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技術 乳酸菌が産生するエキソポリサッカライド

出願人 日東薬品工業株式会社
発明者 山本憲二松崎千秋久景子
出願日 2014年9月18日 (6年2ヶ月経過) 出願番号 2015-537967
公開日 2017年3月2日 (3年8ヶ月経過) 公開番号 WO2015-041299
状態 特許登録済
技術分野 化合物または医薬の治療活性 食品の着色及び栄養改善 多糖類及びその誘導体 動物,微生物物質含有医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 飼料(2)(一般) 化粧料 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造
主要キーワード 動植物性油 参考試験 いわし油 開発室 増大作用 菌体外多糖 エキソポリサッカライド ホモ多糖類
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (6)

課題・解決手段

IgA産生促進能を有する新規乳酸菌が産生するエキソポリサッカライド、該エキソポリサッカライドの製造方法および該エキソポリサッカライドを含む組成物等を提供する。

概要

背景

腸管の免疫器官腸管関連リンパ組織(gut-associated lymphatic tissue, GALT)と総称され、主にパイエル板(Peyer’s patch)、腸間膜リンパ節腸管上皮から構成される。腸管内に侵入した病原体等の異物抗原)は、パイエル板のM細胞に取り込まれ、パイエル板に存在する樹状細胞等の抗原提示細胞によりT細胞提示される。同時に、B細胞も当該抗原を認識し、IgM+B細胞からサイトカイン刺激によりIgA+B細胞にクラススイッチされ、最終的に免疫グロブリンA(以下、「IgA」という)を分泌する形質細胞となる。

腸管固有のIgA産生細胞数は、全身に存在する形質細胞の約70〜80%を占め、当該形質細胞から分泌されるIgAが、病原体の粘膜上皮細胞への付着を阻害する、あるいは、病原体から生産される毒素酵素にIgAが結合して中和する等の感染防御を行うため、IgA産生による腸管免疫活性化を行い、免疫のバランスを保つことは非常に重要である。

近年、アレルギー疾患を有する患者急増しているが、これらの患者は腸管粘膜免疫が低下傾向にあるため、腸管粘膜免疫を増強(発達)させることは、その予防に繋がる可能性が高いと考えられている。

そして、IgA産生促進能を有し、腸管免疫の増強力を有する菌として、ラクトバチルスプランタラム(Lactobacillus plantarum) AYA株(特許文献1)、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)株(特許文献2)等が報告されている。

また、生野菜漬物等、様々な植物から乳酸菌が単離され、プロバイオティクスとして食品や飲料等に添加されているが、IgA産生促進能を有し、腸管免疫を活性化することのできる乳酸菌の報告は、上記の文献などに限られているため、IgA産生促進能の高い新たな乳酸菌の提供が望まれている。

概要

IgA産生促進能を有する新規乳酸菌が産生するエキソポリサッカライド、該エキソポリサッカライドの製造方法および該エキソポリサッカライドを含む組成物等を提供する。

目的

また、生野菜や漬物等、様々な植物から乳酸菌が単離され、プロバイオティクスとして食品や飲料等に添加されているが、IgA産生促進能を有し、腸管免疫を活性化することのできる乳酸菌の報告は、上記の文献などに限られているため、IgA産生促進能の高い新たな乳酸菌の提供が望まれている

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

受託番号NITEBP-1519で寄託されている、ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NTM048株又はその変異株から産生されるエキソポリサッカライド

請求項2

エキソポリサッカライドを産生し得るロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株を培養する工程を含む、エキソポリサッカライドの製造方法。

請求項3

ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が、請求項1に記載の菌株である、請求項2に記載の方法。

請求項4

さらに、培養された菌株の上清を分離し、該上清からエキソポリサッカライドを精製する工程を含む、請求項2又は3に記載の方法。

請求項5

請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法で得られるエキソポリサッカライド。

請求項6

請求項1又は5に記載のエキソポリサッカライドを含む組成物

請求項7

医薬品である、請求項6に記載の組成物。

請求項8

食品である、請求項6に記載の組成物。

請求項9

化粧料である、請求項6に記載の組成物。

請求項10

飼料である、請求項6に記載の組成物。

技術分野

0001

本発明は、ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、特に受託番号NITEBP-1519で寄託されたロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NTM048株が産生するエキソポリサッカライド(exopolysaccharide;EPSともいう)、該EPSの製造方法および該EPSを含む組成物等に関する。

背景技術

0002

腸管の免疫器官腸管関連リンパ組織(gut-associated lymphatic tissue, GALT)と総称され、主にパイエル板(Peyer’s patch)、腸間膜リンパ節腸管上皮から構成される。腸管内に侵入した病原体等の異物抗原)は、パイエル板のM細胞に取り込まれ、パイエル板に存在する樹状細胞等の抗原提示細胞によりT細胞提示される。同時に、B細胞も当該抗原を認識し、IgM+B細胞からサイトカイン刺激によりIgA+B細胞にクラススイッチされ、最終的に免疫グロブリンA(以下、「IgA」という)を分泌する形質細胞となる。

0003

腸管固有のIgA産生細胞数は、全身に存在する形質細胞の約70〜80%を占め、当該形質細胞から分泌されるIgAが、病原体の粘膜上皮細胞への付着を阻害する、あるいは、病原体から生産される毒素酵素にIgAが結合して中和する等の感染防御を行うため、IgA産生による腸管免疫活性化を行い、免疫のバランスを保つことは非常に重要である。

0004

近年、アレルギー疾患を有する患者急増しているが、これらの患者は腸管粘膜免疫が低下傾向にあるため、腸管粘膜免疫を増強(発達)させることは、その予防に繋がる可能性が高いと考えられている。

0005

そして、IgA産生促進能を有し、腸管免疫の増強力を有する菌として、ラクトバチルスプランタラム(Lactobacillus plantarum) AYA株(特許文献1)、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)株(特許文献2)等が報告されている。

0006

また、生野菜漬物等、様々な植物から乳酸菌が単離され、プロバイオティクスとして食品や飲料等に添加されているが、IgA産生促進能を有し、腸管免疫を活性化することのできる乳酸菌の報告は、上記の文献などに限られているため、IgA産生促進能の高い新たな乳酸菌の提供が望まれている。

先行技術

0007

特開2008-201708号公報
特開2010-130954号公報

発明が解決しようとする課題

0008

上記問題を解決するために、本発明者らは鋭意検討の結果、IgAの産生促進能に優れた菌株(NTM048)を見出し、この菌株がロイコノストック(Leuconostoc)属に属する新たな乳酸菌(Leuconostoc mesenteroides)であることを同定した。

0009

このNTM048株について解析する過程で、本発明者らはNTM048株が、エキソポリサッカライドを産生することを新たに見出した。エキソポリサッカライドは、菌体外多糖類とも呼ばれ、微生物が産生するエキソポリサッカライドには、有用な作用を有するものが知られている。そこで、ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株、より好ましくは、NTM048株が産生するエキソポリサッカライド、該エキソポリサッカライドの製造方法および該エキソポリサッカライドを含む組成物等を提供することを本発明の目的とする。

課題を解決するための手段

0010

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、NTM048株の培養上清に、エキソポリサッカライドが分泌されていることを見出した。そして、エキソポリサッカライドを抽出・精製し、それが公知の乳酸菌から産生されるエキソポリサッカライドよりも高いIgA産生促進活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。

0011

すなわち、本発明は下記のとおりである:
[1]受託番号NITEBP-1519で寄託されている、ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NTM048株又はその変異株から産生されるエキソポリサッカライド。
[2]エキソポリサッカライドを産生し得るロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株を培養する工程を含む、エキソポリサッカライドの製造方法。
[3]ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が、[1]に記載の菌株である、[2]の方法。
[4]さらに、培養された菌株の上清を分離し、該上清からエキソポリサッカライドを精製する工程を含む、[2]又は[3]に記載の方法。
[5][2]−[4]のいずれか1つに記載の方法で得られるエキソポリサッカライド。
[6][1]又は[5]に記載のエキソポリサッカライドを含む組成物。
[7]医薬品である、[6]に記載の組成物。
[8]食品である、[6]に記載の組成物。
[9]化粧料である、[6]に記載の組成物。
[10]飼料である、[6]に記載の組成物。

発明の効果

0012

本発明において、えんどう豆から新たに単離した乳酸菌NTM048株が、IgA産生促進能を有し、この菌株がエキソポリサッカライドを産生することを明らかにした。当該エキソポリサッカライドは、公知の乳酸菌から産生されるエキソポリサッカライドよりも高いIgA産生促進活性を有し、食品、医薬品、化粧料、飼料等、様々な分野において使用し得ることから、本発明は産業上極めて有用である。

図面の簡単な説明

0013

本発明で単離した乳酸菌NTM048株のIgA産生誘導能の結果を示す。図中、縦軸はTotal IgA (ng/mL)を示し、横軸は、陰性対照(生理食塩水)、NTM048菌株、陽性対照(LPS)を示す。データは6個の異なる個々の実験平均値±標準誤差(SE)を示す。**P<0.01
NTM048株と、他のLeuconostoc mesenteroides菌株とのIgA産生誘導活性を比較した結果を示す。図中、縦軸はTotal IgA (ng/mL)を示し、横軸は各種菌株、陰性対照(生理食塩水)を示す。データは6個の異なる個々の実験の平均値±標準誤差(SE)を示す。*P<0.05、**P<0.01
マウスにNTM048株を含む経口投与した場合のIgA産生誘導活性を示す。図中、縦軸はTotal IgA (ng/mL)を示し、横軸は日数を示す。データは試験区5匹毎の実験の平均値±標準誤差(SE)を示す。*P<0.05、**P<0.01
EPSによるIgA誘導の結果を示す。図中、縦軸はTotal IgA(ng/mL)を示し、横軸は、陰性対照(生理食塩水)、EPSの濃度が20μg/mL、100μg/mL、250μg/mLの場合を示す。
各菌株から産生・精製したEPSによるIgA産生誘導活性を比較した結果を示す。図中、縦軸はIgA産生の割合を示し、横軸は、陰性対照(生理食塩水)、陽性対照(LPS)、NTM048株(EPS)、B512F株(EPS)、JCM6124株(EPS)を示す。
ゲル濾過クロマトグラフィーによるNTM048株から産生したEPSの分子サイズの測定結果を示す。図中、縦軸はGlucose equivalents (μg/mL)を示し、横軸はElution Volume(mL)を示す。

0014

以下、本発明の詳細を説明する。本発明は、ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株、より好ましくは、NTM048株又はその変異株が産生するエキソポリサッカライド、該エキソポリサッカライドの製造方法および該エキソポリサッカライド含む組成物等を提供する。

0015

(NTM048株)
本発明では以下の方法で、えんどう豆から新たな乳酸菌(NTM048株)を単離した。スクリーニング方法及びNTM048株の菌学的性質は以下のとおりである。
1.スクリーニング
(1)起源
えんどう豆
(2)スクリーニング方法
マウスパイエル板細胞を用いて、IgA産生促進を指標としてスクリーニングを実施した。
2.乳酸菌の同定
(1)ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides) NTM048株
(2)肉眼的特徴
(2−1)MRS寒天培地上において、円形で白色の集落
(2−2)顕微鏡的特徴球菌運動性はなし、芽胞は形成しない。

0016

(3)生育温度
30〜37℃で良好に発育する。
(4)生理学的、生化学的特徴
グラム染色性陽性
糖資化性を表1に示す。

0017

0018

さらに、化学分類学的性質として、16SrRNAの約1.5kbを配列番号1に示す。

0019

以上の諸性質から、バージィーズ・マニュアルオブシステマティックバクテリオロジー(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)に照らし、本菌株をロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)に属する菌株と同定し、ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NTM048と命名した。NTM048株は、2013年1月25日に、日本国千葉県木更津市かずさ足2−5−8に住所を有する、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された。受託番号は、NITEBP-1519である。

0020

本発明の菌株には、上記NTM048株のみならず、当該菌株の変異体であって、少なくとも哺乳動物の腸管関連リンパ組織において、NTM048株と同等以上のIgA産生促進能等を有するものも含まれる。当該変異体は、他の臓器組織(例えば、気管支肺胞血漿等)におけるIgA産生促進作用脾臓骨髄、血液等におけるヘルパーT細胞増大作用が、NTM048株における当該作用と同等以上であることがより好ましい。変異の導入法としては、ニトロソ化合物ニトロソアミンニトロソグアニジン等)、アルキル化剤EMS;ethyl methanesulfonate)のような化学物質処理による方法、紫外線照射放射線照射等が挙げられるが、これらに限定されない。得られた変異株が腸管関連リンパ組織において、NTM048株と同等以上のIgA産生促進作用を示すか否かは、上記NTM048株のスクリーニングに用いたのと同様の方法により、当該変異株のIgA産生促進活性を測定し、これをNTM048株における活性と比較することにより検定することができる。

0021

ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株、より好ましくは、NTM048株又はその変異体は、上述のMRS培地等、乳酸菌培養用の培地(固形培地、又は液体培地等)を用いて培養することができる。

0022

一態様として、ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株、より好ましくは、NTM048株又はその変異体は、EPSが形成される条件下で、適した培地中で培養することができる。適した培地の組成としては、EPSを生成すれば特に限定はなく、炭素源として、例えば、スクロースガラクトースキシロースグルコースソルビトールトレハロースラクトースフルクトースマルトース、又はこれらの混合物を使用することができる。一例として、スクロース、バクトペプトン酵母抽出物、K2HPO4、MnCl2・H2O、NaCl、CaCl2などを組成として含む培地を用いて培養することができる。

0023

当該培地には、必要に応じて、各種ビタミン類ビタミンAビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンCビタミンDビタミンE等、又はこれらの誘導体も含む)、各種アミノ酸天然アミノ酸又は合成アミノ酸も含む)、核酸塩基プリンピリミジン)、無機塩類(MgSO4、MnSO4、FeSO4、NaCl等)等を添加することができる。エキソポリサッカライドを産生すれば特に限定はなく、これらを組み合わせて培地に添加してもよい。

0024

ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株、より好ましくは、NTM048株又はその変異体は、培養温度として、30〜37℃、より好ましくは35〜37℃、培養期間は、16時間〜3日間、より好ましくは1〜2日間、pHは3〜8、より好ましくはpH4〜7で培養し、調製することができる。

0025

本発明の菌株の菌体処理物としては、上述の方法で得られる培養液、及び/又は、当該培養液を、自体公知の方法、例えば、遠心分離、ろ過、磁性分離等の方法により処理した湿菌体又はその洗浄物滅菌水PBS等により洗浄することができる)、これらの凍結乾燥粉末加熱死菌体乾燥死菌体薬品処理による死菌体、菌体壁等の菌体破砕物抽出物等が含まれる。

0026

あるいは、本発明の菌株の菌体処理物としては、ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株、より好ましくは、NTM048株又はその変異体自体を使用し、乳製品穀物、又は加工食品等に当該菌株を接種して発酵させて得られる菌体処理物も含まれる。

0027

(エキソポリサッカライド(菌体外多糖))
エキソポリサッカライドは、菌株が産生する多糖類であり、ホモ多糖類及びヘテロ多糖類分類することができる。ホモ多糖類は、単一の型の単糖から構成される。例えば、α-グルカン、β-グルカン、ガラクタン等が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロ多糖類は、2種以上の異なる単糖の反復単位から構成される。反復単位を構成する単糖の種類としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノースアセチルグルコサミンアセチルガラクトサミンフコースグルクロン酸、非糖置換基(例えば、アセチル基グリセロール等)などが挙げられるが、これらに限定されない。
エキソポリサッカライドの構造は、NMR分析メチル化分析などの手法により解析することができる。

0028

本発明のエキソポリサッカライドは、ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株、より好ましくは、NTM048株又はその変異体を培養して製造することができる。

0029

培養液からのエキソポリサッカライドの分離法は、エキソポリサッカライドが得られれば特に限定はないが、培養液を遠心分離等により、上清と細胞とに分離し、該上清に酸(例えば、トリクロロ酢酸過塩素酸等)又は有機溶媒(例えば、アセトンメタノールエタノール等)を添加してタンパク質を除去し、さらにアルコール(例えば、エタノール、イソプロパノール等)を添加してエキソポリサッカライドを沈殿させて回収することができる。該沈殿はさらに精製(例えば、透析等)を行ってよい。前記分離法は、培養液、培養条件等に応じて、適宜調整することができる。

0030

本発明のNTM048株を培養し、分離することによって得られるエキソポリサッカライドの平均分子量は、公知の方法により求めることができる。例えば、GPC液体クロマトグラフィーやGFC液体クロマトグラフィーによる相対分子量測定法等を使用することができる。後述する実施例の通り、本発明のエキソポリサッカライドの分子量は、30,000〜50,000である。

0031

(組成物)
本発明は、ロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株、より好ましくは、NTM048株又はその変異体が産生するエキソポリサッカライドを含む組成物を提供する。該組成物は、さらに、医薬上許容される担体を含んでもよい。

0032

医薬上許容される担体は、対象に投与したときに対象にアレルギー反応など、望ましくない反応を引き起こすことがない担体をいう。例えば、賦形剤、安定剤、キレート剤希釈剤ゲル化剤溶媒乳化剤懸濁剤分解剤結合剤保存剤潤滑剤、及びこれらの類似物が挙げられるが、これらに限定されない。

0033

本発明はまた、医薬品、食品、化粧料、飼料として前記組成物を提供する。

0034

本発明の医薬品は、腸管免疫活性剤抗アレルギー剤抗ウイルス剤等として使用することができる。

0035

腸管免疫活性とは、腸管関連リンパ組織におけるIgA産生を促進する作用をいう。場合によっては、IgA産生の制御作用も含まれる。

0036

本発明の医薬品は、ヒト、又はヒト以外の動物(例えば、イヌネコ、マウス、ラットハムスターモルモットウサギブタウシニワトリインコ、九官ヤギウマヒツジサル等)に投与し、腸管免疫、アレルギーウイルス感染等に関連する疾患を予防又は治療するために、使用することができる。

0037

腸管免疫活性剤は、腸管免疫に関連する疾患に適用することができる。腸管免疫に関連する疾患とは、例えば、食物(そば、米、小麦牛乳落花生、オレンジりんごキウイフルーツ等の果物、えび、カニ等の甲殻類魚介類等)アレルギー、花粉スギ、イネ、ブタクサセイタカアワダチソウヨモギシラカンバオオアワガエリカモガヤ等)アレルギー、ハウスダスト、化学物質、金属等のアレルギー、感染症黄色ブドウ球菌サルモネラコレラ菌病原性大腸菌ストレプトコッカスミュータンスクロストリジウム赤痢菌等の細菌感染インフルエンザウイルスロタウイルスノロウイルスヘルペスウイルス等のウイルス感染、寄生虫原虫感染等)、炎症性腸疾患クローン病潰瘍性大腸炎等)、自己免疫疾患臓器特異性自己免疫疾患及び全身性自己免疫疾患)、ストレスによる腸管免疫の機能低下等、が挙げられるが、これらに限定されない。

0038

アレルギーは、特定の抗原に対して過剰に免疫反応が起きることをいう。抗アレルギー剤として、I型アレルギー(食物アレルギー花粉症アレルギー性鼻炎気管支喘息アトピー性皮膚炎等)、II型アレルギー(悪性貧血リウマチ熱グッドパスチャー症候群重症筋無力症橋本病等)、III型アレルギー(血清病全身性エリテマトーデスループス腎炎)、急性糸球体腎炎関節リウマチ過敏性肺臓炎リウマチ性肺炎等)等への適用が挙げられるが、これらに限定されない。

0039

抗ウイルス剤としては、インフルエンザウイルス、エイズウイルス等の感染への適用が挙げられるが、これらに限定されない。

0040

当該医薬品の剤型としては、散剤顆粒剤丸剤ソフトカプセルハードカプセル錠剤チュアブル錠、速崩錠、シロップ液剤、懸濁剤、座剤、軟膏クリーム剤ゲル剤、粘付剤、吸入剤注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。

0041

注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内骨膜内、下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ボーラス投与のいずれであってもよい。

0042

本発明の医薬品の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、本発明のエキソポリサッカライドを1日投与量として、通常、0.5μg〜10g、好ましくは、5μg〜5g、より好ましくは、50μg〜1gを、経口的または非経口的に投与することができる。投与は1日に複数回に分けてもよい。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。

0043

また、本発明の医薬品の別の態様として、本発明はまた、有効成分としてのロイコノストックメセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)の菌株、より好ましくは、NTM048菌株(変異体も含む)又はその菌体処理物、および医薬上許容される担体(賦形剤、結合剤、崩壊剤滑沢剤等)を含む、乳酸菌剤、腸管免疫活性剤、抗アレルギー剤、抗ウイルス剤等を提供する。

0044

前記乳酸菌剤、腸管免疫活性剤、抗アレルギー剤、抗ウイルス剤等は、単独で使用することができる。あるいは、他の乳酸菌、乳酸菌製剤、その他の微生物、微生物製剤と併用して使用することもできる。

0045

他の乳酸菌としては、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ロイコノストック(Leuconostoc)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属等に属する種が挙げられ、乳酸菌製剤としては、上記菌を含む製剤が挙げられるが、これらに限定されない。

0046

その他の微生物としては、酵母バチルス(Bacillus)属、酪酸菌(Clostridium butyricum)、麹菌等の真菌等が挙げられ、微生物製剤としては、上記微生物を含む製剤が挙げられるが、これらに限定されない。

0048

上記医薬品は、さらに、甘味料着色料pH調整剤香料、各種アミノ酸等を添加することもできる。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。液体製剤であれば、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。

0049

上記医薬品に含まれるNTM048株又はその変異株の菌数としては、1日あたりの摂取量が104コロニー形成ユニット(以下、cfuという)以上1012cfu以下、好ましくは106cfu以上109cfu以下である。

0050

本発明の食品は、溶液懸濁物粉末固体成形物等、経口摂取可能な形態であればよく、特に限定するものではない。具体例としては、サプリメント(散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等)、飲料(炭酸飲料乳酸飲料スポーツ飲料果汁飲料野菜飲料豆乳飲料コーヒー飲料茶飲料粉末飲料濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等)、乳製品(ヨーグルトバターチーズアイスクリーム等)、菓子グミゼリーガムチョコレートクッキーキャンデーキャラメル和菓子スナック菓子等)、即席食品類(即席麺レトルト食品缶詰電子レンジ食品、即席スープ・みそ類、フリーズドライ食品等)、油、油脂食品マヨネーズドレッシングクリームマーガリン等)、小麦粉製品パンパスタ、麺、ケーキミックスパン粉等)、調味料ソーストマト加工調味料、風味調味料調理ミックス、つゆ類等)、畜産加工品畜肉ハムソーセージ等)が挙げられる。

0051

上記食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類(ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK等)、各種ミネラル類マグネシウム亜鉛、鉄、ナトリウムカリウムセレン等)、食物繊維分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分クエン酸リンゴ酸等)、フレーバーローヤルゼリープロポリスアガリクス等を配合することができる。

0052

本発明の食品の1日摂取量としては、摂取する対象、対象疾患、症状などによっても異なるが、例えば、本発明のポリサッカライドを1日摂取量として、通常、0.1mg〜10g、好ましくは、1mg〜5g、より好ましくは、10mg〜1gを、経口的に摂取することができる。摂取は1日に複数回に分けてもよい。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。

0053

本発明の化粧料としては、クリーム、ゲル乳液美容液ローションマイクロエマルジョンエッセンスパックファンデーション口紅アイシャドーシャンプーコンディショナー入浴剤等が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、香料等を混合してもよい。

0054

本発明の化粧料の1日使用量としては、使用対象、対象疾患、症状などによっても異なるが、例えば、本発明のポリサッカライドを1日使用量として、通常、1μg〜30g、好ましくは、10μg〜10g、より好ましくは、100μg〜1gを、使用することができる。使用は1日に複数回に分けてもよい。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。

0055

本発明の飼料としては、ペットフード、動物又は水産養殖飼料添加物等が挙げられる。

0056

本発明の飼料の1日摂取量としては、摂取させる動物、対象疾患、症状などによっても異なるが、例えば、本発明のポリサッカライドを1日摂取量として、通常、1μg/kg体重〜0.2g/kg体重、好ましくは、10μg/kg体重〜0.02g/kg体重、より好ましくは、0.1mg/kg体重〜2mg/kg体重を、経口的に摂取させることができる。摂取は1日に複数回に分けてもよい。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。

0057

(IgA産生)
本発明において、IgA産生は自体公知の方法で、測定することができる。例えば、パイエル板細胞を後述の実施例に示すコラゲナーゼを使用する方法等により調製して、当該パイエル板細胞を乳酸菌存在下で培養し、培養上清を回収する。当該培養上清中に含まれるIgAの量をELISA法(市販のIgA測定キット等)等、自体公知の方法により測定する。そして、対照群(例えば、陰性対照であれば生理食塩水、陽性対照であればLPS等)と比較して、IgA量の変化を確認する。

0058

パイエル板細胞は、マウス、ラット、ヒト等の種を問わず、調製法も上記方法に限定されず、当業者は必要に応じて適宜選択することができる。あるいは、in vivoでのIgA産生誘導活性を測定するためには、個体(マウス、ラット、ヒト等の種を問わず)から生物学的試料(血液、等)を採取し、当該試料中のIgA量の変化を確認することができる。

0059

以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

0060

培地、試薬及び菌株
培地:RPMI-10培地[RPMI 1640培地(Gibco社製)に10%牛胎児血清を追加]、MRS培地(Difco社製)
試薬:コラゲナーゼ(Sigma社製)、DNase(Takara社製)、B512F株(Leuconostoc mesenteroides)産生デキストラン(Sigma社製)
菌株:NTM048株[えんどう豆から単離した(受託番号:NITEBP-1519、寄託日:2013年1月25日)]、JCM16943株(Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)、JCM6124株(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)[独立行政法人理化学研究所 筑波研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室(JCM)より購入した。]

0061

参考試験例1コラゲナーゼ調製法によるパイエル板細胞の調製
7週齢のBALB/cAマウスより小腸パイエル板を摘出した。当該パイエル板をRPMI-10培地で洗浄し、5 mL のIEC-dissociating solution(25 mMHEPES, 5 mMEDTA, 1 mM DTT in RPMI-10)の入った滅菌ディッシュに移し、CO2インキュベーター内で、37℃で45分インキュベートした。よくピペッティングした後、5 mL のEDTA solution (5 mM EDTA in RPMI-10)の入った滅菌ディッシュ に移し、CO2インキュベーター内で、37℃で5分インキュベートした。さらによくピペッティングした後、パイエル板を、5 mLのdigestion solution (400 U/mL コラゲナーゼ, 30 U/mL DNase in RPMI-10)とスターラーバーを入れた50 mLチューブに移し、37℃で30分攪拌しながらインキュベートした。酵素分解終了後、パイエル板細胞は培地中に懸濁されているため濁っており、遠心(1400 rpm, 7分, 4℃)後、4 mLの上清を吸引除去した。当該パイエル板細胞の懸濁液(1 mL)を40μmのセルストレーナーに通し、遠心(1400 rpm, 7分, 4℃)後、上清を吸引除去し 1 mLのRPMI-10培地に懸濁した。細胞数カウントした後、免疫機能活性の測定に用いた。

0062

参考試験例2IgA産生量の測定
様々な生野菜及び漬物から単離した約200株の乳酸菌について、マウス小腸パイエル板細胞を用いたIgA産生促進能を検討した。

0063

上述のコラゲナーゼ調製法により得られたパイエル板細胞の濃度を2.5 ×105 cells/mLになるよう、CD3抗体コート96穴プレート(BD Biosciences社製)に調整した。当該パイエル板細胞懸濁液に、MRS培地にて液体培養後、生理食塩水にて10 μg/mLに菌体濃度を調整した乳酸菌を等量加え、37℃、5% CO2嫌気条件下で5日間反応後、パイエル板細胞から産生した総IgA量をMouse IgAELISAQuantitation Set (BETHYL社製)を用いて測定した。乳酸菌NTM048株についての結果を図1に示す。

0064

有意に高いIgA産生促進能を有する乳酸菌2株(NTM047、NTM048)を選出した。両株について70℃、30分熱処理し、得られた死菌体について同様にパイエル板細胞を用いたIgA産生促進能を調べたところ、両株ともに生菌体と同様のIgA産生促進能が確認された。当該結果からNTM047株およびNTM048株によるIgA産生誘導物質は菌体壁または菌体外成分であることが示唆された。さらに16S rDNA配列解析により菌種同定を試みたところ、これら2株は同一菌株であることが明らかになった。

0065

参考試験例3 Type strainとの比較
参考試験例2と同様の方法で、パイエル板細胞を用いたin vitroにおけるIgA産生誘導活性について、NTM048株と、JCM16943株及びJCM6124株とで比較を行った。結果を図2に示す。

0066

NTM048株は、Leuconostoc mesenteroides の他の菌株に比べて、IgA産生を高く誘導することが確認された。

0067

参考試験例4 in vivo でのIgA産生誘導活性の確認
6週齢のオスBALB/cマウスに、2週間予備飼育(乳酸菌フリーの餌;AIN-76)を行った後、各試験区5匹ずつに、0、0.05、0.5、5%の乳酸菌NTM048株を含むAIN-76を2週間投与し、0、7、14日目の糞を採取してIgA量を確認した。糞を採取後、6時間凍結乾燥し、糞重量10 mg/200 μLの割合でProtease Inhibitor Cocktail(Roche社製)を含む抽出用緩衝液(PBS)に懸濁した。当該懸濁液を、ボルテックスにて撹拌して30分氷冷した後、遠心(15000 rpm, 10分, 4℃)し、上清中に抽出された総IgA量を上述のとおりELISA法で測定した。

0068

表2に餌の組成を、IgA産生誘導の結果を図3に示す。

0069

0070

14日目にすべての菌体投与区においてIgA量の増加がみられ、0.5%及び5%NTM048株投与マウスにおいて有意差(P<0.01、P<0.05)が認められた。

0071

実施例1菌体外多糖(EPS)の産生と精製方法
EPSの抽出はthe production and purification method for EPS of L. mesenteroides strain(Sarwat,Ul Qader,Aman,&Ahmed,2008)に従い行った。
一晩培養したNTM048菌株培養液500μLをEPS産生用培地50mL(組成:15% sucrose、0.5% bacto-peptone、0.5% yeast extract、1.5% K2HPO4、0.001% MnCl2・H2O、0.001% NaCl、 0.005% CaCl2)に添加し、30℃で24時間培養した後、遠心分離して菌体を取り除いた。上清と同量冷エタノールを添加して沈殿させ、激しく振とうした後、10,000rpmで15分間遠心分離し上清を取り除いた。この工程を2回繰り返した。沈殿したEPSは12時間、塩化カルシウム上で乾燥させた。不純物を取り除くために、蒸留水にEPSの沈殿物を溶かし、再びその懸濁液と同量の冷エタノールを添加して沈殿させた。この工程を2回繰り返し、沈殿したEPSは12時間、塩化カルシウム上で乾燥させた。このEPSは生理食塩水に溶かし、IgA産生誘導活性の測定に使用した。

0072

実施例2IgA測定
参考試験例1と同様の方法により調製したパイエル板細胞を用いて、NTM048株から産生・精製した菌体外多糖(EPS)について、IgA産生促進能を検討した。
参考試験例1のコラゲナーゼ調製法により得られたパイエル板細胞の濃度を2.5 ×105 cells/mLになるよう、CD3抗体コート96穴プレート(BD Biosciences社製)に調整した。当該パイエル板細胞懸濁液に、生理食塩水にて20 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mLの濃度に調整したEPSを等量加え、37℃、5% CO2嫌気条件下で5日間反応後、パイエル板細胞から産生した総IgA量をMouse IgAELISAQuantitation Set (BETHYL社製)を用いて測定した。NTM048菌株産生の菌体外多糖(EPS)についての結果を図4に示す。

0073

実施例3 Type strain産生EPSとの比較
参考試験例1と同様の方法により調製したパイエル板細胞を用いて、NTM048株から産生・精製した菌体外多糖(EPS)、B512F株産生デキストラン、およびJCM6124株から産生・精製した菌体外多糖(EPS)についてIgA産生促進能を検討した。B512F株産生デキストランはSigma社製の試薬(製品番号31398)を使用し、菌体外多糖(EPS)として使用した。JCM6124株から産生・精製したEPSについては、実施例1と同様の方法で産生・精製した。
参考試験例1のコラゲナーゼ調製法により得られたパイエル板細胞の濃度を2.5×105cells/mLになるよう、CD3抗体コート96穴プレート(BD Biosciences社製)に調整した。当該パイエル板細胞懸濁液に、生理食塩水にて各100μg/mLの濃度に調整したEPSを等量加え、37℃、5%CO2嫌気条件下で5日間反応後、産生した総IgA量をMouse IgAELISAQuantitation Set(BETHYL社製)を用いて測定した。NTM048菌株、B512F株産生デキストラン、JCM6124株から産生したEPSの結果を図5に示す。ネガティブコントロールとして生理食塩水を、ポジティブコントロールとしてリポポリサッカライド(LPS)(Sigma社製)10 μg/mLを等量加えてEPSと同様にIgA産生量を測定した。NTM048株産生のEPSは、他の菌株が産生したEPSと比べて、IgA産生を高く誘導することが確認された。

0074

実施例4菌体外多糖(EPS)の分子サイズ
20mLの超純水に実施例1で産生・精製したNTM048株のEPS 20mgを懸濁し、24時間超音波により溶解させた。溶解液をSepharose CL6B(Sigma社製)を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより、流速35mL/hの超純水にて溶出させた。結果を図6に示す。各分画多糖濃度フェノール硫酸法にて測定した。
分子量35,000〜45,000のデキストランD1662(Sigma社製)を対照として抽出ピークを確認したところ、NTM048株産生のEPSの分子量は30,000〜50,000と推定された。

0075

本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。

実施例

0076

ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

0077

本発明は、高いIgA産生促進能を有する乳酸菌(NTM048株)が、エキソポリサッカライドを産生することを明らかにした。当該エキソポリサッカライドは、医薬品、飲食品、化粧料、飼料等様々な分野へ適用可能であるため、本発明は産業上極めて有用である。
本出願は、日本で出願された特願2013−194656(出願日:平成25年9月19日)を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

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