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技術 蛍光検出方法および検出用試料セル

出願人 富士フイルム株式会社
発明者 大塚尚
出願日 2015年8月17日 (5年6ヶ月経過) 出願番号 2016-549906
公開日 2017年8月3日 (3年6ヶ月経過) 公開番号 WO2016-047027
状態 特許登録済
技術分野 光学的測定セル 自動分析、そのための試料等の取扱い 蛍光または発光による材料の調査,分析
主要キーワード 通常流路 未結合状態 透光性誘電体 ポアズイユ 検出液 電荷濃度 試料液流路 連続分離
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重要な関連分野

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図面 (14)

課題

蛍光標識と特異的に結合する被検出物質捕捉する蛍光検出方法およびその検出用試料セルにおいて、捕捉する被検出物質の量を増加させ、高感度且つ検出時間の短縮を実現する。

解決手段

蛍光標識(F)と特異的に結合する抗原(A)を含有する試料液(S)を試料液流路(113)に流下させる。抗原(A)および蛍光標識(F)を含有しない混相液(G)を混相液流路(114)に流下させる。試料液(S)および混相液(G)を試料液流路(113)および混相液流路(114)のいずれの幅よりも狭い二相流流路(115)に導き、二相流流路(115)において、試料液(S)と混相液(G)との二相流を発生せしめ、試料液(S)を側壁(115a)に沿って流下させる。側壁(115a)に設けられた検出部(200)に蛍光標識(F)と特異的に結合した抗原(A)を捕捉させ、検出部(200)に励起光(L)を照射して蛍光を検出し、検出された蛍光に基づいて抗原(A)の存在量を検出する。

概要

背景

近年、病室家庭等での検査を可能にするPOCT(Point Of Care Testing)検査が注目を集めている。このPOCT検査を実現するため、マイクロ流路を備えた検出用試料セルを用いた生化学検査の研究が盛んに行われている。

マイクロ流路を利用する生化学検査としては蛍光法が広く用いられている。蛍光法は、特定波長の光に励起されて蛍光を発する蛍光標識、および蛍光標識と特異的に結合する被検出物質を含有する試料液をマイクロ流路に流下させ、マイクロ流路の一部に設けられた固体表面(固相)である検出部に捕捉させる。そして、蛍光標識と特異的に結合する被検出物質を捕捉した検出部に向けて励起光照射し、蛍光標識が発する蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて、被検出物質の存在量を検出する方法である。

蛍光法には、感度の向上を図るため、検出部の表面から染み出すエバネッセント波を利用するエバネッセント蛍光法や、エバネッセント蛍光法の感度をさらに向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強を利用した表面プラズモン増強蛍光法等が知られている。

また、感度の向上を図るには、検出部に捕捉される被検出物質の量を増加させることも重要である。図7Aや図7Bに示されるような、検出部の表面に直交する方向に試料液を送液する技術(特許文献1)や、図8に示されるような、試料液を検出部上で往復させる送液技術(特許文献2)が提案されている。

また、反応物質が固定された反応流路と、試料液を反応流路に導く試料注入流路と、試料液以外の流体を反応流路に導く他の流路を設け、反応流路内において、試料液以外の流体により試料液を反応物質側の一壁面に沿って流下させる技術(特許文献3)も提案されている。

しかしながら、マイクロ流路内を流下する蛍光粒子は、図9に示すように、中央部分に偏って流下する傾向がある(非特許文献1)。したがって、蛍光粒子が検出部近傍を通過するように流下させることが望まれるが、技術的には確立されていない。なお、マイクロ流路を用いた微粒子分離分級する手法については提案されている(非特許文献2および3)。

概要

蛍光標識と特異的に結合する被検出物質を捕捉する蛍光検出方法およびその検出用試料セルにおいて、捕捉する被検出物質の量を増加させ、高感度且つ検出時間の短縮を実現する。蛍光標識(F)と特異的に結合する抗原(A)を含有する試料液(S)を試料液流路(113)に流下させる。抗原(A)および蛍光標識(F)を含有しない混相液(G)を混相液流路(114)に流下させる。試料液(S)および混相液(G)を試料液流路(113)および混相液流路(114)のいずれの幅よりも狭い二相流流路(115)に導き、二相流流路(115)において、試料液(S)と混相液(G)との二相流を発生せしめ、試料液(S)を側壁(115a)に沿って流下させる。側壁(115a)に設けられた検出部(200)に蛍光標識(F)と特異的に結合した抗原(A)を捕捉させ、検出部(200)に励起光(L)を照射して蛍光を検出し、検出された蛍光に基づいて抗原(A)の存在量を検出する。

目的

本発明は、上記事情に鑑み、検出部に捕捉される、蛍光標識と特異的に結合した被検出物の量を増加させ、高感度且つ検出時間の短縮を実現する蛍光検出法および検出用試料セルを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

被検出物質と特異的に結合する蛍光標識を用意し、前記被検出物質および前記蛍光標識を含有する試料液試料液流路流下させ、前記被検出物質および前記蛍光標識を含有しない混相液を混相液流路に流下させ、前記試料液流路より流下された前記試料液および前記混相液流路より流下された前記混相液を、前記試料液流路および前記混相液流路よりも幅の狭い二相流流路に導き、前記二相流流路において、前記試料液と前記混相液との二相流を発生せしめ、前記試料液を前記二相流流路の一側壁に沿って流下させ、前記一側壁に設けた検出部に前記蛍光標識と特異的に結合した前記被検出物質を捕捉させ、前記検出部に励起光照射し、前記励起光の照射により前記蛍光標識が発する蛍光を検出し、前記検出した蛍光の量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法

請求項2

前記混相液流路として、前記試料液流路の幅以上の幅を有する流路を用いる請求項1に記載の蛍光検出方法。

請求項3

前記励起光を照射する工程において、前記励起光の照射により前記検出部からエバネッセント光を染み出させ、前記エバネッセント光により前記蛍光標識が前記蛍光を発する請求項1または2に記載の蛍光検出方法。

請求項4

前記検出部が金属膜を備え、前記励起光を照射する工程が、前記金属膜に対して、全反射以上の入射角で前記励起光を照射することより、前記金属膜上に電場を増強する表面プラズモンを発生させる請求項3に記載の蛍光検出方法。

請求項5

前記蛍光標識として、前記励起光および前記蛍光を透過する透光性誘電体材料中に蛍光色素分子を内包してなる蛍光ビーズを用いる請求項1〜4のいずれか1項に記載の蛍光検出方法。

請求項6

前記蛍光ビーズが親水性を有するものであり、前記混相液に1.8パーセント以上の濃度を有する生理食塩水を用いる請求項5に記載の蛍光検出方法。

請求項7

前記蛍光ビーズが親水性を有するものであり、前記混相液として有機溶媒を用いる請求項5に記載の蛍光検出方法。

請求項8

前記蛍光ビーズを酸性または塩基性官能基表面修飾し、前記試料液のpHを前記官能基が電離分解できる値とし、前記混相液のpHを前記官能基が電離分解できない値とする請求項5に記載の蛍光検出方法。

請求項9

前記混相液に蛍光色素を有さないビーズを含有させ、前記混相液の単位体積当たりの前記ビーズの数を前記試料液の単位体積当たりの前記蛍光ビーズの数よりも多くする請求項5に記載の蛍光検出方法。

請求項10

請求項1〜9のいずれかに1項に記載の蛍光検出方法に使用される検出用試料セルであって、前記試料液を流下させる試料液流路と、前記混相液を流下させる混相液流路と、前記試料流路下流端と前記混相液流路の下流端とに連通し且つ前記試料液流路および前記検出液流路のいずれの幅よりも狭い幅を有する二相流流路と、前記蛍光標識と特異的に結合した前記被検出物質を捕捉する、前記二相流流路の側壁の一部に設けられた検出部とを備えた検出用試料セル。

請求項11

前記混相液流路の幅が前記試料液流路の幅以上である請求項10に記載の検出用試料セル。

請求項12

前記二相流流路の幅が5μm以上100μm未満の範囲である請求項10または11に記載の検出用試料セル。

請求項13

前記試料液流路の下流端と、前記混相液流路の下流端と、前記二相流流路の上流端とが互いに連通する請求項10〜12のいずれか1項に記載の検出用試料セル。

請求項14

前記試料液流路と前記二相流流路とのなす角度が、前記混相液流路と前記二相流流路とのなす角度に等しい請求項13に記載の検出用試料セル。

技術分野

0001

本発明は蛍光検出方法および検出用試料セルに関する。より詳しくは、蛍光標識と特異的に結合する被検出物質マイクロ流路流下させ、マイクロ流路に設けた検出部に捕捉させ、励起光照射して蛍光標識が発する蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて、被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法および検出用試料セルに関する。

背景技術

0002

近年、病室家庭等での検査を可能にするPOCT(Point Of Care Testing)検査が注目を集めている。このPOCT検査を実現するため、マイクロ流路を備えた検出用試料セルを用いた生化学検査の研究が盛んに行われている。

0003

マイクロ流路を利用する生化学検査としては蛍光法が広く用いられている。蛍光法は、特定波長の光に励起されて蛍光を発する蛍光標識、および蛍光標識と特異的に結合する被検出物質を含有する試料液をマイクロ流路に流下させ、マイクロ流路の一部に設けられた固体表面(固相)である検出部に捕捉させる。そして、蛍光標識と特異的に結合する被検出物質を捕捉した検出部に向けて励起光を照射し、蛍光標識が発する蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて、被検出物質の存在量を検出する方法である。

0004

蛍光法には、感度の向上を図るため、検出部の表面から染み出すエバネッセント波を利用するエバネッセント蛍光法や、エバネッセント蛍光法の感度をさらに向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強を利用した表面プラズモン増強蛍光法等が知られている。

0005

また、感度の向上を図るには、検出部に捕捉される被検出物質の量を増加させることも重要である。図7A図7Bに示されるような、検出部の表面に直交する方向に試料液を送液する技術(特許文献1)や、図8に示されるような、試料液を検出部上で往復させる送液技術(特許文献2)が提案されている。

0006

また、反応物質が固定された反応流路と、試料液を反応流路に導く試料注入流路と、試料液以外の流体を反応流路に導く他の流路を設け、反応流路内において、試料液以外の流体により試料液を反応物質側の一壁面に沿って流下させる技術(特許文献3)も提案されている。

0007

しかしながら、マイクロ流路内を流下する蛍光粒子は、図9に示すように、中央部分に偏って流下する傾向がある(非特許文献1)。したがって、蛍光粒子が検出部近傍を通過するように流下させることが望まれるが、技術的には確立されていない。なお、マイクロ流路を用いた微粒子分離分級する手法については提案されている(非特許文献2および3)。

0008

特開2011−257266号公報
国際公開WO2011/027851号
特開2008−203158号公報

先行技術

0009

D.Ross et al., Anal. Chem. 2001, 73, 2509
山田真澄、関実混相流19巻2号(2005)pp.102-107 「マイクロフルイディクスを利用した微粒子の連続分離分級
山田真澄、関実真空Vol.49 No.7, 2006 pp.404-408 「マイクロ流路を用いた粒子の分級」

発明が解決しようとする課題

0010

蛍光標識と特異的に結合する被検出物質を検出部に捕捉させるには、被検出物質を検出部の表面から100nm程度の領域まで近接させる必要がある。図10はマイクロ流路を流下する試料液の送液を示す模式図である。

0011

しかしながら、被検出物質(抗原)は、図10からも明らかなように、マイクロ流路内の中央付近に偏って流下され、大半の被検出物質は検出部の近傍の領域を通過しない。したがって、分散により検出部近傍に到達する被検出物の量は、試料液内の全被検出物質に対して、0.001パーセント程度に過ぎない。すなわち殆どの被検出物質が検出部に捕捉されず、高感度な検出が困難となる虞がある。

0012

また、マイクロ流路の幅は、製造上の観点より、上記近傍領域より1000倍程広い100μm程度となり、中央付近に位置する被検出物質が、分散により検出部近傍に到達するには時間が掛かり、短時間での検出が困難となる虞もある。

0013

層流として流下する試料液に対しては、特許文献1および2のような、単に試料液を検出部に向けて送液する技術や、特許文献3のような、他の流体を用いて試料液を所望の方向に導く技術では、被検出物を短時間で検出部付近に移動させることは困難である。また、非特許文献1〜3には、蛍光法において、検出部に捕捉される被検出物質を増加させることについては何ら提言もされていない。

0014

本発明は、上記事情に鑑み、検出部に捕捉される、蛍光標識と特異的に結合した被検出物の量を増加させ、高感度且つ検出時間の短縮を実現する蛍光検出法および検出用試料セルを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0015

上記課題を解決するため、本発明に係る蛍光検出方法は、被検出物質と特異的に結合する蛍光標識を用意し、被検出物質および蛍光標識を含有する試料液を試料液流路に流下させ、被検出物質および蛍光標識を含有しない混相液を混相液流路に流下させ、試料液流路より流下された試料液および混相液流路より流下された混相液を、試料液流路および混相液流路よりも幅の狭い二相流流路に導き、二相流流路において、試料液と混相液との二相流を発生せしめ、試料液を二相流流路の一側壁に沿って流下させ、一側壁に設けた検出部に蛍光標識と特異的に結合した被検出物質を捕捉させ、検出部に励起光を照射し、照射により蛍光標識が発する蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて被検出物質の存在量を検出する。

0016

また、上記「照射により蛍光標識が発する蛍光」とは、励起光の照射により直接若しくは間接的に蛍光標識が励起されて発生する蛍光を意味する。また、上記「被検出物質の存在量を検出する」とは、被検出物質の存在の有無を含み、その存在量を定量的に検出する意味である。

0017

また、本発明に係る蛍光検出方法は、混相液流路として、試料液流路の幅以上の幅を有する流路を用いることが望ましい。

0018

また、本発明に係る蛍光検出方法において、励起光の照射により検出部からエバネッセント光を染み出させ、エバネッセント光により蛍光標識が蛍光を発生させることが望ましい。

0019

また、本発明に係る蛍光検出方法において、検出部が金属膜を備え、金属膜に対して、全反射以上の入射角で励起光を照射することより、金属膜上に電場を増強する表面プラズモンを発生させることが望ましい。

0020

また、本発明に係る蛍光検出方法において、蛍光標識として、励起光および蛍光を透過する透光性誘電体材料中に蛍光色素分子を内包してなる蛍光ビーズを用いることが望ましい。

0021

また、本発明に係る蛍光検出方法において、蛍光ビーズが親水性を有するものであり、混相液が1.8パーセント以上の濃度を有する生理食塩水であることが望ましい。ここで、「濃度」とは塩化ナトリウム含有濃度を意味する。

0022

また、本発明に係る蛍光検出方法において、蛍光ビーズが親水性を有するものであり、混相液として有機溶媒を用いることが望ましい。

0023

また、本発明に係る蛍光検出方法において、蛍光ビーズを酸性または塩基性官能基表面修飾し、試料液のpHを官能基が電離分解できる値とし、混相液のpHを官能基が電離分解できない値とすることが望ましい。

0024

また、本発明に係る蛍光検出方法において、混相液に蛍光色素を有さないビーズを含有させ、混相液の単位体積当たりの蛍光ビーズの数を試料液の単位体積当たりの蛍光ビーズの数よりも多くすることが望ましい。

0025

また、本発明に係る検出用試料セルは、本発明に係る蛍光検出方法に使用される検出用試料セルであって、試料液を流下させる試料液流路と、混相液を流下させる混相液流路と、試料流路下流端および混相液流路の下流端に連通し且つ試料液流路および検出液流路のいずれの幅よりも狭い幅を有する二相流流路と、蛍光標識と特異的に結合した被検出物質を捕捉する、二相流流路の側壁の一部に設けられた検出部とを備えるものであってもよい。

0026

また、本発明に係る検出用試料セルにおいて、混相液流路の幅が試料液流路の幅以上であることが望ましい。

0027

また、本発明に係る検出用試料セルにおいて、二相流流路の幅が5μm以上100μm未満の範囲であることが望ましい。

0028

また、本発明に係る検出用試料セルにおいて、試料液流路の下流端と、混相液流路の下流端と、二相流流路の上流端とが互いに連通するものが望ましい。

0029

また、本発明に係る検出用試料セルにおいて、試料液流路と二相流流路とのなす角度が、混相液流路と二相流流路とのなす角度と等しいことが望ましい。

発明の効果

0030

本発明の蛍光検出方法によれば、二相流流路において、試料液と混相液との二相流を発生せしめ、試料液を二相流流路の一側壁に沿って流下させ、一側壁に設けた検出部に蛍光標識と特異的に結合した被検出物質を捕捉させ、検出部に励起光を照射し、照射により蛍光標識が発する蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて被検出物質の存在量を検出するため、蛍光標識と特異的に結合する被検出物質が検出部側の側壁に沿って検出部近傍を流下され、検出部に捕捉される量が増加して高感度且つ検出時間の短縮を実現できる。

図面の簡単な説明

0031

蛍光検出装置の模式図
蛍光検出装置のブロック図
マイクロ流路内の模式図
マイクロ流路の部分拡大図
通常の検出用試料セルを用いた検出画像(その1)
通常の検出用試料セルを用いた検出画像(その2)
二相流流路を有する検出用試料セルを用いた検出画像(その1)
二相流流路を有する検出用試料セルを用いた検出画像(その2)
従来技術による試料液の送液を示す図(その1)
従来技術による試料液の送液を示す図(その2)
従来技術による試料液の送液を示す図(その3)
マイクロ流路内を流下する蛍光粒子の画像
マイクロ流路内を流下する試料液の送液を示す模式図

実施例

0032

以下、図面を参照して本発明の一実施形態を詳細に説明する。本実施形態は、被検出物質としての抗原Aを検出する方法である。図1は本発明の実施形態に用いられる蛍光検出装置1の模式図である。図2は蛍光検出装置1のブロック図である。蛍光検出装置1は、一例として表面プラズモン増強蛍光法を利用した装置とする。

0033

蛍光検出装置1には、抗原Aを含有する検体液を収容する検体容器KB、抗原Aを捕捉する検出用試料セル100およびノズルチップNCが装着される。検体液は、例えば血清血漿、尿等であり、抗原Aとしては、例えばhCGが挙げられる。

0034

蛍光検出装置1は、ノズルチップNC等を駆動させる検体処理部11、検出用試料セル100に励起光を照射する光照射部12、励起光の照射により発生した蛍光を検出する蛍光検出部13、検出した蛍光数を計測して抗原Aの存在量を分析するデータ分析部14を備えている。

0035

検出用試料セル100は、マイクロ流路110が形成された基材100a、蛍光標識Fを含有する試薬を収容する試薬セル120、混相液Gを収容する混相液セル130、試料液Sを注入する注入ウェル140、混相液Gを注入する注入ウェル150、試料液Sおよび混相液Gを排出する排出ウェル160が形成された蓋材100b、マイクロ流路110の一部に設けられた、抗原Aを捕捉する検出部200を備えている。

0036

基材100aには、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリメチルメタクリレートPMMA)、ポリカーボネート(PC)、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィンAPO)等の樹脂を用いることが望ましい。

0037

蛍光標識Fは、抗原Aと特異的に結合し、励起光が照射されると蛍光を発するものである。また、混相液Gは抗原Aおよび蛍光標識Fを含有しない溶液である。試料液Sが体液由来、例えば血清、血漿、尿、鼻水の場合、混相液Gとしては、生理食塩水の通常の濃度(0.9パーセント程度)の2倍以上(1.8パーセント以上)の濃度を有する生理食塩水が挙げられ、具体的にはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いることが望ましい。

0038

マイクロ流路110には、検体処理部11により試料液Sおよび混相液Gが流下される。試料液Sは、ノズルチップNCが検体容器KBより検体液を抽出し、試薬セル120内で混合・撹拌して作製される。試料液Sは、蛍光標識Fと特異的に結合した抗原A、未結合状態の抗原Aおよび蛍光標識Fを含有する。

0039

図3は、マイクロ流路110内の検出部200近傍の模式図である。検出部200は、マイクロ流路の内壁の一部に成膜された金属膜201と、金属膜201に固定された一次抗体Bとから構成される。検出部200は、抗原抗体反応によって抗原Aに一次抗体Bが特異的に結合することにより、抗原Aを捕捉する。

0040

一次抗体Bは、抗原Aの種類に応じて適宜調整可能である。例えばhCGである抗原Aに対しては、抗hCGモノクローナル抗体(Anti−hCG 5008 SP−5,Medix Biochemical社製)を用いることができる。そして、一次抗体Bは、末端カルボキシル基化してアミノカップリング法を施すことにより、金属膜201上に固定される。

0041

蛍光標識Fは、蛍光ビーズFBと蛍光ビーズFBに固定された二次抗体Cとで構成される。二次抗体Cも抗原抗体反応により抗原Aと特異的に結合するものである。検出部200は、蛍光ビーズFBに固定された二次抗体Cと特異的に結合した抗原Aを一次抗体Bと特異的に結合させて捕捉する(サンドイッチ方式)。

0042

蛍光ビーズFBは、蛍光色素分子を、この蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する材料で内包するビーズであることが望ましい。具体的に、蛍光ビーズFBは、ポリスチレン粒子調液したポリスチレン溶液、蛍光色素の蛍光色素溶液をそれぞれ作製し、混合・エバポレートしながら含浸させた後、遠心分離を施して作製される。

0043

作製された蛍光ビーズFBの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一であり、且つ各蛍光ビーズFBの粒径は均一である。蛍光ビーズFBの粒径は、1μm以上5μm未満が望ましく、1μm以上3μm未満がより望ましい。蛍光ビーズFBとして、例えばBangs Laboratories,Inc社製の粒径が1μm、励起波長が660nm、蛍光波長が690nmのビーズを用いることができる。

0044

二次抗体Cも抗原Aに応じて適宜調整可能である。例えばhCGである抗原Aに対しては、抗hCGモノクローナル抗体(Anti−Alpha subunit 6601 SPR−5,Medix Biochemical社製)を用いることができる。二次抗体Cは、蛍光ビーズFBをカルボキシル基で表面修飾し、二次抗体Cの末端をアミノ基化してアミノカップリング法を施すことにより、蛍光ビーズFBに固定される。

0045

検出部200が、蛍光ビーズFBが固定された二次抗体Cと特異的に結合した抗原Aを捕捉した後、光照射部12が、検出部200の裏面側より励起光Lを全反射条件となる入射角度プリズムを介して金属膜201に照射する。

0046

励起光Lが照射されると、金属膜201上にエバネッセント波Eが滲み出す。このエバネッセント波Eと金属膜201の自由電子との速度が等しくなると、金属膜201上にプラズモン共鳴が励起され、光の吸収・表面プラズモン増強電場が発生する。そして、エバネッセント波Eにより蛍光ビーズFBが励起されて増強された蛍光を発する。なお、表面プラズモン増強電場は、金属膜201の表面より約200nm程度の範囲で発生する。

0047

蛍光ビーズFBが蛍光を発すると、蛍光検出部13が、蛍光を蛍光信号として検出する。蛍光検出部13としては、例えばフォトダイオード、CCD、CMOS等を用いることができる。また、蛍光検出部13は、励起光を遮断する不図示のフィルタを用いて、蛍光信号のみを検出する。

0048

蛍光検出部13が蛍光信号を検出すると、データ分析部14が、蛍光信号に基づいた検出画像を作成し、検出画像内の所定面積当たりの蛍光量を計測して抗原Aの存在数を分析する。

0049

データ分析部14は、試料液Sおよび混相液Gを流下させ、所定時間(例えば1分〜20分)経過した後に、抗原Aの存在数を分析してもよいし、試料液Sおよび混相液Gを流下させつつ、蛍光信号を一定間隔(例えば5分間)サンプリングすることにより、蛍光強度時間変化率に基づいて抗原Aの存在数を分析してもよい(レート法)。

0050

検出用試料セル100のマイクロ流路110の構造およびその作用について説明する。図4はマイクロ流路110の部分拡大図を示す図である。

0051

マイクロ流路110は、注入ウェル140(図1参照)と連通して試料液Sを流下させる試料液流路113、注入ウェル150(図1参照)と連通して混相液Gを流下させる混相液流路114、試料液流路113の下流端および混相液流路114の下流端に連通する二相流流路115、二相流流路115の下流端および排出ウェル160(図1参照)に連通する排出流路116から構成される。

0052

試料液流路113と二相流流路115とは角度θ1をなして連通し、混相液流路114と二相流流路115とは角度θ2をなして連通している。また、試料液流路113の下流端、混相液流路114の下流端、二相流流路115の上流端は互いに連通している。試料液流路113、混相液流路114および二相流流路115はそれぞれ一定幅の流路であるが、二相流流路115の幅d3は、試料液流路113の幅d1および混相液流路114の幅d2のいずれよりも狭くなっている。

0053

また、排出流路116は、角度θ3をなして下流方向に向けて幅が拡大する拡幅部116aと拡幅部116aに連通する定幅部116bとを有している。このように、試料液流路113、混相液流路114、二相流流路115および排出流路116は、いわゆるピンチド流路構造を構成するものである。

0054

また、検出部200は、二相流流路115の、試料液流路113側の側壁115aの一部に設けられている。検体処理部11が、試料液Sを注入ウェル140、混相液Gを注入ウェル150にそれぞれ注入して排出ウェル160に負圧を掛けることにより、試料液Sおよび混相液Gが同一の流速で試料液流路113および混相液流路114をそれぞれ流下し、二相流流路115に同時に導かれる。

0055

そして、二相流流路115に導かれた試料液Sおよび混相液Gは、ピンチド流路構造の作用により、二相流流路115において、試料液Sが側壁115a側に、混相液Gが反対側の側壁115b側にそれぞれ沿って二相流として流下する。

0056

試料液Sに含有される、抗原A、蛍光標識Fおよび蛍光標識と特異的に結合した抗原Aは、試料液流路113においては、層流により中央部分に偏って流下されるが、二相流流路115に導かれると、いわゆるピンチドフローフラクショネーション法の原理により、抗原A、蛍光標識Fおよび蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aは、側壁115aに押し付けられながら流下される。

0057

したがって、試料液S内の蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aが、金属膜201の近傍を通過することになり、検出部200に捕捉される抗原Aの量を増加させることができる。なお、検出部200に未結合の抗原Aが捕捉された後に、側壁115aに沿って流下された未結合の蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aの量も増加する。

0058

検出部200に捕捉されなかった蛍光標識Fと特異的に結合した抗原A、未結合の抗原Aおよび蛍光標識Fは排出流路116に導かれる。排出流路116においては、その大きさに応じて、未結合の蛍光標識Fおよび蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aからなるグループと未結合の抗原Aからなるグループとが、互いに異なる流下方向で流下され、排出ウェル160より排出される。

0059

また、二相流流路115に導く混相液Gの流量は、二相流流路115に導く試料液Sの量よりも多くすることが望ましい。これにより、二相流流路115において、試料液Sの幅が混相液Gの幅よりも狭くなり、蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aが検出部200に近接する確率が高くなり、検出部200に捕捉される抗原Aの量を増加させることができる。具体的には、混相液流路114の幅d2を試料液流路113の幅d1よりも広くすることが望ましい。なお、混相液流路114および二相流流路115内の全体で層流となるために試料液Sおよび混相液Gの流量を調整することが望ましい。具体的には、ハーゲンポアズイユ流れ(Hagen-Poiseuille flow)の式を用いて流速分布より各流量を算出することができる。

0060

また、二相流流路115において、試料液Sと混相液Gとからなる二相流が発生し易くするため、試料液流路113と二相流流路115とのなす角度θ1と混相液流路114と二相流流路115とのなす角度θ2とは等しいことが望ましい。また、角度θ1および角度θ2は110〜160度の範囲であることが望ましい。また、拡幅部116aの角度θ3は90度〜130度の範囲であることが望ましい。

0061

また、二相流流路115の幅d3は、5μm以上100μm未満の範囲とすることが望ましく、5μm以上10μm未満とすることがより望ましい。また、試料液流路113の幅d1および混相液流路114の幅d2は、10μm以上2000μm未満とすることが望ましい。なお、試料液流路113、混相液流路114、二相流流路115および排出流路116は、それぞれ均一な深さを有し、その深さは互いに等しいものである。

0062

本実施形態の優位性について詳細に説明する。最初に、二相流路構造を有さないマイクロ流路が形成された通常の検出用試料セルを用いた分析結果を説明する。図5Aは、抗原Aのモル濃度が90pMの試料液Sを通常の検出用試料セルに15分間流下させた後の検出画像を示す。図5Bは、抗原Aのモル濃度が0pMの試料液Sを上記通常流路の検出用試料セルに15分間流下させた後の検出画像を示す。

0063

蛍光顕微鏡を用いて計測された蛍光数は、図5Aにおいては単位面積(1mm2)当たり63個程度であった。図5Bの検出画像は抗原Aの存在量と相関する蛍光数を示す信号としての画像である。図5Bにおいては単位面積(1mm2)当たり25個程度であった。図5Bの検出画像は、金属膜201に非特異的に吸着した蛍光標識Fが発する蛍光数を示すものであり、ノイズを示す画像である。試料液Sの量は100μL程度である。

0064

次に、本実施形態の検出用試料セル100を用いた分析結果を説明する。図6Aは、抗原Aのモル濃度が90pMの試料液Sおよび混相液Gを検出用試料セル100に2分間流下させた後の検出画像である。図6Bは、抗原Aのモル濃度が0pMの試料液Sおよび混相液Gを検出用試料セル100に2分間流下させた後の検出画像を示す。二相流流路115内の試料液Sの量は100μL程度であり、混相液Gの量は3000μL程度である。

0065

計測された蛍光数は、図6Aにおいては単位面積(1mm2)当たり8125個程度、図6Bにおいては単位面積(1mm2)当たり156個程度であった。したがって、通常の検出用試料セルを用いた場合のS/N比が63/25となるのに対し、検出用試料セル100を用いた場合のS/N比は、8125/156となり、通常流路を用いた場合と比較して20倍程度の感度の向上を実現した。

0066

また、検出用試料セル100を用いた場合、蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aが側壁115aに沿って流下されるため、通常流路を用いた場合のように、抗原Aが金属膜201の近傍まで分散されるのを待機する必要がない。したがって、試料液Sの流速を高速化させることが可能であり、試料液Sおよび混相液Gを2分間流下させた後に検出画像を得ることができ、検出時間の短縮も実現した。なお、検出用試料セル100を用いた方法において、通常流路を用いた方法と同様に、試料液Sおよび混相液Gを15分間流下させた後の画像では、通常流路の場合よりも100倍を超えるS/Nが確認された。

0067

ここで、二相流流路115において、蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aが混相液Gに分散することを抑制することも、検出部200に捕捉される確率を向上させるものである。以下に、蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aが混相液Gに分散することを抑制できる本実施形態の第一〜第三の変形例を説明する。

0068

第一の変形例は、混相液G内に蛍光色素を有さないポリスチレンビーズを含有させる方法である。そして、第一の変形例では、混相液G内の単位体積当たりのポリスチレンビーズの数を試料液内の単位体積当たりの蛍光ビーズFBの数よりも多くする。

0069

これにより、混相液Gのビーズの濃度、すなわち単位体積当たりに含有するビーズ濃度が、試料液Sのビーズ濃度よりも高くなる。したがって、試料液Sと混相液Gとのビーズの濃度の差により、蛍光ビーズFBが高濃度の混相液Gに分散され難くなり、その結果として、蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aの混相液Gへの分散も抑制される。

0070

なお、第一の変形例では、混相液G内の蛍光色素を有さないポリスチレンビーズが、照射された励起光Lを散乱させてしまうため、データ分析部14は、前述のレート法よりも、試料液Sおよび混相液Gを所定時間経過した後に分析する方が望ましい。

0071

第二の変形例を説明する。第二の変形例は混相液Gとして有機溶媒を用いる方法である。蛍光ビーズFBは、前述の通り、官能基により表面修飾されている。官能基は、試料液S内でイオン化するため、蛍光ビーズFBの親水性を高くする。

0072

本実施形態では、前述の通り、酸性官能基であるカルボキシル基(−COOH)を用いており、このカルボキシル基は試料液S内ではCOO−にイオン化した状態となる。勿論、酸性官能基としてスルホン酸基等を用いても同様にイオン化した状態となる。

0073

また、蛍光ビーズFBを塩基性官能基で表面修飾した場合も蛍光ビーズFBの親水性を高くする。例えばアミノ基(−NH2)を用いると、試料液S内でNH3+にイオン化した状態となる。勿論、塩基性官能基として4級アンモニウム基等を用いても同様にイオン化した状態となる。

0074

したがって、混相液Gとして有機溶媒を用いると、蛍光ビーズFBにとって混相液Gは疎水的となり、その結果として、蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aの混相液Gへの分散が抑制される。具体的に、有機溶媒としてエタノールメタノールジメチルスルホキシド(DMSO)を用いることができる。

0075

第三の変形例を説明する。第三の変形例は官能基の種類に応じて混相液GのpHを調整する方法である。前述の通り、蛍光ビーズFBに官能基で表面修飾されると、試料液S内で官能基がイオン化した状態となる。そして、酸性官能基を用いると、蛍光ビーズFBはマイナス帯電され、塩基性官能基を用いると、蛍光ビーズFBはプラスに帯電される。なお、試料液SのpHは、官能基のイオン化を施す程度の値であり、具体的にpHは7.4程度である。

0076

第三の変形例では、混相液GのpH値を官能基がイオン化されないpHとする。具体的に、蛍光ビーズFBが酸性官能基で表面修飾される場合は、混相液GのpHを試料液SのpHよりも小さくし、蛍光ビーズFBが塩基性官能基で表面修飾される場合は、混相液GのpHを試料液のpHよりも大きくする。

0077

これにより、混相液Gの電荷濃度が試料液Sの電荷濃度より高くなる。したがって、試料液Sと混相液Gとの電荷濃度の差により、混相液G内では官能基が電荷分離し辛くなり、その結果として、蛍光標識Fと特異的に結合した抗原Aの混相液Gへの分散が抑制される。具体的に、蛍光ビーズFBが、酸性官能基で修飾される場合は混相液のpHを4未満にし、塩基性官能基で修飾される場合は混相液のpHが10を超えるようにすることが望ましい。

0078

以上、本発明の好ましい実施の形態およびその変形例を説明したが、本発明は、これらの実施形態およびその変形例に限定されるものではない。すなわち本発明は、検出部に捕捉される抗原Aの量を増加させて、蛍光法の高感度を実現するものであるから、表面プラズモン増強蛍光法以外に、エバネッセント蛍光法、光導波路を用いた蛍光検出法、種々の蛍光検出方法に適用させることができる。

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