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技術 ハリエニシダ由来のレクチンタンパク質をコードする遺伝子、その遺伝子がコードするタンパク質及びその製造方法

出願人 北海道
発明者 福島久代
出願日 2002年3月20日 (15年9ヶ月経過) 出願番号 2002-576680
公開日 2004年7月15日 (13年6ヶ月経過) 公開番号 WO2002-077238
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 技術情報センター カラム通過液 サブユニット同士 血液型判定 生成溶液 ジェネレート コンストラクション 血球浮遊液

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課題・解決手段

(1)ハリエニシダゲノムDNA中から単離された抗H凝集活性を示す新規レクチンをコードする遺伝子(UEL1遺伝子)及びこれと実質的に等価な塩基配列からなる遺伝子、(2)それらの遺伝子がコードする新規レクチンタンパク質、(3)その遺伝子を込み込んだ組換えベクター、及び(4)その組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換し、その形質転換体を培養し培養物から抗H凝集活性を示すポリペプチド採取する抗H凝集活性を示すタンパク質製造方法

概要

背景

概要

(1)ハリエニシダゲノムDNA中から単離された抗H凝集活性を示す新規レクチンをコードする遺伝子(UEL1遺伝子)及びこれと実質的に等価な塩基配列からなる遺伝子、(2)それらの遺伝子がコードする新規レクチンタンパク質、(3)その遺伝子を込み込んだ組換えベクター、及び(4)その組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換し、その形質転換体を培養し培養物から抗H凝集活性を示すポリペプチド採取する抗H凝集活性を示すタンパク質製造方法

目的

本発明の課題は、ハリエニシダに由来する従来未知のレクチンを探究するとともに、ハリエニシダレクチンをコードする遺伝子配列解明して、遺伝子工学的にレクチンタンパク質を製造する方法を提供する

効果

実績

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請求項1

配列番号1に記載の塩基配列、その相補的配列、またはこれらの配列を構成するコドンの一部が欠失若しくは置換されてなる塩基配列を含む、抗H凝集活性を示すレクチンタンパク質をコードする遺伝子。

請求項2

配列番号1に記載の塩基配列のうち31番〜858番の塩基配列、その相補的配列、またはこれらの配列の1以上のコドンについてアミノ酸配列が異ならないように他のコドンに置換された配列を含む請求の範囲1に記載の遺伝子。

請求項3

配列番号2に記載のアミノ酸配列またはその配列を構成する1以上のアミノ酸が欠失若しくは置換されてなるアミノ酸配列を含み、抗H凝集活性を示すタンパク質

請求項4

配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。

請求項5

請求の範囲1または2に記載の遺伝子を組み込んだ組換えベクター

請求項6

請求の範囲5に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換し、その形質転換体を培養し、培養物から抗H凝集活性を示すタンパク質を採取する抗H凝集活性を示すタンパク質の製造方法

請求項7

組換えベクターがプラスミドであり、プラスミドをアグロバクテリウムに導入して形質転換し、植物細胞をこの形質転換アグロバクテリウムに感染させ、感染植物細胞から抗H凝集活性を示すタンパク質を採取する請求の範囲6に記載の方法

請求項8

植物細胞がタバコ培養細胞である請求の範囲7に記載の方法。

技術分野
本発明は、ハリエニシダ(学名:Ulex europaeus)に由来するレクチンをコードする遺伝子、その遺伝子がコードする新規レクチンタンパク質、その遺伝子を込み込んだ組換えベクター及びそのタンパク質製造方法に関する。
背景技術
レクチンは、特定の糖構造に親和性を有し、細胞膜における複合糖質糖タンパク質または糖脂質)の糖鎖部分結合して細胞凝集等の効果を及ぼす物質として知られている。このうちハリエニシダ種子の粗抽出物に含まれているレクチンは、ヒトのH抗原O型血球膜等に存在する抗原)と特異的に反応する性質(抗H凝集活性)を有する。この性質を利用して、ハニエリシダ種子中のレクチンは、ABO式血液型判定においてO型血球凝集素として用いられている。
ハリエニシダ種子から得られるレクチンとして、これまで3種類のタンパク質(UEA−I、UEA−II、UEA−III)がアフィニティークロマトグラフィーによって単離、精製されている。このうちUEA−IとUEA−IIについては全アミノ酸配列報告されており(J.Biochem.109(1991)p650−658)、UEA−IIIについては部分アミノ酸配列が報告されている(Biol.Chem.Hoppe−Seyler 372(1991)p95−102)。しかし、ハリエニシダが前記3種類とは異なるレクチンを含むか否かは知られておらず、また、UEA−I、UEA−II及びUEA−IIIのいずれについても、それらをコードする遺伝子配列はこれまで知られていない。
従って、本発明の課題は、ハリエニシダに由来する従来未知のレクチンを探究するとともに、ハリエニシダレクチンをコードする遺伝子配列を解明して、遺伝子工学的にレクチンタンパク質を製造する方法を提供することにある。
発明の開示
本発明者は、前記課題を解決するため、ハリエニシダのゲノムDNA中から新規なレクチンをコードする遺伝子(UEL1遺伝子)を単離し、その塩基配列を決定した。さらに、UEL1遺伝子をベクターに組み込み、このベクターによって宿主細胞形質転換し、これを用いて新規なレクチンを製造する方法を開発し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下に示すレクチンをコードする遺伝子、その遺伝子によりコードされるレクチンタンパク質及びその遺伝子を用いて遺伝工学手法により抗H凝集活性を示すタンパク質を製造する方法を提供するものである。
(1)配列番号1に記載の塩基配列、その相補的配列、またはこれらの配列を構成するコドンの一部が欠失若しくは置換されてなる塩基配列を含む、抗H凝集活性を示すレクチンタンパク質をコードする遺伝子。
(2)配列番号1に記載の塩基配列のうち31番〜858番の塩基配列、その相補的配列、またはこれらの配列の1以上のコドンについてアミノ酸配列が異ならないように他のコドンに置換された配列を含む前記1に記載の遺伝子。
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列またはその配列を構成する1以上のアミノ酸が欠失若しくは置換されてなるアミノ酸配列を含み、抗H凝集活性を示すタンパク質。
(4)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
(5)前記1または2に記載の遺伝子を組み込んだ組換えベクター。
(6)前記5に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換し、その形質転換体を培養し、培養物から抗H凝集活性を示すタンパク質を採取する抗H凝集活性を示すタンパク質の製造方法。
(7)組換えベクターがプラスミドであり、プラスミドをアグロバクテリウムに導入して形質転換し、植物細胞をこの形質転換アグロバクテリウムに感染させ、感染植物細胞から抗H凝集活性を示すタンパク質を採取する前記6に記載の方法。
(8)植物細胞がタバコ培養細胞である前記7に記載の方法。
発明の詳細な説明
(A)レクチンコード遺伝子
本発明のレクチンコード遺伝子は、既知のハリエニシダレクチン(UEA−I)のアミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを設計し、これをハリエニシダのゲノムDNAに適用してPCR法により遺伝子の内部配列を求め、その結果に基づいて新たなプライマーを設計することにより遺伝子全長の塩基配列として求めた配列番号1の遺伝子及びこれと実質的に等価な塩基配列からなる遺伝子である。
ここで、配列番号1の遺伝子及びそれと実質的に等価な塩基配列とは、
(1)配列番号1に記載の塩基配列
(2)配列番号1に記載の塩基配列の相補的配列、
(3)上記(1)または(2)の配列を構成するコドンの一部が欠失または置換されてなる塩基配列、及び
(4)上記(1)〜(3)にさらにコドンが付加されてなる塩基配列
を含む。但し、(3)におけるコドンの欠失または置換、(4)におけるコドンの付加は、欠失、置換または付加後の塩基配列によりコードされるタンパク質が抗H凝集活性を示す範囲のものである。
このような(3)または(4)の塩基配列は、(1)または(2)との相同性が通常は80%以上、好ましくは90%以上である配列を含み、より具体的には
(a)アミノ酸配列が異ならないようにコドンを置換した塩基配列、及び
(b)上記配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするDNA塩基配列を含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、温度条件で言えば、完全ハイブリッド融解温度(Tm)より約5℃〜約30℃、好ましくは約10℃〜約25℃低い温度ハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。
配列番号1の塩基配列のうち、31番〜858番の塩基配列が本発明のレクチンタンパクポリペプチド)をコードする領域である。従って、
(i)配列番号1の31番〜858番の塩基配列、
(ii)(i)の相補的配列、
(iii)(i)または(ii)の配列についてアミノ酸配列が異ならないようにコドンを置換して得た塩基配列、及び
(iv)上記配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA塩基配列を含む遺伝子の産物に抗H凝集活性が認められる。
なお、本発明では、アミノ酸配列に基づいてプライマーを設計し、適当なPCR法を組み合わせてゲノムDNAを増幅する方法を採用したが、その他の通常知られているクローニング法によっても、抗H凝集活性を示すタンパク質をコードするDNAを得ることができる。例えば、(1)ハリエニシダ種子から抽出したポリ(A)+RNAからcDNAライブラリ合成して、既知のレクチン(UEA−I)等のアミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブまたは対応する抗体を用いてcDNAライブラリをスクリーニングする方法、(2)既知のアミノ酸配列に基づいてプライマーを設計し、ハリエニシダのDNAあるいはcDNAを適当なPCR法により増幅し、得られたPCR産物プローブとしてcDNAライブラリ、あるいはハリエニシダゲノムライブラリをスクリーニングする方法等によって得ることができる。かくして得られたDNAの塩基配列はダイデオキシチェインターミネーター法(proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74,5463−5467(1977)Sanger,F.et al.)等によって解析することができる。
(B)レクチンタンパク質
本発明のレクチンタンパク質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列またはその配列を構成する1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されてなるアミノ酸配列を含み、抗H凝集活性を示すタンパク質である。
アミノ酸配列の欠失、置換及び付加は、塩基配列におけるコドンの欠失、置換及び付加に対応したものである。
配列番号2に記載のアミノ酸配列と既知のハリエニシダレクチンのアミノ酸配列とを比較した場合、抗H凝集素活性に関係すると考えられる配列については、UEA−Iレクチンでは、128から137番目に位置する10アミノ酸「Asp Thr Ile Gly Ser Pro Val Asn Phe Trp」が糖との結合部位であると考えられており、この部位は他のマメ科レクチンにおいても比較的保存されている配列である(J.Biochem.111(1992)p.436−439)。
本発明のUEL1においては、この部分は154から163番目の10アミノ酸「Asp Thr Ile Gly Ser Pro Val Asn Ser Trp」に相当し、UEA−Iと10アミノ酸中9アミノ酸が同じである。UEL1の塩基配列では、この部分は490から519塩基に対応する。
(C)レクチンの製造方法
本発明のレクチンは、上記のアミノ酸配列に基づいて合成することも可能であるが、上記で得た塩基配列に基づいて遺伝子工学的手法によって製造することができる。典型的には、上記(A)で説明した本発明の遺伝子を適当なベクターを介して宿主細胞に導入し、当該遺伝子を発現させることにより生産することができる。発現は、本発明の遺伝子に係るDNAを用いて直接発現させてもよいし、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させてもよい。また、上記(A)で説明した遺伝子の全長を発現させてもよいし、一部を発現させてもよい。
タンパク質の製造に用いられる慣用宿主−ベクター系を使用することができる。例えば、大腸菌発現システムを使用することが可能であり、大腸菌K12株等またはその変異株発現ベクターを含む、pETベクターシステム(ノヴァジェン(Novagen)社)、PinPointXa、pGEMEX、pET−5(プロメガ(Promega)製)、pGEX−5X(ファルマシア(Pharmacia)製)等が例として挙げられる。
また、例えば大腸菌・酵母シャトルベクターであるpPIC3K(インヴィトロジェン(Invitrogen)社製)とPichia pastorisのような酵母を宿主とした酵母発現システムであるPichia Expression Kit(Invitrogen社)、動物細胞発現系であるBacVectorシステム(Novagen社)、無細胞発現系であるラピッドトランスレーションシステムRTS500(Rapid Translation System RTS500)(ロシュ(Roche)社)等を用いることができる。また、pBI101やpBI121(クローンテク(Clonetech)社)といったベクター等に組み込み、アグロバクテリウムによる形質転換法を用いてタバコ等の植物に導入してレクチンを発現させることもできる。
宿主細胞を、好適な培地で培養し、レクチンを産生蓄積させ、常法により菌体分離破砕し、菌体中の組換えタンパク質を抽出する。抽出した組換えタンパク質を、例えば変性SDS−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動等の手段により分離し採取することによって、本発明のレクチンを製造することができる。
また、以上の通常のタンパク質分離法の他にも、糖(フコース)を結合させた担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法を用いることにより本発明のレクチンを製造することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は以下の記載により限定されるものではない。
実施例1:ハリエニシダからのゲノムDNA抽出
ハリエニシダ幼若植物体地上部(約50mg)を液体窒素中で凍結させ、乳鉢乳棒を用いて粉砕し、0.6mlのCTAB緩衝液(2%セチルトリメチルアンモニウムブロミドトリス塩酸(0.1M,pH8)、EDTA(0.02M,pH8)、塩化ナトリウム(1.4M))を加えて撹拌し、65℃で30分間加温した。その後、0.7mlのクロロホルムイソアミルアルコール(24/1)混合液を加えてさらに撹拌し、生成溶液遠心分離した。遠心分離により得た上清に0.9mlの沈殿用CTAB緩衝液(1%セチルトリメチルアンモニウムブロミド、トリス塩酸(0.05M,pH8)、EDTA(0.01M,pH8))を加えて撹拌し、再び遠心分離した。遠心分離により得た沈殿を緩衝液(0.01Mトリス塩酸、EDTA(1mM,pH8))に溶解後、エタノール沈殿を行って精製ゲノムDNAを得た。
実施例2:ディジェネレートプライマーの合成とPCR法によるDNAの増幅
既知のUEA−Iレクチンのアミノ酸配列に基づいてディジェネレートプライマーUEA−F3(配列番号3)、UEA−R4(配列番号4)を合成した。配列表中、yはcまたはt、nはaまたはcまたはgまたはt、rはaまたはg、wはaまたはt、sはcまたはgを表わす。
実施例1で得たハリエニシダのゲノムDNAを鋳型としてプライマー(UEA−F3及びUEA−R4)を用いてPCR反応を行った。反応条件は、変性(94℃,1分)、アニーリング(51℃,1分)、伸長(72℃,1.5分)を1サイクルとし、これを30サイクル繰り返した。
実施例3:PCR産物の塩基配列決定
実施例2で得たPCR産物をpGEM−T Easyベクターシステム(プロメガ社製)を用いてベクターにライゲーションし、ベクターをコンピテント大腸菌XL1−Blue株(ストラタジーン(Stratagene)社)に導入して、アンピシリン(50μg/ml)を含むLBプレート上で一晩培養した。培地上で生育した大腸菌を培養し、培養菌体からアルカリ−SDS法を用いてプラスミドを抽出、精製した。
精製プラスミド中に挿入されたDNA配列は、M13フォワードリバースプライマー(ニッポンジーン社)、ビッグダイターミネーター・サイクルシーケンシングリアクションキット(Big Dye Terminator Cycle Sequencing reaction kit)(ABI社製)、ABI PRIZM310ジェネティックアナライザー(Genetic Analyzer)(ABI社製)を用いて塩基配列を決定した。このDNA配列から推定されるアミノ酸配列はUEA−Iタンパク質のアミノ酸配列と極めて高い相同性を示した。よって該DNA配列はレクチンをコードする遺伝子内部の部分配列であると考えられる。
実施例4:DNA配列の延長
レクチンタンパク質をコードする全長DNA配列を得るために、tail−PCR法によって部分配列を延長した。実施例3で得られた部分配列に基づいて、その上流側を増幅するように設計したプライマー(UEA11R(配列番号5))、及び下流側を増幅するように設計したプライマー(UEA44F(配列番号6))をそれぞれ合成した。これら合成プライマーと市販のランダムプライマーであるDNAオリゴマー(12)セットA(ニッポンジーン社製)を用いて、tail−PCR法(秀潤社、植物のPCR実験プロトコールp83−89)に準じてPCR反応を行った。得られたPCR産物は、実施例3と同様にクローニングした後その塩基配列を解析した。
上記解析の結果、上流側を増幅するように設計したプライマーによって得られたPCR産物は、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列がUEA−Iタンパク質のN末端を含む部分と極めて高い相同性を示し、下流側に対応するアミノ酸配列はUEA−Iタンパク質のC末端を含む部分と極めて高い相同性を示した。よって、これらのPCR産物はレクチンタンパク質の上流及び下流をコードすると考えられる。
実施例5:レクチンタンパク質をコードする完全長遺伝子の合成
実施例3で得た遺伝子内部の部分配列、実施例4で得たその上流及び下流の配列をいずれも含むような完全長の遺伝子を合成するために、実施例4で得られた配列に基づいて、プライマー(UEA−F(配列番号7)、UEA−R(配列番号8))を合成してハリエニシダのゲノムDNAをPCR反応によって増幅した。得られたPCR産物の塩基配列を解析したところ、配列番号1に示すDNA配列を得た。このDNA配列を有する遺伝子をUEL1遺伝子と命名した。
UEL1遺伝子は、31から33塩基目に開始コドンATGを、856から858塩基目に終止コドンTGAをもっている。この間の領域がコードするアミノ酸配列を配列番号2に示す。
UEL1遺伝子がコードするタンパク質は275のアミノ酸からなり、推定分子量は30138Daである。このタンパク質はUEA−1レクチンタンパク質と90%の相同性を示した。また、このアミノ酸配列をインターネット上の米国国立生物科学技術情報センター(National Center for Biotechnology Information)(USA)のデータベースを用いてホモロジー検索したところ、Cytisus sessilifoliusレクチン、Maackia amurensisレクチン等、数多くのマメ科レクチンと相同性(50%〜70%)があり、新規のレクチンであると考えられる。
実施例6:形質転換された大腸菌による新規レクチンタンパク質の製造方法
大腸菌における組換えUEL1レクチンの発現は、大腸菌発現システムpET−32 Xa/LICベクターシステム(Novagen社)を用いて行った。
UEL1遺伝子の開始コドンを含むプライマー(UEL1/LIC−F(配列番号9))、及び終止コドンを含むプライマー(UEL1/LIC−R(配列番号10))をキットのプロトコルに従って設計、合成した。これを用いてPCR法によりUEL1遺伝子を合成し、これをpET32ベクターに組み込み、該ベクターDNAをコンピテント大腸菌(Novablue Singles(Novagen社))に導入し、50μg/mlアンピシリンを含むLBプレート上で一晩培養した。生育してきた大腸菌を培養し、培養菌体から抽出、精製したプラスミドDNAを発現用のコンピテント大腸菌BL21(DE3)株に導入して、大腸菌を形質転換した。
形質転換した発現用大腸菌を1Mイソプロピル−β−Dガラクトシドを含むLB培地(1%バクトリプトン、0.5%バクトイーストエキストラクト、0.5%塩化ナトリウム)中、30℃で一晩培養した。得られた菌体を遠心分離して、超音波処理によって菌体を破砕、菌体中の組換えタンパク質を抽出、精製した。精製した組換えタンパク質を変性SDS−ポリアクリルアミドゲル(SDS−PAGE)により電気泳動を行ったところ、分子量約50kDaのタンパク質が得られた。
組換えタンパク質は予想されるUEL1タンパク質の分子量より約20kDa大きかったが、これは、ベクターによってコードされるチオレドキシンとの融合タンパク質として発現されているためと考えられる。組換えタンパク質中のレクチンは、Factor Xa(ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)社)を用いてプロテアーゼ処理を行い、チオレドキシンを切断して精製、分離した。切断後のレクチン部分の分子量は約30kDaでUEL1タンパク質の推定分子量と同じであった。
実施例7:タバコ培養細胞によるUEL1タンパク質の発現
(1)プラスミドのコンストラクションとアグロバクテリウムの形質転換
UEL1遺伝子の全長コード領域に対してUEL1/Xba−Fプライマー:tgcaaatctagaaagtgatgtc(配列番号11)およびUEL/Sac−Rプライマー:aagtagagctccaaatcatgcag(配列番号12)を用いてPCRを行なった後、制限酵素NdeIおよびXhoIで消化し、ベクターpBI121(クロンテック(Clontech)社)をXbaIおよびSacIで消化したものにライゲーションし、コンピテント大腸菌XL−1 Blue株に導入して得られた形質転換体からプラスミドDNA(pre−UEL1−pBI)を抽出した。pre−UEL1−pBIプラスミドでアグロバクテリウムC58c1PMP90株をエレクトロポーレーション法によって形質転換した。形質転換アグロバクテリウムを50mg/Lのカナマイシンを含むLB固形培地上で生育させ、UEL1遺伝子をもつアグロバクテリウムのコロニーを50mg/Lのカナマイシンを含むLB液体培地中で一晩培養し、タバコ培養細胞への感染に用いた。
(2)タバコBY−2培養細胞の形質転換
タバコ培養細胞BY−2の形質転換は「植物の細胞を観る実験プロトコール」(福田裕他著、秀潤社(1997)、p125−129)の方法に従い、UEL1遺伝子を導入したアグロバクテリウムをタバコBY−2培養細胞に感染させて行った。形質転換BY−2カルスは、カナマイシンおよびカルベニシリン添加したBY−2固形培地上で選抜し、生育させた。
選択培地上に生育したトランスジェニック(形質転換)BY−2カルス(35クローン)から、それぞれ一部を取りPBS緩衝液(リン酸緩衝化生食塩水)を加えてエッペンドルフチューブ中ですりつぶし、15000rpm×5分(4℃)で遠心後、上清の一部を用いて、0.01%(w/v)トリプシンを添加して37℃で1時間処理した3%(v/v)新鮮ヒトO型血球生理食塩水浮遊液を加えて混合し、凝集活性の有無を確認した。
この結果、35クローン中18クローンが強い(++〜+++)ヒトO型血球凝集能を示した。また、10クローンが弱く(+)ヒトO型血球を凝集し、これらの細胞内で活性のあるUEL1タンパク質が合成されていることが示された。
実施例8:タバコBY−2培養細胞からのリコンビナントレクチンの精製
以下の手順により、タバコ培養細胞由来のリコンビナントUEL1レクチン(rUEL1)を精製した。
実施例7においてヒトO型血球に対して強い凝集活性を示した18クローンのトランスジェニックカルスを選抜し、カナマイシン、カルベニシリンを添加したBY−2液体培地中で2週間旋回培養し、ほぼ飽和状態に達したBY−2培養細胞を8000rpm×30分(4℃)で遠心分離して培養上清細胞画分に分離した。細胞画分は−80℃で凍結した後、室温で融解させ、等量の1.5%(w/v)Triton X−100入りのPBS緩衝液を加えて混合し、細胞を溶解させた。溶解後8000rpm×30分(4℃)で遠心分離して得られた上清を透析チューブ入れ溶液中の界面活性剤を除くため、蒸留水中で2日間透析した。
透析後の細胞上清をろ紙(東洋ろ紙No.2)でろ過をして固形物を除いた後、フコース−アガロース生化学工業)10mlを詰めたカラムに通して細胞上清中のUEL1タンパク質を吸着させた。結合後のカラムをPBSバッファー洗浄後、吸着したフコース結合画分を20mMジアミノプロパン(DAP)溶液を用いて溶出させた。溶出画分(e1〜e6)の一部を、細胞上清(SUP)、カラム通過液(f−t)、精製UEA−I(シグマ(Sigma)社)とともにSDS−PAGE(メルカプトエタノール添加)にかけた。結果を図1に示す。
rUEL1が精製UEA−1と同様に31kDa付近に現れているのが理解されるであろう。なお、実施例9で述べるように、rUEL1も精製UEA−Iも、メルカプトエタノール添加SDS−PAGEでは変性(ジスルフィド結合還元的切断)のため2量体が分かれて2本のバンドになっているものと考えられる。
溶出液を一晩蒸留水中で透析した後凍結乾燥し、精製リコンビナントUEL1タンパク質の結晶を得た。300mlの飽和BY−2細胞培養液から最終的に約3.6mgの精製リコンビナントUEL1(rUEL1)タンパク質が得られた。
実施例9:リコンビナントUEL1タンパク質の解析
(1)血球凝集活性
血球凝集活性の測定をするため、BY−2から精製したUEL1タンパク質、および精製UEA−I(シグマ(Sigma)社)を0.02mg/mlの濃度になるようにPBS緩衝液に溶解し、PBS緩衝液で2倍段階希釈したもの25μlに、等量のトリプシンで処理をした2%ヒトO型血球浮遊液を加えた。血球を加え混合してから20分後に凝集の有無を観察した。結果を表1に示す。表中、+++は強い凝集を、++は中程度の凝集を、+は凝集を示し、−は凝集陰性を示す。

上記の結果に示されるように、タバコ培養細胞由来のリコンビナントUEL1タンパク質(rUEL1)はトリプシンで処理したヒトO型血球浮遊液に対し、128倍希釈(約0.16μg/ml)まで凝集活性を示し、その強さは従来既知のUEA−Iタンパク質と同程度またはそれ以上である。
(2)糖による凝集阻害実験
BY−2由来の精製UEL1タンパク質、および市販の精製UEA−Iを上記(1)で測定した凝集活性に基づいて凝集素価が4倍(約0.6μg/ml)となるようにPBS緩衝液で希釈した。希釈したレクチン溶液25μlに、0.2Mから0.001Mになるように希釈した糖(フコース、ガラクトースマルトースラクトースサッカロースサリシン、およびマンノース水溶液25μlを加えて混合した後、等量のトリプシンで処理した2%ヒトO型血球浮遊液をさらに加えて混合した。血球を混合してから20分後に凝集活性の判定を行い、血球の凝集を完全に阻害(上記(1)の基準で「−」)する糖の最小濃度を求めた。結果を表2に示す。

糖による阻害実験の結果、リコンビナントUEL1、精製UEA−Iのいずれも、ガラクトース以下の糖では0.2Mでも阻害が認められず、フコースによってのみ凝集が阻害が認められた。凝集阻害が起こる糖の最小濃度は、リコンビナントレクチン(rUEL1)では0.001M、精製レクチンでは0.005Mであった。
(3)分子量の推定
分子量の推定には、変性条件下でのSDS−PAGE電気泳動のバンドの移動度から分子量を推定すると共に、泳動緩衝液からメルカプトエタノールを除いた非変性条件下でのアクリルアミドゲル電気泳動を行い、それぞれの泳動条件下でのバンドの移動度から分子量の推定を行った。SDS−PAGE電気泳動はLaemmliの方法(Nature 15,Vol.227(259),pp.680−685(1970))に従った。
結果を図2に示した。図中、Nは非変性条件(メルカプトエタノール非添加PAGE)、Rは変性条件(メルカプトエタノール添加SDS−PAGE)を示す。
大腸菌由来のリコンビナントUEL1(E.Coli rUEL1)は非変性条件下、変性条件下のいずれでも約30kDaに相当する位置に単一のバンドが検出された。一方、タバコ培養細胞由来のリコンビナントUEL1タンパク質(BY−2 rUEL1)は非変性条件下では約53kDa、変性条件下では約32kDaと33kDaに2本のバンドが検出された。精製UEA−Iタンパク質は、非変性条件下では約50kDa、変性条件下では約32kDaと33kDaに2本のバンドが見られた。これらの結果から、タバコBY−2培養細胞由来のリコンビナントUEL1タンパク質は、変性条件下では精製UEA−Iと同様の泳動像を示し、非変性条件下では、みかけの分子量において若干の違いは認められるが、UEA−Iと同様に2量体を形成している可能性が示唆された。また、非変性条件下における挙動の違いから、UEL1とUEA−Iとはサブユニット立体構造はほぼ同じであると予想されるものの、アミノ酸の置換によって、サブユニット同士相互作用において異なっていると考えられる。
産業上の利用可能性
本研究においてハリエニシダ種子から抽出されたUEA−Iレクチンと同様の活性を有するリコンビナントUEL1レクチンが得られたことにより、リコンビナントタンパク質の発現系を利用したUEL1レクチンの構造糖鎖との結合機構の詳細な解析、例えばアミノ酸配列を改変して糖鎖との結合活性に及ぼす影響を調べる等の研究が可能になり、抗Hレクチンの反応機構に関する研究に寄与することが期待される。
また、UEA−Iタンパク質は、血液型判定や、癌やクローン病などの病気マーカーとしても広く用いられており、リコンビナントレクチンを用いた研究は、植物レクチンの解析に限らず、例えば、ヒトの任意血液型抗原特異性をもつように糖鎖結合部位の構造を改変したレクチンを合成して血液型亜型も判定できるレクチンを作成したり、新たな腫瘍マーカーを作成する等の研究が可能になり、ヒトにおける糖鎖抗原の発現や構造の解析においても有用であると考えられる。
本発明のレクチン遺伝子を宿主細胞において発現させることによりヒトのH抗原に反応するレクチンタンパク質を高純度かつ効率的に製造することができる。また、従来未知のレクチンを誘導すること、既知のレクチンよりも抗H凝集活性の高いレクチンを得ることも可能となり、ひいてはABO型血液におけるO型判定の感度の向上等を通じて微少量の試料での血液型判定も期待できる。
さらに、本発明では、300mlのBY−2細胞培養液から約4mgの精製UEL1タンパク質が得られた。ハリエニシダ種子からアフィニティークロマトグラフィーによって抽出した場合には、1kgの種子から約44mgの精製レクチンが得られるが、種子からの抽出は硬い種皮を壊すための粉砕等の機器操作が必要であるのに対し、BY−2細胞は界面活性剤を加えることによって容易に破砕でき、また生体からの抽出には個体間、また種子の成長段階によって収量や力価が変わる可能性が高いが、BY−2細胞は均一な細胞集団であるため収量、力価とも安定して得られ、物質生産側面から見てもリコンビナント抗Hレクチンの製造法はきわめて有用な方法であると考えられる。
配列表








【図面の簡単な説明】
図1は、本発明によるリコンビナントレクチン(フコースアガロースゲル画分e1〜e6)と従来既知のハリエニシダレクチン(UEA−I)のSDS−PAGE像を示す写真である。
図2は、E.coliから得た本発明のリコンビナントレクチン(E.coli UEL1)、タバコBY−2細胞から得た本発明のリコンビナントレクチン(BY−2 UEL1)及び従来既知のハリエニシダレクチン(UEA−I)の非変性PAGE(図中、N)と変性SDS−PAGE(図中、R)の結果を対比して示した写真である。

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