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技術 特定物質の測定方法および特定物質測定用キット

出願人 日東紡績株式会社
発明者 野田健太佐藤善郎小島良
出願日 2011年4月18日 (9年8ヶ月経過) 出願番号 2012-512777
公開日 2013年7月18日 (7年5ヶ月経過) 公開番号 WO2011-136063
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード モデルサンプル 信頼範囲 測定濃度範囲 ブランク吸光度 ブランク試料 コリンキナーゼ シュウ酸カリウム 還元物質
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2013年7月18日)のものです。
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図面 (7)

課題・解決手段

ATPを用いた酵素反応によりADPを発生させる試料中の特定物質測定方法であって、i)試薬成分としてのATP中に不純物として存在するADPに、グルコースADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、ii)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素NAD類を作用させる工程、およびiii)生成するNADH類をピルビン酸乳酸脱水素酵素を作用させNADH類を消去させる工程により試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応;次いで、iv)上記i)からiii)の工程からなるADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程、v)生成するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、vi)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD(P)類を作用させる工程、およびvii)生成するNAD(P)H類を測定する工程により試料中の特定物質を測定する特定物質測定反応からなる特定物質の測定方法により、試料中の広範囲濃度の特定物質を正確に効率的に測定できる。

概要

背景

生体試料中には、試薬ATPを用いた酵素反応によりADPを生成する特定物質、すなわち、ATPよりADPを生成する酵素またはその基質が存在する。そのような特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼクレアチンまたはクレアチンキナーゼコリンまたはコリンキナーゼがある。このような特定物質を測定するため、発生するADPを測定する方法があり、これに関し、種々の方法が開発されてきている(例えば、特許文献1、特許文献2)。
例えば、ADPにホスホエノールピルビン酸ピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸補酵素としてNADH存在下で乳酸脱水素酵素を作用させてNADを生成させ、波長340nmの吸光度をもつNADHの減少量からADPを測定する方法が知られている(非特許文献1)。しかし、この方法は、検体中のADPが多くなるにつれて吸光度が減少する測定方法であるため、測定できるADPの上限値が試薬中のNADHにより制限されたりする場合がある。
また、ADPの測定方法として、試料中のADPにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ等で作用させ、生成する過酸化水素の量からADPを測定する方法が知られている(特許文献3)。しかし、この方法は試料中の尿酸アスコルビン酸等の還元物質や、ビリルビンヘモグロビン等の着色物質の影響を受けやすくそれが測定値に影響を及ぼす場合がある。

さらに、ADPに、マグネシウムイオン存在下でグルコースADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、次いで、生成するグルコース−6−リン酸をNAD(P)存在下でグルコース−6−リン酸脱水素酵素を作用させ、生成するNAD(P)Hの量から、ADPを測定する方法が知られている(特許文献2)。この方法は、NAD(P)Hの生成量に基づいてADPを測定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっているNAD(P)Hを測定することから測定値の信頼性が高く、試料中の還元物質などの影響を受けないという利点を有し、従って、生体試料中のADPを簡便にして高精度で測定することができるとされている(特許文献2)。しかし、特定物質を、試薬ATPを用いた酵素反応によりADPを生成させ、このADPを上記のADP依存性ヘキソキナーゼを用いて測定すると、試薬のATPには、ADPが混在するため、正確な測定ができにくい。また、ATPは水溶液でADPに非酵素的に変換しやすく、測定試薬ロット間で測定値の誤差が生じやすいという問題があった。そこで、そのような問題を解決するため、あらかじめ、キナーゼ等により試薬ATPに混在するADPを除去する方法が知られている(特許文献4)。しかし、この方法は、キナーゼ等の基質も高価であることに加え、試薬の安定性に問題があった。

概要

ATPを用いた酵素反応によりADPを発生させる試料中の特定物質の測定方法であって、i)試薬成分としてのATP中に不純物として存在するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、ii)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD類を作用させる工程、およびiii)生成するNADH類をピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させNADH類を消去させる工程により試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応;次いで、iv)上記i)からiii)の工程からなるADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程、v)生成するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、vi)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD(P)類を作用させる工程、およびvii)生成するNAD(P)H類を測定する工程により試料中の特定物質を測定する特定物質測定反応からなる特定物質の測定方法により、試料中の広範囲濃度の特定物質を正確に効率的に測定できる。

目的

本発明の課題は、ATPを用いる酵素反応によりADPを発生する試料中の特定物質を測定する際、発生するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−6−リン酸を測定することにより、試料中の特定物質を測定する方法において、測定ブランクを減少させ、また、検量線の傾きを小さくすることにより、広範囲のADPの濃度を正確に測定する方法およびそれに使用する安定で安価な特定物質測定用キットを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

ATPを用いた酵素反応によりADPを発生させる試料中の特定物質測定方法であって、i)試薬成分としてのATP中に不純物として存在するADPに、グルコースADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、ii)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素NAD類を作用させる工程、およびiii)生成するNADH類をピルビン酸乳酸脱水素酵素を作用させNADH類を消去させる工程により試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応;次いでiv)上記i)からiii)の工程からなるADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程、v)生成するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、vi)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD(P)類を作用させる工程、およびvii)生成するNAD(P)H類を測定する工程により試料中の特定物質を測定する特定物質測定反応からなることを特徴とする特定物質の測定方法。

請求項2

試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応後、該ADP除去反応における工程iii)の乳酸脱水素酵素反応が進行しない条件下で、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応を行う、請求項1記載の特定物質の測定方法。

請求項3

工程vi)において用いるNAD(P)類がNADP類であり、かつ工程vii)において測定するNAD(P)H類がNADPH類である、請求項2に記載の特定物質の測定方法。

請求項4

工程vi)において用いるグルコース−6−リン酸脱水素酵素の基質親和性がNAD類よりNADP類の方が高い、請求項3に記載の特定物質の測定方法。

請求項5

試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応後、特定物質測定反応におけるvi)からvii)のいずれもの工程での反応液に乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、請求項2から4のいずれかに記載の特定物質の測定方法。

請求項6

乳酸脱水素酵素阻害剤がシュウ酸である、請求項5に記載の特定物質の測定方法。

請求項7

工程vi)において、NAD(P)類としてNAD(P)とチオNAD(P)を共存させて使用し、かつ、工程vii)において、NAD(P)H類を測定する工程が、生成するチオNAD(P)H由来波長405nm付近吸光度の増加を測定することにより行う、請求項1から6のいずれかに記載の特定物質の測定方法。

請求項8

特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程iv)が、試料中の尿素にATP、マグネシウムイオンカリウムイオン炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼを作用させてADPを発生させる工程である、請求項1から7のいずれかに記載の特定物質の測定方法。

請求項9

ATPを用いた酵素反応によりADPを発生させる特定物質を測定するためのキットであり、かつ、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、NAD類、ピルビン酸、乳酸脱水素酵素、およびATPを必須成分として含む第一試薬;およびNAD(P)類を必須成分として含む第二試薬から構成され、かつ第一試薬または第二試薬に、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外である試薬成分を他の試薬成分と独立に含む、特定物質測定用キット

請求項10

特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外の試薬成分が、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼである、請求項9に記載のキット。

請求項11

第二試薬に乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、請求項9または10に記載のキット。

技術分野

0001

本発明は、試料中の特定物質測定方法および特定物質測定用キットに関する。更に詳しくは、試薬ATPを用いた酵素反応ADPを発生させる試料中の特定物質の測定方法、および特定物質測定用キットに関する。

背景技術

0002

生体試料中には、試薬ATPを用いた酵素反応によりADPを生成する特定物質、すなわち、ATPよりADPを生成する酵素またはその基質が存在する。そのような特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼクレアチンまたはクレアチンキナーゼコリンまたはコリンキナーゼがある。このような特定物質を測定するため、発生するADPを測定する方法があり、これに関し、種々の方法が開発されてきている(例えば、特許文献1、特許文献2)。
例えば、ADPにホスホエノールピルビン酸ピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸補酵素としてNADH存在下で乳酸脱水素酵素を作用させてNADを生成させ、波長340nmの吸光度をもつNADHの減少量からADPを測定する方法が知られている(非特許文献1)。しかし、この方法は、検体中のADPが多くなるにつれて吸光度が減少する測定方法であるため、測定できるADPの上限値が試薬中のNADHにより制限されたりする場合がある。
また、ADPの測定方法として、試料中のADPにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ等で作用させ、生成する過酸化水素の量からADPを測定する方法が知られている(特許文献3)。しかし、この方法は試料中の尿酸アスコルビン酸等の還元物質や、ビリルビンヘモグロビン等の着色物質の影響を受けやすくそれが測定値に影響を及ぼす場合がある。

0003

さらに、ADPに、マグネシウムイオン存在下でグルコースADP依存性ヘキソキナーゼを作用させ、次いで、生成するグルコース−6−リン酸をNAD(P)存在下でグルコース−6−リン酸脱水素酵素を作用させ、生成するNAD(P)Hの量から、ADPを測定する方法が知られている(特許文献2)。この方法は、NAD(P)Hの生成量に基づいてADPを測定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっているNAD(P)Hを測定することから測定値の信頼性が高く、試料中の還元物質などの影響を受けないという利点を有し、従って、生体試料中のADPを簡便にして高精度で測定することができるとされている(特許文献2)。しかし、特定物質を、試薬ATPを用いた酵素反応によりADPを生成させ、このADPを上記のADP依存性ヘキソキナーゼを用いて測定すると、試薬のATPには、ADPが混在するため、正確な測定ができにくい。また、ATPは水溶液でADPに非酵素的に変換しやすく、測定試薬ロット間で測定値の誤差が生じやすいという問題があった。そこで、そのような問題を解決するため、あらかじめ、キナーゼ等により試薬ATPに混在するADPを除去する方法が知られている(特許文献4)。しかし、この方法は、キナーゼ等の基質も高価であることに加え、試薬の安定性に問題があった。

0004

特開平9−285297号公報
特開平9−234098号公報
特開平5−244994号公報
特開平10−262697号公報

先行技術

0005

J.Appl.Biochem.,1985,7(4−5),303−310

発明が解決しようとする課題

0006

本発明の課題は、ATPを用いる酵素反応によりADPを発生する試料中の特定物質を測定する際、発生するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−6−リン酸を測定することにより、試料中の特定物質を測定する方法において、測定ブランクを減少させ、また、検量線の傾きを小さくすることにより、広範囲のADPの濃度を正確に測定する方法およびそれに使用する安定で安価な特定物質測定用キットを提供することにある。

課題を解決するための手段

0007

本発明者らは、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させ、次いで、生成するADPに、ADP依存性ヘキソキナーゼ等を作用させてADPを正確に測定できるとされている前記の方法を、補酵素としてチオNAD(P)とNAD(P)を併用して高濃度の尿素等の特定物質の測定に用いることを検討した。しかし、この前記の方法では、試料中の特定物質が高濃度になったり、補酵素としてチオNAD(P)を用いて測定したりすると、ブランクが高くなったり検量線の傾きが大きくなり、特定物質を測定できる濃度範囲が狭くなる問題があり、実用性に問題が発生する場合があることを発見した。さらに、その問題を解決するため種々検討した結果、試薬としてのATP中に存在するADPを、ADP依存性ヘキソキナーゼ反応、グルコース−6−リン酸脱水素酵素反応、乳酸脱水素酵素反応の順で反応させてADPを除去した後に、特定物質を測定すると、測定ブランクが低くなり検量線の傾きが小さくなるため特定物質の測定可能な濃度範囲を広くなり、正確に測定できることを見出した。本発明は、かかる経過によりなされたものである。

0008

従って、本発明は、
[1].ATPを用いた酵素反応によりADPを発生させる試料中の特定物質の測定方法であって、
i)試薬成分としてのATP中に不純物として存在するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、
ii)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD類を作用させる工程、および
iii)生成するNADH類をピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させNADH類を消去させる工程
により試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応;次いで
iv)上記i)からiii)の工程からなるADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程、
v)生成するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、
vi)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD(P)類を作用させる工程、および
vii)生成するNAD(P)H類を測定する工程
により試料中の特定物質を測定する特定物質測定反応
からなることを特徴とする特定物質の測定方法;
[2].試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応後、該ADP除去反応における工程iii)の乳酸脱水素酵素反応が進行しない条件下で、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応を行う、上記[1]記載の特定物質の測定方法;
[3].工程vi)において用いるNAD(P)類がNADP類であり、かつ工程vii)において測定するNAD(P)H類がNADPH類である、上記[2]に記載の特定物質の測定方法;
[4].工程vi)において用いるグルコース−6−リン酸脱水素酵素の基質親和性がNAD類よりNADP類の方が高い、上記[3]に記載の特定物質の測定方法;
[5].試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応後、特定物質測定反応におけるvi)からvii)のいずれもの工程での反応液に乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、上記[2]から[4]のいずれかに記載の特定物質の測定方法;
[6].乳酸脱水素酵素阻害剤がシュウ酸である、上記[5]に記載の特定物質の測定方法;
[7].工程vi)において、NAD(P)類としてNAD(P)とチオNAD(P)を共存させて使用し、かつ、工程vii)において、NAD(P)H類を測定する工程が、生成するチオNAD(P)H由来の波長405nm付近の吸光度の増加を測定することにより行う、上記[1]から[6]のいずれかに記載の特定物質の測定方法;
[8].特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程iv)が、試料中の尿素にATP、マグネシウムイオン、カリウムイオン炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼを作用させてADPを発生させる工程である、上記[1]から[7]のいずれかに記載の特定物質の測定方法;
[9].ATPを用いた酵素反応によりADPを発生させる特定物質を測定するためのキットであり、かつ、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、NAD類、ピルビン酸、乳酸脱水素酵素、およびATPを必須成分として含む第一試薬;およびNAD(P)類を必須成分として含む第二試薬から構成され、かつ第一試薬または第二試薬に、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外である試薬成分を他の試薬成分と独立に含む、特定物質測定用キット;
[10].特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外の試薬成分が、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼである、上記[9]に記載のキット;および
[11].第二試薬に乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、上記[9]または[10]に記載のキット
に関する。

発明の効果

0009

本発明においては、ATPを用いる酵素反応によりADPを発生する試料中の特定物質を測定する際、試薬としてのATP中に存在するADPを、ADP依存性ヘキソキナーゼ反応、グルコース−6−リン酸脱水素酵素反応、乳酸脱水素酵素反応の順で反応させてADPを除去した後に、特定物質を測定することにより、測定ブランクが低く検量線の傾きも小さくなるため広範囲のADPの濃度を正確に測定できる。また、特定物質測定反応の補酵素としてチオNAD(P)とNAD(P)を併用したときには、高濃度の特定物質を測定しやすくなる。

図面の簡単な説明

0010

図1は、本発明において、チオNADPとNADPを用い阻害剤(シュウ酸)を用いない実施例1−7の条件で尿素を測定したときのブランク値の減少を示したものである。
図2は、乳酸脱水素酵素を用いない比較例1−7の条件で尿素を測定したときのブランク値の減少を示したものである。
図3は、本発明において、チオNADPとNADPを用い阻害剤(シュウ酸)を用いない実施例1−7の条件で尿素を測定したとき検量線の結果を示したものである。
図4は、本発明において、チオNADとNADを用いさらに阻害剤(シュウ酸)を用いた実施例8−14の条件で尿素を測定したときのブランク値の減少を示したものである。
図5は、乳酸脱水素酵素を用いない比較例8−14の条件で尿素を測定したときのブランク値の減少を示したものである。
図6は、本発明において、チオNADとNADを用いさらに阻害剤(シュウ酸)を用いた実施例8−14の条件で尿素を測定したときの検量線の結果を示したものである。

0011

本発明に用いられる試料としては、酵素反応でATPをADPに変換する特定物質を含むサンプルであり、好ましくは液体であれば特に限定しないが、血清血漿、尿等の生体試料、または、それらのモデルサンプルが好ましい。
本発明において、特定物質とは、ATPを用いる酵素反応によりADPを生成する物質、すなわち、ATPよりADPを生成する酵素またはその基質であれば特に限定しない。そのような特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼ、クレアチンまたはクレアチンキナーゼ、コリンまたはコリンキナーゼを例示できる。
本明細書においては、そのような特定物質とATPとよりADPを生成する酵素反応を特定物質酵素反応ともいうものとする。
特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼを測定するときには、特定物質酵素反応として、尿素、ATP、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼを作用させるウレアアミドリアーゼ反応を用いることができる。その反応式を下記に示す。

0012

0013

特定物質としてクレアチンまたはクレアチンキナーゼを測定するときには、特定物質酵素反応として、クレアチン、ATP、マグネシウムイオンとクレアチンキナーゼを作用させるクレアチンキナーゼ反応を用いることができる。その反応式を下記に示す。

0014

0015

特定物質としてコリンまたはコリンキナーゼを測定するときには、特定物質酵素反応として、コリン、ATP、マグネシウムイオン、コリンキナーゼを作用させるコリンキナーゼ反応を用いることができる。その反応式を下記に示す。

0016

0017

本発明において、ADPとは、アデノシン二リン酸(Adenosine diphosphate)をいう。本発明において、ATPとは、アデノシン三リン酸(Adenosine triphosphate)をいう。
本発明において、NAD(P)類とは、例えば、NAD、NADP、チオNAD、チオNADPのいずれかを意味し、NAD類とは、例えば、NAD、チオNADのいずれかを意味し、NADP類とは、例えば、NADP、チオNADPのいずれかを意味するが、脱水素酵素反応に用いる補酵素として働くそれらに類似した構造、例えば、リング骨格が同じで補酵素として機能を有することが知られている化合物でもよい。ここで、NADとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、NADPとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味し、チオNADとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、チオNADPとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。
本発明において、NAD(P)H類とは、NAD(P)類の対応する還元型であり、例えば、NAD(P)類がNAD、NADP、チオNAD、チオNADPのときは、それぞれ、NADH、NADPH、チオNADH、チオNADPHを意味する。
本発明において、NAD(P)とは、NADまたはNADPを意味し、NAD(P)Hとは、NAD(P)の対応する還元型を意味し、NAD(P)がNAD、NADPのときは、それぞれ、NADH、NADPHを意味する。本発明において、チオNAD(P)とは、チオNADまたはチオNADPを意味し、チオNAD(P)Hとは、チオNAD(P)の対応する還元型を意味し、チオNAD(P)がチオNAD、チオNADPのときは、それぞれ、チオNADH、チオNADPHを意味する。

0018

本発明において、試料中の特定物質の測定方法は、以下のi)からiii)の工程からなる試薬成分としてのATP中のADPを除去させるADP除去反応と、以下のiv)からvii)の工程からなる試料中の特定物質を測定する特定物質測定反応を必須要件とする。
本発明においては、i)からiii)の工程からなるADP除去反応、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応は、それぞれ、ワンポットで、すなわち一気に行うことが好ましい。

0019

ADP除去反応:
i)試薬成分としてのATP中に不純物として存在するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程
この工程i)においては、下記反応式(本明細書ではこの反応をADP依存性ヘキソキナーゼ反応と記載することもある)において、ADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させてグルコース−6−リン酸(G6P)を生成させる。この工程においては、ADPは、試薬成分としてのATPに不純物として存在するADPである。

0020

0021

金属イオンとしては、マグネシウムイオン、コバルトイオンマンガンイオンなどが好ましい。

0022

ii)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD類を作用させる工程
工程ii)においては、工程i)で生成するグルコース−6−リン酸(G6P)が酵素反応に付される。下記反応式(本明細書では、グルコース−6−リン酸脱水素酵素が関与する反応をグルコース−6−リン酸脱水素酵素反応ともいう)のように、グルコース−6−リン酸脱水素酵素(G6PDH)とNAD類を作用させると、グルコノラクトン−6−リン酸(6−PGL)とともに、NADH類が発生する。

0023

0024

次の工程iii)では乳酸脱水素酵素反応を用いるが、この乳酸脱水素酵素反応は、補酵素としてNADH類を用いると反応が進行し、NADPH類を用いると反応が進行しないので、本工程ii)で用いる補酵素は、NAD類とし、NADH類が生成するようにして、次の工程iii)の乳酸脱水素酵素反応が進行するようにすることが必要である。

0025

iii)生成するNADH類をピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させNADH類を消去させる工程
特定物質測定反応における工程vi)で発生するNAD(P)H類を工程vii)で測定する際、工程ii)で生成するNADH類は、ブランクの上昇の原因となるので、この工程iii)においては、工程ii)で生成するNADH類をピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させる乳酸脱水素反応によりNADH類をNAD類に変換させ消去させる。

0026

0027

以上に説明したi)からiii)の工程からなるADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPが得られ、このATPを用いて、次の特定物質測定反応が行われる。

0028

特定物質測定反応:
iv)上記i)からiii)の工程からなるADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程
本工程iv)においては、特定物質酵素反応を進行させるための試薬成分を用いた特定物質酵素反応により、測定対象である試料中の特定物質と、上記i)からiii)の工程からなるADP除去反応によりADPが除去された試薬成分としてのATPとよりADPを生成させる。

0029

0030

例えば、特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼを測定するときには、前記したウレアアミドリアーゼ反応から明らかなとおり、特定物質酵素反応のための試薬成分として、ウレアアミドリアーゼまたは尿素、ATP、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンを用いる。特定物質として、クレアチンまたはクレアチンキナーゼ、コリンまたはコリンキナーゼを測定するときには、同様に、前記したクレアチンキナーゼ反応、コリンキナーゼ反応から特定物質酵素反応のための試薬成分を決めることができる。

0031

v)生成するADPに、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程
この工程は、前記工程iv)で生成するADPを、ADP依存性ヘキソキナーゼ反応に付す工程である。

0032

0033

金属イオンとしては、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオンなどが好ましい。

0034

vi)生成するグルコース−6−リン酸にグルコース−6−リン酸脱水素酵素とNAD(P)類を作用させる工程
この工程においては、工程v)により生成したグルコース−6−リン酸(G6P)にグルコース−6−リン酸脱水素酵素(G6PDH)を作用させてグルコース−6−リン酸脱水素酵素反応を行い、グルコノラクトン−6−リン酸(6−PGL)とともにNADH類が生成する。なお、補酵素としては、工程ii)とは異なり、工程ii)の後の乳酸脱水素酵素反応を進行させることを考慮する必要がないので、NAD類に限定されず、NAD(P)類を用いることができる。

0035

0036

vii)生成するNAD(P)H類を測定する工程
本工程においては、NAD(P)類では吸光度がほとんどなくNAD(P)H類で吸光度がある波長を用いて、NAD(P)H類由来の吸光度の増加を測定する。そのNAD(P)H類由来の吸光度の増加量から、あらかじめ作成した検量線と比較して、特定物質の濃度を測定することができる。
工程vi)において、補酵素のNAD(P)類としてNAD(P)を用いる場合は、生成するNAD(P)Hに由来する340nm付近、例えば、波長330〜350nmの吸光度の増加量からADPを測定することができる。
本発明において、工程vi)において、補酵素のNAD(P)類としてチオNAD(P)を用いる場合は、生成するチオNAD(P)Hに由来する405nm付近、例えば、波長390〜415nmの吸光度の増加量からADPを測定することができる。本発明においてこのチオNAD(P)を用いることは、安価で入手しやすい可視分光光度計を用いて測定できる点、特定物質の測定領域を著しく改善できる点などで好適である。

0037

また、特定物質の測定領域をさらに広くするため、工程vi)において、補酵素としてチオNAD(P)とNAD(P)を共存させてグルコース−6−リン酸脱水素酵素反応を行い、チオNAD(P)HとNAD(P)Hを発生させ、生成したチオNAD(P)H由来の波長405nm付近の吸光度の増加を測定することによりADPを測定することが特に好ましい。
この場合、用いるNAD(P)の量は特に限定しないが、検量線の傾きを適度に調整するため、用いるチオNAD(P)の量の0.1〜30倍モル数が好ましく、0.5〜25倍モル数がさらに好ましい。

0038

本発明においては、i)からiii)の工程からなるADP除去反応で試薬成分中のADPを除去させた後、工程iii)の乳酸脱水素酵素反応が進行しない条件下で、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応を行うことが好ましい。特定物質測定反応において工程iii)の乳酸脱水素酵素反応が進行すると、工程vi)で生成するNADH類をNAD類にする逆反応が工程vii)のNAD(P)H類を測定する際の誤差の原因となるからである。
本発明においては、工程iii)の乳酸脱水素酵素反応はNAD依存性なので、特定物質測定反応においてこの乳酸脱水素酵素反応を進行させないためには、工程vi)で用いるNAD(P)類は、NADP類であることが好ましい。その際、グルコース−6−リン酸脱水素酵素は、基質親和性がNAD類よりNADP類の方が高いものが好ましい。この場合、グルコース−6−リン酸脱水素酵素は、NADP類に対するKmが、NAD類に対するKmの0.01〜0.5倍が好ましい。
また、乳酸脱水素酵素反応を特定物質測定反応において進行させないためには、試薬成分中のADPを除去させたADP除去反応後、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応において、反応液に乳酸脱水素酵素阻害剤を存在させて乳酸脱水素酵素反応を阻害することも好ましい。乳酸脱水素酵素阻害剤としては、シュウ酸、オキサミン酸およびこれらの塩を例示することができ、中でも、シュウ酸が好ましい。

0039

本発明の特定物質の測定方法においては、i)からiii)の工程からなるADP除去反応を進行させるための第一試薬、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応を進行させるための第二試薬から構成される特定物質測定用キットを用いることが好ましい。この場合、例えば、第一試薬としては、グルコース、ADP依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、NAD類、ピルビン酸、乳酸脱水素酵素、およびATPを必須成分として含むことが好ましい。一般に、このようなATPを含む第一試薬は、必須成分を混合した後、前処理としてATP中のADPを除去するため、例えば、室温から37℃、好ましくは室温で1時間以上放置しておくことが好ましい。この放置操作によりi)からiii)の工程を、ワンポットで、すなわち一気に達成することができる。
第二試薬には、iv)からvii)の工程からなる特定物質測定反応を進行させるための成分として、NAD(P)類を必須成分として含むが、第一試薬に含まれている成分は省略してもよい。第一試薬または第二試薬には、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外である試薬成分は、独立に含まれることが必要であり、さらに少なくともその必須成分の一部または全部が第二試薬に含まれていることが好ましい。
例えば、特定物質が尿素の場合、特定物質を酵素反応に付しADPを発生させる工程に必須であってATP以外である試薬成分は、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼであり、これらが独立に第一試薬または第二試薬に含まれていることが必要である。さらに少なくともその必須成分の一部または全部が第二試薬に含まれていることが好ましい。

0040

本発明の特定物質測定用キットの各成分は、例えば、NAD類、NAD(P)類、金属イオン、グルコース−6−リン酸脱水素酵素等は、本発明の特定物質の測定方法で述べたものを適宜効果に併せて選択して使用することができる。
例えば、第二試薬には、乳酸脱水素酵素阻害剤を含むことが好ましい。第一試薬または第二試薬には、界面活性剤緩衝剤を適宜、加えてもよい。

0041

自動分析装置可視部測定装置を用いてこのキットにより特定物質を測定することができる。
例えば、i)からiii)の工程を経た第一試薬を20〜40℃好ましくは37℃で混合し3〜10分好ましくは5分で放置する。ついでそれに、試料および第二試薬を加え、iv)からvii)の工程を含む特定物質測定反応を、ワンポットで、すなわち一気に行い、生成するNAD(P)Hの増加を適当な波長の吸光度を測定することにより、特定物質を測定することができる。

0042

実施例1−7および比較例1−7
チオNADPとNADPを用い阻害剤(シュウ酸)を用いない本発明による尿素の測定
1.方法
ウレアアミドリアーゼ、ADP依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−6−リン酸脱水素酵素、チオNADP、NADPを用いた尿素窒素測定系において、試薬中のATP中に含有されるADPから、ADP依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−6−リン酸脱水素酵素の反応によって生じるNADHの発色を、前もって試薬中の乳酸脱水素酵素を用いた反応によりNADHをNADに酸化して消去することにより防止した。この方法により、ブランク値、尿素の測定可能の濃度範囲を検討した。更に、乳酸脱水素酵素を用いることなく、NADHをNADに酸化して消去しないで測定する比較例と比較した。

0043

2.試料
ブランク試料生理食塩水を用いた。測定のための試料は尿素窒素として200mg/dLとなる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。

0044

3.試薬
試薬は、以下の第一試薬および第二試薬を用いた。
第一試薬:
第一試薬は、以下の組成のものを用いた。
100mM BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル−2−
アミノエタンスルホン酸)pH7.5
10mM D−グルコース
10mM炭酸水素カリウム
5mMATP・2Na(種々の濃度のADPを含む)
10mMピルビン酸
5mMNAD
0.1%界面活性剤
6KU/Lヘキソキナーゼ
2KU/Lウレアアミドリアーゼ
2KU/L グルコース−6−リン酸脱水素酵素
200U/L 乳酸脱水素酵素

0045

第二試薬:
第二試薬は、以下の組成のものを用いた。
100mM BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル−2−
アミノエタンスルホン酸)pH7.5
10mM酢酸マグネシウム四水和物
5mMNADP
1mMチオNADP
0.1% 界面活性剤

0046

試薬組成について:
本実施例では、表1に示すように試薬成分のATP中にADPが存在している試薬を用いた。本実施例に用いた第一試薬はADPより発生したNADHが乳酸脱水素酵素によりNADとなるように1時間以上放置し、十分な時間を置きATP中のADPを除去した。また、乳酸脱水素酵素(LDH)による逆反応の影響を防ぐため、ADP測定系(特定物質測定反応における工程vi))に用いる補酵素はLDHと反応するチオNADではなく、LDHと反応しないチオNADPを用いた。なお、このとき、その補酵素としてNADPを加えず、チオNADP単独では、測定ブランクが2倍以上で傾きが高く測定濃度範囲は、50mg/dL以下となるため、チオNADPとNADPを併用することにした。
表1に示したとおり、比較例1から7に用いた第一試薬はLDHを添加せず、ADPの消去反応が起きない組成を用いた。加えて、測定系の測定可能範囲を広げることを目的とし、NADPとチオNADPの終濃度比が5:1となるような試薬組成を用いた。

0047

0048

4.測定
測定は以下のように行った。可視部測定装置(吸光度信頼範囲2.5以下)を用い、試料3.0μLと第一試薬100μLとを37℃、5分間混合した後、第二試薬100μLを加え同温度で5分間反応させた。発色反応後の吸光度を当該機種の1ポイントエンド法により波長405nmで測定した。

0049

5.結果
a)ブランク吸光度の比較
ブランクの吸光度の結果を図1と表2に示す。

0050

0051

図1、表2の結果から、第一試薬に添加したLDHにより予め試薬中のADPを消去した実施例の組成では、LDHの添加が無い比較例の組成よりも、ブランクでの吸光度が低減されていることが判明した。

0052

b)直線性の比較
比較例1−7の検量線を図2に、実施例1−7の検量線を図3に示す。
図2で示すように比較例1−7の組成では、尿素窒素濃度200mg/dLの試料を測定する場合、得られる吸光度が測定機器の吸光度上限である2.5を越え、測定不能であった。一方、図3が示すように実施例1−7では尿素窒素濃度200mg/dLの試料を測定しても得られる吸光度は2.5を越えず、本発明により尿素の測定可能範囲が拡大されることが判明した。

0053

実施例8−14および比較例8−14
チオNADとNADを用いさらに阻害剤(シュウ酸)を用いた本発明による尿素の測定
1.方法
ウレアアミドリアーゼ、ADP依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−6−リン酸脱水素酵素、チオNAD、NADを用いた尿素窒素測定系において、試薬中のATP中に含有されるADPから、ADP依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−6−リン酸脱水素酵素の反応によって生じるNADHの発色を、前もって試薬中の乳酸脱水素酵素を用いた反応によりNADHをNADに酸化して消去することにより防止した。その後、乳酸脱水素酵素阻害剤(シュウ酸)によりその酵素反応を停止させた。この方法による、ブランク値、尿素の測定可能な濃度範囲を検討した。更に、乳酸脱水素酵素を用いることなく、NADHをNADに酸化して消去しないで測定する比較例と比較した。

0054

2.試料
ブランク試料は生理食塩水を用いた。測定のための試料は尿素窒素として200mg/dLとなる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。

0055

3.試薬
試薬は、以下の第一試薬および第二試薬を用いた。
第一試薬:
第一試薬は、以下の組成のものを用いた。
100mM BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル−2−
アミノエタンスルホン酸)pH7.5
10mM D−グルコース
10mM炭酸水素カリウム
5mMATP・2Na(種々の濃度のADPを含む)
10mMピルビン酸
5mMNAD
0.1%界面活性剤
6KU/Lヘキソキナーゼ
2KU/Lウレアアミドリアーゼ
2KU/L グルコース−6−リン酸脱水素酵素
200U/L 乳酸脱水素酵素

0056

第二試薬:
第二試薬は、以下の組成のものを用いた。
100mM BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル−2−
アミノエタンスルホン酸)pH7.5
10mM酢酸マグネシウム・四水和物
100mMシュウ酸カリウム一水和物
1mMチオNAD
0.1% 界面活性剤

0057

試薬組成について:
本実施例では、表3に示すように試薬成分のATP中にADPが存在している試薬を用いた。本実施例に用いた第一試薬はADPより発生したNADHが乳酸脱水素酵素(LDH)によりNADとなるように十分な時間を置き用いた。また、試料中の尿素窒素から生成されたNADHがLDHによって消去されないように、LDHに対するインヒビターであるシュウ酸を第二試薬組成中に添加した。表3に示すように比較例に用いた第一試薬はLDHを添加せず、ADPを消去しない組成を用いた。加えて、チオNAD単独では、測定ブランクが2倍以上で傾きが高く測定濃度範囲は、50mg/dl以下となるため、測定系の測定可能範囲を広げることを目的とし、NADとチオNADの終濃度比が5:1となるような試薬組成を用いた。

0058

0059

4.測定
測定は以下のように行った。可視部測定装置(吸光度信頼範囲2.5以下)を用い、試料3.0μLと第一試薬100μLとを37℃、5分間混合した後、第二試薬100μLを加え同温度で5分間反応させた。発色反応後の吸光度を当該機種の1ポイントエンド法により波長405nmで測定した。
5.結果
a)ブランク吸光度の比較
ブランクの吸光度の結果を図4と表4に示す。

0060

0061

図4と表4の結果から、第一試薬に添加したLDHにより予め試薬中のADPを消去した組成では、LDHの添加が無い組成よりも、ブランクでの吸光度が軽減されていることが判明した。

実施例

0062

b)直線性の比較
比較例8−14の検量線を図5に、実施例8−14の検量線を図6に示す。
図5が示すように比較例8−14では、尿素窒素濃度200mg/dLの試料を測定する場合、得られる吸光度が測定機器の吸光度上限である2.5を越え、測定不能であった。一方、図6が示すように実施例8−14では尿素窒素濃度200mg/dLの試料を測定しても得られる吸光度は2.5を越えず、本発明により尿素の測定範囲が拡大されることが判明した。

0063

本発明においては、ATPを用いる酵素反応によりADPを発生する試料中の特定物質を測定する際、試薬としてのATP中に存在するADPを、ADP依存性ヘキソキナーゼ反応、グルコース−6−リン酸脱水素酵素反応、乳酸脱水素酵素反応の順で反応させてADPを除去した後に、特定物質を測定することにより、測定ブランクが低く検量線の傾きも小さくなるため広範囲のADPの濃度を正確に測定できる。また、測定系反応の補酵素としてチオNAD(P)とNAD(P)を併用したときには、高濃度の特定物質を測定しやすくなる。したがって、本発明によれば、尿素またはウレアアミドリアーゼ、クレアチンまたはクレアチンキナーゼ、コリンまたはコリンキナーゼなどの試料中の広範囲濃度の特定物質を正確にかつ効率的に測定でき、本発明の測定方法およびそれに用いるキットは各種の疾患の診断などに極めて有用である。

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