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技術 有効成分として間葉系幹細胞を含む炎症性疾患の予防又は治療のための医薬組成物

出願人 メディポスト・カンパニー・リミテッド
発明者 ヤン,ユンサンオー,ウォニルチョイ,スージンカク,ジヘキム,ドンヒョンリム,フン
出願日 2019年6月5日 (2年8ヶ月経過) 出願番号 2020-564579
公開日 2021年9月30日 (4ヶ月経過) 公開番号 2021-526135
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理 化合物または医薬の治療活性 動物,微生物物質含有医薬
主要キーワード 高酸素状態 物理的要因 内部カニューレ ポンプチューブ 恒温水 高濃度酸素 高酸素濃度 モデル群
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図面 (12)

課題・解決手段

本発明は、有効成分としてHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患の予防又は治療のための医薬組成物に関する。本発明によると、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞は、炎症性サイトカインであるTNF−aの分泌を抑制し、抗炎症マーカーであるCD163及びArg−1の発現を増加させ、それにより、間葉系幹細胞を有効成分として含む医薬組成物は、炎症を抑制するか、又は炎症性疾患を治療するのに有利に使用することができる。

概要

背景

炎症は通常、外来物質又は有害な刺激によって惹起される局所的な保護反応である。炎症の直接的な原因には、細菌、ウイルス及び寄生虫等の感染性病原体火傷又は照射等の物理的要因毒素又は薬物等の化学物質アレルギー又は自己免疫反応等の免疫反応等が含まれる。

一般的に、細菌感染によって引き起こされる炎症には抗生物質が使用され、等の無痛性炎症には抗炎症酵素が使用されている。さらに、激しい痛みを伴う炎症には非ステロイド性抗炎症薬が使用され、異常な免疫系によって引き起こされる炎症には免疫抑制剤又はステロイドが使用されている。しかし、免疫抑制剤及びステロイドについては問題があり、免疫抑制剤は免疫系に直接関与するため、有害作用発生率が高く、ステロイドは長期間使用した場合にも有害作用を示し、ステロイドを中止すると疾患の症状の再発が引き起こされる。

最近、これらの有害作用を克服するために、幹細胞を使用した治療生物学的製剤市場脚光を浴びている。幹細胞の中でも、間葉系幹細胞MSC)は、脂肪細胞骨細胞及び軟骨細胞等のいくつかの細胞系統分化することができる。さらに、間葉系幹細胞には、骨髄に加えて、緻密骨、末梢血脂肪組織臍帯血及び羊膜等の多くの組織から単離することができるという利点がある。

概要

本発明は、有効成分としてHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患の予防又は治療のための医薬組成物に関する。本発明によると、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞は、炎症性サイトカインであるTNF−aの分泌を抑制し、抗炎症マーカーであるCD163及びArg−1の発現を増加させ、それにより、間葉系幹細胞を有効成分として含む医薬組成物は、炎症を抑制するか、又は炎症性疾患を治療するのに有利に使用することができる。

目的

本発明の一態様では、活性成分として、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患を予防又は治療するための医薬組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

活性成分として、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患を予防又は治療するための医薬組成物

請求項2

前記間葉系幹細胞が、表面にHLA−A2を70%以上のレベルで発現している、請求項1に記載の医薬組成物。

請求項3

前記間葉系幹細胞が、表面にCD73、CD90、CD105、CD166及びそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか1つを発現しており、CD14、CD34、CD45、HLA−DR及びそれらの組合せからなる群から選択されるいずれの1つも発現していない、請求項1に記載の医薬組成物。

請求項4

前記間葉系幹細胞が、表面にCD73、CD90、CD105及びCD166のそれぞれを70%以上のレベルで発現しており、CD14、CD34、CD45及びHLA−DRのそれぞれを1%以下のレベルで発現している、請求項1に記載の医薬組成物。

請求項5

前記間葉系幹細胞が、表面にHLA−A2を75%以上のレベルで発現しており、CD73、CD90、CD105及びCD166のそれぞれを70%以上のレベルで発現しており、CD14、CD34、CD45及びHLA−DRのそれぞれを1%以下のレベルで発現している、請求項1に記載の医薬組成物。

請求項6

前記間葉系幹細胞が臍帯血由来する、請求項1に記載の医薬組成物。

請求項7

前記炎症性疾患が、関節リウマチアトピー喘息アレルギー性鼻炎アルツハイマー病移植片対宿主病(GVHD)、糖尿病性腎症クローン病炎症性腸疾患移植後の拒絶反応気管支肺異形成症(BPD)又は慢性閉塞性肺疾患COPD)である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物。

請求項8

個体に請求項1に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、炎症性疾患を予防又は治療するための方法。

技術分野

0001

本発明は、活性成分としてHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患を予防又は治療するための医薬組成物に関する。

背景技術

0002

炎症は通常、外来物質又は有害な刺激によって惹起される局所的な保護反応である。炎症の直接的な原因には、細菌、ウイルス及び寄生虫等の感染性病原体火傷又は照射等の物理的要因毒素又は薬物等の化学物質アレルギー又は自己免疫反応等の免疫反応等が含まれる。

0003

一般的に、細菌感染によって引き起こされる炎症には抗生物質が使用され、等の無痛性炎症には抗炎症酵素が使用されている。さらに、激しい痛みを伴う炎症には非ステロイド性抗炎症薬が使用され、異常な免疫系によって引き起こされる炎症には免疫抑制剤又はステロイドが使用されている。しかし、免疫抑制剤及びステロイドについては問題があり、免疫抑制剤は免疫系に直接関与するため、有害作用発生率が高く、ステロイドは長期間使用した場合にも有害作用を示し、ステロイドを中止すると疾患の症状の再発が引き起こされる。

0004

最近、これらの有害作用を克服するために、幹細胞を使用した治療が生物学的製剤市場脚光を浴びている。幹細胞の中でも、間葉系幹細胞(MSC)は、脂肪細胞骨細胞及び軟骨細胞等のいくつかの細胞系統分化することができる。さらに、間葉系幹細胞には、骨髄に加えて、緻密骨、末梢血脂肪組織臍帯血及び羊膜等の多くの組織から単離することができるという利点がある。

発明が解決しようとする課題

0005

本発明者等は、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞が、インビトロにおいてHLA−A2を発現していない間葉系幹細胞よりも優れた抗炎症効果を示すことを確認した。さらに、本発明者等は、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞が、気管支肺異形成症誘発マウスモデル及びアルツハイマー病誘発マウスモデルにおいて優れた抗炎症効果を示すことも確認した。

課題を解決するための手段

0006

本発明の一態様では、活性成分として、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。

0007

本発明の別の態様では、個体に医薬組成物を投与するステップを含む、炎症性疾患を予防又は治療するための方法を提供する。

0008

本発明のさらに別の態様では、炎症性疾患を予防又は治療するための医薬品を製造するために、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞の使用を提供する。

0009

本発明のさらに別の態様では、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞を単離するステップを含む、優れた炎症抑制能を有する間葉系幹細胞を選択する方法を提供する。

発明の効果

0010

本発明による、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞は、炎症性サイトカインであるTNF−αの分泌を抑制し、抗炎症マーカーであるCD163及びArg−1の発現を増加させ、それにより、間葉系幹細胞を活性成分として含む医薬組成物は、炎症を抑制するか、又は炎症性疾患を治療するために効果的に使用することができる。

図面の簡単な説明

0011

炎症反応を誘発するためにLPSで処理したRaw264.7細胞に、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞(ロット:G171、G28及びG257)又はHLA−A2を発現していない間葉系幹細胞(ロット:G571、G43及びG240)による処理を行い、その後分泌されたmTNF−αの量を測定することによって得られた結果を示した図である。
炎症反応を誘発するためにLPSで処理したRaw264.7細胞に、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞(ロット:G171、G28及びG257)又はHLA−A2を発現していない間葉系幹細胞(ロット:G571、G43及びG240)による処理を行い、その後mTNF−α分泌低下率を算出することによって得られた結果を示した図である。
対照siRNA(HLA−A2(+)−MSC−siCON)又はHLA−A2に対するsiRNA(HLA−A2(+)−MSC−siHLA−A2)で処理された、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞とRaw264.7細胞とを共培養した場合に、炎症反応が誘発されたRaw264.7細胞で分泌されたmTNF−αの量を測定することによって得られた結果を示した図である。
対照siRNA(HLA−A2(+)−MSC−siCON)又はHLA−A2に対するsiRNA(HLA−A2(+)−MSC−siHLA−A2)で処理された、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞とRaw264.7細胞とを共培養した場合に、炎症反応が誘発されたRaw264.7細胞におけるmTNF−α分泌低下率を算出することによって得られた結果を示した図である。
2回継代した間葉系幹細胞(P2)及び6回継代した間葉系幹細胞(P6)におけるHLA−A2発現パターン分析することによって得られた結果を示した図である。
気管支肺異形成症マウスモデルにPBS、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞(HLA−A2(+)−MSC)又は対照siRNA(HLA)(HLA−A2(+)−MSC−siCON)若しくはHLA−A2に対するsiRNA(HLA−A2(+)−MSC−siHLA−A2)で処理された間葉系幹細胞を投与し、その後14日目にマウスから採取した肺組織を染色することによって得られた写真を示した図である。
気管支肺異形成症マウスモデルにPBS、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞(HLA−A2(+)−MSC)又は対照siRNA(HLA)(HLA−A2(+)−MSC−siCON)若しくはHLA−A2に対するsiRNA(HLA−A2(+)−MSC−siHLA−A2)で処理された間葉系幹細胞を投与し、その後14日目にマウスから採取した肺組織の肺胞サイズを測定することによって得られた結果を示した図である。
アルツハイマー病マウスモデルに、生理食塩水(対照)又はHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を投与し、間葉系幹細胞については1回(単回)又は繰り返し(反復)投与し、その後12週目のマウスから採取した脳組織におけるTNF−α及びIFN−γの発現レベルを確認することによって得られた結果を示した図である。
アルツハイマー病マウスモデルに、生理食塩水(対照)又はHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を投与し、間葉系幹細胞については1回(単回)又は繰り返し(反復)投与し、その後20週目のマウスから採取した脳組織におけるTNF−α及びIFN−γの発現レベルを確認することによって得られた結果を示した図である。
アルツハイマー病マウスモデルに、生理食塩水(対照)又はHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を投与し、間葉系幹細胞については1回(単回)又は繰り返し(反復)投与し、その後12週目のマウスから採取した脳組織におけるCD163及びArg−1の発現レベルを確認することによって得られた結果を示した図である。
アルツハイマー病マウスモデルに、生理食塩水(対照)又はHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を投与し、間葉系幹細胞については1回(単回)又は繰り返し(反復)投与し、その後20週目のマウスから採取した脳組織におけるCD163及びArg−1の発現レベルを確認することによって得られた結果を示した図である。

0012

以下に、本発明を詳細に説明する。

0013

本発明の一態様では、活性成分として、ヒト白血球抗原A2(HLA−A2)を表面に発現している間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患を予防又は治療するための組成物を提供する。

0014

HLA−A2は、HLA−A血清型群のヒト白血球抗原(HLA)血清型であり、HLAは、ヒトの主要組織適合複合体MHC遺伝子複合体によってコードされる糖タンパク質分子である。HLA−Aは、有核細胞及び血小板全ての表面で発現しており、細胞傷害性T細胞ウイルス感染細胞又は腫瘍細胞を認識して排除するときの抗原認識において役割を担っている。今までのところ、HLA−A2を発現しているヒト由来間葉系幹細胞炎症抑制効果については報告されていない。

0015

本発明は、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞が、HLA−A2を発現していない間葉系幹細胞よりも優れた炎症抑制能を有するという結果に基づいている。詳細には、本発明の一実施形態では、本発明のHLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞は、これらの細胞が、HLA−A2を発現してない間葉系幹細胞よりも70%、75%、80%、85%、90%又は95%以上高いレベルでHLA−A2を発現していることを特徴とする。

0016

さらに、本発明の間葉系幹細胞は、表面に分化型73(CD73)、CD90、CD105、CD166及びそれらの組合せの集団からなる群から選択されるいずれか1つを発現することができ、CD14、CD34、CD45、ヒト白血球抗原DR(HLA−DR)及びそれらの組合せからなる群から選択されるいずれの1つも発現することができない。

0017

詳細には、本発明の間葉系幹細胞は、表面にCD73、CD90、CD105及びCD166のそれぞれを70%以上のレベルで発現することができ、CD14、CD34、CD45及びHLA−DRのそれぞれを1%以下のレベルで発現することができる。より詳細には、本発明の間葉系幹細胞は、表面にHLA−A2を75%以上のレベルで発現することができ、CD73、CD90、CD105及びCD166のそれぞれを70%以上のレベルで発現することができ、CD14、CD34、CD45及びHLA−DRのそれぞれを1%以下のレベルで発現することができる。

0018

CD73はまた、5’−ヌクレオチダーゼ(5’−NT)とも呼ばれ、NT5E遺伝子によってコードされる酵素である。CD73は、アデノシン一リン酸AMP)をアデノシンに変換するように作用する。

0019

CD90は、N−グリコシル化グリコホスファチジルイノシトール(GPI)及び単一のV様免疫グロブリンドメインから構成されている細胞表面タンパク質である。

0020

CD105は、エンドグリン(ENG)とも呼ばれ、細胞表面に位置するI型膜糖タンパク質であり、TGFベータ受容体複合体の一部である。

0021

CD166は、細胞表面に位置するI型膜貫通型糖タンパク質であり、タンパク質免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーである。CD166は、ALCAM遺伝子によってコードされている。

0022

CD14はパターン認識受容体PRR)であり、自然免疫系の構成要素の1つである。細菌のリポ多糖(LPS)を検出するために、CD14は共受容体であるトール様受容体4(TLR4)及びMD−2と一緒に作用し、リポ多糖結合タンパク質(LBP)の存在下でLPSに結合する。

0023

CD34は、ヒトにおいてCD34遺伝子によってコードされている膜貫通型リン酸化糖タンパク質である。

0024

CD45は、ヒトにおいてPTPRC遺伝子によってコードされているタンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)酵素である。

0025

HLA−DRは、HLAのクラスIIに属する細胞表面受容体であり、自己免疫、疾患感受性、疾患抵抗性等に関与している。

0026

間葉系幹細胞としては、それらの起源に関係なく、任意の間葉系幹細胞を使用することができ、臍帯血由来間葉系幹細胞を使用することが好ましい。

0027

さらに、医薬組成物中のHLA−A2を発現している間葉系幹細胞の含有量は、1.0×105細胞/ml〜1.0×108細胞/mlであってもよく、詳細には1.0×105細胞/ml〜1.0×108細胞/ml、又は2.0×105細胞/ml〜5.0×107細胞/mlであってもよい。好ましくは、医薬組成物中のHLA−A2を発現している間葉系幹細胞の含有量は、5.0×106細胞/ml〜3×107細胞/mlであってもよい。本発明の一実施形態では、1×107細胞/mlの含有量を有する溶液50μlをマウスに投与した。

0029

さらに、本発明の医薬組成物は、滑沢剤湿潤剤甘味剤矯臭剤乳化剤懸濁剤保存剤及びそれらの組合せからなる群から選択される薬学的に許容できる添加剤をさらに含んでいてもよい。

0030

本発明の医薬組成物の総重量に対して、担体は、約1重量%〜約99.99重量%、好ましくは約90重量%〜約99.99重量%の量で含有されていてもよく、薬学的に許容できる添加剤は、約0.1重量%〜約20重量%の量で含有されていてもよい。

0031

医薬組成物は、従来の方法に従って薬学的に許容できる担体及び賦形剤を配合することによって単位剤形に調製してもよく、又はその製剤を多回用量容器に入れてもよい。ここで、製剤は、油性又は水性媒体中の溶液、懸濁液、シロップ又は乳濁液の形態、或いは抽出物粉末顆粒又はカプセルの形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでいてもよい。

0032

炎症性疾患とは、炎症を伴う疾患を意味する。炎症性疾患には、関節リウマチアトピー喘息アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、移植片対宿主病(GVHD)、糖尿病性腎症クローン病炎症性腸疾患移植後の拒絶反応、気管支肺異形成症(BPD)又は慢性閉塞性肺疾患COPD)が含まれていてもよいが、これらに限定されない。

0033

本発明の別の態様では、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞を含む炎症性疾患を治療するための医薬組成物を個体に投与するステップを含む、炎症性疾患を予防又は治療するための方法を提供する。

0034

HLA−A2を発現している間葉系幹細胞は、医薬組成物において前述されたものと同じである。

0035

個体は、哺乳類、特にヒトであってもよい。医薬組成物の投与経路及び用量については、対象の状態及び有害作用の有無に応じて、医薬組成物を様々な方法及び用量で対象に投与することができ、最適な投与方法及び用量は、当業者が適切な範囲で選択することができる。さらに、医薬組成物は治療する炎症性疾患に治療効果があることが知られているその他の薬物又は生理活性物質と組み合わせて投与してもよく、又はその他の薬物との複合製剤の形態で処方してもよい。

0036

医薬組成物を非経口的に投与する場合、医薬組成物は、例えば、皮下、眼内、腹腔内、筋肉内、経口、直腸眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内脳室内髄腔内、鼻腔内又は静脈経路に投与することができる。

0037

投与は、1回以上、又は1〜3回行うことができ、3回について詳細に述べる。反復投与の場合、投与は、1〜56日、7〜49日、14〜42日又は21〜35日の間隔で行ってもよい。好ましくは、投与は28日の間隔で行ってもよい。大用量を投与する場合は、投与は1日に数回行ってもよい。

0038

HLA−A2を発現している間葉系幹細胞の用量は、1×106細胞/個体〜1×108細胞/個体であってもよい。詳細には、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞の用量は、5×104細胞/kg〜1×107細胞/kg、1×105細胞/kg〜7×106細胞/kg又は2×105細胞/kg〜5×105細胞/kgであってもよい。

0039

本発明のさらに別の態様では、炎症性疾患を予防又は治療するための医薬品を製造するために、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞の使用を提供する。

0040

本発明のさらに別の態様では、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞を単離するステップを含む、優れた炎症抑制能を有する間葉系幹細胞を選択する方法を提供する。

0041

選択方法に関して、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞を単離する方法は、例えば、フローサイトメーターを使用して実施することができる。

0042

本発明の一実施形態では、間葉系幹細胞を抗CD14抗体、抗CD34抗体、抗CD45抗体、抗HLA−DR抗体、抗CD73抗体、抗CD90抗体、抗CD105抗体、抗CD166抗体及びマウス抗HLA−A2抗体で処理して、間葉系幹細胞の細胞表面抗原を分析した。次に、HLA−A2、CD73、CD90、CD105及びCD166を発現している間葉系幹細胞のみに電荷を与え、電場を通過させた。このようにして、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞を単離した。

0043

下記に、以下の実施例を使用して本発明を詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲はこれに限定されない。

0044

実施例1:HLA−A2を表面に発現している臍帯血由来間葉系幹細胞の確認
臍帯血由来間葉系幹細胞については、間葉系幹細胞を最初に臍帯血から単離し、次に5回継代した。継代された間葉系幹細胞(5回継代)は、いくつかのロットで使用されるように液体窒素中で凍結保存した。凍結保存した間葉系幹細胞は、37℃の恒温水浴中で約3分間解凍した。次に、間葉系幹細胞を10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を含有するα−MEM培地再懸濁し、遠心分離機で1200rpmで5分間遠心分離した。遠心分離が完了した後、上清を除去し、残存する間葉系幹細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁した。

0045

その後、臍帯血由来間葉系幹細胞の細胞表面抗原を分析するために、細胞を暗所で25℃で15分間、抗CD14抗体(BD Pharmigen、カタログ番号555397)、抗CD34抗体(BD Pharmigen、カタログ番号555822)、抗CD45抗体(BD Pharmigen、カタログ番号555482)、抗HLA−DR抗体(BD Pharmigen、カタログ番号555811)、抗CD73抗体(BD Pharmigen、カタログ番号550257)、抗CD90抗体(Invitrogen、カタログ番号12−0909−42)、抗CD105抗体(Invitrogen、カタログ番号12−1057−42)、抗CD166抗体(BD Pharmigen,カタログ番号555263)及びマウス抗HLA−A2抗体(BD Pharmigen、カタログ番号558570)と反応させた。反応完了後、PBSで1回洗浄を実施し、遠心分離を1200rpmで5分間実施し、間葉系幹細胞のみを単離した。各チューブを1%の濃度のホルムアルデヒド200μlで処理して、細胞を固定した。ここで、細胞表面抗原の分析は、MACSQuant Analyzer 10フローサイトメーター(Miltenyi biotec、Bergisch Gladbach、ドイツ)及びMACS Quantifyソフトウェアを使用して実施した。分析結果は以下の表1に示す。

0046

表1に示したように、ロットG171、G028及びG257の臍帯血由来間葉系幹細胞は、表面にHLA−A2を70%以上のレベルで発現していることが確認された。その一方で、ロットG571、G043及びG240の臍帯血由来間葉系幹細胞は、表面にHLA−A2を1%未満で発現していることが確認された。前記の分析から、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞の群(HLA−A2(+))及びHLA−A2を表面に発現していない間葉系幹細胞の群(HLA−A2(−))は互いに明確に区別された。

0047

実施例2:HLA−A2を発現している臍帯血由来間葉系幹細胞の炎症抑制効果の確認(I)
HLA−A2発現に応じた間葉系幹細胞の炎症抑制効力を比較するために、各ロットにおける間葉系幹細胞の炎症抑制効果を調べた。

0048

詳細には、マウス由来マクロファージであるRaw264.7細胞を炎症刺激物質であるリポ多糖(LPS)で処理し、こうして炎症反応を誘発した。凍結保存されている各ロットの間葉系幹細胞は、37℃の恒温水浴中で約3分間解凍した。次に、間葉系幹細胞を10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を含有するα−MEM培地に再懸濁し、遠心分離機で1200rpmで5分間遠心分離した。遠心分離が完了した後、上清を除去し、残存する間葉系幹細胞をRPMI培地に再懸濁した。

0049

LPS1μg/mlを含有するRPMI培地を使用して、Raw264.7細胞2×104個を、ロットG171、G028、G257、G571、G043又はG240の間葉系幹細胞2×104個と各ウェル中で一緒にインキュベートした。24時間後、培地を収集し、分泌されたmTNF−αの量を、クアンチイン(Quantikine)(登録商標)マウスTNF−αイムノアッセイキット(R&D Systems)を使用して分析した。

0050

その結果、図1に例示したように、Raw264.7細胞をロットG171、G028又はG257の間葉系幹細胞と一緒にインキュベートした場合、Raw264.7細胞をロットG571、G043又はG240の間葉系幹細胞と一緒にインキュベートした場合と比較して、Raw264.7細胞で分泌されるmTNF−αの量がさらに減少することが確認された。

0051

さらに、上記で測定した分泌されたmTNF−αの量に基づいて、低下率を算出した。その結果、HLA−A2を表面に発現している間葉系幹細胞群(HLA−A2(+):G171、G028、G257)は、約35%のmTNF−α分泌低下率を示し、一方で、HLA−A2を表面に発現していない間葉系幹細胞群(HLA−A2(−):G571、G043、G240)は、15%以下のmTNF−α分泌低下率を示すことが確認された(図2)。

0052

実施例3:HLA−A2を表面に発現している臍帯血由来間葉系幹細胞の炎症抑制効果の確認(II)
間葉系幹細胞におけるHLA−A2の発現を抑制した場合も間葉系幹細胞の抗炎症効果の抑制をもたらすかどうかを確認するために、炎症抑制効果を比較用するため、siRNAを使用して間葉系幹細胞におけるHLA−A2の発現を抑制した。

0053

マウス由来マクロファージであるRaw264.7細胞を炎症刺激物質であるリポ多糖(LPS)で処理し、こうして炎症反応を誘発した。次に、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞(HLA−A2(+)−MSC)を、対照siRNA(配列番号3及び4)(HLA−A2(+)−MSC−siCON)又はHLA−A2に対するsiRNA(配列番号1及び2)(HLA−A2(+)−MSC−siHLA−A2)で処理し、次に炎症反応を誘導したRaw264.7細胞と一緒にインキュベートした。その後、分泌されたmTNF−αの量をそれぞれのRaw264.7細胞で調べた。

0054

詳細には、ロットG027、G074、G171、G610、G028又はG257の間葉系幹細胞は、対照siRNA(HLA−A2(+)−MSC−siCON)又はHLA−A2に対するsiRNA(HLA−A2(+)−MSC−siHLA−A2)による処理によって調製した。次に、LPSを1μg/mlの濃度で含有するRPMI培地を使用して、各ウェル中でRaw264.7細胞2×104個を、調製された間葉系幹細胞2×104個と一緒にインキュベートした。24時間後、培地を収集し、分泌されたmTNF−αの量を、クアンチカイン(登録商標)マウスTNF−αイムノアッセイキット(R&D Systems)を使用して分析した。

0055

その結果、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞を対照siRNAで処理した場合(HLA−A2(+)−MSC−siCON)、分泌されるTNF−αの量が減少した。その一方で、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞をHLA−A2に対するsiRNAで処理した場合(HLA−A2(+)−MSC−siHLA−A2)、分泌されるTNF−αの量はあまり減少しなかった(図3)。

0056

さらに、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞を対照siRNAで処理した場合(HLA−A2(+)−MSC−siCON)と、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞をHLA−A2に対するsiRNAで処理した場合(HLA−A2(+)−MSC−siHLA−A2)との間のTNF−α分泌低下率について比較した。その結果、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞をHLA−A2に対するsiRNAで処理した場合、TNF−α分泌低下率が減少し、間葉系幹細胞におけるHLA−A2の発現抑制はまた、間葉系幹細胞の炎症抑制効果の減少を引き起こしたことが確認された(図4)。

0057

実施例4:間葉系幹細胞の継代数に応じた間葉系幹細胞におけるHLA−A2の発現レベルの変化の確認
臍帯血由来間葉系幹細胞におけるHLA−A2の発現が臍帯血由来間葉系幹細胞の継代数に応じて変化するかどうかを確認するために、間葉系幹細胞を最初に臍帯血から単離し、次に2回継代した間葉系幹細胞(2代目、P2、G028)及び6回継代した間葉系幹細胞(6代目、P6、G171)を使用してHLA−A2発現パターンを分析した。

0058

FACS分析は、実施例1と同じ方法で抗HLA−A2抗体を用いて実施した。その結果、それぞれ2回及び6回継代した間葉系幹細胞はいずれも90%以上のレベルでHLA−A2を発現しており、間葉系幹細胞は継代数にかかわらずHLA−A2を発現していることが確認された(図5)。

0059

実施例5:気管支肺異形成症マウスモデルを使用した、HLA−A2を表面に発現している臍帯血由来間葉系幹細胞の治療効果の確認
気管支肺異形成症は、構造の異常及び肺発達の停止を特徴とする疾患である。これは、呼吸窮迫新生児酸素換気装置による高濃度酸素療法を適用する過程で、肺の炎症が過度に誘発され肺障害を引き起こす、炎症性疾患の1つである。今のところ、世界中において、気管支肺異形成症の根本的治療治療法はない。

0060

したがって、HLA−A2を表面に発現している臍帯血由来間葉系幹細胞を気管支肺異形成症マウスモデルに投与した場合に、未成熟肺組織の再生及び炎症の抑制等の治療効果が認められるかどうかを確認した。

0061

詳細には、出生後の酸素換気装置による治療で起こる高酸素濃度の状態を反映させるために、妊娠中の母マウスを入手し、出産させた。その後、生後10時間以内の新生仔マウスを正常又は高酸素濃度のケージに移して飼育した。出産した母マウスもそれぞれ新生仔マウスを飼育するために同じケージに移して飼育した。妊娠中の母マウスから出産する新生仔マウスの数に変動が生じる可能性があり、新生仔マウスを高酸素濃度の条件で飼育した場合の平均死亡率は約50%であるという観点から、各群において合計18匹のマウスを飼育したので、最終的なマウスの数は各群において9匹であった。9匹のうち、3匹のマウスは肺組織の形態学的分析に使用し、3匹のマウスは炎症性物質を確認するための肺胞溶液抽出のために使用し、残りの3匹のマウスはRNA又はタンパク質分析のために使用した。各群の説明を以下の表2に示す。

0062

生後3日目に、新生仔マウスに麻酔薬としてゾレチル50 50mg/ml及びロンプン23.32mg/mlを腹腔内注射した。次に、PBS、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞(HLA−A2(+))又は対照siRNA(siCON)若しくはHLA−A2に対するsiRNA(siHLA−A2)で処理した間葉系幹細胞を新生仔マウスの気道に投与した。ここで、間葉系幹細胞を投与した群では、新生仔マウス1匹あたり間葉系幹細胞5×105個をPBS50μlに懸濁し、1回で投与した。その後、生後14日目に、麻酔薬をマウスの腹腔内に再度注射した。肺組織を採取し、分析した。4%ホルムアルデヒドで24時間固定した肺組織の塊をパラフィン包埋し、厚さ4μmの切片に切断し、ヘマトキシリンエオシン組織学的に染色し、光学顕微鏡で組織学的に観察した。このようにして、高酸素濃度によって障害が誘発された肺組織に対する、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞の治療効果を、比較によって評価した。

0063

その結果、高酸素濃度によって障害が誘発された後にPBSのみを投与された群(高酸素状態−PBS)は、正常酸素濃度下の群の肺組織と比較して、重度の肺胞障害を伴う肺組織を有していた。この肺胞障害に対して、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞を投与した群、すなわち本発明の投与群(高酸素状態−HLA−A2(+)−MSC−siCON)は、正常酸素濃度下の群と同様の肺胞保護又は治療効果を有していた。その一方で、投与群(高酸素状態−HLA−A2(+)−MSC−siHLA−A2)では治療効果はほとんど観察されなかった。これらの結果から、HLA−A2を発現している臍帯血由来間葉系幹細胞は、高酸素濃度によって引き起こされた肺の炎症及び肺障害を治療することができることが確認された(図6)。

0064

さらに、肺胞障害の程度は、平均線指数として定量化した。その結果、図7に例示したように、気管支肺異形成症モデル群(高酸素状態−PBS)は、正常群と比較して、肺胞発達障害のために有意に高い平均線形指数を示した。HLA−A2を発現している間葉系幹細胞を投与した群又は投与群(高酸素状態−HLA−A2(+)−MSC−siCON)では、肺障害が改善したため、平均線形指数が有意に低下したことが認められる。その一方で、投与群(高酸素状態−HLA−A2(+)−MSC−siHLA−A2)は、治療効果がほとんどないため、平均線形指数が有意には低下しなかった(図7)。

0065

実施例6:アルツハイマー病マウスモデルを使用した、HLA−A2を表面に発現している臍帯血由来間葉系幹細胞の治療効果の確認
アルツハイマー病マウスモデルとして、6か月齢5XFADマウス(Jackson Laboratory、米国)を使用した。5XFADマウスでは、2か月齢からアミロイドベータが脳組織で産生され始め、4か月齢でアミロイドベータは脳組織に蓄積し、約6か月齢で認知障害が現れる。6月齢5XFADマウスに、マウスの体重(g)あたり5μlの麻酔薬を腹腔内投与し、使用した麻酔薬は、ゾレチル、ロンプン及び生理食塩水を4:1:5の比で混合したものである。

0066

実施例1で単離したHLA−A2を発現している間葉系幹細胞の脳室内投与のために、ガイドカニューレ標的位置ブレグマから、前/後:−0.22mm、内/外:1.0mm、背/腹:2.5mm)に挿入し、その後カニューレ周りに配置されたネジで固定した。その後、回復のためにマウスに6〜8日の回復期間を与えた。次に、HLA−A2を発現している臍帯血由来間葉系幹細胞をハミルトンシリンジに移し、次いで内部カニューレをガイドカニューレに入れた。脳室内注射は、0.5μl/分の注入速度で実施した。各群の説明を以下の表3に示す。

0067

殺処分時に、体重に応じて適量の麻酔薬を腹腔内投与し、次いで蠕動ポンプを用いて心臓灌流を実施した。まず、心臓を露出させるために、マウスの皮膚、横隔膜及び肋骨を切断し、ポンプチューブ左心室に接続した。その後、PBSを体内循環させて血液を排出した。

0068

その後、脳組織を収集し、−80℃で冷凍保存した。脳組織は、溶解緩衝液及び超音波処理器を使用して溶解した。次に、ブラッドフォードアッセイを使用して、脳組織溶解物希釈して使用した。脳組織の溶解物等の溶解物の測定に適したサイトカインELISAキットを使用した。炎症誘発性サイトカインは、TNF−α ELISAキット(PeproTech、900K54EK)及びIFN−γ ELISAキット(RayBio、ELM−IFNg−CL)を使用して分析し、抗炎症性サイトカインは、CD163 ELISAキット(LSBio、カタログ番号LS−F9079)及びArg−1 ELISAキット(LSBio、カタログ番号LS−F6864)を使用して分析した。

0069

その結果、対照と比較して、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞を1回投与した実験群及びHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を繰り返し投与した実験群において、試験A(12週目)及び試験B(20週目)の両方の条件下でTNF−α及びINF−γが減少していた。特に、対照と比較して、TNF−αはHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を繰り返し投与した実験群で統計的に有意に減少し、INF−γはHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を1回投与した実験群で統計的に有意に減少していた(図8及び図9)。これらの結果から、間葉系幹細胞を繰り返し投与した場合、時間が経過した後でも抗炎症効力が維持されていることが確認された。

実施例

0070

さらに、CD163及びアルギナーゼ−1(Arg−1)は、脳組織における抗炎症性サイトカインとして典型的には知られており、ELISAによって分析した。その結果、対照と比較して、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞を1回投与した実験群及びHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を繰り返し投与した実験群において、試験A(12週目)及び試験B(20週目)の両方の条件下でCD163及びArg−1が増加していた。特に、対照と比較して、CD163は、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞を繰り返し投与した実験群において統計的に有意に増加し、Arg−1は、HLA−A2を発現している間葉系幹細胞を1回投与した実験群及びHLA−A2を発現している間葉系幹細胞を繰り返し投与した実験群の両方において統計的に有意に増加していた(図10及び図11)。これらの結果から、間葉系幹細胞を繰り返し投与した場合、時間が経過した後でも抗炎症効力が維持されていることが確認された。

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