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技術 2型糖尿病患者の治療薬選択の補助方法、治療薬の効果予測方法、検査方法及び治療方法

出願人 国立大学法人金沢大学学校法人同志社アルフレッサファーマ株式会社
発明者 御簾博文金子周一竹下有美枝篁俊成斎藤芳郎田中睦
出願日 2015年9月10日 (5年2ヶ月経過) 出願番号 2016-547506
公開日 2017年9月14日 (3年2ヶ月経過) 公開番号 WO2016-039426
状態 特許登録済
技術分野 非環式または炭素環式化合物含有医薬 生物学的材料の調査,分析 ペプチド又は蛋白質 化合物または医薬の治療活性 特有な方法による材料の調査、分析
主要キーワード 積率相関係数 金コロイド液 糖尿患者 エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム 金コロイド試薬 セレノシステイン残基 塩化金酸水溶液 測光ポイント
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (9)

課題・解決手段

2型糖尿病患者治療薬選択の補助方法、治療薬の効果予測方法検査方法及び治療方法を提供することを課題とする。 2型糖尿病患者由来検体(特に、血液)において、セレノプロテインP値カットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン投与の効果が高いことを見出し、本発明を完成した。

概要

背景

2型糖尿病
世界規模で増加し続ける2型糖尿病は、網膜・神経の合併症虚血性心疾患等の動脈硬化性疾患を促進することで人類のQOLと生命を脅かしており、その新たな治療法の開発は急務である。肝臓は、糖・脂質代謝主役を担うだけではなく、血管新生因子をはじめとする各種生理活性物質生体内最大の産生臓器である。2型糖尿病では、インスリンによる肝臓からの糖放出抑制作用は減弱しており、この現象インスリン抵抗性と呼ばれる。インスリン抵抗性は、肝臓からの糖放出亢進による高血糖及び脂質の産生亢進による高脂血症をもたらし、動脈硬化性疾患を促進する。さらに肝臓は、動脈硬化リスクにつながる血管新生因子をはじめとする各種生理活性物質の生体内最大の産生臓器である(参照:特許文献1)。

セレノプロテインP(SeP))
セレノプロテインP(SeP)は、セレン豊富に含む細胞外タンパク質であり、血漿セレンの53%を占める主要なセレノプロテインである。SePについて6種のモノクローナル抗体(BD1、BD3、BF2、AE2、AH5及びAA3)が知られ、SeP測定法として、2種のモノクローナル抗体を用いた酵素結合免疫吸着法ELISA)が開発されている。SePは、血漿カリクレインでの分解を受けることにより、N末端フラグメント及びC末端側フラグメントを生じ、上記の6種のモノクローナル抗体のうち、BD1、BD3、BF2、AE2及びAH5はN末端側フラグメントに対して特異的に反応し、AA3はC末端側フラグメントに対して特異的に反応する。AA3を用いたウェスタンブロット分析で確認されているように、血漿中には、SePの全長タンパク質と、血漿カリクレインでの分解による切断で生じたフラグメントタンパク質とが存在し得る。臨床研究の促進のために、生体内における血漿カリクレインによるSePの分解の有無又は程度が簡便に測定できる方法が求められている(参照:特許文献2)。

先行特許文献)
特許文献1は、「セレノプロテインPを測定することを含む、2型糖尿病の検出方法」を開示している。しかし、特許文献1は、「セレノプロテインP値指標として2型糖尿病の治療薬を選択する方法」を開示又は示唆をしていない。
特許文献2は、「検体中の被測定物質(セレノプロテインP)の長鎖型及び短鎖型を分別して測定する方法は、(a)該検体と、該長鎖型及び該短鎖型に結合し得る第1の特異的結合物質が結合した微小粒子及び該長鎖型に結合し得るが該短鎖型に結合しない第2の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、該微小粒子の凝集反応を測定する工程;(b)該検体と、異なる認識部位で該長鎖型及び該短鎖型に結合し得る、第3の特異的結合物質が結合した微小粒子及び第4の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、該微小粒子の凝集反応を測定する工程;(c)該(a)の測定値を用いて該長鎖型の量を決定する工程;及び(d)該(b)の測定値から該(a)の測定値を差し引いた値を用いて該短鎖型の量を決定する工程を含む。」を開示している。しかし、特許文献2は、「セレノプロテインP値を指標として2型糖尿病の治療薬を選択する方法」を開示又は示唆をしていない。

非特許文献
非特許文献1は、「セレノプロテインP発現は、メトホルミン投与治療により抑制されるが、AMPK阻害剤又はFoxO3a siRNAの共投与によりこの抑制は阻害される。メトホルミンは、AMPK阻害剤/FoxO3aパスウェイを介して、セレノプロテインP発現を抑制している。」を開示している。しかし、非特許文献1は、「セレノプロテインP値を指標として2型糖尿病の治療薬を選択する方法」を開示又は示唆をしていない。

概要

2型糖尿病患者の治療薬選択の補助方法、治療薬の効果予測方法検査方法及び治療方法を提供することを課題とする。 2型糖尿病患者由来の検体(特に、血液)において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン投与の効果が高いことを見出し、本発明を完成した。

目的

本発明は、2型糖尿病患者の治療薬選択の補助方法、治療薬の効果予測方法、検査方法及び治療方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

2型糖尿病患者由来検体において、セレノプロテインP値カットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与を選択することを特徴とする2型糖尿病治療薬選択の補助方法

請求項2

前記検体が、血液である請求項1に記載の治療薬選択の補助方法。

請求項3

前記カットオフ値が、3.5μg/mL〜4.7μg/mLである請求項1又は2に記載の治療薬選択の補助方法。

請求項4

2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与が有効であると判断することを特徴とする2型糖尿病の治療効果予測する方法。

請求項5

前記検体が、血液である請求項4に記載の治療効果を予測する方法。

請求項6

前記カットオフ値が、4.5μg/mL以上である請求項4又は5に記載の治療効果を予測する方法。

請求項7

2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与を選択することを特徴とする2型糖尿病の治療薬選択のための2型糖尿病患者由来の検体の検査方法

請求項8

前記検体が、血液である請求項7に記載の検査方法。

請求項9

前記カットオフ値が、3.5μg/mL〜4.7μg/mLである請求項7又は8に記載の検査方法。

請求項10

以下の工程を含む2型糖尿病の治療方法:(1)2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高いかどうかを判定する工程;及び(2)セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩を該患者に投与する工程。

請求項11

前記カットオフ値が、3.5μg/mL〜4.7μg/mLである請求項10に記載の治療方法。

技術分野

0001

本発明は、2型糖尿病患者由来検体において、セレノプロテインP値カットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与を選択することを特徴とする2型糖尿病治療薬選択の補助方法、治療薬の効果予測方法検査方法及び治療方法に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願2014-184499号優先権を請求する。

背景技術

0002

(2型糖尿病)
世界規模で増加し続ける2型糖尿病は、網膜・神経の合併症虚血性心疾患等の動脈硬化性疾患を促進することで人類のQOLと生命を脅かしており、その新たな治療法の開発は急務である。肝臓は、糖・脂質代謝主役を担うだけではなく、血管新生因子をはじめとする各種生理活性物質生体内最大の産生臓器である。2型糖尿病では、インスリンによる肝臓からの糖放出抑制作用は減弱しており、この現象インスリン抵抗性と呼ばれる。インスリン抵抗性は、肝臓からの糖放出亢進による高血糖及び脂質の産生亢進による高脂血症をもたらし、動脈硬化性疾患を促進する。さらに肝臓は、動脈硬化リスクにつながる血管新生因子をはじめとする各種生理活性物質の生体内最大の産生臓器である(参照:特許文献1)。

0003

(セレノプロテインP(SeP))
セレノプロテインP(SeP)は、セレン豊富に含む細胞外タンパク質であり、血漿セレンの53%を占める主要なセレノプロテインである。SePについて6種のモノクローナル抗体(BD1、BD3、BF2、AE2、AH5及びAA3)が知られ、SeP測定法として、2種のモノクローナル抗体を用いた酵素結合免疫吸着法ELISA)が開発されている。SePは、血漿カリクレインでの分解を受けることにより、N末端フラグメント及びC末端側フラグメントを生じ、上記の6種のモノクローナル抗体のうち、BD1、BD3、BF2、AE2及びAH5はN末端側フラグメントに対して特異的に反応し、AA3はC末端側フラグメントに対して特異的に反応する。AA3を用いたウェスタンブロット分析で確認されているように、血漿中には、SePの全長タンパク質と、血漿カリクレインでの分解による切断で生じたフラグメントタンパク質とが存在し得る。臨床研究の促進のために、生体内における血漿カリクレインによるSePの分解の有無又は程度が簡便に測定できる方法が求められている(参照:特許文献2)。

0004

先行特許文献)
特許文献1は、「セレノプロテインPを測定することを含む、2型糖尿病の検出方法」を開示している。しかし、特許文献1は、「セレノプロテインP値を指標として2型糖尿病の治療薬を選択する方法」を開示又は示唆をしていない。
特許文献2は、「検体中の被測定物質(セレノプロテインP)の長鎖型及び短鎖型を分別して測定する方法は、(a)該検体と、該長鎖型及び該短鎖型に結合し得る第1の特異的結合物質が結合した微小粒子及び該長鎖型に結合し得るが該短鎖型に結合しない第2の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、該微小粒子の凝集反応を測定する工程;(b)該検体と、異なる認識部位で該長鎖型及び該短鎖型に結合し得る、第3の特異的結合物質が結合した微小粒子及び第4の特異的結合物質が結合した微小粒子とを混合し、該微小粒子の凝集反応を測定する工程;(c)該(a)の測定値を用いて該長鎖型の量を決定する工程;及び(d)該(b)の測定値から該(a)の測定値を差し引いた値を用いて該短鎖型の量を決定する工程を含む。」を開示している。しかし、特許文献2は、「セレノプロテインP値を指標として2型糖尿病の治療薬を選択する方法」を開示又は示唆をしていない。

0005

非特許文献
非特許文献1は、「セレノプロテインP発現は、メトホルミン投与治療により抑制されるが、AMPK阻害剤又はFoxO3a siRNAの共投与によりこの抑制は阻害される。メトホルミンは、AMPK阻害剤/FoxO3aパスウェイを介して、セレノプロテインP発現を抑制している。」を開示している。しかし、非特許文献1は、「セレノプロテインP値を指標として2型糖尿病の治療薬を選択する方法」を開示又は示唆をしていない。

0006

国際公開2008/013324号公報
特開2014−52338号公報

先行技術

0007

January 3, 2014,Volume 289, (1), 335-345

発明が解決しようとする課題

0008

2型糖尿病治療において、メトホルミンを第一選択治療薬とするかDPP4(ジペプチジルペプチターゼ-4)阻害薬を第一選択治療薬とするかは主治医の裁量に委ねられている。しかし、2型糖尿病患者は、選択する治療薬により治療反応性の個人差が大きく、効果がない症例も多数存在する。
メトホルミンは、低血糖にほとんどならず、寿命延長エビデンスが存在する。しかし、メトホルミンは、抗がん作用消化管副作用下痢食欲低下)等も報告されており、治療反応性にかなりの個人差がある。
また、DPP4阻害薬は、インスリン分泌刺激効果があり、やはり血糖値降下作用に個人差があることが報告されている。
以上により、メトホルミンを第一選択治療薬とするかDPP4阻害薬を第一選択治療薬とするかを客観的に判断できる方法の要望があった。
すなわち、本発明は、2型糖尿病患者の治療薬選択の補助方法、治療薬の効果予測方法、検査方法及び治療方法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

0009

本発明者等は、上記課題を解決すべく、「2型糖尿病患者由来の検体(特に、血液)において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン投与の効果が高いこと」を見出し、本発明を完成した。

0010

すなわち、本発明は以下からなる。
1.2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与を選択することを特徴とする2型糖尿病の治療薬選択の補助方法。
2.前記検体が、血液である前項1に記載の治療薬選択の補助方法。
3.前記カットオフ値が、3.5μg/mL〜4.7μg/mLである前項1又は2に記載の治療薬選択の補助方法。
4.2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与が有効であると判断することを特徴とする2型糖尿病の治療効果予測する方法。
5.前記検体が、血液である前項4に記載の治療効果を予測する方法。
6.前記カットオフ値が、4.5μg/mL以上である前項4又は5に記載の治療効果を予測する方法。
7.2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与を選択することを特徴とする2型糖尿病の治療薬選択のための2型糖尿病患者由来の検体の検査方法。
8.前記検体が、血液である前項7に記載の検査方法。
9.前記カットオフ値が、3.5μg/mL〜4.7μg/mLである前項7又は8に記載の検査方法。
10.以下の工程を含む2型糖尿病の治療方法:
(1)2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高いかどうかを判定する工程;及び
(2)セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩を該患者に投与する工程。
11.前記カットオフ値が、3.5μg/mL〜4.7μg/mLである前項10に記載の治療方法。

発明の効果

0011

本発明は、2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン投与を選択することを特徴とする2型糖尿病の治療薬選択の補助方法、治療薬の効果予測方法、検査方法及び治療方法を提供することができる。
これにより、メトホルミン投与の治療効果を投与前に予測することが可能になり、メトホルミン投与の効果が期待される2型糖尿病患者には早期からメトホルミンを投与することにより、高い治療効果を得ることができる。

図面の簡単な説明

0012

血漿カリクレインによるセレノプロテインP(SeP)の切断を示す模式図。
FL−SeP測定系におけるSeP濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフ検量線)。縦軸は、吸光度変化量を表し、横軸はSeP濃度(μg/mL)を示す。
メトホルミン投与群での血糖値の変化及びHbA1c値の変化を示すグラフ(ピアソン積率相関係数を使用)。
DPP4阻害薬投与群での血糖値の変化及びHbA1c値の変化を示すグラフ(ピアソンの積率相関係数を使用)。
メトホルミン投与群及びDPP4阻害薬投与群でのセレノプロテインP値の変化を示すグラフ(ピアソンの積率相関係数を使用)。
メトホルミン投与群及びDPP4阻害薬投与群での血糖値の変化(ピアソンの積率相関係数を使用)。
メトホルミン投与群での投与前SeP値が高値(4.55μg/mL以上)の症例でのセレノプロテインP値の変化。
治療前の2型糖尿患者血清中のセレノプロテインP値の分布図。
選択したカットオフ値以上の症例でのメトホルミン投与群及びDPP4阻害薬投与群での血糖値の変化。

0013

本発明は、「2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与を選択することを特徴とする2型糖尿病の治療薬選択の補助方法」、「2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与が有効であると判断することを特徴とする治療効果を予測する方法」、「2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与を選択することを特徴とする2型糖尿病の治療薬選択のための2型糖尿病患者由来の検体の検査方法」及び「2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩を該患者に投与することを特徴とする治療方法」である。以下に詳細に説明する。

0014

(2型糖尿病の治療薬選択の補助方法)
本発明の2型糖尿病の治療薬選択の補助方法は、以下の工程を含む。
(1)2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高いかどうかを判定する工程。
(2)セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与を選択することを判定する工程。

0015

(2型糖尿病のメトホルミン塩酸塩投与の治療効果を予測する方法)
本発明の2型糖尿病のメトホルミン塩酸塩投与の治療効果を予測する方法は、以下の工程を含む。
(1)2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高いかどうかを判定する工程。
(2)セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与が有効であると判定する工程。
なお、「有効」とは、メトホルミン塩酸塩投与により、血糖値改善、HbA1c値改善、血液中のSeP値低下、及び/又は糖尿病治療の効果があることを意味する。

0016

(2型糖尿病の治療薬選択のための2型糖尿病患者由来の検体の検査方法)
本発明の2型糖尿病の治療薬選択のための2型糖尿病患者由来の検体の検査方法は、以下の工程を含む。
(1)2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高いかどうかを判定する工程。
(2)セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩投与を選択することを判定する工程。

0017

(2型糖尿病の治療方法)
本発明の2型糖尿病の治療方法は、以下の工程を含む。
(1)2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高いかどうかを判定する工程。
(2)セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン塩酸塩を該患者に投与する工程。
さらに、必要に応じて、以下の工程を含む。
(3)メトホルミン塩酸塩投与により患者の症状が改善しない場合には、DPP4阻害薬投与に変更する工程又はDPP4阻害薬を併用する工程。

0018

(検体)
本発明の検体は、2型糖尿病患者由来でありかつセレノプロテインPが存在していれば特に限定されない。例えば、全血、血液(末梢単核球)、血清、血漿、尿、髄液腹水リンパ液、肝臓由来液、乳汁等が挙げられる。特に、末梢単核球、血清等が採取等の取り扱いが容易で、侵襲性が低いという点で最も好ましい。2型糖尿病患者からサンプルを取得する方法は、特に限定されず、自体公知の方法を利用することができる。

0019

(セレノプロテインP)
セレノプロテインP(SeP)は、セレノシステインを10残基含むタンパク質である。セレノプロテインPは、過酸化水素過酸化脂質還元して無毒化し、また細胞内の酸化還元を制御するグルタチオンペルオキシダーゼ様活性を有する酵素として作用する。
また、本発明者らは、セレノプロテインPは2型糖尿病の検出マーカーとなることを開示している(参照:特許文献1)。
セレノプロテインPは、ヒト血清中に含まれており、文献「Saito Y.et al., J Biol chem 274:2866-2871, 1999」の記載の方法に従って、ヒト血清より単離・精製することができる。
また、セレノプロテインP(SeP)は、血漿カリクレインにより切断される(参照:図1)。図1上段図は、全長SePを表し、中段及び下段は血漿カリクレイン切断により生じるSePフラグメントを表す。図1中、「N」及び「C」はそれぞれ、N末端側及びC末端側を表し、「Sec」はセレノシステイン残基を表す。カリクレインは、235位のアルギニン図1中「R235」)と236位のグルタミン図1中「Q236」)との間、及び242位のアルギニン(図1中「R242」)と243位のアスパラギン酸図1中「D243」)との間を切断し、SePのN末端側フラグメント(アミノ酸残基1〜235)及びC末端側フラグメント(アミノ酸残基243〜361)を含む3つのフラグメントを生じ得る(図1)。「長鎖型」は、未切断の全長SeP(アミノ酸残基1〜361:本明細書においては「FL−SeP」と称する場合がある)であり、「短鎖型」は、切断で生じたSePフラグメント(本明細書においては「S−SeP」と称する場合がある)であり、SePフラグメントは、例えば、N末端側フラグメント(アミノ酸残基1〜235)であり得る。

0020

(メトホルミン塩酸塩)
メトホルミン塩酸塩(化学名:1,1-Dimethylbiguanide monohydrochloride)は、「メトグルコ錠」、「グリコラン錠」、「メトホルミン塩酸塩錠」、その他の販売名で、2型糖尿病治療薬として複数の製薬企業から販売されている(以下、販売名としては「メトグルコ錠」とする)。
用法・用量は、通常、成人にはメトホルミン塩酸塩として1日500mgより開始し、1日2〜3回に分割して食直前又は食後に経口投与する。維持量は、効果を観察しながら決めるが、通常1日750mg〜1,500mgとする。なお、患者の状態により適宜増減するが、1日最高投与量は2,250mgまでである。

0021

(DPP4阻害薬)
DPP4阻害薬は、糖尿病内服治療薬であり、DPP4(ジペプチジルペプチターゼ-4)酵素を阻害する薬を意味し、一般名であるシタグリプチンビルダグリプチンアログリプチンリナグリプチン、テネリグリプチン及びアナグリプチンが知られている。
例えば、投与量及び投与時期は、以下を例示することができるが特に限定されない。
○シタグリプチン
通常、成人にはシタグリプチンとして50mgを1日1 回経口投与する。なお、効果不十分な場合には、経過を十分に観察しながら100mgを1日1回まで増量することができる。
○ビルダグリプチン
通常、成人には、ビルダグリプチンとして50mgを1日2回、夕に経口投与する。なお、患者の状態に応じて50mgを1日1回朝に投与することができる。
○アログリプチン
通常、成人にはアログリプチンとして25mgを1日1回経口投与する、好ましくは朝食後に投与する。
○リナグリプチン
通常、成人にはリナグリプチンとして5mgを1日1回経口投与する。
○テネリグリプチン
通常、成人にはテネリグリプチンとして20mgを1日1回経口投与する。なお、効果不十分な場合には、経過を十分に観察しながら40mgを1日1回に増量することができる。
○アナグリプチン
通常、成人にはアナグリプチンとして1回100mgを1日2回朝夕に経口投与する。なお、効果不十分な場合には、経過を十分に観察しながら1回量を200mgまで増量することができる。

0022

(2型糖尿病患者の治療薬選択のためのカットオフ値)
本発明の2型糖尿病患者の治療薬選択のためのカットオフ値の範囲は、検体中(特に血清中)において、下記実施例4より、3.5μg/mL〜4.7μg/mL、好ましくは3.7μg/mL〜4.5μg/mL、より好ましくは3.9μg/mL〜4.3μg/mL、最も好ましくは約4.1μg/mLである。

0023

(メトホルミン塩酸塩投与が有効であると判断するためのカットオフ値)
本発明のメトホルミン塩酸塩投与が有効であると判断するためのカットオフ値の範囲は、検体中(特に血清中)において、下記実施例3より、4.5μg/mL以上、例えば、4.5μg/mL〜6.0μg/mL、より好ましくは4.5μg/mL〜5.5μg/mL、最も好ましくは4.5μg/mL〜5.0μg/mLである。なお、メトホルミン塩酸塩投与が有効であったとの一つの指標は、血中のセレノプロテインP値が有意に低下したことである。

0024

(セレノプロテインP値の測定方法
本発明の2型糖尿病患者の治療薬選択の補助方法、治療薬の効果予測方法、検査方法及び治療方法におけるセレノプロテインP値の測定方法は特に限定されないが、セレノプロテインPを直接測定してもよいし、セレノプロテインPのmRNAを測定して、セレノプロテインP値を算出してもよい。
セレノプロテインPを直接測定する方法として、セレノプロテインPを特異的に認識し結合する抗セレノプロテインP抗体を用いる免疫学的測定法により行うことができる。抗セレノプロテインP抗体は、公知の方法により作製することができる。免疫学的測定法としては、抗セレノプロテインP抗体を固相化した担体を用いる方法やウエスタンブロッティング等が挙げられる。固相化担体を用いる方法として、例えば、固相化マイクロタイタープレートを用いるELISA、固相化粒子を用いる凝集法等が挙げられるが、これらには限定されず、公知の免疫学的測定法を採用して、血中セレノプロテインPを測定することができる。
また、セレノプロテインPのmRNAを測定する方法は、ノーザンブロッティングRTPCR法DNAチップDNAマイクロアレイ)を利用した方法等により測定することができる。これらの方法も公知の方法で行うことができる。

0025

セレノプロテインPの測定方法は、好ましくは、2種のモノクローナル抗体を用いた酵素結合免疫吸着法{参照:Saito, Y.ら,J. Health Sci. (2001) 47巻, 346〜352頁}、下記実施例に示す金コロイドを使用した抗原抗体反応を用いた測定方法(参照:特許文献2)等が挙げられる。

0026

以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の症例は金沢大医学倫理委員会承認を得て、実施されている。

0027

(検体中のセレノプロテインP値測定系の構築
検体のセレノプロテインP値を測定するための測定系を構築した。詳細は、以下の通りである。

0028

(調製例1:金コロイド液の調製)
95℃の蒸留水1Lに10w/v%塩化金酸水溶液2mLを攪拌しながら加え、1分後に2w/v%クエン酸ナトリウム水溶液10mLを加え、さらに20分間攪拌した後、30℃に冷却した。冷却後、0.1w/v%炭酸カリウム水溶液でpH7.1に調節した。

0029

(調製例2:各種抗セレノプロテインP抗体結合金コロイド試薬の調製)
抗ヒトセレノプロテインPラットモノクローナル抗体AH5及びAA3は、文献{Saito, Y.ら,J. Health Sci. (2001) 47巻, 346〜352頁}に記載の手順にしたがって得た。AH5は、セレノプロテインPのカリクレイン切断によって生じるセレノプロテインPのN末端側を認識するモノクローナル抗体であり、AA3は、セレノプロテインPのC末端側を認識するモノクローナル抗体である。

0030

抗セレノプロテインPモノクローナル抗体AH5及びAA3について、抗体結合金コロイド試薬を以下のようにして調製した。抗体を、0.05w/v%アジ化ナトリウムを含む10mM 2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニルエタンスルホン酸(以下、「HEES」)緩衝液(pH7.1)で希釈し、50μg/mLの濃度にした。得られた抗体溶液100mLを、調製例1で調製した約1Lの金コロイド液に加え、冷蔵下で2時間攪拌した。さらに、5.46w/v%マンニトール、0.5w/v%ウシ血清アルブミンBSA)、及び0.05%アジ化ナトリウムを含む10mMHEPES緩衝液(pH7.1)を110mL添加し、37℃にて90分間攪拌した。次いで、8000rpmで40分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、得られた沈殿物に、3w/v%マンニトール、0.1w/v%BSA、及び0.05w/v%アジ化ナトリウムを含む5mM HEPES緩衝液(pH7.5)(A溶液)を約1L加え、抗体結合金コロイド粒子を分散させた後、8000rpmで40分間遠心分離し、上清を除去した。さらに、沈殿物に、0.9%デキストラン硫酸ナトリウムを含むA溶液を加えて抗体結合金コロイド粒子を分散させ、全量を240mLとし、これを抗体結合金コロイド試薬として回収した。

0031

AH5結合金コロイド試薬及びAA3結合金コロイド試薬を、それぞれ、金コロイド試薬1及び金コロイド試薬2とした。

0032

(調製例3:セレノプロテインP測定用試薬の調製)
5w/v%塩化ナトリウム、1.0w/v%エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物、0.1w/v%アルキルフェニルジスルホン酸ナトリウム塩、及び0.5w/v%ポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む0.25M 2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール塩酸緩衝液(pH7.8)に、ポリエチレングリコールを以下の「FL−SeP測定用」に、2.4w/v%になるように添加して、試薬を得た。

0033

(FL−SeP測定系の設計)
全長SeP(「FL−SeP」)量の測定のために、セレノプロテインPのN末端側を認識する抗体が結合した金コロイド粒子及びC末端側を認識する抗体が結合した金コロイド粒子を用いる測定系を設計した(本明細書において、「FL−SeP測定系」ともいう)。FL−SeP測定系では、FL−SePのみが凝集反応に関与し得る。

0034

(FL−SeP測定系の検量線の作成)
精製SeP(FL−SeP)を、文献{Saito, Y.ら,J. Biol. Chem. (1999) 274, 2866-2871}の記載にしたがってヒト血漿から精製した。
該精製SePをそれぞれ0.0μg/mL、0.75μg/mL、1.5μg/mL、3.0μg/mL、6.0μg/mL、及び9.0μg/mLの濃度で標準マトリックス(3w/v%BSAを含む50mM 2−[ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール緩衝液(pH6.5))中に含む、FL−SeP標準液を調製した。得られたFL−SeP標準液3μLに、調製例3のFL−SeP測定用試薬を170μL分注し、37℃にて約5分間加温し、次いで、金コロイド試薬1及び金コロイド試薬2を混合したものを85μL分注し、37℃にて反応させた。次いで、得られた反応溶液日立7070自動分析装置に供し、主波長505nm及び副波長660nmで測光ポイント18から31の吸光度変化を測定し、660nmでの吸光度変化量に505nmでの吸光度変化量の絶対値を加えた値を求め、吸光度変化量とした。
そして、FL−SeP測定系におけるSeP濃度と吸光度変化量との関係を示す検量線を作成した(参照:図2)。

0035

(2型糖尿患者の各治療薬投与)
本実施例の2型糖尿患者の背景及び各治療薬投与方法は以下の通りである。

0036

(2型糖尿患者の背景)
2型糖尿患者の背景は、以下の表の通りである。

0037

0038

(2型糖尿患者の治療薬の投与方法)
2型糖尿病患者79名をランダムにDPP4阻害薬アログリプチン(ネシーナ登録商標)25 mg/朝食後内服群とメトホルミン塩酸塩(メトグルコ登録商標)1,000 mg /朝食及び夕食後内服群に割り付けた。主治医の判断により、メトグルコは、最大2,250 mg/日まで増量可能とした。各治療薬の3か月間の内服の前後での血糖値及びHbA1c(ヘモグロビンエイワンシー)値の変化を自体公知の方法により測定し、並びに、血清中セレノプロテインP値変化を下記記載の方法により測定した。

0039

2型糖尿病患者79名から自体公知の方法で得られた血清3μLを実施例1に記載のFL−SeP測定系に供して、検量線(参照:図2)を参照して、血清中のセレノプロテインP値を測定した。

0040

(2型糖尿患者の検体のセレノプロテインP値の解析
実施例2で得られた各治療薬の3か月間の内服の前後での血糖値の変化、HbA1c値の変化及び血清中セレノプロテインP値変化を解析した。詳細は、以下の通りである。

0041

(メトホルミン投与群での血糖値の変化及びHbA1c値の変化)
メトホルミン投与群での血糖値の変化及びHbA1c値の変化を図3に示す。図3に記載のグラフから明らかなように、メトホルミン群では3か月間のSeP値低下度と血糖値降下度並びにSeP値低下度とHbA1c値降下度は相関する傾向にあった。さらに、メトホルミン群では、SeP値がよく低下した症例では、血糖値もよく改善する傾向があった。

0042

(DPP4阻害薬投与群での血糖値の変化及びHbA1c値の変化)
DPP4阻害薬投与群での血糖値の変化及びHbA1c値の変化を図4に示す。図4に記載のグラフから明らかなように、DPP4阻害薬投与群では、3か月間のSeP値低下度と血糖値降下度並びにSeP値低下度とHbA1c値降下度は相関しなかった。

0043

(メトホルミン投与群及びDPP4阻害薬投与群でのセレノプロテインP値の変化)
メトホルミン投与群及びDPP4阻害薬投与群でのSeP値の変化を図5に示す。図5に記載のグラフから明らかなように、メトホルミン投与群では、投与前のSeP値と投与後3か月間のSeP値低下度は相関した。しかし、DPP4阻害薬投与群では、投与前のSeP値と投与後3か月間のSeP値低下度は相関しなかった。すなわち、治療開始前のSeP値が高値症例では、メトホルミン投与によりSeP値をより低下させた。

0044

(メトホルミン投与群及びDPP4阻害薬投与群での血糖値の変化)
メトホルミン投与群及びDPP4阻害薬投与群での血糖値の変化を図6に示す。図6に記載のグラフから明らかなように、メトホルミン投与群では、投与前のSeP値と投与後3か月間の血糖値低下度は相関した。しかし、DPP4阻害薬投与群では、投与前のSeP値と投与後3か月間の血糖値低下度は相関しなかった。すなわち、治療薬投与前の血中SeP値は、メトホルミン投与においてのみその後の血糖値降下度を予測できた。

0045

(メトホルミン投与群での投与前SeP値が高症例でのセレノプロテインP値の変化)
メトホルミン投与群での投与前SeP値が高値(4.55μg/mL以上)の症例でのSeP値の変化を図7に示す。図7に記載のグラフから明らかなように、3か月間のメトホルミン投与により有意に血中SeP値を低下させた。

0046

図3図7に記載のグラフの結果より、2型糖尿患者の血液中のSeP値が高値な場合には、メトホルミン投与により、血糖値及びHbA1c値を改善し、さらに血液中の2型糖尿病の検出マーカーであるSeP値を有意に低下させることを確認した。

0047

(2型糖尿患者のメトホルミン投与を選択するためのカットオフ値の設定)
2型糖尿患者のメトホルミン投与を選択するためのカットオフ値を設定した。詳細は、以下の通りである。

0048

(治療前の2型糖尿患者の血清中のセレノプロテインP値分布からの選択)
治療前の2型糖尿患者の血清中のSeP値分布を図8に示す。図8に記載の分布図より、中央値より高い値である4.1μg/mLをカットオフ値として選択した。

0049

(選択したカットオフ値の検証)
選択したカットオフ値である4.1μg/mL以上の症例でのメトホルミン投与群及びDPP4阻害薬投与群での血糖値の変化を図9に示す。図9に記載のグラフの結果から明らかなように、メトホルミン投与群では、血糖値を有意に改善した。すなわち、治療前の2型糖尿患者の血清中のSeP値が4.5μg/mL以上、例えば、4.5μg/mL〜6.0μg/mL、より好ましくは4.5μg/mL〜5.5μg/mL、最も好ましくは4.5μg/mL〜5.0μg/mLの場合には、メトホルミン投与により血糖値の改善(糖尿病治療効果)があることを確認した。

実施例

0050

(総論)
以上の実施例により、治療前の2型糖尿患者の血清中のセレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン投与により、血糖値改善、HbA1c値改善、血液中のSeP値低下、さらには糖尿病治療の有効性があることを予測することができる。

0051

2型糖尿病患者由来の検体において、セレノプロテインP値がカットオフ値よりも高い場合には、メトホルミン投与を選択することを特徴とする2型糖尿病の治療薬選択の補助方法、治療薬の効果予測方法、検査方法及び治療方法の提供。

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