図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2008年12月25日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (6)

課題・解決手段

本発明は、茸等の好酸球炎症疾患において、病変部位集積した好酸球に誘導されるH−PGDSを検出し、または鼻腔洗浄液気管支肺胞液中のPGD2を測定したりすることにより、病態重症度診断したり、これら疾患の再発性予測する方法を提供する。

概要

背景

茸の成立は未だに明らかではないが、慢性副鼻腔炎に伴って認められる炎症性病変であることから、古くは感染による炎症がその成因に関与していると考えられていた。一方、鼻茸を組織学的に観察すると、好酸球浸潤を伴うものが多いので、その成因に気管支喘息アレルギー性鼻炎といった好酸球性炎症の関与も推察されている。
鼻茸は慢性副鼻腔炎の症状のうち鼻閉頭重感を引き起こすのみならず、鼻副鼻腔換気障害による副鼻腔炎重症化や、後鼻漏による下気道障害を引き起こす。
したがって、鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎の治療手術療法であるが、喘息合併した症例や、局所の好酸球浸潤の強い症例は2〜3年以内に再発が認められる。

花粉症に代表されるアレルギー性鼻炎の患者あるいはアレルギー性気管支喘息は、抗原暴露されると肥満細胞からプロスタグランジンPG)D2、PGE2、ヒスタミンロイコトリエンLT)C4、LTD4、LTE4等のケミカルメディエーターが過剰に産生・放出された後に好酸球に代表される炎症細胞が局所に集積する。集積した好酸球は活性化されると主要塩基性蛋白(MBP)、好酸球カチオン蛋白(ECP)等の組織傷害タンパク質を放出して更に炎症を増悪すると考えられている。

これまで、慢性副鼻腔炎(鼻茸)やアレルギー性鼻炎、気管支喘息(特にアレルギー性気管支喘息)、アレルギー性皮膚炎等の疾患と、プロスタグランジンD2(PGD2)の関与は知られている(例えば、非特許文献1,2)。一方これらの疾患ではPGE2やLTC4、LTD4、LTE4産生や好酸球の浸潤数が重症度指標とされてきた。しかしながら、炎症部位での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現を調べることにより、これらの疾患の重症度を診断し、再発性予測する方法は、これまで知られていない。

これら疾患の治療にはステロイド糖質コルチコイド)の投与著効を示すが、副作用の問題から長期投与が困難である。そこで、非ステロイド性抗炎症薬抗アレルギー薬抗ヒスタミン薬抗ロイコトリエン薬の投与が行われているが、その薬効には個人差が大きい。
アレルギー, Vol.54, No.3/4, Page.384
アレルギー, Vol.52, No.8/9, Page.759

概要

本発明は、鼻茸等の好酸球性炎症疾患において、病変部位に集積した好酸球に誘導されるH−PGDSを検出し、または鼻腔洗浄液気管支肺胞液中のPGD2を測定したりすることにより、病態の重症度を診断したり、これら疾患の再発性を予測する方法を提供する。

目的

好酸球性炎症疾患の重症度を診断したり、これら疾患の再発性を予測したりする方法であって、炎症部位での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現を調べて、重症度を診断し、再発性を予測する診断方法を提供することを目的とする。

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

炎症部位での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質発現を測定するか、またはプロスタグランジンD2(PGD2)量を測定することを含む、好酸球炎症疾患重症度診断する方法。

請求項2

患者から採取された好酸球性炎症疾患の炎症部位での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現量またはプロスタグランジンD2(PGD2)量が高いほど、好酸球性炎症疾患の重症度が重度であると診断する、請求項1に記載の診断方法

請求項3

好酸球性炎症疾患が、慢性副鼻腔炎鼻アレルギー鼻炎気管支喘息(特にアレルギー性気管支喘息)、またはアレルギー性皮膚炎である請求項1または2に記載の診断方法。

請求項4

慢性副鼻腔炎が、茸を伴うことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の診断方法。

請求項5

炎症部位での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現を測定するか、またはプロスタグランジンD2(PGD2)量を測定することを含む、好酸球性炎症疾患の再発性予測する方法。

請求項6

患者から採取された好酸球性炎症疾患の炎症部位での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現量またはプロスタグランジンD2(PGD2)量が高いほど、好酸球性炎症疾患の再発性が高いと予測する、請求項5に記載の再発性を予測する方法。

請求項7

好酸球性炎症疾患が、慢性副鼻腔炎、鼻アレルギー性鼻炎、気管支喘息(特にアレルギー性気管支喘息)、またはアレルギー性皮膚炎である請求項5または6に記載の再発性を予測する方法。

請求項8

慢性副鼻腔炎が、鼻茸を伴うことを特徴とする請求項5〜7のいずれかに記載の再発性を予測する方法。

請求項9

患者から採取された鼻茸での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現を測定するか、またはプロスタグランジンD2(PGD2)量を測定することを含む、鼻茸の再発性を予測する方法。

請求項10

患者から採取された鼻茸での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現量、またはプロスタグランジンD2(PGD2)量が高いほど、鼻茸の再発性が高いと予測する、請求項9に記載の再発性を予測する方法。

請求項11

1)ヒト造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)大量発現トランスジェニックマウス抗原感作してアレルギー疾患モデルを作製し、鼻腔気道あるいは皮膚に抗原を暴露して好酸球性アレルギー疾患を惹起し、2)好酸球性疾患を誘導する前または後に造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)阻害物質またはプロスタグランジン受容体DP拮抗薬である候補化合物をトランスジェニックマウスに投与し、3)トランスジェニックマウスにおける好酸球性炎症疾患の状態を、候補物質を与えないトランスジェニックマウスにおける状態と比較する、ことを含む好酸球性炎症疾患の進行を防止し、または再発の予防に用いる化合物スクリーニング方法

技術分野

0001

本発明は、好酸球炎症疾患重症度診断し、これら疾患の再発性予測する方法に関するものである。更に詳しくは、本発明は慢性副鼻腔炎(特に茸を伴う慢性副鼻腔炎)、アレルギー性鼻炎気管支喘息(特にアレルギー性気管支喘息)、アレルギー性皮膚炎等の疾患による炎症部位集積した好酸球の活性化を、好酸球での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)遺伝子あるいはタンパク質発現量を指標として測定し、これら好酸球性炎症疾患の重症度を診断し、再発性を予測することに関するものである。

背景技術

0002

鼻茸の成立は未だに明らかではないが、慢性副鼻腔炎に伴って認められる炎症性病変であることから、古くは感染による炎症がその成因に関与していると考えられていた。一方、鼻茸を組織学的に観察すると、好酸球浸潤を伴うものが多いので、その成因に気管支喘息やアレルギー性鼻炎といった好酸球性炎症の関与も推察されている。
鼻茸は慢性副鼻腔炎の症状のうち鼻閉頭重感を引き起こすのみならず、鼻副鼻腔換気障害による副鼻腔炎重症化や、後鼻漏による下気道障害を引き起こす。
したがって、鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎の治療手術療法であるが、喘息合併した症例や、局所の好酸球浸潤の強い症例は2〜3年以内に再発が認められる。

0003

花粉症に代表されるアレルギー性鼻炎の患者あるいはアレルギー性気管支喘息は、抗原暴露されると肥満細胞からプロスタグランジン(PG)D2、PGE2、ヒスタミンロイコトリエンLT)C4、LTD4、LTE4等のケミカルメディエーターが過剰に産生・放出された後に好酸球に代表される炎症細胞が局所に集積する。集積した好酸球は活性化されると主要塩基性蛋白(MBP)、好酸球カチオン蛋白(ECP)等の組織傷害性タンパク質を放出して更に炎症を増悪すると考えられている。

0004

これまで、慢性副鼻腔炎(鼻茸)やアレルギー性鼻炎、気管支喘息(特にアレルギー性気管支喘息)、アレルギー性皮膚炎等の疾患と、プロスタグランジンD2(PGD2)の関与は知られている(例えば、非特許文献1,2)。一方これらの疾患ではPGE2やLTC4、LTD4、LTE4産生や好酸球の浸潤数が重症度の指標とされてきた。しかしながら、炎症部位での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現を調べることにより、これらの疾患の重症度を診断し、再発性を予測する方法は、これまで知られていない。

0005

これら疾患の治療にはステロイド糖質コルチコイド)の投与著効を示すが、副作用の問題から長期投与が困難である。そこで、非ステロイド性抗炎症薬抗アレルギー薬抗ヒスタミン薬抗ロイコトリエン薬の投与が行われているが、その薬効には個人差が大きい。
アレルギー, Vol.54, No.3/4, Page.384
アレルギー, Vol.52, No.8/9, Page.759

発明が解決しようとする課題

0006

好酸球性炎症疾患の重症度を診断したり、これら疾患の再発性を予測したりする方法であって、炎症部位での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現を調べて、重症度を診断し、再発性を予測する診断方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0007

上記目的を達成する本発明者は鋭意研究を行い、次のような知見を得たことに基づいて本発明を完成させた。
1)副鼻腔炎に伴う重症の鼻茸では好酸球の浸潤が顕著である。
2)通常、好酸球にはH−PGDSが検出されないが、病変部位ではEG2あるいはMBP陽性の活性化好酸球でH−PGDSの発現が亢進する。
3)好酸球でのH−PGDSの発現量は、好酸球性炎症疾患の重症度と相関する。すなわちH−PGDSの発現量が高いほど好酸球性炎症疾患が重症である。
4)好酸球でのH−PGDSの発現量は、鼻茸の再発率と相関する。すなわちH−PGDSの発現量が高いほど鼻茸の再発率が高い。

0008

従って本願発明は、好酸球性炎症疾患の重症度を診断する方法であって、炎症部位での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現量を測定するか、またはプロスタグランジンD2(PGD2)量を測定することを含む、重症度を診断する方法を要旨とする。

0009

本願発明はまた、好酸球性炎症疾患の再発性を予測する方法であって、炎症部位での造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)タンパク質の発現量を測定するか、またはプロスタグランジンD2(PGD2)量を測定することを含む再発性を予測する方法をも要旨とする。

0010

本願発明はまた、1)ヒト造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)大量発現トランスジェニックマウスに抗原を感作してアレルギー疾患モデルを作製し、鼻腔気道あるいは皮膚に抗原を暴露して好酸球性アレルギー疾患を惹起し、
2)好酸球性疾患を誘導する前または後に造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)阻害物質またはプロスタグランジン受容体DP拮抗薬候補化合物をトランスジェニックマウスに投与し、
3)トランスジェニックマウスにおける好酸球性炎症疾患の状態を、候補物質を与えないトランスジェニックマウスにおける状態と比較する、
ことを含む好酸球性炎症疾患の進行を防止し、または再発の予防に用いる化合物スクリーニング方法をも要旨とする。

発明の効果

0011

本発明によれば、好酸球性炎症疾患の重症度の新たな診断方法と、これらの疾患の再発性を予測する方法を提供することができる。また本発明によれば好酸球性炎症疾患の進行を防止し、再発予防に用いる化合物をスクリーニングすることができる。

図面の簡単な説明

0012

MBP(好酸球の指標)抗体とH−PGDSとの蛍光抗体染色を示す。上段の非好酸球性疾患患者では、H−PGDSとMBP陽性細胞はほとんど一致しないが、好酸球の浸潤が顕著な患者ではMBP陽性細胞のほとんどが、H−PGDSを発現する.

0013

EG2(活性化好酸球)抗体とH−PGDSとの蛍光抗体染色を示す。上段の好酸球浸潤が軽度な患者では、H−PGDS陽性細胞とEG2陽性細胞(活性化好酸球)はほとんど一致しないが、好酸球浸潤が著明な患者では、EG2陽性細胞のほとんどが、H−PGDS陽性細胞であった。目盛りは10μmである。

0014

鼻茸のH−PGDS,COX−1およびCOX−2に対するウェスタンブロッティングを示す。左側7例は、好酸球浸潤が著明な患者で、右側7例は好酸球浸潤が軽微な患者である。

0015

鼻茸のH−PGDS、COX−1およびCOX−2に対するウェスタンブロッティングを示す。左側4例は、術後2年以内にポリープが再発した症例、右側4例は再発しなかった経過が良好な症例を示す。再発群は経過良好群と比較してH−PGDSの発現が多い。

0016

鼻茸におけるH−PGDSmRNAの発現量を示す。再発例は経過良好例と比較して、発現量が高かった。

0017

好酸球EG2抗体とH−PGDSとの蛍光抗体染色を示す。再発群ではEG2陽性細胞のほとんどが、H−PGDS陽性細胞であった。目盛りは10μmである。

発明を実施するための最良の形態

0018

本発明の対象となる好酸球性炎症疾患には慢性副鼻腔炎(特に、鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎)、鼻アレルギー鼻炎、気管支喘息(特にアレルギー性気管支喘息)、またはアレルギー性皮膚炎を含む。
本発明において「重症度」とは、好酸球性炎症疾患を軽症、中等症、重症に分ける指標を示し、それぞれの疾患の診断基準や重症度分類等(例えば、2002年版 鼻アレルギー診療ガイドライン厚生労働省21世紀医療開拓推進研究事業[EBM分野]アレルギー鼻炎ガイドライン班 作成)により診断される。
本発明において「再発性」とは、好酸球性炎症疾患(特に鼻茸)症状の再燃性を示し、例えば鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎の場合には、鼻茸切除後、2年以内に副鼻腔粘膜腫脹が見られた場合を「再発」とする。

0019

本発明の方法において用いる試料は、炎症部位から採取されるが、鼻アレルギー性鼻炎、気管支喘息(特にアレルギー性気管支喘息)等の場合には鼻腔洗浄液気管支肺胞洗浄液を用いることができる。例えば生理食塩水にて鼻腔洗浄し、回収された液を遠心分離し、沈殿物塗沫標本とした後に、H−PGDS抗体染色あるいはライトギムザ染色を行い、H−PGDS陽性の好酸球を同定する。また回収された液を遠心分離して得た上清中のプロスタグランジン(PGD2)量をEIA法(Krawiec ME, Westcott JY, Chu HW, Balzar S, TrudeauJB, Schwartz LB, Wenzel SE, Persistent wheezing in very young children is associated with lower respiratory inflammation, Am J Respir Crit Care Med 2001;163:1338-1343 および Shichijo M, Inagaki N, Nakai N, Kimata M, Nakahata T, Serizawa I, Iikura Y, Saito H, Nagai H, The effects of anti-asthma drugs on mediator release from cultured human mast cells, Clin Exp Allergy. 1998 Oct;28(10):1228-36 を参照)、あるいはLC−MS法(Sugimoto M, Sugiyama S, Yanagita N,Ozawa T, Laser high performance liquid chromatography determination of prostaglandins in nasal lavage fluid in allergic rhinitis, Clin Exp Allergy. 1994 Apr;24(4):324-9 を参照)によって定量する。

0020

炎症局所で好酸球が発現するH−PGDSは、以下の実施例で説明するように、組織染色法、RTPCR法、ウェスタンブロッティング法あるいはin situハイブリダイゼーション法によって検出する。これらの方法は当業者に周知である。H-PGDSの測定にこれらの方法を適用した例は、以下の文献: Hematopoietic prostaglandin D synthase is expressed in microglia in the developingpostnatal mouse brain. Glia. 2003,May, 42(3):263-74; Induction of hematopoietic prostaglandin D synthase in hyalinated necrotic muscle fibers: its implication in grouped necrosis. Neuropathol (Berl). 2002, Oct,104(4):377-84. Epub 2002 Jun 6; Essential role for hematopoietic prostaglandin D2 synthase in the control of delayed type hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 28;103(13):5179-84. Epub 2006 Mar 17 に記載されている。これらの文献は本明細書の1部を構成する。

0021

上述のように測定したPGD2量、H−PGDSについて、好酸球性炎症疾患の炎症部位でのPGD2量、H−PGDSタンパク質の発現量が高いほど、好酸球性炎症疾患が重症であることが明らかとなった。従って、本発明は、患者から採取された好酸球性炎症疾患の炎症部位でのH−PGDSタンパク質の発現量またはPGD2量が高いほど、好酸球性炎症疾患の重症度が重度であると診断する好酸球性炎症疾患の診断方法を提供する。
また上述のように測定したPGD2量、H−PGDSについて、好酸球性炎症疾患の炎症部位でのPGD2量、H−PGDSタンパク質の発現量が高いほど、好酸球性炎症疾患の再発性が高いことが明らかとなった。特に鼻茸においては、鼻茸におけるPGD2量、H−PGDSタンパク質の発現量が高いほど、鼻茸の再発性、特に鼻茸切除後の経過を追跡した2年以内の再発性が高いことが明らかとなった。従って、本発明は、患者から採取された好酸球性炎症疾患の炎症部位でのH−PGDSタンパク質の発現量またはPGD2量が高いほど、好酸球性炎症疾患の再発性が高いと予測する、好酸球性炎症疾患の再発性を予測する方法も提供する。更には、患者から採取された鼻茸でのH−PGDSタンパク質の発現量またはPGD2量が高いほど、鼻茸の再発性が高いことを予測する、鼻茸の再発性を予測する方法も提供する。
本願発明により好酸球性炎症疾患とH-PDGSの発現が相関性を有する事が明らかになったので、H-PDGSの発現が好酸球性炎症疾患の発症の原因である事が予測し得る。したがってH−PGDS阻害物質またはDP拮抗薬が好酸球性炎症疾患の治療剤となりうる可能性がある。

0022

H−PGDS阻害剤の例は、4−ベンズヒドリルオキシ−1−{3−(1H−テトラゾール−5−イル)−プロピルピペリジン(HQL−79)、1−アミノ−4−{4−[4−クロロ−6−(2−スルホフェニルアミノ)−[1,3,5]トリアジン−2−イルメチル]−3−スルホ−フェニルアミノ}−9,10−ジオキソ−9,10−ジヒドロアントラセン−2−スルホン酸(チバクローンブルー)、1−アミノ−4−(4−スルファモイルアニリノ)−アントラキノン−2−スルホン酸 (PGD−042)もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物、2−(2’−ベンゾチアゾリル)−5−スチリルー3−(4’−フタヒドラディル)テトラゾリウム塩化物(PGD−016)またはそれらの水和物を含む。
製薬上許容される塩とは、塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩カリウム塩等のアルカリ金属塩カルシウム塩マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩アンモニウム塩トリメチルアミン塩トリエチルアミン塩ジシクロヘキシルアミン塩エタノールアミン塩ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩ブロイン塩等の脂肪族アミン塩;N,N−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩;ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等のヘテロ環芳香族アミン塩テトラメチルアンモニウム塩テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第4級アンモニウム塩アルギニン塩リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。酸性塩としては、例えば、塩酸塩硫酸塩、硝酸塩リン酸塩炭酸塩炭酸水素塩過塩素酸塩等の無機酸塩酢酸塩プロピオン酸塩乳酸塩マレイン酸塩フマール酸塩、酒石酸塩リンゴ酸塩クエン酸塩アスコルビン酸塩等の有機酸塩メタンスルホン酸塩イセチオン酸塩ベンゼンスルホン酸塩p−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩アスパラギン酸塩グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によって形成させることができる。水和物を形成する時は、任意の数の水分子配位していてもよい。

0023

プロスタグランジンD受容体の拮抗薬の例は、(±)−3−ベンジル−5−(6−カルボキシヘキシル)−1−(2−シクロヘキシル−2−ヒドロキシエチルアミノ)−ヒダントイン(BW A868C)、(+)−(3R)−3−(4−フルオロベンゼンスルホンアミド)−1,2,3,4−テトラヒドロカルバゾール−9−プロピオン酸ラマトロバン)、(Z)−7−[(1R,2R,3S,5S)−2−(5−ヒドロキシベンンゾ[b]チオフェン−3−イルカルボニルアミノ)−10−ノルピナン−3−イル]ヘプタ−5−エン酸、(Z)−7−[(1R,2R,3S,5S)−2−(ベンゾ[b]チオフェン−3−イルカルボニルアミノ)−10−ノルピナン−3−イル]ヘプタ−5−エン酸(ピナグラジン)もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物である。

0024

好酸球性炎症疾患者に対するこれらの化合物の投与の前後において、本発明の方法による診断方法を行いH-PGDSの発現量の測定、またはPGD2の生成量を測定すれば、該化合物が好酸球性炎症疾患の治療薬であるか否かを確認できる。

0025

本発明は、1)ヒトH−PGDS大量発現トランスジェニックマウスに抗原を感作してアレルギー疾患モデルを作製し、鼻腔、気道あるいは皮膚に抗原を暴露して好酸球性アレルギー疾患を惹起し、
2)好酸球性疾患を誘導する前または後にH−PGDS阻害物質またはDP拮抗薬候補化合物をトランスジェニックマウスに投与し、
3)トランスジェニックマウスにおける好酸球性炎症疾患の状態を、候補物質を与えないトランスジェニックマウスにおける状態と比較する、
ことを含む好酸球性炎症疾患の進行を防止し、または再発の予防に用いる化合物のスクリーニング方法にも関する。

0026

WO 01/24627号に開示されている方法に従って造血器型プロスタグランジンD合成酵素(H−PGDS)大量発現トランスジェニックマウスを作製できる。この文献は本明細書の一部を構成する。ヒト細胞のmRNAから調製したcDNAライブラリーから、ラットH−PGDS遺伝子のcDNA(Cell 90:1085-10975,1997;GenBankAccession No. D82071)をプローブしてヒトH−PGDSのcDNA(Eur. J. Biochem. 267:3315-3322, 2000; GenBank Accession No.NM-014485)をクローニングする。次にベクターpCAGGS(Gene 108: 193-199 (1991))のクローニング部位(Sal I/Not I)にヒトH−PGDSのcDNAを挿入結合し、導入ベクター構築する。図18はこの導入ベクターにおける導入遺伝子の構成である。この導入遺伝子はCMVエンハンサーとチキンβ—アクチンプロモーターをH−PGDScDNAの上流に有しており、マウス染色体に導入されると、これらのエンハンサーおよびプロモーターの作用によりH−PGDSmRNAを大量に発現される。この導入ベクターをマイクロインジェクション法によりFVB系マウス(National Institute of Health Animal Genetic Resourceより入手)の受精卵注入する。遺伝子導入受精卵は定法に従って仮親の卵管移植し、個体へと発生させ出生させる。得られたマウスの尾部からDNAを抽出し、導入遺伝子の配列に基づき合成されたプローブを用いて、サザンブロット法によりトランスジェニックマウスを選別する。

0027

次に、ヒトH−PGDS大量発現トランスジェニックマウスを用いて好酸球性アレルギー性疾患モデルを作製する。マウスに水酸化アルミニウムゲルに懸濁した卵白アルブミンを抗原として腹腔内あるいは気道内に投与(感作)する。感作から2-3週間後に、鼻腔、気道あるいは皮膚に抗原である卵白アルブミン溶液を暴露して好酸球性アレルギー疾患を惹起する。抗原暴露後24時間から72時間後には抗原を暴露しない群(対照群)に比べて鼻腔、気道あるいは皮膚に顕著な好酸球の浸潤が観察される。

0028

以下に本発明を慢性副鼻腔炎に対して実施した例を説明する。これら実施例は説明のためのものであって、本発明が実施例に限定されるものではないことは勿論である。

0029

実施例1

0030

慢性副鼻腔炎の患者に対する治療として、鼻茸の切除手術施行した。摘出した鼻茸での好酸球の浸潤を調べる目的で、鼻茸組織を用いて組織化学的な検査を行った。まず、摘出した鼻茸を10%中性ホルマリン固定したのち、パラフィン切片を作成した。その切片を常法によりヘマトキシリンエオジンHE)染色を行った後、顕微鏡下で観察して浸潤細胞あたりの好酸球数を測定し20%以上を好酸球浸潤高度例、10%以下を非好酸球性鼻茸として分類した。

0031

表1に患者背景を示す。実験に用いた鼻茸は表1の高度例7例と軽度例7例である。その中で7例はダニに対して末梢血中特異的IgE抗体が陽性であった。術前の末梢血好酸球の割合では2群間有意差は無かった。

0032

MBP陽性活性化好酸球でのH−PGDSの発現
鼻茸でのH−PGDSの細胞分布を調べる目的で、H−PGDSと好酸球の指標である主要塩基性蛋白質(MBP)に対する抗体を用いた酵素免疫染色を行った。

0033

まず、10%中性ホルマリンで固定した鼻茸のパラフィン切片を100%キシレンに浸して脱パラフィンを行った。その後0.3%ペプシン溶液にて室温で10分間反応させて抗原性賦活化を行った。その後10%正常ヤギ血清と0.1%Triton Xを含むリン酸緩衝液に室温で1時間反応させて蛋白質非特異的結合部位を塞いだ。そして、H−PGDS抗体(polyclonal rabbit anti-human HPGDS antibody,Cayman Chamical 社製,ブロッキング液で1:10000に希釈)、及び、抗 MBP抗体(monoclonal anti-human eosinophil majorbasicprotein antibody, clone BMK, Biodesign International社より購入。ブロッキング液で1:1000に希釈)と4℃で一晩反応させ、洗浄後、2次抗体として、Alexa488標識抗ウサギIgG抗体とAlexa546 標識抗マウスIgG抗体(Molecular Probes 社製、希釈1:500)と室温で1時間反応させた。充分に洗浄後、共焦点蛍光顕微鏡(BIO-RAD社製 Radiance 2000)を用いて、常法(Nantel F, Fong C, Lamontague S, et al. Expression of prostaglandin D2 receptorsDPand CRTH2 in human nasal mucosa. Prostaglandins and Other Lipid Mediat. 2004; 73: 87-101.)により観察した。

0034

その結果、従来、好酸球の指標とされてきた主要塩基性蛋白質(MBP)とH−PGDSを比較すると、好酸球の浸潤が軽度な患者の組織(L3)では、MBP陽性細胞(好酸球)とH−PGDS陽性細胞はほとんど一致しないが、好酸球の浸潤が顕著な患者(H6)の組織では、MBP陽性細胞のほとんどにH−PGDSが発現することが判明した(図1参照)。単位面積あたりでの陽性染色細胞を比較すると、MBP陽性細胞のうちH−PGDSタンパク質を発現している細胞の割合は、好酸球浸潤高度例の方が有意に高いことが判明した(表1参照)

0035

実施例2
EG2陽性活性化好酸球でのH−PGDSの発現
鼻茸でのH−PGDSの活性化好酸球への分布を調べる目的で、H−PGDSと活性化好酸球の指標であるEG2抗原(Eosinophil Cationic Protein (ECP)活性化された好酸球に認められる、傷害性の蛋白質)を特異的に認識する抗体(Bentley AM, JacobsonMR, Cumberworth V, Barkans JR, Moqbel R. et al. Immunohistology of the nasal mucosa in seasonal allergic rhinitis: increases in activated eosinophils and epithelial mast cells. J Allergy Clin Immunol. 1992;89(4): 877-83.)の発現を免疫組織化学染色法によって比較した。

0036

まず、10%中性ホルマリンで固定した鼻茸のパラフィン切片を100%キシレンに浸して脱パラフィンを行った後、0.3%ペプシン溶液にて抗原性の賦活化を行った。その後10%正常ヤギ血清、0.1%Triton X含有PBSにてブロッキングを行い、一次抗体を添加して4℃で1晩反応させた。一次体として、HPGDS抗体(polyclonal rabbit anti-human HPGDS antibody, Cayman Chamical 社より購入。ブロッキング液で1:10000に希釈),あるいは、抗EG2抗体(monoclonal anti-human eosinophil cationic protein antibody, clone EG2, Pharmacia社製)と反応させ、上述と同様に、2次抗体としてAlexa488標識抗ウサギIgG抗体とAlexa546 標識抗マウスIgG抗体(Molecular Probes 希釈1:500)を用いて免疫染色を行い、共焦点蛍光顕微鏡(BIO-RAD社製 Radiance 2000)にて観察した。

0037

その結果、好酸球の浸潤が軽度な患者の組織(L3)では、EG2陽性細胞(好酸球)とH−PGDS陽性細胞はほとんど一致しないが、好酸球の浸潤が顕著な患者の組織(H6)では、EG2陽性細胞のほとんどにH−PGDSが発現することが判明した。(図2参照)。さらに、単位面積あたりでEG2陽性細胞のうちH−PGDS陽性細胞を発現している割合を好酸球浸潤の程度について比較すると、好酸球浸潤高度例の方が有意に高いことが判明した(表1参照)。

0038

実施例3
慢性副鼻腔炎患者から採取した鼻茸組織検体のウェスタンブロッティング(1)
鼻茸でのH−PGDS蛋白質の発現を調べる目的で、鼻茸組織の抽出液を用いてSDSゲル電気泳動を行い、泳動後の蛋白質の転写ナイロン膜を用いてH−PGDSに対する抗体によるウェスタンブロッティングを行った。

0039

まず、摘出標本約50mgをPBS0.5mlの中でホモジナイズし、7000g(4℃、20分)遠心分離したのち、10万g(4℃、1時間)で遠心分離して上清とマイクロゾーム分画を得た。上清を10/20%SDS−PAGEに、マイクロソームを4/20%SDS−PAGE(いずれも第一化学)で泳動し、PVDFメンブレン(Millipore)に100mA にて1時間転写した。非特異的な結合をスキムミルクでブロッキングした後、H−PGDS抗体(polyclonal rabbit anti-human HPGDS antibody, Cayman Chamical 社より購入;1:5000希釈で使用)、シクロオキシゲナーゼ(COX)−1抗体(polyclonal rabbit anti-human COX-1 antibody, Cayman Chamical 社より購入;1:1000希釈で使用)、COX−2抗体(monoclonal mouse anti-human COX-2 antibody, Cayman Chamical 社より購入;1mg/mlに希釈して使用)を5%スキムミルクと0,1%Tween 20 含有PBSで希釈して4℃で一晩反応させた。次に2次抗体として、HRP標識anti−mouseIgG抗体または、anti−rabbit IgG抗体(Jackson Laboratories社より購入。トリス緩衝液で1:1000に希釈して使用)と室温で1時間反応させた。その後ECLdetection reagent (Amasham International 社製)と室温で2分間反応させた後Kodak XOMAT AR film(Eastman Kodak 社製)15分間焼付け現像した。

0040

その結果、左側7例は病変部位に好酸球の浸潤が顕著であった群(H1〜7)で、右側7例は、好酸球の浸潤が軽度であった群(L1〜7)である。左から症例H1〜7とL1〜7を示す。アレルギー性鼻炎の有無にかかわらず左側(H1〜7)は全例でH−PGDSの発現が顕著であった。H−PGDSの発現と病態の重症度に強い相関が認められた。右側(L1〜7)は7例中3例に強い発現が認められる。ところが、シクロオキシゲナーゼ(COX)−1あるいはCOX−2の発現と病態の重症度には相関が認められなかった。また、好酸球浸潤が軽度な群中でH−PGDS発現が高かった3例はいずれも末梢血好酸球の割合が高く、好酸球とH−PGDSの関わりが推察される。(図3参照)。

0041

実施例4
鼻茸切除時点でのH−PGDSタンパク質の発現と再発率の関係を調べる目的で、鼻茸切除後の経過を追跡し、2年以内に副鼻腔粘膜の腫脹が見られた症例を再発群とし、2年以内に粘膜の腫脹が見られなかった症例を経過良好群として、H−PGDSの発現を調べた。患者背景を表2に示す。

0042

慢性副鼻腔炎患者から採取した鼻茸組織検体のウェスタンブロッティング(2)
実施例3と同様の方法で、H−PGDS抗体、シクロオキシゲナーゼ(COX)−1、COX−2抗体にてウェスタンブロッティング(Kanaoka Y, Ago H, Inagaki E, et al. Cloning and crystal structure of hematopoietic prostaglandin D synthase. Cell 1997; 90:10851095.)を行った。

0043

その結果、再発群では(左から症例R1〜4)鼻茸におけるH−PGDSの発現量が高かった。一方、経過が良好であった症例では(良好群左から症例R8〜11)H−PGDSの発現が低かった。従って、H−PGDS発現量で、鼻茸の再発性を予測することができる(図4参照)。

0044

実施例5
慢性副鼻腔炎患者から採取した鼻茸組織検体の定量的PCR
H−PGDSmRNAの発現と再発率との関係を調べる目的で、定量的RT−PCR(Kanaoka Y, Ago H, Inagaki E, et al. Cloning and crystal structure of hematopoietic prostaglandin D synthase. Cell 1997; 90:10851095.)を行った。

0045

手術で摘出した後、速やかに−80℃凍結保存した鼻茸から、RN easy Mini Kit およびOmniscriptRTKit (共にQIAGEN)を用いtotal RNAの抽出およびcDNAへの逆転写を行った。定量的PCRはLight Cycler−FastStart DNA Master SYBR Green1(Roche)を用いた。H−PGDSのプライマーをF1:5’GAATAGAACAAGCTGACTGGC(配列番号1)、 R1:5’AGCCAAATGTGTGTTTTTGG(配列番号2)とデザインし、95℃、10分の熱変性した後、95℃ 15秒;57℃ 5秒;72℃ 10秒を40サイクルの条件で施行した。内部標準としてGAPDH遺伝子について測定した。GAPDHのプライマーはF1:5’TGAACGGGAAGCTCACTGG(配列番号3)、R1:5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA(配列番号4)とデザインし、95℃、10分の熱変性した後、95℃ 15秒;63℃ 20秒;72℃ 10秒を40サイクルの条件で行った。cDNAの定量はLight Cycler TM System(Roche)を用いた蛍光測定法によって行った。

0046

その結果、H−PGDSタンパク質の結果と同様に、2年以内に鼻茸が再発した症例では鼻茸におけるH−PGDSの発現量が高かった。一方、経過が良好であった症例ではH−PGDSの発現が低かった(図5参照)。
以上の結果は、患者から採取した組織のH−PGDSタンパク質やmRNA量をウェスタンブロッティング法やPCR法で定量することによって、鼻茸の再発性を予測することができることを示している。

0047

実施例6
好酸球でのH−PGDS発現と再発率との関係を調べる目的で、実施例2と同様の方法で、好酸球EG2抗体とH−PGDSとの蛍光抗体染色を行った。
その結果、経過良好群(症例R12)では、H−PGDSとEG2陽性細胞(図6、矢印)はほとんど一致しないが、再発群(症例R6)では、EG2陽性細胞のほとんどがH−PGDS陽性細胞と一致する。以上の結果は、H−PGDSとEG2の両方が陽性の活性化好酸球の多い鼻茸は再発率が高いことを示している。

0048

以上詳述したように、本発明は鼻茸等の好酸球性炎症疾患において、病変部位に集積した好酸球に誘導されるH−PGDSを検出したり、鼻腔洗浄液や気管支肺胞液中のPGD2を測定したりすることにより、病態の重症度を診断したり、これら疾患の再発性を予測する方法を提供するものである。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

新着 最近 公開された関連が強い 技術

この 技術と関連性が強い 技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する挑戦したい社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ