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技術 インスリン測定方法

出願人 積水メディカル株式会社
発明者 近藤純一新山加菜美山本光章
出願日 2014年3月31日 (6年7ヶ月経過) 出願番号 2015-508826
公開日 2017年2月16日 (3年9ヶ月経過) 公開番号 WO2014-157723
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード 緩衝域 乖離度合 pH緩衝液 測光ポイント 容量混合比 ヘテロジニアス 測定操作 生化学自動分析装置
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2017年2月16日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (2)

課題・解決手段

血液試料測定の際の非特異反応が抑制されたヒトインスリンラテックス凝集免疫測定方法及び測定試薬を提供することを課題とする。 pH緩衝作用を有するアミン化合物を2種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体担持した粒子による免疫反応を行う。

概要

背景

ヒトインスリン分子量5807のペプチドで、糖尿病診断治療上、重要な分子マーカーの一つである。ヒト血液試料中のインスリン免疫学的測定は、その濃度の問題から、長らく競合RIAあるいは化学発光免疫測定法が主流であったが、近年のラテックス凝集免疫測定方法(LTIA)の高感度化に伴い、生化学自動分析装置に適用可能なLTIA用試薬報告され、一部は市販されるに至っている。
非特許文献1の方法は、抗インスリン抗体担持したラテックス粒子を用いたサンドイッチLTIA法であるが、サンドイッチLTIAによるペプチドの測定は実用化された例が少ないため、なお課題が存在する。

概要

血液試料測定の際の非特異反応が抑制されたヒトインスリンのラテックス凝集免疫測定方法及び測定試薬を提供することを課題とする。 pH緩衝作用を有するアミン化合物を2種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体を担持した粒子による免疫反応を行う。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
2件

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請求項1

pH緩衝作用を有するアミン化合物を2種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体担持した粒子による免疫反応を行うことを特徴とするインスリン測定方法

請求項2

pH緩衝作用を有するアミン化合物がHEES、MES及びTrisからなる群より選ばれるものである、請求項1に記載の測定方法。

請求項3

緩衝液のpHが7.3〜7.8である、請求項1又は2に記載の測定方法。

請求項4

pH緩衝作用を有するアミン化合物を2種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体を担持した粒子による免疫反応を行うことを特徴とする、インスリンの粒子凝集免疫測定方法における血液試料由来非特異反応抑制方法

技術分野

0001

本発明は、血液試料測定の際の非特異反応が抑制されたヒトインスリンラテックス凝集免疫測定方法及び測定試薬に関する。

背景技術

0002

ヒトインスリンは分子量5807のペプチドで、糖尿病診断治療上、重要な分子マーカーの一つである。ヒト血液試料中のインスリン免疫学的測定は、その濃度の問題から、長らく競合RIAあるいは化学発光免疫測定法が主流であったが、近年のラテックス凝集免疫測定方法(LTIA)の高感度化に伴い、生化学自動分析装置に適用可能なLTIA用試薬報告され、一部は市販されるに至っている。
非特許文献1の方法は、抗インスリン抗体担持したラテックス粒子を用いたサンドイッチLTIA法であるが、サンドイッチLTIAによるペプチドの測定は実用化された例が少ないため、なお課題が存在する。

0003

国際公開第2011/010673号パンフレット

先行技術

0004

関東化学株式会社 サイアスINSULIN II添付文書(2010年2月作成)

発明が解決しようとする課題

0005

本発明者らは非特許文献1に記載された方法での測定値が、従来のヘテロジニアス化学発光酵素免疫測定方法(従来法)での測定値と乖離する検体選抜し、その検体を用いてサンドイッチLTIA法での非特異反応の抑制方法について検討したところ、特定のpH緩衝剤を2種類以緩衝液中に含有させた状態でLTIA法での免疫反応を行うと、従来法の測定値との乖離度合縮小できることを見出し本発明を完成させるに至った。

課題を解決するための手段

0006

すなわち本発明は、以下に関するものである。
[1]pH緩衝作用を有するアミン化合物を2種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体を担持した粒子による免疫反応を行うことを特徴とするインスリンの測定方法
[2]pH緩衝作用を有するアミン化合物がHEES、MES及びTrisからなる群より選ばれるものである、[1]に記載の測定方法。
[3]緩衝液のpHが7.3〜7.8である、[1]又は[2]に記載の測定方法。
[4]pH緩衝作用を有するアミン化合物を2種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体を担持した粒子による免疫反応を行うことを特徴とする、インスリンの粒子凝集免疫測定方法における血液試料由来の非特異反応の抑制方法。

発明の効果

0007

本発明の測定方法によれば血液試料測定の際の非特異反応を抑制してヒトインスリンのラテックス凝集免疫測定を行うことができる。免疫測定方法に使用されるpH緩衝剤は、抗原抗体反応時のpHの至適化を目的として処方されており、pH緩衝域を拡大するためや、主たるpH緩衝剤と組み合わせてpHを調整するために2種類のpH緩衝剤を使用することはこれまでも行われてきたが、特定の2種類以上のpH緩衝剤を緩衝液中に含有させると、非特異反応が抑制されることは予想できず、全く意外なことである。

図面の簡単な説明

0008

従来のLTIA法の測定結果本発明方法の測定結果の相関図である。上段:化学発光酵素免疫測定方法(ルミパルスプレスト(登録商標)インスリン、富士レビオ社)と従来のLTIA法(サイアスINSULINII、関東化学社)、下段:化学発光酵素免疫測定方法(ルミパルスプレスト(登録商標)インスリン、富士レビオ社)と本発明方法。

0009

本発明方法の測定対象となる血液試料は全血血清血漿である。
本発明方法におけるpH緩衝作用を有するアミン化合物を2種類以上含有する緩衝液は、HEPES(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)、MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid)及びTris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)からなる群より選ぶことができる。該緩衝液(pH緩衝作用を有するアミン化合物2種類以上含有させた場合の該pH緩衝作用を有するアミン化合物2種類以上の合計濃度)の好適な濃度範囲は100mM〜1000mM、好ましくは200mM〜800mM、より好ましくは400mM〜800mMであり、該緩衝液の好適なpHは7.3〜7.8である。
本発明方法に使用可能な抗インスリン抗体を担持したラテックス粒子は、特許文献1ほか、当業者に公知の方法により得ることができる。

0010

本発明を実施するための試薬の形態は、通常使用されるラテックス凝集免疫測定試薬の形態を取ることができる。例えば、本発明の緩衝液を第一試薬とし、抗インスリン抗体を担持したラテックス粒子を含有する溶液を第二試薬とする形態や、本発明の緩衝液に抗インスリン抗体を担持したラテックス粒子を含有させた一試薬形態を挙げることができる。
また、本発明を実施するための試薬には、ラテックス凝集免疫測定試薬に含有させることが公知の各成分、例えば、カルシウムマグネシウムなどの金属イオンイオン性非イオン性両性などの界面活性剤EDTAなどのキレーターデキストラン硫酸などの多糖高分子化合物アルブミンなどのタンパク質、Hetero Block(Omega Biologicals, Inc.)、ブロクエース(DSファルマ社)、BPF(東洋紡社)などの市販のブロッキング剤、抗IgM抗体などと含有させることができる。

0011

本発明方法の具体的な手順として、日立7170型自動分析装置などの分析装置を使用し、血液試料を主にpH緩衝液からなる第一試薬に添加しインキュベートした後、そこに抗インスリン抗体を担持したラテックス粒子を含有する第二試薬を添加し、主波長570nm、副波長800nm等の適当な波長での吸光度を測定し、インスリン濃度を求めることにより行うことができる。
なお、前述の本発明方法におけるpH緩衝作用を有するアミン化合物の濃度は、第一試薬と第二試薬の容量混合比が3:1の場合で記載している。

0012

次に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。

0013

[実施例1]
1.測定操作
218例の患者血清を化学発光酵素免疫測定方法(ルミパルスプレスト(登録商標)インスリン、富士レビオ社)、従来のLTIA法(サイアスINSULINII、関東化学社)、本発明方法で測定した。
本発明方法は、特許文献1に記載の抗インスリンモノクローナル抗体感作ラテックスを使用して以下の第一試薬、第二試薬を調製して行った。

0014

第一試薬
600mM MES
200mM Tris
200mM NaCl
50μg/mL Hetero Block(Omega Biologicals, Inc.)
200μg/mL 抗IgM抗体
pH7.5
第二試薬
7.5mM Tris
66221抗体感作ラテックス
66226抗体感作ラテックス
pH8.0

0015

日立7170型自動分析装置を用い、血清10μLを第一試薬150μLに添加し5分、37℃でインキュベートした後、そこに第二試薬50μLを添加し、測光ポイント19−34のタイミングで主波長570nm、副波長800nmでの吸光度を測定し、インスリン濃度を求めた。

実施例

0016

2.測定結果
化学発光酵素免疫測定方法の測定値を100とした場合、従来のLTIA法では81例の血清で±30%を超える値を示した。一方、本発明方法では、±30%を超える値を示す血清は認められなかった。化学発光酵素免疫測定方法の測定値をX、従来のLTIA法の測定値又は本発明方法の測定値をYとし、相関関係を確認した。結果を図1に示す。本発明方法では、従来のLTIA法で認められた化学発光酵素免疫測定方法の測定との乖離が収束していることがわかる。

0017

本発明によれば、ヒトインスリンのラテックス凝集免疫測定方法における血液試料測定の際の非特異反応を抑制することが可能となった。本発明では、通常pH緩衝剤として使用されるアミン化合物を選択して使用することにより該効果を得ることができるため、試薬処方の設計に不要な制限が付加されることがなく、工業的に非常に有用である。

0018

(1)FERM BP−11233
(2)FERM BP−11234

0019

[寄託生物材料への言及]
(1)66221抗体を産生するハイブリドーマ66221
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
日本国県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305-8566)
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成21年4月8日(2009年4月8日)(原寄託日)
平成22年2月17日(2010年2月17日)(原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP−11233
(2)66226抗体を産生するハイブリドーマ66226
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305-8566)
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成21年4月8日(2009年4月8日)(原寄託日)
平成22年2月17日(2010年2月17日)(原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP−11234

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