
そして、出原らは、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の使用により、ペリオスチン測定の正確性が改善されることを見出し(特許文献3参照。)、更に、出原らは、ペリオスチンの特定領域を検出することによる正確性の改善された肺線維症又は間質性肺炎の検査方法等を見出した(特許文献4参照。)。

なお、他に、OSF2(ペリオスチン)に対するポリクローナル抗体モノクローナル抗体及びこれらの抗体を用いる診断方法等が開示され(特許文献5参照。)、Osf2/Cbfa1と命名される新規造骨細胞特異的転写因子を測定するのに抗OSF2(ペリオスチン)抗体を用いた免疫測定法が開示され(特許文献6参照。)、ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体及びこの抗体を用いる乳癌の骨への転移等を調べる診断アッセイ法等が開示され(特許文献7参照。)、そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体及びこの抗体を用いるペリオスチンの定量方法等が開示されている(特許文献8参照。)。

しかしながら、このように種々の疾患の検査に有用なペリオスチンの測定においては、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別のため、測定の感度の改善が望まれていた。

概要

試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応等を利用した測定における、感度が改善された高感度なペリオスチン測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、及びペリオスチン測定方法、並びに試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法を提供する。ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものである。なし

目的

しかしながら、このように種々の疾患の検査に有用なペリオスチンの測定においては、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別のため、測定の感度の改善が望まれていた

効果

実績

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請求項1

ペリオスチンに特異的に結合する抗体を含む、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とする、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬。

請求項2

ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用前処理剤であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とする、ペリオスチン測定用の前処理剤。

請求項3

ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定方法において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とする、試料に含まれるペリオスチンの測定方法。

請求項4

ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とする、試料に含まれるペリオスチン測定の感度改善方法

技術分野

0001

本発明は、アレルギー疾患や他の疾患のマーカーとなりうるペリオスチン骨芽細胞特異因子2又はOSF2とも呼ばれる)の測定試薬測定用前処理剤測定方法及び測定の感度改善方法に関するものである。
本発明は、臨床検査臨床病理学免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。

背景技術

0002

ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質であり、そのN末端側よりC末端側にかけて順に、EMI領域、R1領域、R2領域、R3領域、R4領域及びC末端領域よりなるものであるが、本発明者の一人である出原は、このペリオスチン遺伝子発現レベルの測定がアレルギー性疾患検査方法として有用であることを見出して、アレルギー疾患の検査方法の発明を完成させた(特許文献1及び非特許文献1参照。)。
また、出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることを見出した(特許文献2参照。)。
そして、出原らは、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の使用により、ペリオスチン測定の正確性が改善されることを見出し(特許文献3参照。)、更に、出原らは、ペリオスチンの特定領域を検出することによる正確性の改善された肺線維症又は間質性肺炎の検査方法等を見出した(特許文献4参照。)。

0003

なお、他に、OSF2(ペリオスチン)に対するポリクローナル抗体モノクローナル抗体及びこれらの抗体を用いる診断方法等が開示され(特許文献5参照。)、Osf2/Cbfa1と命名される新規造骨細胞特異的転写因子を測定するのに抗OSF2(ペリオスチン)抗体を用いた免疫測定法が開示され(特許文献6参照。)、ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体及びこの抗体を用いる乳癌の骨への転移等を調べる診断アッセイ法等が開示され(特許文献7参照。)、そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体及びこの抗体を用いるペリオスチンの定量方法等が開示されている(特許文献8参照。)。

0004

しかしながら、このように種々の疾患の検査に有用なペリオスチンの測定においては、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別のため、測定の感度の改善が望まれていた。

0005

国際公開第02/052006号パンフレット
国際公開第09/148184号パンフレット
特開2012−58048号公報
国際公開第13/035799号パンフレット
特開平5−268982号公報
特表2002−502250号公報
特表2005−500059号公報
国際公開第07/077934号パンフレット

先行技術

0006

G.Takayamaら,J.Allergy Clin.Immunol.,118巻,98〜104頁,2006年発行

発明が解決しようとする課題

0007

前述した、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、その測定の感度は十分なものではなかった。
このため、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、更なる測定の感度の改善が望まれていた。
これに対して、本発明の課題は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応等を利用した測定における、感度が改善された高感度な測定試薬、測定用前処理剤、及び測定方法を提供すること、並びに試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法を提供することである。
なお、本発明において、感度とは、被測定量の変化量(被測定量の変化に対する応答の大きさの割合)のことである。

課題を解決するための手段

0008

本発明者らは、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定について検討を重ねたところ、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

0009

すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
(1)ペリオスチンに特異的に結合する抗体を含む、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とする、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬。
(2)ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とする、ペリオスチン測定用の前処理剤。
(3)ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定方法において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とする、試料に含まれるペリオスチンの測定方法。
(4)ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とする、試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法。

発明の効果

0010

本発明のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法は、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該測定の感度を改善することができるものである。
これにより、本発明のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法は、その測定において測定値として大きなシグナルを得ることができるものである。
よって、本発明のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法においては、ごく低濃度のペリオスチンまで測定が可能となるものである。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法においては、試薬盲検試薬ブランク)は変わらないものの、感度が向上するため、正確なペリオスチンの測定を行うことができるものである。
更に、本発明のペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用前処理剤、ペリオスチン測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法においては、測定値として得られるシグナルが大きいので、これにより試料を高い希釈倍率希釈することが可能となり、その結果、血清等の試料のマトリックス成分による測定への干渉度合いを低減させることができるものである。

図面の簡単な説明

0011

血清試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を示した図である。

0012

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

0013

〔1〕抗ペリオスチン抗体
1.抗体
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、試料に含まれるペリオスチンの測定方法、及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法においては、ペリオスチンに特異的に結合する抗体(以下、「抗ペリオスチン抗体」ということがある)を用い、試料に含まれていたペリオスチンと抗原抗体反応を行わせる(又は当該抗原抗体反応のために用いる)。

0014

本発明において、抗ペリオスチン抗体は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体であれば特に限定はない。

0015

この抗ペリオスチン抗体としては、例えば、ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、抗体の断片〔Fab及びF(ab’)2など〕、又は一本鎖抗体(scFv)等を挙げることができる。

0016

なお、この抗ペリオスチン抗体は、遺伝子組み換え技術等により免疫原を免疫する動物とは異なる動物種アミノ酸配列に変化させた抗体(キメラ抗体ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等)であってもよい。

0017

そして、抗ペリオスチン抗体としては、モノクローナル抗体であることが好ましい。

0018

また、本発明においては、2種以上の、抗ペリオスチン抗体を用いてもよい。

0019

2.免疫原
本発明における抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
本発明における抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原として、ペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
すなわち、ヒト又はウシブタイヌネコマウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類由来のペリオスチン、又は遺伝子組み換え操作により得たペリオスチン等のペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。

0020

前記のペリオスチンの全部又は一部を免疫原とすることにより、本発明における抗ペリオスチン抗体を取得することができる。
なお、この抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原は、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に1ないし数個(通常1〜8個、好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、特に好ましくは1〜2個)のアミノ酸残基欠失置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。

0021

また、抗体は、3個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告(F.Hudeczら,J.Immunol.Methods,147巻,201〜210頁,1992年発行)がある。
よって、本発明における抗ペリオスチン抗体の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に1ないし数個(通常1〜8個、好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、特に好ましくは1〜2個)のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する3つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する3つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列からなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、本発明における抗ペリオスチン抗体の免疫原の最小単位として考えることができる。

0022

前記の免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等、又はペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に1ないし数個(通常1〜8個、好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、特に好ましくは1〜2個)のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、ヒト等の体液細胞組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。

0023

なお、本発明において、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を取得する方法としては特に限定はなく、如何なる方法によるものでもよく、例えば、公知の方法により取得することができる。

0024

例えば、ヒトのペリオスチンを取得する方法として、次の方法(“G.Takayamaら,J.Allergy Clin.Immunol.,118巻,1号,713〜723頁,2006年発行”)等を挙げることができる。
(a) まず、ペリオスチン(ポリヌクレオチド塩基配列核酸データベースGenBankのAccession NumberD13666;アミノ酸配列:核酸データベースGenBankのAccession NumberBAA02837)にV5/Hisタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質昆虫細胞であるS2細胞において発現させた上で精製する。

0025

(b) すなわち、具体的には、S2細胞の形質転換体は次のように調製する。
MT/Bip/V5−HisAプラスミド(Invitrogen社、米国カリフォルニア州Carlsbad)にペリオスチンの上記部分をコードするcDNAを挿入して、これをpMT/Bip/periostin−V5−HisAとする。
S2細胞にpMT/Bip/periostin−V5−HisA及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるpAcHygro(Invitrogen社、米国カリフォルニア州Carlsbad)を公知の方法で共導入し、形質転換させる。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形転換体を得る。
そして、S2細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にV5エピトープ/Hisタグの結合したペリオスチンを発現させる。

0026

(c) S2リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行う。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体S2細胞の培地硫酸銅を加えることにより、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導する。
これにより、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌される。
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水PBS)に透析した後、ニッケルレジン(Ni−NTA Agarose、Qiagen社、ドイツ国Hilden)と混合して、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させる。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてS2リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出させる。
溶出されたS2リコンビナントペリオスチンタンパク質をPBS等に透析し、精製されたヒトのペリオスチンタンパク質を取得する。

0027

また、ヒトのペリオスチンは、次の方法によっても取得することができる。
すなわち、ペリオスチンのcDNAを、GEX−KGベクター(“KL.Guanら,Anal.Biochem.,192巻,262〜267頁,1991年発行”)に組み込んで、大腸菌BL21にトランスフェクションする。
これをアンピシリン入りLB培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース4B(GE Healthcare社、Little Chalfont、英国)により、グルタチオントランスフェラーゼ(GST)を付加したペリオスチンを精製する。
これにトロンビンにてGSTを切断し、GSTを付加しないペリオスチンを取得する。
これをブラッドフォード法にて定量して、その量(濃度)が明確となったヒトのペリオスチンを取得することができる。

0028

更に、ヒトのペリオスチンは、例えば、“I.Takayamaら,J.Biochem.,146巻,5号,713〜723頁,2009年発行”などに記載された方法等によっても取得することができる。

0029

なお、ヒトのペリオスチンのEMI領域は、例えば、“I.Kiiら,J.Biol.Chem.,285巻,3号,2028〜2039頁,2010年発行”、又は“T.Maruhashiら,J.Biol.Chem.,285巻,17号,13294〜13303頁,2010年発行”などに記載された方法等により取得することができる。

0030

また、ヒトのペリオスチンのR1領域、R2領域又はR3領域はそれぞれ、“I.Takayamaら,J.Biochem,146巻,5号,713〜723頁,2009年発行”などに記載された方法等により取得することができる。

0031

また、ヒトのペリオスチンのR4領域及びC末端領域のアミノ酸配列はそれぞれ、“I.Takayamaら,J.Biochem,146巻,5号,713〜723頁,2009年発行”などに記載された方法等により取得することができる。

0032

なお、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座1タンパク質の化学IV」,東京化学同人,1975年、屋ら「ペプチド合成の基礎実験」,丸善,1985年、日本生化学会編「続生化学実験講座2 タンパク質の化学 下」,東京化学同人,1987年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。
また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾システイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。

0033

更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つDNA又はRNAより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座1 遺伝子研究法I」,東京化学同人,1986年、日本生化学会編「続生化学実験講座1 遺伝子研究法II」,東京化学同人,1986年、日本生化学会編「続生化学実験講座1 遺伝子研究法III」,東京化学同人,1987年等を参照して調製すればよい。

0034

ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体キャリア)を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数5のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告(木山ら,「日本薬学会第112回年会講演要旨集3」,122頁,1992年発行)もあるので、担体を使用することは必須ではない。

0035

なお、抗体を産生させる際に担体(キャリア)を使用する場合の担体としては、スカシガイヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミンBSA)、ニワトリ血清アルブミンポリ−L−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。

0036

免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はN−サクシミジル−3−(2−ピリジルジチオプロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。

0037

3.ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体、すなわち、ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。

0038

このポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生用の免疫原としては、前記の免疫原を用いることができる。

0039

前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体(キャリア)の結合物を、哺乳動物(マウス、モルモットハムスターウサギ、ラット、ヒツジヤギ、ウシ、ウマロバ、若しくはラクダなど)又は鳥類(ニワトリ、アヒル、若しくはダチョウなど)等に免疫する。

0040

なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。

0041

その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。

0042

このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス(“H.Riosら,Molecular and Cellular Biology,25巻,24号,11131〜11144頁,2005年発行”)等を挙げることができる。

0043

ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫原、担体、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、マウスの場合には一匹当り一回につき0.1μg〜5mgの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。

0044

なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバント添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバントフロイント不完全アジュバント水酸化アルミニウムアジュバント化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。

0045

初回免疫後、1〜2週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては、2〜6回が一般的である。
この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中抗体価の測定をELISA法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して抗体を含む抗血清を得る。

0046

この抗血清を、硫酸アンモニウム硫酸ナトリウム等による塩析法イオン交換クロマトグラフィーゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。

0047

以上の操作により、ペリオスチンに結合することができるポリクローナル抗体(ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体)を得ることができる。

0048

ところで、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られたポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。

0049

この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。

0050

4.モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、すなわち、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。

0051

このモノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法(G.Koehlerら,Nature,256巻,495〜497頁,1975年発行)によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。

0052

更に、抗体遺伝子のcDNAライブラリーから、マカフェティーらのファージディスプレイ法(M.McCaffertyら,Nature,348巻,552〜554頁,1990年発行)を用いてモノクローナル抗体を作製することも可能である。

0053

なお、例えば、細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、下記の操作により行うことができる。

0054

(1) まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物(マウス、ハムスター、ラット、又はラビットなど、例えば近交系マウスのBALB/c)又は鳥類(ニワトリなど)等に免疫する。

0055

なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。

0056

その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。

0057

このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス(“H.Riosら,Mol.Cell.Biol.,25巻,24号,11131〜11144頁,2005年発行”)等を挙げることができる。

0058

ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき0.1μg〜5mgの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。

0059

なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に行えばよい。

0060

(2)初回免疫後、1〜2週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては2〜6回が一般的である。
この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。

0061

(3)初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をELISA法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム水溶液)に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。

0062

(4) この最終免疫の3〜5日後に、免疫動物の脾細胞リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。

0063

(5) この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等(マウス、ヌードマウス、ラットなど)の骨髄腫細胞ミエローマ細胞)とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチングアニンホスホリボシル・トランスフェラーゼ(HGPRT)又はチミジンキナーゼ(TK)等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、BALB/cマウス由来のHGPRT欠損細胞株である、P3−X63−Ag8株(ATCCTIB9)、P3−X63−Ag8−U1株(癌研究リサーチソースバンク〔JCRB〕9085)、P3−NS1−1−Ag4−1株(JCRB 0009)、P3−X63−Ag8・653株(JCRB 0028)又はSP2/O−Ag−14株(JCRB 0029)等を用いることができる。

0064

細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール(PEG)、リポソームもしくはセンダイウイルスHVJ)等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がHGPRT欠損株又はTK欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリンチミジンを含む選別用培地(HAT培地)を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞との融合細胞(ハイブリドーマ)のみを選択的に培養し、増殖させることができる。

0065

(6) このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット若しくはニワトリなどの動物等(例えば、ヒトのペリオスチンの測定に用いる場合にはヒト由来のものが好ましく、ウシのペリオスチンの測定に用いる場合にはウシ由来のものが好ましく、イヌのペリオスチンの測定に用いる場合にはイヌ由来のものが好ましい)のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてELISA法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、「ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体(モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体)」を産生するハイブリドーマを選択することができる。

0066

(7) このハイブリドーマ選択方法限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。

0067

(8) このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、DMEM培地、RPMI1640培地又はASF培地103等の培地を用いることができる。
また、このモノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることもできる。

0068

(9) このようにして得られた、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができる。

0069

(10)なお、前記(6)の通り、得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はイヌ等の動物のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてELISA法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。

0070

(11) この「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を産生するハイブリドーマより、前記(7)〜(9)のようにして、「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を得ることができる。

0071

なお、得られた「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体である。

0072

〔2〕.界面活性剤
1.総論
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

0073

また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

0074

そして、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法は、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものである。

0075

本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬及びペリオスチン測定用の前処理剤においては、界面活性剤又は還元剤を含有することにより、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善することができるものである。

0076

また、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法においては、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることにより、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善することができるものである。

0077

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法における当該ペリオスチンと界面活性剤の接触であるが、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させること等を挙げることができる。

0078

2.本発明における界面活性剤
本発明における界面活性剤としては、両性界面活性剤非イオン性界面活性剤陰イオン性界面活性剤、又は陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。

0079

この界面活性剤としては、例えば、カルボキシベタイン型両性界面活性剤、グリシン型両性界面活性剤アミンオキシド型両性界面活性剤若しくは2−アルキルイミダゾリン誘導型両性界面活性剤などの両性界面活性剤;ポリオキシエチレンアルキルエーテルポリオキシプロピレンアルキルエーテルポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン−脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミンポリオキシエチレンアルキルアミドソルビタン脂肪酸エステルグリセリン脂肪酸エステルデカグリセリン脂肪酸エステルポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルポリエチレングリコール脂肪酸エステルポリオキシエチレンフィトステロールフィトスタノールポリオキシエチレンヒマシ油硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤;硫酸エステル塩スルホン酸塩脂肪酸塩リン酸エステル塩若しくはアミノ酸型界面活性剤などの陰イオン性界面活性剤;又はアミン塩型、トリメチル型、ジアルキル型若しくはベンジル型などの陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。

0080

なお、両性界面活性剤であるカルボキシベタイン型両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン又は脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノベタイン等を挙げることができる。
そして、このアルキルジメチルアミノ酢酸ベタインとしては、例えば、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等を挙げることができる。

0081

また、グリシン型両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジアミノエチルグリシン又はジアルキルジアミノエチルグリシン等を挙げることができる。

0082

また、アミンオキシド型両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド等を挙げることができる。

0083

また、2−アルキルイミダゾリンの誘導型両性界面活性剤としては、例えば、2−アルキル−N−カルボキシメチル−N−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等を挙げることができる。

0084

なお、両性界面活性剤である、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインはニッサンアノン登録商標)BL又はニッサンアノン(登録商標)BL−SFという商品名で、ヤシ油ジメチルアミノ酢酸ベタインはニッサンアノン(登録商標)BFという商品名で、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチル−アミノ酢酸ベタインはニッサンアノン(登録商標)BDF−R又はニッサンアノン(登録商標)BDF−SFという商品名で、パーム核油脂肪酸−アミドプロピルジメチル−アミノ酢酸ベタインはニッサンアノン(登録商標)BDC−SFという商品名で、ラウリン酸−アミドプロピルジメチル−アミノ酢酸ベタインはニッサンアノン(登録商標)BDL−SFという商品名で、ラウリルジアミノエチル−グリシンナトリウム液はニッサンアノン(登録商標)LG−Rという商品名で、2−アルキル−N−カルボキシメチル−N−ヒドロキシエチル−イミダゾリニウムベタイン(イミダゾリン型)はニッサンアノン(登録商標)GLM−R又はニッサンアノン(登録商標)GLM−R−LV(粘性改良タイプ)という商品名で、そしてラウリルアミノジ酢酸モノナトリウムはニッサンアノン(登録商標)LA又はニッサンアノン(登録商標)LAパウダーという商品名で、それぞれ日油株式会社(日本国)より市販されている。

0085

なお、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンの直鎖アルキルエーテル(例えば、ポリオキシエチレンオクチルエーテル、ポリオキシエチレンノニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルポリオキシエチレンオレイルエーテル、若しくはポリオキシエチレンベヘニルエーテル)、又はポリオキシエチレンの分岐鎖アルキルエーテル等を挙げることができる。

0086

また、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンの直鎖アルキルフェニルエーテル(例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル〔4−(1,1,3,3−テトラメチルブチルフェニル−ポリエチレングリコール[商品名:Triton X−100]、ポリオキシエチレン(40)イソオクチルフェニルエーテル[商品名:Triton X−405]等〕、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルフェニルエーテル、若しくはポリオキシエチレンステアリルフェニルエーテル)、又はポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフェニルエーテル等を挙げることができる。

0087

また、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン−脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレンの直鎖脂肪酸エステル(例えば、ラウリン酸ポリオキシエチレン、ステアリン酸ポリオキシエチレン、オレイン酸ポリオキシエチレン、若しくはヤシ油脂肪酸ポリオキシエチレン)、ポリオキシエチレンの分岐鎖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンの直鎖アルキル置換安息香酸エステル(例えば、オクチル安息香酸ポリオキシエチレン、ノニル安息香酸ポリオキシエチレン、ラウリル安息香酸ポリオキシエチレン、若しくはステアリル安息香酸ポリオキシエチレン)、又はポリオキシエチレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステル等を挙げることができる。

0088

なお、陰イオン性界面活性剤である硫酸エステル塩としては、例えば、アルキル硫酸エステル塩又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩等を挙げることができる。

0089

そして、このアルキル硫酸エステル塩としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムドデシル硫酸ナトリウム)、アルキル硫酸エステルトリエタノールアミン塩又は2−エチルヘキシル硫酸エステルナトリウム塩等を挙げることができる。

0090

また、このポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩としては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸トリエタノールアミン等を挙げることができる。

0091

なお、陰イオン性界面活性剤であるスルホン酸塩としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩又はその他のスルホン酸塩等を挙げることができる。

0092

そして、このアルキルベンゼンスルホン酸塩としては、例えば、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムドデシルベンゼンスルホン酸又はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等を挙げることができる。

0093

また、ジアルキルスルホコハク酸塩としては、例えば、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム又はジ2−エチルヘキシル−スルホコハク酸ナトリウム等を挙げることができる。

0094

また、その他のスルホン酸塩としては、例えば、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウムアルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム又はアルカンスルホン酸ナトリウム等を挙げることができる。

0095

なお、陰イオン性界面活性剤である脂肪酸塩としては、例えば、アルキルエーテルカルボン酸塩等を挙げることができる。

0096

なお、陰イオン性界面活性剤であるアミノ酸型界面活性剤としては、例えば、アシル−N−メチルタウリン脂肪酸メチルタウリン酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸メチルタウリン酸−ナトリウム塩、N−デカノイル−N−メチルタウリン酸−ナトリウム塩、N−ラウロイル−N−メチルβ−アラニンナトリウム塩、 N−ラウロイル−N−メチル−β−アラニントリエタノールアミン塩、α−スルホ脂肪酸メチル−エステルナトリウム塩、脂肪酸アミドエーテル硫酸−エステルナトリウム塩、N−オレイル−N−メチルグリシン又はN−ラウロイル−N−メチルグリシン−ナトリウム塩等を挙げることができる。

0097

なお、前記の各界面活性剤は、日油株式会社(日本国)、花王株式会社(日本国)、日光ケミカルズ株式会社(日本国)又は和光純薬工業株式会社(日本国)等より市販されている。

0098

3.濃度
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法において、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤を接触させる際の当該界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、当該ペリオスチンと界面活性剤との接触時に、0.01%(w/v)以上であることが好ましい。

0099

なお、当該ペリオスチンと界面活性剤との接触時の界面活性剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは0.04%(w/v)以上であり、更に好ましくは0.12%(w/v)以上であり、特に好ましくは0.5%(w/v)以上である。

0100

また、当該ペリオスチンと界面活性剤との接触時の界面活性剤の濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると20%(w/v)迄で十分である。

0101

なお、当該ペリオスチンと界面活性剤との接触時の界面活性剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは10%(w/v)以下であり、特に好ましくは5%(w/v)以下である。

0102

また、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤を接触させる場合には、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬又はペリオスチン測定用の前処理剤に界面活性剤を含有させて、当該測定試薬又は当該前処理剤と試料を混合等することにより、当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させても良い。
この場合、当該測定試薬又は当該前処理剤と試料を混合等した際の当該界面活性剤の濃度が、前記の濃度となるよう、界面活性剤を当該測定試薬又は当該前処理剤に含有させることが好ましい。

0103

なお、例えば、当該測定試薬が第1試薬及び第2試薬よりなり、当該抗原抗体反応を生じさせる試薬成分が第2試薬に含まれる場合、当該抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させるときは、界面活性剤は第1試薬に含有させればよい。(なお、この第1試薬はペリオスチン測定用の前処理剤であってよい。)また、当該抗原抗体反応時に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させるときは、界面活性剤は第2試薬に含有させればよい。

0104

また、例えば、当該測定試薬が第1試薬、第2試薬、第3試薬、第4試薬及び第5試薬よりなり、当該抗原抗体反応を生じさせる試薬成分が第4試薬に含まれる場合、当該抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させるときは、界面活性剤は第1試薬、第2試薬及び/又は第3試薬に含有させればよい。(なお、これらの当該第1試薬、第2試薬及び/又は第3試薬はペリオスチン測定用の前処理剤であってよい。)また、当該抗原抗体反応時に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させるときは、界面活性剤は第4試薬に含有させればよい。

0105

また、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させる場合には、ペリオスチン測定用の前処理剤(例えば、試料の希釈液等であっても良い)に界面活性剤を含有させて、当該前処理剤と試料を混合等することにより、当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させても良い。
この場合、当該前処理剤と試料を混合等し、抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させる際の当該界面活性剤の濃度が、前記の濃度となるよう、界面活性剤を当該前処理剤に含有させることが好ましい。

0106

4.界面活性剤の使用等
本発明において、界面活性剤は、1種類のものを使用して測定を行ってもよく、又は複数種類のものを使用して測定を行ってもよい。

0107

本発明において、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善する目的のためには、界面活性剤としては、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤が好ましい。

0108

両性界面活性剤としては、ベタイン型両性界面活性剤が好ましく、アルキルジメチルベタイン型両性界面活性剤がより好ましく、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインが特に好ましい。

0109

また、陰イオン性界面活性剤としては、硫酸エステル塩が好ましく、アルキル硫酸エステル塩がより好ましく、ラウリル硫酸ナトリウムが特に好ましい。

0110

〔3〕.還元剤
1.総論
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

0111

また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

0112

そして、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法は、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものである。

0113

本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬及びペリオスチン測定用の前処理剤においては、界面活性剤又は還元剤を含有することにより、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善することができるものである。

0114

また、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法においては、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることにより、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善することができるものである。

0115

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法における当該ペリオスチンと還元剤の接触であるが、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと還元剤を接触させること等を挙げることができる。

0116

2.本発明における還元剤
(1)総論
本発明における還元剤としては、特に限定はなく、還元能力を有するものであればよい。

0117

この還元剤としては、例えば、チオール化合物、或いは「硫黄中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩」等を挙げることができる。

0118

(2)チオール化合物
本発明において、このチオール化合物としては、例えば、ジチオスレイトール(DTT)、N−アセチル−L−システイン(NAC)、チオグリセロール還元型グルタチオン、システイン、ジチオエリスリトール、臭化2−アミノエチルイソチオウロニウム、2−チオグルコースチオグリコール酸2−メルカプトエタノール、N−グアニル−L−システイン、メルカプト酢酸メルカプトコハク酸、2−メルカプトエタンスルホン酸、又はシステアミン等のSH基を有する化合物を挙げることができる。

0119

(3)硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩
本発明において、この「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩」としては、例えば、スルホキシル酸〔H2SO2〕、亜硫酸〔H2SO3〕、チオ亜硫酸〔H2S2O2〕、チオ硫酸〔H2S2O3〕、亜ジチオン酸〔H2S2O4〕、二亜硫酸〔H2S2O5〕、ジチオン酸〔H2S2O6〕、二硫酸〔H2S2O7〕、又はポリチオン酸〔H2SxO6(x=3、4‥‥)〕等を挙げることができる。
また、この「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩」の「これらの塩」とは、前記の「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸」のプロトンとして解離しうる水素の一部又は全部がアルカリ金属アルカリ土類金属、その他の金属又は塩基性基で置換された化合物のことである。
例えば、このアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウムルビジウム又はセシウム等を挙げることができ、アルカリ土類金属としては、ベリリウムマグネシウムカルシウムストロンチウム又はバリウム等を挙げることができ、そして塩基性基としては、アンモニウム基等を挙げることができる。

0120

3.濃度
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法において、試料に含まれていたペリオスチンと還元剤を接触させる際の当該還元剤の濃度は、特に限定されないが、当該ペリオスチンと還元剤との接触時に、0.001mM以上であることが好ましい。

0121

なお、当該ペリオスチンと還元剤との接触時の還元剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは0.01mM以上であり、特に好ましくは0.05mM以上である。

0122

また、当該ペリオスチンと還元剤との接触時の還元剤の濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると50mM迄で十分である。

0123

なお、当該ペリオスチンと還元剤との接触時の還元剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは20mM以下であり、特に好ましくは10mM以下である。

0124

また、試料に含まれていたペリオスチンと還元剤を接触させる場合には、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬又はペリオスチン測定用の前処理剤に還元剤を含有させて、当該測定試薬又は当該前処理剤と試料を混合等することにより、当該ペリオスチンと還元剤を接触させても良い。
この場合、当該測定試薬又は当該前処理剤と試料を混合等した際の当該還元剤の濃度が、前記の濃度となるよう、還元剤を当該測定試薬又は当該前処理剤に含有させることが好ましい。

0125

なお、例えば、当該測定試薬が第1試薬及び第2試薬よりなり、当該抗原抗体反応を生じさせる試薬成分が第2試薬に含まれる場合、当該抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと還元剤を接触させるときは、還元剤は第1試薬に含有させればよい。(なお、この第1試薬はペリオスチン測定用の前処理剤であってよい。)また、当該抗原抗体反応時に当該ペリオスチンと還元剤を接触させるときは、還元剤は第2試薬に含有させればよい。

0126

また、例えば、当該測定試薬が第1試薬、第2試薬、第3試薬、第4試薬及び第5試薬よりなり、当該抗原抗体反応を生じさせる試薬成分が第4試薬に含まれる場合、当該抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと還元剤を接触させるときは、還元剤は第1試薬、第2試薬及び/又は第3試薬に含有させればよい。(なお、これらの当該第1試薬、第2試薬及び/又は第3試薬はペリオスチン測定用の前処理剤であってよい。)また、当該抗原抗体反応時に当該ペリオスチンと還元剤を接触させるときは、還元剤は第4試薬に含有させればよい。

0127

また、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと還元剤を接触させる場合には、ペリオスチン測定用の前処理剤(例えば、試料の希釈液等であっても良い)に還元剤を含有させて、当該前処理剤と試料を混合等することにより、当該ペリオスチンと還元剤を接触させても良い。
この場合、当該前処理剤と試料を混合等し、抗原抗体反応の前に当該ペリオスチンと還元剤を接触させる際の当該還元剤の濃度が、前記の濃度となるよう、還元剤を当該前処理剤に含有させることが好ましい。

0128

4.還元剤の使用等
本発明において、還元剤は、1種類のものを使用して測定を行ってもよく、又は複数種類のものを使用して測定を行ってもよい。

0129

また、本発明において、還元剤と界面活性剤を組み合わせて使用し、測定を行ってもよい。

0130

本発明において、試料に含まれるペリオスチン測定の感度を改善する目的のためには、還元剤としては、チオール化合物が好ましく、ジチオスレイトール、N−アセチル−L−システイン、チオグリセロール、還元型グルタチオン、システイン又はジチオエリスリトールがより好ましく、ジチオスレイトール、N−アセチル−L−システイン又はチオグリセロールが更に好ましく、ジチオスレイトールが特に好ましい。

0131

〔4〕.試料
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、試料に含まれるペリオスチンの測定方法、及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法における試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液髄液唾液、腹水若しくは羊水などの体液;あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある生体試料等の試料であれば対象となる。

0132

なお、測定に用いる試料の形態は、液体であることが好ましいので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の処理を既知の方法に従って行い、液体試料としてもよい。

0133

また、必要に応じて、試料は濃縮処理を行ってもよい。

0134

また、試料は、その測定の前に、希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
例えば、試料を抗ペリオスチン抗体と接触させ、結合させる前に、試料に希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
この希釈液として、各種水溶媒を用いることができる。
例えば、水、生理食塩水又はトリス(ヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液〔Tris緩衝液〕、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。
なお、この緩衝液のpHについては、pH5〜pH10の範囲にあることが好ましい。

0135

また、試料が血液(全血)である場合、この全血試料を、水又は界面活性剤を含有する水系溶媒等の低張液と混合し、赤血球破裂させる処理を行うことが、その後の測定を支障なく行う上で、好ましい。

0136

〔5〕.測定対象物質
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、試料に含まれるペリオスチンの測定方法、及び試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法における測定対象物質はペリオスチンである。

0137

この本発明における測定対象物質としてのペリオスチンとしては、特に限定はなく、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類等由来のペリオスチン等を挙げることができる。

0138

この測定対象物質としてのペリオスチンとしては、ヒトのペリオスチンが特に好ましい。

0139

〔6〕.ペリオスチンの測定試薬
1.総論
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

0140

本発明のペリオスチンの測定試薬は、上記の特徴により、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該測定の感度を改善することができるものである。

0141

2.抗原抗体反応を利用したペリオスチンの測定試薬
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定試薬であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものであるが、このようなものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。

0142

この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定試薬の測定原理としては、例えば、酵素免疫測定法ELISAEIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、放射免疫測定法RIA)、発光免疫測定法(LIA)、酵素抗体法蛍光抗体法イムノクロマトグラフィー法免疫比濁法ラテックス比濁法ラテックス凝集反応測定法赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平9−229936号公報及び特開平10−132819号公報などに記載された測定対象物質(被検物質)に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質(被検物質)に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はDahlbeackらが示したELSA法(Enzyme−linked Ligandsorbent Assay)(Thromb.Haemost.,79巻,767〜772頁,1998年発行;国際公開第98/23963号パンフレット)等を挙げることができる。

0143

そして、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、サンドイッチ法競合法又は均一系法(ホモニアス系法)等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

0144

本発明のペリオスチンの測定試薬は、一つの測定試薬よりなるものであってよい。
この場合、抗ペリオスチン抗体は、その一つの測定試薬に含有される。
また、この場合、界面活性剤(又は還元剤)も、その一つの測定試薬に含有される。

0145

また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってよい。
この場合、抗ペリオスチン抗体は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。
また、この場合、界面活性剤又は還元剤も、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。このとき、当該界面活性剤又は当該還元剤を含有する測定試薬は本発明のペリオスチン測定用前処理剤であってよい。

0146

例えば、本発明のペリオスチンの測定試薬が、第1試薬及び第2試薬の二つの測定試薬より構成されるものである場合、抗ペリオスチン抗体は、第1試薬にのみ含有させてもよく、また、第2試薬にのみ含有させてもよく、更には、第1試薬と第2試薬の両方に含有させてもよい。
また、例えば、本発明のペリオスチンの測定試薬が、第1試薬及び第2試薬の二つの測定試薬より構成されるものである場合、界面活性剤又は還元剤は、第1試薬にのみ含有させてもよく、あるいは第2試薬にのみ含有させてもよく、更には、第1試薬と第2試薬の両方に含有させてもよい。

0147

なお、本発明のペリオスチンの測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。

0148

この水系溶媒としては、例えば、水、若しくは生理食塩水等を挙げることができ、又は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液〔Tris緩衝液〕、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。

0149

この緩衝液のpHについては、適宜適当なpHを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、pH5〜pH10の範囲内のpHを選択して用いることが一般的である。

0150

また、本発明のペリオスチンの測定試薬には、抗ペリオスチン抗体等の他に、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミンHSA)、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質;カルシウムイオンなどの各種金属イオンカルシウム塩などの各種塩類;各種糖類;脱脂粉乳;正常ウサギ血清などの各種動物血清アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤活性化物質反応促進物質;ポリエチレングリコールなどの感度増加物質;又は、非特異的反応抑制物質等の1種又は2種以上を適宜含有させてもよい。

0151

なお、これらを本発明のペリオスチンの測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、0.001〜10%(w/v)が好ましく、特に0.01〜5%(w/v)が好ましい。

0152

なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することもできる。

0153

前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正キャリブレーション)を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。

0154

ところで、本発明のペリオスチンの測定試薬は、界面活性剤又は還元剤及び水系溶媒を含有する第1試薬と、抗ペリオスチン抗体を含有する第2試薬とを含む、ペリオスチンの測定試薬であってもよい。なお、この場合、当該第1試薬は本発明のペリオスチン測定用前処理剤であってよい。

0155

また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、水系溶媒を含有する第1試薬と、抗ペリオスチン抗体並びに界面活性剤又は還元剤を含有する第2試薬とを含む、ペリオスチンの測定試薬であってもよい。

0156

また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、測定試薬キットであることが好ましい。

0157

3.抗ペリオスチン抗体
本発明のペリオスチンの測定試薬においては、上記「〔1〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載された抗体を使用することができ、例えば、以下の抗体を使用することができる。
(i) ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体
(ii) ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体
(iii) ペリオスチンに特異的に結合することができるモノクローナル抗体

0158

なお、本発明のペリオスチンの測定試薬において、例えば、ペリオスチン一分子二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれもが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
例えば、酵素標識抗体固相化抗体を用いるELISA法のサンドイッチ法の測定試薬においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチン抗体である必要がある。

0159

ところで、前記の抗ペリオスチン抗体は、1種類のものだけではなく、複数種類のものを含有してもよい。

0160

なお、この抗ペリオスチン抗体の詳細については、前記の「〔1〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載した通りである。

0161

4.標識抗体を用いた免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬が、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法を測定原理とする場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体のいずれもの抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。

0162

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、界面活性剤又は還元剤を含有するものである。

0163

なお、この標識抗体を用いた免疫学的測定試薬において用いる固相担体としては、ポリスチレンポリカーボネートポリビニルトルエンポリプロピレンポリエチレンポリ塩化ビニルナイロンポリメタクリレートポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチンアガロースセルロースセファロースガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセルビーズマイクロプレートマイクロタイタープレート)、試験管スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
なお、前記の抗ペリオスチン抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて抗体を固相担体に固定化することができる。

0164

物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗ペリオスチン抗体と固相担体を接触させたりすること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」,臨床病理刊行会,1983年発行;日本生化学会編「新生化学実験講座1タンパク質IV」,東京化学同人,1991年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基チオール基アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。

0165

また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチン抗体を固定化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理マスキング処理)を行ってもよい。

0166

標識物質としては、酵素免疫測定法の測定試薬の場合には、パーオキシダーゼ(POD)、アルカリホスファターゼ(ALP)、β−ガラクトシダーゼウレアーゼカタラーゼグルコースオキシダーゼ乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の測定試薬の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の測定試薬の場合には、トリチウムヨウ素125又はヨウ素131等を用いることができる。
また、発光免疫測定法の測定試薬においては、NADH−FMNH2−ルシフェラーゼ系、ルミノール過酸化水素−POD系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。

0167

抗ペリオスチン抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」,臨床病理刊行会,1983年発行;日本生化学会編「新生化学実験講座1タンパク質IV」,東京化学同人,1991年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。

0168

測定の操作法は公知の方法等(日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」,臨床病理刊行会,1983年発行;石川榮治ら編「酵素免疫測定法」,第3版,医学書院,1987年発行;川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊No.31 酵素免疫測定法」,共立出版,1987年発行)等により行うことができる。

0169

例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体=固相化抗体=ペリオスチン=標識抗体」の複合体を抗原抗体反応により形成させる。(例えば、この「固相担体=固相化抗体=ペリオスチン=標識抗体」の複合体を形成させる抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤を接触させる。)

0170

そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体=ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量(濃度)のみを測定することができる。

0171

具体的には、酵素免疫測定法の測定試薬の場合は、例えば抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の測定試薬の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の測定試薬の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の測定試薬の場合は発光反応系による発光量等を測定する。

0172

なお、標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法を測定原理とする本発明のペリオスチンの測定試薬に関し、その標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法の詳細については、後記「〔8〕.ペリオスチンの測定方法」の「3.標識抗体を用いた免疫学的測定方法」に記載した通りである。

0173

5.凝集反応法による免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬が、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法(凝集反応法)を測定原理とする場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。

0174

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬は、界面活性剤又は還元剤を含有するものである。

0175

また、前記の凝集反応法を測定原理とする場合、本発明のペリオスチンの測定試薬は、「抗ペリオスチン抗体」又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する。

0176

なお、本発明のペリオスチンの測定試薬が二つの測定試薬より構成される場合、「抗ペリオスチン抗体」又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」は、第2試薬に含有させることが好ましい。
そして、本発明のペリオスチンの測定試薬が二つ以上の測定試薬より構成されるものである場合、「抗ペリオスチン抗体」又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する試薬以外の試薬、すなわち、「抗ペリオスチン抗体」も「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」も含有しない試薬は、例えば前記の水系溶媒を含有する試薬等であってよい。

0177

なお、前記の凝集反応法による測定試薬においては、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液〔Tris緩衝液〕又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。

0178

抗ペリオスチン抗体を固相担体に固定化させて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレン、スチレンスチレンスルホン酸塩共重合体アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体塩化ビニルアクリル酸エステル共重合体酢酸ビニルアクリル酸共重合体ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジルメタ)アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体メタクリル酸重合体アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカアルミナカーボンブラック金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。

0179

抗ペリオスチン抗体を固相担体に固定化させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。

0180

物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗ペリオスチン抗体と固相担体を接触させたりすること等により行うことができる。

0181

また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」,臨床病理刊行会,1983年発行;日本生化学会編「新生化学実験講座1タンパク質IV」,東京化学同人,1991年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。

0182

また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチン抗体を固定化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理(マスキング処理)を行ってもよい。

0183

なお、ラテックス比濁法を測定原理とする測定試薬の場合、固相担体として用いるラテックス粒子粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質(ペリオスチン)を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、0.04〜1μmであることが好ましい。

0184

また、ラテックス比濁法を測定原理とする測定試薬の場合、抗ペリオスチン抗体を固定化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のペリオスチンの濃度、抗ペリオスチン抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。

0185

しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固定化された「抗ペリオスチン抗体」と試料に含まれていた「ペリオスチン」との抗原抗体反応時(測定反応時)に、「抗ペリオスチン抗体」を固定化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において0.005〜1%(w/v)となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「抗ペリオスチン抗体を固定化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。

0186

また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が0.01〜100μmの範囲内にあることが好ましく、0.5〜10μmの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、1〜10の範囲内にあることが好ましく、1〜2の範囲内にあることがより好ましい。

0187

なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート(マイクロタイタープレート)又はトレイ等を挙げることができる。
これらの容器の溶液収容部分(マイクロプレートのウェル等)の底面は、U型、V型又はUV型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。

0188

測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗ペリオスチン抗体、又は試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。

0189

測定の操作法の例を以下挙げる。
例えば、まず、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」及び「界面活性剤」若しくは「還元剤」を含有する測定試薬、又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬及び「界面活性剤」若しくは「還元剤」を含有する測定試薬等を調製し、準備する。

0190

次に、例えば、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」及び「界面活性剤」(又は「還元剤」)を含有する測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料とを接触させる。[同時に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤(又は還元剤)が接触する。]
または、「界面活性剤」(若しくは「還元剤」)を含有する測定試薬と、試料とを混合することにより試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤(又は還元剤)を接触させ、次にこの混合液に「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する試薬を混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料を接触させる。

0191

これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」の「抗ペリオスチン抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。

0192

そして、これより生成した、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」(抗ペリオスチン抗体=固相担体=抗ペリオスチン抗体)と「ペリオスチン」との複合体凝集物(…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=固相担体=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=固相担体=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…)を測定する。

0193

この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。

0194

そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質(ペリオスチンの濃度が既知の試料)を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度(定量値)を算出する。

0195

なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、1波長測定であっても、又は2波長測定(2つの波長による差又は比)であってもよい。
なお、測定波長は、340nmから1,000nmの中から選ばれるのが一般的である。

0196

なお、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置(専用機)であってもよい。

0197

また、本発明におけるペリオスチンの測定は、1ステップ法(1試薬法)により行ってもよいし、又は2ステップ法(2試薬法)等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。

0198

なお、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法を測定原理とする本発明のペリオスチンの測定試薬に関し、その抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法の詳細については、後記「〔8〕.ペリオスチンの測定方法」の「4.凝集反応法による免疫学的測定方法」に記載した通りである。

0199

〔7〕.ペリオスチン測定用の前処理剤
1.総論
本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものである。

0200

本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、上記の特徴により、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該測定の感度を改善することができるものである。

0201

2.ペリオスチン測定用の前処理剤
本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチン測定用の前処理剤であって、界面活性剤又は還元剤を含有することを特徴とするものであるが、このようなものであれば、特に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。

0202

この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定方法の測定原理としては、例えば、酵素免疫測定法(ELISA、EIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、放射免疫測定法(RIA)、発光免疫測定法(LIA)、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平9−229936号公報及び特開平10−132819号公報などに記載された測定対象物質(被検物質)に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質(被検物質)に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はDahlbeackらが示したELSA法(Enzyme−linked Ligandsorbent Assay)(Thromb.Haemost.,79巻,767〜772頁,1998年発行;国際公開第98/23963号パンフレット)等を挙げることができる。

0203

そして、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法(ホモジニアス系法)等のいずれの手法にも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、用手法に適用してもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行う測定に適用してもよい。

0204

本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、界面活性剤若しくは還元剤を含むものであってもよく、又は界面活性剤若しくは還元剤そのものであってもよい。

0205

また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、液体であってもよく、又固体等であってもよい。

0206

なお、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤が液体の場合、その溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。

0207

この水系溶媒としては、例えば、水、若しくは生理食塩水等を挙げることができ、又は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液〔Tris緩衝液〕、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。

0208

この緩衝液のpHについては、適宜適当なpHを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、pH5〜pH10の範囲内のpHを選択して用いることが一般的である。

0209

また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤には、界面活性剤の他に、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質;カルシウムイオンなどの各種金属イオン;カルシウム塩などの各種塩類;各種糖類;脱脂粉乳;正常ウサギ血清などの各種動物血清;アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤;活性化物質;反応促進物質;ポリエチレングリコールなどの感度増加物質;又は、非特異的反応抑制物質等の1種又は2種以上を適宜含有させてもよい。

0210

なお、これらを本発明のペリオスチン測定用の前処理剤に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、0.001〜10%(w/v)が好ましく、特に0.01〜5%(w/v)が好ましい。

0211

また、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、そのもの単独にて、販売することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定用の前処理剤は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することもできる。

0212

なお、本発明のペリオスチン測定用の前処理剤は、試料に添加又は試料と混合等することにより、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることができる。

0213

〔8〕.ペリオスチンの測定方法
1.総論
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定方法において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものである。

0214

本発明のペリオスチンの測定方法は、上記の特徴により、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該測定の感度を改善することができるものである。

0215

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法においては、前記の「〔6〕.ペリオスチンの測定試薬」の項に記載した測定試薬、及び前記の「〔7〕.ペリオスチン測定用の前処理剤」の項に記載した前処理剤を使用することができる。

0216

2.抗原抗体反応を利用したペリオスチンの測定方法
本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定方法は、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定方法において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものであるが、この抗ペリオスチン抗体を使用するものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。

0217

この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法(ELISA、EIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、放射免疫測定法(RIA)、発光免疫測定法(LIA)、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平9−229936号公報及び特開平10−132819号公報などに記載された測定対象物質(被検物質)に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質(被検物質)に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はDahlbeackらが示したELSA法(Enzyme−linked Ligandsorbent Assay)(Thromb.Haemost.,79巻,767〜772頁,1998年発行;国際公開第98/23963号パンフレット)等を挙げることができる。

0218

そして、本発明のペリオスチンの測定方法における測定には、サンドイッチ法、競合法又は均一系法(ホモジニアス系法)等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定方法における測定は、用手法により行ってもよく、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

0219

3.抗ペリオスチン抗体
本発明のペリオスチンの測定方法においては、上記「〔1〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載された抗体を使用することができ、例えば、以下の抗体を使用することができる。
(i) ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体
(ii) ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体
(iii) ペリオスチンに特異的に結合することができるモノクローナル抗体

0220

なお、本発明のペリオスチンの測定方法において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれもが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
例えば、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるELISA法のサンドイッチ法においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチン抗体である必要がある。

0221

ところで、前記の抗ペリオスチン抗体は、1種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。

0222

なお、この抗ペリオスチン抗体の詳細については、前記の「〔1〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載した通りである。

0223

4.標識抗体を用いた免疫学的測定方法
本発明のペリオスチンの測定方法における測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体のいずれの抗体もが抗ペリオスチン抗体である必要がある。

0224

本発明においては、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤(又は還元剤)を接触させる。

0225

測定の操作法は公知の方法等(日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」,臨床病理刊行会,1983年発行;石川榮治ら編「酵素免疫測定法」,第3版,医学書院,1987年発行;北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊No.31 酵素免疫測定法」,共立出版,1987年発行)等により行うことができる。

0226

例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体=固相化抗体=ペリオスチン=標識抗体」の複合体を抗原抗体反応により形成させる。[例えば、この「固相担体=固相化抗体=ペリオスチン=標識抗体」の複合体を形成させる抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤(又は還元剤)を接触させる。]

0227

そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体=ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量(濃度)のみを測定することができる。

0228

具体的には、酵素免疫測定法の場合は、例えば、抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量等を測定する。

0229

5.凝集反応法による免疫学的測定方法
本発明のペリオスチンの測定方法における測定を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法(凝集反応法)により実施する場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。

0230

本発明においては、例えば、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させる。

0231

測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗ペリオスチン抗体、又は試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。

0232

測定の操作法の例を以下挙げる。
例えば、まず、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」及び「界面活性剤」(又は「還元剤」)を含有する測定試薬、又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬及び「界面活性剤」(又は「還元剤」)を含有する測定試薬等を調製し、準備する。

0233

次に、例えば、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」及び「界面活性剤」(又は「還元剤」)を含有する測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料とを接触させる。[同時に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤(又は還元剤)が接触する。]

0234

または、「界面活性剤」(若しくは「還元剤」)を含有する測定試薬と、試料とを混合することにより試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤(若しくは還元剤)を接触させ、次にこの混合液に「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する試薬を混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料を接触させる。

0235

これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」の「抗ペリオスチン抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。

0236

そして、これより生成した、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」(抗ペリオスチン抗体=固相担体=抗ペリオスチン抗体)と「ペリオスチン」との複合体凝集物(…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=固相担体=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=固相担体=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…)を測定する。

0237

この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。

0238

そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質(ペリオスチンの濃度が既知の試料)を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度(定量値)を算出する。

0239

なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、1波長測定であっても、又は2波長測定(2つの波長による差又は比)であってもよい。
なお、測定波長は、340nmから1,000nmの中から選ばれるのが一般的である。

0240

なお、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置(専用機)であってもよい。

0241

また、本発明におけるペリオスチンの測定は、1ステップ法(1試薬法)により行ってもよいし、又は2ステップ法(2試薬法)等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。

0242

なお、以下、ラテックス比濁法を測定原理とする方法によりペリオスチンの測定を行う場合を例にとって、より具体的に説明を行う。

0243

〔a〕抗原抗体反応の前に接触させる場合
(1) まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第1試薬:
ペリオスチン測定用前処理剤[界面活性剤(又は還元剤)を含有する緩衝液(水系溶媒)]
第2試薬:
「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」を含有する緩衝液

0244

(2)血清等の試料の一定量と前記の第1試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応の前に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤(又は還元剤)を接触させる。
なお、試料と第1試薬の混合比率(量比)は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1℃〜30℃)又は微温(30℃〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい。(例えば、37℃等)

0245

(3) 一定時間後、前記の試料と第1試薬との混合液に、前記の第2試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。
なお、第2試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1℃〜30℃)又は微温(30℃〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい。(例えば、37℃等)
そして、前記の静置の時間は、1分間以上、かつ10分間以下の一定時間であることが好ましく、3分間以上、かつ5分間以下の一定時間であることがより好ましい。

0246

試料と第1試薬との混合液への第2試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。

0247

そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=ラテックス粒子=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=ラテックス粒子=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。

0248

(4) そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。

0249

(5) そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量(濃度)の算出を行う。

0250

〔b〕抗原抗体反応時に接触させる場合
(1) まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第1試薬:
緩衝液(水系溶媒)
第2試薬:
「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」、並びに「界面活性剤」(又は「還元剤」)を含有する緩衝液

0251

(2)血清等の試料の一定量と前記の第1試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第1試薬の混合比率(量比)は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1℃〜30℃)又は微温(30℃〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい。(例えば、37℃等)

0252

(3) 一定時間後、前記の試料と第1試薬との混合液に、前記の第2試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。[これにより、更に、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応時に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤(又は還元剤)を接触させる。]
なお、第2試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1℃〜30℃)又は微温(30℃〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい。(例えば、37℃等)
そして、前記の静置の時間は、1分間以上、かつ10分間以下の一定時間であることが好ましく、3分間以上、かつ5分間以下の一定時間であることがより好ましい。

0253

試料と第1試薬との混合液への第2試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。

0254

そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=ラテックス粒子=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=ラテックス粒子=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。

0255

(4) そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。

0256

(5) そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量(濃度)の算出を行う。

0257

〔9〕.ペリオスチン測定の感度の改善方法
1.総論
本発明の試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものである。

0258

本発明の試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法は、上記の特徴により、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該測定の感度を改善することができるものである。

0259

なお、本発明の試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法においては、前記の「〔6〕.ペリオスチンの測定試薬」の項に記載した測定試薬、及び「〔7〕.ペリオスチンの測定用の前処理剤」の項に記載した前処理剤を使用することができる。

0260

2.抗原抗体反応を利用したペリオスチンの測定
本発明の試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した、試料に含まれるペリオスチンの測定において、当該ペリオスチンと界面活性剤又は還元剤を接触させることを特徴とするものであるが、この試料に含まれるペリオスチンの測定は抗ペリオスチン抗体を使用するものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。

0261

本発明において、この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法(ELISA、EIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、放射免疫測定法(RIA)、発光免疫測定法(LIA)、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平9−229936号公報及び特開平10−132819号公報などに記載された測定対象物質(被検物質)に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質(被検物質)に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はDahlbeackらが示したELSA法(Enzyme−linked Ligandsorbent Assay)(Thromb.Haemost.,79巻,767〜772頁,1998年発行;国際公開第98/23963号パンフレット)等を挙げることができる。

0262

そして、本発明におけるペリオスチンの測定には、サンドイッチ法、競合法又は均一系法(ホモジニアス系法)等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよく、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

0263

3.抗ペリオスチン抗体
本発明におけるペリオスチンの測定においては、上記「〔1〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載された抗体を使用することができ、例えば、以下の抗体を使用することができる。
(i) ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体
(ii) ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体
(iii) ペリオスチンに特異的に結合することができるモノクローナル抗体

0264

なお、本発明におけるペリオスチンの測定において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれもが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
例えば、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるELISA法のサンドイッチ法においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチン抗体である必要がある。

0265

ところで、前記の抗ペリオスチン抗体は、1種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。

0266

なお、この抗ペリオスチン抗体の詳細については、前記の「〔1〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載した通りである。

0267

4.標識抗体を用いた免疫学的測定
本発明におけるペリオスチンの測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体のいずれの抗体もが抗ペリオスチン抗体である必要がある。

0268

本発明においては、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤若しくは還元剤を接触させる。

0269

測定の操作法は公知の方法等(日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」,臨床病理刊行会,1983年発行;石川榮治ら編「酵素免疫測定法」,第3版,医学書院,1987年発行;北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊No.31 酵素免疫測定法」,共立出版,1987年発行)等により行うことができる。

0270

例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体=固相化抗体=ペリオスチン=標識抗体」の複合体を抗原抗体反応により形成させる。[例えば、この「固相担体=固相化抗体=ペリオスチン=標識抗体」の複合体を形成させる抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時に当該ペリオスチンと界面活性剤(若しくは還元剤)を接触させる。]

0271

そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体=ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量(濃度)のみを測定することができる。

0272

具体的には、酵素免疫測定法の場合は、例えば抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量等を測定する。

0273

5.凝集反応法による免疫学的測定
本発明におけるペリオスチンの測定を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法(凝集反応法)により実施する場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。

0274

本発明においては、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応の前又は当該抗原抗体反応時等に当該ペリオスチンと界面活性剤若しくは還元剤を接触させる。

0275

測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗ペリオスチン抗体、又は試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。

0276

測定の操作法の例を以下挙げる。
例えば、まず、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」並びに「界面活性剤」(若しくは「還元剤」)を含有する測定試薬、又は「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬及び「界面活性剤」(若しくは「還元剤」)を含有する測定試薬等を調製し、準備する。

0277

次に、例えば、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」並びに「界面活性剤」(又は「還元剤」)を含有する測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料とを接触させる。[同時に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤(又は「還元剤」)が接触する。]

0278

または、「界面活性剤」(若しくは「還元剤」)を含有する測定試薬と、試料とを混合することにより試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤(若しくは還元剤)を接触させ、次にこの混合液に「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する試薬を混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料を接触させる。

0279

これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」の「抗ペリオスチン抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。

0280

そして、これより生成した、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」(抗ペリオスチン抗体=固相担体=抗ペリオスチン抗体)と「ペリオスチン」との複合体凝集物(…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=固相担体=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=固相担体=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…)を測定する。

0281

この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。

0282

そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質(ペリオスチンの濃度が既知の試料)を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度(定量値)を算出する。

0283

なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、1波長測定であっても、又は2波長測定(2つの波長による差又は比)であってもよい。
なお、測定波長は、340nmから1,000nmの中から選ばれるのが一般的である。

0284

なお、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置(専用機)であってもよい。

0285

また、本発明におけるペリオスチンの測定は、1ステップ法(1試薬法)により行ってもよいし、又は2ステップ法(2試薬法)等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。

0286

なお、以下、ラテックス比濁法を測定原理とする方法によりペリオスチンの測定を行う場合を例にとって、より具体的に説明を行う。

0287

〔a〕抗原抗体反応の前に接触させる場合
(1) まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第1試薬:
ペリオスチン測定用前処理剤[界面活性剤(又は還元剤)を含有する緩衝液(水系溶媒)]
第2試薬:
「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」を含有する緩衝液

0288

(2)血清等の試料の一定量と前記の第1試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応の前に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤(又は還元剤)を接触させる。
なお、試料と第1試薬の混合比率(量比)は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1℃〜30℃)又は微温(30℃〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい。(例えば、37℃等)

0289

(3) 一定時間後、前記の試料と第1試薬との混合液に、前記の第2試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。
なお、第2試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1℃〜30℃)又は微温(30℃〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい。(例えば、37℃等)
そして、前記の静置の時間は、1分間以上、かつ10分間以下の一定時間であることが好ましく、3分間以上、かつ5分間以下の一定時間であることがより好ましい。

0290

試料と第1試薬との混合液への第2試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。

0291

そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=ラテックス粒子=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=ラテックス粒子=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。

0292

(4) そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。

0293

(5) そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量(濃度)の算出を行う。

0294

〔b〕抗原抗体反応時に接触させる場合
(1) まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第1試薬:
緩衝液(水系溶媒)
第2試薬:
「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」、並びに「界面活性剤」(又は「還元剤」)を含有する緩衝液

0295

(2)血清等の試料の一定量と前記の第1試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第1試薬の混合比率(量比)は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1℃〜30℃)又は微温(30℃〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい。(例えば、37℃等)

0296

(3) 一定時間後、前記の試料と第1試薬との混合液に、前記の第2試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。[これにより、更に、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応時に、試料に含まれていたペリオスチンと界面活性剤(又は還元剤)を接触させる。]
なお、第2試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1℃〜30℃)又は微温(30℃〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい。(例えば、37℃等)
そして、前記の静置の時間は、1分間以上、かつ10分間以下の一定時間であることが好ましく、3分間以上、かつ5分間以下の一定時間であることがより好ましい。

0297

試料と第1試薬との混合液への第2試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。

0298

そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=ラテックス粒子=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体=ラテックス粒子=抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。

0299

(4) そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。

0300

(5) そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少(吸光度の増加)又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量(濃度)の算出を行う。

0301

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

0302

〔実施例1〕(本発明の効果の確認−1)[界面活性剤]
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の試料に含まれるペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定用の前処理剤、ペリオスチンの測定方法、及びペリオスチン測定の感度の改善方法の効果を確かめた。

0303

1.ペリオスチンの調製
ペリオスチン(ヌクレオチド配列:核酸データベースGenBankのAccession NumberD13666のヌクレオチド配列、アミノ酸配列:核酸データベースGenBankのAccession NumberBAA02837のアミノ酸配列)にV5/Hisタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるS2細胞において発現させた上で精製した。

0304

具体的には、S2細胞の形質転換体は次のように調製した。
pMT/Bip/V5−HisAプラスミド(Invitrogen社、米国カリフォルニア州Carlsbad)にペリオスチンの上記部分をコードするcDNAを挿入して、これをpMT/Bip/periostin−V5−HisAとした。

0305

次に、S2細胞にこのpMT/Bip/periostin−V5−HisA及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるpAcHygro(Invitrogen社、米国カリフォルニア州Carlsbad)を公知の方法で共導入し、形質転換した。

0306

次に、ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得た。
そして、S2細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にV5/Hisタグの結合したペリオスチンを発現させた。

0307

そして、このC末端に6個のヒスチジンが結合したS2リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行った。
まず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体S2細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。

0308

次に、この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)〔137mMの塩化ナトリウム、2.68mMの塩化カリウム、1.47mMのリン酸二水素カリウム、及び8.04mMのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液(pH7.4)〕に透析した後、ニッケルレジン(Ni−NTA Agarose、Qiagen社、ドイツ国Hilden)と混合して、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
次に、レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてS2リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出することにより、ペリオスチンを取得した。
なお、作成したプラスミドのDNAの配列を確認し、組み込まれた配列が目的通りのものであることを確認した。

0309

2.抗ペリオスチンモノクローナル抗体
〔1〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製−1回目
以下の手順により、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。(1回目)

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