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技術 MUC1由来のペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物、免疫誘導剤、及び抗原提示細胞の製造方法

出願人 日本電気株式会社
発明者 宮川知也岡正朗硲彰一玉田耕治宇高恵子
出願日 2016年3月9日 (4年8ヶ月経過) 出願番号 2017-505372
公開日 2018年1月18日 (2年10ヶ月経過) 公開番号 WO2016-143814
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 ペプチド又は蛋白質 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 微生物、その培養処理
主要キーワード 非タンパク性アミノ酸 能動学習 助教授 油性タイプ マルチタイプ 除反応 セルカウント 非水溶性溶剤
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2018年1月18日)のものです。
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図面 (5)

課題・解決手段

本発明は、配列番号1〜12のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した8以上のアミノ酸残基を含み、且つ11以下のアミノ酸残基から成るペプチド、を提供する。

概要

背景

生体内では、常時偶発的に癌細胞が発生すると考えられているが、通常は自然免疫による癌細胞由来の特異的な癌抗原の排除反応が起こり、次いで、特異的免疫応答誘導され、リンパ球等による癌細胞の排除反応が起こると想定されている。

癌細胞由来の抗原が認識されるためには、細胞表面上に存在するヒト白血球抗原HLA)とリンパ球が複合体を形成する必要がある。主要組織適合性抗原であるHLA分子は、クラスI分子(HLA−A型、B型C型)と、クラスII分子(HLA−DP型、DQ型、DR型)に大別される。細胞傷害性T細胞(CTL)による癌細胞の排除反応は、癌細胞表面のHLAクラスI分子に提示された、8〜11のアミノ酸からなる癌抗原(CTLエピトープ)がCTL上のT細胞抗原受容体(TCR)により特異的に認識されることで誘導される。

現在、様々な免疫関連疾患治療又は予防への応用を期待して免疫原性ペプチドの探索が行われており、例えば、特開平8−151396号公報には、特定のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドがHLA結合性を有する旨記載されている。

概要

本発明は、配列番号1〜12のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した8以上のアミノ酸残基を含み、且つ11以下のアミノ酸残基から成るペプチド、を提供する。

目的

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、HLAクラスI分子に結合する免疫原性ペプチド、特に、CTLを誘導し得るペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物免疫誘導剤、及び抗原提示細胞の製造方法等を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

列番号1〜12のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した8以上のアミノ酸残基を含み、且つ11以下のアミノ酸残基から成るペプチド

請求項2

前記アミノ酸配列中、1又は数個アミノ酸置換、挿入、欠失又は付加しており、且つ免疫原性を有する、請求項1に記載のペプチド。

請求項3

前記アミノ酸配列中、第2位のアミノ酸がチロシンフェニルアラニンメチオニントリプトファンバリンロイシン又はグルタミンで、そして/あるいはC末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン又はバリンで置換されている、請求項2に記載のペプチド。

請求項4

請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドを含む、癌の治療又は予防のための医薬組成物

請求項5

ワクチンの形態である、請求項4に記載の医薬組成物。

請求項6

前記ペプチドが1又は複数の型のHLA分子と結合することができる、請求項4又は5に記載の医薬組成物。

請求項7

請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドを含む免疫誘導剤

請求項8

細胞傷害性T細胞誘導するための、請求項7に記載の免疫誘導剤。

請求項9

前記ペプチドが1又は複数の型のHLA分子と結合することができる、請求項7又は8に記載の免疫誘導剤。

請求項10

請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドと抗原提示細胞とをin vitroで接触させる工程を含む、CTL誘導活性を有する抗原提示細胞の製造方法。

技術分野

0001

本発明は、MUC1由来ペプチド、より具体的には、ヒト白血球抗原との結合を介してT細胞抗原提示する免疫原性ペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物免疫誘導剤及び抗原提示細胞の製造方法等に関する。

背景技術

0002

生体内では、常時偶発的に癌細胞が発生すると考えられているが、通常は自然免疫による癌細胞由来の特異的な癌抗原の排除反応が起こり、次いで、特異的免疫応答誘導され、リンパ球等による癌細胞の排除反応が起こると想定されている。

0003

癌細胞由来の抗原が認識されるためには、細胞表面上に存在するヒト白血球抗原(HLA)とリンパ球が複合体を形成する必要がある。主要組織適合性抗原であるHLA分子は、クラスI分子(HLA−A型、B型C型)と、クラスII分子(HLA−DP型、DQ型、DR型)に大別される。細胞傷害性T細胞(CTL)による癌細胞の排除反応は、癌細胞表面のHLAクラスI分子に提示された、8〜11のアミノ酸からなる癌抗原(CTLエピトープ)がCTL上のT細胞抗原受容体(TCR)により特異的に認識されることで誘導される。

0004

現在、様々な免疫関連疾患の治療又は予防への応用を期待して免疫原性ペプチドの探索が行われており、例えば、特開平8−151396号公報には、特定のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドがHLA結合性を有する旨記載されている。

先行技術

0005

特開平8−151396号公報

発明が解決しようとする課題

0006

HLA結合性を有するペプチドは多数知られているが、各種の癌の治療又は予防に用いることのできるペプチドがさらに求められている。また、HLAは多型性富む遺伝子であるため、複数のHLA型に対応したマルチタイプの免疫原性ペプチドについての要求もある。

課題を解決するための手段

0007

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、HLAクラスI分子に結合する免疫原性ペプチド、特に、CTLを誘導し得るペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物、免疫誘導剤、及び抗原提示細胞の製造方法等を提供することを目的とする。

0008

即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
(1)配列番号1〜12のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した8以上のアミノ酸残基を含み、且つ11以下のアミノ酸残基から成るペプチド。
(2)前記アミノ酸配列中、1又は数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失又は付加しており、且つ免疫原性を有する、(1)に記載のペプチド。
(3)前記アミノ酸配列中、第2位のアミノ酸がチロシンフェニルアラニンメチオニントリプトファンバリンロイシン又はグルタミンで、そして/あるいはC末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン又はバリンで置換されている、(2)に記載のペプチド。
(4)(1)〜(3)のいずれかに記載のペプチドを含む、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
(5)ワクチンの形態である、(4)に記載の医薬組成物。
(6)前記ペプチドが1又は複数の型のHLA分子と結合することができる、(4)又は(5)に記載の医薬組成物。
(7)(1)〜(3)のいずれかに記載のペプチドを含む免疫誘導剤。
(8)細胞傷害性T細胞を誘導するための、(7)に記載の免疫誘導剤。
(9)前記ペプチドが1又は複数の型のHLA分子と結合することができる、(7)又は(8)に記載の免疫誘導剤。
(10)(1)〜(3)のいずれかに記載のペプチドと抗原提示細胞とをin vitroで接触させる工程を含む、CTL誘導活性を有する抗原提示細胞の製造方法。

発明の効果

0009

近年、癌の治療法として免疫療法が注目されている。本発明のペプチドはHLA結合性が高く、且つCTL誘導能も高いため、がんワクチンとしての有用性が強く期待される。また、種々の免疫療法、特に樹状細胞療法への応用も想定される。

0010

ムチン(Mucin)は正常及び悪性の様々な上皮細胞発現する、巨大糖たんぱく質である(DevinePLand McKenzie IF: Mucins: structure, function, and associations with malignancy. Bioessays 14: 619-625, 1992.)ムチンポリペプチドの一つMUC1は、細胞表面の細胞膜を貫通して発現するユニークな糖たんぱく質である(Gendler SJ, Lancaster CA, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Peat N, Burchell J, Pemberton L, Lalani EN and Wilson D: Molecular cloning and expression of human tumor-associated polymorphic epithelial mucin. J Biol Chem 265: 15286-15293, 1990.)
がん細胞が持つMUC1の糖修飾不完全であり(Hanisch FG, Stadie TR, Deutzmann F and Peter-Katalinic J: MUC1 glycoforms in breast cancer - cell line T47D as a model for carcinoma-associated alterations of O-glycosylation. Eur J Biochem 236: 318-327, 1996.)、MUC1に対するキラーT細胞が誘導されていることが、膵臓がん乳がん卵巣がん等で報告されている(20 Barnd DL, Lan MS, Metzgar RS and Finn OJ: Specific, major histocompatibility complex-unrestricted recognition of tumorassociated mucins by human cytotoxic T cells. Proc Natl Acad Sci USA 86: 7159-7163, 1989.
21 Jerome KR, Barnd DL, Bendt KM, Boyer CM, Taylor-Papadimitriou J, McKenzie IF, Bast RC Jr and Finn OJ: Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinoma recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res 51: 2908-2916, 1991.
22 IoannidesCG, Fisk B, Fan D, Biddison WE, Wharton JT and O'Brian CA: Cytotoxic T cells isolated from ovarian malignant ascites recognize a peptide derived from theHER-2/neu protooncogene. Cell Immunol 151: 225-234, 1993.)。
また、本発明のペプチドのうち特定のものについては複数のHLA型に結合することができる。よって、本発明のペプチドによれば、極めて広範な癌患者群をカバーする癌ワクチン、樹状細胞療法の提供等が可能になる。

図面の簡単な説明

0011

図1は、MUC1に対する樹状細胞/CTL療法を受けた患者(HLA型:24:02/33:03)由来のサンプルを配列番号1、3、5又は10のペプチドで刺激した場合のELISAアッセイの結果(IFN−γ産生細胞数)を示す。
図2は、MUC1に対する樹状細胞/CTL療法を受けた患者(HLA型:24:02/33:03)由来のサンプルを配列番号1、3、5又は10のペプチドで刺激した場合のELISAアッセイの結果(IFN−γ産生細胞数)を示す。
図3は、MUC1に対する樹状細胞/CTL療法を受けた患者(HLA型:02:06/24:02)由来のサンプルを配列番号1、3、5又は10のペプチドで刺激した場合のELISAアッセイの結果(IFN−γ産生細胞数)を示す。
図4は、MUC1に対する樹状細胞/CTL療法を受けた患者(HLA型:02:01/02:06)由来のサンプルを配列番号1、2、3、5、10又は11のペプチドで刺激した場合のELISAアッセイの結果(IFN−γ産生細胞数)を示す。

0012

1.免疫原性ペプチド
本発明に係るペプチドは配列番号1〜12のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した8以上のアミノ酸残基を含み、且つ合計11以下、好ましくは10以下、より好ましくは9以下のアミノ酸残基から成るペプチドである。本発明のペプチドは配列番号1〜12のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。本発明のペプチドは腫瘍関連抗原の一つであるムチン1(MUC1)に由来する。
MUC1を構成するアミノ酸配列に基づき、能動学習実験法(特開平11−316754号公報)を用いて得られる仮説により予測された、HLA分子との結合性が−logKd値に換算して3以上であるアミノ酸配列が選択された。

0013

本発明のペプチドを構成するアミノ酸配列とそのHLA結合予測スコアについて以下の表1に示す。

0014

本発明のペプチドはHLA結合性があり、且つ免疫原性を有する(以降、単に「HLAペプチド」又は「免疫原性ペプチド」と称する場合もある)。本明細書で使用する場合、「免疫原性」とは免疫反応を誘導することができることを意味し、例えば、CTL誘導活性を有し、延いては癌細胞に対する細胞傷害活性を有することを意味する。

0015

好ましい態様において、本発明のペプチドはHLA−A遺伝子Aの対立遺伝子型の複数と結合することができるマルチHLAペプチドである。例えば、配列番号10のペプチドは、HLA−A*24:02遺伝子の産物(HLA−A*24:02分子)、HLA−A*02:01遺伝子の産物(HLA−A*02:01分子)及びHLA−A*02:06遺伝子の産物(HLA−A*02:06分子)と強く結合するとともに、高い免疫原性を有するものである。

0016

本発明のペプチドが結合し得るHLAサブタイプはHLA−A*24:02、HLA−A*02:01及びHLA−A*02:06に限定されるものではない。しかしながら、これらのHLAサブタイプは日本人を含む東洋人の85%程度、また西洋人の55%程度を網羅するものであるため、本発明のマルチHLAペプチドは免疫療法等において広い患者カバー率を有すると考えられる。

0017

本発明のペプチドは、免疫原性を保持する限り、配列番号1〜12のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基又はその一部が修飾されていてもよい。配列番号1〜12で表されるアミノ酸配列は抗原提示細胞上で提示される状態を意図しているが、本発明のペプチドを直接体内に投与した場合、投与経路によっては消化器官などでその末端消化されるなどの変化を受けることがある。よって、本発明のペプチドは、抗原提示細胞上で所定のHLAクラスI分子と結合する際に配列番号1〜12で示されるアミノ酸残基が保持されているように、抗原提示細胞に取り込まれる前はN末端及び/又はC末端に1又は複数のアミノ酸残基等が付加された前駆体の状態で存在していてもよい。

0018

更に、本発明のペプチドは所望の免疫原性を有する限り、本発明のペプチドを構成する1個又は数個のアミノ酸残基が置換、挿入、欠失又は付加されているか、そして/あるいは糖鎖付加、側鎖酸化、及び/又はリン酸化などの修飾がされていてもよい。本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工アミノ酸変異体、誘導体を含む。本明細書においてアミノ酸は、天然タンパク性L-アミノ酸;D-アミノ酸;アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸;ノルロイシンβ-アラニンオルニチンなどの天然非タンパク性アミノ酸;及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸(α−メチルアラニンなど)、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸(β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン及びα-メチル-ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸(「ホモ」アミノ酸)及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸(システイン酸など)が挙げられる。

0019

アミノ酸残基の置換等に関して、HLAに結合性を示すペプチド配列規則性を考慮して(J. Immunol., 152: p3913, 1994; Immunogenetics, 41: p178, 1995; J. Immunol., 155: p4307, 1994)、当業者は適宜本発明のペプチドを構成するアミノ酸残基を置換することができる。

0020

より具体的には、HLA−A*24:02分子に結合するペプチドの場合、ペプチドを構成する第2位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンで置換されてもよく、そして/あるいはC末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンで置換されていてもよい。また、HLA−A*02:01分子に結合するペプチドの場合、第2位のアミノ酸がロイシン又はメチオニンで置換されてもよく、そして/あるいはC末端のアミノ酸がバリン又はロイシンで置換されていてもよい。更に、HLA−A*02:06分子に結合するペプチドの場合、第2位のアミノ酸がバリン又はグルタミンに置換されてもよく、そして/あるいはC末端のアミノ酸がバリン又はロイシンで置換されていてもよい。

0021

本発明のペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、Fmoc法やtBoc法等の固相法または液相法により人工合成してもよい。また、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを発現させることにより所望のペプチドを製造してもよい。また、こうして得られたペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて同定可能である。例えば、エドマン分解法質量分析法などを用いて同定可能である。

0022

2.医薬組成物
本発明に係る癌の治療又は予防のための医薬組成物は、有効成分として、例えば、配列番号1〜12から成る群から選択される1種以上のアミノ酸配列における連続した8以上のアミノ酸残基を含み、且つ、合計11以下、好ましくは10以下、より好ましくは9以下のアミノ酸残基からなるペプチドを含む。医薬組成物に含まれるペプチドは配列番号1〜12のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。当該ペプチドは上文で定義したとおりである。

0023

本発明のペプチドは抗原提示細胞上で提示されることによりCTLを誘導し、この誘導されたCTLが癌細胞を傷害する。そのため、本発明の医薬組成物の有効成分は本発明のペプチドに限定されず、CTLを直接的又は間接的に誘導し得る成分、例えば同ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクター、あるいは同ペプチドとHLA分子との複合体を表面に提示する抗原提示細胞又は抗原提示細胞から分泌されるエキソソーム、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。使用する抗原提示細胞としてマクロファージ、樹状細胞等が挙げられるが、CTL誘導能が高い樹状細胞を使用することが好ましい。癌治療に使用されることが知られているその他の成分、例えばケモカインサイトカイン腫瘍壊死因子化学療法剤等を本発明の医薬組成物に含めてもよい。ペプチドの用量は、例えば患者が成人の場合1日当たり約1〜10mgであってもよい。しかしながら、用量は患者の年齢、体重、投与方法等に応じて変動するため、当業者により適宜決定される。

0024

限定されることを意図するものではないが、本発明の医薬組成物は以下の作用機序により癌細胞の殺傷等に有用であると考えられる。本発明の医薬組成物が特定の癌患者に投与されることにより、医薬組成物中のペプチドは抗原提示細胞表面にHLA分子と結合した状態で提示される。CTLはこのような抗原提示細胞上のペプチドを認識すると活性化し、増殖して全身循環に回る。ペプチドに特異的なCTLが癌組織侵入すると、癌細胞の表面にあるHLA分子に自然に結合している特異的癌抗原由来の同一ペプチドを認識して、その癌細胞を殺傷する。この働きにより癌の治療に寄与することができる。

0025

癌の治療のみならず、本発明の医薬組成物は癌の予防に使用することができる。例えば、本発明の医薬組成物を健康な人体に投与することにより、CTLが誘導され、誘導された細胞傷害性T細胞が体内で留まるため、特定の癌細胞が発生したときに、この癌細胞を傷害することができる。同様に、癌治療後の人体に投与することにより、癌の再発を予防してもよい。

0026

治療又は予防される癌としては、MUC1を発現するあらゆる癌が想定される。限定することを意図するものではないが、より具体的には膵臓癌肝細胞癌前立腺癌肺癌乳癌大腸癌血液癌脳腫瘍腎臓癌皮膚癌等が対象として挙げられる。例えば、本発明のペプチドの由来であるMUC1は膵臓癌で過剰発現しているため、本発明のペプチドは特に膵臓癌の治療又は予防に有効であると考えられる。治療又は予防されるべき癌が複数種類存在している場合、免疫原性ペプチド等の有効成分を複数種類本発明の医薬組成物に含有させることができる。

0027

本発明の医薬組成物は、水溶性溶剤に溶かして、製薬上許容される塩の形態で製剤にして、患者に投与することができる。このような製薬上許容される塩の形態としては、生理的に受け入れられる水溶性の塩、例えばナトリウムカリウムマグネシウムカルシウム、などの塩の形で生理的なpHにて緩衝させた形態が挙げられる。また、水溶性溶剤の他に、非水溶性溶剤を用いることもでき、このような非水溶性溶剤としては、例えばエタノールプロピレングリコールなどのアルコールが挙げられる。

0028

また、本実施形態の医薬組成物を含む製剤には、様々な目的に対する薬剤を含めてもよく、このような薬剤としては、例えば保存剤緩衝剤などが挙げられる。保存剤としては、ナトリウム重亜硫酸、ナトリウム重硫酸、ナトリウムチオ硫酸塩ベンザルコニウムクロロブタノールチメロサール酢酸フェニル水銀硝酸フェニル水銀メチルパラベンポリビニルアルコールフェニルエチルアルコールアンモニアジチオスレイトールベータメルカプトエタノールなどが挙げられる。また、緩衝剤としては、炭酸ナトリウムホウ酸ナトリウムリン酸ナトリウム酢酸ナトリウム重炭酸ナトリウムなどが挙げられる。これら薬剤は、系のpHを2〜9、好ましくは4〜8の間で維持することができる量で存在することができる。

0029

本発明の医薬組成物の剤型も特に限定されないが、ワクチンの形態として使用される場合、その剤型は注射剤筋肉、皮下、皮内)、経口製剤点鼻製剤等が例示される。本発明の医薬組成物がワクチンの形態である場合、複数種類の有効成分を含む混合カクテルワクチンであってもよい。例えば、このようなワクチンは配列番号1〜12で表されるペプチドのうちのいずれか2つ以上、又は他の有効成分との組み合わせで複数種類有効成分を含有し得る。

0030

また、本発明のワクチンは、医薬組成物以外の成分であり、それ自身には活性がなく、医薬組成物のワクチンとしての効果をより一層高める効果のある成分を含んだ不活性成分含有ワクチンであってもよい。不活性成分としては、アジュバントトキソイドなどが挙げられる。アジュバントの例としては、限定することを意図するものではないが、水酸化アルミニウムリン酸アルミニウムリン酸カルシウム等の沈降性タイプのもの、フロイント完全アジュバントフロイント不完全アジュバント等の油性タイプのものが挙げられる。

0031

本発明の医薬組成物は、ワクチンの形態で存在する場合、好ましくは皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射または注入、あるいは経皮、又は咽頭などの粘膜からの吸入などにより、体内に投与される。その一回投与量は、細胞傷害性T細胞を有意に誘導できる量から有意な数の非癌細胞が傷害を受けない量の間にて設定することができる。

0032

本発明の医薬組成物は、人体への投与のみならず、体外での使用も意図される。より具体的には、本発明の医薬組成物は、抗原提示細胞をin vitro又はex vivoで刺激してCTL誘導活性を増大するために使用されてもよい。例えば、癌樹状細胞療法に使用される場合を例に説明すると、本発明の医薬組成物は、癌の治療又は予防を必要とする患者に由来する樹状細胞等の抗原提示細胞に予め接触された後、この抗原提示細胞を患者の体内に戻すことで患者に投与され得る。医薬組成物に含まれるペプチドは、例えばリポフェクション法、インジェクション法等により抗原提示細胞内に導入することができる。このような用途において本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが使用される場合、ポリヌクレオチドは当業界で公知の手法により抗原提示細胞に導入され得る。例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法マイクロインジェクション法細胞融合法、DEAEデキストラン法、リン酸カルシウム法等により、対象のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターで患者由来の抗原提示細胞をin vitroで形質転換等してもよい。

0033

3.免疫誘導剤
本発明に係る免疫誘導剤は、有効成分として、例えば、配列番号1〜12から成る群から選択される1種以上のアミノ酸配列における連続した8以上のアミノ酸残基を含み、且つ、合計11以下、好ましくは10以下、より好ましくは9以下のアミノ酸残基からなるペプチドを含む。免疫誘導剤に含まれるペプチドは配列番号1〜12のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。当該ペプチドは上文で定義したとおりである。

0034

本発明のペプチドは抗原提示細胞上で提示されることにより免疫を誘導すると考えられる。そのため、本発明の免疫誘導剤の有効成分は本発明のペプチドに限定されず、免疫を直接的又は間接的に誘導し得る成分、例えば本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含む発現ベクター、あるいは同ペプチドとHLA分子との複合体を表面に提示する抗原提示細胞又は抗原提示細胞から分泌されるエキソソーム、あるいはこれらの組み合わせであってもよい。使用する抗原提示細胞としてマクロファージ、樹状細胞等が挙げられるが、CTL誘導能が高い樹状細胞を使用することが好ましい。

0035

本発明の免疫誘導剤は、人体への投与のみならず、体外での使用も意図される。より具体的には、本発明の免疫誘導剤は、抗原提示細胞をin vitro又はex vivoで刺激してCTL誘導活性を増大するために使用されてもよい。例えば、樹状細胞療法に使用される場合を例に説明すると、本発明の免疫誘導剤は、免疫誘導を必要とする患者に由来する樹状細胞等の抗原提示細胞に予め接触された後、この抗原提示細胞を患者の体内に戻すことで患者に投与され得る。免疫誘導剤に含まれるペプチドは、例えば、リポソームを介したトランスフェクション(リポフェクション法)、インジェクション法等により抗原提示細胞内に導入することができる。このような用途において本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが使用される場合、ポリヌクレオチドは当業界で公知の手法により抗原提示細胞に導入され得る。例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、DEAEデキストラン法、リン酸カルシウム法等により、対象のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを発現するベクターで患者由来の抗原提示細胞をin vitroで形質転換等してもよい。

0036

本明細書で使用する場合、「免疫誘導」とは免疫反応を誘導し、例えば、抗原提示細胞のCTL誘導活性を増大させ、更にはCTLの癌細胞に対する細胞傷害活性を増大させることを意味する。また、本明細書で使用する場合、「CTL誘導」とは、in vitro又はin vivoにおいて、本発明のペプチドが抗原提示細胞表面上に提示されることによりある抗原を特異的に認識するCTLを誘導又は増殖するか、ナイーブT細胞を、癌細胞等の標的細胞を殺傷する能力(細胞傷害活性)を持つエフェクター細胞分化させるか、そして/あるいはCTLの細胞傷害活性を増大させることを意味する。CTL誘導活性は、CTLによるサイトカイン(例えばインターフェロン(IFN)−γ)産生を評価することで測定することができる。例えば、本発明のペプチドで刺激された末梢血単核細胞等の抗原提示細胞により前駆細胞から誘導されたサイトカイン産生細胞の増大を、ELISPOT(Enzyme-Linked ImmunoSpot)法またはELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法等の公知の高感度イムノアッセイを用いて評価することによりCTL誘導活性を測定してもよい。細胞傷害活性も51Cr遊離法等の公知の手法により測定できる。上記活性がコントロールと比較して有意に増大している場合、例えば5%以上、10%以上、20%以上、好ましくは50%以上増大している場合、免疫又はCTLが誘導されていると評価することができる。

0037

4.抗原提示細胞の製造方法
本発明に係る抗原提示細胞の製造方法は、例えば、配列番号1〜12から成る群から選択される1種以上のアミノ酸配列における連続した8以上のアミノ酸残基を含み、且つ、合計11以下、好ましくは10以下、より好ましくは9以下のアミノ酸残基からなるペプチドと抗原提示細胞とをin vitroで接触させる工程を含む。本発明の製造方法で使用されるペプチドは配列番号1〜12のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。当該ペプチドは上文で定義したとおりである。

0038

本発明の製造方法で使用されるペプチドは、抗原提示細胞表面のHLAクラスI分子に結合し、抗原ペプチドとしてCTLに提示され、それにより抗原提示細胞のCTL活性を誘導すると考えられる。そのため、抗原提示細胞と接触させるのは本発明のペプチドに限定されず、CTLを直接的又は間接的に誘導し得る成分、例えば同ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクター、あるいは同ペプチドとHLA分子との複合体を表面に提示する抗原提示細胞又は抗原提示細胞から分泌されるエキソソーム、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。使用する抗原提示細胞としてマクロファージ、樹状細胞等が挙げられるが、CTL誘導能が高い樹状細胞を使用することが好ましい。

0039

本発明の製造方法で製造される抗原提示細胞は、上記医薬組成物又は免疫誘導剤の有効成分として使用されるだけではなく、免疫療法等のために使用されることが意図される。例えば、癌樹状細胞療法に使用される場合を例に説明すると、製造される抗原提示細胞は、免疫誘導を必要とする患者に由来する、CTL誘導能の低い樹状細胞等の抗原提示細胞に予め接触させた後、この抗原提示細胞を患者の体内に戻すことで患者に投与され得る。本発明のペプチドは、例えば、リポソームを介したトランスフェクション(リポフェクション法)、インジェクション法等により抗原提示細胞内に導入することができる。このような用途において本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが使用される場合、ポリヌクレオチドは当業界で公知の手法により抗原提示細胞に導入され得る。例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、DEAEデキストラン法、リン酸カルシウム法等により、対象のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターで患者由来の抗原提示細胞をin vitroで形質転換等してもよい。

0040

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

0041

具体的に、本実施例における予測・実験・評価の手順は、国際公開2006/004182号パンフレットに記載された能動学習実験計画に基づいて行い、全体として次のステップを繰り返してルール構築した。

0042

(1)後述する下位学習アルゴリズム試行1回分を行う。すなわち、蓄積データのランダムリサンプリングから複数の仮説を発現し、ランダムに発現された質問候補点(ペプチド)に対する予測値の分散が最も大きい点を、実験すべき質問点として選ぶ。

0043

(2)選ばれた質問点のペプチドを、後述する合成・精製法により製造し、実際の結合能を後述する実験により測定して蓄積データに加える。

0044

このような能動学習法を行うことにより、本来ならば、9アミノ酸残基からなるペプチドについて、HLA結合性ペプチドの全候補物質5000億(=209)通り以上について行う必要のある結合実験の数を削減できた。

0045

以上説明したようなルールにより、配列番号1〜12に示したアミノ酸配列を抽出した。

0046

<ペプチド合成と精製>
配列番号1〜12のアミノ酸配列を有するペプチドは、Fmocアミノ酸を用い、Merrifieldの固相法にて、マニュアル合成をした。脱保護の後、C18カラムを用いて逆相HPLC精製をし、95%以上の純度にした。ペプチドの同定と純度の確認は、MALDI−TOF質量分析にて行った(AB SCIEX MALDI−TOF/TOF5800)。ペプチドの定量は、BSAを標準蛋白質としてMicro BCAアッセイ(Thermo Scientific社)にて行った。

0047

<ペプチドのHLA−A*24:02分子への結合実験>
HLA−A*24:02遺伝子の産物であるHLA−A*24:02分子へのペプチドの結合能の測定は、HLA−A*24:02分子を発現するC1R−A24細胞(熊本大学、滝口雅文教授作成のものを、許可を得て愛媛大学、安川正貴助教授から供与いただいた。)を用いて行った。

0048

まず、C1R−A24細胞をpH3.3の酸性条件に30秒曝し、HLA−A*24:02分子に元来結合している内因性ペプチドと、HLAクラスI分子に共通して会合している軽鎖β2mを解離、除去した。中和後、C1R−A24細胞に精製β2mを添加し、ペプチドの希釈列に加えて、上4時間インキュベートした。この間に再会合したHLA−A*24:02分子、ペプチド、β2mの3者の会合体MHC−pep)を認識する蛍光標識モノクローナル抗体17A12を用いて染色した。

0049

その後、個々のC1R−A24細胞当たりのMHC−pep数(上記蛍光抗体蛍光強度に比例する)を、蛍光細胞解析装置FACScan(Becton−Dickinson社)を用いて定量測定した。1細胞当たりの平均蛍光強度から、本発明者が論文(Udaka et al., Immunogenetics, 51, 816−828, 2000)に発表した方法にて、HLA−A*24:02分子とペプチド間の結合解離定数Kd値を算出した。

0050

<ペプチドのHLA−A*02:01分子への結合実験>
HLA−A*02:01遺伝子の産物であるHLA−A*02:01分子へのペプチドの結合能の測定は、HLA−A*02:01分子を発現する細胞株T2(ATCCより購入)を用いて行った。

0051

結合能を測定したいペプチドの段階希釈列にT2細胞と精製β2mを加えたのち、37℃で4時間インキュベートした。この時点までにペプチドの濃度依存性に発現量が増加したHLA−A*02:01分子を、会合型特異的な蛍光標識モノクローナル抗体BB7.2を用いて染色した。

0052

その後、1細胞あたりの蛍光量フローサイトメーターにて測定し、本発明者が論文(Udaka et al.,Immunogenetics, 51, 816−828, 2000)に発表した方法にて、解離定数Kd値を算出した。

0053

<ペプチドのHLA−A*02:06分子への結合実験>
HLA−A*02:06遺伝子の産物であるHLA−A*02:06分子へのペプチドの結合能の測定は、マウスのTAP(transporter associated with antigen processing)欠損細胞株であるRMASに、HLA−A*02:06遺伝子のcDNAを導入したRA2.6細胞(高知大学にて新たに作成した細胞株)を用いて行った。

0054

まずRA2.6細胞を26℃で一晩培養し、細胞表面にペプチドを結合していないHLA−A*02:06分子が蓄積したところへペプチドの希釈列を加え、26℃で60分結合させた。

0055

その後35℃で4時間培養することにより、ペプチドを結合していない空のHLA−A*02:06分子が変性し、立体構造が失われる。そこへ、ペプチド結合型HLA−A*02:06分子を特異的に認識する蛍光標識モノクローナル抗体BB7.2を加え、氷上で20分インキュベートし、細胞を染色した。

0056

その後、1細胞あたりの蛍光量をフローサイトメーターにて測定し、本発明者論文(Udaka et al.,Immunogenetics, 51, 816−828, 2000)に発表した方法にて、解離定数Kd値を算出した。

0057

<結合実験の評価結果>
その結果、以下の表に示すような各HLA分子に対する本発明のペプチドの結合実験データが得られた。

0058

尚、配列番号1〜12のアミノ酸配列は、GENBANKに登録されているMUC1の所定のゲノムタンパク質全長配列(配列番号13)(>sp|P15941|MUC1_HUMANMucin-1 OS=Homo sapiens GN=MUC1 PE=1SV=3)に由来する。

0059

<ペプチド免疫誘導試験
(1)ペプチド刺激樹状細胞の調製
・Day0〜9(樹状細胞の誘導)
MUC1に対する樹状細胞/CTL療法を受けた患者[0]からフェレーシスにより得られた末梢血単球のうち、培養フラスコ接着した細胞画分AIM−CM培地(Gibco社製)中で10日間、37℃で培養した。培養期間中、培地に対し0日目及び3日目にIL−4を15μl、顆粒球単球コロニー刺激因子GM-CSF)を30μLそれぞれ添加し、5日目にIL−4を15μl、GM−CSFを30μl、腫瘍壊死因子(TFN)-αを75μl添加した。

0060

・Day10(ペプチド刺激及び樹状細胞の回収
誘導した樹状細胞を新たにAIM−CM培地中に回収し、本発明のペプチド(配列番号1〜12)が20μg/mlとなるよう添加した。その後、樹状細胞を含む培地を2時間37℃で培養した。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして以下のペプチドを使用した。
HLA−A*24:02用ポジティブコントロール(EBVLMP2, 419-427:TYGPVFMCL(配列番号14))
HLA−A*24:02用ネガティブコントロール(HIVenv gp160, 584-592:RYLRDQQLL(配列番号15))
HLA−A*02:01用ポジティブコントロール(Flu A MP, 58-66:GILGFVFTL(配列番号16))
HLA−A*02:01用ネガティブコントロール(HIV gap p17, 77-85:SLYNTVATL(配列番号17))
HLA−A*02:06用ポジティブコントロール(EBV LMP2 453-461:LTAGFLIFL(配列番号18))
HLA−A*02:06用ネガティブコントロール(HIV gap p24 341-349:ATLEEMMTA(配列番号19))

0061

樹状細胞を回収し十分な量のAIM−CM培地で3回以上洗浄した後セルカウントした。

0062

(2)CD8T細胞の調製
・Day0〜9
上記ワクチンで2回以上治療された後の患者からフェレーシスにより得られた末梢血単球のうち、培養フラスコに接着しない浮遊細胞画分(リンパ球を)含む)をAIM−CM培地(Gibco社製)中で10日間、37℃で培養した。培養期間中、培地に対し4日目及び6日目にそれぞれIL−2を40μl添加した。

0063

・Day10
CD8ネガティブセレクションキット(Miltenyi社製)を用いて培地からCD8 T細胞を分離しセルカウントした。

0064

(3)共培養
上記(1)及び(2)で得られた樹状細胞とCD8T細胞を以下の条件にてAIM−CM培地中で37℃で共培養した。
・CD8T細胞:5×105cells/well
・樹状細胞 :2×105cells/well

0065

・Day12又は13
上記培地にIL−2 20U/mlを含んだAIM−CM培地0.4ml/wellを添加した。

0066

(5)ELISAアッセイ
・Day17
T細胞と上記ペプチドでパルスした樹状細胞の共培養7日目の培養上清を、x1, x5, x25, x125の4段階に希釈し、Human IFN-γ ELISA MAX Deluxe Set (BioLegend社製)を用いて、測定限度内に収まる希釈段階を同定した。その後、同定した希釈段階にて、各サンプルにつき3回ずつ測定を行った。代表的なELISAアッセイの結果として、HLA型が24:02/33:03の患者、24:02/33:03の患者、11:01/24:02の患者、02:06/24:02の患者、02:01/02:06の患者、についてのものを順に図1〜4に示す。

実施例

0067

以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

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