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技術 非RI系における細胞障害能迅速測定法

出願人 国立大学法人長崎大学
発明者 田中義正酒井佑宜水田賢志植田弘師
出願日 2015年3月30日 (4年7ヶ月経過) 出願番号 2016-511857
公開日 2017年4月13日 (2年7ヶ月経過) 公開番号 WO2015-152111
状態 特許登録済
技術分野 ピリジン系化合物 化学反応による材料の光学的調査・分析 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 有機錯体形成剤 漏出量 セクステット ビニルスルファニル アルコキシラート ヨードキシ安息香酸 テルピリジン セプテット
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2017年4月13日)のものです。
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課題・解決手段

本発明の目的は、正確で再現性が高く、かつ、簡便で迅速に細胞障害能または細胞増殖能を測定するための新規化合物および該化合物を用いた細胞障害能または細胞増殖能の測定方法を提供することにある。本発明は、式(I):(式中、R1は、置換基を示し、R2およびR3は、それぞれ、置換されていてもよい炭化水素基、または置換されていてもよい複素環基を示し、Yは、置換基を示し、nは、0〜3の整数を示し、Zは、単結合、−O−、−S−、−SO−、−SO2−、または−NR4−(R4は、水素原子または置換基を示す。)を示し、およびAは、置換されていてもよいC1−6アルキレン基を示す。)で表される化合物またはその塩に関する。

概要

背景

免疫細胞治療では、血漿からNK細胞、T細胞などの免疫細胞を取り出し、体外で増殖および/または活性化した後、患者投与することが行われている。しかしながら、現状では、同じ療法であっても、効果がまちまちである。この理由として、免疫細胞を増殖および/または活性化する過程において、免疫細胞がどの程度増殖および/または活性化されて細胞障害能を持つかの測定がされないまま、あるいは免疫細胞の増殖および/または活性化が不十分なまま、患者に投与されることが挙げられる。この結果、患者は場合によっては効果がないかもしれない治療を半年ないし一年以上も受けることになる可能性がある。

細胞の活性あるいは生細胞の数を測定する方法として、RI系では[51Cr]クロム酸ナトリウムを用いたγ線測定法が知られており、非RI系では、乳酸脱水素酵素漏出や、テルピリジン誘導体キレートを用いた時間分解蛍光法が知られている(特許文献1、非特許文献1)。γ線測定法はγ線を扱うことのできるRI施設の使用が必須であることから汎用性がなく、臨床現場などでの扱いが困難になる。乳酸脱水素酵素の漏出検定法では、標的細胞からだけでなく、エフェクター細胞からの自然漏出があり、バックグラウンドが高すぎるため正確な測定ができない点が問題となる。また、従来のテルピリジン誘導体キレート(例えば、ビスアセトキシメチル) 2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシレート:BATDA)を用いたEu時間分解蛍光法では、標的細胞からのキレート漏出が大きく、細胞の状態による結果のばらつきも大きいことから標準的な測定法とはなりにくい。

概要

本発明の目的は、正確で再現性が高く、かつ、簡便で迅速に細胞障害能または細胞増殖能を測定するための新規化合物および該化合物を用いた細胞障害能または細胞増殖能の測定方法を提供することにある。本発明は、式(I):(式中、R1は、置換基を示し、R2およびR3は、それぞれ、置換されていてもよい炭化水素基、または置換されていてもよい複素環基を示し、Yは、置換基を示し、nは、0〜3の整数を示し、Zは、単結合、−O−、−S−、−SO−、−SO2−、または−NR4−(R4は、水素原子または置換基を示す。)を示し、およびAは、置換されていてもよいC1−6アルキレン基を示す。)で表される化合物またはその塩に関する。

目的

本発明は、正確で再現性があり、かつ簡便で迅速な細胞障害能を測定するための新規化合物および該化合物を用いた細胞障害能の測定方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

式(I):(式中、R1は、置換基を示し、R2およびR3は、それぞれ、置換されていてもよい炭化水素基、または置換されていてもよい複素環基を示し、Yは、置換基を示し、nは、0〜3の整数を示し、Zは、単結合、−O−、−S−、−SO−、−SO2−、または−NR4−(R4は、水素原子または置換基を示す。)を示し、およびAは、置換されていてもよいC1−6アルキレン基を示す。)で表される化合物またはその塩。

請求項2

Aがメチレンである、請求項1に記載の化合物またはその塩。

請求項3

請求項1または2に記載の化合物またはその塩を含む、有機錯体形成剤

請求項4

請求項1または2に記載の化合物またはその塩を含む、生細胞数測定用試薬

請求項5

細胞障害能測定用試薬である、請求項4に記載の試薬

請求項6

細胞増殖能測定用試薬である、請求項4に記載の試薬。

請求項7

請求項1または2に記載の化合物またはその塩と細胞を混合する工程、およびランタノイド元素錯体を形成し、蛍光を測定する工程を含む、細胞障害能を測定する方法。

請求項8

ランタノイド元素と錯体を形成する前に、界面活性剤を加えることを特徴とする、請求項7に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、細胞障害能を非RIでかつ迅速に測定するための新規化合物および該化合物を用いた細胞障害能の測定方法に関する。

背景技術

0002

免疫細胞治療では、血漿からNK細胞、T細胞などの免疫細胞を取り出し、体外で増殖および/または活性化した後、患者投与することが行われている。しかしながら、現状では、同じ療法であっても、効果がまちまちである。この理由として、免疫細胞を増殖および/または活性化する過程において、免疫細胞がどの程度増殖および/または活性化されて細胞障害能を持つかの測定がされないまま、あるいは免疫細胞の増殖および/または活性化が不十分なまま、患者に投与されることが挙げられる。この結果、患者は場合によっては効果がないかもしれない治療を半年ないし一年以上も受けることになる可能性がある。

0003

細胞の活性あるいは生細胞の数を測定する方法として、RI系では[51Cr]クロム酸ナトリウムを用いたγ線測定法が知られており、非RI系では、乳酸脱水素酵素漏出や、テルピリジン誘導体キレートを用いた時間分解蛍光法が知られている(特許文献1、非特許文献1)。γ線測定法はγ線を扱うことのできるRI施設の使用が必須であることから汎用性がなく、臨床現場などでの扱いが困難になる。乳酸脱水素酵素の漏出検定法では、標的細胞からだけでなく、エフェクター細胞からの自然漏出があり、バックグラウンドが高すぎるため正確な測定ができない点が問題となる。また、従来のテルピリジン誘導体キレート(例えば、ビスアセトキシメチル) 2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシレート:BATDA)を用いたEu時間分解蛍光法では、標的細胞からのキレート漏出が大きく、細胞の状態による結果のばらつきも大きいことから標準的な測定法とはなりにくい。

0004

特表平3−500297号公報

先行技術

0005

Journal of Immunological Methods,193(2),1996,pp.199−206

発明が解決しようとする課題

0006

本発明は、正確で再現性があり、かつ簡便で迅速な細胞障害能を測定するための新規化合物および該化合物を用いた細胞障害能の測定方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0007

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、下記の式(I)で示される化合物を用いることにより、自然漏出が低く、細胞の状態による値のばらつきが少なく、かつ簡便に細胞障害能を測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。

0008

即ち、本発明は以下の通りである。
[1]式(I):

0009

0010

(R1は、置換基を示し、
R2およびR3は、それぞれ、置換されていてもよい炭化水素基、または置換されていてもよい複素環基を示し、
Yは、置換基を示し、
nは、0〜3の整数を示し、
Zは、単結合、−O−、−S−、−SO−、−SO2−、または−NR4−(R4は、水素原子または置換基を示す。)を示し、
および
Aは、置換されていてもよいC1−6アルキレン基を示す。)
で表される化合物またはその塩(以下、化合物(I)と略記することがある。)。
[2]Aがメチレンである、上記[1]に記載の化合物またはその塩。
[3]上記[1]または[2]に記載の化合物またはその塩を含む、有機錯体形成剤
[4]上記[1]または[2]に記載の化合物またはその塩を含む、生細胞数測定用試薬
[5]細胞障害能測定用試薬である、上記[4]に記載の試薬
[6]細胞増殖能測定用試薬である、上記[4]に記載の試薬。
[7]上記[1]または[2]に記載の化合物またはその塩と細胞を混合する工程、および
ランタノイド元素錯体を形成し、蛍光を測定する工程
を含む、細胞障害能を測定する方法。
[8]ランタノイド元素と錯体を形成する前に、界面活性剤を加えることを特徴とする、上記[7]に記載の方法。

発明の効果

0011

本発明の化合物は、テルピリジン骨格に特定の置換基を導入し、細胞内におけるエステラーゼ分解後のキレート化合物極性をあげることにより、正確で再現性が高く、かつ、簡便な、非RI系での細胞障害能測定用試薬または細胞増殖測定用試薬として有用である。また、本発明の測定方法は、非RIで、しかも、簡便かつ迅速にエフェクター細胞/標的細胞系の細胞障害能または細胞増殖能を測定できることから、がんウィルス感染免疫研究、細胞療法における新規の活性化物質等の探索、臨床検査などにおいて有用である。さらに、細胞療法の際、免疫細胞の増殖能および/または活性化能を測定し、治療効果を確認した後、患者に投与することにより、治療効果を高めることができる。

図面の簡単な説明

0012

図1は、本発明化合物(実施例8)を用いた細胞障害能の測定における96穴プレートの配置を示す。
図2は、本発明化合物(実施例8)を用いたウィルス感染細胞HCT−4および赤芽腫HCT−4およびK562における時間分解蛍光強度を示す。
図3は、本発明化合物(実施例8)を用いて細胞障害能を測定した結果を示す。

0013

以下に、本発明について詳細に説明する。
以下、本明細書中で用いられる各置換基の定義について詳述する。
本明細書中、「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素塩素臭素ヨウ素が挙げられる。
本明細書中の「置換されていてもよい炭化水素基」としては、特に断りのない限り、例えば、「置換されていてもよいC1−12アルキル基」、「置換されていてもよいC2−12アルケニル基」、「置換されていてもよいC2−12アルキニル基」、「置換されていてもよいC3−8シクロアルキル基」、「置換されていてもよいC3−8シクロアルケニル基」、「置換されていてもよいC7−14アラルキル基」、「置換されていてもよいC6−14アリール基」などが挙げられる。

0014

本明細書中、「C1−12アルキル(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、メチルエチルプロピルイソプロピルブチルイソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチルネオペンチル、1−エチルプロピルヘキシルイソヘキシル、1,1−ジメチルブチル、2,2−ジメチルブチル、3,3−ジメチルブチル、2−エチルブチルヘプチルオクチル、ノニルデシルウンデシルドデシルが挙げられる。本明細書中の「C1−6アルキル(基)」としては、「C1−12アルキル(基)」のうち、炭素数が1〜6のものが挙げられる。

0015

本明細書中の「C2−12アルケニル(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、ビニルプロペニルイソプロペニル、2−ブテン−1イル、4−ペンテン−1−イル、5−へキセン−1−イルなどが挙げられる。本明細書中の「C2−6アルケニル(基)」としては、上記「C2−12アルケニル(基)」のうち、炭素数が2〜6のものが挙げられる。

0016

本明細書中の「C2−12アルキニル(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、2−ブチン−1−イル、4−ペンチン−1−イル、5−へキシン−1−イルなどが挙げられる。本明細書中の「C2−6アルキニル(基)」としては、上記「C2−12アルキニル(基)」のうち、炭素数が2〜6のものが挙げられる。

0017

本明細書中の「C3−8シクロアルキル(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチルシクロヘキシルシクロヘプチルシクロオクチルなどが挙げられる。

0018

本明細書中の「C3−8シクロアルケニル(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、シクロプロペニル(例、2−シクロプロペン−1−イル)、シクロブテニル(例、2−シクロブテン−1−イル)、シクロペンテニル(例、1−シクロペンテン−1−イル、2−シクロペンテン−1−イル、3−シクロペンテン−1−イル)、シクロヘキセニル(例、1−シクロヘキセン−1−イル、2−シクロヘキセン−1−イル、3−シクロヘキセン−1−イル)などが挙げられる。

0019

本明細書中の「C7−14アラルキル(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、ベンジルフェネチル、1−メチル−2−フェニルエチルジフェニルメチル、1−ナフチルメチル、2−ナフチルメチル、2,2−ジフェニルエチル、3−フェニルプロピル、4−フェニルブチル、5−フェニルペンチルなどが挙げられる。

0020

本明細書中、「C6−14アリール(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、フェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、1−アントリル、2−アントリル、9−アントリルが挙げられる。

0021

本明細書中、「C1−12アルコキシ(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、メトキシエトキシプロポキシイソプロポキシブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、tert−ブトキシ、ペンチルオキシヘキシルオキシヘプチルオキシオクチルオキシ、ノニルオキシデシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシが挙げられる。「C1−6アルコキシ(基)」としては、「C1−12アルコキシ(基)」のうち、炭素数が1〜6のものが挙げられる。

0022

本明細書中の「C2−12アルケニルオキシ(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、ビニルオキシプロペニルオキシイソプロペニルオキシなどが挙げられる。「C2−6アルケニルオキシ(基)」としては、「C2−12アルケニルオキシ(基)」のうち、炭素数が2〜6のものが挙げられる。

0023

本明細書中の「C2−12アルキニルオキシ(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、2−ブチニルオキシ、2−ペンチニルオキシ、5−ヘキシニルオキシなどが挙げられる。「C2−6アルキニルオキシ(基)」としては、「C2−12アルキニルオキシ(基)」のうち、炭素数が2〜6のものが挙げられる。

0024

本明細書中の「C3−8シクロアルキルオキシ(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシシクロヘキシルオキシ、シクロヘプチルオキシ、シクロオクチルオキシなどが挙げられる。

0025

本明細書中の「C3−8シクロアルケニルオキシ(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、シクロプロペニルオキシ(例、2−シクロプロペニルオキシ)、シクロブテニルオキシ(例、2−シクロブテニルオキシ)、シクロペンテニルオキシ(例、1−シクロペンテニルオキシ、2−シクロペンテニルオキシ、3−シクロペンテニルオキシ)、シクロヘキセニルオキシ(例、1−シクロヘキセニルオキシ、2−シクロヘキセニルオキシ、3−シクロヘキセニルオキシ)などが挙げられる。

0026

本明細書中の「C7−14アラルキルオキシ(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、ベンジルオキシ、フェネチルオキシなどが挙げられる。

0027

本明細書中の「C6−14アリールオキシ(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、フェノキシ、1−ナフチルオキシ、2−ナフチルオキシなどが挙げられる。

0028

本明細書中の「複素環−オキシ(基)」としては、後述の「複素環(基)」で置換されたヒドロキシ基が挙げられる。該複素環−オキシ(基)の好適な例としては、テトラヒドロピラニルオキシ、チアゾリルオキシ、ピリジルオキシピラゾリルオキシ、オキサゾリルオキシ、チエニルオキシ、フリルオキシなどが挙げられる。

0029

本明細書中の「C1−6アルキルスルファニル(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、メチルスルファニルエチルスルファニルプロピルスルファニルイソプロピルスルファニル、ブチルスルファニル、sec−ブチルスルファニル、tert−ブチルスルファニルなどが挙げられる。

0030

本明細書中の「C2−6アルケニルスルファニル(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、ビニルスルファニル、プロペニルスルファニル、イソプロペニルスルファニルなどが挙げられる。

0031

本明細書中の「C1−6アルキルスルホニル(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、メチルスルホニルエチルスルホニルプロピルスルホニルイソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル、sec−ブチルスルホニル、tert−ブチルスルホニルなどが挙げられる。

0032

本明細書中、「C1−6アルキレン基」としては、例えば、メチレン、エチレンプロピレンブチレン、ペンチレンヘキシレンが挙げられる。

0033

本明細書中の「複素環(基)」としては、特に断りのない限り、例えば、環構成原子として、炭素原子以外に窒素原子硫黄原子及び酸素原子から選ばれる1又は2種、1ないし4個のヘテロ原子を含む3ないし14員(単環、2環又は3環式)複素環基、好ましくは、(i)5ないし14員(好ましくは、5ないし10員)芳香族複素環基、(ii)3ないし8員非芳香族複素環基などが挙げられる。なかでも5または6員芳香族複素環基、あるいは5または6員非芳香族複素環基が好ましい。具体的には、例えば、チエニル(例:2−チエニル、3−チエニル)、フリル(例:2−フリル、3−フリル)、ピリジル(例:2−ピリジル、3−ピリジル、4−ピリジル)、チアゾリル(例:2−チアゾリル、4−チアゾリル、5−チアゾリル)、オキサゾリル(例:2−オキサゾリル、4−オキサゾリル、5−オキサゾリル)、ピラジニルピリミジニル(例:2−ピリミジニル、4−ピリミジニル)、ピロリル(例:1−ピロリル、2−ピロリル、3−ピロリル)、イミダゾリル(例:1−イミダゾリル、2−イミダゾリル、4−イミダゾリル)、ピラゾリル(例:1−ピラゾリル、3−ピラゾリル、4−ピラゾリル)、トリアゾリル(例:1−トリアゾリル、2−トリアゾリル)、テトラゾリルピリダジニル(例:3−ピリダジニル、4−ピリダジニル)、イソチアゾリル(例:3−イソチアゾリル、4−イソチアゾリル、5−イソチアゾリル)、イソキサゾリル(例:3−イソキサゾリル、4−イソキサゾリル、5−イソキサゾリル)、インドリル(例:1−インドリル、2−インドリル、3−インドリル)、2−ベンゾチアゾリル、2−ベンズオキサゾリルベンズイミダゾリル(例:1−ベンズイミダゾリル、2−ベンズイミダゾリル)、ベンゾ[b]チエニル(例:2−ベンゾ[b]チエニル、3−ベンゾ[b]チエニル)、ベンゾ[b]フリル(例:2−ベンゾ[b]フラニル、3−ベンゾ[b]フラニル)、キノリル(例:2−キノリル、3−キノリル、4−キノリル、5−キノリル、8−キノリル)、イソキノリル(例:1−イソキノリル、3−イソキノリル、4−イソキノリル、5−イソキノリル)、ピラゾロピリジニル(例:ピラゾロ[1,5−a]ピリジン−3−イル)などの芳香族複素環基;
例えば、ピロリジニル(例:1−ピロリジニル、2−ピロリジニル、3−ピロリジニル)、オキサゾリジニル(例:2−オキサゾリジニル)、イミダゾリニル(例:1−イミダゾリニル、2−イミダゾリニル、4−イミダゾリニル)、ピペリジニル(例:ピペリジノ、2−ピペリジニル、3−ピペリジニル、4−ピペリジニル)、ピペラジニル(例:1−ピペラジニル、2−ピペラジニル)、モルホリニル(例:2−モルホリニル、3−モルホリニル、モルホリノ)、チオモルホリニル(例:2−チオモルホリニル、3−チオモルホリニル、チオモルホリノ)、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニルなどの非芳香族複素環基などが挙げられる。

0034

本明細書中、「置換されていてもよいC1−12アルキル基」、「置換されていてもよいC2−12アルケニル基」、「置換されていてもよいC2−12アルキニル基」、「置換されていてもよいC1−6アルキレン基」としては、例えば、
置換基群A]
(1)ハロゲン原子;
(2)ヒドロキシ
(3)アミノ
(4)ニトロ;
(5)シアノ;
(6)ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−アミノ、C6−14アリール、モノ−又はジ−C6−14アリール−アミノ、C3−8シクロアルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルコキシ−C1−6アルコキシ、C1−6アルキルスルファニル、C1−6アルキルスルフィニル、C1−6アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシルカルバモイルチオカルバモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルバモイル、モノ−又はジ−C6−14アリール−カルバモイル、スルファモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−スルファモイル及びモノ−又はジ−C6−14アリール−スルファモイルから選ばれる1ないし3個の置換基で置換されていてもよい複素環基;
(7)モノ−又はジ−C1−6アルキル−アミノ;
(8)モノ−又はジ−C6−14アリール−アミノ;
(9)モノ−又はジ−C7−14アラルキル−アミノ;
(10)N−C1−6アルキル−N−C6−14アリール−アミノ;
(11)N−C1−6アルキル−N−C7−14アラルキル−アミノ;
(12)C3−8シクロアルキル;
(13)ハロゲン化されていてもよいC1−6アルコキシ;
(14)C1−6アルキルスルファニル;
(15)C1−6アルキルスルフィニル;
(16)C1−6アルキルスルホニル;
(17)エステル化されていてもよいカルボキシル;
(18)C1−6アルキル−カルボニル
(19)C3−8シクロアルキル−カルボニル;
(20)C6−14アリール−カルボニル;
(21)カルバモイル;
(22)チオカルバモイル;
(23)モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルバモイル;
(24)モノ−又はジ−C6−14アリール−カルバモイル;
(25)N−C1−6アルキル−N−C6−14アリール−カルバモイル;
(26)モノ−又はジ−5ないし7員複素環−カルバモイル;
(27)カルボキシルで置換されていてもよいC1−6アルキル−カルボニルアミノ
(28)ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−アミノ、C6−14アリール、モノ−又はジ−C6−14アリール−アミノ、C3−8シクロアルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルコキシ−C1−6アルコキシ、C1−6アルキルスルファニル、C1−6アルキルスルフィニル、C1−6アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルバモイル、モノ−又はジ−C6−14アリール−カルバモイル、スルファモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−スルファモイル及びモノ−又はジ−C6−14アリール−スルファモイルから選ばれる1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC6−14アリールオキシ;
(29)ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−アミノ、C6−14アリール、モノ−又はジ−C6−14アリール−アミノ、C3−8シクロアルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルコキシ−C1−6アルコキシ、C1−6アルキルスルファニル、C1−6アルキルスルフィニル、C1−6アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルバモイル、モノ−又はジ−C6−14アリール−カルバモイル、スルファモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−スルファモイル及びモノ−又はジ−C6−14アリール−スルファモイルから選ばれる1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC6−14アリール;
(30)複素環−オキシ;
(31)スルファモイル;
(32)モノ−又はジ−C1−6アルキル−スルファモイル;
(33)モノ−又はジ−C6−14アリール−スルファモイル;
(34)ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−アミノ、C6−14アリール、モノ−又はジ−C6−14アリール−アミノ、C3−8シクロアルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルコキシ−C1−6アルコキシ、C1−6アルキルスルファニル、C1−6アルキルスルフィニル、C1−6アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルバモイル、モノ−又はジ−C6−14アリール−カルバモイル、スルファモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−スルファモイル及びモノ−又はジ−C6−14アリール−スルファモイルから選ばれる1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC7−14アラルキルオキシ;
(35)C1−6アルキル−カルボニルオキシ
(36)C1−6アルコキシ−カルボニル;
(37)モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルボニルアミノ;
(38)モノ−又はジ−C1−6アルコキシ−カルボニルアミノ;
(39)モノ−又はジ−C6−14アリールオキシ−カルボニルアミノ;
(40)モノ−又はジ−C7−14アラルキルオキシ−カルボニルアミノ;
(41)トリC1−6アルキルシリルオキシ;
などから選ばれる1ないし5個の置換基をそれぞれ置換可能な位置に有していてもよい、「C1−12アルキル基」、「C2−12アルケニル基」、「C2−12アルキニル基」、「C1−6アルキレン基」が挙げられる。置換基が複数存在する場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。

0035

本明細書中、「置換されていてもよいC3−8シクロアルキル基」、「置換されていてもよいC3−8シクロアルケニル基」、「置換されていてもよいC7−14アラルキル基」、「置換されていてもよいC6−14アリール基」、「置換されていてもよい複素環基」としては、例えば、
[置換基群B]
(1)置換基群A;
(2)置換されていてもよいC1−6アルキル;
(3)置換されていてもよいC2−6アルケニル;
(4)置換されていてもよいC2−6アルキニル;
などから選ばれる1ないし5個の置換基をそれぞれ置換可能な位置に有していてもよい、「C3−8シクロアルキル基」、「C3−8シクロアルケニル基」、「C7−14アラルキル基」、「C6−14アリール基」、「複素環基」が挙げられる。置換基が複数存在する場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。

0036

置換基B群中の、「置換されていてもよいC1−6アルキル」、「置換されていてもよいC2−6アルケニル」、「置換されていてもよいC2−6アルキニル基」の置換基としては、例えば、上記置換基A群から選択される置換基が挙げられる。当該置換基の数は、1個〜置換可能な最大数、より好ましくは1〜3個である。

0037

以下、式(I)中の各記号の定義について詳述する。
R1は、置換基を示す。
R1は、好ましくは、置換されていてもよいC1−12アルキル基、または置換されていてもよいC1−12アルコキシ基である。
R1は、より好ましくは、
(1)ヒドロキシ基、
(2)ホルミル基
(3)C1−6アルキル−アミノカルボニル基(例、エチルアミノカルボニル)、および
(4)ヒドロキシ−C1−6アルコキシ基(例、ヒドロキシエトキシ
から選択される1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC1−6アルキル(例、メチル、エチル、プロピル)
である。

0038

R2およびR3は、それぞれ、置換されていてもよい炭化水素基、または置換されていてもよい複素環基を示す。
R2およびR3は、好ましくは、C1−12アルキル基である。
R2およびR3は、より好ましくは、C1−6アルキル基(例、メチル、エチル、プロピル)である。

0039

Yは、置換基を示す。
nは、0〜3の整数を示す。
nは、好ましくは0である。

0040

Zは、単結合、−O−、−S−、−SO−、−SO2−、または−NR4−(R4は、水素原子または置換基を示す。)を示す。
Zは、好ましくは、単結合または−O−である。

0041

Aは、置換されていてもよいC1−6アルキレン基を示す。
Aは、好ましくは、メチレンである。

0042

本明細書中で説明される基、置換基などの好ましい例は、より好ましくは、組み合わせて用いられる。

0043

好適な化合物(I)としては、以下の化合物が挙げられる。
[化合物A]
R1が、
(1)ヒドロキシ基、
(2)ホルミル基、
(3)C1−6アルキル−アミノカルボニル基(例、エチルアミノカルボニル)、および
(4)ヒドロキシ−C1−6アルコキシ基(例、ヒドロキシエトキシ)
から選択される1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC1−6アルキル(例、メチル、エチル、プロピル)であり、
R2およびR3が、C1−6アルキル基(例、メチル、エチル、プロピル)
であり、
nが0であり、
Zが、単結合または−O−であり、および
Aが、メチレン基
である化合物またはその塩。

0044

上記化合物(I)の具体例としては、実施例1〜9の化合物が挙げられる。

0045

化合物(I)のうち、塩としては、例えば、金属塩アンモニウム塩有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えば、ナトリウム塩カリウム塩等のアルカリ金属塩カルシウム塩マグネシウム塩バリウム塩等のアルカリ土類金属塩アルミニウム塩等が挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリメチルアミントリエチルアミン、ピリジン、エタノールアミンジエタノールアミントリエタノールアミン等との塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば、塩酸臭化水素酸硝酸硫酸リン酸等との塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えば、ギ酸酢酸トリフルオロ酢酸フタル酸フマル酸シュウ酸酒石酸マレイン酸クエン酸コハク酸リンゴ酸メタンスルホン酸ベンゼンスルホン酸p−トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。

0046

次に、本発明の化合物(I)もしくはその塩の製造法について説明する。
なお、以下の製造法において得られる製造中間体は、精製せずに次の反応に用いることもできるが、反応混合物からクロマトグラフィー再結晶等の公知の手法により単離、精製して用いてもよい。

0047

本発明の化合物(I)は、例えば下記A法およびB法を用いて製造することができる。
化合物(I)中、R1がアルコキシ基である式(Ia)で表される化合物またはその塩(以下、化合物(Ia)ともいう)は、以下のA法またはこれに準ずる方法により製造することができる。
[A法]

0048

0049

[式中、R1’およびR1”は、それぞれ置換されていてもよいC1−12アルキル基を示し、Xはハロゲン原子を示し、Aは上記と同意義を示す。R2およびR3は上記と同意義を示し、かつ、同一である。]
Xは、好ましくは、塩素原子である。
(工程1)
アルカリ金属水素化物に、ジエチル1’,H−[2,2’:6’,2”]テルピリジン−4’−オキソ−6,6”−ジカルボキシラート(以下、化合物(1)ともいう)を加えた後、求電子試剤を反応させることによりO−置換−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(以下、化合物(2)ともいう)を製造する。
化合物1は、公知の方法(P. Kadjane, C. Plata−Iglesias, R. Ziessel, L. J. Charbonniere, Dalton Trans. 2009, 5688−5700)またはそれに準ずる方法で製造することができる。
アルカリ金属水素化物としては、例えば、水素化ナトリウム水素化カリウムなどが挙げられる。
求電子試剤としては、例えば、ヨウ化メチル臭化エチルなどが挙げられる。
求電子試剤の使用量は、化合物(1)1モルに対して、通常約1〜3モル、好ましくは約1〜2モルである。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、THF、ジエチルエーテル等が挙げられる。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約20〜50℃である。
反応時間は、通常約2〜48時間、好ましくは約12〜24時間である。
(工程2)
化合物(2)と塩基の混合物撹拌した後、酸で反応混合物のpHを調整することにより、4’−置換−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸(以下、化合物(3)ともいう)を製造する。
塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム水酸化カリウム水酸化リチウム等が挙げられる。
塩基の使用量は、化合物(2)1モルに対して、通常約2〜10モル、好ましくは約3〜5モルである。
酸としては、例えば、塩酸、酢酸が挙げられる。
pHは、通常約2〜5、好ましくは約3〜4である。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約20〜40℃である。
反応時間は、通常約10〜48時間、好ましくは約12〜36時間である。
(工程3)
塩基の存在下、化合物(3)と式(4)で表されるハロアルキルアルコキシラート誘導体(以下、化合物(4)ともいう)を反応させることにより、化合物(Ia)を製造する。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N,N−ジメチル4−アミノピリジン等が挙げられる。
塩基の使用量は、化合物(3)1モルに対して、通常約2〜10モル、好ましくは約2〜4モルである。
化合物(4)は、市販品を使用してもよく、あるいは公知の方法により対応する原料化合物から製造することもできる。
化合物(4)の使用量は、化合物(3)1モルに対して、通常約2〜6モル、好ましくは約2〜4モルである。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、THF等が挙げられる。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約40〜60℃である。
反応時間は、通常約12〜48時間、好ましくは約12〜36時間である。

0050

上記A法により得られる化合物(1)、化合物(2)および化合物(3)は、種々のアシル化反応アルキル化反応アミド化反応酸化反応還元反応加水分解反応脱水反応等の公知の反応に付すことにより、さらに誘導体化することもできる。このような反応は、それ自体公知の方法またはそれに準じて行うことができる。
また、化合物(1)、化合物(2)および化合物(3)がヒドロキシ基等の官能基を有する場合、適宜保護して反応を行うことができる。このような保護基および保護・脱保護反応は、公知の保護基および方法(例えば、Wiley−Interscience社1999年刊「Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Ed.」(Theodora W. Greene,Peter G. M. Wuts著))に準じて行うことができる。

0051

化合物(I)中、R1がヒドロキシメチル基である式(Ib)で表される化合物またはその塩(以下、化合物(Ib)ともいう)は、以下のB法またはこれに準ずる方法により製造することができる。
[B法]

0052

0053

[式中、AおよびXは上記と同意義を示す。R2およびR3は上記と同意義を示し、かつ、同一である。]
Xは、好ましくは、塩素原子である。

0054

(工程1)
式(5)で表される2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−カルボン酸(以下、化合物(5)ともいう)、炭酸カリウムおよびヨウ化メチルを反応させ、化合物(5)のメチルエステル体を製造する。
炭酸カリウムの使用量は、化合物(5)1モルに対して、通常約1〜5モル、好ましくは約2〜3モルである。
ヨウ化メチルの使用量は、化合物(5)1モルに対して、通常約1〜5モル、好ましくは約1〜2モルである。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、THF等が挙げられる。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約20〜40℃である。
反応時間は、通常約2〜48時間、好ましくは約12〜24時間である。
(工程2)
化合物(5)のメチルエステル体を水素化アルミニウムリチウム還元し、化合物(5)のヒドロキシメチル体を製造する。
水素化アルミニウムリチウムの使用量は、化合物(5)1モルに対して、通常約1〜3モル、好ましくは約1〜2モルである。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、THF、ジエチルエーテル等が挙げられる。
反応温度は、通常約−20〜50℃、好ましくは約0〜20℃である。
反応時間は、通常約1〜12時間、好ましくは約3〜5時間である。
(工程3)
化合物(5)のヒドロキシメチル体をピリジンに溶解し、無水酢酸と反応させることにより、式(6)で表される2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イルメチルアセテート(以下、化合物(6)ともいう)を製造する。
ピリジンの使用量は、化合物(5)1モルに対して、通常約1〜10L、好ましくは約2〜5Lである。
無水酢酸の使用量は、化合物(5)1モルに対して、通常約1〜10モル、好ましくは約1〜2モルである。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約20〜40℃である。
反応時間は、通常約2〜48時間、好ましくは約12〜24時間である。
(工程4)
化合物(6)と過酸化物を反応させることにより化合物(6)のピリジンオキシドを製造する。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジクロロメタンクロロホルム四塩化炭素、1,2−ジクロロエタンクロロベンゼン等が挙げられる。
反応温度は、通常約−20〜50℃、好ましくは約0〜20℃である。
反応時間は、通常約2〜48時間、好ましくは約12〜24時間である。
(工程5)
化合物(6)のピリジンオキシドとベンゾイルクロリドを反応させ、次いでシアノ化剤を反応させることにより、式(7)で表される(6、6”−ジシアノ−2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イル)メチルアセテート(以下、化合物(7)ともいう)を製造する。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えばジクロロメタン等が挙げられる。
ベンゾイルクロリドの使用量は化合物(6)1モルに対して、通常2〜10モル、好ましくは約4〜5モルである。
シアノ化剤としては、トリメチルシリルシアニド等が挙げられる。
シアノ化剤の使用量は化合物(6)1モルに対して、通常2〜10モル、好ましくは約4〜5モルである。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約20〜40℃である。
反応時間は、通常約2〜48時間、好ましくは約12〜24時間である。
(工程6)
化合物(7)をアルカリ加水分解に付すことにより、式(8)で表される4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸(以下、化合物(8)ともいう)を製造する。
本工程は上記A法の工程2と同様に行うことができる。
(工程7)
塩基の存在下、化合物(8)と化合物(4)を反応させることにより、化合物(Ib)を製造する。
本工程は上記A法の工程3と同様に行うことができる。

0055

本発明の化合物は、細胞内におけるエステラーゼ分解後、ランタノイド元素と有機錯体を形成することができ、当該錯体の蛍光を測定することにより生細胞数を測定することができる。本発明の化合物によって測定できるものとしては、生細胞数に限定されるものではなく、例えば、細胞障害能、細胞増殖能が挙げられる。
次に、本発明の細胞障害能を測定する方法を説明する。
本発明の方法は、式(I)で表される化合物と細胞を混合する工程、およびランタノイド元素と錯体を形成し、蛍光を測定する工程を含む。

0056

本発明の方法における「細胞」としては、細胞障害能を持つ細胞であり、例えば、NK細胞、T細胞などの免疫細胞、白血病細胞などのがん細胞などが挙げられる。
本発明の方法における「ランタノイド元素」としては、例えば、ユーロピウムサマリウムテルビウムなどが挙げられる。好ましくは、ユーロピウムが用いられる。
本発明の方法における「界面活性剤」は、NP−40、トリトンX−100、ジギトニンCHAPS等から適宜選択される。好ましくは、ジギトニンである。

0057

上記蛍光は、例えば、時間分解蛍光測定により測定することができる。
本発明の細胞障害能を測定する方法は、従来の細胞障害アッセイと比べて感度がよいため、測定時間を短縮することができる。

0058

本発明の細胞障害能を測定する際、標識化合物の自然漏出量を検討する必要があるが、その方法として、例えば下記の方法が挙げられる。
1.RPMI1640培地中、標的細胞を37℃、5%CO2で終夜インキュベートする。
2.RPMI1640培地中、1×106細胞/mLの濃度なるよう播種し、式(I)で表される化合物を終濃度が25μMになるように加え、37℃、5%CO2で15分間インキュベートする。
3.用時調製した0.125%ジギトニンDMSO溶液を加え、よく混合した後、37℃、5%CO2で15分間インキュベートする。
ここで、当該ジギトニンDMSO溶液は、ジギトニンをDMSOに溶解し、すぐに水を添加し、ジギトニン濃度が最終的に0.0625%になるように調製する。
4.よく混合し、遠心した後、Eu溶液250μLを含むプレート(96ウェル平底)に上清を移す。
5.15分間静置した後、PHERAstarマイクロプレートリーダーにより時間分解蛍光を測定する。

0059

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
全てのNMRデータは、Varian社の Gemini300、 JEOL社の AL 400 、 Varian社の 500PS分光器で測定された。1Hと13CNMRスペクトルは、内部標準物質としてテトラメチルシランか、(2,2,3,3−D4)トリメチルシリル-3-プロピオン酸またはそのナトリウム塩(1H および 13C)を用いた溶媒ピークに対する100万分率(ppm)で化学シフト(δ)として記した。化学シフト(δ)は、100万分率(ppm)で記され、カップリング定数(J)は、ヘルツ(Hz)単位で記されている。多重度記述するために次のような略語を使用している。
s=シングレット,d=ダブレット,t=トリプレット,q=カルテット,quint.=クインテット,sext.=セクステット,sept.=セプテット,br=ブロード,m=マルチプレット
すべての反応は、マグネティックスターラーで撹拌され、不活性ガス雰囲気下で行われた。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Fuji Silysia Chemical Ltd社製のsilica gel C60(50−200 μm)、あるいはCHROMATOREX DIOL(MB 100−40/75)で、実験の項で述べられているように溶出液ステムを用いて行われた。TLCは、TLC Silic gel 60 F254 aluminium sheets(Merck社)か、silica gel F254 glass plates(Merck社)のどちらかを用いて行われた。

0060

実施例における略号の意味は以下の通りである。
MR核磁気共鳴スペクトル
Hz:ヘルツ
J:カップリング定数
HRMS:高分解能質量分析スペクトル
THF:テトラヒドロフラン
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
DMSO:ジメチルスルホキシド
IEA:ジイソプロピルエチルアミン
IPE:ジイソプロピルエーテル
TEA:トリエチルアミン
BATDA:ビス(アセトキシメチル) 2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート

0061

実施例1:
ビス(ブチロキシメチル) 4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)

0062

0063

上記A法工程1に記載の方法(2.5 mmolスケール)に従って、求電子試剤として2−アセトキシエチルブロミドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:50%n−ヘキサン酢酸エチル)で精製することにより、ジエチル4’−(2−アセトキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(494mg、収率41%)をオレンジ固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 1.48 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 2.14 (s, 3H), 4.49−4.54 (m, 4H), 4.52 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 8.00 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.16 (dd, J = 1.0, 7.6 Hz, 2H), 8.20 (s, 2H), 8.80 (dd, J = 1.0, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.3, 20.9, 61.8, 62.4, 66.1, 108.3, 124.3, 125.1, 137.7, 147.8, 156.0, 156.4, 165.2, 166.8, 170.9.
(工程2)

0064

0065

上記A法工程2に記載の方法(0.8 mmolスケール)に従って、ジエチル4’−(2−アセトキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラートを用いて反応を行った。得られた粗生成物を減圧濃縮することにより、4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸(248mg、収率78%)を黄色固体として得た。得られた固体はさらに精製せず次の反応に用いた。
1H NMR(500MHz, d-DMSO) δ 3.84 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 4.32 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 8.16 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 8.19 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.24 (s, 2H), 8.84 (d, J = 7.6 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 59.4, 70.2, 107.9, 123.6, 124.8, 138.7, 154.3, 155.9, 166.3, 167.3.
(工程3)

0066

0067

上記A法工程3に記載の方法(0.39 mmolスケール)に従って、4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸およびブチリルオキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:50%n−ヘキサン/酢酸エチル)で精製することにより、ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(101mg、収率45%)を黄色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 0.97 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 1.70 (sext. J = 7.6 Hz, 4H), 2.41 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 4.08 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.41 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 6.11 (s, 4H), 7.99 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.16 (dd, J = 1.2, 7.6 Hz, 2H), 8.18 (s, 2H), 8.78 (dd, J = 1.0, 7.9 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 61.1, 69.6, 80.1, 108.5, 124.9, 125.6, 137.8, 146.3, 156.0, 156.2, 163.9, 167.1, 172.3.

0068

実施例2:
ビス(アセトキシメチル) 4’−(2−オキソ−2−(プロピルアミノ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)

0069

0070

上記A法工程1に記載の方法(1.0 mmolスケール)に従って、求電子試剤として2−オキソ−2−(プロピルアミノ)エトキシメチルブロミドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:50%n−ヘキサン/酢酸エチル)で精製することにより、ジエチル4’−(2−オキソ−2−(プロピルアミノ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(342mg、収率70%)を白色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.50 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 1.65 (sext. J = 7.3 Hz. 2H), 3.38 (q, J = 7.9 Hz, 2H), 4.53 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 6.76 (br. t, NH), 8.01 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 8.17 (dd, J = 1.0, 7.6 Hz, 2H), 8.22 (s, 2H), 8.79 (dd, J = 1.0, 7.9 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 11.3, 14.3, 22.8, 40.9, 61.9, 66.8, 108.2, 124.3, 125.3, 137.8, 147.8, 155.6, 156.7, 165.1, 165.3, 166.9.
(工程2)

0071

0072

上記A法工程2に記載の方法(0.6 mmolスケール)に従って、ジエチル4’−(2−オキソ−2−(プロピルアミノ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラートを用いて反応を行うことにより、4’−(2−オキソ−2−(プロピルアミノ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸(210mg、収率79%)を薄黄色固体として得た。
1H NMR(500MHz, d-DMSO) δ 0.84 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1.48 (sext. J = 7.1 Hz, 2H), 3.13 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 4.82 (s, 2H), 8.15 (dd, J = 1.2, 7.8 Hz, 2H), 8.20 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 8.25 (s, 2H), 8.37 (br. t, J = 5.9 Hz, NH), 8.86 (dd, J = 1.2, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 11.4, 22.4, 40.2, 66.9, 108.1, 124.2, 125.2, 138.9, 147.9, 154.6, 155.8, 165.9, 166.2, 166.6.
(工程3)

0073

0074

上記A法工程3に記載の方法(0.14 mmolスケール)に従って、4’−(2−オキソ−2−(プロピルアミノ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸およびアセトキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製することにより、ビス(アセトキシメチル) 4’−(2−オキソ−2−(プロピルアミノ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(78mg、収率98%)を白色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 1.00 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1.67 (sext, J = 7.4 Hz, 2H), 2.19 (s, 6H), 3.40 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 4.79 (s, 2H), 6.11 (s, 4H), 6.78 (br. t, J = 5.6 Hz, NH), 8.03 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 8.20 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 8.22 (s, 2H), 8.82 (d, J = 7.6 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 11.4, 20.8, 22.8, 40.9, 66.9, 80.3, 108.4, 125.0, 125.9, 138.0, 146.5, 155.9, 156.5, 163.8, 165.4, 166.8, 169.6.

0075

実施例3:
ビス(アセトキシメチル) 4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)

0076

0077

上記A法工程3に記載の方法(0.05 mmolスケール)に従って、4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸およびアセトキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をプレパラティブTLC(溶離液:クロロホルム:アセトン=4:1)で精製することにより、標題化合物(12mg、収率47%)を白色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 2.18 (s, 6H), 4.07-4,10 (m, 2H), 4.42 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 6.11 (s, 4H), 8.01 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.21 (s, 2H), 8.81 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 20.8, 61.1, 65.6, 80.2, 108.5, 124.9, 125.7, 137.9, 146.4, 156.1, 156.3, 163.9, 165.5, 169.6.

0078

実施例4:
ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(2−オキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)

0079

0080

2−ヨードキシ安息香酸(60 mg,0.21 mmol)のDMSO(2 mL)懸濁液に、ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(25 mg,0.04 mmol)を室温で加え、24時間撹拌した。水で反応をクエンチし、有機層を分離し、水層を酢酸エチル(2×10 mL)で抽出した。有機層を合わせ、食塩水洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過した後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:酢酸エチル)で精製することにより、標題化合物(19mg、収率74%)を白色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.4 Hz. 6H), 1.71 (sext. J = 7.3 Hz, 4H), 2.42 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 4.93 (s, 2H), 6.12 (s, 4H), 8.02 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 8.18−8.21 (m, 4H), 8.81 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 9.96 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 72.4, 80.1, 108.3, 124.9, 125.8, 137.9, 146.4, 163.8, 172.3, 172.5, 197.0.

0081

実施例5:
ビス(プロピオニルオキシメチル) 4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)

0082

0083

上記A法工程3に記載の方法(0.05 mmolスケール)に従って、4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸およびプロピオニルオキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をプレパラティブTLC(溶離液:クロロホルム:アセトン=2:1)で精製することにより、標題化合物(4mg、収率13%)を白色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 1.19 (t, J = 8.0 Hz, 6H), 2.46 (q, J = 8.0 Hz, 4H), 4.07-4.10 (m, 2H), 4.41 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 6.12 (s, 4H), 8.01(t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.18 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H), 8.21 (s, 2H), 8.82 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H).

0084

実施例6:
ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(3−ヒドロキシプロポキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)

0085

0086

上記A法工程1に記載の方法(0.5 mmolスケール)に従って、求電子試剤として3−((テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)オキシ)プロピルブロミドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン:酢酸エチル=2:1〜1:1)で精製することにより、ジエチル4’−(3−((テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)オキシ)プロポキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(110mg、収率40%)を白色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 1.49 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.52-1.63 (m, 4H), 1.70-1.76 (m, 1H), 1.80-1.89 (m, 1H), 2.18 (quint., J = 6.0 Hz, 2H), 3.50-3.54 (m, 1H), 3.63-3.67 (m, 1H), 3.85-3.90 (m, 1H), 3.98-4.02 (m, 1H), 4.37-4.44 (m, 2H), 4.51 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 4.63 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 7.98 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.14 (dd, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H), 8.17 (s, 2H), 8.78 (dd, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.3, 19.6, 25.4, 29.5, 30.6, 61.8, 62.3, 63.7, 65.2, 99.0, 108.3, 124.3, 125.0, 137.6, 147.7, 156.2, 156.2, 165.3, 167.3.
(工程2)

0087

0088

上記A法工程2に記載の方法(0.20 mmolスケール)に従って、ジエチル4’−(3−((テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)オキシ)プロポキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラートを用いて反応を行うことにより、4’−(3−ヒドロキシプロポキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸(61mg、収率77%)を黄色固体として得た。得られた固体はさらに精製せず次の反応に用いた。
1H NMR(500MHz, d-DMSO) δ 1.93-1.99 (m, 2H), 3.62 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.33 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 8.11-8.19 (m, 6H), 8.78-8.84 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 32.0, 57.2, 65.6, 108.0, 124.3, 125.3, 139.0, 147.9, 154.6, 155.6, 165.9, 167.4.
(工程3)

0089

0090

上記A法工程3に記載の方法(0.05 mmolスケール)に従って、4’−(3−ヒドロキシプロポキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸およびブチリルオキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をプレパラティブTLC(溶離液:ヘキサン:酢酸エチル=2:1)で精製することにより、ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(3−ヒドロキシプロポキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(15mg、収率51%)を白色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.5 Hz, 6H), 1.71 (sext., J = 7.5 Hz, 4H), 2.16 (quint., J = 6.0 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 3.93 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.46 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 6.11 (s, 4H), 8.01 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.17 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.22 (s, 2H), 8.81 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 31.9, 35.8, 59.6, 65.7, 80.1, 108.6, 124.9, 125.6, 137.8, 146.4, 156.1, 156.4, 163.9, 167.3, 172.4.

0091

実施例7:
ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)

0092

0093

上記A法工程1に記載の方法(1.3 mmolスケール)に従って、求電子試剤として2−(2−アセトキシエトキシ)エチルブロミドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:50%n−ヘキサン/酢酸エチル)で精製することにより、ジエチル4’−(2−(2−アセトキシエトキシ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(60mg、収率9%)をオレンジ色固体として得た。
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 1.49 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 2.08 (s, 3H), 3.81−3.83 (m, 2H), 3.96−3.98 (m, 2H), 4.27 (t, J = 3.5 Hz, 2H), 4.43−4.46 (m, 2H), 4.50 (q, J = 7.1 Hz, 4H),7.98 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.13 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.19 (s, 2H), 8.87 (d, J = 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.2, 20.8, 61.8, 63.5, 67.6, 69.3, 108.4, 124.4, 125.1, 137.7, 147.8, 156.2, 156.4, 165.4, 167.1, 171.1.
(工程2)

0094

0095

上記A法工程2に記載の方法(0.1 mmolスケール)に従って、ジエチル4’−(2−(2−アセトキシエトキシ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラートを用いて反応を行い、減圧濃縮することにより、4’−(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸(30mg、収率>90%)を白色固体として得た。得られた固体はさらに精製せず次の反応に用いた。
1H NMR(500MHz, d-DMSO) δ 3.55 (m, 4H), 3.87 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 4.44 (t, J = 3.9 Hz, 2H), 8.15 (dt, J = 1.3, 7.6 Hz, 2H), 8.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.26 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 8.86 (ddd, J = 1.3, 2.4, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 60.7, 68.4, 69.1, 73.0, 108.5, 124.7, 125.6, 139.4, 148.2, 166.3, 167.5.
(工程3)

0096

0097

上記A法工程3に記載の方法(0.07 mmolスケール)に従って、4’−(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸およびブチリルオキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:酢酸エチル)で精製することにより、ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(21mg、収率56%)を薄黄色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 1.71 (sext. J = 7.6 Hz, 4H), 2,41 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 3.72 (dd, J = 3.9, 5.6 Hz, 2H), 3.80 (dd, J = 4.2, 4.9 Hz, 2H), 3.97−3.99 (m, 2H), 4.47−4.49 (m, 2H), 6.11 (s, 4H), 8.00 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.17 (dd, J = 1.0, 7.8 Hz, 2H), 8.24 (s, 2H), 8.81 (dd, J = 1.0, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 61.2, 67.7, 69.6, 72.7, 80.1, 108.7. 124.9, 125.6, 137.8, 146.4, 156.0, 156.4, 163.9, 167.2, 172.3.

0098

実施例8:
ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート

0099

0100

(工程1)
2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−カルボン酸(200 mg,0.72 mmol)のDMF(3.6 mL)溶液に、炭酸カリウム(20 mg, 1.4 mmol)およびヨウ化メチル(0.07 mL,1.1 mmol)を加え、反応混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物に食塩水を加え、水層を酢酸エチル(3×5.0 mL)で抽出し、抽出液を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。混合物をろ過し、減圧濃縮することにより、粗生成物を得た。得られた粗生成物は精製せずに次の反応に用いた。 粗生成物(0.72 mmol)のテトラヒドロフラン(7.2 mL)溶液に、リチウムアルミニウムヒドリド(28 mg,0.7 mmol)を0℃で加えた。3時間撹拌した後、反応混合物に硫酸ナトリウム10水和物を加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物をセライトパッドでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をピリジン(3.6 mL)に溶解し、該溶液に無水酢酸(0.14mL, 1.4 mmol)を加えた。16時間撹拌した後、混合物にトルエンを加え、減圧濃縮した。残渣をCHROMATOREX Diolシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:n−ヘキサン:酢酸エチル=1:0〜1:1)で精製することにより、2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イルメチルアセテート(88 mg、収率40% 3工程)を白色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 2.20 (s, 3H), 5.28 (s, 2H), 7.32-7.35 (m, 2H), 7.85 (dt, J = 2.0, 8.0 Hz, 2H), 8.43 (s, 2H), 8.61 (td, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H), 8.70-8.71 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 20.9, 64.8, 119.2, 121.3, 123.9, 136.8, 146.9, 149.1, 155.8, 155.8, 170.6.
(工程2)
2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イルメチル アセテート(88 mg,0.28 mmol)のジクロロメタン(2.8 mL)溶液に、m−クロ過安息香酸(170 mg, 75%, 0.74 mmol)を0℃で加えた。19時間撹拌した後、混合物を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液(20 mL)で洗浄し、水層をクロロホルム(2×20 mL)で抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をジクロロメタン(2.8 mL)に溶解し、得られた溶液にベンゾイルクロリド(0.10 mL,0.86 mol)を室温で加えた。20分間撹拌した後、トリメチルシリルシアニド(0.11 mL,0.87 mmol)を滴下し、室温で19時間撹拌した。該溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(5.0 mL)を加え、分液した後、水層をクロロホルム(3×5.0 mL)で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム:酢酸エチル=1:0〜15:1)で精製することにより、(6、6”−ジシアノ−2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イル)メチルアセテート(92 mg,収率92%)を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.26 (s, 3H), 5.33 (s, 2H), 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.02 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.52 (s, 2H), 8.81 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ 20.9, 64.4, 117.2, 120.7, 124.3, 128.5, 133.4, 138.0, 148.1, 154.0, 157.0, 170.6.
(工程3)
(6、6”−ジシアノ−2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イル)メチル アセテート(80 mg,0.23 mmol)のエタノール(6.9 mL)溶液および蒸留水(1.8 mL)に水酸化カリウム(200 mg,3.9 mmol)を加えた。反応混合物を 11時間加熱還流した後、室温まで冷却した。1規定塩酸でpHを約4に調整し、析出物をろ取することにより、4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸を薄茶色固体として得た。得られた固体はさらに精製せずに次の反応に用いた。
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 4.77 (s, 2H), 8.12 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.17 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.57 (s, 2H), 8.83 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ62.0, 124.0, 125.0, 138.8, 148.1, 154.0, 154.6, 155.2, 166.0.
(工程4)
4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸(18 mg,0.05 mmol)のDMF(1.0 mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(0.05 mL,0.29 mmol)およびクロロメチルブチラート(0.03 mL, 0.24 mmol)を加えた。反応混合物を50℃に加熱した。15時間撹拌した後、室温まで冷却し、混合物を飽和塩アンモニウム水溶液(2.0 mL)で洗浄した。水層を酢酸エチル(3×5.0 mL)で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:n−ヘキサン:酢酸エチル=2:1〜1:1)で精製することにより、ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(10mg,収率36%)を白色ろう状物質として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.5 Hz, 6H), 1.71 (sext., J = 8.0 Hz, 4H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.45 (brt, J = 6.0 Hz, 1H), 4.9(br. d, J = 6.0 Hz, 2H), 6.12 (s, 4H), 8.01 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.17 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H), 8.61 (s, 2H), 8.80 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 63.9, 80.2, 119.7, 124.9, 125.6, 137.9, 146.5, 152.6, 154.5, 156.5, 163.9, 172.3.

0101

実施例9:
ビス(アセトキシメチル) 4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート

0102

0103

上記A法工程3に記載の方法(0.05 mmolスケール)に従って、4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸およびアセトキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン:酢酸エチル=2:1〜1:3)で精製することにより、標題化合物(5.2mg、収率20%)を白色固体として得た。
1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 2.18 (s, 6H), 4.96 (brs. 2H), 6.11 (s, 4H), 8.02 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.19 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.62 (s, 2H), 8.82 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 20.8, 63.9, 80.2, 119.7, 125.0, 125.7, 137.9, 138.9, 146.5, 154.6, 156.5, 169.6.

0104

実施例10:本発明化合物を用いた細胞障害能の測定(時間分解蛍光アッセイ(Euアッセイ:1)を行う際に、自然漏出量をモニターする必要があるが、その方法について下記に記す。)
30mLのRPMI1640培地中で、組織球腫U937細胞を、37℃、5%CO2条件下で一晩培養し、該培養液30mLを50mLのコニカルチューブに移し、細胞数計測した。1700rpm、4℃で5分間遠心し、上清を廃棄し、1×106cells/mLになるように細胞をRPMI1640培地に再懸濁した。該細胞懸濁液1mLを15mLのコニカルチューブに移し、2.5μLの式(I)で表される化合物またはその塩(10mMの保存溶液)を加え(最終濃度:25μM)、37℃、5%CO2条件下で15分間インキュベートした。5mLのRPMI1640培地で細胞を3回洗浄した後、細胞を5mLのRPMI1640培地に再懸濁し、該細胞懸濁液2mLを6mLのRPMI1640培地を含む15mLのコニカルチューブに移し、細胞の濃度を5×103cells/100μLとした。該細胞懸濁液100μLを、96ウェル平底プレートの6つのウェルに播種した。自然漏出量を決定するためのウェルには100μLのRPMI1640培地を、最大漏出量を決定するためのウェルには90μLのRPMI1640培地を加えた。該プレートを500rpm、室温で2分間遠心した後、37℃、5%CO2条件下で30分間インキュベートした。新たに調製した19%DMSO中の0.125%ジギトニン溶液(3mgジギトニン、0.456mL DMSOおよび1.944mL H2Oの混合溶液)10μLを、前記最大漏出量を決定するためのウェルにそれぞれ添加し、良く混合した後、さらに30分間インキュベートした。インキュベーション後、再度細胞懸濁液を良く混合し、1700rpm、室温で2分間遠心した。遠心後、上清25μLを慎重にとり、250μLのユーロピウム溶液を含む96ウェル平底プレートに移した後、そこから200μLの溶液を96ウェルNuncプレートに移した。該プレートを15分間静置した後、ARVマルチプレートリーダーで時間分解蛍光を測定した。
上記の方法で測定した結果を下記表1に示す。

0105

実施例

0106

実施例11:本発明化合物を用いた細胞障害能の測定(時間分解蛍光アッセイ(Euアッセイ:1))
(1)ターゲット細胞の準備
30mLのRPMI1640培地中で、HTLV−1に感染したHAM患者髄液由来細胞株HCT−4細胞を、37℃、5%CO2条件下で一晩培養し、RPIMI1640培地20mL中に細胞4.8×106になるように、細胞を計測し0.24×106cells/mLに調製した。1700rpm、4℃で5分間遠心し、上清を廃棄し、1×106cells/mLになるように細胞を4.8mLのRPMI1640培地に再懸濁した。該細胞懸濁液を各1mLずつ15mLのコニカルチューブ2本(A−1、A−2)に移した。
(2)ターゲット細胞の準備
30mLのRPMI1640培地中で、ヒト慢性白血病由来細胞株K562細胞を、37℃、5%CO2条件下で一晩培養し、RPIMI1640培地20mL中に細胞4.8×106になるように、細胞数を計測し0.24×106cells/mLに調製した。1700rpm、4℃で5分間遠心し、上清を廃棄し、1×106cells/mLになるように細胞を4.8mlのRPMI1640培地に再懸濁した。該細胞懸濁液を各1mLずつ15mLのコニカルチューブ3本(B−1、B−2、B−3)に移した。B−1に2.5μLのDMSOを、B−2とB−3には、2.5μLの10mM実施例8の化合物を加えた。37℃で15分間静置した。5mLのRPMI1640培地で細胞を3回洗浄した後、1700rpm、4℃で5分間遠心し、それぞれを5mLのRPMI1640培地に再懸濁し、該細胞懸濁液2mLを6mLのRPMI1640培地を含む15mLのコニカルチューブに移した。
(3)エフェクター細胞の準備
ヘルパーNK細胞60×103cellsを、12mlのRPMI培養液に懸濁し、1700rpm、4℃で5分間遠心し、上清を捨て、RPMI1640培養液3mlに再懸濁した。
以下、下記の濃度に調整したものを3mLずつ準備した。

ヘルパーNK細胞濃度
エフェクター細胞/標的細胞比40 2 x 106/ml
エフェクター細胞/標的細胞比20 1 x 106/ml
エフェクター細胞/標的細胞比10 5 x 105/ml
エフェクター細胞/標的細胞比5 2.5 x 105/ml
エフェクター細胞/標的細胞比2.5 1.25 x 104/ml
エフェクター細胞/標的細胞比1.25 6.25 x 103/ml
エフェクター細胞/標的細胞比0.625 3.125 x 103/ml
エフェクター細胞/標的細胞比0 0/ml (Cell concentration):

上記濃度ヘルパーNK細胞懸濁液をそれぞれ100μL、また自然漏出量を決めるためにRPIM1640培養液100μL、最大漏出量を決定するためにRPIM培養液90μLを、96ウェル平底プレートに加えた。HCT-4細胞液、K562細胞液を96穴プレートに100μL加えた。
上記までの96穴プレートの配置は図1に示す通りである。該プレートを500rpm、室温で2分間遠心した後、37℃で20分間インキュベートした。19%DMSO中の0.125%ジギトニン溶液(3mgジギトニン、0.456mL DMSOおよび1.944mL H2Oの混合溶液)を、新たに調製しその10μLを、最大放出量を決定するためのウェルにそれぞれ添加し、良く混合した後、さらに20分間インキュベートした。インキュベーション後、再度細胞懸濁液を良く混合し、1700rpm、室温で2分間遠心した。遠心後、上清25μLを慎重にとり、250μLのユーロピウム溶液を含む96ウェル平底プレートに移した後、そこから200μLの溶液を96ウェルNuncプレートに移した。該プレートを15分間静置した後、ARVOマルチプレートリーダーで時間分解蛍光を測定した。
上記の方法で測定した結果を図2および図3に示す。
これにより、エフェクター細胞の細胞障害能の測定が可能であることが示された。

0107

本発明の化合物は、細胞障害能または細胞増殖能を測定するための試薬として有用である。また、当該試薬を用いて、細胞障害能または細胞増殖能を正確で再現性が高く、かつ、簡便で迅速に測定することができる。
本出願は、日本国で2014年3月31日に出願された特願2014−073475を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

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