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技術 被測定物質の検出又は測定用キット、及び検出又は測定方法

出願人 日水製薬株式会社
発明者 奥裕一神谷尚徳篠原久美子柴原裕亮上坂良彦
出願日 2000年9月11日 (20年3ヶ月経過) 出願番号 2001-523863
公開日 2003年4月2日 (17年8ヶ月経過) 公開番号 WO2001-020328
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード 結合ポイント バイオセル リリースパッド 結合子 着色色素 HBs抗体 HBs抗原 同一物質
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課題・解決手段

キットを製造する際の収率が高く、容易にリガンドを標識することができ、試薬感度コントロールすることができるキット、及びその製造方法を提供する。リガンドL1に対して2価以上の結合性を有する被測定物質Aの検出・測定キットであり、以下の受容体I、受容体II、固相複合体を包含する。受容体I:物質B1に結合性を有する物質R1にマーカーMを結合させてなるR1−Mと、リガンドL1と物質B1からなるL1−B1を結合させたL1−B1−R1−M。受容体II:被測定物質Aとは異なる結合性を有する物質B2をリガンドL2に導入したL2−B2と、物質B2に対して結合性を有する物質R2にB2とは異なる結合性の結合子B3を結合させてなるR2−B3を予め結合させて得られたL2−B2−R2−B3。固相複合体:結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなるR3−固相。

概要

背景

概要

キットを製造する際の収率が高く、容易にリガンドを標識することができ、試薬感度コントロールすることができるキット、及びその製造方法を提供する。リガンドL1に対して2価以上の結合性を有する被測定物質Aの検出・測定キットであり、以下の受容体I、受容体II、固相複合体を包含する。受容体I:物質B1に結合性を有する物質R1にマーカーMを結合させてなるR1−Mと、リガンドL1と物質B1からなるL1−B1を結合させたL1−B1−R1−M。受容体II:被測定物質Aとは異なる結合性を有する物質B2をリガンドL2に導入したL2−B2と、物質B2に対して結合性を有する物質R2にB2とは異なる結合性の結合子B3を結合させてなるR2−B3を予め結合させて得られたL2−B2−R2−B3。固相複合体:結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなるR3−固相。

目的

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請求項1

2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体I、下記の受容体II、並びに受容体I、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキット:1)物質B1に対して結合性を有する物質R1にマーカーMを結合させてなる化合物R1−Mと、被測定物質Aと結合性を有するリガンドL1と物質B1を結合させてなる化合物L1−B1を結合させてなる化合物L1−B1−R1−Mで表される受容体I;2)被測定物質Aと結合性を有するリガンドL2に被測定物質Aとは異なる結合性を有する物質B2を導入してなる化合物L2−B2と、物質B2に対して結合性を有する物質R2に該物質B2とは異なる結合性を有する結合子B3を結合させてなる化合物R2−B3を予め結合させて得られた化合物L2−B2−R2−B3で表される受容体II;及び、3)結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体。

請求項2

タンパク質Pの一部を構成するリガンドL3に対して2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体I、下記の受容体II、並びに受容体I、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキット:1)タンパク質PにマーカーMを結合させた化合物P−Mで表される受容体I;2)タンパク質PあるいはリガンドL3に被測定物質Aとは異なる結合性を有する物質B2を導入してなる化合物P−B2あるいはL3−B2と、物質B2に対して結合性を有する物質R2に該物質B2とは異なる結合性を有する結合子B3を結合させてなる化合物R2−B3を結合させて得られた化合物P−B2−R2−B3あるいはL3−B2−R2−B3で表される受容体II;及び、3)結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体。

請求項3

2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体I、下記の受容体II、並びに受容体I、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキット:1)物質B1に対して結合性を有する物質R1にマーカーMを結合させてなる化合物R1−Mと、被測定物質Aと結合性を有するリガンドL1と物質B1を結合させてなる化合物L1−B1を結合させてなる化合物L1−B1−R1−Mで表される受容体I;2)被測定物質Aと結合性を有するリガンドL2に被測定物質Aとは異なる結合性を有する結合子B3を予め結合させて得られた化合物L2−B3で表される受容体II;及び、3)結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体。

請求項4

前記物質R1は、前記物質B1との結合ポイント複数個有し、物質B1を介して物質R1に前記リガンドL1が複数個結合されていることを特徴とする請求項1又は3記載のキット。

請求項5

前記複数個のリガンドL1の各々の反応性複数種である請求項4記載のキット。

請求項6

前記物質R2は、前記物質B2との結合ポイントを複数個有し、物質B2を介して物質R2に前記リガンドL2又はリガンドL3が複数個結合されていることを特徴とする請求項1又は2記載のキット。

請求項7

前記複数個のリガンドL2又はリガンドL3の各々の反応性は複数種である請求項6記載のキット。

請求項8

前記固相複合体が、少なくもと前記受容体IIとは独立して存在している請求項1、2又は3記載のキット。

請求項9

前記2価以上の結合性を有する被測定物質Aが、DNA、RNA、抗原及び抗体の群から選ばれた物質である請求項1、2又は3記載のキット。

請求項10

前記リガンドL1、リガンドL2又はリガンドL3が、DNA、RNA、抗原、抗体、レクチン糖タンパク質及び糖の群から選ばれた物質である請求項1、2又は3記載のキット。

請求項11

前記リガンドL1及びリガンドL2が同一の物質である請求項1又は3記載のキット。

請求項12

前記リガンドL1、L2及びリガンドL3が異なる配列を持つ物質である請求項1、2又は3記載のキット。

請求項13

前記物質B1と物質R1、あるいは物質B2と物質R2の結合性は、解離定数として10−8から10−16(M)で示されるものである請求項1、2又は3記載のキット。

請求項14

前記物質B1及び/又は物質B2がビオチンである請求項1、2又は3記載のキット。

請求項15

前記物質B1及び/又は物質B2がDNA、RNA、抗原、抗体、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ばれた物質である請求項1、2又は3記載のキット。

請求項16

前記物質R1及び/又は物質R2がストレプトアビジン及びアビジンの群から選ばれた物質である請求項1、2又は3記載のキット。

請求項17

前記物質R1及び/又は物質R2が抗原、抗体、DNA、RNA、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ばれた物質である請求項1、2又は3記載のキット。

請求項18

前記物質R1及び物質R2が同一物質である請求項1記載のキット。

請求項19

前記物質R1及び物質R2が異なる物質である請求項1記載のキット。

請求項20

前記結合子B3と被結合子R3は、DNA又はRNAの少なくとも一部分の相補的結合により結合可能なものである請求項1、2又は3記載のキット。

請求項21

前記マーカーMが着色色素蛍光色素発光性物質金属コロイドラテックスリポソーム放射性同位元素酵素、DNA及びRNAの群から選ばれた物質である請求項1、2又は3記載のキット。

請求項22

前記固相がポリスチレンニトロセルロースナイロンセルロース及びガラスの群から選ばれた物質である請求項1、2又は3記載のキット。

請求項23

2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出又は測定する方法であって、1)被測定物質Aを、2)物質B1に対して結合性を有する物質R1にマーカーMを結合させてなる化合物R1−Mと、上記被測定物質Aと結合性を有するリガンドL1と物質B1を結合させてなる化合物L1−B1を結合させてなる化合物L1−B1−R1−Mで表される受容体I、並びに、3)被測定物質Aと結合性を有するリガンドL2に被測定物質Aとは異なる結合性を有する物質B2を導入してなる化合物L2−B2と、物質B2に対して結合性を有する物質R2に該物質B2とは異なる結合性を有する結合子B3を結合させてなる化合物R2−B3を予め結合させて得られた化合物L2−B2−R2−B3で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、4)前記生成した複合体を、結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体により捕獲し、5)捕獲された複合体中のマーカーMを検出又は測定することを特徴とする被測定物質を検出又は測定する方法。

請求項24

タンパク質Pの一部を構成するリガンドL3に対して2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出又は測定する方法であって、1)被測定物質Aを、2)タンパク質PにマーカーMを結合させた化合物P−Mで表される受容体I、並びに3)タンパク質PあるいはリガンドL3に被測定物質Aとは異なる結合性を有する物質B2を導入してなる化合物P−B2あるいはL3−B2と、物質B2に対して結合性を有する物質R2に該物質B2とは異なる結合性を有する結合子B3を結合させてなる化合物R2−B3を結合させて得られた化合物P−B2−R2−B3あるいはL3−B2−R2−B3で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、4)前記生成した複合体を、結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体により捕獲し、5)捕獲された複合体中のマーカーMを検出又は測定することを特徴とする被測定物質を検出又は測定する方法。

請求項25

2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出又は測定する方法であって、1)被測定物質Aを、2)物質B1に対して結合性を有する物質R1にマーカーMを結合させてなる化合物R1−Mと、上記被測定物質Aと結合性を有するリガンドL1と物質B1を結合させてなる化合物L1−B1を結合させてなる化合物L1−B1−R1−Mで表される受容体I、並びに、3)被測定物質Aと結合性を有するリガンドL2に被測定物質Aとは異なる結合性を有する結合子B3を予め結合させて得られた化合物L2−B3で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、4)前記生成した複合体を、結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体により捕獲し、5)捕獲された複合体中のマーカーMを検出又は測定することを特徴とする被測定物質を検出又は測定する方法。

技術分野

0001

本発明は、液体試料中包含される2価以上の結合性を有する被測定物質を検出あるいは測定するキットであって、被測定物質に特異的に結合するリガンドに対して直接結合してマーカーにて標識するか、あるいは間接的に結合してマーカーにて標識してなるリガンド・マーカー複合体と、被測定物質に特異的に結合するリガンドを固相に結合するための結合子とを含むリガンド・結合子複合体と、該リガンド・結合子複合体を、固相に捕獲するための被結合子を結合させた固相とを含むことからなるキット、及び検出又は測定方法に関する。

背景技術

0002

液体試料中に包含される抗体などリガンドに対する2価以上の結合性を有する物質を検出あるいは測定する方法には、次の方法が知られている。すなわち、リガンドを酵素などのマーカーで標識したものと、固相にリガンドを結合させたものを準備しておき、前記リガンドをマーカーで標識したものと、液体試料中の抗体とを反応させる。次いでこの溶液を前記リガンド結合固相と反応させて、固相に結合したマーカーの有無を検出あるいは量を測定する方法である(例えば、特開平9−229938号公報)。この方法では、同じリガンドに対する抗体が標識リガンドに予め反応してしまうために、固相化されたリガンドに反応しなくなり、感度が高くない場合が多かった。

0003

そのため、特許第2532788号公報にあるように、捕獲種(R)を固相に結合させておき、第一の免疫学的物質(I1)と検出可能な同位体(M)との結合生成物からなる分散された第一の粒子の第一のバッチ(M−I1)と、第2の免疫反応性物質(I2)と捕獲可能種(B)との第2の結合生成物からなる分散された第2の粒子の第2のバッチ(I2−B)とを、免疫反応性分析物(G)を介して結合させて複合体(M−I1−G−I2−B)を形成させ、固相に結合させた捕獲種(R)と反応させて、免疫反応性分析物の介在あるいは量を評価する方法があった。この方法では、第一の免疫学的物質(I1)と第二の免疫学的物質(I2)を同一のものを用いることにより、第一の免疫学的物質(I1)と検出可能な同位体(M)同志で免疫反応性分析物(G)が結合せずに、第一の免疫学的物質(I1)と第2の免疫反応性物質(I2)が、同時に免疫反応性分析物(G)と反応するために感度が高いという特色がある。

0004

さらに、特開平10−253632号公報には、オリゴヌクレオチド(ON)を固相化しておき、そのオリゴヌクレオチド(ON)と相補的なオリゴヌクレオチド(ON’)で標識されたリガンド(ON’−L)(例えば、ON’−抗原又はON’−抗体)と、マーカー標識化リガンド(M−L)とを、リガンド(L)対して結合する分析物(A)に対して反応させ、複合体(ON’−L−A−L−M)を形成させて、オリゴヌクレオチド結合固相と該複合体中に含まれるオリゴヌクレオチド同志の相補的な結合により、固相に複合体を結合させることによりマーカー(M)の有無、量により分析物を評価する方法が示されている。この方法では、分析物(A)とマーカー標識化リガンド(M−L)が先に複合体を形成せずに、ON’−LとM−Lが同時に分析物(A)と反応するために、特許第2532788号公報の方法と同様に感度が高いという特性を有する。さらにこの方法では、固相化するオリゴヌクレオチド、対応するリガンド(L)に結合させるオリゴヌクレオチドをそれぞれ配列を変化させることにより複数の分析対象物を同時に測定することが可能になる。

0005

前記特許第2532788号公報あるいは特開平10−253632号公報の方法のように感度高く、測定対象物を検出あるいは測定するには、第一あるいは第二の免疫反応性物質、あるいは配位子を何らかの結合子で標識する必要がある。

0006

しかしながら、前記免疫反応性物質あるいはリガンド(L)を直接結合子で標識する場合、標識化工程の途中における標識化リガンド(L)の精製過程で、リガンド(L)の物性が変化して不溶化しやすく、結合子標識化配位子(例えば、結合子で標識された抗原)の回収率が著しく低下する場合があった。

0007

一方、低分子ペプチドをリガンド(L)として直接標識する際に標識されたペプチドは回収されるものの、立体配置による障害と思われる免疫化学的反応性の低下が起きることもあった。さらに、低分子のペプチドを金属コロイド着色ラテックスなどで標識しようとした場合、低分子であるが故に、標識ができないといったこともあった。

0008

特許第2501960号公報には、マーカーで標識化された特異的結合能を有する物質P2(例えば、アビジンストレプトアビジン)と、マーカーで標識化されていない特異的結合能を有する物質P2と、P2に対する1価の結合成分P1(例えば、ビオチン)とリガンドR1を結合させた化合物P1−R1、及び、前記マーカーで標識されていない物質P2が固相に結合されたものからなる試薬が示されている。該試薬は、複合体あたりのリガンド量を調整することができないため、あるいは、固相との反応がビオチン−アビジンによる結合性であり、強固な結合性であるため、試薬の感度をコントロールすることが困難という問題がある。そのため、他の要因による極微量な免疫物質に対しても反応してしまい、好ましくない判定結果をもたらす場合もある。

0009

そこで、本発明の目的は、抗体などのリガンドに対して2価以上の結合性を有する、液体試料中に包含される分析対象物質を検出あるいは測定するキットであって、簡易に検出あるいは測定でき、キットを製造する際の収率が高く、低分子量のリガンドや、高分子量のリガンドであっても、さらにはタンパク質の一部を構成するリガンドであって、容易に標識することができ、例えば、リガンドにマーカーを標識させる場合にリガンドが低分子化合物であっても、収率よくリガンド・マーカー複合体を製造することができ、キット中に含まれるリガンドの量の調整を可能とすることにより、あるいは、固相と複合体との結合性を変化させることができ、その結合性を変化させることにより試薬の感度をコントロールすることができるキットを提供すること、被測定物質の検出又は測定方法を提供することである。

発明の開示

0010

本発明は、上記課題を解決するために下記のようなキットを構成することからなる。

0011

本発明の1番目型式のキットは、2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体I、下記の受容体II、並びに受容体I、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキットである。

0012

1)物質B1に対して結合性を有する物質R1にマーカーMを結合させてなる化合物R1−Mと、被測定物質Aと結合性を有するリガンドL1と物質B1を結合させてなる化合物L1−B1を結合させてなる化合物L1−B1−R1−Mで表される受容体I;

0013

2)被測定物質Aと結合性を有するリガンドL2に被測定物質Aとは異なる結合性を有する物質B2を導入してなる化合物L2−B2と、物質B2に対して結合性を有する物質R2に該物質B2とは異なる結合性を有する結合子B3を結合させてなる化合物R2−B3を予め結合させて得られた化合物L2−B2−R2−B3で表される受容体II;及び、

0014

3)結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体。

0015

本発明の2番目の型式のキットは、タンパク質Pの一部を構成するリガンドL3に対して2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体I、下記の受容体II、並びに受容体I、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキットである。

0016

1)タンパク質PにマーカーMを結合させた化合物P−Mで表される受容体I;

0017

2)タンパク質PあるいはリガンドL3に被測定物質Aとは異なる結合性を有する物質B2を導入してなる化合物P−B2あるいはL3−B2と、物質B2に対して結合性を有する物質R2に該物質B2とは異なる結合性を有する結合子B3を結合させてなる化合物R2−B3を結合させて得られた化合物P−B2−R2−B3あるいはL3−B2−R2−B3で表される受容体II;及び、

0018

3)結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体。

0019

本発明のキットにおいて、固相複合体は、少なくもと受容体IIとは独立して存在している。即ち、測定前では固相複合体は、受容体II及び受容体Iと独立した組み合わせのキットであるか、あるいは、受容体IIと独立し、受容体Iと同じ系の組み合わせのキットであってもよい。

0020

本発明の3番目の型式のキットは、2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体I、下記の受容体II、並びに受容体I、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキットである。

0021

1)物質B1に対して結合性を有する物質R1にマーカーMを結合させてなる化合物R1−Mと、被測定物質Aと結合性を有するリガンドL1と物質B1を結合させてなる化合物L1−B1を結合させてなる化合物L1−B1−R1−Mで表される受容体I;

0022

2)被測定物質Aと結合性を有するリガンドL2に被測定物質Aとは異なる結合性を有する結合子B3を予め結合させて得られた化合物L2−B3で表される受容体II;及び、

0023

3)結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体。

0024

本発明のキットにおいて、2価以上の結合性を有する被測定物質Aは、DNA、RNA、抗原及び抗体の群から選ぶことができる。

0025

本発明のキットにおいて、リガンドL1とリガンドL2が同一物質(例えば、アビジン同士、又はストレプトアビジン同士)であっても、異なる配列を持つ物質(例えば、配列の異なるDNA同士又はRNA同士の組み合わせ、あるいはアビジンとストレプトアビジンの組み合わせ)であってもよい。

0026

本発明のキットにおいて、リガンドL(L1、L2、L3)は、DNA、RNA、抗原、抗体、レクチン糖タンパク質及び糖の群から選ぶことができる。

0027

本発明のキットにおいて、物質R1及び/又は物質R2は、ストレプトアビジン、アビジン、抗原、抗体、DNA、RNA、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ぶことができる。

0028

本発明のキットにおいて、物質R1と物質R2が同一物質(例えば、アビジン同士、又はストレプトアビジン同士)であっても、異なる物質(例えば、アビジンとストレプトアビジン)であってもよい。

0029

本発明のキットにおける、物質B1及び/又は物質B2は、ビオチン、DNA、RNA、抗原、抗体、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ばれた物質が使用できる。本発明のキットにおいて、代表的な例には、物質B1及び/又は物質B2にビオチンが使用される場合である。このような場合には、物質R1と物質R2にアビジン同士、及び/又はストレプトアビジン同士が使用される。

0030

本発明のキットにおける、物質B1と物質R1、あるいは物質B2と物質R2の結合性は、解離定数として10−8から10−16(M)の範囲が好ましい。

0031

本発明のキットにおいて、マーカーには、例えば、着色色素蛍光色素発光性物質、金属コロイド、ラテックスリポソーム放射性同位元素、酵素、DNA及びRNAなる群から選ばれた物質を使用することができる。

0032

本発明で使用される固相には、ポリスチレンニトロセルロースナイロンセルロース及びガラスの群から選ばれた物質が好適に使用される。

0033

本発明の被測定物質Aを検出又は測定するための1番目の型式のキット使用する検出又は測定方法は、2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出又は測定する方法であって、

0034

1)被測定物質Aを、

0035

2)物質B1に対して結合性を有する物質R1にマーカーMを結合させてなる化合物R1−Mと、上記被測定物質Aと結合性を有するリガンドL1と物質B1を結合させてなる化合物L1−B1を結合させてなる化合物L1−B1−R1−Mで表される受容体I、並びに、

0036

3)被測定物質Aと結合性を有するリガンドL2に被測定物質Aとは異なる結合性を有する物質B2を導入してなる化合物L2−B2と、物質B2に対して結合性を有する物質R2に該物質B2とは異なる結合性を有する結合子B3を結合させてなる化合物R2−B3を予め結合させて得られた化合物L2−B2−R2−B3で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、

0037

4)前記生成した複合体を、結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体により捕獲し、

0038

5)捕獲された複合体中のマーカーMを検出又は測定することを特徴とする方法である。

0039

本発明の被測定物質Aを検出又は測定するための2番目の型式のキットを使用する検出又は測定方法は、タンパク質Pの一部を構成するリガンドL3に対して2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出又は測定する方法であって、

0040

1)被測定物質Aを、

0041

2)タンパク質PにマーカーMを結合させた化合物P−Mで表される受容体I、並びに

0042

3)タンパク質PあるいはリガンドL3に被測定物質Aとは異なる結合性を有する物質B2を導入してなる化合物P−B2あるいはL3−B2と、物質B2に対して結合性を有する物質R2に該物質B2とは異なる結合性を有する結合子B3を結合させてなる化合物R2−B3を結合させて得られた化合物P−B2−R2−B3あるいはL3−B2−R2−B3で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、

0043

4)前記生成した複合体を、結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体により捕獲し、

0044

5)捕獲された複合体中のマーカーMを検出又は測定することを特徴とする方法である。

0045

本発明の被測定物質Aを検出又は測定するための3番目の型式のキット使用する検出又は測定方法は、2価以上の結合性を有する被測定物質Aを検出又は測定する方法であって、

0046

1)被測定物質Aを、

0047

2)物質B1に対して結合性を有する物質R1にマーカーMを結合させてなる化合物R1−Mと、上記被測定物質Aと結合性を有するリガンドL1と物質B1を結合させてなる化合物L1−B1を結合させてなる化合物L1−B1−R1−Mで表される受容体I、並びに、

0048

3)被測定物質Aと結合性を有するリガンドL2に被測定物質Aとは異なる結合性を有する結合子B3を予め結合させて得られた化合物L2−B3で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、

0049

4)前記生成した複合体を、結合子B3に対して結合性を有する被結合子R3を固相に結合させてなる化合物R3−固相で表される固相複合体により捕獲し、

0050

5)捕獲された複合体中のマーカーMを検出又は測定することを特徴とする被測定物質を検出又は測定する方法である。

0051

上記の被測定物質Aを検出又は測定する3つの方法において、前記各1)〜3)の要件による複合体を形成する方法は、1工程で同時に反応を進行させて実施してもよいし、複数工程で接触させる順序を変えて順次実施してもよい。

0052

本発明の1番目の型式のキットに使用される化合物L1−B1−R1−M(受容体I)の実施の態様において、物質R1としてストレプトアビジン又はアビジンを使用し、マーカーMとして金属コロイド又は酵素を結合させた物質を使用し、化合物L1−B1としてのビオチン結合リガンドなる物質を、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンとの特異的結合反応により結合させてなる化合物は、新規物質として特徴がある。

0053

本発明の1番目の型式のキットは、リガンドL1が水溶性の場合にも適用できるが、特に、不溶性が高い場合に好適である。不溶性の高いリガンドL1は、直接標識すると不溶性の性質が複合体に付与されてしまい、非特異反応の原因となる場合がある。しかしながら、例えば、親水性が比較的高いアビジンあるいはストレプトアビジンなどの物質R1又はR2と結合することにより、複合体となった化合物L1−B1−R1−M(受容体1)あるいは化合物L2−B2−R2−B3(受容体II)を全体として親水性にすることが可能となり、非特異反応の発生を防止できる。

0054

なお、リガンドL1がどのような物質であっても、キットを構成する各複合体を調製するのに、ビオチン−アビジン反応を用いた場合には、複合体調製時の条件が一定にできる。このことにより、省力化が可能となる。本発明では予め複合体としてのL2−B2−R2−B3(受容体II)を調製している。そのため、複合体当たりリガンド量をコントロールできる。このことにより、試薬の感度をコントロールすることができる。

0055

本発明の2番目の型式のキットは、リガンドL2が低分子ではなく、水溶性の高分子、例えば、水溶性タンパク質である場合に好適である。このようなタンパク質をリガンドL2とする場合には、リガンドL2はマーカーMで直接標識可能である。

0056

本発明の3番目の型式のキットは、被測定物質Aが、DNA又はRNAのオリゴヌクレオチドの測定に好適であり、この場合、リガンドL1は被測定物質Aのオリゴヌクレオチドの一方の端部の配列に対して少なくとも相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リガンドL2は被測定物質Aのもう一方の端部の配列に対して少なくとも相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。さらに、この場合、リガンドL2の被測定物質Aの結合側とは反対の端部の配列は、固相に結合されたDNA又はRNAのオリゴヌクレオチドの配列に対して少なくとも相補的である。

発明を実施するための最良の形態

0057

本発明の技術的意義を次に発明の実施の態様に基づいて説明する。

0058

アビジン又はストレプトアビジンと、ビオチンの結合は10−15(M)という結合定数を示し一般的な免疫反応の結合定数の100倍以上の良好な結合性を示す。この結合は6−8Mグアニジン、pH1.5、120℃の条件下15分間で解離することが報告されており(Green,N.:Purification of Avidin,in Methodsin Enzymology,XVIII,(McCormick,D.,and Wright,L.,eds.).Academic Press,NY,414(1970).)、常温では極めて安定な結合体が形成される。

0059

R1又はR2としてアビジン又はストレプトアビジンを用いた、本発明の1番目の型式のキットの具体例について説明する。R1又はR2としてのアビジン又はストレプトアビジンと、B1又はB2としてのビオチン等の強固な結合を利用してリガンドL1とマーカーMを結合させてなる化合物L1−B1−R1−Mで表される受容体I、あるいはリガンドL2と結合子B3としてのオリゴヌクレオチドを結合させてなる化合物L2−B2−R2−B3で表される受容体IIが使用できる。

0060

前記受容体Iの調製は、あらかじめリガンドL1に物質B1としてのビオチンを導入したもの(化合物L1−B1)と、物質R1としてのアビジン又はストレプトアビジンにマーカーMを結合させたもの(化合物R1−M)を調製しておき、これらの化合物におけるアビジン又はストレプトアビジンR1とビオチンB1との結合により、化合物L1−B1−R1−Mなる複合体(受容体I)を極めて容易に、安定に調製することが可能となる。このようにして得られた複合体は、実質的にリガンドL1をマーカーMで標識したものである。

0061

この方法により調製した複合体である化合物L1−B1−R1−M(受容体I)は、マーカーMが、例えば、アビジン又はストレプトアビジン(R1)に結合し、さらに、例えば、アビジン又はストレプトアビジン(R1)にビオチン化リガンド(化合物L1−B1)が結合したものである。したがって、リガンドL1が低分子量のペプチドなどの立体障害的な影響を受けやすい物質であっても、マーカーMは高分子であるアビジン又はストレプトアビジン(R1)を介在して結合しているので、こうした影響を受けにくい。また、リガンドL1がマーカーMに直接結合できないような物質であっても、この方法によれば、確実にリガンドL1とマーカーMの複合体が調製できる。

0062

なお、リガンドL3が立体障害が生じないような比較的安定な物質である場合、即ち、タンパク質Pの一部を構成するリガンドL3には、マーカーMはリガンドL3或いはリガンドL3を含むタンパク質Pに直接結合させて化合物P−Mをリガンド−マーカー複合体(受容体I)として用いることができる(本発明の2番目の型式のキット)。

0063

物質B1と物質B2が同一で、リガンドL1とL2が同一の場合には、次の方法で、本発明の1番目の型式のキットの調製が容易となる。本発明における受容体II、即ち、リガンドL2と結合子B3とを複合させた化合物(L2−B2−R2−B3)を調製するには、結合子B3として、例えば、オリゴヌクレオチドONを用いる場合には、予め、物質R2とオリゴヌクレオチドON(結合子B3)を結合させたもの(化合物R2−ON)を準備しておき、受容体I(L1−B1−R1−M)を調製したときに準備した化合物L1−B1(ただし、L1−B1はL2−B2と同一化合物である)を前記化合物R2−ONと反応させて、化合物L2−B2−R2−ONなる複合体(受容体II)を調製する。この方法によって、リガンドL2とヌクレオチドON(結合子B3)を含む複合体を調製することが可能となる。

0064

この方法によれば、リガンドL2が低分子量のペプチドなどの標識が難しい物質であっても、物質R2(例えば、ストレプトアビジン、アビジン、抗原、抗体、DNA、RNA、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ばれた物質)と、物質B2の介在により、確実にリガンドL2とヌクレオチドON(結合子B3)との複合体が調製できる。

0065

本発明の1番目の型式のキットを構成するには、図3フロー図に示すように、化合物R1−Mと化合物R2−B3(例えば、R2−ON)を予め準備しておき、且つ、化合物L1−B1(但し、化合物L1−B1と化合物L2−B2とは同一化合物の場合)を共通に使用して、リガンドL1とマーカーMの複合体、即ち、L1−B1−R1−Mで表される受容体I、及びリガンドL2と結合子B3(例えば、オリゴヌクレオチドON)の複合体、即ち、化合物L2−B2−R2−B3で表される受容体IIの調製することにより、本発明の1番目の型式のキットを極めて容易に調製することができる。

0066

さらに、物質R1又は物質R2として用いられるアビジン又はストレプトアビジンは物質B1又は物質B2としてのビオチンとの結合部位を1分子あたり4個保有しているため、リガンドL1又はリガンドL2の導入比を、アビジン又はストレプトアビジン当たり1から4個の間で変化させることが可能で、この導入率を制御することにより反応性、感度をコントロールすることも可能となる。

0067

リガンドL1又はリガンドL2が疎水性の強い物質である場合、リガンドL1にマーカーMを、あるいはリガンドL2にオリゴヌクレオチドONなどの結合子B3を直接導入すると、さらに物性が変化し、疎水性がさらに強まり非特異的な結合の原因になる場合も少なくない。しかしながら、本発明の1番目の型式のキットのように、リガンド−ビオチンと、アビジン−マーカーあるいはアビジン−結合子とを結合させる場合には、リガンドとマーカーの複合体あるいはリガンドと結合子の複合体を調製する際には、アビジンが親水性に富んでいるためリガンドの疎水性をアビジンと結合することによって軽減でき、疎水性に由来する非特異的な反応を除去することも可能である。また、上述したようにアビジンとリガンド−ビオチンの導入比を変化させることにより、こちらの方からも反応性を制御することが可能である。

0068

以上の説明は主として本発明の1番目の型式のキットについてのものであるが、本発明の2番目の型式のキットについては1番目の型式のキットと同様なことが言える。

0069

本発明の検出又は測定のためのキット及びその検出又は測定方法によれば、固相に複合体を捕獲するために、結合子B3と被結合子R3を結合させたものを用いており、これらの結合を種々の結合性の異なる組み合わせの物質を採用することにより、結合性の強弱を変化させることができ、即ち、試薬の感度をコントロールすることができる。例えば、レクチン−糖の結合反応では、ビオチン−アビジン結合反応よりもはるかに反応性が低いため、B3とR3にレクチン−糖を用いれば、ビオチン−アビジン反応を用いたものよりも、より多くの抗原あるいは抗体が無ければ反応しないキットを構成することが可能となる。

0070

結合子B3と被結合子R3を少なくとも一部が相補的な配列をもつRNA、DNAのオリゴヌクレオチドを使用して結合する場合には、オリゴヌクレオチドの相補的配列長短を変化させることにより、結合性の強弱をコントロールすることができ、試薬の感度をコントロールすることができる。

0071

本発明の検出又は測定のためのキット及びその検出又は測定方法によれば、固相化するオリゴヌクレオチド、対応する配位子に結合させるオリゴヌクレオチドの組み合わせを複数個用意し、それぞれの組み合わせに対応させた複数の分析対象物に特異的に結合するリガンドを選択してキットを構成することにより、複数の分析対象物を同時に検出又は測定することが可能になる。

0072

図8は、リガンドL1とリガンドL2が異なる配列を持つ物質である場合の本発明のキットを用い、被測定物質Aと反応させ、受容体I、受容体II及び被測定物質からなる複合体を固相複合体に捕獲した状態を示す。具体的には、図8で示す被測定物質Aは、RNA又はDNAのオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドの両端の配列に対して相補的な配列を有する、一方のオリゴヌクレオチドをリガンドL1とし、他方のオリゴヌクレオチドをリガンドL2としている。図8の態様を構成するキットの構成要素は、前記本発明の1番目の型式のキットと同じである。
実施例1

0073

オリゴヌクレオチドの合成

0074

5‘末端アミノ基を有する以下のようなオリゴヌクレオチドをパーキンエルマー社製DNA合成装置391Aを用いて、それぞれ合成した。一部のものは、サワディテクノロジー社に合成を依頼した。
アミノ基−GAATTCCGGGGATCCGT CG(以下「ペア1+」という)
アミノ基−CGA CGG ATC CCC GGG AAT TC(以下「ペア1−」という)
アミノ基−AAC GGA ATC TAA TCA GGA GG(以下「ペア8+」という)
アミノ基−CCTCCT GAT TAG ATT CCG TT(以下「ペア8−」という)
アミノ基−CCG ACT ACA GAA GAG GAG AA(以下「ペア7+」という)
実施例2

0076

ウサギIgGにペア8−を導入した。すなわち、ウサギIgG 25mgを含む0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液2mlと、IgGの50〜100倍モル過剰のSATA(ピアス社製)を37℃で1時間反応させた。反応後、終濃度0.1M Tris塩酸緩衝液、0.1Mヒドロキシルアミンになるようにそれぞれの試薬を添加して、37℃で1時間反応させ、この後SephadexG−25(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を充填したカラムアプライし、SH導入ウサギIgGを調製した。一方、ペア8−1000nmolを溶解した、5mMEDTAを含む0.1MMOPS緩衝液pH7.0に、オリゴヌクレオチドの50倍モル過剰のEMCS(同仁化学社製)を添加し、37℃で1時間反応させた。反応後、常法に従ってエタノール沈殿洗浄を行い、マレイミド基導入オリゴヌクレオチドを調製した。このマレイミド基導入オリゴヌクレオチドを、SH基導入IgGと37℃で1時間反応させ、次いでUltrogel AcA34(Biosepra社製)にアプライし、ペア8−標識ウサギIgGを調製した。
実施例3

0077

金コロイド標識ストレプトアビジンの調製

0078

粒径40nmの金コロイド(530nmにおける吸光度)5mlと150ugストレプトアビジン(ベクター社製)を含む2mMホウ酸緩衝液pH9.0 1mlを混合して反応させた。この後、牛血清アルブミンを終濃度1%になるように添加してブロッキングを行い、遠心分離により金コロイド標識ストレプトアビジンを沈さとして回収し、牛血清アルブミン1%溶液で遠心洗浄を行い、同溶液で沈さを懸濁して、金コロイド標識ストレプトアビジンを調製した。
実施例4

0079

オリゴヌクレオチド標識ストレプトアビジンの調製

0080

ストレプトアビジン2mgを溶解した0.2Mホウ酸緩衝液pH8.0 1mlに、ストレプトアビジンの100倍モル過剰のSATAを添加して、37℃で1時間反応させた。その後、終濃度0.1MTris、及び0.1Mヒドロキシルアミンとなるように試薬を添加して、37℃で30分反応させた。この後、SephadexG−25にアプライし、SH基導入ストレプトアビジンを得た。一方、ペア8+ 216nmolを溶解した、5mMEDTAを含む0.1MMOPS緩衝液pH7.0に、オリゴヌクレオチドの100倍モル過剰のEMCSを添加し、37℃で1時間反応させた。反応後、常法に従ってエタノール沈殿、洗浄を行い、マレイミド基導入オリゴヌクレオチドを導入した。このマレイミド基導入オリゴヌクレオチドを、SH基ストレプトアビジンと37℃で1時間反応させ、次いでUltrogel AcA34にアプライし、ペア8+標識ストレプトアビジンを調製した。
実施例5

0081

CVcore3ペプチド結合金コロイド標識ストレプトアビジンの調製

0082

前記実施例3で調製した金コロイド標識ストレプトアビジン200ulとビオチン導入HCVcore3ペプチド(イノジェネティクス社製) 5ulを混合して37℃で1時間反応させた後、金コロイド複合体を遠心分離により沈さとして回収し、牛血清アルブミン1%溶液で遠心洗浄を行い、同溶液で沈さを懸濁して、HCV core3ペプチド結合金コロイド標識ストレプトアビジンを調製した。
実施例6

0083

HCVcore3ペプチド結合オリゴヌクレオチド標識ストレプトアビジンの調製

0084

前記実施例4で調製したオリゴヌクレオチド標識ストレプトアビジン200ugに前記実施例5で使用したビオチン導入HCVcore3ペプチド56ugを混合して37℃で1時間反応させ、YM30(ミリポア社製)を用いた限外濾過を行い、HCV core3ペプチド結合オリゴヌクレオチド標識ストレプトアビジンを調製した。
実施例7

0085

ペア8−標識IgG結合ニトロセルロース膜の調製

0086

前記実施例2で調製したペア8−標識ウサギIgGを1mg/mlとなるように希釈してXY3000(商品名、バイオドット社製、テストストリップ製造用XY分注ステム)に充填し、PETで裏打ちをしたニトロセルロース膜(mdi社製)に塗布した。乾燥後、ブロクエース(商品名、乳業社製、ブロッキング剤)で室温、3時間ブロッキングを行い、精製水で洗浄後、乾燥させた。この後、一端にセルロース製濾紙ワットマン社製WF1.5あるいはmdi社製)を貼り付け、もう一端にはコンジュゲートリリースパッド(mdi社製、グラスフィルター)を貼り付けた(一部は2重になるようにした)。これを幅5mmになるように切断し、ハウジングに格納した。
実施例8

0087

HCV抗体陽性血清での反応性

0088

前記実施例5で調製したHCVcore3ペプチド結合金コロイド標識ストレプトアビジン5ulと前記実施例6で調製したHCV core3ペプチド結合オリゴヌクレオチド標識ストレプトアビジン150ng、4.4%Tween80、44mMEDTAを含む溶液11.5ulに、HCV抗体陽性血清を100ul添加し、混合して素早く、前記実施例7で調製したペア8−標識IgG結合ニトロセルロース膜の試料添加窓に添加した。15分後ペア8−標識IgGを塗布した部位に金コロイドの赤紫色ラインが観察された。一方、対照としてHCV抗体が含まれていないことがわかっている血清を添加した場合は、ラインが観察されなかった。以上の結果より、リガンドに対する特異的な抗体が含まれることが本発明の方法により判定できることが確認できた。
実施例9

0089

金コロイド標識TP抗原の調製

0090

40nmの粒径の金コロイド5mlと100ugの遺伝子組み換え操作により得られたTP17K抗原(Lee Labs社製)を含む2mMホウ酸緩衝液pH9.0 1mlを混合して反応させた。この後、牛血清アルブミンを終濃度1%になるように添加してブロッキングを行い、遠心分離により金コロイド標識TP抗原を沈さとして回収し、牛血清アルブミン1%溶液で遠心洗浄を行い、同溶液で沈さを懸濁して、金コロイド標識TP抗原を調製した。
実施例10

0091

オリゴヌクレオチド標識アビジンの調製

0092

アビジン10mgを溶解した0.1Mリン酸緩衝液pH7.0 1mlに、アビジンの100倍モル過剰のEMCSを添加して、37℃で1時間反応させた。この後、SephadexG−25にアプライし、マレイミド基導入アビジンを得た。一方、ペア8+375nmolを溶解した、5mMEDTAを含む0.1MMOPS緩衝液pH7.0に、オリゴヌクレオチドの100倍モル過剰のSATAを添加し、37℃で1時間反応させた。反応後、終濃度0.1MTris、及び0.1Mヒドロキシルアミンとなるように試薬を添加して、37℃で30分反応させた。次いで常法に従ってエタノール沈殿、洗浄を行い、SH基導入オリゴヌクレオチドを調製した。このSH基導入オリゴヌクレオチドを、マレイミド基アビジンと37℃で1時間反応させ、次いでUltrogel AcA44にアプライし、ペア8+標識アビジンを調製した。
実施例11

0093

ビオチン標識TP17K抗原の調製

0094

500ugのTP17K抗原(イノジェネティクス社製)と5mMEDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液pH7.0 0.5mlに、TP17K抗原の100倍モル過剰のNHS−biotin(ピアス社製)を添加して37℃で1時間反応させ、反応後SephadexG−25カラムにアプライして、ビオチン標識TP17K抗原を調製した。TP17K抗原の回収率は、75%であった。
実施例12

0095

ビオチン化TP17K抗原とオリゴヌクレオチド標識アビジンの反応によるオリゴヌクレオチド標識TP17K抗原の調製

0096

前記実施例10で調製したオリゴヌクレオチド標識アビジンと前記実施例11で調製したビオチン標識TP17K抗原をモル比で、それぞれ1:8、1:4、1:2、1:1、1:0.5という混合比で37℃で30分間反応させ、4℃に保存した。

0097

前記実施例10で調製したオリゴヌクレオチド標識アビジンと前記実施例11で調製したビオチン標識TP17K抗原を混合しているだけであるので、TP17K抗原の回収率は、75%であった。
実施例13

0098

種々の混合比時のオリゴヌクレオチド標識TP17K抗原の反応性

0099

前記実施例12で調製した、種々の混合比時のオリゴヌクレオチド標識TP17K抗原の反応性を評価した。すなわち、前記実施例9で調製した金コロイド標識TP抗原を5ul、ビオチン1mg/mlを5ul、TP抗体陰性血清90ulに、前記実施例12で調製したオリゴヌクレオチド標識TP17K抗原をそれぞれ2ul添加した。この反応系を2本調製し、ここにTP抗体陽性血清を一方には添加し、もう一方には添加せずに、それぞれ速やかに混合し、前記実施例7で調製したペア8−標識IgG結合ニトロセルロース膜を格納したハウジングの試料添加窓に全量をそれぞれアプライした。

0100

アプライ後20分後の、陽性検体でのラインの濃さは、1:2のものが最も濃く、次いで1:4と1:1がほぼ同等、これに次いで、1:0.5、1:8という順であった。一方TP抗体陰性血清を添加したものはいずれの混合比であってもラインは出現しなかった。

0101

この成績は、オリゴヌクレオチド標識アビジンとビオチン標識抗原の混合比を変化させることによって、容易に検出感度を変化させることが可能であることを示している。
実施例14

0102

HBs抗原検出用のオリゴヌクレオチド標識IgGの調製

0103

ウサギIgGにペア1−を導入した。方法は、前記実施例2と同様にした。
実施例15

0104

HBs抗原検出用のオリゴヌクレオチド標識マウス抗HBs−Fab‘の調製

0105

モノクローン抗HBs−IgG10mgを含む0.1Mクエン酸緩衝液pH3.5に、IgGの5%になるようにペプシンベーリンガーマンハイム社製)を添加して37℃で一定時間反応させた。反応後、0.1Mリン酸緩衝液pH6.0で平衡化したUltrogel AcA44(商品名、バイオセプラ社製)カラムにアプライし、F(ab‘)2画分を収集した。

0106

このF(ab‘)25.2mgをYM30(ミリポア社製)による限外濾過で濃縮後、終濃度0.1Mになるようにメルカプトエチルアミンナカライテスク社製)を添加して、37℃で90分間還元した。この後、Sephadex G−25カラム(商品名、アマシャムファルマシアバイオテク社製)にアプライしてマウス抗HBs−Fab‘ 2.6mgを得た。

0107

一方ペア1+ 191nmolを溶解した5mMEDTAを含む0.1MMOPS緩衝液pH7.0に、オリゴヌクレオチドの100倍モル過剰のEMCSを添加し、37℃で30分反応させた。反応後、常法に従ってエタノール沈殿、洗浄を行い、マレイミド基導入オリゴヌクレオチドを調製した。

0108

このマレイミド基導入オリゴヌクレオチドを、マウス抗HBs−Fab‘と37℃で1時間反応させ、次いでUltrogel AcA44にアプライし、ペア1+標識マウス抗HBs−Fab‘を調製した。
実施例16

0109

HBs抗原−TP抗体を同時に検出するためのニトロセルロース膜の調製

0110

前記実施例2で調製したペア8−標識ウサギIgGと前記実施例14で調製したペア1−標識ウサギIgGを1mg/mlとなるように希釈して、それぞれXY3000(商品名、バイオドット社製)に充填し、PETで裏打ちをしたニトロセルロース膜に、ペア1−は原点より30mmの位置に、ペア8−は原点より35mmの位置にそれぞれ塗布した。乾燥後、ブロックエース(商品名、雪印乳業社製)で室温、3時間ブロッキングを行い、精製水で洗浄後、乾燥させた。この後、一端にセルロース製濾紙(ワットマン社製WF1.5あるいはmdi社製)を貼り付け、もう一端にはコンジュゲートリリースパッド(アドバンスドマイクロデバイス社製)を貼り付けた(一部は2重になるようにした)。これを幅5mmになるように切断し、ハウジングに格納した。
実施例17

0111

HBs抗原−TP抗体を同時に独立して検出できるかどうかの検討

0112

HBs抗原−TP抗体を同時に独立して検出できるかどうかの検討を次のようにして行った。すなわち、前記実施例9で調製した金コロイド標識TP抗原を5ul、ビオチン1mg/mlを5ul、TP抗体及びHBs抗原陰性血清90ulに、前記実施例12で調製した1:4の混合比で調製したオリゴヌクレオチド標識TP17K抗原を10倍希釈しその溶液を1ul添加した。これに前記実施例15で調製したオリゴヌクレオチド標識マウス抗HBs−Fab‘を90ng添加し、金コロイド標識抗HBs抗体ブリティッシュバイオセルインターナシナル社製)を9ul添加した。この反応系を4本調製し、ここにTP抗体陽性血清5ulを一方には添加し、1本にはTP抗体陰性、HBs抗原陰性血清を5ul添加し、さらに、HBs抗原50ng/ml及び220ug/mlをそれぞれ含む血清をそれぞれ5ul速やかに混合し、前記実施例16で調製したペア8−標識ウサギIgG結合及びペア1−標識ウサギIgG結合ニトロセルロース膜を格納したハウジングの試料添加窓に全量をそれぞれアプライした。

0113

アプライ後20分の判定で、TP抗体陰性、HBs抗原陰性血清を添加したものは、両方のラインは出現せず、TP抗体陽性血清を添加したものはペア8−が塗布された部分のみに、また、HBs抗原を添加したものはペア1−が塗布された部分のみにラインが出現し、それぞれの項目が同じニトロセルロース膜上で独立して検出できた。
実施例18

0114

ビオチン標識TP17K抗原の調製

0115

500ugのTP17K抗原(Lee Labs社製)と5mMEDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液pH7.0 0.5mlに、TP17K抗原の100倍モル過剰のNHS−biotinを添加して37℃で1時間反応させ、反応後SephadexG−25カラムにアプライして、ビオチン標識TP17K抗原を調製した。TP17K抗原の回収率は、75%であった。このビオチン標識TP17K抗原は、前記実施例12に記載したように、前記実施例10で調製したオリゴヌクレオチド標識アビジンと混合するだけであるので、最終的な回収率は75%であった。
比較例

0116

TP17K抗原の直接標識によるオリゴヌクレオチド標識TP17K抗原の調製

0117

TP17K抗原(Lee Labs社製)473μgと5mMEDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液pH7.4に、TP17K抗原の20倍モル過剰のSATAを添加し、37℃で90分反応させ、この後ヒドロキシルアミン、トリス緩衝液を添加して反応させた。次いでSephadexG−25カラム(商品名、アマシァムファルマシアバイオテク社製)にアプライし、SH基導入TP17K抗原200μg(回収率42.2%)を得た。一方、ペア7+ 133nmol、5mMEDTAを含む0.1M MOPS緩衝液pH7.85に、ペア7+の200倍モル過剰のEMCSを添加して、37℃で2時間反応させた。この後、常法によりオリゴヌクレオチドをエタノール沈殿、洗浄し、マレイミド基導入オリゴヌクレオチド105nmolを得た。

0118

SH基導入TP17K抗原200μgとマレイミド基導入オリゴヌクレオチド105nmolを混合し、37℃で2時間反応させた。この後、Ultrogel AcA44カラムにアプライし、オリゴヌクレオチド標識TP17K抗原150μg(回収率32%)を得た。

0119

前記実施例18と比較例を比較すると、比較例は、回収率が32%であるのに対して、実施例18の方が回収率は75%と大幅に改善されることがわかった。
実施例19

0120

HCVcore2、core3、core6、core10の結合金コロイド標識ストレプトアビジンの調製

0121

530nmにおける吸光度が10を示すように調製した金コロイド標識ストレプトアビジン(ブリティッシュバイオセルインターナショナル社製)500μlとビオチン化HCVcore2 2μg、ビオチン化HCV core3 2μg、ビオチン化HCV core6 2μg、ビオチン化HCV core10 2μg(何れもイノジェネディクス社製)を混合して、37℃1時間反応させた。反応後、遠心分離により、HCV core2、core3、core6、core10結合金コロイド標識ストレプトアビジンを沈さとして回収した。この沈さを、2%のウシ血清アルブミンを含む20mMホウ酸ナトリウム緩衝液pH8.0で懸濁して、4℃で保存した。
実施例20

0122

オリゴヌクレオチド標識HCVcore2、core3、core6、core10結合ストレプトアビジンの調製

0123

前記実施例4で調製した、ペア8+標識ストレプトアビジン100μgにHCVcore2、core3、core6、及びcore10 30μgをそれぞれ別々に混合し、37℃1時間反応させ、限外濾過により、ペア8+標識HCV core2結合ストレプトアビジン、ペア8+標識HCV core3結合ストレプトアビジン、ペア8+標識HCV core6結合ストレプトアビジン、ペア8+標識HCV core10結合ストレプトアビジンをそれぞれ調製した。
実施例21

0124

オリゴヌクレオチド標識HCVcore2+core3+core6+core10結合ストレプトアビジンの調製

0125

前記実施例4で調製した、ペア8+標識ストレプトアビジン100μgにHCVcore2、core3、core6、又はcore10 30μgを同時に混合し、37℃1時間反応させ、限外濾過により、ペア8+標識HCV core2+core3+core6+core10結合ストレプトアビジンを調製した。
実施例22

0126

HCV抗体陽性血清との反応性

0127

前記実施例8と同様に、前記実施例19で調製したHCVcore2、core3、core6、core10結合金コロイド標識ストレプトアビジンと、前記実施例20で調製したペア8+標識HCV core2結合ストレプトアビジン 37.5ng、ペア8+標識HCV core3結合ストレプトアビジン

0128

37.5ng、ペア8+標識HCVcore6結合ストレプトアビジン37.5ng、ペア8+標識HCV core10結合ストレプトアビジン 37.5ngを含む組み合わせ(組み合わせA)と、前記実施例19で調製したHCV core2、core3、core6、core10結合金コロイド標識ストレプトアビジン 5μlと、前記実施例21で調製したオリゴヌクレオチド標識HCV core2+core3+core6+core10結合ストレプトアビジン 150ngを含む組み合わせ(組み合わせB)を比較したところ、組み合わせAでは、HCV抗体陽性血清との反応性が5分から、組み合わせBでは反応性が7分から確認できた。また、前前記実施例8で行った実験では反応性が15分から確認できた。このことから、単一種のペプチドを標識ストレプトアビジンに結合させて反応系を構築するよりも、複数種のペプチドを標識ストレプトアビジンに結合させて反応系を構築した場合の方が反応性が高いことが分かった。
産業上の利用可能性

0129

本発明の検出又は測定のためのキット及びその検出又は測定方法によれば、試薬の感度をコントロールすることができる。

0130

例えば、本発明のキットは、受容体I及び受容体II当たりのリガンドL1又はリガンドL2の量を調整することができる。このことにより、測定感度の調整が可能となる。具体的には、物質R1は、物質B1との結合ポイントを複数個有するものが使用でき、物質B1を介して物質R1にリガンドL1を複数個結合させることができる。また、物質R2は、物質B2との結合ポイントを複数個有するものを使用することができ、物質B2を介して物質R2にリガンドL2又はリガンドL3を複数個結合させることができる。

0131

具体的には、物質R1又はR2としてアビジン又はストレプトアビジンを使用する場合には、アビジン又はストレプトアビジンは物質B1としてのビオチンとの結合部位を1分子あたり4個保有しているため、リガンドLの導入比を、アビジン又はストレプトアビジン当たり1から4個の間で変化させることが可能である。したがって、この導入率を制御することにより反応性、感度をコントロールすることも可能となる。さらに、この感度のコントロールは、化合物L−B1−R1−Mと化合物L−B1−R2−B3の双方に行えるので、きめ細かい感度のコントロールが可能となる。

0132

結合子B3及び被結合子R3として、種々の結合性の異なる組み合わせの物質を選択することにより、結合性の強弱を変化させることができ、即ち、試薬の感度をコントロールすることができる。

0133

結合子B3と被結合子R3として、少なくとも一部が相補的な配列をもつRNA、DNAのオリゴヌクレオチドを使用する場合には、オリゴヌクレオチドの長短を変化させることにより、結合性の強弱をコントロールすることができる。

0134

本発明のキットにおいては、物質R1又はR2に結合させる複数のリガンドの各々の反応性を単一とするだけでなく、複数種としてもよい。この場合、リガンドの反応性が単一の場合よりも被測定物質Aに対する反応性が高まる。

0135

本発明の検出又は測定のためのキット及びその検出又は測定方法によれば、固相化させるための結合子B3及び被結合子R3にRNA又はDNA等のオリゴヌクレオチドを用い、少なくとも一部の相補的結合により複合体を固相に結合させる場合には、オリゴヌクレオチドの配列を変化させた複数種のものが使用できるので、それぞれの種類に対応させた複数の分析対象物を同時に測定することが可能になる。

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