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技術 プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法

出願人 味の素株式会社
発明者 浅原貴之松野潔森由起子
出願日 2007年4月17日 (14年0ヶ月経過) 出願番号 2008-513147
公開日 2009年9月10日 (11年8ヶ月経過) 公開番号 WO2007-125783
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物、その培養処理 微生物による化合物の製造
主要キーワード 可逆過程 プリン骨格 キサンチル酸 列重み リングセグメント 大豆蛋白加水分解物 イノシンモノリン酸 下流域
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課題・解決手段

プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼ酵素活性が低下したバチルス属細菌培地中で培養し、該培地中または菌体内にプリン系物質を生成蓄積させ、同培地中又は菌体内からプリン系物質を回収することにより、プリン系物質を製造する。

概要

背景

発酵法によるイノシンおよびグアノシン生産に関しては、アデニン要求株、またはそれにプリンアナログをはじめとする各種の薬剤に対する耐性を付与したバチルス属微生物(特許文献1〜8参照)、およびブレビバクテリウム属の微生物(特許文献9、10又は非特許文献1参照)等を用いる方法が知られている。

このような変異株を取得するには、従来、微生物に紫外線照射ニトロソグアニジン(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)処理などの変異誘起処理を行い、適当な選択培地を用いて、目的とする変異株を取得するという方法が行われてきた。

一方で、遺伝子工学技術を用いたプリン系物質生産株育種もバチルス属の微生物(特許文献11〜20参照)、ブレビバクテリウム属の微生物(特許文献21参照)、およびエシェリヒア属の微生物(特許文献22参照)で行われている。具体的には、例えば、プリンオペロンリプレッサータンパク質遺伝子(purR)が破壊されたバチルス属細菌を用いて、ヒポキサンチンウラシルグアニン及びアデニン等の核酸物質を効率よく製造する方法(特許文献23参照)が開示されている。

バチルスズブチリスでは、前記リプレッサータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、AMP生合成関与するpurA遺伝子(非特許文献2参照)、ホルミルテトラヒドロ葉酸生合成に関与するglyA遺伝子(非特許文献3参照)およびヒポキサンチン/グアニンのトランスポーターをコードするpbuG遺伝子(非特許文献4参照)などの発現を調節することが知られている。

さらに、purR遺伝子破壊に加えて、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子(purA)を破壊してアデニン要求性を付与すること、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(deoD)を破壊して、イノシンのヒポキサンチンへの分解を抑制することによって、イノシンを効率的に製造する微生物、及びそれを用いたイノシンの製造法が開示されている(特許文献8参照)。

トランスアルドラーゼは、ペントースリン酸経路の一つであり、セドヘプツロース7−リン酸とD−グリセルアルデヒド3−リン酸からD−エリトロース4−リン酸とD−フルクトース6−リン酸を生成する可逆反応触媒する酵素である。この酵素とプリン系物質の生合成経路との関係はあまり知られておらず、同酵素活性を低下させてプリン系物質生産菌を育種するという試みはなされていなかった。
特公昭38−23099号公報
特公昭54−17033号公報
特公昭55−2956号公報
特公昭55−45199号公報
特公昭57−14160号公報
特公昭57−41915号公報
特開昭59−42895号公報
特開2004−242610号公報
特公昭51−5075号公報
特公昭58−17592号公報
特開昭58−158197号公報
特開昭58−175493号公報
特開昭59−28470号公報
特開昭60−156388号公報
特開平1−27477号公報
特開平1−174385号公報
特開平3−58787号公報
特開平3−164185号公報
特開平5−84067号公報
特開平5−192164号公報
特開昭63−248394号公報
国際公開第99/03988号パンフレット
米国特許第6,284,495号
Agric.Biol.Chem., 1978, 42, 399-405
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 7455-7459
J. Bacteriol., 2001, 183, 6175-6183
J. Bacteriol., 2003, 185, 5200-5209

概要

プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下したバチルス属細菌培地中で培養し、該培地中または菌体内にプリン系物質を生成蓄積させ、同培地中又は菌体内からプリン系物質を回収することにより、プリン系物質を製造する。

目的

本発明は、発酵法によってプリンヌクレオシド及び/又はプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を製造するために好適なバチルス属細菌を創製すること、及び同細菌を用いたプリン系物質の製造法を提供することを課題とする。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

請求項2

前記プリン系物質がイノシンキサントシングアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである請求項1に記載のバチルス属細菌。

請求項3

前記プリン系物質がイノシン酸キサンチル酸グアニル酸、及びアデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである請求項1に記載のバチルス属細菌。

請求項4

前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子を破壊すること、または、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させることにより、トランスアルドラーゼ活性が低下した請求項1〜3のいずれか一項に記載のバチルス属細菌。

請求項5

前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子が下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードする遺伝子である請求項4に記載のバチルス属細菌。(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個アミノ酸残基置換欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質。

請求項6

さらにフルクトースビスフォスファターゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載のバチルス属細菌。

請求項7

さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載のバチルス属細菌。

請求項8

さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項に記載のバチルス属細菌。

請求項9

プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるpurR遺伝子が破壊されたことにより、プリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする請求項8に記載のバチルス属細菌。

請求項10

さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載のバチルス属細菌。

請求項11

さらに、IM脱水素酵素活性が低下するように改変されたことを特徴とする請求項1〜10に記載のバチルス属細菌。

請求項12

バチルス属細菌がバチルスズブチリスである請求項1〜11のいずれか一項に記載のバチルス属細菌。

請求項13

請求項1〜12のいずれか1項に記載のバチルス属細菌を培地に培養して、同細菌の細胞内又は培地中にプリン系物質を蓄積せしめ、同細胞又は培地からプリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法

請求項14

プリン系物質がプリンヌクレオシド又はプリンヌクレオチドである、請求項13に記載の方法。

請求項15

前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである請求項14に記載の方法。

請求項16

前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、及びアデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである請求項14に記載の方法。

請求項17

請求項15に記載の方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸フェニル燐酸、及びカルバミル燐酸からなる群より選択される燐酸供与体と、ヌクレオシド−5’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物又は酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。

技術分野

0001

本発明は5’−イノシン酸および5’−グアニル酸を代表とするプリンヌクレオチド、並びにこれらの合成原料として重要な物質であるイノシンおよびグアノシン等のプリンヌクレオシド、などのプリン系物質製造法、及びそれに用いられるバチルス属細菌に関する。プリン系物質は、調味料医薬並びにそれらの原料等として有用である。

背景技術

0002

発酵法によるイノシンおよびグアノシンの生産に関しては、アデニン要求株、またはそれにプリンアナログをはじめとする各種の薬剤に対する耐性を付与したバチルス属微生物(特許文献1〜8参照)、およびブレビバクテリウム属の微生物(特許文献9、10又は非特許文献1参照)等を用いる方法が知られている。

0003

このような変異株を取得するには、従来、微生物に紫外線照射ニトロソグアニジン(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)処理などの変異誘起処理を行い、適当な選択培地を用いて、目的とする変異株を取得するという方法が行われてきた。

0004

一方で、遺伝子工学技術を用いたプリン系物質生産株育種もバチルス属の微生物(特許文献11〜20参照)、ブレビバクテリウム属の微生物(特許文献21参照)、およびエシェリヒア属の微生物(特許文献22参照)で行われている。具体的には、例えば、プリンオペロンリプレッサータンパク質遺伝子(purR)が破壊されたバチルス属細菌を用いて、ヒポキサンチンウラシルグアニン及びアデニン等の核酸系物質を効率よく製造する方法(特許文献23参照)が開示されている。

0005

バチルスズブチリスでは、前記リプレッサータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、AMP生合成関与するpurA遺伝子(非特許文献2参照)、ホルミルテトラヒドロ葉酸生合成に関与するglyA遺伝子(非特許文献3参照)およびヒポキサンチン/グアニンのトランスポーターをコードするpbuG遺伝子(非特許文献4参照)などの発現を調節することが知られている。

0006

さらに、purR遺伝子破壊に加えて、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子(purA)を破壊してアデニン要求性を付与すること、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(deoD)を破壊して、イノシンのヒポキサンチンへの分解を抑制することによって、イノシンを効率的に製造する微生物、及びそれを用いたイノシンの製造法が開示されている(特許文献8参照)。

0007

トランスアルドラーゼは、ペントースリン酸経路の一つであり、セドヘプツロース7−リン酸とD−グリセルアルデヒド3−リン酸からD−エリトロース4−リン酸とD−フルクトース6−リン酸を生成する可逆反応触媒する酵素である。この酵素とプリン系物質の生合成経路との関係はあまり知られておらず、同酵素活性を低下させてプリン系物質生産菌を育種するという試みはなされていなかった。
特公昭38−23099号公報
特公昭54−17033号公報
特公昭55−2956号公報
特公昭55−45199号公報
特公昭57−14160号公報
特公昭57−41915号公報
特開昭59−42895号公報
特開2004−242610号公報
特公昭51−5075号公報
特公昭58−17592号公報
特開昭58−158197号公報
特開昭58−175493号公報
特開昭59−28470号公報
特開昭60−156388号公報
特開平1−27477号公報
特開平1−174385号公報
特開平3−58787号公報
特開平3−164185号公報
特開平5−84067号公報
特開平5−192164号公報
特開昭63−248394号公報
国際公開第99/03988号パンフレット
米国特許第6,284,495号
Agric.Biol.Chem., 1978, 42, 399-405
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 7455-7459
J. Bacteriol., 2001, 183, 6175-6183
J. Bacteriol., 2003, 185, 5200-5209

発明が解決しようとする課題

0008

本発明は、発酵法によってプリンヌクレオシド及び/又はプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を製造するために好適なバチルス属細菌を創製すること、及び同細菌を用いたプリン系物質の製造法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

0009

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、バチルス属細菌において、ペントースリン酸経路のトランスアルドラーゼの酵素活性を低下させることによって、プリンヌクレオシドやプリンヌクレオチドの生産能が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。

0010

(1)プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変されたバチルス属細菌。
(2)前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである前記バチルス属細菌。
(3)前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである前記バチルス属細菌。
(4)前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子を破壊することまたは、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させることにより、トランスアルドラーゼ活性が低下した前記バチルス属細菌。
(5)前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子が下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードする遺伝子である前記バチルス属細菌。
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個アミノ酸残基置換欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、トランスアルドラーゼ酵素活性を有するタンパク質。
(6)さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
(7)さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
(8)プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるpurR遺伝子が破壊されたこと、または、プリンオペロンのアテニュエーター領域の一部が除去されたことにより、プリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする前記バチルス属細菌。
(9)さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌
(10)さらにフルクトース−ビスフォスファターゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
(11)さらに、IM脱水素酵素活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
(12)バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである前記バチルス属細菌。
(13)前記バチルス属細菌を培地に培養して、同細菌の細胞内又は培地中にプリン系物質を蓄積せしめ、同細胞又は培地からプリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法。
(14)プリン系物質がプリンヌクレオシド又はプリンヌクレオチドである、前記方法。
(15)前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである前記方法。
(16)前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、及びアデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである前記方法。
(17)前記方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸フェニル燐酸、及びカルバミル燐酸からなる群より選択される燐酸供与体と、ヌクレオシド−5’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物又は酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。

0011

<1>本発明のバチルス属細菌
(I)プリン系物質生産能の付与
本発明のバチルス属細菌は、プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変されたバチルス属細菌である。

0012

「プリン系物質」とはプリン骨格を含む物質をいうが、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドなどが挙げられる。プリンヌクレオシドには、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンなどが含まれ、プリンヌクレオチドには、プリンヌクレオシドの5’−燐酸エステル、例えばイノシン酸(イノシン−5’−リン酸以下「IMP」ともいう)、キサンチル酸(キサントシンー5’−リン酸 以下「XMP」ともいう)、グアニル酸(グアノシン−5’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう)、アデニル酸(アデノシン−5’−モノリン酸以下「AMP」ともいう)などが含まれる。

0013

「プリン系物質生産能」とは、本発明のバチルス属細菌を培地中で培養したときに、プリン系物質を細胞又はまたは培地から回収できる程度に細胞内または培地中に生成、分泌、蓄積できる能力をいう。なお、本発明のバチルス属細菌は、上記プリン系物質のうちの2種類以上の生産能を有するものであってもよい。

0014

プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌としては、本来的にプリン系物質生産能を有するものであってもよいが、以下に示すようなバチルス属細菌を、変異法や組換えDNA法を利用して、プリン系物質生産能を有するように改変することによって得られるものでもよい。また、後述するようにしてトランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変することによってプリン系物質生産能が付与又は増強されたバチルス属細菌であってもよい。

0015

尚、本発明において、「酵素活性が低下する」とは、前記トランスアルドラーゼ、又は後述するプリン系物質を分解する酵素、イノシンモノリン酸(IMP)脱水素酵素等の酵素活性が、非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌における活性よりも低いこと、及び、活性が実質的に消失していることを含む。また、後述するプリンオペロンリプレッサーの活性についても同様である。

0016

本発明のバチルス属細菌を得るために用いられるバチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス等が挙げられる。
バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス168 Marburg(ATCC6051)、バチルス・ズブチリスPY79(Plasmid, 1984, 12, 1-9)等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスT(ATCC23842)、及びバチルス・アミロリケファシエンスN(ATCC23845)等が挙げられる。また、バチルス・プミルスとしては、バチルス・プミルス Gottheil No.3218(ATCC No.21005)(米国特許第3,616,206号)等が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャーコレクション(American Type Culture Collection)、住所P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America)から入手することができる。

0017

プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌は、上記のようなバチルス属細菌に、例えば、プリンヌクレオシド要求性、又はさらにプリンアナログ等の薬剤に対する耐性を付与することにより、取得することが出来る(特公昭38−23099、特公昭54−17033、特公昭55−45199、特公昭57−14160、特公昭57−41915、特公昭59−42895参照)。栄養要求性及び薬剤耐性を持つバチルス属細菌は、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)、またはEMS(エチルメタンスルフォネート)等の通常の変異処理に用いられている変異剤による処理によって取得することが出来る。

0018

プリンヌクレオシドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
バチルス属に属するイノシン生産株の具体例として、バチルス・ズブチリスKMBS16株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするpurR遺伝子の欠損(purR::spc)、スクシニル−AMPシンターゼをコードするpurA遺伝子の欠損(purA::erm)、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子の欠損(deoD::kan)が導入された、既知のバチルス・ズブチリスtrpC2株(168 Marburg)の誘導体である(特開2004−242610、US2004166575A1)。また、バチルス・ズブチリス菌株AJ3772(FERM P−2555)(特開昭62−014794)等を使用することもできる。

0019

グアノシン生産能を有するバチルス属細菌としては、IMP脱水素酵素の活性が上昇したバチルス属細菌(特開平3−58787)、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性遺伝子が組み込まれているベクターをアデニン要求性変異株に導入したバチルス属細菌(特公平4−28357)等が挙げられる。

0020

またプリンヌクレオチドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている(Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259)。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ5’−グアニル酸(グアノシン−5’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう)生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる(特公昭56−12438号公報)。

0021

また、キサンチル酸生産菌は、コリネバクテリウムアンモニアゲネス(Corynebacterium ammmoniagenes)を中心とするコリネ型細菌の育種に用いた方法を使用して構築することができる。例えば、PRPP amidotransferaseを強化株(特開平8-168383)、脂肪族アミノ酸耐性株(特開平4-262790)、デヒドロプロリン耐性株(韓国特許公開公報2003-56490)を取得することによって、キサンチル酸生産菌を構築することができる。

0022

また、プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌を育種する方法として、以下の方法が挙げられる。プリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドに共通のプリン生合成に関与する酵素、すなわちプリン生合成酵素の細胞内での活性を上昇させる方法が挙げられる。該酵素の細胞内での活性は、バチルス属細菌の非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌よりも上昇させることが好ましい。「活性が上昇する」とは、例えば、細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。例えば、前記酵素の遺伝子の発現量を上昇させることにより活性を上昇させることができる。 前記プリン生合成に関与する酵素としては、たとえばホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ(PRPP synthetase [EC:2.7.6.1])などが挙げられる

0023

ペントースリン酸系に取り込まれたグルコースなどの糖源が代謝により生成したカタボライトの一部は、リブロース−5−リン酸を経由して、リボース−5−リン酸となる。生合成されたリボース−5−リン酸より、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成の不可欠な前駆物質であるホスホリボシルピロリン酸(PRPP)が生成される。具体的には、リボース−5−リン酸は、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼによりPRPPに転換される。したがって、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇するように改変することにより、バチルス属細菌にプリン系物質生産能を付与又は増強することができる。

0024

「ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇する」とは、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性は例えば、Switzer等の方法(MethodsEnzymol., 1978, 51, 3-11)、Roth等の方法(Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17)により、測定することができる。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇したバチルス属細菌は、例えば、特開2004−242610号公報に記載の方法と同様にして、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子をバチルス属細菌で高発現させることにより作製することができる。本発明に利用出来るホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子は、配列番号3に記載のバチルス属細菌由来のprs遺伝子(Genbank Accession No. X16518)が挙げられるが、他の細菌由来の遺伝子、動植物由来の遺伝子でもバチルス属でホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば、何れも用いることが出来る。

0025

一方、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成に不可欠な前駆物質であるPRPPが生成されると、その一部は、プリン生合成に関与する酵素群によりプリンヌクレオチド、プリンヌクレオシドへと変換される。そのような酵素群をコードする遺伝子としては、バチルス・ズブチリスのプリンオペロン、具体的にはpurEKB−purC(orf)QLF−purMNH(J)−purDオペロンの遺伝子(Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87)(現在では、purEKBCSQLFMNHDとも呼ばれる:Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASMPress, Washington D.C., 2002。Genbank Accession No.NC_000964)、およびエシェリヒアコリのpurレギュロンの遺伝子(Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996)が例示される。

0026

したがって、これらの遺伝子の発現を増強することにより、プリン系物質生産能を付与又は増強することもできる。なお、本発明に用いることが出来るプリンオペロン遺伝子はこれらのものには限定されず、他の微生物や動植物由来の遺伝子も利用することも出来る。

0027

プリンオペロンの発現量を増大させる方法としては、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、プリンオペロン遺伝子をバチルス属細菌で高発現させる方法が挙げられる。

0028

プリンオペロンの発現量を増大させる第2の方法として、プリンオペロン固有プロモーターをより強力なプロモーターに置換することや、固有のプロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に置換することが挙げられる。

0029

例えば、バチルス・ズブチリス(B. subtilis 168 Marburg株;ATCC6051)では、プリンオペロンの−35配列はコンセンサス配列(TTGACA)であるが、−10配列はTAAGATであり、コンセンサス配列TATAATとは異なっている(Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274−8287)。したがって、−10配列(TAAGAT)をコンセンサス配列あるいはコンセンサス配列に近づけることにより、TATAAT、またはTATGAT、もしくはTAAAATとなるように改変することで、プリンオペロンの転写活性を上昇させることができる。なお、プロモーター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様の方法で行うことが出来る。

0030

プリンオペロンの発現量を増大させる第3の方法として、プリンオペロンのリプレッサーの発現量を低下させる方法も挙げられる(USP6,284,495号)。「プリンオペロンのリプレッサーの発現」とは、プリンオペロン遺伝子の転写、及び転写産物翻訳の両方を含む。また、「発現量を低下させる」とは、発現量が、非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌における発現量よりも低いこと、及び、発現が実質的に消失していることを含む。

0031

プリンペオペロンのリプレッサー(プリンリプレッサー)の発現量を低下させるためには、例えば、バチルス属細菌を紫外線照射またはNTGもしくはEMS等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、プリンリプレッサーの発現量が低下した変異株を選択する方法を採用することができる。

0032

また、プリンリプレッサーの発現量が低下したバチルス属細菌は、変異処理の他に、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202)により、染色体上のプリンリプレッサーをコードする遺伝子(purR;GenBankAccessionNC_000964(コード領域は塩基番号54439〜55293;配列番号5)を、正常に機能しない遺伝子(以下、「破壊型遺伝子」ということがある)で置換することによって得ることができる。

0033

破壊型遺伝子で、宿主染色体上の正常遺伝子を置換するには、例えば以下のようにすればよい。なお、以下の例では、purR遺伝子を例として説明するが、他の遺伝子、例えば後述のpurA、deoD、guaB、fbp又はywjH遺伝子についても、同様にして遺伝子破壊を行うことができる。

0034

染色体上の配列と相同性を有する配列を持ち、バチルス属細菌内で複製できないプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることがある。このような菌株を選択することにより、染色体上の正常なpurR遺伝子が破壊型purR遺伝子に置換された菌株を取得することができる。

0035

このような相同組換えによる遺伝子破壊技術は既に確立しており、直鎖DNAを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたpurR遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製できないプラスミドを用いることによっても、purR遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体DNA中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のpurR遺伝子配列と染色体上のpurR遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することができる。

0036

遺伝子破壊に用いる破壊型purR遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によりpurR遺伝子の一定領域を欠失させたり、purR遺伝子へ他のDNA断片(マーカー遺伝子等)を挿入したり、部位特異的変異法(Kramer, W. and Fritz, H. J., MethodsEnzymol., 1987, 154, 350-367)またはリコンビナントPCR法PCRTechnology, Stockton Press (1989))や次亜硫酸ナトリウムヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理(Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 2170-2174)によって、purR遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の中に1つまたは複数個塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさたりして、コードされるリプレッサーの活性が低下したか、又はpurR遺伝子の転写が低下したものを選択することにより、取得することができる。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりpurR遺伝子の一定領域を欠失させる方法、又はpurR遺伝子へ他のDNA断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。欠失させるpurR遺伝子の一定領域は、purR遺伝子の5’末端側、内部、3’末端側のいずれであってもよいが、purR遺伝子の全長の90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上であると、リプレッサーの活性が低下する確実性が高くなる。また、purR遺伝子のコード領域中に塩基を欠失又は挿入させ、フレームシフト変異を起こさせる場合は、複数箇所で塩基の欠失又は挿入を起こさせること、及び、3’末端側で塩基の欠失又は挿入を起こさせることが、リプレッサーの活性を確実に低下させ得る点で好ましい。

0037

また、プリンリプレッサーの活性の低下は、上記の遺伝子破壊による以外に、通常の変異処理法によって、染色体上のpurR遺伝子に、細胞中のプリンリプレッサーの活性が低下するような変異を導入すればよい。例えば、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換ミスセンス変異)を導入すること、また終始コドンを導入すること(ナンセンス変異)、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る。また、染色体上のpurR遺伝子にトランスポゾンを挿入することによっても、リプレッサーの活性を低下させることができる。

0038

また、プリンリプレッサーの活性の低下は、染色体DNA上のpurR遺伝子のプロモーター等の発現調節配列微弱なものに置換することによっても達成される。プロモーターの強度は、RNA合成開始の頻度により定義される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128)等に記載されている。また、国際公開W000/18935に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より微弱なものに改変することも可能である。さらに、リボソーム結合部位(RBS)と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNA翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られている。このRBSの改変は、目的遺伝子の転写を減少させることと組み合わせてもよい。

0039

更に、purR遺伝子より転写されたメッセンジャーRNA不安定化するような変異を導入した組換えDNAを作製し、これをバチルス属細菌宿主に導入して形質転換してもよい。
後述のpurA、deoD、guaB、fbp又はywjH遺伝子についても、上記と同様にしてコードされる酵素の活性を低下させることができる。

0040

なお、purR遺伝子は、プリンオペロンを持つ微生物の染色体DNAから、公知のpurR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドプライマーとするPCR法によって取得することができる。また、プリンオペロンを持つ微生物の染色体DNAライブラリーから、公知のpurR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、purR遺伝子を取得することができる。バチルス・ズブチリス168 Marburg株では、purR遺伝子の塩基配列が報告されている(GenBankaccession No.D26185(コード領域は塩基番号118041〜118898)、NC_000964(コード領域は塩基番号54439〜55296))。purR遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を、配列表の配列番号5及び6に示す(特開2004−242610号参照)。

0041

purR遺伝子を得るためのPCRに用いるプライマーとしては、purR遺伝子の一部あるいは全長を増幅することができるものであればよく、具体的には配列番号17(GAAGTTGATGATCAAAA)及び配列番号18(ACATATTGTTGACGATAAT)に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。

0042

破壊型遺伝子の作製に用いるpurR遺伝子は、必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。また、各遺伝子の取得に用いる微生物は、同遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いるバチルス属細菌のpurR遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば特に制限されない。しかし、通常は、目的とするバチルス属細菌と同じ細菌に由来する遺伝子を用いることが好ましい。

0043

前記マーカー遺伝子としては、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子テトラサイクリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。エンテロコッカスフェカリス(Enterococcus faecalis)由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子は、バチルスジェネチックストックセンター(BGSC)より市販されているエシェリヒア・コリECE101株から、プラスミドpDG1726を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。スタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureus)のエリスロマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター(BGSC)より市販されているエシェリヒア・コリECE91株から、プラスミドpDG646を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。カナマイシン耐性遺伝子は、ストレプトコッカス・フェカリス(Streptococcus faecalis)由来カナマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター(BGSC)より市販されているエシェリヒア・コリ ECE94株から、プラスミドpDG783を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。さらに、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)のクロラムフェニコール耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター(BGSC)より市販されているバチルス・ズブチリス1E17株から、プラスミドpC194を調製し、該プラスミドを鋳型としてPCRにより増幅することで、取得することができる。ストレプトコッカス・アガラクティア由来のテトラサイクリン耐性遺伝子は、エシェリヒア・コリECE99株からプラスミドpDG1513を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる(Gene 1995 167:335-336)。

0044

マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のpurR遺伝子の適当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、purR遺伝子破壊株が得られる。染色体上のpurR遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやPCR法により、染色体上のpurR遺伝子又はマーカー遺伝子を解析することによって、確認することができる。前記スペクチノマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子が染色体DNAに組み込まれたことの確認は、これらの遺伝子を増幅することができるプライマーを用いたPCRにより、行うことができる。

0045

また、プリンオペロンの発現は、プロモーター下流に位置するterminator−antiterminator配列(以下、アテニュエーター配列と称する)により制御されていることが知られている(Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274−8287、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894−10902、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136−2141)。したがって、アテニュエーター配列を欠損させることで、プリンオペロンの発現量を上昇させることができる。アテニュエーター配列の欠損はpurR破壊と同様の方法で行うことが出来る。

0046

なお、プリンオペロン転写をさらに増大させるためには、上記方法を組み合わせてもよく、例えば、purR遺伝子を破壊し、さらに、アテニュエーター配列を欠損させたプリンオペロンをプラスミドで増幅するか、あるいは、このようなプリンオペロンを染色体上で多コピー化させてもよい。

0047

また、プリン生合成に関与する酵素の活性増強は、プリン生合成に関与する酵素の調節を解除すること、例えば、前記酵素のフィードバック阻害を解除する方法によっても行うことができる(WO99/03988)。

0048

さらに、プリン系物質の細胞内への取り込みを弱化することによっても、プリン系物質生産能を強化することができる。例えば、プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みは、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応を遮断することによって弱化することができる。上記プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応は、たとえばヌクレオシドパーミアーゼに触媒される反応である。

0049

さらに、プリンヌクレオシドを製造する場合には、プリンヌクレオシド生産能を増強させるためにプリン系物質を分解する酵素の活性を低下させてもよい。このような酵素として、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼが挙げられる。

0050

PRPPから、プリン生合成に関与する酵素群により生合成されたプリンヌクレオチドは、脱リン酸化されて、プリンヌクレオシドに変換される。プリンヌクレオシドを効率的に蓄積せしめるためには、プリンヌクレオシドを更に分解してヒポキサンチン等とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性を低下させることが好ましい。すなわち、イノシンをはじめとするプリンヌクレオシドを基質とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼを弱化、あるいは欠損させるように改変することが望ましい。

0051

プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の低下は、具体的には、バチルス属細菌でプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子とpupG遺伝子を破壊することによって達成することができる。本発明のバチルス属細菌は、上記のようなdeoD遺伝子とpupG遺伝子を単独、または同時に破壊するように改変されたものであってもよい。deoD遺伝子、pupG遺伝子は、例えばバチルス属由来の遺伝子(deoD;Genbank Accession No.NC_000964(配列番号7), pupG;Genbank Accession No. NC_000964(配列番号9))が利用でき、上記purR遺伝子破壊と同様の方法で遺伝子破壊株を取得出来る。

0052

また、プリン系物質生産能を増強させるために、サクシニル−AMPシンターゼの活性を低下させてもよい。サクシニル−AMPシンターゼをコードする遺伝子としては、purA遺伝子が挙げられる。purA遺伝子としては、例えば、GenBankAccession No.NC_000964(コード領域は相補鎖の塩基番号4153460-4155749)(配列番号11)で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。

0053

さらに、プリン系物質生産能を増強させるために、イノシンモノリン酸(IMP)脱水素酵素の活性を低下させてもよい。IMP脱水素酵素をコードする遺伝子としては、guaB遺伝子が挙げられる。guaB遺伝子としては、例えば、GenBankAccession No.NC_000964(コード領域は15913-17376)(配列番号13)で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。

0054

また、プリン系物質生産能を増強させるために、フルクトース−ビスフォスファターゼの活性を低下させてもよい。フルクトース−ビスフォスファターゼをコードする遺伝子としては、fbp遺伝子が挙げられる。fbp遺伝子としては、例えば、GenBankAccession No.NC_000964(コード領域は4127053-4129065)(配列番号15)で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。

0055

また、プリン系物質生産能を増強させる方法として、プリン系物質を排出する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を増幅することが考えられる。このような遺伝子が増幅された細菌としては、例えば、rhtA遺伝子を増幅したバチルス属細菌が挙げられる(特開2003−219876)。

0056

上記のようにして破壊されるpurR、deoD、pupG、purA、guaB、もしくはfbp遺伝子、又は発現が増強されるprs遺伝子は、各々保存的バリアントであってよく、例えば各々配列番号6、8、10、12、14、16又は4に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、かつ、それぞれプリンリプレッサー、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、サクシニル−AMPシンターゼ、IMP脱水素酵素、又はフルクトース−ビスフォスファターゼ、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。前記「数個」は、例えば2〜50個、好ましくは、2〜30個、より好ましくは2〜10個である。

0057

上記のようなアミノ酸配列に対する変更は、通常、タンパク質の活性を維持するような保存的変更である。保存的なアミノ酸置換としては、serまたはthrによるAlaの置換;gln、hisまたはlysによるargの置換;glu、gln、lys、his、aspによるasnの置換;asn、gluまたはglnによるaspの置換;serまたはalaによるcysの置換;asn、glu、lys、his、aspまたはargによるglnの置換;asn、gln、lysまたはaspによるgluの置換;proによるglyの置換;asn、lys、gln、arg、tyrによるhisの置換;leu、met、val、pheによるileの置換;ile、met、val、pheによるleuの置換;asn、glu、gln、his、argによるlysの置換;ile、leu、val、pheによるmetの置換;trp、tyr、met、ileまたはleuによるpheの置換;thr、alaによるserの置換;serまたはalaによるthrの置換;phe、tyrによるtrpの置換;his、pheまたはtrpによるtyrの置換;およびmet、ile、leuによるvalが挙げられる。

0058

上記purR、deoD、pupG、purA、guaB、fbp遺伝子、又はprs遺伝子の保存的バリアントとしては具体的には、各々配列番号5、7、9、11、13、15又は3に示す塩基配列を有するDNAと、例えば70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有するDNAが挙げられる。より具体的には、配列番号5、7、9、11、13、15又は3に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、60℃、1×SSC,0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度洗浄が行われる条件が挙げられる。洗浄の回数は、1回又はそれ以上、好ましくは2回又は3回である。

0059

DNAの相同性の評価は、BLAST検索FASTA検索およびCrustalW等の計算方法によって行うことができる。
BLAST(ベーシックローカルアラインメント検索ツール)は、プログラムblastp、blastn、blastx、megablast、tblastn、およびtblastxにより使用されるヒューリスティック検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、SamuelおよびStephen F. Altschulの統計学的方法(「一般的なスコアリングスキームを使用することにより、分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法(Methodsfor assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes)」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68、「分子配列における多重ハイスコアリングセグメントに関する用途および統計学(Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences)」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7)を用いて、得られた結果が有意であると見なす。FASTA検索方法は、W.R. Pearsonにより記載されている(「FASTPおよびFASTAによる迅速かつ高感度な配列比較(Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA)」、Methods in Enzymology, 1990 183:63-98)。ClustalW方法は、Thompson J.D.、Higgins D.G.およびGibson T.J.により記載されている(「CLUSTAL W:配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティおよび重み行列法選択による漸進的多重配列アラインメント感度の改善(CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice)」、Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680)。

0060

また、破壊型遺伝子の作製に用いられるDNAも、purR、deoD、pupG、purA又はguaB遺伝子の保存的バリアントであってもよい。

0061

バチルス属細菌の染色体DNAに目的遺伝子を組み込むには、後述するトランスアルドラーゼをコードする遺伝子と同様にして行えばよい。

0062

<2>トランスアルドラーゼの酵素活性を低下させるための改変
本発明のバチルス属細菌は、上述のようなプリン系物質生産能を有する菌株をトランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変することによって取得することが出来る。ただし、改変の順は問わず、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変したのちにプリンヌクレオチド生産能を付与してもよい。

0063

ここでトランスアルドラーゼとは、セドヘプツロース7-リン酸とD-グリセロアルデヒド3-リン酸からD-エリスロース4−リン酸とD−フルクトース6-リン酸を可逆的に生成する反応を触媒する酵素であり、この反応はペントースリン酸経路の反応の一部である。「ペントースリン酸経路」とは、細胞内にとりこまれたグルコースが、グルコースキナーゼによりリン酸化され、グルコース−6−リン酸が生合成され、グルコース−6−リン酸は、酸化的にリボース−5−リン酸へ転換される経路エピメラーゼトランスケトラーゼ(EC:2.2.1.1)、トランスアルドラーゼ(EC:2.2.1.2)の作用により、トリオース、テトロロース、ペントース、ヘキソースヘプトースリン酸エステル相互変換する可逆過程からなる経路を意味する。

0064

トランスアルドラーゼの酵素活性は、以下のような方法で測定出来る。例えば、生成したD−グリセルアルデヒド3−リン酸をトリオースリン酸イソメラーゼによりヒドロキシアセトンリン酸とし、これをグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼNADHを用いて測定する方法(Ochoa, T., and Horecker, B. L., 1966, MethodsEnzymol., 9, 499-505)で測定出来る。

0065

トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変するには、例えば、上記のpurR遺伝子の破壊で示したように、相同組換え法により、染色体上のトランスアルドラーゼをコードする遺伝子を、正常に機能しない遺伝子(例えば薬剤耐性等のマーカー遺伝子をトランスアルドラーゼをコードする遺伝子内部に挿入した破壊型遺伝子)で置換することにより、達成できる。また、purR遺伝子について述べたように、通常の変異処理法によって、染色体上のトランスアルドラーゼ遺伝子に、細胞中のトランスアルドラーゼの酵素活性が低下するような変異を導入してもよい。

0066

バチルス・ズブチリスのトランスアルドラーゼは、配列番号2に示す212個のアミノ酸から構成されるタンパク質が挙げられ、該タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは配列番号1(ywjH遺伝子;Genbank Accession No.NC_000964)の塩基配列を有する遺伝子を改変に用いることができる。なお、ywjH遺伝子は、バチルス・ズブチリス染色体上325度近傍に存在する。

0067

トランスアルドラーゼをコードする遺伝子も、前述の各遺伝子と同様に、ywjH遺伝子の保存的バリアントであってもよい。具体的には、配列番号1に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、かつ、トランスアルドラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。あるいは、配列番号2に示すアミノ酸配列と、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%、特に好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相同性を有し、かつトランスアルドラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。より具体的には、配列番号1に示す塩基配列を有するDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、60℃、1×SSC,0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件が挙げられる。洗浄の回数は、1回又はそれ以上、好ましくは2回又は3回である。

0068

上記のようなトランスアルドラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするDNAは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、これら酵素をコードする塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたDNAは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のDNAをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のDNAを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。

0069

目的とする遺伝子は、例えば、バチルス属細菌の染色体DNAを鋳型とし、目的とする遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法(PCR:polymerase chain reaction; White,T.J. et al., TrendsGenet., 1989, 5, 185-189参照)によって、取得することができる。染色体DNAは、DNA供与体である細菌から、例えば、斎三浦の方法(H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 1963, 72, 619-629、生物工学実験書、日本生物工学会編、97〜98頁、培風、1992年参照)等により調製することができる。PCR用プライマーは、バチルス属細菌の公知の遺伝子配列に基づいて、又は他の細菌等で配列が公知の遺伝子間で保存されている領域の情報に基づいて、調製することができる。

0070

バチルス属細菌の染色体DNAに目的遺伝子を組み込むためのベクターとしては、pHV1248(Prtit, M.-A., et. al., J. Bacteriol., 1990, 172, 6736-6740)等の温度感受性複製起点をもつベクターやpHSG398(宝酒造(株))、pBluescriptSK−(Stratagene)等のE.coli用ベクター等が挙げられる。

0071

目的遺伝子とバチルス属細菌で機能するマーカーを搭載したベクターを連結して組換えDNAを調製するには、目的遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。

0072

上記のように調製した組換えDNAをバチルス属細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法(Dubnau, D., and Davidoff-Abelson, R., J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)、又は、宿主細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法(Chang, S. and Cohen, S.N., Molec. Gen. Genet., 1979, 168, 111-115)が挙げられる。

0073

<2>プリン系物質の製造法
本発明のバチルス属細菌はプリン系物質を効率よく生産する。したがって、本発明のバチルス属細菌を好適な培地で培養することによって、細菌の細胞内又は培地中にプリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を生成蓄積せしめることができる。

0074

本発明に用いる培地としては、炭素源窒素源無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能なものならばよい。

0075

炭素源としてはグルコース、フラクトースシュークロースマルトースマンノースガラクトースアラビノースキシローストレハロース、リボース、でんぷん加水分解物糖蜜等の糖類、グリセロールやマンニトールなどのアルコール類が使用され、その他、グルコン酸酢酸クエン酸マレイン酸フマール酸コハク酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。

0077

有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトンカザミノ酸酵母エキス大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。

0078

無機塩類としてはリン酸塩マグネシウム塩カルシウム塩鉄塩マンガン塩等が使用される。

0079

培養条件は、用いるバチルス属細菌の種類によるが、例えばバチルス・ズブチリスでは、発酵温度20〜50℃、pHを4〜9に制御しつつ通気培養を行う。培養中にpHが低下する場合にはアンモニアガス等のアルカリ中和する。かくして40時間〜3日間程度培養することにより、培養液中にプリンヌクレオシドが蓄積される。

0080

培養終了後、培養液中に蓄積されたイノシンを採取する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、沈殿法、またはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。

0081

また、本発明に用いる微生物は、さらにヌクレオシダーゼヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を欠損させれば、各々に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドを蓄積させることができ、又イノシンの要求性を付与すれば、これらの生合成系経路上の前駆体及びその関連物質を蓄積させることができる。

0082

さらに、本発明の方法により製造されたイノシン又はグアノシンに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させることにより、5’−イノシン酸あるいは5’−グアニル酸が得られる。

0083

また、本発明の微生物を用いて生産されたプリンヌクレオシドに、ホスホトランスフェラーゼを作用させることによってリン酸化し、プリンヌクレオチド(ヌクレオシド−5’−燐酸エステル)を生産することも可能である(特開2000-295996)。例えば、エシェリヒア・コリのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を導入したエシェリヒア属細菌を用いるプリンヌクレオチドの製造法(WO91/08286号パンフレット)、エキシグオバクテリウム・アセチリカムのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を導入したコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを用いたプリンヌクレオチドの製造法(WO96/30501号パンフレット)を採用することができる。

0084

また、本発明の微生物を用いて生産されたプリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、カルバミル燐酸からなる群より選択された燐酸供与体と、ヌクレオシド−5’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物や、酸性フォスファターゼ(EC 3.1.3.2)を作用させることによって、プリンヌクレオチド(ヌクレオシド−5’−燐酸エステル)を生産することも可能である。ヌクレオシド−5’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物は、プリンヌクレオシドをプリンヌクレオチドに変換する能力を有するものであれば特に制限されないが、例えば、国際公開パンフレットWO9637603号に記載されたような微生物が挙げられる。

0085

また、特開平07−231793に開示されているようなエシェリヒア・ブラッタエ(Escherichia blattae)JCM 1650、セラチアフィカリア(Serratia ficaria)ATCC33105、クレブシエラプランティコラ(Klebsiella planticola)IFO 14939 (ATCC 33531)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)IFO 3318 (ATCC 8724)、クレブシエラ・テリゲナ(Klebsiella terrigena)IFO 14941 (ATCC 33257)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)IFO 3168、エンテロバクターアエロゲネス(Enterobacter aerogenes)IFO 12010、エンテロバクター・アエロゲネス IFO 13534 (ATCC 13048)、クロモバクテリウム・フルヴィアティレ(Chromobacterium fluviatile)IAM 13652、クロモバクテリウム・ヴィオラセウム(Chromobacterium violaceum)IFO 12614、セデセア・ラパゲイ(Cedecea lapagei)JCM 1684、セデセア・ダヴィシエ(Cedecea davisiae)JCM 1685、セデセア・ネテリ(Cedecea neteri)JCM 5909などを用いることもできる。

0086

酸性フォスファターゼとしては、例えば、特開2002−000289に開示されているようなものを用いることができ、より好ましくはヌクレオシドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼ(特開平10−201481参照)やヌクレオチダーゼ活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ(WO9637603参照)、燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ(特開2001−245676)などを用いることができる。

0087

本発明の微生物を用いて生産されたプリンヌクレオシドを化学的にリン酸化することにより、プリンヌクレオチドを得ることも可能である(Bulletin of the Chemical Society of Japan 42,3505)。また、微生物が有しているATP再生系を利用して、本発明のXMP生産能を有する微生物とXMPアミナーゼ活性を共役させることによってGMPを得る方法、イノシンキナーゼを共役させることによってIMPを得る方法も採用できる(Biosci.Biotech.Biochem.,51,840(1997) 特開昭63-230094)。

0088

上記プリンヌクレオチドの製造に用いる、本発明の方法により製造されたイノシン又はグアノシン、又はプリンヌクレオシドは、精製されたものであってもよいが、プリンヌクレオシドの発酵液又はプリンヌクレオシドを含む粗精製物であってもよい。

0089

[実施例]
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

0090

<プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするpupG遺伝子およびdeoD遺伝子を欠損した菌株の作製>
バチルス・ズブチリス(B. subtilis 168 Marburg株;ATCC6051)由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子(purR)、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子(purA)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(pupG)を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子(guaB)が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPPシンセターゼ遺伝子(prs)のSD配列を改変した組換え体KMBS310(特願2005−280186号)を用いて、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(deoD)を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。尚、前記プリンオペロン及びPRPPシンセターゼ遺伝子は、各々プロモーター領域及びSD配列の改変により発現が強化されている。

0091

KMBS16(purR::spc purA::erm deoD::kan;特開2004−242610号公報)より、FouetとSonensheinの方法(J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844)により調製したゲノムDNAを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法(J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)により調製したB. subtilis 168 Marburg株のコンピテントセルを形質転換し、5μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたいくつかのコロニーの中でスペクチノマイシン耐性又はエリスロマイシン耐性となっていないコロニーを選択し、それらの内の一株を、KMBS5(deoD::kan)と名づけた。

0092

KMBS5より、FouetとSonensheinの方法(J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844)により調製したゲノムDNAを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法(J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)により調製したKMBS310株のコンピテントセルを形質転換し、5μg/mlのカナマイシンと20μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたいくつかのコロニーを選択し、野生型deoD遺伝子がdeoD::kanで置換されており、かつKMBS310由来のすべての変異が野生型配列と置換されていないことが確認できた形質転換体の内の一株を、KMBS321と名づけた。

0093

<フルクトース−ビスフォスファターゼをコードするfbp遺伝子、トランスアルドラーゼをコードするywjH遺伝子、又は両遺伝子を欠損した菌株の作製と培養評価>
(1)fbp遺伝子欠損株の作製
上述のバチルス・ズブチリス(B. subtilis 168 Marburg株;ATCC6051)由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子(purR)、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子(purA)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(pupG)を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子(guaB)が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子(prs)のSD配列が改変され、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(deoD)を欠損した組換え体KMBS321を用いて、フルクトース−ビスフォスファターゼ遺伝子(fbp)を欠損させた菌株の作製を、以下のようにして行った。

0094

(i)fbp上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク(GenBankAccessionNC_000964およびV01277)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ28 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。

0095

TTCCCTTAGGGTTATTTTCGTTTCAAAA(配列番号19)
cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA(配列番号20;小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)のプロモーター上流域の配列)

0096

B. subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、fbp遺伝子5’末端領域と上流の約1350 bpを含む増幅断片を得た。

0097

(ii)fbp下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク(GenBankAccessionNC_000964およびV01277)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、27 merのPCR用プライマーを作製した。

0098

acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG(配列番号21;小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)の構造遺伝子下流域の配列)
TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA(配列番号22)

0099

バチルス・ズブチリス168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、fbp遺伝子3’末端領域と下流の約1770 bp含む増幅断片を得た。

0100

(iii)cat遺伝子のPCR法による増幅
遺伝子データバンク(GenBankAccession No.V01277およびNC_000964)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。

0101

tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG(配列番号23;小文字の塩基はfbp遺伝子5’末端領域の配列で配列番号20の3’末端領域と相補するようにデザインされている)
cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT(配列番号24;小文字の塩基はfbp遺伝子3’末端領域の配列で配列番号21の3’末端領域と相補するようにデザインされている)

0102

クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)が搭載されているプラスミドpC194を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、cat遺伝子を含む約980 bpの増幅断片を得た。

0103

(iv)cat遺伝子がfbp領域に挿入された断片のリコンビナントPCR法による増幅
(i)から(iii)で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400(Amersham Pharmacia Biotech)で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号19および22を用いて、PCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 4.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、cat遺伝子がfbp領域に挿入された増幅断片を得た。

0104

(v)fbpを破壊したイノシン生産菌株の作製
(iv)で取得したcat遺伝子を挿入したfbp領域(fbp::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法(J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)により調製したB. subtilis KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、(iv)に示したPCR法により、染色体上のfbp領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたfbp領域(fbp::cat)と2回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS133と名づけた。

0105

(2)ywjH遺伝子欠損株の作製
上述のバチルス・ズブチリス(B. subtilis 168 Marburg株;ATCC6051)由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子(purR)、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子(purA)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(pupG)を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子(guaB)が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子(prs)のSD配列が改変され、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(deoD)を欠損した組換え体KMBS321を用いて、トランスアルドラーゼ遺伝子(ywjH)を欠損させた菌株の作製を、以下のようにして行った。

0106

(i)ywjH上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク(GenBankAccessionNC_000964およびV01277)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ28 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。

0107

ATGGACGGAATCGAAATCTTAAAACGGA(配列番号25)
cgtttgttgaactaatgggtgctttAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC(配列番号26;小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)のプロモーター上流域の配列)

0108

B. subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、ywjH遺伝子5’末端領域と上流の約1420 bpを含む増幅断片を得た。

0109

(ii)ywjH下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク(GenBankAccessionNC_000964およびV01277)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、28 merのPCR用プライマーを作製した。

0110

acagctccagatccatatccttctTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG(配列番号27;小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)の構造遺伝子下流域の配列)

0111

GGATGACGTTATCGATAATGACTTCCTT(配列番号28)
B. subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、ywjH遺伝子3’末端領域と下流の約1370 bp含む増幅断片を得た。

0112

(iii)cat遺伝子のPCR法による増幅
遺伝子データバンク(GenBankAccession No.V01277およびNC_000964)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。

0113

gagaagcgaatgaattaggaattctAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG(配列番号29;小文字の塩基はywjH遺伝子5’末端領域の配列で配列番号26の3’末端領域と相補するようにデザインされている)

0114

ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT(配列番号30;小文字の塩基はywjH遺伝子3’末端領域の配列で配列番号27の3’末端領域と相補するようにデザインされている)
クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)が搭載されているプラスミドpC194を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、cat遺伝子を含む約980 bpの増幅断片を得た。

0115

(iv)cat遺伝子がywjH領域に挿入された断片のリコンビナントPCR法による増幅
(i)から(iii)で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400(Amersham Pharmacia Biotech)で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号25および28を用いて、PCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 4分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、cat遺伝子がywjH領域に挿入された増幅断片を得た。

0116

(v)ywjHを破壊したイノシン生産菌株の作製
(iv)で取得したcat遺伝子を挿入したywjH領域(ywjH::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法(J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)により調製したB. subtilis KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、(iv)に示したPCR法により、染色体上のywjH領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたywjH領域(ywjH::cat)と2回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS135と名づけた。

0117

(3)fbp ywjH二重欠損株の作製
バチルス・ズブチリス(B. subtilis 168 Marburg株;ATCC6051)由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子(purR)、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子(purA)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(pupG)、フルクトース−ビスフォスファターゼ遺伝子(fbp)を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子(guaB)が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子(prs)のSD配列を改変した組換え体TABS133を用いて、トランスアルドラーゼ遺伝子(ywjH)を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。

0118

(i)ywjH上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク(GenBankAccessionNC_000964およびM29725)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ26 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。

0119

TAAAGCGTGATAGACATACAGTGCTG(配列番号31)
cattgcaagacttttttcaccaagcAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC(配列番号32;小文字の塩基はpDG1513上にクローニングされているテトラサイクリン耐性遺伝子(tet)のプロモーター上流域の配列)

0120

B. subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、ywjH遺伝子5’末端領域と上流の約2250 bpを含む増幅断片を得た。

0121

(ii)ywjH下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク(GenBankAccessionNC_000964およびM29725)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、26 merのPCR用プライマーを作製した。

0122

gagagagttcaaaattgatcctttTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG(配列番号33;小文字の塩基はpDG1513上にクローニングされているテトラサイクリン耐性遺伝子(tet)の構造遺伝子下流域の配列)
TTGCATATACATGTCAGGAGCATTCA(配列番号34)

0123

B. subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、ywjH遺伝子3’末端領域と下流の約2280 bp含む増幅断片を得た。

0124

(iii)tet遺伝子のPCR法による増幅
遺伝子データバンク(GenBankAccession No.M29725およびNC_000964)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。

0125

gagaagcgaatgaattaggaattctGCTTGGTGAAAAAAGTCTTGCAATG(配列番号35;小文字の塩基はywjH遺伝子5’末端領域の配列で配列番号32の3’末端領域と相補するようにデザインされている)
ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAAAGGATCAATTTTGAACTCTCTC(配列番号36;小文字の塩基はywjH遺伝子3’末端領域の配列で配列番号33の3’末端領域と相補するようにデザインされている)

0126

テトラサイクリン耐性遺伝子(tet)が搭載されているpDG1513を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、cat遺伝子を含む約2070 bpの増幅断片を得た。

0127

(iv)tet遺伝子がywjH領域に挿入された断片のリコンビナントPCR法による増幅
(i)から(iii)で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400(Amersham Pharmacia Biotech)で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号31および34を用いて、PCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 7分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、tet遺伝子がywjH領域に挿入された増幅断片を得た。

0128

(v)fbpおよびywjHを破壊したイノシン生産菌株の作製
(iv)で取得したtet遺伝子を挿入したywjH領域(ywjH::tet)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法(J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)により調製したB. subtilisTABS133株のコンピテントセルを形質転換し、12.5 μg/mlのテトラサイクリンと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、(iv)に示したPCR法により、染色体上のywjH領域が、内部がテトラサイクリン耐性遺伝子で置換されたywjH領域(ywjH::tet)と2回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS174と名づけた。

0129

(4)fbp遺伝子、ywjH遺伝子、あるいは両遺伝子を欠損したイノシン生産菌株のプリンヌクレオシド生産
fbp遺伝子欠損株TABS133、ywjH遺伝子欠損株TABS135、両遺伝子を欠損した株TABS174およびコントロール株であるKMBS321を、グアニン20 mg/Lを含むLB培地プレート上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後72時間目サンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。fbp遺伝子欠損株TABS133、ywjH遺伝子欠損株TABS135のイノシンの蓄積は、コントロール株であるKMBS321株のそれよりも高かった。また、両遺伝子を欠損させた株のイノシン蓄積は、TABS133株あるいはTABS135株のそれよりも高かった。

0130

[発酵培地組成]
グルコース30 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃(T-N)* 1.35 g/L
DL-メチオニン0.4 g/L
L-トリプトファン0.02 g/L
アデニン0.1 g/L
グアノシン0.075 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
デカノール消泡剤) 0.5 ml/L
(KOHでpH 7.0に調整)
炭酸カルシウム50 g/L
*:大豆蛋白加水分解物

0131

0132

〔配列表の説明〕
配列番号1:ywjH遺伝子の塩基配列
配列番号2:トランスアルドラーゼのアミノ酸配列
配列番号3:prs遺伝子の塩基配列
配列番号4:ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼのアミノ酸配列
配列番号5:purR遺伝子の塩基配列
配列番号6:プリンリプレッサーのアミノ酸配列
配列番号7:deoD遺伝子の塩基配列
配列番号8:deoD遺伝子産物(プリンヌクレオシドホスホリラーゼ)のアミノ酸配列
配列番号9:pupG遺伝子の塩基配列
配列番号10:pupG遺伝子産物(プリンヌクレオシドホスホリラーゼ)のアミノ酸配列
配列番号11:purA遺伝子の塩基配列
配列番号12:サクシニル−AMPシンターゼのアミノ酸配列
配列番号13:guaB遺伝子の塩基配列
配列番号14:IMP脱水素酵素のアミノ酸配列
配列番号15:fbp遺伝子の塩基配列
配列番号16:フルクトース−ビスフォスファターゼのアミノ酸配列
配列番号17:purR遺伝子増幅用プライマー
配列番号18:purR遺伝子増幅用プライマー
配列番号19:fbp遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号20:fbp遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号21:fbp遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号22:fbp遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号23:cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号24:cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号25:ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号26:ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号27:ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号28:ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号29:cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号30:cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号31:ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号32:ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号33:ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号34:ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号35:tet遺伝子増幅用プライマー
配列番号36:tet遺伝子増幅用プライマー

0133

本発明のバチルス属細菌を用いることにより、プリンヌクレオシド及び/又はプリンヌクレオチドの生産効率を向上させることが出来る。

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