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技術 花弁で機能するシソ由来のプロモーター

出願人 サントリーホールディングス株式会社
発明者 田中良和水谷正子
出願日 2010年3月9日 (9年8ヶ月経過) 出願番号 2011-510256
公開日 2012年10月25日 (7年0ヶ月経過) 公開番号 WO2010-122848
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 植物の栽培 植物の育種及び培養による繁殖 微生物、その培養処理
主要キーワード バカラ バラ花弁 特定時期 音波下 ルーピン ドライフラワー 押し花 ブドフラワ
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (3)

課題・解決手段

本発明により、植物の花の色を変えるために有用な新規プロモーター、すなわち、以下の: (1)配列番号1に示す塩基配列を含む核酸、 (2)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して1個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び/又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、 (3)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び (4)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸、から成る群から選ばれる核酸が提供される。

概要

背景

遺伝子組換え技術を利用すると、有用な遺伝子を目的の植物で発現させることにより、その植物に新しい形質を付与することができる。このようにして作製された遺伝子組換え植物は既に広範囲で商業的に栽培されている。遺伝子の発現の調節は、主に転写の段階で制御されているので、転写調節は遺伝子の発現を調節する上で最も重要である。すなわち、適切な時期に、適切な組織で、適切な強さで目的の遺伝子を転写させることが、産業上有用な遺伝子組換え植物を作製するために重要である。転写の開始は多くの場合、転写領域の5'側にあるDNA配列により制御されていて、その終結は転写領域の3'側にあるDNA配列により制御されている。遺伝子の転写の開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節するDNA上の領域はプロモーター、転写の終結を決定する領域はターミネーターと呼ばれる。プロモーターは、開始コドンの5'側数十bpに存在することがあり、TATAボックスなどの配列を含むことが多い。そのさらに5’側には様々な転写調節因子が結合するシスエレメントがあり、これらの存在は、転写の時期、転写が行われる組織、転写の強さなどを制御している。転写調節因子はそのアミノ酸配列により多くのファミリー分類される。例えば、Myb型転写調節因子、bHLHbasichelix loop helix)型転写調節因子などは有名なファミリーである。実際には、転写制御領域とプロモーターは同じような意味で用いられることが多く、厳密な区別はされていない。

花の色の主成分であるアントシアニンは、フラボノイドと総称される二次代謝物一員である。アントシアニンの色はその構造に依存する。すなわち、アントシアニンの発色団であるアントシアニジンのB環の水酸基の数が増加すると青くなる。また、アントシアニンを修飾する芳香族アシル基クマイル基カフェオイル基など)の数が増加するとアントシアニンの色は青くなり(すなわち吸収極大値長波長シフトする)、アントシアニンの安定性が増すことが知られている(以下、非特許文献1参照)。
アントシアニンの生合成に関わる酵素や該酵素をコードする遺伝子はよく研究されている(同非特許文献1参照)。例えば、アントシアニンに芳香族アシル基を転移する反応を触媒する酵素遺伝子リンドウラベンダーペチュニアなどから得られている(以下、特許文献1、特許文献2参照)。赤ジソの葉に蓄積されるアントシアニン(マロニルシソニン、3-O-(6-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl)-5-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosyl)-cyanidin)(以下、非特許文献2参照)の合成に関わる酵素遺伝子は、ヒドロキシシナモイルCoA:アントシアニン3グルコシド−芳香族アシル基転移酵素(3AT)の遺伝子{以下、単に「シソアントシアニン3−アシル基転移酵素(3AT)遺伝子ともいう。}を始め既にいくつかの遺伝子が報告されている(同特許文献1参照)。さらにアントシアニンの生合成酵素の遺伝子の転写調節についても知見が得られている。これらの遺伝子の開始コドンの5'側に位置する転写制御領域の中には、Myb型転写調節因子、bHLH型転写調節因子が結合するシスエレメント配列がある。Myb型転写調節因子とbHLH型転写調節因子がペチュニア、トウモロコシ、シソなどのアントシアニンの合成を制御していることも知られている(同非特許文献1参照)。

植物において遺伝子の転写を担っているプロモーター(以下、転写調節領域ともいう。)には、どの組織でも又は発育段階のどの時期にでも機能するいわゆる構成的プロモーターと、特定の器官・組織でのみ機能する器官・組織特異的プロモーターや、発育段階の特定時期にのみ発現する時期特異的プロモーターとがある。遺伝子組換植物で有用遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、構成的プロモーターがよく用いられる。代表的な構成的プロモーターとしては、カリフラワー35Sプロモーターやそれを元に構築されたプロモーター(以下、非特許文献3参照)、Mac1プロモーター(以下、非特許文献4参照)などがある。しかしながら、植物において、多くの遺伝子は、組織・器官特異的又は時期特異的に発現している。これは遺伝子を組織・器官特異的又は時期特異的に発現することが植物にとっては必要であることを示唆している。このような組織・器官特異的又は時期特異的な転写調節領域を利用して植物の遺伝子組換えを行った例がある。例えば、種子特異的な転写調節領域を用いて蛋白質を種子で蓄積させた例がある。

ところで、植物は多様な色の花を咲かせるが、全ての色の花を咲かせることができる種は、その種がもつ遺伝的な制約から、少ない。例えば、バラカーネーションなどには青や紫色の花を咲かせる品種は自然には存在しない。なぜなら、バラやカーネーションは、多くの青や紫色の花を咲かせる種が合成するデルフィニジンというアントシアニジンを合成するために必要なフラボノイド3’,5’-水酸化酵素(以下、単にF3'5'Hともいう。)遺伝子を持っていないからである。これらの種に、青や紫色の花を咲かせる種であるペチュニア、パンジーなどのF3'5'H遺伝子を導入することにより、これらの種で花の色を青くすることができた。この場合、異種由来のF3'5'H遺伝子を転写させるために、キンギョソウ又はペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子の転写調節領域が用いられている。例えば、キンギョソウ又はペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子の転写調節領域を含むプラスミドとして、以下の特許文献3に記載されたプラスミドpCGP485、pCGP653、構成的な転写調節領域を含むプラスミドとして、プラスミドpCGP628(Mac1プロモーターを含む)、以下の特許文献4に記載されたプラスミドpSPB130(エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイク35Sプロモーターを含む)が挙げられる。

しかしながら、このようなプロモーターが組換え植物において、どの程度強く機能して目的の表現型をもたらすことができるかどうかは、予測することは困難である。また、宿主植物と同じ又は類似の塩基配列を導入したり、導入遺伝子染色体多コピーされたり又は繰り返し挿入されたりすると、遺伝子のサイレンシングが起こることがある(以下、非特許文献5参照)。したがって、複数の外来遺伝子を発現させるために同じプロモーターを繰り返して使うことは遺伝子のサイレンシングを引き起こすことがあるので、避けるべきである。
以上のことから、いくつかのプロモーターが花の色を変えるために使われてはきたが、さらに別の花の色を変えるために宿主植物と目的に応じた有用なプロモーターが未だ必要とされている。

概要

本発明により、植物の花の色を変えるために有用な新規プロモーター、すなわち、以下の: (1)配列番号1に示す塩基配列を含む核酸、 (2)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して1個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び/又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、 (3)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び (4)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸、から成る群から選ばれる核酸が提供される。

目的

本発明が解決しようとする課題は、植物の花の色を変えるために有用な新規プロモーターを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

以下の:(1)配列番号1に示す塩基配列を含む核酸、(2)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して1個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び/又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、(3)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び(4)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸、から成る群から選ばれる核酸。

請求項2

請求項1に記載の核酸を含む発現ベクター又は発現カセット

請求項3

配列番号2に示す塩基配列を含む、請求項2に記載の発現ベクター又は発現カセット。

請求項4

請求項2又は3に記載の発現ベクター又は発現カセットにより形質転換されたキクを除く非ヒト宿主

請求項5

請求項1に記載の核酸が導入された、キクを除く植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織

請求項6

切り花である、請求項5に記載のキクを除く植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。

請求項7

請求項6に記載の切り花を用いた切り花加工品

技術分野

0001

本発明は、新規プロモーターに関する。より詳しくは、本発明は、シソ由来アントシアニン3−アシル基転移酵素(3AT)遺伝子の転写調節領域、及びその利用に関する。

背景技術

0002

遺伝子組換え技術を利用すると、有用な遺伝子を目的の植物で発現させることにより、その植物に新しい形質を付与することができる。このようにして作製された遺伝子組換え植物は既に広範囲で商業的に栽培されている。遺伝子の発現の調節は、主に転写の段階で制御されているので、転写調節は遺伝子の発現を調節する上で最も重要である。すなわち、適切な時期に、適切な組織で、適切な強さで目的の遺伝子を転写させることが、産業上有用な遺伝子組換え植物を作製するために重要である。転写の開始は多くの場合、転写領域の5'側にあるDNA配列により制御されていて、その終結は転写領域の3'側にあるDNA配列により制御されている。遺伝子の転写の開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節するDNA上の領域はプロモーター、転写の終結を決定する領域はターミネーターと呼ばれる。プロモーターは、開始コドンの5'側数十bpに存在することがあり、TATAボックスなどの配列を含むことが多い。そのさらに5’側には様々な転写調節因子が結合するシスエレメントがあり、これらの存在は、転写の時期、転写が行われる組織、転写の強さなどを制御している。転写調節因子はそのアミノ酸配列により多くのファミリー分類される。例えば、Myb型転写調節因子、bHLHbasichelix loop helix)型転写調節因子などは有名なファミリーである。実際には、転写制御領域とプロモーターは同じような意味で用いられることが多く、厳密な区別はされていない。

0003

花の色の主成分であるアントシアニンは、フラボノイドと総称される二次代謝物一員である。アントシアニンの色はその構造に依存する。すなわち、アントシアニンの発色団であるアントシアニジンのB環の水酸基の数が増加すると青くなる。また、アントシアニンを修飾する芳香族アシル基クマイル基カフェオイル基など)の数が増加するとアントシアニンの色は青くなり(すなわち吸収極大値長波長シフトする)、アントシアニンの安定性が増すことが知られている(以下、非特許文献1参照)。
アントシアニンの生合成に関わる酵素や該酵素をコードする遺伝子はよく研究されている(同非特許文献1参照)。例えば、アントシアニンに芳香族アシル基を転移する反応を触媒する酵素遺伝子リンドウラベンダーペチュニアなどから得られている(以下、特許文献1、特許文献2参照)。赤ジソの葉に蓄積されるアントシアニン(マロニルシソニン、3-O-(6-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl)-5-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosyl)-cyanidin)(以下、非特許文献2参照)の合成に関わる酵素遺伝子は、ヒドロキシシナモイルCoA:アントシアニン3グルコシド−芳香族アシル基転移酵素(3AT)の遺伝子{以下、単に「シソアントシアニン3−アシル基転移酵素(3AT)遺伝子ともいう。}を始め既にいくつかの遺伝子が報告されている(同特許文献1参照)。さらにアントシアニンの生合成酵素の遺伝子の転写調節についても知見が得られている。これらの遺伝子の開始コドンの5'側に位置する転写制御領域の中には、Myb型転写調節因子、bHLH型転写調節因子が結合するシスエレメント配列がある。Myb型転写調節因子とbHLH型転写調節因子がペチュニア、トウモロコシ、シソなどのアントシアニンの合成を制御していることも知られている(同非特許文献1参照)。

0004

植物において遺伝子の転写を担っているプロモーター(以下、転写調節領域ともいう。)には、どの組織でも又は発育段階のどの時期にでも機能するいわゆる構成的プロモーターと、特定の器官・組織でのみ機能する器官・組織特異的プロモーターや、発育段階の特定時期にのみ発現する時期特異的プロモーターとがある。遺伝子組換植物で有用遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、構成的プロモーターがよく用いられる。代表的な構成的プロモーターとしては、カリフラワー35Sプロモーターやそれを元に構築されたプロモーター(以下、非特許文献3参照)、Mac1プロモーター(以下、非特許文献4参照)などがある。しかしながら、植物において、多くの遺伝子は、組織・器官特異的又は時期特異的に発現している。これは遺伝子を組織・器官特異的又は時期特異的に発現することが植物にとっては必要であることを示唆している。このような組織・器官特異的又は時期特異的な転写調節領域を利用して植物の遺伝子組換えを行った例がある。例えば、種子特異的な転写調節領域を用いて蛋白質を種子で蓄積させた例がある。

0005

ところで、植物は多様な色の花を咲かせるが、全ての色の花を咲かせることができる種は、その種がもつ遺伝的な制約から、少ない。例えば、バラカーネーションなどには青や紫色の花を咲かせる品種は自然には存在しない。なぜなら、バラやカーネーションは、多くの青や紫色の花を咲かせる種が合成するデルフィニジンというアントシアニジンを合成するために必要なフラボノイド3’,5’-水酸化酵素(以下、単にF3'5'Hともいう。)遺伝子を持っていないからである。これらの種に、青や紫色の花を咲かせる種であるペチュニア、パンジーなどのF3'5'H遺伝子を導入することにより、これらの種で花の色を青くすることができた。この場合、異種由来のF3'5'H遺伝子を転写させるために、キンギョソウ又はペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子の転写調節領域が用いられている。例えば、キンギョソウ又はペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子の転写調節領域を含むプラスミドとして、以下の特許文献3に記載されたプラスミドpCGP485、pCGP653、構成的な転写調節領域を含むプラスミドとして、プラスミドpCGP628(Mac1プロモーターを含む)、以下の特許文献4に記載されたプラスミドpSPB130(エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイク35Sプロモーターを含む)が挙げられる。

0006

しかしながら、このようなプロモーターが組換え植物において、どの程度強く機能して目的の表現型をもたらすことができるかどうかは、予測することは困難である。また、宿主植物と同じ又は類似の塩基配列を導入したり、導入遺伝子染色体多コピーされたり又は繰り返し挿入されたりすると、遺伝子のサイレンシングが起こることがある(以下、非特許文献5参照)。したがって、複数の外来遺伝子を発現させるために同じプロモーターを繰り返して使うことは遺伝子のサイレンシングを引き起こすことがあるので、避けるべきである。
以上のことから、いくつかのプロモーターが花の色を変えるために使われてはきたが、さらに別の花の色を変えるために宿主植物と目的に応じた有用なプロモーターが未だ必要とされている。

0007

WO 96/25500
WO 01/72984
WO 94/28140
WO 05/17147

先行技術

0008

Plant J. 54, 737-749, 2008
Agricultural and Biological Chemistry, 53, 797-800, 1989
Plant Cell Physiology 1996, 37, 49-59
Plant Molecular Biology 1990, 15, 373-381
Annals of Botany 1997, 79, 3-12

発明が解決しようとする課題

0009

本発明が解決しようとする課題は、植物の花の色を変えるために有用な新規プロモーターを提供することである。
外来遺伝子を組換え植物において、好ましくは特定の器官や組織、より好ましくはアントシアニンを蓄積する器官や花弁で発現させる場合には、適切なプロモーター、ターミネーターを選択することが望まれている。本発明が解決しようとする課題は、このような配列を取得することでもある。

課題を解決するための手段

0010

本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、植物の花の色を変えるために有用な新規プロモーターとして、シソ由来のアントシアニン3−アシル基転移酵素(3AT)遺伝子の転写調節領域を発見し、その有用性を確認して、本願発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。

0011

[1]以下の:
(1)配列番号1に示す塩基配列を含む核酸
(2)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して1個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び/又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、
(3)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
(4)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸。

0012

[2]前記[1]に記載の核酸を含む発現ベクター又は発現カセット

0013

[3]配列番号2に示す塩基配列を含む、請求項2に記載の発現ベクター又は発現カセット。

0014

[4]前記[2]又は[3]に記載の発現ベクター又は発現カセットにより形質転換されたキクを除く非ヒト宿主

0015

[5]前記[1]に記載の核酸が導入された、キクを除く植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。

0016

[6]切り花である、前記[5]に記載のキクを除く植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
[7]前記[6]に記載の切り花を用いた切り花加工品

発明の効果

0017

アカジソの葉で酵素遺伝子の転写をつかさどっていると考えられるプロモーター領域、すなわち、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域が異種であるペチュニアとバラの花弁で転写調節領域として機能しうることが分かった。したがって、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域を利用して、花などのアントシアニンが蓄積する組織内で特異的に外来遺伝子の転写を起こさせることが可能となる。転写させる外来遺伝子としては、花色香りに関連した遺伝子があるが、これらに限られるものではない。

図面の簡単な説明

0018

SFL205の概略図。
シソ3AT遺伝子導入用バイナリーベクターpSPB3311の概略図。

0019

本発明の転写調節領域としては、例えば、配列番号1に示す塩基配列から成る核酸が挙げられる。しかしながら、配列番号1に示す塩基配列から成る核酸において数個(1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個)の塩基の付加、欠失及び/又は置換によって修飾された塩基配列から成るプロモーターも、元のプロモーターと同様の活性を維持していると考えられる。従って、本発明は、花弁で転写調節領域として機能する限り、配列番号1に示す塩基配列に対して1個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び/又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸にも関する。

0020

本発明は、さらに、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、又はシソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸にも関する。

0021

これらの核酸として、配列番号1に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号1に示す塩基配列と好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、最も好ましくは約99%の塩基配列同一性を有する塩基配列から成る核酸が挙げられる。
ここで、ストリンジェンシー条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的に求められるものである。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性DNAの再アニールする能力に依存する。具体的には、例えば、低ストリンジェンシー条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルター洗浄段階において、37℃〜42℃の温度条件下、5×SSC及び0.1%SDS溶液中で洗浄することなどが挙げられる。また、高ストリンジェンシー条件としては、例えば、洗浄段階において、65℃、0.1×SSC、0.1%SDS溶液中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェンシー条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。

0022

本発明は、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域を含む発現ベクター又は発現カセット、及び該発現ベクター又は発現カセットにより形質転換された非ヒト宿主にも関する。
明細書中、「発現カセット」とは、任意の核酸にプロモーターとターミネーターを連結したDNA断片をいう。
さらに、本発明は、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域を有用な外来遺伝子に連結し、該遺伝子を導入して得られる色変わりなどの有用な形質をもつ植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織、特に、花弁、切り花に関する。形質転換可能である植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメンラントルコギキョウフリージアガーベラグラジオラスカスミソウ、カランコエユリペラルゴニウムゼラニウム、ペチュニア、トレニアチューリップ、イネ、オオムギ小麦ナタネポテトトマトポプラバナナユーカリサツマイモ、タイズ、アルファルファルーピン、トウモロコシなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
本発明は、上記切り花を用いた加工品(切り花加工品)にも関する。ここで、切り花加工品としては、当該切り花を用いた押し花ブリザーブドフラワー、ドライフラワー樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。

0023

本明細書中、用語「キク植物(単に「キク」ともいう)」とは、キク科(Asteraceae)のキク属(Chrysanthemum)の植物を意味し、代表的な種としてはキク(Chrysanthemum morifolium)が挙げられる。

0024

以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
分子生物学的手法は特に断らない限り、Molecular Cloning(Sambrook and Russell, 2001)に依った。
実施例1:シソアントシアニン3−アシル基転移酵素染色体遺伝子クローニング
シソにはアントシアニンを葉に蓄積する赤い変種と蓄積しない緑色の変種が知られている。前者の葉から、その染色体DNAを、報告されている方法(Plant Mol Biol. December 1997; 35(6):915-27参照)で調製した。この染色体DNAをSau3AI(TOYOBO社製)で部分分解し、ショ糖密度勾配法により10〜15kbのDNA断片を含む画分を回収した。この断片を、公知の方法を用いてラムダファージベクター一種であるEMBL3(Promega社製)のBamHI部位に挿入することにより、染色体DNAライブラリーを作製した。得られたライブラリーをシソに由来するアントシアニン3−アシル基転移酵素のcDNAであるpSAT208(Plant Cell Physiol. April 2000; 41(4):495-502参照)をプローブとして用いてスクリーニングした。ライブラリーのスクリーニングは、既に報告されている方法(Plant Cell Physiol. July 1996; 37(5):711-6参照)に拠った。プローブとハイブリダイズしたプラーク純化後、培養し、得られたファージからDNAを調製した。

0025

実施例2:シソアントシアニン3−アシル基転移酵素染色体遺伝子の塩基配列決定
上記で得たDNA10μgをXbaIで消化し、0.7%アガロースゲルで分離した後、ハイボンドN(アマシャム社製)にブロットした。この膜を上記と同じようにハイブリダイズしたところ、約6.8kbのDNA断片がプローブとハイブリダイズすることがわかった。同じDNA20μgをXbaIで消化し、0.7%アガロースゲルで分離した後、約6.8kbのDNA断片を、ジーンクリーンを用いて精製し、XbaIで消化したpBluscriptSKII-と連結した。得られたプラスミドをpSPB513とした。このプラスミドに含まれるシソ由来のDNA配列をプライマーウォーキング法により決定した。その塩基配列を配列番号4に示す。この配列には、アントシアニン3−アシル基転移酵素cDNAであるpSAT208と高い相同性を示す領域があり、この領域がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列番号6)は、pSAT208のコードするアミノ酸配列と比べて19個のアミノ酸残基の置換と2個のアミノ酸の欠失が見られ、イントロンは観察されなかった。また、上記pSAT208と高い相同性を示す領域を含む配列は、その開始コドンと考えられるATGの上流に3438bpの配列と、その終止コドンと考えられるTAAの下流に2052bpの配列を含んでいた。上記3438bpの配列内には、アントシアニン3−アシル基転移酵素ではない別のオープンリーディングフレーム(ORF、配列番号5)が存在した。この部分を除く、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域を増幅するために、以下の実験を行った。

0026

実施例3:シソアントシアニン3−アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域の増幅
1ngのpSPB513を鋳型として2種のプライマー(5’-AAGCTTAACTATTATGATCCCACAGAG-3’(配列番号7、下線部はHindIIIの認識配列)、5’-GGATCCGGCGGTGTTGAACGTAGC-3’(配列番号8、下線部はBamHIの認識配列)を用いて、PCR(95℃1分間保持後、52℃1分間、72℃2分間、95℃1分間からなる反応を25サイクル)を行なった。増幅された約1.1kbのDNA断片をHindIIIとBamHIで消化した。
特許文献4に記載されたプラスミドpSPB567(エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイク35Sプロモーターの3'側にパンジー由来のF3'5'H遺伝子が連結され、さらにその3'側にノパリンシンターゼのターミネーターが連結されている)をPacIで消化し、パンジー由来のF3'5'H遺伝子を含むDNA断片をpBin+(Transgenic Research 4, 288-290, 1995参照)のPacI部位にクローニングした。得られたプラスミドの内、エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイク35SプロモーターがpBin+のAscI部位の近くにあるところのプラスミドをpSPB575とした。このプラスミドをHindIIIとBamHIで消化し、ここに前記したシソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域を含む約1.1kbのDNA断片を、HindIIIとBamHIで消化したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpSFL205とした(図1参照)。

0027

pSFL205をHindIIIとSacIで消化して、約100bpのDNA断片を回収した。このDNA断片と、pSPB513をSacIとXbaIで消化して得られる約4kbのDNA断片と、HindIIIとXbaIで消化したプラスミドpBin+とを連結して、プラスミドpSPB3311を得た(図2参照)。このプラスミドpSPB3311は、配列番号2に示す塩基配列を含むバイナリーベクターとなっていて、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域と該遺伝子の翻訳領域とその3'側の非翻訳領域を含む。

0028

実施例4:シソアントシアニン3−アシル基転移酵素染色体遺伝子のペチュニアでの発現
実施例3で得られたプラスミドpSPB3311(バイナリーベクター)を、リーフディスクを用いるアグロバクテリウム法で、ペチュニア品種バカラレッド(サカタタネ社製)に形質転換し、約20系統形質転換体を得た。形質転換は公知の方法(Plant J. 1994, 5, p. 81)に拠った。また、同様に、特許文献1に記載されているpBELA11(ラベンダーアントシアニン3−アシル基転移酵素遺伝子を植物で発現させるためのバイナリーベクター、エンハンサーを繰り返したカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターとノパリンシンターゼ由来ターミネーターの間にラベンダーのアントシアニン3−アシル基転移酵素cDNAが挿入されている)で、ペチュニア品種バカラレッド(サカタのタネ)を形質転換して、約20系統の形質転換個体を得た。
上記2種のバイナリーベクター(pSPB3311又はpBELA11)を含むアグロバクテリウムを用いて形質転換したペチュニアの花の色は、形質転換前のバカラレッドに比較して相対的に薄い赤色をしていた。それぞれ代表的な組換えペチュニアをそれぞれPT266-7, PT267-1とした。これらのペチュニア花弁のアントシアニンを特許文献4に記載された方法で分析した。組換えペチュニアの花弁では、宿主に比べ高速液体クロマトグラフィーの保持時間が長いアントシアニン量が増加していて、これらの吸収スペクトルは310nm付近に肩が観察された。これは、組換えペチュニアでは芳香族アシル基が結合したと考えられるアントシアニン量が増加したことを示しており、導入したシソあるいはラベンダーのアントシアニン3アシル基転移酵素遺伝子がペチュニアにおいて機能したことを示す。
さらにLC-FT-ICR-MSの手法(J. Japan. Soc. Hort. Sci. 77:94-102 (2008), Plant J. 54:949-962)により宿主と組換えペチュニアのアントシアニンを分析した。この手法を用いるとアントシアニンの精密マススペクトルを測定でき、タンデム質量分析によりMS/MSスペクトルを得ることができる。PT266-7, PT267-1では、宿主には見られないシアニジン(クマロイル)グルコシド〔m/z 595.143717, MS/MS 287〕、デルフィニジン(クマロイル)グルコシド〔m/z 611.139648, MS/MS 303.1〕、ペオニジン(クマロイル)グルコシド〔m/z 609.161119, MS/MS 303.1〕に一致する分子量とMS/MSスペクトルを示すアントシアニンが検出された(〔〕内にm/z と MS/MS のm/zを示した)。

0029

アントシアニンの合成に関わる酵素遺伝子はペチュニアの花弁の発育段階に従い転写量が変化することが知られている。例えば、ペチュニアの花弁の生育段階を5つに分け、各段階での花弁でのフラボノイド3'5'-水酸化酵素遺伝子の発現量を調べると、この遺伝子はペチュニアの花弁が開花し始める段階から開花間もない段階で強く発現し、成熟した花弁では発現量が減少する(PCT/AU92/00334参照)。一方、構成的なプロモーターが制御する遺伝子は、花弁の発育段階に係わらず、一定の発現量をもたらす。
pSPB3311を導入したペチュニアの花弁を同様に5段階に分け、シソのアントシアニン3アシル基転移酵素遺伝子の発現を調べたところ、花弁が開花し始める段階から開花間もない段階で強く発現し、成熟した花弁では発現量が減少していた。一方、pBELA11を導入したペチュニアは、生育段階に係わりなく、一定の転写物の量を示した。以上の結果から、シソ由来のアントシアニン3−アシル基転移酵素転写制御領域は、シソとは異種のペチュニアで構造遺伝子を転写させることができること、そしてその転写はアントシアニン生合成酵素の遺伝子と並行していることが示され、花の色を変化させるためにこのような転写調節領域は有用であることが明らかとなった。換言すれば、本実施例において、シソ由来のアントシアニン3−アシル基転移酵素の染色体遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域は、花弁あるいはアントシアニンが蓄積する器官で、アントシアニンの構造を変える、すなわち花の色を変えるために必要なレベルで機能することが示され、これらは人為的に異種の遺伝子を発現させるために有用であることを意味している。

実施例

0030

実施例5:シソアントシアニン3−アシル基転移酵素転写調節領域のバラでの発現
図1に示すpSFL205を、バラ品種ラバンデに導入し、27系統の組換えバラ植物体を取得した。バラの形質転換に関してはすでに多くの方法が報告されており(例えば、Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-888 (1994)、米国特許第5480789号、同第5792927号、EP536327A1号公報、米国特許公開第20010007157A1号公報参照)、これらの方法に従って形質転換を実施できる。
具体的にはAgrobacterium tumefaciens Agl0株(Lazo et al. Bio/Technology 9: 963-967, 1991)の菌液中に、無菌の葉から誘導したバラのカルスを5分間浸し、滅菌濾紙で余分な菌液を拭き取った後、継代用培地移植し、2日間暗所共存培養した。
その後、カルベニシリンを400mg/l 加えたMS液体培地で洗浄し、継代用培地にカナマイシン50mg/l とカルベニシリン200mg/lを加えた選抜除菌培地へ移植した。選抜培地上で生育阻害を受けず、正常に増殖する部分の移植と培養を繰り返し、カナマイシン耐性カルスを選抜した。
カナマイシン耐性を示した形質転換カルスを、カナマイシン50mg/l、カルベニシリン 200mg/lを添加した再分化用の培地で培養し、カナマイシン耐性シュートを得た。得られたシュートは1/2MS培地発根させた後、馴化を行った。馴化個体は鉢上げ後、閉鎖系温室で栽培して開花させた。
バラ花弁に含まれるアントシアニジンの量は次のように測定した。凍結乾燥した花弁0.5gを、4mlの0.1%TFAを含む50%アセトニトリル(CH3CN)中で20分間、超音波下で抽出し、0.45μmのフィルターで濾過した。上記濾液0.2mlをガラス試験管中で減圧乾固し、0.2mlの6N塩酸(HCl)に溶解し、100℃で20分間、加水分解を行った。分解後のアントシアニジンは0.2mlの1-ペンタノールで抽出し、有機層HPLCで以下の条件により分析した。カラムODS-A312(6mmφx15cm、ワイエムシー株式会社)を用い、移動相としてAcOH:MeOH:H2O=15:20:65の溶液を用い、流速1ml/minで溶出した。検出はフォトダイオードアレイ検出器SPD-M10A(島津製作所)で600-400nmのスペクトルを測定し、吸収極大(λmax)及びリテンションタイム(R.T.)で同定し、520nmの吸光度面積で定量した。このHPLC条件下でデルフィニジン及びシアニジンのR.T.及びλmaxは、それぞれ、4.0分と5.2分、及びび534nmと525nmであった。同定と定量には、フナコシ株式会社より購入したデルフィニジン塩酸塩及びシアニジン塩酸塩を標品として用いた。
組換えバラ花弁に含まれるデルフィジン含有率(総アントシアニジン量の中のデルフィニジンの割合)は最高51%で平均は20.5%であった。この結果は、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素転写調節領域が、シソとは異種の植物において目的の遺伝子を転写させることができることを示している。

0031

アカジソの葉で酵素遺伝子の転写をつかさどっていると考えられるプロモーター領域、すなわち、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域が異種であるペチュニアとバラの花弁で転写調節領域として機能しうることが分かった。したがって、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域を利用して、花などのアントシアニンが蓄積する組織内で特異的に外来遺伝子の転写を起こさせることが可能となる。転写させる外来遺伝子としては、花色、香りに関連した遺伝子があるが、これらに限られるものではない。

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