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技術 白血球または単核球の分離方法、分離材

出願人 株式会社カネカ
発明者 佐藤伸彦塚本彩子
出願日 2011年11月24日 (7年11ヶ月経過) 出願番号 2012-545792
公開日 2014年5月19日 (5年6ヶ月経過) 公開番号 WO2012-070622
状態 特許登録済
技術分野 微生物・酵素関連装置 微生物、その培養処理 動物,微生物物質含有医薬 不織物
主要キーワード 回収ポート クロスフロータイプ 洗浄液バッグ 被覆ステンレス鋼 滅菌耐性 洗浄量 捕捉状態 剥離溶液
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重要な関連分野

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図面 (10)

課題・解決手段

本発明の課題は、各血球成分を含む体液から効率的に白血球または単核球を分離する分離システム及び分離材を提供することである。平均繊維径が2.0μm以上6.0μm以下であって、通気度係数Mが6.2以上35以下である分離材に各血球成分を含む体液を接触させ、白血球を分離材に捕捉し、剥離溶液を用いて捕捉された白血球または単核球を回収することにより効率的に白血球または単核球を分離することができる。

概要

背景

近年、血液学や科学テクノロジー急速な進歩に伴い、全血骨髄臍帯血組織抽出物をはじめとする体液から必要な血液分画のみを分離して患者投与することで治療効果を高め、さらに、治療に必要のない分画は投与しないことで副作用を抑制する、という治療スタイルが広く普及している。

例えば、血液輸血もその1つである。赤血球製剤は、出血および赤血球が不足する場合、または赤血球の機能低下により酸素欠乏している場合に使用される血液製剤である。赤血球製剤には、異常な免疫反応移植片対宿主病(GVHD)などの副作用を誘導する白血球は不要であり、フィルターで白血球を除去する必要がある。場合によっては白血球に加えて血小板も除去することもある。

一方、血小板製剤は、血液凝固因子の欠乏による出血ないし出血傾向にある患者に使用される血液製剤である。血小板製剤の製造のためには、遠心分離により、血小板以外の不要な細胞や成分は除去され、必要とされる血小板成分のみが採取されている。

加えて近年、白血病固形癌治療に向けた造血幹細胞移植が盛んに行われるようになり、治療に必要な、造血幹細胞を含む白血球群を分離し投与する方法がとられている。この造血幹細胞のソースとして、ドナーの負担が少ない、増殖能力が優れている、等の利点から、骨髄や末梢血に加えて臍帯血も注目を浴びている。また近年、月経血中にも幹細胞豊富に存在することが示唆され、これまで廃棄されていた月経血も貴重な幹細胞ソースとして利用される可能性がある。

骨髄や末梢血に関して、不要な細胞を除き白血球を分離・純化して投与することが望まれている一方で、臍帯血についても血縁者のためのバンキングが盛んになり、使用時まで凍結保存する必要性から、凍結保存による赤血球溶血を防ぐことを目的に白血球は分離・純化されている。

白血球の分離方法としては、フィコールを用いた比重液による遠心分離法赤血球沈降剤であるヒドロキシエチルスターチを用いた遠心分離法が提案されているが、閉鎖系での処理が不可能であり異物や菌が混入すること、処理するのに長時間を要するなどの問題を有している。

遠心分離法を用いない細胞分離方法として、最近では、赤血球と血小板は捕捉されず白血球のみを捕捉するフィルター材料を用いて白血球を回収する方法(特許文献1、特許文献2)も報告されている。しかしながら、従来、フィルターに白血球を捕捉させるためには繊維径が3μm未満である必要があると報告されており(非特許文献1)、各文献の報告においても使用されている分離材の繊維径は2.5μm未満である(特許文献1、特許文献2、特許文献3)。これは、従来の白血球除去フィルターが白血球を極限まで取り除くことを目的としているためであり、白血球の捕捉率が高い一方で、体液処理時に詰まりやすく、回収操作時に圧上昇を引き起こして細胞回収率の低下や手技的な問題を誘発するなどの問題があった。

従って、白血球を回収するためのフィルターとしては、従来の白血球除去フィルターを転用しても十分な機能を果たすことはできなかった。

概要

本発明の課題は、各血球成分を含む体液から効率的に白血球または単核球を分離する分離システム及び分離材を提供することである。平均繊維径が2.0μm以上6.0μm以下であって、通気度係数Mが6.2以上35以下である分離材に各血球成分を含む体液を接触させ、白血球を分離材に捕捉し、剥離溶液を用いて捕捉された白血球または単核球を回収することにより効率的に白血球または単核球を分離することができる。

目的

骨髄や末梢血に関して、不要な細胞を除き白血球を分離・純化して投与することが望まれている

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
3件

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請求項1

平均繊維径が2.0μm以上6.0μm以下であり、かつ、通気度係数Mが6.2以上35以下である不織布からなることを特徴とする、体液から白血球または単核球を分離するための分離材

請求項2

不織布が、ポリオレフィンポリアミド、およびポリエステルからなる群から選択される少なくとも1つからなる、請求項1に記載の分離材。

請求項3

体液が、末梢血臍帯血骨髄月経血、および組織抽出物からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項1または2に記載の分離材。

請求項4

請求項1〜3のいずれかに記載の分離材を、体液の入口と出口を有する容器充填して得られる細胞分離用容器。

請求項5

分離材が、体液の流れる方向に1枚または複数枚積層して充填されていることを特徴とする、請求項4に記載の細胞分離用容器。

請求項6

分離材が、体液の流れる方向に圧縮された状態で充填されていることを特徴とする、請求項4または5に記載の細胞分離用容器。

請求項7

カラムタイプであることを特徴とする、請求項4〜6のいずれかに記載の細胞分離用容器。

請求項8

請求項1〜3のいずれかに記載の分離材に体液を接触させて白血球または単核球を分離する工程を含む、細胞分離方法

請求項9

請求項4〜7のいずれかに記載の細胞分離用容器に体液を接触させて白血球または単核球を分離材に捕捉させる第一の工程、および、剥離溶液を用いて、捕捉した白血球または単核球を分離材から回収する第二の工程からなる、細胞分離方法。

請求項10

第二の工程が、細胞分離用容器の出口から剥離溶液を導入し、入口から白血球または単核球を回収する工程である、請求項9に記載の細胞分離方法。

請求項11

さらに、第一の工程の後であって第二の工程の前に、入口から生理食塩水または緩衝液を導入することにより、細胞分離用容器内の夾雑成分を除去する工程を含む、請求項9または10に記載の細胞分離方法。

請求項12

さらに、第一の工程の前に、分離材を生理食塩水または緩衝液と接触させる工程を含む、請求項9〜11のいずれかに記載の細胞分離方法。

請求項13

さらに、第一の工程の前に、細胞分離容器の体液の入口を細胞分離容器の体液の出口より低い高さに固定する工程を含む、請求項9〜12のいずれかに記載の細胞分離方法。

請求項14

白血球と血小板が実質的に分離材に捕捉され、赤血球が実質的に捕捉されないことを特徴とする、請求項8〜13のいずれかに記載の細胞分離方法。

請求項15

分離された白血球または単核球が、造血幹細胞および/または間葉系幹細胞を含むことを特徴とする、請求項8〜14のいずれかに記載の細胞分離方法。

請求項16

請求項8〜15のいずれかに記載の細胞分離方法に、さらに、液体窒素環境下にする工程を含むことを特徴とする、細胞凍結保存方法

請求項17

液体窒素環境下が−196℃から−30℃であることを特徴とする請求項16に記載の凍結保存方法。

請求項18

ジメチルスルホキシドデキストランアルブミン、およびヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される少なくとも1つの凍結保護剤を使用することを特徴とする請求項16または17に記載の凍結保存方法。

請求項19

凍結保存した幹細胞生存率が80%以上であることを特徴とする請求項16〜18のいずれかに記載の凍結保存方法。

請求項20

請求項8〜15のいずれかに記載の細胞分離方法によって得られた白血球、単核球、または幹細胞。

請求項21

CD34陽性細胞、CD133陽性細胞、CD34陰性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陰性細胞、CD45陰性且つCD44陽性且つCD73陽性且つCD90陽性細胞、CD45陰性且つCD235a陰性且つCD33陰性且つCD7陰性細胞、CD45陽性且つCD133陽性且つCD117陽性細胞、CD45陽性且つCD133陰性且つCD117陽性細胞、CD45陽性且つCD133陽性且つCD164陽性細胞、CD45陽性且つCD133陰性且つCD164陽性細胞、およびCD45陰性且つCD309陽性細胞からなる群から選択されるいずれかの細胞を含む請求項20に記載の幹細胞。

請求項22

CD45陽性且つCD164陽性細胞、またはCD45陽性且つCD117陽性細胞を含む請求項20に記載の白血球。

技術分野

0001

本発明は、各血球成分を含む体液から、白血球または単核球を選択的に回収するための分離材分離方法に関する。

背景技術

0002

近年、血液学や科学テクノロジー急速な進歩に伴い、全血骨髄臍帯血組織抽出物をはじめとする体液から必要な血液分画のみを分離して患者投与することで治療効果を高め、さらに、治療に必要のない分画は投与しないことで副作用を抑制する、という治療スタイルが広く普及している。

0003

例えば、血液輸血もその1つである。赤血球製剤は、出血および赤血球が不足する場合、または赤血球の機能低下により酸素欠乏している場合に使用される血液製剤である。赤血球製剤には、異常な免疫反応移植片対宿主病(GVHD)などの副作用を誘導する白血球は不要であり、フィルターで白血球を除去する必要がある。場合によっては白血球に加えて血小板も除去することもある。

0004

一方、血小板製剤は、血液凝固因子の欠乏による出血ないし出血傾向にある患者に使用される血液製剤である。血小板製剤の製造のためには、遠心分離により、血小板以外の不要な細胞や成分は除去され、必要とされる血小板成分のみが採取されている。

0005

加えて近年、白血病固形癌治療に向けた造血幹細胞移植が盛んに行われるようになり、治療に必要な、造血幹細胞を含む白血球群を分離し投与する方法がとられている。この造血幹細胞のソースとして、ドナーの負担が少ない、増殖能力が優れている、等の利点から、骨髄や末梢血に加えて臍帯血も注目を浴びている。また近年、月経血中にも幹細胞豊富に存在することが示唆され、これまで廃棄されていた月経血も貴重な幹細胞ソースとして利用される可能性がある。

0006

骨髄や末梢血に関して、不要な細胞を除き白血球を分離・純化して投与することが望まれている一方で、臍帯血についても血縁者のためのバンキングが盛んになり、使用時まで凍結保存する必要性から、凍結保存による赤血球溶血を防ぐことを目的に白血球は分離・純化されている。

0007

白血球の分離方法としては、フィコールを用いた比重液による遠心分離法赤血球沈降剤であるヒドロキシエチルスターチを用いた遠心分離法が提案されているが、閉鎖系での処理が不可能であり異物や菌が混入すること、処理するのに長時間を要するなどの問題を有している。

0008

遠心分離法を用いない細胞分離方法として、最近では、赤血球と血小板は捕捉されず白血球のみを捕捉するフィルター材料を用いて白血球を回収する方法(特許文献1、特許文献2)も報告されている。しかしながら、従来、フィルターに白血球を捕捉させるためには繊維径が3μm未満である必要があると報告されており(非特許文献1)、各文献の報告においても使用されている分離材の繊維径は2.5μm未満である(特許文献1、特許文献2、特許文献3)。これは、従来の白血球除去フィルターが白血球を極限まで取り除くことを目的としているためであり、白血球の捕捉率が高い一方で、体液処理時に詰まりやすく、回収操作時に圧上昇を引き起こして細胞回収率の低下や手技的な問題を誘発するなどの問題があった。

0009

従って、白血球を回収するためのフィルターとしては、従来の白血球除去フィルターを転用しても十分な機能を果たすことはできなかった。

0010

特表2001−518792号公報
国際公開第98/32840号公報
特開平10−313855号公報

先行技術

0011

繊維学会誌Vol.61、No.8 p.P215−216(2005)

発明が解決しようとする課題

0012

本発明の目的は、各血球成分を含む体液から、圧上昇を回避しつつ、白血球または単核球を高い効率で回収するための高効率な分離材を提供すること、及び当該分離材を用いた細胞分離方法を提供することである。

課題を解決するための手段

0013

本発明者らは、体液から効率的に白血球または単核球を分離でき、かつ、圧上昇を引き起こしにくい分離材や、細胞分離方法に関して鋭意検討を行った。その結果、特定の分離材を用いることにより、高効率に白血球または単核球を分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。

0014

即ち本発明は、平均繊維径が2.0μm以上6.0μm以下であり、かつ、通気度係数Mが6.2以上35以下である不織布からなることを特徴とする、体液から白血球または単核球を分離するための分離材に関する。不織布が、ポリオレフィンポリアミド、およびポリエステルからなる群から選択される少なくとも1つからなることが好ましい。体液が、末梢血、臍帯血、骨髄、月経血、および組織抽出物からなる群から選択される少なくとも1つであることが好ましい。

0015

また、本発明は、上記の分離材を、体液の入口と出口を有する容器充填して得られる細胞分離用容器に関する。細胞分離用容器において、分離材が、体液の流れる方向に1枚または複数枚積層して充填されていることが好ましく、体液の流れる方向に圧縮された状態で充填されていることが好ましい。細胞分離用容器は、カラムタイプであることが好ましい。

0016

また、本発明は、上記の分離材に体液を接触させて白血球または単核球を分離する工程を含む、細胞分離方法に関する。

0017

また、本発明は、上記の細胞分離用容器に体液を接触させて白血球または単核球を分離材に捕捉させる第一の工程、および、剥離溶液を用いて白血球または単核球を分離材から回収する第二の工程からなる、白血球または単核球の細胞分離方法に関する。この細胞分離方法において、第一の工程が上記の細胞分離用容器の入口から体液を導入し、出口から排出する工程であり、第二の工程が細胞分離用容器の出口から剥離溶液を導入し、入口から白血球または単核球を回収する工程であることが好ましい。さらに、第一の工程の後であって第二の工程の前に、入口から生理食塩水または緩衝液を導入することにより、細胞分離用容器内の夾雑成分を除去する工程を含むことが好ましい。さらに、第一の工程の前に、分離材を生理食塩水または緩衝液と接触させる工程を含むことが好ましい。さらに、第一の工程の前に、細胞分離容器の体液の入口を細胞分離容器の体液の出口より低い高さに固定する工程を含むことが好ましい。白血球と血小板が実質的に分離材に捕捉され、赤血球が実質的に捕捉されないことが好ましい。分離された白血球または単核球が、造血幹細胞および/または間葉系幹細胞を含むことが好ましい。

0018

また、本発明は、上記の細胞分離方法によって得られた細胞を液体窒素環境下にすることを特徴とする凍結保存方法に関する。液体窒素環境下は−196℃から−30℃であることが好ましい。この凍結保存方法において、ジメチルスルホキシドデキストランアルブミン、およびヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される少なくとも1つの凍結保護剤を使用することが好ましい。凍結保存した幹細胞の生存率が80%以上であることが好ましい。

0019

また、本発明は、上記の細胞分離方法によって得られた白血球、単核球、または幹細胞に関する。幹細胞は、CD34陽性細胞、CD133陽性細胞、CD34陰性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陰性細胞、CD45陰性且つCD44陽性且つCD73陽性且つCD90陽性細胞、CD45陰性且つCD235a陰性且つCD33陰性且つCD7陰性細胞、CD45陽性且つCD133陽性且つCD117陽性細胞、CD45陽性且つCD133陰性且つCD117陽性細胞、CD45陽性且つCD133陽性且つCD164陽性細胞、CD45陽性且つCD133陰性且つCD164陽性細胞、およびCD45陰性且つCD309陽性細胞からなる群から選択されるいずれかの細胞を含むことが好ましい。白血球は、CD45陽性且つCD164陽性細胞、またはCD45陽性且つCD117陽性細胞を含むことが好ましい。

発明の効果

0020

本発明によれば、全血・骨髄・臍帯血・月経血・組織抽出物をはじめとする体液から、簡便且つ迅速に、目詰まりや圧上昇を起こしにくく効率的に白血球または単核球を分離することができる。

0021

本発明の分離材および細胞分離方法を用いると、従来報告されているよりも目詰まりを起こしにくいうえに、白血球や単核球の回収率が高いという多面的な利点がある。さらに、この技術は、バフィーコート等の前処理をした後に使用することも可能であるが、基本的にはそのような前処理をすること無く、末梢血、臍帯血、骨髄、月経血、組織抽出物から、白血球または単核球を分離することが可能である。

0022

本発明の分離材を容器に充填して得られるフィルターは無菌的な閉鎖系での処理に使用することも可能である。回収された白血球含有液または単核球含有液は造血幹細胞や間葉系幹細胞が豊富に含まれる細胞群であり、白血病治療、心筋再生血管再生などの再生医療のための治療細胞調製用フィルターとして提供することが可能である。

0023

本発明の分離材を使用して得られる白血球は赤血球の混入率が極めて低く、使用時まで凍結保存しても溶血などに起因する影響は非常に少ない。また、白血球は無菌的に分離されていることから、そのまま増幅して細胞を調製することもできる。このため、本発明の分離材は、輸血用製剤調製用途に加えて、再生医療用の細胞ソースを調製するためのフィルターとして非常に有用である。本発明の分離材を使用することにより副作用が少なく安全性の高い治療用細胞の調製が可能となる。

図面の簡単な説明

0024

新鮮ウシ末梢血の白血球回収率の結果
新鮮ヒト末梢血の白血球回収率の結果
新鮮ブタ骨髄の白血球回収率の結果
新鮮ウシ末梢血の白血球回収率の結果
新鮮ヒト末梢血の白血球回収率の結果
新鮮ブタ骨髄の白血球回収率の結果
カラムの模式図
造血系幹細胞から成るコロニー写真
血球成分分離システムの一例
血球成分分離システムの一例(入口が出口より低い場合)

0025

以下に本発明について詳細に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。

0026

本発明は、平均繊維径が2.0μm以上6.0μm以下であり、かつ、通気度係数Mが6.2以上35以下である不織布からなることを特徴とする、体液から白血球または単核球を分離するための分離材に関する。

0027

分離材は、材料と体液の接触時間の観点から繊維状であって容易に作製や入手ができる不織布により構成される。不織布の製造方法としては、大きく分けて湿式と乾式、さらには、レジンボンドサーマルボンドスパンレースニードルパンチステッチボンドスパンボンドメルトブローなどが挙げられるが、これらの製法に限定されることはない。10μm以下の繊維径を持つ不織布の場合、メルトブロー法スパンレース法が好適である。不織布はカレンダー加工プラズマ処理が施されていてもよい。

0028

不織布繊維としては、複合単糸を複数に分割した、いわゆる分割繊維も、好適に使用できる。繊維が複雑に絡み合って血球分離効率がよいからである。

0029

分離材は、容器に入れず使用してもよいし、体液の入口と出口を備えた容器に分離材を入れて使用してもよい。このうち、実用性を考慮すると、容器に入れて使用する後者の態様が好ましい。

0030

不織布を構成する繊維の平均繊維径は、2.0μm以上6.0μm以下であることが好ましく、2.5μm以上5.7μm以下であることがより好ましく、3.5μm以上5.0μm以下であることがさらに好ましい。平均繊維径が2.0μmより小さいと、目詰まりが起こり易くなり回収率が低下する傾向がある。平均繊維径が6.0μmより大きいと、白血球の分離材への捕捉能が低下する傾向がある。

0031

なお、平均繊維径とは繊維軸に対して直角方向の繊維の幅である。繊維径の測定は、不織布からなる分離材を走査型電子顕微鏡にて写真撮影し、写真に記載されたスケールから求めた繊維径の計算値を平均することにより求められる。つまり、測定した繊維径の平均値を意味しており、50個以上、望ましくは100個以上の平均値である。ただし、繊維が多数に重なりあった場合、他繊維が邪魔をしてその幅が測定できない場合、又は、著しく直径の異なる繊維が混在している場合などは、そのデータは除いて繊維径を算出する。

0032

分離材の通気度係数Mは6.2以上35以下であることが好ましく、7.0以上14.2以下であることがより好ましく、9.2以上10.0以下であることがさらに好ましい。通気度係数が6.2より小さいと、細胞が密に分離材に捕捉されるため回収性能が低下する傾向がある。通気度係数が35より大きいと、細胞が分離材に捕捉されにくくなる傾向がある。

0033

なお、通気度係数Mは、分離材の通気度(cc/cm2・sec)と厚み(mm)の積で定義される値であり、分離材の厚みの影響を除いた本質的なパラメーターである。すなわち、通気度は分離材の孔径の大きさに依存するパラメーターであるが、同じ通気度であっても分離材の厚みが小さいほど本質的な通気度はより小さく、同じ厚み相当に換算すると通気度は小さくなる。そこで通気度と厚みを掛け合わせることにより、分離材の本質的な孔径を表すパラメーターとなる。

0034

通気度は例えば、JIS L1096−1999に記載されたフラジール形法に則り、または準拠し、容易に測定することが可能である。また厚みについてもデジタルノギスをはじめ種々の機器で測定することが可能である。ただし、通気度の測定方法はこれらの測定方法に限定されるものではない。

0035

分離材の平均繊維径が2.0μm以上6.0μm以下であり、かつ、分離材の通気度係数Mが6.2以上35以下であると、白血球または単核球を効率良く分離することができる。

0036

分離材に用いられる材料としては、滅菌耐性や細胞への安全性の観点から、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリエステル等が望ましい。ポリオレフィンとしては、ポリプロピレンポリエチレン高密度ポリエチレン低密度ポリエチレン等が挙げられ、ポリアミドとしては、ナイロン等が挙げられ、ポリエステルとしては、ポリエチレンテレフタート、ポリブチレンテレフタレート等が挙げられる。さらに、ポリビニルアルコール塩化ビニリデンレーヨンビニロンアクリルポリメチルメタクリレートポリヒドロキシエチルメタクリレートポリアクリルニトリルポリアクリル酸ポリアクリレート)、ナイロン、ポリイミドアラミド芳香族ポリアミド)、ポリアミド、キュプラカーボンフェノール、ポリエステル、パルプポリウレタンポリスチレンポリカーボネートなどの合成高分子アガロースセルロースセルロースアセテートキトサンキチンなどの天然高分子ガラスなどの無機材料や金属等も用いられるが、なかでも、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリプロピレン、アクリル、ナイロン、ポリウレタン、ガラスが好ましい。また、これらの材料は一種類単独とは限らず、必要に応じて材料を複合・混合・融合して用いてもよい。さらに必要ならば蛋白質ペプチドアミノ酸、糖類など、特定の細胞に親和性を有する分子を材料に固定してもよい。

0037

体液とは、全血、末梢血、骨髄、臍帯血、月経血、組織抽出物、およびそれらの組み合わせを意味し、粗分離したものであっても構わない。また、体液の採取源となる動物種としては、例えば、ヒト、ウシ、マウスラット、ブタ、サルイヌネコなどの哺乳動物が挙げられる。

0038

体液は、前もって抗凝固剤で処理されたものであってもよい。抗凝固剤としては、ACD(acid-citrate-dextrose)液、CPD(citrate-phosphate-dextrose)液、CPDA(citrate-phosphate-dextrose-adenine)液などのクエン酸抗凝固剤、ヘパリン低分子ヘパリン、フサンメチルナファモスタット)、EDTA等の抗凝固剤が挙げられる。各分画の使用目的に影響がなければ、特に体液の保存条件は問わない。

0039

上記の分離材により分離することのできる白血球または単核球としては、具体的には、リンパ球単球、CD3陽性細胞、CD14陽性細胞、CD19陽性細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞が挙げられる。

0040

本発明は、また、上記の分離材を体液の入口と出口を有する容器に充填して得られる細胞分離用容器に関する。

0041

分離材を充填する容器の形態、大きさ、材質は特に限定はない。容器の形態は、球、コンテナカセットバッグチューブ、カラム等、任意の形態であってよい。好ましい具体例としては、例えば、容量約0.1mLから400mL程度、直径約0.1cmから15cm程度の半透明筒状容器が挙げられる。また、一片の長さ0.1cmから20cm程度の長方形または正方形で、厚みが0.1cmから5cm程度の四角柱容器等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

0042

容器の型としては、クロスフロータイプ、カラムタイプ等が挙げられる。クロスフロータイプまたはカラムタイプのどちらでも使用することができ、特に容器のタイプは限定されないが、回収液を均一に導入できるという観点からカラムタイプがより好ましい。従来の有核細胞を捕捉する細胞分離容器においては、効率良く細胞を回収できるという観点からクロスフロータイプが使用されているが、高い粘度の剥離溶液しか使用できないという制限があった。しかし、本発明の分離材をカラムタイプの容器と組み合わせると、低い粘度の剥離溶液でも細胞回収率の低下はなく、高い分離性能が得られる。

0043

カラムタイプとは、例えばフィルター面に対して面の中心付近に液の入口と出口が付いている容器、またはフィルター面に対して垂直に入口部と出口部が位置している容器、またはフィルター面に対して垂直方向に液が流れることを特徴とする容器、または分離材の圧縮方向に対して平行に液が流れることを特徴とするような容器のことをいう。図7にカラムタイプの一例を示した。

0044

一方、クロスフロータイプとは、白血球除去フィルター(旭化成メディカル株式会社製「セパセル」、ポール社製「ピュアセルRC」)に代表されるように、フィルター面に対して液の入口と出口の位置が面の中心から外れており、フィルター面に対して平行に入口部と出口部が位置している容器を差す。ここでフィルター面に対して入口部と出口部が垂直に位置しているとは面から入口と出口の角度(鋭角)が45度以上90度未満であることを指し、フィルター面に対して入口部と出口部が平行に位置しているとは面から入口と出口の角度(鋭角)が0度以上45度未満であることを意味する。

0045

容器は、任意の構造材料を使用して作製することができる。構造材料としては具体的には、非反応性ポリマー生物親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマーポリテトラフルオロエチレンポリクロロトリフルオロエチレンテトラフルオロエチレンヘキサフルオロプロピレンコポリマーポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー;ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。容器の材料として有用な金属材料(生物親和性金属、合金)について、ステンレス鋼チタン白金タンタル、金、およびそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。

0046

これらのうち、滅菌耐性を有する構造材料が好ましく、具体的にはポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。

0047

分離材は、不織布からなる分離材を適当な大きさに切断し、厚み1mmから200mm程度に、体液の流れる方向に、1枚または複数枚積層して使用されることが好ましい。各分画の分離効率の面から、積層の厚みは1.5mmから150mmであることがより好ましく、2mmから100mmであることがさらに好ましい。

0048

分離材を容器に充填する場合には、体液の流れる方向に、1枚または複数枚積層状態で使用することができ、厚みは1mmから50mm程度であることが好ましい。各分画の分離効率の面から1.5mmから40mmであることがより好ましく、2mmから35mmであることがさらに好ましい。

0049

また分離材をロール状に巻いて、容器に充填してもよい。ロール状で使用する場合、該ロールの内側から外側に向けて体液を処理することにより血球を分離してもよいし、或いはその逆に該ロールの外側から内側に向けて体液を処理してもよい。

0050

分離材を容器に充填する際には、体液の流れる方向に圧縮して容器に充填してもよいし、圧縮せずに容器充填してもよい。圧縮の有無は、分離材の材質等に応じて適宜選定することができる。

0051

細胞分離容器において、分離材は適当な大きさに切断した平板状で充填されてもよいし、ロール状に巻いた形状で充填されてもよい。さらには、2種以上併用してもよいし、上述した分離材以外の分離材を併用してもよく、実質的に白血球を捕捉し回収するような分離システムを構成できればよい。実質的に白血球を捕捉するとは、分離材と接触した体液に含まれる白血球のうち60%以上が分離材に捕捉されることを意味する。さらに、細胞分離用容器全体に捕捉される白血球のうち、本発明の分離材が捕捉した白血球が60%以上の割合を占めることが好ましい。

0052

細胞分離容器は、赤血球を実質的に捕捉せず、白血球を実質的に捕捉するという特徴を有する。ここで赤血球を実質的に捕捉しないとは、分離材と接触した体液に含まれる赤血球のうち60%以上が分離材を通過する性質を持つことを意味する。さらに、本発明の分離材は、血小板が実質的に捕捉される材料であってもよいが、これに限定されない。血小板が実質的に捕捉されるとは、分離材と接触した体液に含まれる血小板のうち、50%以上が分離材に捕捉されることを意味する。60%以上が分離材に捕捉されることがより好ましい。

0053

また、本発明は、上述の分離材に体液を接触させて、白血球または単核球を分離する工程を含む、細胞分離方法に関する。さらに、本発明は、上述の細胞分離容器に体液を接触させて白血球または単核球を分離材に捕捉させる第一の工程、および、剥離溶液を用いて、捕捉した白血球または単核球を分離材から回収する第二の工程からなる、細胞分離方法に関する。

0054

具体的には、第一の工程として、分離材が充填された容器に体液を入口側より注入し、白血球または単核球を捕捉させ赤血球は通過させる。次いで第二の工程として、容器の出口方向から、すなわち、体液や洗浄液通液方向とは逆方向から、剥離溶液を流すことにより、分離材に捕捉された白血球または単核球を高収率分離回収することができる。また必ずしも必要ではないが、体液を分離材に接触させ白血球を分離材に捕捉させる工程の後に、洗浄液を同方向より通液することにより容器内に溜まった赤血球を効率的に回収・分離することもできる。

0055

体液の入口と出口を有する細胞分離容器に、体液を流す際は、体液の入口を体液の出口よりも高くなるようにセットし、重力と同方向に体液を流してもよいが、体液の入口を体液の出口よりも低くなるようにセットし、重力と逆方向に体液を流してもよい。重力と逆方向に体液を流すことにより、体液が容器内に均一に流れることから分離効率をさらに向上させることができる。

0056

上記の細胞分離容器を使用して、血球成分分離システムを構成することができる。血球成分分離システムは、細胞分離容器の他に、洗浄溶液や剥離溶液の入口や出口、赤血球回収のバッグ、白血球回収のバッグ等を同時に備えていることが実用的であり好ましい。この場合、細胞分離容器は、体液が流入する入口と流出する出口を有しており、さらに体液の入口や体液の入口とは独立して、容器内に溜まった赤血球を流す洗浄溶液の流入部を有し、さらに体液の出口や体液の出口とは独立して洗浄液の流出部を有し、尚且つ、上記体液及び洗浄液の流出部或いは流出部以外に、独立して、剥離溶液を導入するための入口も備えていることが好ましい。容器に付属する洗浄液の入口や出口は、体液の入口や出口として機能してもよく、入口側の回路に、三方活栓等を介して、血液バッグと洗浄溶液バッグが接続されていてもよい。分離溶液の導入口は体液の出口として機能してもよい。また、剥離溶液の回収側は体液の入口として機能してもよく、同様に三方活栓を介して各バッグやシリンジ等が接続されていてもよい。図9図10に血球成分分離システムの一例を示す。

0057

血球成分分離システムには、さらに、体液の保存バッグ、分離された白血球を回収するための剥離溶液回収バッグ、赤血球回収バッグなどが備え付けられていることが好ましい。これらのバッグが上記記載の各溶液の入口や出口に接続されることで、無菌的な閉鎖系で体液を分離することが可能となる。また各バッグは使用後に切り離して使えることが好ましく、一般的に使用されている血液バッグのような形状をしていてもよいが、平板状のカートリッジ方式等でもよい。各バッグの形態としては、必要に応じて細胞培養可能なバッグ、凍結保存耐性を有するバッグ等を選択してもよい。

0058

本発明の分離方法について具体的に説明する。
1)体液送液工程
分離材を充填した容器の体液入口側より体液を通液する際には、体液を入れた容器から送液回路を通じて自然落下で送液しても、ポンプにより送液してもよい。また、体液を入れたシリンジを直接、容器に接続し、手でシリンジを押してもよい。ポンプにより通液する場合には、送液速度が速過ぎると分離効率が落ち、遅過ぎると処理時間がかかる傾向がある。送液速度としては、例えば0.1mL/minから100mL/minの速度が挙げられるが、これに限定されるものではない。

0059

また体液送液工程の前処理として、生理食塩水や緩衝液で分離材を浸漬させる工程を実施してもよい。この操作は必ずしも必要ではないが、分離材の上記溶液への浸漬が分離効率の向上と血液流路確保に影響すると考えられるため、場合によっては実施してもよい。この前処理溶液は以下の洗浄工程に用いる溶液と同一である必要はないが、同一であれば溶液バッグ共有できるため、回路システム単純化と操作性の観点から同一であることが好ましい。前処理の液量としては、分離材が充填される容器の1倍から100倍程度が実用的であり好ましい。使用できる緩衝液としては、特に限定されないが、リンゲル液、細胞培養に用いる培地リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液が好ましい。

0060

2)洗浄工程
本工程は必ずしも必要ではないが、夾雑物除去効率を高める場合には実施してもよい。この工程により除去できる夾雑物として、赤血球、血漿等の非血球成分が挙げられる。洗浄液の流入側より体液送液工程と同方向より洗浄液を通液する際には、洗浄液は回路を通じて、自然落下で送液しても、ポンプにより送液してもよい。ポンプにより送液する場合の流速は、体液送液工程と同程度であり、0.1mL/minから100mL/minの速度が挙げられるが、これに限定されるものではない。洗浄量は容器の容量によって異なるが、洗浄量が少なすぎると容器に残存する赤血球成分が多くなり、洗浄量が多すぎると分離効率が落ちるとともに多大な時間を要することから、容器の0.5倍から100倍程度の液量で洗浄することが好ましい。

0061

使用できる洗浄液としては、赤血球のみを洗い流すことが可能であり回収される白血球中の他血球の混入を抑制でき、血球の捕捉状態を保持することができれば、どのような溶液を用いても構わないが、生理食塩水、リンゲル液、細胞培養に用いる培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液が好ましい。

0062

3)白血球または単核球の剥離
分離材を充填した容器に体液の通液とは逆方向(体液流出側)より剥離溶液を注入し、白血球を剥離させる。剥離溶液を注入する際には、剥離溶液を予めシリンジ等に入れておき、シリンジのプランジャーを手や機器を用いて勢い良く押し出すことにより実行できる。回収液量や流速は、容器の容量や処理量により異なるが、容器の1倍から100倍程度の液量で、流速0.5mL/secから20mL/secの流速が好ましいが、これらに限定されるものではない。

0063

剥離溶液は低張液であれば特に限定されないが、生理的食塩水、リンゲル液、デキストラン糖注、ヒドロキシエチルスターチなどの注射用剤として使用実績があるものや、緩衝液、細胞培養用培地等が挙げられる。

0064

また捕捉された細胞の回収率を上げるために回収液の粘張度を上げてもよい。そのために上記分離溶液にアルブミン、フィブリノゲングロブリン、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ヒドロキシエチルセルロースコラーゲンヒアルロン酸ゼラチン等を添加できるが、これらに限定されるものではない。剥離溶液の粘度は特に限定されないが、粘度が高すぎると回収操作が行いにくくなる傾向があることから、20mPa・s以下がより好ましい。カラムタイプの容器であれば低粘度の剥離溶液を使用しても分離性能は低下しないことから10mPa・s以下でも使用することができる。更には5mPa・s以下の剥離溶液でも使用することが可能である。

0065

上記の細胞分離方法により回収された白血球には、造血幹細胞、間葉系幹細胞、CD34陽性細胞が含まれることが好ましい。

0066

また、本発明は、上記の細胞分離方法によって得られた細胞を液体窒素環境下にすることを特徴とする凍結保存方法に関する。上記の細胞分離方法は、従来の遠心分離法に比して細胞に与えるストレスが非常に低いため、この細胞分離方法で得られた細胞は、凍結保存後活性が非常に高い。

0067

細胞を凍結保存する際は、凍結時の細胞を保護する目的で、凍結保護剤が添加される。添加される凍結保護剤の種類は特に制限されないが、ジメチルスルホキシド、デキストラン、アルブミン、ヒドロキシエチルスターチ等が使用できる。上記凍結保護剤は単独で使用してもよいが数種を組み合わせて使用してもよい。

0068

凍結保存方法では、細胞は液体窒素環境下で保存されればよく、液体窒素に浸った状態で保存してもよく、また液体窒素の気体下で保存しても構わない。保存時の温度は特に限定されないが、細胞の活性の低下を防ぐために−196℃から−30℃であることが好ましい。−196℃から−50℃であることがより好ましく、−196℃から−70℃であることがさらに好ましい。

0069

本発明は、また、上述の凍結保存方法によって得られた白血球、単核球、幹細胞に関する。上述の凍結保存方法によって得られる幹細胞としては、体液中に含まれる、自己複製能を持ち尚且つ分化能を有する細胞であればどのような幹細胞であっても構わない。具体的には、造血幹細胞、間葉系幹細胞、Embryonic−like Stem Cell、血管内皮前駆細胞、などが挙げられる。

0070

造血幹細胞の例としては、CD34陽性細胞、CD133陽性細胞、CD34陰性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陰性細胞、CD45陽性且つCD133陽性且つCD117陽性細胞、CD45陽性且つCD133陰性且つCD117陽性細胞、CD45陽性且つCD133陽性且つCD164陽性細胞、CD45陽性且つCD133陰性且つCD164陽性細胞が挙げられる。

0071

一般的な造血幹細胞としては、CD34陽性細胞またはCD133陽性細胞が挙げられるが、臍帯血では、造血幹細胞が、CD34陰性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陰性細胞へと分化すると考えられている。本発明の分離材を使用すればこれらの造血幹細胞も分離することができ、また分離後の細胞は凍結しても活性の低下は少ない。また造血幹細胞の中でも特に移植時の生着に関わると言われている、造血増殖因子(Stem Cell Factor)の受容体であるCD117陽性細胞、細胞接着に関わるCD164陽性細胞についても、本発明の分離材で分離後に凍結しても活性の低下は少ない。

0072

また臍帯血中間葉系幹細胞と考えられているCD45陰性且つCD44陽性且つCD73陽性且つCD90陽性細胞も、本発明の分離材で分離後に凍結しても活性の低下は少ない。臍帯血中には間葉系幹細胞は僅かしか存在せず、遠心分離ではロスが大きく分離しにくいという問題があったが、本発明の分離材では効率的に分離することが可能である。

0073

臍帯血中にはLineage Negative Stem Cellという多分化能を有する興味深い幹細胞が存在し、Embryonic−like Stem Cellと呼ばれている。本発明の分離材では、このCD45陰性且つCD235a陰性且つCD33陰性且つCD7陰性細胞を効率的に分離することが可能であり、凍結しても活性の低下は少ない。

0074

血管内皮前駆細胞のCD45陰性且つCD309陽性細胞についても、本発明の分離材で分離後に凍結しても活性の低下は少ない。

0075

また、白血球中のCD45陽性且つCD164陽性細胞、CD45陽性且つCD117陽性細胞についても、本発明の分離材で分離後に凍結しても活性の低下は少ない。

0076

凍結保存後の細胞の生存率は、80%以上であることが好ましく、85%以上であることがより好ましい。

0077

以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例の態様に限定されるものではない。以下の実施例及び比較例に示した不織布は非圧縮時の厚みが全て一定の範囲になるように枚数を調整し、充填している。また実施例および比較例における、分離材を充填した容器は図7に示したようなカラムタイプであり、液の入口と出口はフィルターの面に対して中心に位置しており、フィルター面に対して垂直に液の入口と出口が位置している。

0078

(実施例1)
厚さ6mm直径18mmの、ポリカーボネートからなるカラム状の容器に、ポリブチレンテレフタレート製不織布(平均繊維径2.0μm、通気度係数M=7.0)28枚を、積層状態で、図7に示した態様となるよう充填した。まず生理食塩水45mLを入口側よりシリンジを用いて手押しで通液した。次にCPD抗凝固の新鮮ウシ血液20mL(CPD:血液=200:28で混合した12%CPDを含むウシ末梢血)を2.5mL/minの速度で通液し、次に同方向より生理食塩水10mLを通液した。その後、逆方向から10%FBS添加αMEM培地30mL(粘度2.9mPa・s)をシリンジを用いて手押しで通液することにより白血球を回収した。剥離溶液はスムーズに導入することができた。処理前血液の血算、回収した溶液の血算を血球カウンター(シスメックス社製、K−4500)により測定し、白血球の回収率を算出した。結果は表1、図1、および図4に示した。

0079

(実施例2)
ポリプロピレン製不織布(平均繊維径3.5μm、通気度係数M=9.6)を28枚積層状態で充填したこと以外は実施例1と同様の操作を実施した。結果は表1、図1、および図4に示した。

0080

(実施例3)
ポリブチレンテレフタレート製不織布(平均繊維径2.9μm、通気度係数M=10.0)を28枚積層状態で充填したこと以外は実施例1と同様の操作を実施した。結果は表1、図1、および図4に示した。

0081

(実施例4)
ナイロン製不織布(平均繊維径5.0μm、通気度係数M=9.2)を32枚積層状態で充填したこと以外は実施例1と同様の操作を実施した。結果は表1、図1、および図4に示した。

0082

(比較例1)
ポリブチレンテレフタレート製不織布(平均繊維径1.7μm、通気度係数M=5.9)を84枚積層状態で充填したこと以外は実施例1と同様の操作を実施した。回収操作時に少し抵抗がかかっていたことから、カラム内圧が高く詰まっていることが示唆された。結果は表1、図1、および図4に示した。

0083

(比較例2)
ポリプロピレン製不織布(平均繊維径2.1μm、通気度係数M=6.0)を30枚積層状態で充填したこと以外は実施例1と同様の操作を実施した。結果は表1、図1、および図4に示した。

0084

(比較例3)
ポリプロピレン製不織布(平均繊維径4.9μm、通気度係数M=39.6)を24枚積層状態で充填したこと以外は実施例1と同様の操作を実施した。結果は表1、図1、および図4に示した。

0085

0086

(実施例5)
CPD抗凝固の新鮮ウシ血液20mLの代わりに、CPD抗凝固の新鮮ヒト血液10mLを用いた以外は実施例1と同様の分離材を用い、同様の操作を実施した。さらに、処理前の血液、回収した分離溶液をFACSLysing Solutionで溶血後、フローサイトメーター(BD FACSCanto)により単核球陽性率を求め、白血球数と単核球陽性率を掛けあわせて総単核球数を算出した。回収した溶液中の総単核球数を処理前の総単核球数で割った割合を単核球回収率とした。結果は表2、図2、および図5に示した。

0087

(実施例6)
CPD抗凝固の新鮮ウシ血液20mLの代わりに、CPD抗凝固の新鮮ヒト血液10mLを用いた以外は実施例2と同様の分離材を用い、同様の操作を実施した。結果は表2、図2、および図5に示した。

0088

(実施例7)
CPD抗凝固の新鮮ウシ血液20mLの代わりに、CPD抗凝固の新鮮ヒト血液10mLを用いた以外は実施例3と同様の分離材を用い、同様の操作を実施した。さらに、処理前の血液、回収した分離溶液をFACSLysing Solutionで溶血後、フローサイトメーター(BD FACSCanto)により単核球陽性率を求め、白血球数と単核球陽性率を掛けあわせて総単核球数を算出した。回収した溶液中の総単核球数を処理前の総単核球数で割った割合を単核球回収率とした。結果は表2、図2、および図5に示した。

0089

(実施例8)
ポリブチレンテレフタレート製不織布(平均繊維径2.9μm、通気度係数M=10.0)の代わりにポリプロピレン製不織布(繊維径5.7μm、通気度係数M=14.2)を40枚積層状態で充填したこと以外は実施例7と同様に操作を実施した。結果は表2、図2、および図5に示した。

0090

(比較例4)
CPD抗凝固の新鮮ウシ血液20mLの代わりに、CPD抗凝固の新鮮ヒト血液10mLを用いた以外は比較例1と同様の分離材を用い、同様の操作を実施した。回収操作時に少し抵抗がかかっていたことから、カラム内圧が高く詰まっていることが示唆された。結果は表2、図2、および図5に示した。

0091

(比較例5)
CPD抗凝固の新鮮ウシ血液20mLの代わりに、CPD抗凝固の新鮮ヒト血液10mLを用いた以外は比較例2と同様の分離材を用い、同様の操作を実施した。結果は表2、図2、および図5に示した。

0092

0093

(実施例9)
CPD抗凝固の新鮮ウシ血液20mLの代わりに、ヘパリン(最終濃度50単位/mL)とCPD(最終濃度12%)で抗凝固した新鮮ブタ骨髄10mLを用いた以外は実施例3と同様の分離材を用い、同様の操作を実施した。結果は表3、図3、および図6に示した。

0094

(実施例10)
ポリブチレンテレフタレート製不織布(平均繊維径5.3μm、通気度係数M=20.0)を24枚積層状態で充填したこと以外は実施例9と同様の操作を実施した。結果は表3、図3、および図6に示した。

0095

(比較例6)
比較例2の分離材を用いた以外は実施例9と同様の操作を実施した。回収操作時にシリンジで押し出すのに非常に抵抗があり、スムーズに押し出すことができなかったことから、カラム内圧が高く詰まっていることが示唆された。結果は表3、図3、および図6に示した。

0096

0097

(実施例11)
実施例3の分離材、12%CPDを含む新鮮ウシ血液25mLを用い、10%ACD−A、10%FBS含有αMEM培地30mL(粘度2.9mPa・s)で回収操作を行った。結果は表4に示した。

0098

(実施例12)
10%ACD−A、4%ヒト血清アルブミン含有低分子デキストラン糖注(大塚製薬社製)(粘度7.3mPa・s)を用いること以外は実施例11と同様の分離材、同様の方法で実験を実施した。結果は表4に示した。

0099

(実施例13)
10%ACD−A含有サリンヘス輸液6%(フレゼニウスカービジャパン社製)(粘度2.3mPa・s)を用いること以外は実施例11と同様の分離材、同様の方法で実験を実施した。結果は表4に示した。

0100

(実施例14)
10%ACD−A、4%ヒト血清アルブミン含有サリンヘス輸液6%(フレゼニウスカービジャパン社製)(粘度4.3mPa・s)を用いること以外は実施例11と同様の分離材、同様の方法で実験を実施した。結果は表4に示した。

0101

(実施例15)
10%ACD−A含有20%スクロースを用いること以外は実施例11と同様の分離材、同様の方法で実験を実施した。結果は表4に示した。

0102

(実施例16)
10%ACD−A含有生理食塩水(大塚製薬社製)(粘度1.1mPa・s)を用いること以外は実施例11と同様の分離材、同様の方法で実験を実施した。結果は表4に示した。

0103

0104

実施例11〜16の結果に示されているように、本発明の分離材を用いれば、どのような回収液を用いても、高い回収率で白血球を回収することができる。

0105

(実施例17)
実施例8で回収された細胞を白血球濃度2×106になるように調製し、メチルセルロース培地MethoCult H4034(StemCell Technologies社製)3mLに対して0.3mLを添加した後、混合液1.1mLをペトリディッシュ分注し、37℃、5%CO2下で培養した。14日後に顕微鏡にて観測したところ、赤血球系前駆細胞や白血球前駆細胞等の造血系幹細胞から成る各種コロニーが形成され、回収された細胞がCD34陽性細胞や造血幹細胞を含むことが確認された。造血系幹細胞からなるコロニーの写真を図8に示す。

0106

(実施例18)
実施例9、実施例10で回収された細胞溶液の3mLを10%FBS含有αMEM培地で合計10mLとし、10cmのシャーレ播種し、37℃、5%CO2下で培養した。3日毎に培地交換を行い、9日間培養した結果、シャーレに接着する間葉系幹細胞のコロニーを確認し、回収された細胞が間葉系幹細胞を含むことが確認された。

0107

(実施例19)
厚さ12mm直径44mmの、ポリカーボネートからなるカラム状の容器に、ポリブチレンテレフタレート製不織布(平均繊維径3.5μm、通気度係数M=8.9)112枚を、積層状態で、図7に示した態様となるよう充填した。図10に記載したように入口が出口より低くなるように細胞分離容器をセットした。まず生理食塩水約50mLを体液の入口から出口へ流れるように通液した。次にCPD抗凝固ヒト末梢血80mLを同方向へ通液し、白血球を細胞分離容器に捕捉させた。最後にラインを切り替え、通液とは逆方向つまり体液の出口から入口に流れるように、4%ヒト血清アルブミン含有サリンヘス輸液6%(フレゼニウスカービジャパン社製)(粘度4.3mPa・s)を、シリンジを用いて手押しで導入し、細胞を細胞回収バッグに回収した。結果は表5に示した。

0108

(実施例20)
4%ヒト血清アルブミン含有サリンヘス輸液6%(フレゼニウスカービジャパン社製)(粘度4.3mPa・s)の代わりに生理食塩水(粘度1.1mPa・s)を用いること以外は実施例19と同様の操作を行った。結果は表5に示した。

0109

(実施例21)
CPD抗凝固ヒト末梢血の代わりにCPD抗凝固ヒト臍帯血を用いること以外は実施例19と同様の操作を行った。結果は表5に示した。

0110

(実施例22)
厚さ12mm直径44mmの、ポリカーボネートからなるカラム状の容器に、ポリブチレンテレフタレート製不織布(平均繊維径3.5μm、通気度係数M=8.9)112枚を、積層状態で、図7に示した態様となるよう充填した。図9に示したように入口が出口より高くなるように細胞分離容器をセットした。まず生理食塩水約50mLを体液の入口から出口へ流れるように通液した。次にCPD抗凝固ヒト臍帯血80mLを同方向へ通液し、白血球を細胞分離容器に捕捉させた。最後にラインを切り替え、通液とは逆方向つまり体液の出口から入口に流れるように、4%ヒト血清アルブミン含有サリンヘス輸液6%(フレゼニウスカービジャパン社製)(粘度4.3mPa・s)を、シリンジを用いて手押しで導入し、細胞を細胞回収バッグに回収した。結果は表5に示した。

0111

(実施例23)
CPD抗凝固ヒト末梢血80mLの代わりにCPD抗凝固ウシ末梢血150mLを用いること以外は実施例19と同様の操作を行った。結果は表5に示した。

0112

(実施例24)
CPD抗凝固ヒト臍帯血80mLの代わりにCPD抗凝固ウシ末梢血150mLを用いること以外は実施例22と同様の操作を行った。結果は表5に示した。

0113

0114

以上の結果より、本発明の分離材及び分離方法を用いることにより、圧上昇を引き起こしにくく、尚且つ剥離溶液の種類に依存せず、効率良く白血球または単核球を分離可能であることが分かる。入口が出口より低くなるように細胞分離容器をセットすることにより、白血球回収率をさらに向上させることができる。一方、比較例に示したように、繊維径や通気度係数Mが小さい不織布を使用すると、圧が上昇する傾向があり、総じて白血球回収率が低下する傾向がある。

0115

(実施例25)
実施例21、および実施例22で分離した細胞を凍結保存し、凍結保存後の細胞の活性を評価した。分離した細胞をCryobag(Macopharma社製)に移し4℃に冷やした後、DMSOの最終濃度が10%になるように凍結保護剤としてDMSOとデキストラン40の混合液を添加した。その後プログラムフリーザーで少しずつ段階的に温度を下げ液体窒素タンクの中(マイナス196℃)で、凍結状態で保存した。14日間後、凍結保存した細胞を37℃の温浴中解凍し、デキストランとアルブミンの混合液に移した。その混合液を遠心上清を除いた後、細胞をデキストランとアルブミンの混合液に再度懸濁し、細胞のカウントを行った。分離後回収率として、分離前の細胞数に対する、分離後の処理液中に含まれる細胞数の割合を算出した。また、凍結後回収率として、凍結前の細胞数に対する、凍結後の処理液中に含まれる細胞数の割合を算出した。

0116

実施例21で得られた細胞については、白血球、単核球、CD34陽性細胞、CD133陽性細胞、CD34陰性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陽性細胞、CD45陽性且つCD133陽性且つCD117陽性細胞、CD45陽性且つCD133陰性且つCD164陽性細胞、及びCD45陽性且つCD117陽性細胞について分離後の回収率、凍結保存後の回収率、凍結保存後の生存率を算出した。結果は表6に示した。

0117

0118

実施例22で得られた細胞については、白血球、単核球、CD34陽性細胞、CD133陽性細胞、CD34陰性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陽性細胞、CD34陽性且つCD133陰性細胞、CD45陰性且つCD44陽性且つCD73陽性且つCD90陽性細胞、CD45陰性且つCD235a陰性且つCD33陰性且つCD7陰性細胞、CD45陽性且つCD133陽性且つCD117陽性細胞、CD45陽性且つCD133陰性且つCD117陽性細胞、CD45陽性且つCD133陽性且つCD164陽性細胞、CD45陽性且つCD133陰性且つCD164陽性細胞、CD45陰性CD309陽性細胞、CD45陽性且つCD164陽性細胞、CD45陽性且つCD117陽性細胞について、分離後の回収率、凍結保存後の回収率、凍結保存後の生存率を算出した。結果は表7に示した。

0119

実施例

0120

以上のように、本発明の細胞分離方法は、細胞に与えるストレスが非常に低いため、この細胞分離方法で得られた細胞は、凍結保存後でも、高い活性を維持している。

0121

1体液の入口
2 体液の出口
3分離材
4、5 分離材を圧縮させるためのワッシャー
6容器
7血球分離カラム
チャンバー
血球分離材の充填された容器
10 体液バッグ
11プライミング液バッグ(兼洗浄液バッグ
12赤血球回収バッグ
13白血球回収バッグ(単核球回収バッグ)
14回収ポート
15、16、17三方活栓
18〜24 回路

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