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課題・解決手段

(A)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸/そのアンチセンス鎖、に対し相補的ハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端バルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該バルジの隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該バルジにナフチリジン誘導体化合物固定化されてなる核酸プローブと、(B)前記評価対象核酸とを混合し、ハイブリダイズした際にナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルを検出し、前記一塩基多型を評価することを特徴とする、核酸中の一塩基多型の検出方法。本発明の検出方法によれば、核酸中の一塩基多型を、簡便な操作で、低コストで、高感度に検出することができる。

概要

背景

一塩基多型(SNP)は、ゲノムDNA上に存在する個体間の違いであり、ヒト等における種々の疾患や種々の表現形質の違いを生じうる。従って、かかるSNPは、遺伝子疾患解析、個体間の識別等に利用されている。

現在、一塩基多型(SNP)の検出に使われているリアルタイムPCR法としては、例えば、Taq Man(登録商標)法、SYBR(登録商標)Green法が挙げられる。Taq Man(登録商標)法は、非常に感度の良い方法であるが、検出に用いるTaq Man(登録商標)プローブの設計、合成が煩雑であり、検出コストが高い。また、SYBR(登録商標)Green法は、二本鎖DNAとの結合により蛍光強度が増大することを利用した簡便な方法であるが、非特異的な増幅による二本鎖の形成も「ポジティブ」として検出されるため、検出エラーが大きく、アレル特異性を上げるために用いるプライマーを最適化することが課題である。これらの方法におけるプライマーは、設計ソフトを用いてある程度適正なプライマーを設計した後、アレル特異性が最も高くなるようにプライマーの配列やPCRの条件を最適化して用いているが、個々のゲノムによる最適化が必要になるため、最適条件を見つけることが大変な作業となっている。

これに対して、本発明者らは、ナフチリジン環を含む化合物が、バルジ構造に特異的に結合することにより、結合前の吸収極大波長からシフトし、かつ、該バルジ塩基に隣接するヌクレオチドと対をなすヌクレオチド残基の種類により蛍光強度が変動するという蛍光特性を利用した、ヘアピンプライマーPCR(HP−PCR)法を報告している(特許文献1参照)。具体的には、先ず、ナフチリジン環を含む化合物が特異的に結合するバルジ領域を導入したヘアピン構造を5’末端に有するプライマーを調製し、次に、PCRにより、対象核酸ハイブリダイズさせてバルジ構造を含むデュプレックスを形成させる。そこに、該ナフチリジン環含有化合物を添加してバルジ構造に結合させることで、吸収極大の波長がシフトし、蛍光強度の変動として観測される。

概要

(A)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸/そのアンチセンス鎖、に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該バルジの隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該バルジにナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブと、(B)前記評価対象核酸とを混合し、ハイブリダイズした際にナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルを検出し、前記一塩基多型を評価することを特徴とする、核酸中の一塩基多型の検出方法。本発明の検出方法によれば、核酸中の一塩基多型を、簡便な操作で、低コストで、高感度に検出することができる。

目的

また、SYBR(登録商標)Green法は、二本鎖DNAとの結合により蛍光強度が増大することを利用した簡便な方法であるが、非特異的な増幅による二本鎖の形成も「ポジティブ」として検出されるため、検出エラーが大きく、アレル特異性を上げるために用いるプライマーを最適化することが課題である

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

(A)i)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的ハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端シトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物固定化されてなる核酸プローブ、又はii)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブと、(B)前記評価対象核酸と、を混合し、前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に前記シトシンバルジ又はチミンバルジが消失することによる2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルを検出し、前記一塩基多型を評価することを特徴とする、核酸中の一塩基多型の検出方法

請求項2

下記1)〜4):1)一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、2)一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、3)前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、及び4)前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、の少なくとも一つをハイブリダイズさせ、その際の2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルに基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する、請求項1記載の検出方法。

請求項3

シグナルが蛍光である請求項1又は2記載の検出方法。

請求項4

2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が、下記式(II):で示される化合物、及び下記式(V):で示される化合物からなる群より選ばれる1種以上の2,7−ジアミノ−1,8−ナフチリジンである、請求項1〜3いずれかに記載の検出方法。

請求項5

i’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及びii’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び、i’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、ii’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、を含有してなる、請求項1〜4いずれかに記載の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキット

技術分野

0001

本発明は、標的となる核酸中の一塩基多型を検出する方法及びそのキットに関する。さらに詳しくは、標的となる核酸中の一塩基多型を、簡便に、高感度に検出する方法及びそのキットに関する。

背景技術

0002

一塩基多型(SNP)は、ゲノムDNA上に存在する個体間の違いであり、ヒト等における種々の疾患や種々の表現形質の違いを生じうる。従って、かかるSNPは、遺伝子疾患解析、個体間の識別等に利用されている。

0003

現在、一塩基多型(SNP)の検出に使われているリアルタイムPCR法としては、例えば、Taq Man(登録商標)法、SYBR(登録商標)Green法が挙げられる。Taq Man(登録商標)法は、非常に感度の良い方法であるが、検出に用いるTaq Man(登録商標)プローブの設計、合成が煩雑であり、検出コストが高い。また、SYBR(登録商標)Green法は、二本鎖DNAとの結合により蛍光強度が増大することを利用した簡便な方法であるが、非特異的な増幅による二本鎖の形成も「ポジティブ」として検出されるため、検出エラーが大きく、アレル特異性を上げるために用いるプライマーを最適化することが課題である。これらの方法におけるプライマーは、設計ソフトを用いてある程度適正なプライマーを設計した後、アレル特異性が最も高くなるようにプライマーの配列やPCRの条件を最適化して用いているが、個々のゲノムによる最適化が必要になるため、最適条件を見つけることが大変な作業となっている。

0004

これに対して、本発明者らは、ナフチリジン環を含む化合物が、バルジ構造に特異的に結合することにより、結合前の吸収極大波長からシフトし、かつ、該バルジ塩基に隣接するヌクレオチドと対をなすヌクレオチド残基の種類により蛍光強度が変動するという蛍光特性を利用した、ヘアピンプライマーPCR(HP−PCR)法を報告している(特許文献1参照)。具体的には、先ず、ナフチリジン環を含む化合物が特異的に結合するバルジ領域を導入したヘアピン構造を5’末端に有するプライマーを調製し、次に、PCRにより、対象核酸ハイブリダイズさせてバルジ構造を含むデュプレックスを形成させる。そこに、該ナフチリジン環含有化合物を添加してバルジ構造に結合させることで、吸収極大の波長がシフトし、蛍光強度の変動として観測される。

先行技術

0005

WO2006/082685号パンフレット

発明が解決しようとする課題

0006

特許文献1の方法では、ヘアピン構造を有するプライマーが安価で容易に入手可能であり、かつ、該プライマーとサンプルとナフチリジン環含有化合物を混合するだけという簡便な操作により行なうことができる。しかしながら、ナフチリジン環含有化合物とバルジ構造との結合には、下記に示す
ナフチリジン環含有化合物 + DNA ⇔ ナフチリジン環含有化合物・DNA
という平衡が存在しているため、PCR時には過剰のナフチリジン環含有化合物を要することになる。そのため、バルジ構造に非結合のナフチリジン環含有化合物の蛍光バックグランドとして検出されるため、検出感度下げるという問題があった。

0007

本発明の課題は、標的となる核酸中の一塩基多型及び遺伝子を、簡便に、かつ、高感度に検出する方法及びそのキットを提供することにある。

課題を解決するための手段

0008

本発明者らが検討を重ねた結果、PCRに用いるヘアピン構造を有するプライマーの特定位置にナフチリジン環含有化合物を予め結合させることによって、PCRの進行により該ヘアピン構造が開いてバルジ構造が消失すると、ナフチリジン環含有化合物が遊離して蛍光を回復するので、蛍光ラベルしたプライマーのみの蛍光強度変化モニタリングすることが可能となり、検出エラーを大きく減少することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

0009

即ち、本発明は、以下の〔1〕〜〔2〕に関する。
〔1〕 (A)i)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、又は
ii)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ
と、
(B)前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に前記シトシンバルジ又はチミンバルジが消失することによる2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルを検出し、
前記一塩基多型を評価することを特徴とする、核酸中の一塩基多型の検出方法
〔2〕 i’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び
ii’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
及び、
i’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
ii’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
を含有してなる、前記〔1〕記載の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキット。

発明の効果

0010

本発明の検出方法によれば、核酸中の一塩基多型を低コストで、簡便に、かつ、高感度に検出することができるという優れた効果が奏される。また、本発明の一塩基多型の検出方法は蛍光増大型のPCR検出法であり、プライマーのデザインが簡単で、競合するプライマーをPCRチューブ内に存在させる事によってアレル特異性を大きく向上させることができることから、他の遺伝子の増幅をモニターしてしまう点、アレル特異性を高める為に条件を検討しなければならない点、更にプライマーのデザインが難しい点など従来技術の問題点を解決することが可能となる。

図面の簡単な説明

0011

図1は、本発明における核酸プローブの模式図を示す図である。
図2は、N,N’−ビス−3−アミノプロピル−2,7−ジアミノ−1,8−ナフチリジン(DANP)の光学特性を示す図である。
図3は、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物をDNAに固定化する模式図である。
図4は、N,N’−ビス−3−アミノプロピル−2,7−ジアミノ−1,8−ナフチリジンの隣接位置がグアニン残基であるバルジDNA結合時の光学特性を示す図である。
図5は、本発明の本発明の一塩基多型の検出方法の概要を示す図である。
図6は、バルジDNAの種類による蛍光の消光を示す図である。
図7は、本発明の検出法を使ったPCRの進行に伴う蛍光強度変化を示す図である。
図8は、評価対象核酸の量を変えた時のPCRの進行に伴う蛍光強度変化を示す図である。
図9は、ある蛍光強度に達するまでのPCRの回数を示す図である。
図10は、評価対象核酸のSNPが異なる場合のPCRの進行に伴う蛍光強度変化を示す図である。
図11は、本発明の検出法を使ったPCRの進行に伴う蛍光強度変化を示す図である。

0012

本発明の一塩基多型の検出方法は、ヘアピン構造を5’末端に有するアレル特異的なプライマーを用いたPCR法であって、該プライマーがヘアピン構造の特定位置にナフチリジン環含有化合物を予め結合させたプローブである点に特徴を有する。

0013

ナフチリジン環含有化合物をバルジ近傍に化学的に固定化すると、ナフチリジン環含有化合物の絶対量はプライマー量と等価となるため、遊離型の場合に比べて、溶液中に過剰に存在するナフチリジン環含有化合物の蛍光強度によるバックグラウンドの増加といった問題がなくなる。

0014

また、本発明では、バルジ前後の塩基対が特定の塩基対の場合に、ナフチリジン環含有化合物がバルジに結合した際の蛍光を消光するという現象を利用する。即ち、バルジ前後を特定の塩基対とすることにより、PCR前ではナフチリジン環含有化合物による蛍光強度を小さい状態にしておく。次いで、PCR反応が進行してポリメラーゼによりヘアピン構造が開かれると、バルジに結合していたナフチリジン環含有化合物がDNA二本鎖外に移動して、元来有する蛍光が観測されるようになる。

0015

本発明の一塩基多型の検出方法では、(A)特定の核酸プローブと(B)評価対象核酸とを混合し、前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に生じるシグナルを検出する。

0016

本発明で用いられる核酸プローブとしては、以下の態様が挙げられる。
i)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が導入されてなる核酸プローブ、
ii)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ

0017

なお、本明細書において、「塩基」とは、特に断りのない限り、デオキシリボヌクレオチドをいう。従って、本明細書において、「シトシン」(C)、「チミン」(T)、「アデニン」(A)、及び「グアニン」(G)は、特に断りのない限り、それぞれのデオキシリボヌクレオチド、即ち、それぞれ、「2’−デオキシシチジン」「2’−デオキシチミジン」、「2’−デオキシアデノシン」及び「2’−デオキシグアノシン」を意味する。

0018

また、本明細書において、「少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸」とは、少なくとも一つ、好ましくは1〜5個の一塩基多型が存在することが確認されている核酸であって、特に断りのない限り、一塩基多型の位置に存在するヌクレオチドは、野生型ヌクレオチド及び変異型ヌクレオチドのいずれをも含む。さらに、本明細書において、「一塩基多型存在位置の野生型ヌクレオチド」とは、一塩基多型が確認されている部位のヌクレオチドであって、いわゆる正常型塩基配列中のかかる部位のヌクレオチドをいい、「一塩基多型存在位置の変異型ヌクレオチド」とは、一塩基多型が確認されている部位のヌクレオチドであって、いわゆる変異型の塩基配列中のかかる部位のヌクレオチドをいう。

0019

さらに、本明細書において、「シトシンバルジ又はチミンバルジ」とは、二本鎖を形成しているDNAにおいて、一方に対して、他方がシトシン又はチミンが余剰となり塩基対を形成しない領域のことをいう。よって、かかるシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列(ヘアピン配列ともいう)とは、該ヘアピン配列の5’末端と3’末端の末端塩基同士から順に、自己配列内におけるハイブリダイズによって二本鎖を形成してヘアピン構造を形成しながら、かつ、該二本鎖の途中においてシトシンバルジ又はチミンバルジを有する二本鎖(デュプレックス)が形成され得るような配列を有するものであればよい。具体的には、例えば、一本鎖DNAの両末端同士がハイブリダイズしてシトシンバルジ又はチミンバルジを有する二本鎖を形成し、シトシンバルジ又はチミンバルジの領域よりも中央に存在するDNAは一本鎖のまま存在しているものが挙げられる。

0020

本発明で用いられる核酸プローブは、その骨格に、前記評価対象核酸そのもの又はそのアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有する部分を含む。より詳しくは、評価対象核酸の種類に応じて、野生型(正常型)の評価対象核酸及びそのアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有する部分、変異型の評価対象核酸及びそのアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有する部分を含むものが含まれる。さらに、評価対象核酸の一塩基多型の種類に応じて、一塩基多型の存在位置に野生型ヌクレオチドを含むもの、一塩基多型の存在位置に変異型ヌクレオチドを含むものが含まれる。なお、「アンチセンス鎖」とは、特定の塩基配列(以下、センス鎖という)に対し相補的な塩基配列を有し、かつセンス鎖にハイブリダイズし得るヌクレオチドをいう。

0021

次いで、本発明における核酸プローブは、前記評価対象核酸又はそのアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有するものに、さらにその5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されている(図1参照)。本明細書において、前記付加された配列を「タグ構造」と記載することもある。なお、核酸プローブにおける塩基配列は、特に限定なく、チオホスファイト法、フォスフォアミダイト法等の公知の方法に従って、所望の配列を有するものに調製することができ、例えば、評価対象核酸そのもの又はそのアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列に、自己配列内において該配列の5’末端と3’末端の末端塩基同士から順にハイブリダイズによって二本鎖を形成してヘアピン構造を形成しながら、かつ、該二本鎖の途中においてシトシンバルジ又はチミンバルジを有する二本鎖(デュプレックス)を形成し得るタグ構造の塩基配列、を付加した塩基配列を設計して調製することができる。タグ構造の塩基配列としては、前記ヘアピン構造を形成するのであれば特に限定されず、例えば、
5' -ATCATGCTTTTGCCATGAT - 3'(配列番号1)
に示すような配列が挙げられる。かかる配列において、例えば、5’末端から5番目のTに後述の2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化され、3’末端から6番目のCがバルジ構造を形成する。

0022

本発明におけるタグ構造は、シトシンバルジ又はチミンバルジを含むヘアピン構造を呈するが、該シトシンバルジ又はチミンバルジには、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されている。なお、本明細書において、シトシンバルジ又はチミンバルジへの化合物の固定化とは、該バルジにおいて塩基対を形成しないシトシン又はチミンに結合して固定化される態様、該バルジに隣接する塩基と結合してバルジ領域に固定化される態様、及び、両方に結合して固定化される態様のいずれをも含む。

0023

本発明における2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物としては、式(I):

0024

0025

(式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、第1級アミン残基、第2級アミン残基、又は第3級アミン残基を示す)
で表される化合物が挙げられる。

0026

前記第1級アミン残基としては、−NH2基が挙げられる。また、前記第2級アミン残基としては、例えば、−NH(CH2)3NH2基、−NH(CH2)4NH2基、−NH(CH2)2NH2基、−NH(CH2)2NH(CH3)基等が挙げられる。さらに、前記第3級アミン残基としては、例えば、−N(CH3)(CH2)2NH2基等が挙げられる。本発明においては、シトシンバルジ又はチミンバルジとの水素結合形成の観点から、第2級アミン残基が好ましく、R1及びR2のいずれもが第2級アミン残基であることがより好ましい。

0027

前記2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物としては、具体的には、例えば、下記式(II):

0028

0029

で表されるN,N’−ビス−3−アミノプロピル−2,7−ジアミノ−1,8−ナフチリジン(以下、DANPと記載することもある)が挙げられる。

0030

N,N’−ビス−3−アミノプロピル−2,7−ジアミノ−1,8−ナフチリジン(DANP)は、ナフチリジン環のN1、N8位の窒素側にドナーアクセプター、アクセプター、ドナーの順で水素結合があるので、二本鎖DNA、好ましくはシトシンバルジ又はチミンバルジと1:1の量論比で安定な複合体を形成する。

0031

また、DANPは、例えば、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中の紫外可視吸収スペクトルの測定において〔図2(a)参照〕、単独では364nmに吸収極大を示すが、例えば、シトシンバルジDNAと結合すると吸光度が減少し、かつ、吸収極大が30nm長波長側の394nmに、チミンバルジDNAと結合すると同じく吸収極大が390nmにシフトするという特性を有する。さらに、DANP単独の吸収極大に相当する波長364nmで励起した蛍光スペクトルの測定では〔図2(b)参照〕、単独では394nmに最大発光を示すが、例えば、シトシンバルジDNAと結合すると424nm付近幅広発光が観察され、チミンバルジDNAと結合するとシトシンバルジDNA結合時と同様の波長に幅広い発光が弱い強度ながらも確認される。このようにDANP−シトシンバルジ結合、DANP−チミンバルジ結合が示す特徴的な発光により、DANP単独、DANP−シトシンバルジ結合、DANP−チミンバルジ結合のそれぞれが識別できる。なお、ここでのシトシンバルジ又はチミンバルジ結合時の光特性は、シトシンバルジDNA又はチミンバルジDNAの隣接に位置する塩基の種類に限定されるものではないが、吸収極大の波長は2〜3nm程度変動する場合もある。

0032

DANPは、特開2004−262827号公報に記載の方法により合成したものを用いてもよい。

0033

なお、本発明においては、前記DANPと同等の性質、即ち、例えば、蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を示すものであれば、前記DANPの誘導体化合物を用いることができる。かかる誘導体化合物の例としては、下記式(III):

0034

0035

〔式中、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、l、m、及びnは、それぞれ独立して1〜6の自然数を示す〕
で表される化合物、下記式(IV):

0036

0037

〔式中、R5及びR6は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、o及びpは、それぞれ独立して1〜6の自然数を示す〕
で表される化合物等が挙げられる。

0038

式(III)に示される化合物において、前記R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を十分に発揮させる観点から、好ましくは、一方がアミノ基であることが望ましい。また、前記l、m、及びnは、それぞれ独立して1〜6の自然数である。蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を十分に発揮させる観点から、前記lが、好ましくは2以上、より好ましくは3以上であり、好ましくは6以下、より好ましくは5以下、さらに好ましくは4以下であり、具体的には、好ましくは2〜6、より好ましくは3〜5、さらに好ましくは3〜4である。また、前記と同様の観点から、前記mが、好ましくは2以上、より好ましくは3以上であり、好ましくは6以下、より好ましくは5以下、さらに好ましくは4以下であり、具体的には、好ましくは2〜6、より好ましくは3〜5、さらに好ましくは3〜4である。さらに、前記と同様の観点から、前記nが、好ましくは2以上、より好ましくは3以上であり、好ましくは6以下、より好ましくは5以下、さらに好ましくは4以下であり、具体的には、好ましくは2〜6、より好ましくは3〜5、さらに好ましくは3〜4である。

0039

式(IV)に示される化合物において、前記R5及びR6は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を十分に発揮させる観点から、好ましくは、少なくとも一方がアミノ基であることが望ましい。また、前記o及びpは、それぞれ独立して1〜6の自然数である。蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を十分に発揮させる観点から、前記oが、好ましくは2以上、より好ましくは3以上であり、好ましくは6以下、より好ましくは5以下、さらに好ましくは4以下であり、具体的には、好ましくは2〜6、より好ましくは3〜5、さらに好ましくは3〜4である。また、前記同様の観点から、前記pが、好ましくは2以上、より好ましくは3以上であり、好ましくは6以下、より好ましくは5以下、さらに好ましくは4以下であり、具体的には、好ましくは2〜6、より好ましくは3〜5、さらに好ましくは3〜4である。

0040

また、本発明においては、前記2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物として、下記式(V):

0041

0042

で表されるN,N’−ビス−3−アミノブチル−2,7−ジアミノ−1,8−ナフチリジンも好適に用いられる。

0043

式(V)で表される化合物も、DANPと同様に、二本鎖DNA、好ましくはシトシンバルジ又はチミンバルジと1:1の量論比で安定な複合体を形成する。

0044

式(V)で表される化合物の紫外可視吸収スペクトルは、DANPと同様のスペクトルであり、バルジとの結合による吸収極大波長の変動もDANPと同程度である。

0045

なお、式(V)で表される化合物は、公知の方法に従って合成することができる。

0046

前記2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物をシトシンバルジ又はチミンバルジへ固定化する方法としては、特に限定はなく、DNA上に化合物を修飾する公知の方法、例えば、活性カルボン酸アミンの反応を用いたポストモディフィケーション方法が挙げられる。具体的には、例えば、図3に示すように、標的のDNA及び2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物をそれぞれ合成後、該DNAを2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物の溶液(例えば、アセトニトリル溶液)中に、室温中、好ましくは15〜30℃で、10〜20分間浸漬し、必要により精製することにより、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物をシトシンバルジ又はチミンバルジに水素結合させて固定化することができる。

0047

また、前記タグ構造において、シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置には、グアニン残基が導入されている。即ち、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されたシトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置には、グアニン−シトシン(G−C)塩基対が形成されている。一般に、芳香族分子が二本鎖DNAに挿入されると、該分子電子状態挿入箇所隣接塩基スタッキング相互作用から影響を受けることが知られている。よって、これにより、前記2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物がシトシンバルジ又はチミンバルジに結合した際に生じる蛍光を消光することが可能となる。本発明においては、グアニン残基による消光効果を確実なものとする観点から、シトシンバルジ又はチミンバルジのグアニン−シトシン(G−C)塩基対が形成される側とは反対側の隣接塩基と該バルジのシトシン又はチミンとによって、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されることが好ましい。

0048

例えば、シトシンバルジDNAにDANPを結合させた一本鎖DNAの場合(ssDNA)、前記シトシンバルジDNA−DANPを有する塩基配列とバルジ領域以外は相補的で、かつ、バルジ隣接位置にグアニン残基が導入された塩基配列によるデュプレックスの場合(C−bulge)、前記シトシンバルジDNA−DANPを有する塩基配列と完全相補な塩基配列によるデュプレックスの場合(full−match)について、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中の紫外可視吸収スペクトルの測定において〔図4(a)参照〕、それぞれの吸収極大が、DANP単独で364nm、ssDNAとfull−matchがいずれも380nmであるのに対し、C−bulgeは400nmであることが分かる。また、DANP単独の吸収極大に相当する波長364nmで励起した蛍光スペクトルの測定では〔図4(b)参照〕、DANP単独で極大発光が393nm、強度が58であるの対し、ssDNA、full−match、C−bulgeはいずれも極大発光が410nmであるが、各強度は16、20、6とC−bulgeが最も弱く、DANP単独の10分の1程度であることが分かる。このように、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物をシトシンバルジ又はチミンバルジバルジに固定化した際に、その隣接位置にグアニン残基を導入することにより、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物の発光が消光される。

0049

前記核酸プローブの長さは、バルジDNAについて、十分な安定性及び高い配列特異性を十分に発揮させる観点から、好ましくは15ヌクレオチド残基以上、より好ましくは20ヌクレオチド残基以上であり、好ましくは45ヌクレオチド残基以下、より好ましくは40ヌクレオチド残基以下である。

0050

本発明の一塩基多型の検出方法では、前記した光特性を有する(A)核酸プローブと(B)評価対象核酸とを混合してハイブリダイズさせて、PCRの進行に伴うシトシンバルジ又はチミンバルジが消失することによる2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルを検出する。即ち、本発明の検出方法では、図5に示すように、調製された(A)核酸プローブと(B)評価対象核酸を混合してハイブリダイズが進行することにより〔図5(1)参照〕、(A)核酸プローブのヘアピン構造が開かれてシトシンバルジ又はチミンバルジのバルジ構造が消失し〔図5(2)参照〕、バルジ構造に結合していた2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が二本鎖外に存在することになるので〔図5(3)参照〕、該2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物の蛍光強度を測定する〔図5(4)参照〕。

0051

(A)核酸プローブと(B)評価対象核酸との混合は、そのモル比〔(A)/(B)〕が1/1程度となるよう行なわれれば、二本鎖形成を十分に行ない、十分な蛍光強度を得られることから好ましいが、評価対象核酸の種類や量によって、一概に決定されない。

0052

混合の際のpH条件は、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物のシグナル、バルジへの該化合物の結合に基づく吸収極大波長のシフト、蛍光強度等の検出を効率よく行なう観点、ならびに、核酸の安定性の観点から、好ましくは5以上、より好ましくは6以上、さらに好ましくは6.5以上であり、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物のバルジ構造からの遊離を十分に行なう観点及び十分な蛍光強度を発揮させる観点から、好ましくは9以下、より好ましくは8以下、さらに好ましくは7.5以下である。

0053

前記混合の際には、例えば、リン酸緩衝液トリス塩酸緩衝液等が用いられうる。

0054

本明細書において、ハイブリダイズとは、ある配列を有する核酸分子と、その核酸分子の少なくとも一部分に対し相補的な核酸分子が互いに相補的な塩基配列に基づき水素結合を介して会合することを意味する。本発明におけるハイブリダイズは、例えば、1mM〜1M、好ましくは10〜100mMの塩化ナトリウムを含むpH5〜8、好ましくはpH6〜7の緩衝溶液、好ましくはリン酸緩衝液中で行うことが望ましい。なお、ハイブリダイズが可能となる条件は、公知技術に従って、適宜最適化できる。

0055

シトシンバルジ又はチミンバルジが消失することによる2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルとしては、蛍光シグナルが好ましい。蛍光シグナルは、遊離の2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物と、シトシンバルジ又はチミンバルジに結合し更に隣接塩基のグアニンによって消光された時の2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物とに由来する蛍光強度の差を十分に大きくする観点から、シトシンバルジ及びチミンバルジのいずれもの場合にも、好ましくは400〜480nm、より好ましくは450nm付近における蛍光強度である。なお、励起波長は2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物の種類に基づいて、適宜、調整できる。

0056

かくして、本発明により、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物を用いることにより、蛍光物質等の標識物質別途添加することなく、一塩基多型を検出することができるという優れた効果が奏される。そのため、本発明の検出方法では、伸長反応増幅反応酵素反応(例えば、前記伸長反応、増幅反応、ミスマッチ核酸分解反応等)条件の検討、電気泳動条件の検討、標識物質による標識等の複雑な工程を行なうことなく、簡便に、一塩基多型を検出することができる。さらに、前記2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物は、PCR反応前は隣接位にグアニン残基を有するシトシンバルジ又はチミンバルジに結合して消光されるため、バックグラウンドシグナルベルを低減させ、高感度での一塩基多型の検出が可能になる。

0057

本発明の検出方法の別の態様としては、
1)一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
2)一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
3)前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、及び
4)前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
のそれぞれをハイブリダイズさせた際の2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルに基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する。

0058

具体的には、例えば、評価対象核酸の一塩基多型の存在位置において、本願発明における核酸プローブとのハイブリダイズが行なわれた場合のみ、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づく強い強度の蛍光が発光され、それ以外は2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物がプローブ内のシトシンバルジ又はチミンバルジと結合して該蛍光が消光されているため、該プローブにおける一塩基多型の存在部位の塩基対の種類から、より高感度に一塩基多型の評価を行なうことができる。

0059

また、本発明では、本発明の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキットを提供する。本発明のキットは、前記核酸プローブを含有することを特徴とし、本発明の検出方法を効率よく簡便に低コストで行なうことができ、核酸中の一塩基多型を、低コストで、簡便な操作により、効率よく、高感度で検出することができるという優れた効果を発揮する。

0060

具体的には、
i’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び
ii’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
及び
i’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び
ii’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の5’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの5’若しくは3’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
を含有する。

0061

本発明のキットには、前記核酸プローブを安定的に保持するための試薬、例えば、緩衝液等を適宜含有していてもよい。

0062

また、本発明のキットの提供形態は、適切な核酸プローブ、必要な試薬等、本発明の検出方法を行なうに適した試薬全てを、本発明の検出方法を行なうに適した容量及び/又は形態で含有した1つの容器として提供される形態であってもよく、核酸プローブ、試薬等をそれぞれ別の容器により提供される形態であってもよい。また、かかるキットには、キットに含まれる成分を用いて、本発明の検出方法を行なうための手順等を記載した説明書が含有されていてもよい。

0063

以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。

0064

試験例1
シトシンバルジ、チミンバルジ、グアニンバルジ、又はアデニンバルジを有する塩基配列にDANPを結合させた塩基配列の蛍光強度を測定した。

0065

配列番号2で示される10merの鋳型核酸(xcD1)の合成をNHS−Carboxy−dTアミイト(Glen research社製)を用いて、DNA自動合成機(Applied Biocyctems社製)で所望の配列のものを合成した。なお、アデニンアミンダイトとグアニンアミンダイトは、脱保護が容易であるため、パック(pac)を保護されたものを使用した。DNA自動合成機上では切り出し・脱保護を行わず、CPG樹脂にDNAが結合している段階でCPGビーズを含むカラムを取り出した。このカラムの両端にシリンジを1本ずつ繋ぎ、前記DANP溶液1mLをシリンジ2本中で反復移動し、そのまま20分程度反応させた。その後、真空ポンプで乾燥し、エッペンドルフ(登録商標)チューブにビーズを移し、これに1mLの28%アンモニア水によって処理し、3時間室温で放置することにより、切り出し・脱保護を行った。その後は、CPGビーズを濾過で取り除き、スピードバックによって濃縮し、HPLC精製を行って、DANPが5’末端から5塩基目に位置するTの5位に結合したプローブxcD1(配列番号2)〕を調製した。なお、得られたプローブの確認は、MALDI TOF/MSを用いて行なった。次に、配列番号3〜6で示されるシトシンバルジ、チミンバルジ、グアニンバルジ、又はアデニンバルジを形成し得る塩基配列を同様に合成した。
(template) xcD1: 5' -TCCATGCAAC- 3'(配列番号2)
(C bulge) cD1-1: 5' -GTTGCCATGGA- 3'(配列番号3)
(A bulge) cD1-3: 5' -GTTGACATGGA- 3'(配列番号4)
(G bulge) cD1-4: 5' -GTTGGCATGGA- 3'(配列番号5)
(T bulge) cD1-5: 5' -GTTGTCATGGA- 3'(配列番号6)

0066

得られたバルジを形成し得る核酸(配列番号3〜6)と鋳型核酸(配列番号2)とをエッペンチューブ内でハイブリダイズさせた後、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中に4.5μMとなる溶液を調製し、波長380nmで励起した蛍光スペクトルを測定した。結果を図6に示す。

0067

図6より、シトシンバルジの蛍光強度が一番弱く、次はチミンバルジ、グアニンバルジであり、アデニンバルジが最も強いことが分かる。

0068

核酸プローブの調製例1
特開2004−262827号公報に記載の方法により、アミノ基をBoc保護したN,N’−ビス−3−アミノプロピル−2,7−ジアミノ−1,8−ナフチリジンを合成した後、4N HCl溶液を用い、脱保護してDANP塩酸塩を得た。得られたDANP塩酸塩は、ジメチルスルホキシドに溶解後、N,N−ジイソプロピルエチルアミンを用いて中和し、DANPの溶液を調製した(濃度0.1M)。

0069

次に、pUC18(464位にグアニンのSNPを有する)をテンプレートにしてPCRを行うために、試験例1と同様にして、DNA自動合成機を使ってDANPがプローブの5’末端から5塩基目にあるTの5位に結合したシトシンバルジ構造を形成し得るプローブ〔primer 1(配列番号7)〕を調製した。なお、プローブの濃度の確認は酵素分解を用いて行った。
(primer 1): 5' -ATCATGCTTTTGCCATGATCAGGAAACAGCTATGAC- 3'(配列番号7)

0070

PCRの試験例1
得られた核酸プローブ(5’末端にシトシンバルジ構造を含んだへアピンタグを持つプライマー)(primer 1)を用いて、PCRを行った。具体的には、pUC18をテンプレートとして、Qiagen社のTaq PCR Master Mix、へアピンタグを持つセンスプライマー(primer 1)とへアピンタグを持たないアンチセンスプライマー〔M13M3(配列番号8)〕をそれぞれ最終濃度0.5μM、pUC18を加えPCR溶液を調製した。このPCR溶液を95℃ 1分加熱後、1サイクル95℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒の反応を40サイクル行った。途中5回毎にサンプルを採取し、蛍光強度(励起波長355nm、発光波長450nm)を測定した。その結果、PCRの進行に伴い、蛍光強度の増大が観測された(図7)。
(primer 1): 5' -ATCATGCTTTTGCCATGATCAGGAAACAGCTATGAC- 3'(配列番号7)
(M13M3): 5' -GTTGTAAAACGACGGCCAGT- 3'(配列番号8)

0071

PCRの試験例2
PCRの試験例1とテンプレートの量だけ変えてPCRを行い、5回毎の蛍光強度(励起波長355nm、発光波長450nm)をPCR回数に対してプロットしたグラフ図8である。この図8の蛍光強度380の時のテンプレート量を縦軸にとり、横軸PCRサイクルをプロットしたものが図9となる。

0072

図8より、テンプレート濃度のみが違う溶液を調製しPCRを行うと、テンプレートの濃度を反映した蛍光強度変化のプロファイルが観測されたことが分かる。また、図9より、図8の蛍光強度380の時のテンプレート量とPCRサイクルをプロットした結果、ほぼ直線のグラフが得られたことから、これは少なくとも使ったテンプレートの濃度範囲内では定量ができる事が示唆される。

0073

PCRの試験例3
PCRの試験例1において、テンプレートのSNPサイトがグアニンからチミンに変異したテンプレートを用いて試験例1と同様にしてPCRを行った。5回毎の蛍光強度(励起波長355nm、発光波長450nm)をPCR回数に対してプロットしたグラフが図10である。図10より、明らかにテンプレートがプライマーの3’末端とマッチの時と比べて蛍光強度の増大が小さく、このプライマーでSNP検出が可能である事が示唆される。

0074

PCRの試験例4
N,N’−ビス−3−アミノブチル−2,7−ジアミノ−1,8−ナフチリジン(式(V)で表される化合物)をDANPの合成方法を参照にして合成したものを用いて、DNA自動合成機を使って、核酸プローブの調製例1における配列番号7にて示される塩基配列において、DANPが結合したのと同じ位置に、式(V)で表される化合物を結合させた核酸プローブを調製した。次いで、PCRの試験例1と同様にして、PCR反応を行って蛍光強度を測定した。なお、PCRの試験例1におけるDANPの40サイクル後の蛍光強度増加量を100%とした場合の、相対蛍光強度を算出して示した(図11)。

実施例

0075

図11より、式(V)で表される化合物についても、PCRの進行に伴って蛍光強度の増大が観測され、DANPよりも蛍光強度の増大程度が大きいものであった(130〜140%程度)。

0076

本発明の検出方法によれば、核酸中の一塩基多型を、簡便な操作で、低コストで、高感度に検出することができる。また、一塩基多型に限らず他の遺伝子の検出ができる可能性が高い。従って、安価で、簡便で高感度な遺伝子診断遺伝子解析等が可能になる。

0077

配列表の配列番号1は、合成DNA(核酸プローブのタグ構造)の塩基配列である。
配列表の配列番号2は、合成DNA(鋳型配列)の塩基配列である。
配列表の配列番号3は、合成DNA(シトシンバルジ)の塩基配列である。
配列表の配列番号4は、合成DNA(チミンバルジ)の塩基配列である。
配列表の配列番号5は、合成DNA(グアニンバルジ)の塩基配列である。
配列表の配列番号6は、合成DNA(アデニンバルジ)の塩基配列である。
配列表の配列番号7は、合成DNA(primer 1)の塩基配列である。
配列表の配列番号8は、合成DNA(M13M3)の塩基配列である。

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