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課題・解決手段

本明細書では、T細胞ゲノム編集及び形質導入を行うための方法、ならびにそれらを用いて免疫療法を行うための方法を開示する。とりわけ、本開示は、遺伝子改変キメラ抗原受容体(CAR)保有T細胞、及びがん治療におけるその使用方法に関する。

概要

背景

キメラ抗原受容体細胞(CAR−T)免疫療法は、ますます広く知られるようになっている。T細胞は、抗原認識部分及びT細胞活性ドメインで構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように、遺伝的に修飾されている。CARは、がん細胞上に過剰発現した抗原を認識するように設計されている。CAR−Tは、B細胞悪性腫瘍に対する優れた臨床効果を示しており、2種の治療薬、キムリア商標)(チサゲンクロセル、Novartis)及びイエスカルタ(商標)(アキシカブタゲンシロロイセル、Kite/Gilead)は、最近FDAにより承認された。これら治療薬のそれぞれは、それぞれの患者自身のT細胞にCARを形質導入すること、及び、疾患標的自家CAR−T細胞を患者養子細胞移入すること、を含む。このプロセスは、かなり長い時間を要し、非常に費用がかかる。

CAR−T療法の広い応用範囲は、2つの別の点で限定されている。第1に、T細胞悪性腫瘍に対するCAR−T細胞治療薬の開発には、CAR−T細胞上における標的抗原の発現が、CAR−T細胞の同胞殺し及び有効性の低下を誘導し得ることから、悪性T細胞とエフェクターT細胞の間における標的抗原の共通発現を一因とする未解決問題があることが判明している。第2に、CAR−T療法において、個々の患者自身のT細胞(同種異系)以外のT細胞を使用すると、移植片対宿主病を含む同種異系反応が引き起こされる場合がある。

更に、CAR−T細胞の作製は非効率的であり、CAR−T療法を含む、安価で容易に利用可能な養子細胞移入療法の最終目的は、所望の特性を有する同種異系細胞の増殖を促進させる改良された方法により、十分に満たされ得る。本明細書では、このような方法、及びそれらの方法を用いて作製される細胞を開示する。

概要

本明細書では、T細胞のゲノム編集及び形質導入を行うための方法、ならびにそれらを用いて免疫療法を行うための方法を開示する。とりわけ、本開示は、遺伝子改変キメラ抗原受容体(CAR)保有T細胞、及びがんの治療におけるその使用方法に関する。

目的

ゲノム編集T細胞及びゲノム編集CAR−T細胞
本開示は、キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞(CAR−T細胞)など、キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物、及び、がん、例えば、血液悪性腫瘍治療用の免疫療法を行うための方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

ゲノム編集免疫エフェクター細胞集団を作製するための方法であって、a.T細胞受容体(TCR)保有免疫エフェクター細胞の集団のゲノムを編集すること、b.前記免疫エフェクター細胞集団を活性化させること、及び、c.ゲノム編集免疫エフェクター細胞の前記集団を増殖させること、の工程を含む、前記方法。

請求項2

前記T細胞受容体(TCR)保有免疫エフェクター細胞は、1種または複数種タンパク質を認識する少なくとも1種のキメラ抗原受容体(CAR)を形質導入されている、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記ゲノム編集工程(a)は、前記免疫エフェクター細胞集団に、前記1種または複数種のCARを形質導入することを含む、請求項2に記載の方法。

請求項4

工程(b)と工程(c)の間に実施される、前記免疫エフェクター細胞集団に、前記1種または複数種のCARを形質導入する追加の工程を含む、請求項2に記載の方法。

請求項5

a.T細胞受容体(TCR)保有免疫エフェクター細胞の集団のゲノムを編集すること、b.前記免疫エフェクター細胞集団を活性化させること、c.前記免疫エフェクター細胞集団に、1種または複数種のタンパク質を認識する少なくとも1種のキメラ抗原受容体(CAR)を形質導入すること、及び、d.ゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の前記集団を増殖させること、の工程を含む、ゲノム編集キメラ抗原受容体(CAR)保有免疫エフェクター細胞の集団を作製するための方法である、請求項4に記載の方法。

請求項6

前記免疫エフェクター細胞は精製されている、請求項5に記載の方法。

請求項7

前記免疫エフェクター細胞はT細胞である、請求項6に記載の方法。

請求項8

前記キメラ抗原受容体(CAR)が認識する前記1種または複数種のタンパク質は、抗原及び細胞表面タンパク質から選択される、請求項7に記載の方法。

請求項9

ゲノムは、CRISPR関連タンパク質(Cas−CRISPR)、転写活性化因子エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を使用して、編集される、請求項8に記載の方法。

請求項10

ゲノムは、Cas−CRISPRを使用して編集される、請求項9に記載の方法。

請求項11

前記ゲノムは、Cas9−CRISPRを使用して編集される、請求項10に記載の方法。

請求項12

前記Cas9は、mRNAまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、請求項11に記載の方法。

請求項13

前記Cas9は、mRNAとして前記細胞内に送達される、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記Cas9は、タンパク質として前記細胞内に送達される、請求項12に記載の方法。

請求項15

編集される前記遺伝子を標的とするガイドRNA(gRNA)は、前記Cas9と同時に送達される、請求項12に記載の方法。

請求項16

前記送達はエレクトロポレーションによる、請求項15に記載の方法。

請求項17

前記ゲノム編集は、1種または複数種の抗原、細胞表面タンパク質、または分泌可能なタンパク質の発現欠失または抑制することを含む、請求項16に記載の方法。

請求項18

欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体I(MHCI)またはそのサブユニットである、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記サブユニットはβ2ミクログロブリン(B2M)である、請求項18に記載の方法。

請求項20

欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、T細胞受容体(TCR)またはそのサブユニットである、請求項17に記載の方法。

請求項21

欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、TRAC(TCR−α)、TCR−β、CD3ε、CD3ζ、CD3δ、及びCD3γ、から選択される、請求項20に記載の方法。

請求項22

欠失/抑制される細胞表面タンパク質はTRACである、請求項21に記載の方法。

請求項23

欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、T細胞の消耗を防止するタンパク質である、請求項17に記載の方法。

請求項24

T細胞の消耗を防止する細胞表面タンパク質は、T細胞上の免疫チェックポイントである、請求項23に記載の方法。

請求項25

T細胞の消耗を防止する前記表面タンパク質は、PD−1、LAG−3、Tim−3、及びCTLA−4、から選択される、請求項24に記載の方法。

請求項26

前記ゲノム編集は、1種または複数種の分泌可能なタンパク質の発現を欠失または抑制することを含む、請求項16に記載の方法。

請求項27

前記分泌可能なタンパク質はサイトカインである、請求項26に記載の方法。

請求項28

前記サイトカインは、MCP1(CCL2)、MCP−2、GMCSF、G−CSF、M−CSF、Il−4、及びIFNγ、から選択される、請求項27に記載の方法。

請求項29

前記サイトカインはGM−CSFである、請求項28に記載の方法。

請求項30

前記分泌可能なタンパク質は転写因子である、請求項26に記載の方法。

請求項31

前記転写因子は、AHR、BCL6、FOXP3、GATA3、MAF、RORC、SPI1、TBX21、から選択される、請求項30に記載の方法。

請求項32

欠失/抑制される細胞表面タンパク質または抗原は、CAR(複数可)の標的である、請求項17に記載の方法。

請求項33

前記細胞は、編集後最長48時間静置されてから活性化される、請求項1に記載の方法。

請求項34

前記細胞は、編集後最長24時間静置されてから活性化される、請求項1に記載の方法。

請求項35

前記細胞は、編集後最長8時間静置されてから活性化される、請求項1に記載の方法。

請求項36

前記細胞は、編集後最長4時間静置されてから活性化される、請求項1に記載の方法。

請求項37

前記細胞は、編集後24〜48時間静置されてから活性化される、請求項1に記載の方法。

請求項38

前記細胞は、ゲノム編集の直後に活性化される、請求項1に記載の方法。

請求項39

前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗CD3抗体及び抗CD28抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団曝露することによって行われる、請求項37に記載の方法。

請求項40

前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗CD3抗体、抗CD28抗体、及び抗CD2抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団を曝露することによって行われる、請求項1に記載の方法。

請求項41

前記抗体はビーズに固定されている、請求項39に記載の方法。

請求項42

前記ゲノム編集細胞は、最長5日間にわたり活性化される、請求項39に記載の方法。

請求項43

前記ゲノム編集細胞は、最長2日間にわたり活性化される、請求項39に記載の方法。

請求項44

前記ゲノム編集細胞は、最長1日間にわたり活性化される、請求項39に記載の方法。

請求項45

前記抗CD3抗体、抗CD28抗体、及び/または抗CD2抗体は、磁場の印加または洗浄により、前記細胞集団から取り除かれる、請求項42のいずれか1項に記載の方法。

請求項46

前記CARは、活性化後48時間未満において、前記細胞に形質導入される、請求項43に記載の方法。

請求項47

前記CARは、活性化後24時間未満において、前記細胞に形質導入される、請求項45に記載の方法。

請求項48

前記CARは、前記CARをコードするレンチウイルスベクターを用いて、前記細胞に形質導入される、請求項46に記載の方法。

請求項49

細胞の前記集団を、20日間未満にわたり増殖させる、請求項48に記載の方法。

請求項50

細胞の前記集団を、12日間未満にわたり増殖させる、請求項48に記載の方法。

請求項51

細胞の前記集団を、10日間未満にわたり増殖させる、請求項48に記載の方法。

請求項52

細胞の前記集団を、8日間未満にわたり増殖させる、請求項48に記載の方法。

請求項53

細胞の前記集団を、6日間未満にわたり増殖させる、請求項48に記載の方法。

請求項54

約25℃〜約40℃の温度で実施される、請求項49に記載の方法。

請求項55

約30℃〜約37℃の温度で実施される、請求項54に記載の方法。

請求項56

フローサイトメトリーを用いて前記細胞を解析して、前記CAR(または、複数を形質導入する場合、複数のCAR)の発現を確認する追加の工程を含む、請求項55に記載の方法。

請求項57

TCR+細胞を枯渇させる追加の工程を含む、請求項56に記載の方法。

請求項58

使用する前記免疫エフェクター細胞は、健康なドナーから採取される、請求項20に記載の方法。

請求項59

前記ドナーはヒトである、請求項58に記載の方法。

請求項60

前記キメラ抗原受容体(複数可)は、悪性細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、請求項59に記載の方法。

請求項61

悪性細胞上に発現した前記1種または複数種の抗原は、BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim−3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56、及びCD1a、から選択される、請求項60に記載の方法。

請求項62

前記キメラ抗原受容体(複数可)は、悪性T細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、請求項60に記載の方法。

請求項63

悪性T細胞上に発現した前記抗原は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、TCRA、及びTCRβ、から選択される、請求項62に記載の方法。

請求項64

前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、請求項60に記載の方法。

請求項65

悪性形質細胞上に発現した前記抗原は、BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138、及びCD19、から選択される、請求項64に記載の方法。

請求項66

前記キメラ抗原受容体(複数可)は、悪性B細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、請求項60に記載の方法。

請求項67

悪性B細胞上に発現した前記抗原は、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38、及びCD45、から選択される、請求項66に記載の方法。

請求項68

悪性B細胞上に発現した前記抗原は、CD19及びCD20から選択される、請求項67に記載の方法。

請求項69

前記キメラ抗原受容体は、悪性中皮細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、請求項60に記載の方法。

請求項70

悪性中皮細胞上に発現した前記抗原はメソテリンである、請求項69に記載の方法。

請求項71

CARがCD7を標的とし、TRAC及びCD7が欠失している、キメラ抗原受容体T(CAR−T)細胞(UCART7細胞)の集団を作製するための方法であって、a.Cas9−CRISPR、及び抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)をコードする遺伝子を標的とするgRNAを使用して、健康なヒトドナーに由来するT細胞の集団内のCD7遺伝子及びTRAC遺伝子を編集して、CD7及びTRACを欠失/抑制すること、b.前記T細胞集団を活性化させること、c.前記T細胞集団に、CD7を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、d.UCART7細胞の前記集団を増殖させること、の工程を含む、前記方法。

請求項72

CARが、CD2及びCD3εを標的とするタンデムCARであり、CD3ε及びCD2が欠失している、キメラ抗原受容体T(CAR−T)細胞(tUCART2/3細胞)の集団を作製するための方法であって、a.Cas9−CRISPR、及び抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)をコードする遺伝子を標的とするgRNAを使用して、健康なヒトドナーに由来するT細胞の集団内のCD2遺伝子及びCD3ε遺伝子を編集して、CD2及びCD3εを欠失/抑制すること、b.前記T細胞集団を活性化させること、c.前記T細胞集団に、CD2及びCD3εを認識するタンデムキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、d.tUCART2/3細胞の前記集団を増殖させること、の工程を含む、前記方法。

請求項73

請求項1に記載の方法を用いて作製された、ゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団。

請求項74

請求項73に記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団、ならびに、少なくとも1種の治療的に許容される担体及び/またはアジュバント、を含む、治療用組成物

請求項75

請求項1に記載のキメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む、患者における固形器腫瘍を治療するための方法。

請求項76

請求項1に記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む、患者における血液悪性腫瘍を治療するための方法。

請求項77

前記血液悪性腫瘍はT細胞悪性腫瘍である、請求項76に記載の方法。

請求項78

前記T細胞悪性腫瘍はT細胞急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)である、請求項77に記載の方法。

請求項79

前記T細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である、請求項76に記載の方法。

請求項80

前記血液悪性腫瘍はB細胞悪性腫瘍である、請求項76に記載の方法。

請求項81

前記B細胞悪性腫瘍はB細胞リンパ腫である、請求項80に記載の方法。

請求項82

前記B細胞悪性腫瘍はB細胞性白血病である、請求項80に記載の方法。

請求項83

前記血液悪性腫瘍は骨髄性悪性腫瘍である、請求項76に記載の方法。

請求項84

前記骨髄性悪性腫瘍は急性骨髄性白血病である、請求項83に記載の方法。

技術分野

0001

本出願は、2018年5月31日に出願された米国仮出願第62/678,886号の利益を主張するものであり、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。

0002

本明細書では、T細胞ゲノム編集及び形質導入を行うための方法、ならびにそれらを用いて免疫療法を行うための方法を開示する。とりわけ、本開示は、遺伝子改変キメラ抗原受容体(CAR)保有T細胞(CAR−T)、ならびに、T細胞悪性腫瘍及びB細胞悪性腫瘍治療におけるその使用方法に関する。

背景技術

0003

キメラ抗原受容体T細胞(CAR−T)免疫療法は、ますます広く知られるようになっている。T細胞は、抗原認識部分及びT細胞活性ドメインで構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように、遺伝的に修飾されている。CARは、がん細胞上に過剰発現した抗原を認識するように設計されている。CAR−Tは、B細胞悪性腫瘍に対する優れた臨床効果を示しており、2種の治療薬、キムリア商標)(チサゲンクロセル、Novartis)及びイエスカルタ(商標)(アキシカブタゲンシロロイセル、Kite/Gilead)は、最近FDAにより承認された。これら治療薬のそれぞれは、それぞれの患者自身のT細胞にCARを形質導入すること、及び、疾患標的自家CAR−T細胞を患者養子細胞移入すること、を含む。このプロセスは、かなり長い時間を要し、非常に費用がかかる。

0004

CAR−T療法の広い応用範囲は、2つの別の点で限定されている。第1に、T細胞悪性腫瘍に対するCAR−T細胞治療薬の開発には、CAR−T細胞上における標的抗原の発現が、CAR−T細胞の同胞殺し及び有効性の低下を誘導し得ることから、悪性T細胞とエフェクターT細胞の間における標的抗原の共通発現を一因とする未解決問題があることが判明している。第2に、CAR−T療法において、個々の患者自身のT細胞(同種異系)以外のT細胞を使用すると、移植片対宿主病を含む同種異系反応が引き起こされる場合がある。

0005

更に、CAR−T細胞の作製は非効率的であり、CAR−T療法を含む、安価で容易に利用可能な養子細胞移入療法の最終目的は、所望の特性を有する同種異系細胞の増殖を促進させる改良された方法により、十分に満たされ得る。本明細書では、このような方法、及びそれらの方法を用いて作製される細胞を開示する。

図面の簡単な説明

0006

図1は、本明細書で開示するゲノム編集CAR−T細胞を作製するための代替法の2つの実施形態を示し、遺伝子編集は活性化に先行する。上部のパネルは、期間及び工程間の長さの選択肢を示すフローチャートを示し、下部のパネルは、あるより具体的な実施形態を示している。

0007

図2は、TRACのゲノム編集後におけるT細胞受容体(TCR)の欠失を確認するためのフローサイトメトリーによるT細胞を示す。

0008

図3〜8は、+4日目のT細胞におけるTCRα及びCD3εの表面発現により測定したCD3+T細胞及びCD3−T細胞の増殖について、T細胞のゲノム編集(例えば、Cas9mRNA及びgRNAのエレクトロポレーション(EP))と活性化(例えば、抗CD3mAb及び抗CD28mAbを用いた刺激による)の間の期間を長くすることの影響を示す。それぞれの図において、上部のパネルは、TCR発現、具体的には、CD3発現(APCアロフィコシアニン)によるFL6−A、横軸)に対するTRAC発現(FITCフルオレセインイソチオシアネート)によるFL1−A、縦軸)を示す、フローサイトメトリー結果の散布図である。下部のパネルは、CD3抗原発現(APCによるFL6−A、横軸)に対する、CD3+細胞及びCD3−細胞のカウント(縦軸)を示す。

0009

図3は、活性化の前にゲノム編集(EP)を実施しなかった場合の、+4日目のT細胞におけるTCRα及びCD3εの表面発現により測定したCD3+細胞及びCD3−細胞の増殖を示す。

0010

図4は、ゲノム編集(EP)の直後、すなわち、意図的な遅延なしに、細胞を活性化させた場合の、+4日目のT細胞におけるTCRα及びCD3εの表面発現により測定したCD3+細胞及びCD3−細胞の増殖を示す。

0011

図5は、ゲノム編集(EP)の4時間後に細胞を活性化させた場合の、+4日目のT細胞におけるTCRα及びCD3εの表面発現により測定したCD3+細胞及びCD3−細胞の増殖を示す。

0012

図6は、ゲノム編集(EP)の8時間後に細胞を活性化させた場合の、+4日目のT細胞におけるTCRα及びCD3εの表面発現により測定したCD3+細胞及びCD3−細胞の増殖を示す。

0013

図7は、ゲノム編集(EP)の20時間後に細胞を活性化させた場合の、+4日目のT細胞におけるTCRα及びCD3εの表面発現により測定したCD3+細胞及びCD3−細胞の増殖を示す。

0014

図8は、遺伝子編集T細胞におけるTRAC欠失の動態を示す。

0015

図9は、理論上のT細胞活性化ウィンドウを示す。

0016

図10は、遺伝子編集T細胞におけるT細胞増殖の動態を示す。上部のパネルは絶対細胞カウント数を示し、下部のパネルは増殖倍率を示している。

0017

図面の更なる説明については以下に記載する。

0018

それゆえ、本明細書では、実施形態1として、
a.T細胞受容体(TCR)保有免疫エフェクター細胞集団のゲノムを編集すること、
b.免疫エフェクター細胞集団を活性化させること、及び、
c.ゲノム編集免疫エフェクター細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、ゲノム編集免疫エフェクター細胞の集団を作製するための方法を開示する。

0019

細胞の集団を増殖させるために、編集前における細胞の活性化が必要であることは、従来の方法が教示するところである。本明細書で示すとおり、一部の状況においては、逆の順番がより効果的であり、効率的な、細胞のゲノム編集及び編集集団の増殖を可能とする。

0020

編集は多くの形態を取り得る。タンパク質または核酸のいずれか、とりわけ、RNAを、広範な目的のために、細胞に形質導入してもよい。遺伝子の欠失または抑制、キメラ抗原受容体(CAR)の挿入または発現、及びタンパク質または短ヘアピンRNA(shRNA)の発現を全て実施してもよい。CRISPR(とりわけ、Cas9及びガイドRNAを使用した)などの技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を用いた編集を使用してもよく、ベクターもまた、発現及び/または遺伝子導入用構築物送達することができる。コア編集と、それに続く活性化に付随して、それに先行するまたはそれに続く編集工程もまた実施してもよい。

0021

以下の開示は、本方法の実施形態、選択肢、及び用途に加え、本方法を用いて作製した遺伝子改変細胞、ならびに、例えば、疾患を治療するための、免疫療法及び養子細胞移入におけるこのような細胞の使用を詳述する。それゆえ、本明細書では以下の実施形態を提供する。

0022

実施形態2.前記T細胞受容体(TCR)保有免疫エフェクター細胞は、1種または複数種のタンパク質を認識する少なくとも1種のキメラ抗原受容体(CAR)を形質導入されている、実施形態1に記載の方法。

0023

実施形態3.前記ゲノム編集工程(a)は、前記免疫エフェクター細胞集団に、前記1種または複数種のCARを形質導入することを含む、実施形態2に記載の方法。

0024

実施形態4.工程(b)と工程(c)の間に実施される、前記免疫エフェクター細胞集団に、前記1種または複数種のCARを形質導入する追加の工程を含む、実施形態2に記載の方法。

0025

実施形態5.ゲノム編集キメラ抗原受容体(CAR)保有免疫エフェクター細胞の集団を作製するための方法であって、
a.T細胞受容体(TCR)保有免疫エフェクター細胞の集団のゲノムを編集すること、
b.前記免疫エフェクター細胞集団を活性化させること、
c.前記免疫エフェクター細胞集団に、1種または複数種のタンパク質を認識する少なくとも1種のキメラ抗原受容体(CAR)を形質導入すること、及び、
d.ゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、前記方法。

0026

実施形態6.前記TCR保有免疫エフェクター細胞は精製されている、実施形態1から実施形態5のいずれか1つに記載の方法。

0027

実施形態7.前記免疫エフェクター細胞はT細胞である、実施形態1から実施形態6のいずれか1つに記載の方法。

0028

実施形態8.前記キメラ抗原受容体(CAR)が認識する前記1種または複数種のタンパク質は、抗原及び細胞表面タンパク質から選択される、実施形態1から実施形態7のいずれか1つに記載の方法。

0029

実施形態9.ゲノムは、CRISPR関連タンパク質(Cas−CRISPR)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を使用して、編集されて前記細胞内に送達される、実施形態1から実施形態8のいずれか1つに記載の方法。

0030

実施形態10.ゲノムは、Cas−CRISPRを使用して編集される、実施形態9に記載の方法。

0031

実施形態11.前記ゲノムは、Cas9−CRISPRを使用して編集される、実施形態10に記載の方法。

0032

実施形態12.前記Cas9は、mRNAまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態11に記載の方法。

0033

実施形態13.前記Cas9は、mRNAとして前記細胞内に送達される、実施形態12に記載の方法。

0034

実施形態14.前記Cas9は、タンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態12に記載の方法。

0035

実施形態15.編集される前記遺伝子を標的とするガイドRNA(gRNA)は、前記Cas9と同時に送達される、実施形態9から実施形態14のいずれか1つに記載の方法。

0036

実施形態16.ゲノムは、前記細胞に、タンパク質またはshRNAをコードする核酸を形質導入することにより編集される、実施形態1から実施形態16のいずれか1つに記載の方法。

0037

実施形態17.前記形質導入することは、ウイルスまたはウイルスベクターによる、実施形態16に記載の方法。

0038

実施形態18.前記形質導入することは、レンチウイルスベクターによる、実施形態17に記載の方法。

0039

実施形態19.前記形質導入することは、アデノ随伴ウイルスによる、実施形態17に記載の方法。

0040

実施形態20.前記送達または形質導入することは、エレクトロポレーションによる、実施形態9から実施形態19のいずれか1つに記載の方法。

0041

実施形態21.前記ゲノム編集は、1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制することを含む、実施形態1から実施形態20に記載の方法。

0042

実施形態22.欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体I(MHCI)またはそのサブユニットである、実施形態21に記載の方法。

0043

実施形態23.欠失/抑制される細胞表面タンパク質はβ2ミクログロブリンである、実施形態22に記載の方法。

0044

実施形態24.欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、T細胞受容体(TCR)またはそのサブユニットである、実施形態21に記載の方法。

0045

実施形態25.欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、TRAC(TCR−α)、TCR−β、CD3ε、CD3ζ、CD3δ、及びCD3γ、から選択される、実施形態24に記載の方法。

0046

実施形態26.欠失/抑制される細胞表面タンパク質はTRACである、実施形態25に記載の方法。

0047

実施形態27.欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、T細胞の消耗を防止するタンパク質である、実施形態21に記載の方法。

0048

実施形態28.T細胞の消耗を防止する細胞表面タンパク質は、T細胞上の免疫チェックポイントである、実施形態27に記載の方法。

0049

実施形態29.T細胞の消耗を防止する前記表面タンパク質は、PD−1、LAG−3、Tim−3、及びCTLA−4、から選択される、実施形態28に記載の方法。

0050

実施形態30.前記ゲノム編集は、1種または複数種の分泌可能なタンパク質の発現を欠失または抑制することを含む、実施形態21に記載の方法。

0051

実施形態31.前記分泌可能なタンパク質はサイトカインである、実施形態30に記載の方法。

0052

実施形態32.前記サイトカインは、MCP1(CCL2)、MCP−2、GMCSF、G−CSF、M−CSF、Il−4、及びIFNγ、から選択される、実施形態31に記載の方法。

0053

実施形態33.前記サイトカインはGM−CSFである、実施形態32に記載の方法。

0054

実施形態34.前記分泌可能なタンパク質は転写因子である、実施形態31に記載の方法。

0055

実施形態35.前記転写因子は、AHR、BCL6、FOXP3、GATA3、MAF、RORC、SPI1、TBX21、から選択される、実施形態32に記載の方法。

0056

実施形態36.欠失/抑制される前記細胞表面タンパク質または抗原は、前記CARの標的である、実施形態21に記載の方法。

0057

実施形態37.前記ゲノム編集は、タンパク質発現ブロッカー(PEBL)を発現するように形質導入することを含む、実施形態21に記載の方法。

0058

実施形態38.前記ゲノム編集は、shRNAを発現するように形質導入することを含む、実施形態21に記載の方法。

0059

実施形態39.前記細胞は、編集後最長48時間静置されてから活性化される、実施形態1から実施形態38のいずれか1つに記載の方法。

0060

実施形態40.前記細胞は、編集後最長24時間静置されてから活性化される、実施形態1から実施形態38のいずれか1つに記載の方法。

0061

実施形態41.前記細胞は、編集後最長8時間静置されてから活性化される、実施形態1から実施形態38のいずれか1つに記載の方法。

0062

実施形態42.前記細胞は、編集後最長4時間静置されてから活性化される、実施形態1から実施形態38のいずれか1つに記載の方法。

0063

実施形態43.前記細胞は、編集後24〜48時間静置されてから活性化される、実施形態1から実施形態38のいずれか1つに記載の方法。

0064

実施形態44.前記細胞は、ゲノム編集の直後に活性化される、実施形態1から実施形態38のいずれか1つに記載の方法。

0065

実施形態45.前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗CD3抗体及び抗CD28抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団曝露することによって行われる、実施形態1から実施形態44のいずれか1つに記載の方法。

0066

実施形態46.前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗CD3抗体、抗CD28抗体、及び抗CD2抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団を曝露することによって行われる、実施形態1から実施形態44のいずれか1つに記載の方法。

0067

実施形態47.前記抗体はビーズに固定されている、実施形態45から実施形態46のいずれか1つに記載の方法。

0068

実施形態48.前記ゲノム編集細胞は、最長5日間にわたり活性化される、実施形態1から実施形態47のいずれか1つに記載の方法。

0069

実施形態49.前記ゲノム編集細胞は、最長2日間にわたり活性化される、実施形態1から実施形態47のいずれか1つに記載の方法。

0070

実施形態50.前記ゲノム編集細胞は、最長1日間にわたり活性化される、実施形態1から実施形態47のいずれか1つに記載の方法。

0071

実施形態51.前記抗CD3抗体、抗CD28抗体、及び/または抗CD2抗体は、磁場の印加または洗浄により、前記細胞集団から取り除かれる、実施形態45から実施形態50のいずれか1つに記載の方法。

0072

実施形態52.前記CARは、活性化後48時間未満において、前記細胞に形質導入される、実施形態2から実施形態51のいずれか1つに記載の方法。

0073

実施形態53.前記CARは、活性化後24時間未満において、前記細胞に形質導入される、実施形態2から実施形態51のいずれか1つに記載の方法。

0074

実施形態54.前記CARは、前記CARをコードするレンチウイルスベクターを用いて、前記細胞に形質導入される、実施形態2から実施形態53のいずれか1つに記載の方法。

0075

実施形態55.細胞の前記集団を、20日間未満にわたり増殖させる、実施形態1から実施形態54のいずれか1つに記載の方法。

0076

実施形態56.細胞の前記集団を、12日間未満にわたり増殖させる、実施形態1から実施形態54に記載の方法。

0077

実施形態57.細胞の前記集団を、10日間未満にわたり増殖させる、実施形態1から実施形態54に記載の方法。

0078

実施形態58.細胞の前記集団を、8日間未満にわたり増殖させる、実施形態1から実施形態54に記載の方法。

0079

実施形態59.細胞の前記集団を、6日間未満にわたり増殖させる、実施形態1から実施形態54に記載の方法。

0080

実施形態60.約25℃〜約40℃の温度で実施される、実施形態1から実施形態59のいずれか1つに記載の方法。

0081

実施形態61.約30℃〜約37℃の温度で実施される、実施形態1から実施形態59のいずれか1つに記載の方法。

0082

実施形態62.約37℃で実施される、実施形態1から実施形態59のいずれか1つに記載の方法。

0083

実施形態63.約30℃で実施される、実施形態1から実施形態59のいずれか1つに記載の方法。

0084

実施形態64.フローサイトメトリーを用いて前記細胞を解析して、前記CAR(または、複数を形質導入する場合、複数のCAR)の発現、及び/または、形質導入タンパク質の発現、及び/または、タンパク質の発現(または、その欠如、すなわち、欠失または抑制)、を確認する追加の工程を含む、実施形態1から実施形態63のいずれか1つに記載の方法。

0085

実施形態65.TCR+細胞を枯渇させる追加の工程を含む、実施形態24から実施形態64のいずれか1つに記載の方法。

0086

実施形態66.使用する前記免疫エフェクター細胞は、健康なドナー(または、臍帯血から、もしくはPBMCから)から採取される、実施形態1から実施形態65のいずれか1つに記載の方法。

0087

実施形態67.前記ドナーはヒトである、実施形態66に記載の方法。

0088

実施形態68.前記キメラ抗原受容体(複数可)は、悪性細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、実施形態2から実施形態67のいずれか1つに記載の方法。

0089

実施形態69.悪性細胞上に発現した前記1種または複数種の抗原は、BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim−3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56、及びCD1a、から選択される、実施形態68に記載の方法。

0090

実施形態70.前記キメラ抗原受容体(複数可)は、悪性T細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、実施形態68に記載の方法。

0091

実施形態71.悪性T細胞上に発現した前記抗原は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、TCRA、及びTCRβ、から選択される、実施形態70に記載の方法。

0092

実施形態72.前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、実施形態68に記載の方法。

0093

実施形態73.悪性形質細胞上に発現した前記抗原は、BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138、及びCD19、から選択される、実施形態72に記載の方法。

0094

実施形態74.前記キメラ抗原受容体(複数可)は、悪性B細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、実施形態68に記載の方法。

0095

実施形態75.悪性B細胞上に発現した前記抗原は、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38、及びCD45、から選択される、実施形態74に記載の方法。

0096

実施形態76.悪性B細胞上に発現した前記抗原は、CD19、CD20、CD22、CD24、CD38、及びCD45、から選択される、実施形態75に記載の方法。

0097

実施形態77.前記キメラ抗原受容体は、悪性中皮細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、実施形態68に記載の方法。

0098

実施形態78.悪性中皮細胞上に発現した前記抗原はメソテリンである、実施形態77に記載の方法。

0099

実施形態79.ゲノム編集CAR−T細胞の集団を作製するための方法であって、
a.Cas9−CRISPR、及び抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)をコードする遺伝子(複数可)を標的とするgRNAを用いて、T細胞集団における前記1種または複数種の抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)の発現を欠失または抑制すること、
b.前記T細胞集団を活性化させること、
c.前記T細胞集団に、1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、
d.CAR−T細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、前記方法。

0100

実施形態80.欠失/抑制される細胞表面タンパク質または抗原は、TRAC(TCR−α)、TCR−β、CD3ε、CD3ζ、CD3δ、及びCD3γ、から選択される、実施形態79に記載の方法。

0101

実施形態81.欠失/抑制される細胞表面タンパク質または抗原はTRACである、実施形態80に記載の方法。

0102

実施形態82.T細胞受容体(TCR)シグナル伝達欠損したゲノム編集CAR−T細胞の集団を作製するための方法であって、
a.前記T細胞受容体(TCR)またはそのサブユニットの発現を欠失または抑制し、任意選択的に、Cas9−CRISPR、及び抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)をコードする遺伝子(複数可)を標的とするgRNAを用いて、T細胞集団における前記1種または複数種の抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)の発現を欠失または抑制すること、
b.前記T細胞集団を活性化させること、
c.前記T細胞集団に、1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、
d.TCR欠損CAR−T細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、前記方法。

0103

実施形態83.欠失/抑制される前記TCRサブユニットは、TRAC(TCR−α)、TCR−β、CD3ε、CD3ζ、CD3δ、及びCD3γ、から選択される、実施形態82に記載の方法。

0104

実施形態84.欠失/抑制される前記TCRサブユニットはTRACである、実施形態82に記載の方法。

0105

実施形態85.前記Cas9は、mRNAまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態79から実施形態83のいずれか1つに記載の方法。

0106

実施形態86.前記Cas9は、mRNAとして前記細胞内に送達される、実施形態85に記載の方法。

0107

実施形態87.前記Cas9は、タンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態86に記載の方法。

0108

実施形態88.1種または複数種の抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)の発現を欠失または抑制することを含む、実施形態82から実施形態87のいずれか1つに記載の方法。

0109

実施形態89.欠失/抑制される前記細胞表面タンパク質または抗原は、前記CARの標的である、実施形態88に記載の方法。

0110

実施形態90.ゲノムは、前記細胞に、タンパク質またはshRNAをコードする核酸を形質導入することにより編集される、実施形態79から実施形態89のいずれか1つに記載の方法。

0111

実施形態91.前記形質導入することは、ウイルスまたはウイルスベクターによる、実施形態90に記載の方法。

0112

実施形態92.前記形質導入することは、レンチウイルスベクターによる、実施形態91に記載の方法。

0113

実施形態93.前記形質導入することは、アデノ随伴ウイルスによる、実施形態91に記載の方法。

0114

実施形態94.前記送達または形質導入することは、エレクトロポレーションによる、実施形態79から実施形態93のいずれか1つに記載の方法。

0115

実施形態95.欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体I(MHCI)またはそのサブユニットである、実施形態79から実施形態94のいずれか1つに記載の方法。

0116

実施形態96.前記サブユニットはβ2ミクログロブリンである、実施形態94に記載の方法。

0117

実施形態97.欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、T細胞の消耗を防止するタンパク質である、実施形態79から実施形態93のいずれか1つに記載の方法。

0118

実施形態98.T細胞の消耗を防止する細胞表面タンパク質は、T細胞上の免疫チェックポイントである、実施形態97に記載の方法。

0119

実施形態99.T細胞の消耗を防止する前記表面タンパク質は、PD−1、LAG−3、Tim−3、及びCTLA−4、から選択される、実施形態98に記載の方法。

0120

実施形態100.前記ゲノム編集は、タンパク質発現ブロッカー(PEBL)を発現するように形質導入することを含む、実施形態79から実施形態93のいずれか1つに記載の方法。

0121

実施形態101.前記キメラ抗原受容体(複数可)は、悪性細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、実施形態79から実施形態100のいずれか1つに記載の方法。

0122

実施形態102.悪性細胞上に発現した前記1種または複数種の抗原は、BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim−3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56、及びCD1a、から選択される、実施形態101に記載の方法。

0123

実施形態103.前記キメラ抗原受容体(複数可)は、悪性T細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、実施形態101に記載の方法。

0124

実施形態104.悪性T細胞上に発現した前記抗原は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、TCRA、及びTCRβ、から選択される、実施形態103に記載の方法。

0125

実施形態105.前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、実施形態101に記載の方法。

0126

実施形態106.悪性形質細胞上に発現した前記抗原は、BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138、及びCD19、から選択される、実施形態105に記載の方法。

0127

実施形態107.前記キメラ抗原受容体(複数可)は、悪性B細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、実施形態101に記載の方法。

0128

実施形態108.悪性B細胞上に発現した前記抗原は、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38、及びCD45、から選択される、実施形態107に記載の方法。

0129

実施形態109.悪性B細胞上に発現した前記抗原は、CD19、CD20、CD22、CD24、CD38、及びCD45、から選択される、または、CD19及びCD20から選択される、実施形態108に記載の方法。

0130

実施形態110.前記キメラ抗原受容体は、悪性中皮細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する、実施形態101に記載の方法。

0131

実施形態111.悪性中皮細胞上に発現した前記抗原はメソテリンである、実施形態110に記載の方法。

0132

実施形態112.CARがCD7を標的とし、TRAC及びCD7が欠失している、キメラ抗原受容体T(CAR−T)細胞(UCART7細胞)の集団を作製するための方法であって、
a.Cas9−CRISPR、及び抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)をコードする遺伝子を標的とするgRNAを使用して、健康なヒトドナーに由来するT細胞の集団内のCD7遺伝子及びTRAC遺伝子を編集して、CD7及びTRACを欠失/抑制すること、
b.前記T細胞集団を活性化させること、
c.前記T細胞集団に、CD7を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、
d.UCART7細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、前記方法。

0133

実施形態113.CARが、CD2及びCD3εを標的とするタンデムCARであり、CD3ε及びCD2が欠失している、キメラ抗原受容体T(CAR−T)細胞(tUCART2/3細胞)の集団を作製するための方法であって、
a.Cas9−CRISPR、及び抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)をコードする遺伝子を標的とするgRNAを使用して、健康なヒトドナーに由来するT細胞の集団内のCD2遺伝子及びCD3ε遺伝子を編集して、CD2及びCD3εを欠失/抑制すること、
b.前記T細胞集団を活性化させること、
c.前記T細胞集団に、CD及びCD3εを認識するタンデムキメラ抗原受容体を形質導入すること、ならびに、
d.tUCART2/3細胞の前記集団を増殖させること、
の工程を含む、前記方法。

0134

実施形態114.前記Cas9は、mRNAまたはタンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態79から実施形態113のいずれか1つに記載の方法。

0135

実施形態115.前記Cas9は、mRNAとして前記細胞内に送達される、実施形態114に記載の方法。

0136

実施形態116.前記Cas9は、タンパク質として前記細胞内に送達される、実施形態114に記載の方法。

0137

実施形態117.1種または複数種の抗原(複数可)、細胞表面タンパク質(複数可)、または分泌可能なタンパク質の発現を欠失または抑制することを含む、実施形態79から実施形態116のいずれか1つに記載の方法。

0138

実施形態118.ゲノムは、前記細胞に、タンパク質またはshRNAをコードする核酸を形質導入することにより編集される、実施形態79から実施形態119のいずれか1つに記載の方法。

0139

実施形態119.前記形質導入することは、ウイルスまたはウイルスベクターによる、実施形態118に記載の方法。

0140

実施形態120.前記形質導入することは、レンチウイルスベクターによる、実施形態119に記載の方法。

0141

実施形態121.前記形質導入することは、アデノ随伴ウイルスによる、実施形態118に記載の方法。

0142

実施形態122.前記送達または形質導入することは、エレクトロポレーションによる、実施形態79から実施形態121のいずれか1つに記載の方法。

0143

実施形態123.欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体I(MHCI)またはそのサブユニットである、実施形態117から実施形態122のいずれか1つに記載の方法。

0144

実施形態124.前記サブユニットはβ2ミクログロブリンである、実施形態123に記載の方法。

0145

実施形態125.欠失/抑制される細胞表面タンパク質は、T細胞の消耗を防止するタンパク質である、実施形態117から実施形態122のいずれか1つに記載の方法。

0146

実施形態126.T細胞の消耗を防止する細胞表面タンパク質は、T細胞上の免疫チェックポイントである、実施形態125に記載の方法。

0147

実施形態127.T細胞の消耗を防止する前記表面タンパク質は、PD−1、LAG−3、Tim−3、及びCTLA−4、から選択される、実施形態126に記載の方法。

0148

実施形態128.前記ゲノム編集は、タンパク質発現ブロッカー(PEBL)を発現するように形質導入することを含む、実施形態117から実施形態122のいずれか1つに記載の方法。

0149

実施形態129.前記細胞は、編集後最長48時間静置されてから活性化される、実施形態79から実施形態128のいずれか1つに記載の方法。

0150

実施形態130.前記細胞は、編集後最長24時間静置されてから活性化される、実施形態79から実施形態128のいずれか1つに記載の方法。

0151

実施形態131.前記細胞は、編集後最長8時間静置されてから活性化される、実施形態79から実施形態128のいずれか1つに記載の方法。

0152

実施形態132.前記細胞は、編集後最長4時間静置されてから活性化される、実施形態79から実施形態128のいずれか1つに記載の方法。

0153

実施形態133.前記細胞は、編集後24〜48時間静置されてから活性化される、実施形態79から実施形態128のいずれか1つに記載の方法。

0154

実施形態134.前記細胞は、ゲノム編集の直後に活性化される、実施形態79から実施形態128のいずれか1つに記載の方法。

0155

実施形態135.前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗CD3抗体及び抗CD28抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団を曝露することによって行われる、実施形態79から実施形態134のいずれか1つに記載の方法。

0156

実施形態136.前記免疫エフェクター細胞の前記活性化は、抗CD3抗体、抗CD28抗体、及び抗CD2抗体、または上記のいずれかの機能性フラグメントに、前記細胞集団を曝露することによって行われる、実施形態79から実施形態134のいずれか1つに記載の方法。

0157

実施形態137.前記抗体はビーズに固定されている、実施形態107から実施形態136のいずれか1つに記載の方法。

0158

実施形態138.前記ゲノム編集細胞は、最長5日間にわたり活性化される、実施形態79から実施形態137のいずれか1つに記載の方法。

0159

実施形態139.前記ゲノム編集細胞は、最長2日間にわたり活性化される、実施形態79から実施形態137のいずれか1つに記載の方法。

0160

実施形態140.前記ゲノム編集細胞は、最長1日間にわたり活性化される、実施形態79から実施形態137のいずれか1つに記載の方法。

0161

実施形態141.前記抗CD3抗体、抗CD28抗体、及び/または抗CD2抗体は、磁場の印加または洗浄により、前記細胞集団から取り除かれる、実施形態79から実施形態137のいずれか1つに記載の方法。

0162

実施形態142.前記CARは、活性化後48時間未満において、前記細胞に形質導入される、実施形態79から実施形態141のいずれか1つに記載の方法。

0163

実施形態143.前記CARは、活性化後24時間未満において、前記細胞に形質導入される、実施形態79から実施形態141のいずれか1つに記載の方法。

0164

実施形態144.前記CARは、前記CARをコードするレンチウイルスベクターを用いて、前記細胞に形質導入される、実施形態79から実施形態143のいずれか1つに記載の方法。

0165

実施形態145.細胞の前記集団を、20日間未満にわたり増殖させる、実施形態79から実施形態144のいずれか1つに記載の方法。

0166

実施形態146.細胞の前記集団を、12日間未満にわたり増殖させる、実施形態79から実施形態144に記載の方法。

0167

実施形態147.細胞の前記集団を、10日間未満にわたり増殖させる、実施形態79から実施形態144に記載の方法。

0168

実施形態148.細胞の前記集団を、8日間未満にわたり増殖させる、実施形態79から実施形態144に記載の方法。

0169

実施形態149.細胞の前記集団を、6日間未満にわたり増殖させる、実施形態79から実施形態144に記載の方法。

0170

実施形態150.約25℃〜約40℃の温度で実施される、実施形態79から実施形態149のいずれか1つに記載の方法。

0171

実施形態151.約30℃〜約37℃の温度で実施される、実施形態79から実施形態149のいずれか1つに記載の方法。

0172

実施形態152.約37℃で実施される、実施形態79から実施形態149のいずれか1つに記載の方法。

0173

実施形態153.約30℃で実施される、実施形態79から実施形態149のいずれか1つに記載の方法。

0174

実施形態154.フローサイトメトリーを用いて前記細胞を解析して、前記CAR(または、複数を形質導入する場合、複数のCAR)の発現、及び/または、形質導入タンパク質の発現、及び/または、タンパク質の発現(または、その欠如、すなわち、欠失または抑制)、を確認する追加の工程を含む、実施形態79から実施形態153のいずれか1つに記載の方法。

0175

実施形態155.TCR+細胞を枯渇させる追加の工程を含む、実施形態79から実施形態154のいずれか1つに記載の方法。

0176

実施形態156.使用する前記免疫エフェクター細胞は、健康なドナー(または、臍帯血から、もしくはPBMCから)から採取される、実施形態79から実施形態155のいずれか1つに記載の方法。

0177

実施形態157.前記ドナーはヒトである、実施形態156に記載の方法。

0178

実施形態158.実施形態1から実施形態157のいずれか1つに記載の方法を用いて作製された、ゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団。

0179

実施形態159.前記キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞は、自殺遺伝子を更に含む、実施形態158に記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞。

0180

実施形態160.内在性T細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記細胞内において阻害される、実施形態158から実施形態159のいずれか1つに記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞。

0181

実施形態161.アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、実施形態160に記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞。

0182

実施形態162.前記細胞は同胞殺しを誘導しない、実施形態160または実施形態161に記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞。

0183

実施形態163.デュアルCAR保有ゲノム編集免疫エフェクター細胞またはタンデムCAR保有ゲノム編集免疫エフェクター細胞である、実施形態158から実施形態162のいずれか1つに記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞。

0184

実施形態164.実施形態158から実施形態162のいずれか1つに記載のゲノム編集キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞の集団、ならびに、少なくとも1種の治療的に許容される担体及び/またはアジュバント、を含む、治療用組成物

0185

実施形態165.がん、自己免疫疾患、または感染症の治療を必要とする対象において、前記がん、自己免疫疾患、または感染症の治療を行うための方法であって、実施形態1から実施形態157のいずれか1つに記載のゲノム編集免疫エフェクター細胞、ゲノム編集CAR−T細胞、またはゲノム編集タンデムCAR−T細胞の集団を、前記対象に投与することを含む、前記方法。

0186

実施形態166.がんの治療のための、実施形態165に記載の方法。

0187

実施形態167.前記がんは血液悪性腫瘍である、実施形態166に記載の方法。

0188

実施形態168.前記血液悪性腫瘍は、白血病リンパ腫多発性骨髄腫、から選択される、実施形態167に記載の方法。

0189

実施形態169.前記血液悪性腫瘍はホジキンリンパ腫である、実施形態167に記載の方法。

0190

実施形態170.前記血液悪性腫瘍はB細胞リンパ腫である、実施形態167に記載の方法。

0191

実施形態171.前記B細胞リンパ腫は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、慢性リンパ性白血病(CLL)/小リンパ球性リンパ腫(SLL)、及びB細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病(ALL)、から選択される、実施形態170に記載の方法。

0192

実施形態172.前記血液悪性腫瘍はT細胞リンパ腫である、実施形態167に記載の方法。

0193

実施形態173.前記T細胞リンパ腫は、T細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫(T−ALL)、末梢T細胞リンパ腫PTCL)、T細胞慢性リンパ性白血病(T−CLL)、及びセザリー症候群、から選択される、実施形態172に記載の方法。

0194

実施形態174.前記血液悪性腫瘍は白血病である、実施形態167に記載の方法。

0195

実施形態175.前記白血病は、急性骨髄性(または骨髄性)白血病(AML)、慢性骨髄性(または骨髄性)白血病(CML)、急性リンパ性(またはリンパ芽球性)白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、毛様細胞性白血病(時として、リンパ腫に分類される)、から選択される、実施形態174に記載の方法。

0196

実施形態176.前記血液悪性腫瘍は形質細胞性悪性腫瘍である、実施形態167に記載の方法。

0197

実施形態177.前記血液悪性腫瘍は、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫から選択される形質細胞性悪性腫瘍である、実施形態176に記載の方法。

0198

実施形態178.前記がんは固形腫瘍である、実施形態165に記載の方法。

0199

本明細書で開示するのは、T細胞集団における1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制すること、T細胞集団を活性化させて、T細胞集団に、1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、及び、CAR−T細胞の集団を増殖させること、の工程を含む、ゲノム編集CAR−T細胞の集団を作製するための方法である。

0200

特定の実施形態では、形質導入工程は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを利用する。

0201

特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性T細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する。

0202

特定の実施形態では、抗原は、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、TCRA、及びTCRβ、から選択される。

0203

特定の実施形態では、細胞表面タンパク質は、PD−1、LAG−3、Tim−3、及びCTLA−4に限定するわけではないがそれらから選択される、T細胞上の免疫チェックポイントである。

0204

特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも1種の抗原に特異的に結合する。

0205

自殺遺伝子を更に含むCAR−T細胞についてもまた開示する。

0206

内在性T細胞受容体介在性シグナル伝達が阻害されているCAR−T細胞についてもまた開示する。

0207

アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しないCAR−T細胞についてもまた開示する。

0208

特定の実施形態では、CAR−T細胞は同胞殺しを誘導しない。

0209

特定の実施形態では、本方法に記載のデュアルCAR−T細胞またはタンデムCAR−T細胞を開示する。

0210

特定の実施形態では、CAR−T細胞の集団、ならびに、少なくとも1種の治療的に許容される担体及び/またはアジュバントを含む、治療用組成物である。

0211

ゲノム編集CAR−T細胞、デュアルCAR−T細胞、タンデムCAR−T細胞の集団、または治療用組成物を、固形腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、対象における固形腫瘍を治療するための方法についてもまた開示する。

0212

ゲノム編集CAR−T細胞、デュアルCAR−T細胞、タンデムCAR−T細胞の集団、または治療用組成物を、血液悪性腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、対象における血液悪性腫瘍を治療するための方法についてもまた開示する。

0213

特定の実施形態では、血液悪性腫瘍はT細胞悪性腫瘍である。

0214

特定の実施形態では、T細胞悪性腫瘍はT細胞急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)である。

0215

特定の実施形態では、T細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である。

0216

特定の実施形態では、血液悪性腫瘍はB細胞悪性腫瘍である。

0217

特定の実施形態では、B細胞悪性腫瘍はB細胞リンパ腫である。

0218

特定の実施形態では、B細胞悪性腫瘍はB細胞性白血病である。

0219

特定の実施形態では、血液悪性腫瘍は骨髄性悪性腫瘍である。

0220

特定の実施形態では、骨髄性悪性腫瘍は急性骨髄性白血病である。

0221

T細胞集団における1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質の発現を欠失または抑制すること、T細胞集団を活性化させて、T細胞集団に、1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を認識するキメラ抗原受容体を形質導入すること、及び、CAR−T細胞の集団を増殖させること、の工程を含む、T細胞受容体(TCR)シグナル伝達を欠損したゲノム編集CAR−T細胞の集団を作製するための方法についてもまた開示する。

0222

ゲノム編集T細胞及びゲノム編集CAR−T細胞
本開示は、キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞(CAR−T細胞)など、キメラ抗原受容体保有免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物、及び、がん、例えば、血液悪性腫瘍の治療用の免疫療法を行うための方法を提供する。

0223

CAR−T細胞は、キメラ抗原受容体を発現するT細胞である。CAR分子を発現するT細胞は、ヘルパーT細胞細胞傷害性T細胞ウイルス特異的細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、またはガンマデルタ(γδ)T細胞、であってもよい。

0224

キメラ抗原受容体(CAR)は、1)細胞外リガンド結合ドメイン、すなわち、抗原認識ドメイン、2)膜貫通ドメイン、及び3)シグナル伝達ドメイン、を含む、組換え融合タンパク質である。

0225

細胞外リガンド結合ドメインは、リガンドに結合可能なオリゴペプチドまたはポリペプチドである。細胞外リガンド結合ドメインは、標的の抗原、受容体、ペプチドリガンドタンパク質リガンド、または標的のポリペプチドであってもよい、細胞表面分子相互作用可能であることが好ましい。細胞外リガンド結合ドメインは、約0.1pM〜約10pM、約0.1pM〜約1pM、または、より好ましくは、約0.1pM〜約100nMの親和性定数または相互作用(KD)の親和性で、抗原に特異的に結合することができる。親和性定数または相互作用(KD)の親和性を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。一部の例では、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上における細胞表面マーカーとして機能するリガンドを認識するように選択される。

0226

一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(2〜6))により連結された軽(VL)鎖可変フラグメント及び重(VH)鎖可変フラグメントを含む、一本鎖抗体フラグメント(scFv)を含み、T細胞抗原またはT細胞に特異的ではない抗原のいずれかに対する特異性を付与する。一実施形態では、CAR−T細胞のキメラ抗原受容体は、CAR−T細胞(例えば、ゲノム編集CAR−T細胞)が欠損している抗原である、悪性T細胞上に発現または過剰発現したT細胞特異的抗原に結合し得る。

0227

悪性T細胞上に発現した、CARが標的とする抗原の非限定例としては、CD5、CD7、CD2、CD4、及びCD3、が挙げられる。

0228

白血病細胞(例えば、異常な骨髄芽球赤血球、または血小板)の表面上に発現した、CARが標的とする抗原の非限定例としては、CD123(IL3RA)、CD371(CLL−1、CLEC12A)、CD117(c−kit)、及びCD135(FLT3)、CD7、ならびにTim3、が挙げられる。白血病、すなわち、急性骨髄性白血病(AML)を治療するために、これらの抗原を標的とする細胞外リガンド結合ドメインを有するCARを構築してもよい。

0229

多発性骨髄腫細胞(例えば、悪性形質細胞)の表面上に発現した、CARが標的とする抗原の非限定例としては、BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138、及びCD19、が挙げられる。多発性骨髄腫を治療するために、これらの抗原を標的とする細胞外リガンド結合ドメインを有するCARを構築してもよい。別の実施形態では、多発性骨髄腫を治療するために、B細胞成熟抗原(BCMA)ならびに膜貫通型活性化因子及びCAM相互作用因子(TACI)のリガンドを標的とし、BCMAとTACIの両方を効果的に共標的とする、APRILタンパク質の一部を有するCARを構築してもよい。シグナルペプチドは、分泌されたタンパク質または膜貫通タンパク質の、細胞膜及び/または細胞表面への輸送を誘導し、ポリペプチドの適切な局在化を可能とする。とりわけ、本開示のシグナルペプチドは、付加ポリペプチド、すなわち、CAR受容体を、細胞膜へと誘導するが、付加ポリペプチドの細胞外リガンド結合ドメインは細胞表面上に提示されており、付加ポリペプチドの膜貫通ドメインは細胞膜にまたがっており、付加ポリペプチドのシグナル伝達ドメインは細胞の細胞質部分内にある。一実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトCD8αに由来するシグナルペプチドである。一実施形態では、シグナルペプチドは、CD8αシグナルペプチドの機能性フラグメントである。機能性フラグメントは、付加ポリペプチドを細胞膜及び/または細胞表面へと誘導するCD8αシグナルペプチドの少なくとも10アミノ酸のフラグメントとして定義される。ヒトCD8αシグナルペプチドの機能性フラグメントの例としては、アミノ酸配列MALPVTALLLPLALLLHAA、MALPVTALLLP、PVTALLLPLALL、及びLLLPLALLLHAARP、が挙げられる。

0230

通常、細胞外リガンド結合ドメインは、膜貫通ドメイン(Tm)により、キメラ抗原受容体(CAR)のシグナル伝達ドメインに連結している。膜貫通ドメインは細胞膜を貫通し、CARをT細胞表面に固定し、細胞外リガンド結合ドメインをシグナル伝達ドメインに連結させて、T細胞表面上におけるCARの発現に影響を及ぼす。

0231

本開示における膜貫通ドメインの極めて特徴的な特性は、免疫細胞の表面に発現して、所定の標的細胞に対する免疫細胞応答を誘導する能力である。膜貫通ドメインは、天然または合成の供給源に由来していてもよい。代替的に、本開示の膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来していてもよい。

0232

本開示の膜貫通ポリペプチドの非限定例としては、T細胞受容体のサブユニット、例えば、CD3複合体を構成するα、β、γまたはζのポリペプチドなど、IL−2受容体p55(α鎖)、p75(β鎖またはγ鎖)、及び、Fc受容体のサブユニット鎖、とりわけ、FcγIIIタンパク質またはCDタンパク質、が挙げられる。代替的に、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、主に疎水性アミノ酸残基(例えば、ロイシン及びバリン)を含んでいてもよい。一実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8αから選択されるT細胞表面糖タンパク質CD8α鎖I型アイソフォーム前駆体(NP_001139345.1)、及びCD28に由来する。

0233

膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと上記膜貫通ドメインの間のヒンジ領域を更に含んでいてもよい。用語「ヒンジ領域」とは一般的に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドのことを意味する。とりわけ、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインに更なるフレキシビリティ及びアクセシビリティをもたらすために使用される。ヒンジ領域は、最大300アミノ酸、好ましくは、10〜100アミノ酸、最も好ましくは、25〜50アミノ酸、を含んでいてもよい。ヒンジ領域は、天然分子、例えば、CD28、4−1BB(CD137)、OX−40(CD134)、CD3ζ、T細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、ICOS、CD154などの全てもしくは一部、または、抗体定常領域の全てもしくは一部、に由来していてもよい。代替的に、ヒンジ領域は、天然ヒンジ配列に相当する合成配列であってもよく、または、ヒンジ領域は、完全な合成ヒンジ配列であってもよい。一実施形態では、ヒンジドメインは、ヒトCD8α、FcγRIIIα受容体、またはIgG1(本明細書ではそのように呼ぶ)の一部を含み、それらのポリペプチドに対して少なくとも80%、90%、95%、97%、または99%の配列同一性を有する。

0234

本開示のキメラ抗原受容体(CAR)は、細胞外リガンド結合ドメインが標的に結合した後に、細胞内シグナル伝達に影響を及ぼし、免疫細胞及び免疫応答の活性化をもたらす、CARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインを含む。言い換えると、シグナル伝達ドメインは、CARを発現する免疫細胞における少なくとも1種の正常エフェクター機能の活性化に影響を及ぼす。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパーT細胞活性であってもよい。それゆえ、用語「シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達して細胞に特殊機能を実行させる、タンパク質の部分のことを意味する。

0235

CARに用いるシグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体の結合後にシグナル伝達を開始するために協同で作用するT細胞受容体及び共受容体細胞質配列、ならびに、これら配列の任意の誘導体またはバリアント、及び同一の機能的性能を有する任意の合成配列であってもよい。シグナル伝達ドメインは、2種の異なる部類細胞質シグナル伝達配列を含み、一方の部類は抗原依存的な一次活性化を開始し、もう一方の部類は抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらす。一次細胞質シグナル伝達配列は、ITAMの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。ITAMは、syk/zap70クラスのチロシンキナーゼ用の結合部位として機能する様々な受容体の細胞質内尾部に存在する、明確なシグナル伝達モチーフである。本開示において使用可能なITAMの非限定例としては、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66d、に由来するITAMを挙げることができる。一部の実施形態では、CARのシグナル伝達ドメインは、それらITAMに対して少なくとも80%、90%、95%、97%、または99%の配列同一性のアミノ酸配列を有するCD3ζシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

0236

加えて、本開示のCAR−T細胞は、1種または複数種の自殺遺伝子療法システムを更に含んでいてもよい。当該技術分野において周知の好適な自殺遺伝子療法システムとしては、いくつかの単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVtk)/ガンシクロビルGCV)、または誘導性カスパーゼ9タンパク質、が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、自殺遺伝子はキメラCD34/チミジンキナーゼである。

0237

同胞殺し抵抗性。本明細書で開示するT細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損していることにより、同胞殺し抵抗性であってもよい。一部の実施形態では、T細胞の抗原は、キメラ抗原受容体が修飾抗原にもはや特異的に結合しないように、修飾されている。例えば、キメラ抗原受容体が認識する抗原のエピトープは、1つもしくは複数のアミノ酸変異(例えば、置換または欠失)によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい。その他の実施形態では、抗原の発現は、T細胞において、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上低下する。タンパク質の発現を低下させるための方法は当技術分野において周知であり、タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結するプロモーターを修飾または置換することが挙げられるがこれらに限定されない。更にその他の実施形態では、T細胞は、例えば、抗原をコードする遺伝子を欠失または破壊することにより、抗原が発現しないように修飾される。上記の実施形態のそれぞれでは、T細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する1種または好ましくは全ての抗原を欠損していてもよい。抗原を欠損させるT細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については上に記載している。例示的な実施形態では、CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いて、抗原、例えば、以下に記載する抗原を欠損させるT細胞を修飾してもよい。代替的に、TALENを用いて遺伝子を編集してもよい。

0238

特定の状況では、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原の欠損で、T細胞を選択してもよい。ある特定のT細胞は、より少ない任意の表面タンパク質を産生及び提示するが、その代わりに、T−CARの標的となる抗原を欠失または非機能化する場合には、T細胞を、抗原の欠損で選択して、抗原欠損細胞の集団をCARの形質導入用に増殖させてもよい。このような細胞はまた、同胞殺し抵抗性であり得る。

0239

アロ反応性の回避。本開示が包含するCAR−T及びその他のCAR保有免疫エフェクター細胞は、T細胞受容体(TCR)−CD3複合体の一部を欠失させた結果として、内在性T細胞受容体(TCR)シグナル伝達を更に欠損していてもよい。様々な実施形態では、本明細書で開示するCAR保有免疫エフェクター細胞を用いて、内在性TCRシグナル伝達を除去または抑制することが望ましい場合がある。例えば、同種異系T細胞を用いてCAR−T細胞を作製する場合に、CAR−T細胞における内在性TCRシグナル伝達を抑制または除去することにより、移植片対宿主病(GvHD)を予防または抑制してもよい。内在性TCRシグナル伝達を除去または抑制するための方法は当該技術分野において周知であり、TCR−CD3受容体複合体の一部、例えば、TCR受容体α鎖(TRAC)、TCR受容体β鎖(TRBC)、CD3ε、CD3γ、CD3δ、及び/またはCD3ζ、を欠失させること、が挙げられるがこれらに限定されない。TCR受容体複合体の一部を欠失させることにより、TCR介在性シグナル伝達を阻害することができ、それにより、生命脅かすGvHDを誘導することなく、CAR−T細胞の供給源として同種異系T細胞を安全に使用することを可能としてもよい。

0240

CAR抗原。本明細書で開示するT細胞を用いてゲノム編集される好適な抗原、及び本明細書で開示するCAR−T細胞におけるCARが認識する好適な抗原としては、血液悪性腫瘍に特異的な抗原が挙げられる。これら好適な抗原としては、T細胞特異的抗原、及び/またはT細胞に特異的ではない抗原を挙げることができる。抗原は、CAR−T細胞のキメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原であってもよく、T−CAR細胞が欠損している抗原は、悪性T細胞上に発現した抗原、好ましくは、非悪性T細胞と比較して悪性T細胞上に過剰発現した抗原(すなわち、T細胞悪性腫瘍に由来するT細胞)である。このような抗原の例としては、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、TRAC、及びTCRβ、が挙げられる。

0241

T細胞悪性腫瘍は、T細胞前駆細胞、成熟T細胞、またはナチュラルキラー細胞、に由来する悪性腫瘍を含む。T細胞悪性腫瘍の例としては、T細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫(T−ALL)、T細胞大顆粒リンパ球(LGL)性白血病、ヒトT細胞白血病ウイルス1型陽性HTLV−1+)成人T細胞性白血病/リンパ腫(ATL)、T細胞前リンパ球性白血病(T−PLL)、ならびに、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)、ALK陽性未分化大細胞リンパ腫、及びALK陰性未分化大細胞リンパ腫を含むがこれらに限定されない、様々な末梢性T細胞リンパ腫(PTCL)、が挙げられる。

0242

好適なCAR抗原としてはまた、多発性骨髄腫細胞、すなわち、悪性形質細胞の表面上に認められる抗原、例えば、BCMA、CS1、CD38、及びCD19などを挙げることができる。代替的に、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B−ALL)、及び骨髄性白血病を治療するための、BCMAとTACIの両方を効果的に共標的とする、BCMA及びTACIに対するリガンドである、APRILタンパク質の細胞外部分を発現するように、CARを設計してもよい。

0243

本明細書で開示するT細胞を用いてゲノム編集される好適な抗原、及び本明細書で開示するCAR−T細胞におけるCARが認識する好適な抗原の別の例については、以下の表2〜4に記載する。これらの抗原としては、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、TRAC、TCRβ、CS1、CD38、が挙げられる。

0244

自殺遺伝子。代替的にまたは加えて、ゲノム編集T細胞は、1種または複数種の自殺遺伝子を更に含んでいてもよい。本明細書で使用する場合、「自殺遺伝子」とは、活性化した場合にCAR−T細胞の死をもたらす、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いてCAR−T細胞に導入された核酸配列のことを意味する。自殺遺伝子により、必要に応じ、in vivoにおけるT細胞の効果的な追跡及び除去を促進してもよい。自殺遺伝子を活性化させることにより促進された殺傷は、当該技術分野において周知の方法を用いて生じさせてもよい。当該技術分野において周知の好適な自殺遺伝子療法システムとしては、様々な単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVtk)/ガンシクロビル(GCV)自殺遺伝子療法システム、または誘導性カスパーゼ9タンパク質、が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な実施形態では、自殺遺伝子は、CD34/チミジンキナーゼキメラ自殺遺伝子である。

0245

CAR及びCAR−Tを構築するための方法
「キメラ抗原受容体(CAR)」とは、本明細書で使用する場合、及び当該技術分野において一般的に使用する場合、抗原が細胞外ドメインに結合すると、細胞に特殊機能を実行させる細胞内ドメイン(シグナル伝達ドメイン)に結合した、抗原特異的細胞外ドメイン(抗原認識ドメイン)を有する組換え融合タンパク質のことを意味する。キメラ抗原受容体は、MHC非依存性抗原に結合するその能力と、その細胞内ドメインを介して活性化シグナルを変換するその能力の両方により、その他の抗原結合因子とは区別される。

0246

臨床グレードのCAR−T細胞集団のCAR設計、送達及び発現、ならびに製造を行うための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Lee et al.,Clin.Cancer Res.,2012,18(10):2780−90を参照されたい。CARをコードする遺伝子改変キメラ抗原受容体ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、少なくとも1種の共刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、を含む。

0247

キメラ抗原受容体の抗原特異的細胞外ドメインは、抗原(一般的には、悪性腫瘍の表面に発現した抗原)を認識してそれに特異的に結合する。「抗原特異的細胞外ドメイン」(すなわち、「抗原結合ドメイン」)は抗原に特異的に結合するが、その際、例えば、約0.1pM〜約10μM、好ましくは約0.1pM〜約1μM、より好ましくは約0.1pM〜約100nMの親和性定数または相互作用(KD)の親和性で抗原に結合する。相互作用の親和性を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。本開示のCARに用いるのに好適な抗原特異的細胞外ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであってもよく、多種多様なそれらは、当技術分野において周知である。一部の例においては、抗原結合ドメインは一本鎖Fv(scFv)である。その他の抗体ベース認識ドメイン、cAb VHH(ラクダ科抗体可変ドメイン)及びそれらのヒト化型IgNAR VH(サメ抗体可変ドメイン)及びそれらのヒト化型、sdAb VH(単一ドメイン抗体可変ドメイン)、ならびに、「ラクダ化」抗体可変ドメイン、が使用に好適である。一部の例においては、T細胞受容体(TCR)ベース認識ドメイン、例えば、一本鎖TCR(scTv、VαVβを含む一本鎖2ドメインTCR)などもまた、使用に好適である。

0248

本開示のキメラ抗原受容体はまた、抗原特異的細胞外ドメインに抗原が結合すると、T細胞に細胞内シグナルをもたらす、「細胞内ドメイン」を含む。本開示のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体を発現するT細胞における少なくとも1種のエフェクター機能の活性化に影響を及ぼす。用語「エフェクター機能」とは、T細胞などの分化細胞における特殊機能のことを意味する。例えば、T細胞のエフェクター機能は、NKのトランス活性化、T細胞の活性化及び分化、B細胞の活性化、樹状細胞の活性化及びクロスプレゼンテーション活性、ならびにマクロファージの活性化、であってもよい。それゆえ、用語「細胞内ドメイン」とは、抗原が細胞外ドメインに結合すると、エフェクター機能シグナルを伝達してT細胞に特殊機能を実行させる、CARの部分のことを意味する。好適な細胞内ドメインの非限定例としては、T細胞受容体のζ鎖またはそのホモログ(例えば、η、δ、γ、またはε)のいずれか、MB1鎖、829、Fe Rill、Fe Rl、及びCD3ζとCD28などのシグナル伝達分子の組み合わせ、CD27、4−1 BB、DAP−10、OX40及びこれらの組み合わせ、ならびにその他の類似した分子及びフラグメント、が挙げられる。活性化タンパク質ファミリーのその他のメンバーの細胞内シグナル伝達部位、例えば、FcγRIII及びFcεRIなどを使用してもよい。通常は、完全な細胞内ドメインを採用するが、多くのケースでは、完全な細胞内ポリペプチドの使用は必須ではない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケート部分が有用となり得る範囲において、エフェクター機能シグナルをなおも伝達する限りにおいて、このようなトランケート部分をインタクト鎖の代わりに使用してもよい。それゆえ、用語「細胞内ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内ドメインの任意のトランケート部分を含むことを意味する。

0249

通常、抗原特異的細胞外ドメインは、「膜貫通ドメイン」により、キメラ抗原受容体の細胞内ドメインに連結している。膜貫通ドメインは細胞膜を貫通し、CARをT細胞表面に固定し、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結させることにより、T細胞表面上におけるCARの発現に影響を及ぼす。キメラ抗原受容体はまた、1種もしくは複数種の共刺激ドメイン及び/または1種もしくは複数種のスペーサーを更に含んでいてもよい。「共刺激ドメイン」は、in vivoにおけるサイトカインの産生、増殖、細胞傷害性、及び/または持続性を向上させる共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインから誘導される。「スペーサー」は、(i)抗原特異的細胞外ドメインを膜貫通ドメインに連結させる、(ii)膜貫通ドメインを共刺激ドメインに連結させる、(iii)共刺激ドメインを細胞内ドメインに連結させる、及び/または(iv)膜貫通ドメインを細胞内ドメインに連結させる。例えば、抗原特異的細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサードメインを設けて、抗原結合ドメインの柔軟性に影響を及ぼすことにより、CAR機能に影響を及ぼしてもよい。好適な膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びスペーサーは、当該技術分野において周知である。

0250

モノCAR−T細胞
特定の実施形態では、本開示は、抗原または細胞表面タンパク質に特異的に結合する単一のCARを含む遺伝子改変T細胞を提供し、T細胞は、その抗原または細胞表面タンパク質を任意選択的に欠損している(例えば、CD7CARTΔCD7細胞)。非限定的な例では、抗原または細胞表面タンパク質の欠損は、(a)キメラ抗原受容体が、修飾された抗原もしくは細胞表面タンパク質にもはや特異的に結合しないように、T細胞が発現する抗原もしくは細胞表面タンパク質を修飾すること(例えば、キメラ抗原受容体が認識する1種もしくは複数種の抗原のエピトープは、1つもしくは複数のアミノ酸変異(例えば、置換または欠失)によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい)、(b)抗原もしくは細胞表面タンパク質の発現が、T細胞において、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくはそれ以上低下するように、T細胞を修飾すること、または(c)抗原もしくは細胞表面タンパク質が発現しないように、T細胞を修飾すること(例えば、抗原または細胞表面タンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊により)、によるものである。上記の実施形態のそれぞれでは、CAR−T細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する1種または好ましくは全ての抗原または細胞表面タンパク質を欠損していてもよい。1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を欠損させるT細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については本明細書に記載している。以下に記載する実施形態では、CRISPR−Cas9システムを用いて、1種または複数種の抗原を欠損させるT細胞を修飾する。これら実施形態のうちのいずれかは、本明細書で開示する方法を用いて実施してもよい。更なる実施形態では、T細胞は自殺遺伝子を含む。

0251

例えば、商業的に合成された抗CD7一本鎖可変フラグメント(scFv)を、CD28及び/または4−1BB内部シグナル伝達ドメインを有する第3世代のCAR骨格クローニングすることにより、CD7特異的CAR−T細胞用のCARを作製してもよい。P2Aペプチドの後に細胞外hCD34ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗hCD34磁性ビーズを用いた精製の後における、CARによる両方の検出を可能としてもよい。その他の悪性T細胞抗原に特異的なCARを作製するために、同様の方法を続けてもよい。

0252

本開示が包含するCAR−T細胞は、T細胞受容体(TCR)−CD3複合体の一部を欠失させた結果として、内在性T細胞受容体(TCR)シグナル伝達を更に欠損していてもよい。様々な実施形態では、本明細書で開示するCAR−T細胞を用いて、内在性TCRシグナル伝達を除去または抑制することが望ましい場合がある。例えば、同種異系T細胞を用いてCAR−T細胞を作製する場合に、CAR−T細胞における内在性TCRシグナル伝達を抑制または除去することにより、移植片対宿主病(GvHD)を予防または抑制してもよい。内在性TCRシグナル伝達を除去または抑制するための方法は当該技術分野において周知であり、TCR−CD3受容体複合体の一部、例えば、TCR受容体α鎖(TRAC)、TCR受容体β鎖(TCRβ)もしくはそのサブタイプ、TCRδ、TCRγ、CD3ε、CD3γ、及び/またはCD3δ、を欠失させること、が挙げられるがこれらに限定されない。TCR受容体複合体の一部を欠失させることにより、TCR介在性シグナル伝達を阻害することができ、それにより、生命を脅かすGvHDを誘導することなく、CAR−T細胞の供給源として同種異系T細胞を安全に使用することを可能としてもよい。

0253

加えて、本開示が包含するCAR−T細胞は、本明細書に記載の1種または複数種の自殺遺伝子を更に含んでいてもよい。

0254

類似の方法を用いて、その他のモノCAR−T細胞を構築してもよく、それらについては以下の表1に記載する。

0255

細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、またはガンマデルタ(γδ)T細胞に由来する、ゲノム編集されたCAR−T細胞の表面上に発現させることのできるCARアミノ酸配列の実施形態について以下の表2に開示する。

0256

タンデムCAR−T細胞
タンデムCAR−T細胞(tCAR−T)は、2つの異なる細胞表面分子(例えば、抗原/タンパク質)と相互作用可能な2つの異なる細胞外リガンド結合(抗原/タンパク質認識)ドメインを含む単一キメラ抗原ポリペプチドを有するT細胞であり、細胞外リガンド結合ドメインは、1つまたは複数のフレキシブルリンカーによって互いに連結し、1種または複数種の共刺激ドメインを共有しており、第1または第2の細胞外リガンド結合ドメインの結合により、1種または複数種の共刺激ドメイン(複数可)、及びシグナル伝達ドメインにわたり、シグナルが伝達される。

0257

特定の実施形態では、T細胞は、1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質(例えば、CD7*CD2−tCARΔCD7ΔCD2細胞用のCD7及びCD2、または、CD3*CD2−tCARΔCD3ΔCD2細胞用のCD2)を欠損している。非限定的な例では、抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)の欠損は、(a)キメラ抗原受容体が、修飾された抗原(複数可)もしくは細胞表面タンパク質(複数可)にもはや特異的に結合しないように、T細胞が発現する抗原もしくは細胞表面タンパク質を修飾すること(例えば、キメラ抗原受容体が認識する1種もしくは複数種の抗原のエピトープは、1つもしくは複数のアミノ酸変異(例えば、置換または欠失)によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい)、(b)抗原(複数可)もしくは細胞表面タンパク質(複数可)の発現が、T細胞において、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくはそれ以上低下するように、T細胞を修飾すること、または(c)抗原(複数可)もしくは細胞表面タンパク質(複数可)が発現しないように、T細胞を修飾すること(例えば、抗原または細胞表面タンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊により)、によるものである。上記の実施形態のそれぞれでは、CAR−T細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する1種または好ましくは全ての抗原または細胞表面タンパク質を欠損していてもよい。1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を欠損させるT細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については本明細書に記載している。以下に記載する実施形態では、CRISPR−Cas9システムを用いて、1種または複数種の抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)を欠損させるT細胞を修飾する。これら実施形態のうちのいずれかは、本明細書で開示する方法を用いて実施してもよい。更なる実施形態では、T細胞は自殺遺伝子を含む。

0258

ペプチドリンカーによって分離された、商業的に合成された抗CD2一本鎖可変フラグメント(scFv)及び抗CD3一本鎖可変フラグメント(scFv)を、例えば、CD28及び/または4−1BB内部シグナル伝達ドメインを有する第2または第3世代のCAR骨格を含有するレンチウイルスベクターにクローニングすることにより、ゲノム編集タンデムCAR−T細胞用のtCAR、すなわち、CD2*CD3−tCARTΔCD2ΔCD3εを作製してもよい。P2Aペプチドの後に細胞外hCD34ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗hCD34磁性ビーズを用いた精製の後における、CARによる両方の検出を可能としてもよく、代替的に、その他のマーカーも利用可能であり、バイシストロン性構築物を作製するためのその他の方法も利用可能である。その他の悪性T細胞抗原に特異的なtCARを作製するために、同様の方法を続けてもよい。

0259

タンデムCARは、異なるリンカー構造を有していてもよく、すなわち、直鎖状またはヘアピンであってもよく、ヘアピンリンカーは、(Cys=Cys)二本鎖結合(DSB)を任意選択的に含んでいてもよい。

0260

直鎖状タンデムCAR−T細胞は、第1のシグナルペプチド、第1の細胞外リガンド結合ドメイン、第2の細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、1種または複数種の共刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、を含む、キメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドを含み、第1の細胞外リガンド結合抗原認識ドメイン及び第2の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、異なる細胞表面分子、すなわち、がん細胞、例えば、悪性T細胞、悪性B細胞、または悪性形質細胞上の抗原に対する親和性を有し、直鎖状タンデムCAR−T細胞は、直鎖状タンデムCAR−T細胞における細胞表面分子の発現低下をもたらす、1つまたは複数の遺伝子修飾、欠失、または破壊を有する。

0261

別の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトCD8αに由来するシグナルペプチドである。

0262

第3の実施形態では、第1の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS)により連結されたVH1及びVL1と呼ばれる重(VH)鎖可変フラグメント及び軽(VL)鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント(scFv)を含む。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、2、3、4、5、または6回繰り返されている。一部の実施形態では、第1の抗原認識ドメインは、1)VH1−(GGGGS)3〜4−VL1、または2)VL1−(GGGGS)3〜4−VH1から選択することができる。

0263

一部の実施形態では、第2の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS)により連結されたVH2及びVL2と呼ばれる重(VH)鎖可変フラグメント及び軽(VL)鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント(scFv)を含む。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、2、3、4、5、または6回繰り返されている。一部の実施形態では、第1の抗原認識ドメインは、1)VH2−(GGGGS)3〜4−VL2、または2)VL2−(GGGGS)3〜4−VH2から選択することができる。

0264

更なる実施形態では、第1の抗原認識ドメイン及び第2の抗原認識ドメインは、5アミノ酸(GGGGS)の短いリンカーペプチドにより連結されている。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、2、3、4、5、または6回繰り返されている。

0265

タンデムCAR構築物
一実施形態では、第1の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS)により連結されたVH1及びVL1と呼ばれる重(VH)鎖可変フラグメント及び軽(VL)鎖可変フラグメント、を含み、細胞表面分子、すなわち、悪性T細胞上に発現した抗原を標的とする、一本鎖抗体フラグメント(scFv)を含む。

0266

特定の実施形態では、VH1及びVL1と呼ばれる重(VH)鎖可変フラグメント及び軽(VL)鎖可変フラグメントは、BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim−3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56、及びCD1a、から選択される、悪性T細胞上に発現した抗原を標的とする。

0267

特定の実施形態では、第2の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS)により連結されたVH2及びVL2と呼ばれる重(VH)鎖可変フラグメント及び軽(VL)鎖可変フラグメント、を含み、細胞表面分子、すなわち、悪性細胞上に発現した抗原を標的とする、一本鎖抗体フラグメント(scFv)を含む。

0268

特定の実施形態では、VH2及びVL2と呼ばれる重(VH)鎖可変フラグメント及び軽(VL)鎖可変フラグメントは、BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim−3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56、及びCD1a、から選択される、悪性細胞上に発現した抗原を標的とし、CAR分子の第1の細胞外リガンド結合ドメインの可変重(VH1)鎖配列及び可変軽(VL1)鎖配列とは異なる。

0269

タンデムCARの別の例については、以下の表3に記載する。

0270

例えば、表4では、上の表3に記載の抗原対のいずれかを標的とする、scFvのVHドメイン及びVLドメインを組み込まれていてもよい直鎖状タンデムCAR構築物を提供する。

0271

以下の表5では、上の表3に記載の抗原対のいずれかを標的とする、scFvのVHドメイン及びVLドメインを組み込まれていてもよいヘアピンタンデムCAR構築物も提供する。

0272

以下の表6では、CD2 scFv及びCD3 scFvのVHドメイン及びVLドメインを組み込んだヘアピンタンデムCAR構築物も提供する。

0273

以下の表7では、上の表3に記載の抗原対のいずれかを標的とする、scFvのVHドメイン及びVLドメインを組み込まれていてもよいヘアピンタンデムCAR構築物も提供する。

0274

デュアルCAR−T細胞
特定の実施形態では、本開示は、同一エフェクター細胞内に発現した異なる抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)に対する親和性を有する、2つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを有する遺伝子改変T細胞を提供し、それぞれのCAR機能は独立している。CARは、異なる抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)に特異的に結合する単一または複数のポリヌクレオチド配列から発現してもよく、T細胞は、CARが結合する抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)を欠損している(例えば、CD7*CD2−dCARΔCD7ΔCD2細胞)。非限定的な例では、抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)の欠損は、(a)キメラ抗原受容体が、修飾された抗原(複数可)もしくは細胞表面タンパク質(複数可)にもはや特異的に結合しないように、T細胞が発現する抗原もしくは細胞表面タンパク質を修飾すること(例えば、キメラ抗原受容体が認識する1種もしくは複数種の抗原のエピトープは、1つもしくは複数のアミノ酸変異(例えば、置換または欠失)によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい)、(b)抗原(複数可)もしくは細胞表面タンパク質(複数可)の発現が、T細胞において、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくはそれ以上低下するように、T細胞を修飾すること、または(c)抗原(複数可)もしくは細胞表面タンパク質(複数可)が発現しないように、T細胞を修飾すること(例えば、抗原または細胞表面タンパク質をコードする遺伝子の欠失または破壊により)、によるものである。上記の実施形態のそれぞれでは、CAR−T細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する1種または好ましくは全ての抗原または細胞表面タンパク質を欠損していてもよい。1種または複数種の抗原または細胞表面タンパク質を欠損させるT細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については本明細書に記載している。以下に記載する実施形態では、CRISPR−Cas9システムを用いて、1種または複数種の抗原(複数可)または細胞表面タンパク質(複数可)を欠損させるT細胞を修飾する。これら実施形態のうちのいずれかは、本明細書で開示する方法を用いて実施してもよい。更なる実施形態では、T細胞は自殺遺伝子を含む。

0275

商業的に合成された抗CD2一本鎖可変フラグメントを、例えば、CD28及び/または4−1BB内部シグナル伝達ドメインを有する第2または第3世代のCAR骨格を含有するレンチウイルスベクターにクローニングしてから、商業的に合成された抗CD3ε一本鎖可変フラグメントを、CD28及び/または4−1BB内部シグナル伝達ドメインを有する別の第2または第3世代のCAR骨格を含有する同一レンチウイルスベクターにクローニングして、2種のCAR構築物が同一ベクターから発現するプラスミドを生じさせることにより、ゲノム編集デュアルCAR−T細胞用のdCAR、すなわち、CD2*CD3ε−dCARTΔCD2ΔCD3εを作製してもよい。P2Aペプチドの後に細胞外hCD34ドメインを加えて、ウイルス形質導入及び抗hCD34磁性ビーズを用いた精製の後における、CARによる両方の検出を可能としてもよい。その他の悪性T細胞抗原に特異的なtCARを作製するために、同様の方法を続けてもよい。

0276

類似の方法を用いて、その他のデュアルCARを構築してもよく、それらについては以下の表3〜4に記載する。

0277

一実施形態では、デュアルCAR−T細胞は、(i)第1のシグナルペプチド、第1の抗原認識ドメイン、第1のヒンジ領域、第1の膜貫通ドメイン、第1の共刺激ドメイン、及び第1のシグナル伝達ドメイン、を含む、第1のキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチド、ならびに、(ii)第2のシグナル伝達ペプチド、第2の抗原認識ドメイン、第2のヒンジ領域、第2の膜貫通ドメイン、第2の共刺激ドメイン、及び第2のシグナル伝達ドメイン、を含む、第2のキメラ抗原受容体ポリペプチド、を含み、第1の抗原認識ドメイン及び第2の抗原認識ドメインは、異なる標的抗原に対する親和性を有し、デュアルCAR−T細胞は、デュアルCAR−T細胞における標的抗原の発現低下をもたらす、1つまたは複数の遺伝子破壊を有する。

0278

第2の実施形態では、第1のシグナルペプチドはCD8aシグナル配列である。

0279

第3の実施形態では、第1の抗原認識ドメインは、5アミノ酸(GGGGS)の短いリンカーペプチドにより連結された、第1の抗原認識ドメイン用の、VH1及びVL1と呼ばれる免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、3または4回繰り返されている。一部の実施形態では、第1の抗原認識ドメインは、VH1−(GGGGS)3〜4−VL1、またはVL1−(GGGGS)3〜4−VH1から選択することができる。

0280

一部の実施形態では、第1のヒンジ領域はCD8aを含む。

0281

一部の実施形態では、第1の膜貫通ドメインはCD8またはCD28である。

0282

一部の実施形態では、第1の共刺激ドメインは、4−1BB、CD28、またはいずれかの順番の両方の組み合わせ、すなわち、4−1BB−CD28、もしくはCD28−4−1BBを含む。

0283

一部の実施形態では、第1のシグナル伝達ドメインは、CD3ζ、またはCD3ζバイペプチド、すなわち、CD3ζ−CD3ζである。

0284

一部の実施形態では、第2のシグナルペプチドは、配列番号:1のCD8aシグナル配列である。

0285

一部の実施形態では、第2の抗原認識ドメインは、5アミノ酸(GGGGS)の短いリンカーペプチドにより連結された、第2の抗原認識ドメイン用の、VH2及びVL2と呼ばれる免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、3または4回繰り返されている。一部の実施形態では、第2の抗原認識ドメインは、VH2−(GGGGS)3〜4−VL2、またはVL2−(GGGGS)3〜4−VH2から選択することができる。

0286

一部の実施形態では、第2のヒンジ領域はCD8aを含む。

0287

一部の実施形態では、第2の膜貫通ドメインはCD8またはCD28である。

0288

一部の実施形態では、第2の共刺激ドメインは、4−1BB、CD28、またはいずれかの順番の両方の組み合わせ、すなわち、4−1BB−CD28、もしくはCD28−4−1BBを含む。

0289

一部の実施形態では、第2のシグナル伝達ドメインは、CD3ζ、またはCD3ζバイペプチド、すなわち、CD3ζ−CD3ζである。

0290

一部の実施形態では、CARポリペプチドは、VH1−(GGGGS)3〜4−VL1の第1の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びVH2−(GGGGS)3〜4−VL2の第2の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。

0291

一部の実施形態では、CARポリペプチドは、VL1−(GGGGS)3〜4−VH1の第1の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びVL2−(GGGGS)3〜4−VH2の第2の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。

0292

一部の実施形態では、CARポリペプチドは、VH2−(GGGGS)3〜4−VL2の第1の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びVH1−(GGGGS)3〜4−VL1の第2の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。

0293

一部の実施形態では、CARポリペプチドは、VL2−(GGGGS)3〜4−VH2の第1の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びVL1−(GGGGS)3〜4−VH1の第2の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。

0294

一部の実施形態では、CARポリペプチドは、VH1−(GGGGS)3〜4−VL1の第1の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びVL2−(GGGGS)3〜4−VH2の第2の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。

0295

一部の実施形態では、CARポリペプチドは、VL1−(GGGGS)3〜4−VH1の第1の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びVH2−(GGGGS)3〜4−VL2の第2の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。

0296

一部の実施形態では、CARポリペプチドは、VH2−(GGGGS)3〜4−VL2の第1の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びVL1−(GGGGS)3〜4−VH1の第2の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。

0297

一部の実施形態では、CARポリペプチドは、VL2−(GGGGS)3〜4−VH2の第1の抗原認識ドメイン融合タンパク質、及びVH1−(GGGGS)3〜4−VL1の第2の抗原認識ドメイン融合タンパク質、を含む。

0298

一部の実施形態では、CARポリペプチドは、少なくとも1つの高効率開裂部位を含み、その高効率開裂部位は、P2A、T2A、E2A、及びF2Aから選択される。

0299

一部の実施形態では、CARポリペプチドは自殺遺伝子を含む。

0300

一部の実施形態では、CARポリペプチドはサイトカインを含む。

0301

一部の実施形態では、CARポリペプチドは変異サイトカインを含む。

0302

一部の実施形態では、CARポリペプチドはサイトカイン受容体を含む。

0303

一部の実施形態では、CARポリペプチドは変異サイトカイン受容体を含む。

0304

一部の実施形態では、デュアルCAR−T細胞は、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD33、CD123(IL3RA)、CD371(CLL−1、CLEC12A)、CD117(c−kit)、CD135(FLT3)、BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138、及びCD19、APRIL、ならびにTACI、から選択される2種の抗原を標的とする。

0305

デュアルCARの別の例については、以下の表8に記載する。

0306

更なる態様では、CAR−T細胞対照を作製してもよい。例えば、対照CAR−T細胞は、悪性T細胞上に発現していない抗原に結合する細胞外ドメインを含んでいてもよい。例えば、治療用CAR−T細胞が、CD7などのT細胞抗原、または、CD2及びCD3などの複数のT細胞抗原を標的とする場合、対照CAR−T細胞が結合する抗原は、CD19であってもよい。CD19はT細胞上ではなくB細胞上に発現する抗原であることから、CD19に結合するように適合させた細胞外ドメインを有するCAR−T細胞は、T細胞に結合しない。これらのCAR−T細胞を対照として用いて、目的のがんを標的とする及び/または目的の抗原を認識するCAR−T細胞の、結合効率及び非特異的結合を解析してもよい。

0307

業者に周知の変化形態を任意選択的に採用して、WO2018027036A1に開示されるように、CARを更に設計してもよい。WO2018027036A1に開示されるように、加えて、当該技術分野において周知の方法を用いて、また市販の供給元から、レンチウイルスベクター及び細胞株を得てもよく、ガイドRNAを設計、検証及び合成してもよい。

0308

レトロウイルスを用いて遺伝子改変CARをT細胞内に導入してもよく、それにより、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を標的細胞ゲノム内に効率的かつ安定的に組み込むことが可能となる。当該技術分野において周知のその他の方法としては、レンチウイルス形質導入、トランスポゾンベースのシステム、直接的なRNAトランスフェクション、及びCRISPR/Casシステム(例えば、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(すなわちCasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(すなわちCasA)、Cse2(すなわちCasB)、Cse3(すなわちCasE)、Cse4(すなわちCasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、及びCu1966などの好適なCasタンパク質を用いたI型、II型、またはIII型のシステム)、が挙げられるがこれらに限定されない。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)もまた使用してもよい。例えば、Shearer RF and Saunders DN,“Experimental design for stable genetic manipulation in mammalian cell lines: lentivirus and alternatives,”Genes Cells 2015 Jan;20(1):1−10を参照されたい。

0309

PI3Kシグナル伝達の操作を使用して、構成的なCARの自己シグナル伝達による変異CAR−T細胞の分化を防止してもよく、長命メモリーT細胞の発現を促進させてもよい。CAR−Tの製造中及びex vivo増殖中にPI3Kを薬理学的に阻害することにより、優先的なエフェクターT細胞の発現を阻害して、CAR−Tのエフェクター/メモリー比率を、空のベクターを形質導入したT細胞に認められる比率にまで回復させることができ、それにより、in vivoにおけるT細胞の持続性及び治療活性を向上させることができる。p110δ PI3Kを阻害することにより腫瘍特異的治療用CD8T細胞の有効性及び記憶を向上させることができる一方で、p110α PI3Kを阻害することによりサイトカイン産生及び抗腫瘍効果を向上させることができる。

0310

T細胞の表面上にCARが存在することにより、リガンドがない場合であってもT細胞の活性化及び分化に変化が生じ得ることから、このPI3Kの阻害が提案されている。scFvフレームワークとシグナル伝達ドメインの両方に関連する、CARによる構成的な自己シグナル伝達により、分化の変異及び生存率の低下を含む、異所性のT細胞挙動がもたらされ得る。この異所性のT細胞挙動は、患者におけるCAR−T細胞の有効性がそれらCAR−T細胞のin vivo寿命直接関係している場合に重要である。CD28共刺激ドメインが存在すると、持続的なCARの自己シグナル伝達が引き起こすCAR−T細胞の消耗が増加し、4−1BB共刺激ドメインの効果はより少ない。更に、CD3−zetaは、PI3K、AKT、mTOR及び解糖経路構成的活性化を有意に向上させ、セントラル/ステムメモリー細胞よりも短命エフェクター細胞の形成を促進させる。例えば、Zhang W.et al.,“Modulation of PI3K signaling to improve CAR T cell function,”Oncotarget,2018 Nov 9;9(88):35807−35808を参照されたい。

0311

サイトカイン/ケモカイン/転写因子の遺伝子の欠失または抑制
TCRならびに細胞表面タンパク質及び抗原を遺伝子編集することに加えて、分泌可能なタンパク質、例えば、サイトカインなどの遺伝子を、本明細書で開示する方法を用いて編集してもよい。ケモカイン及び転写因子を編集してから活性化させてもよい。このような編集を行って、例えば、サイトカイン放出症候群(CRS)の発症または維持を抑制または予防してもよい。CRSは、免疫治療薬(またはその他の免疫学的刺激物)に応答した免疫細胞からの、大規模で急速なサイトカインの放出によって引き起こされる。本明細書で開示する方法を用いて、1つまたは複数のサイトカインまたはケモカインの遺伝子の修飾、破壊、または欠失を達成してもよい。

0312

例えば、Cas9−CRISPRを用いることにより、または、サイトカイン、ケモカイン、もしくは転写因子の遺伝子配列にCARを標的形質導入することにより、本明細書で開示する免疫エフェクター細胞から欠失させることができるサイトカイン、ケモカイン、及び転写因子としては、以下、XCL1、XCL2、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CX3CL1、IL−1α(IL1A)、IL−1β(IL1B)、IL−1RA、IL−18、IL−2、IL−4、IL−7、IL−9、IL−13、IL−15、IL−3、IL−5、GM−CSF、IL−6、IL−11、G−CSF、IL−12、LIF、OSM、IL−10、IL−20、IL−14、IL−16、IL−17、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、CD154、LT−β、TNF−α、TNF−β、4−1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL−1、TRAIL、TWEAK、TRANCE、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、Epo、Tpo、Flt−3L、SCF、M−CSF、MSP、A2M、ACKR1、ACKR2、ACKR3、ACVR1、ACVR2B、ACVRL1、ADIPOQ、AGER、AGRN、AHR、AIMP1、AREG、BCL6、BMP1、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMPR2、C10orf99、C1QTNF4、C5、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CCR6、CCR7、CD109、CD27、CD28、CD36、CD4、CD40LG、CD70、CD74、CD8a、CER1、CHRD、CKLF、CLCF1、CMTM1、CMTM2、CMTM3、CMTM4、CMTM5、CMTM6、CMTM7、CMTM8、CNTF、CNTFR、COPS5、CRLF1、CSF1、CSF1R、CSF2、CSF3、CSF3R、CTF1、CX3CR1、CXCL16、CXCL17、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、EBI3、EDN1、ELANE、ENG、FAM3B、FAM3C、FAM3D、FAS、FASLG、FGF2、FLT3LG、FOXP3、FZD4、GATA3、GBP1、GDF1、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF9、GPI、GREM1、GREM2、GRN、HAX1、HFE2、HMGB1、HYAL2、ICAM3、ICOS、IFNA10、IFNA14、IFNA16、IFNA2、IFNA5、IFNA6、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNK、IFNL1、IFNL3、IFNW1、IL10RA、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL17A、IL17B、IL17C、IL17D、IL17F、IL18BP、IL−19、IL1F10、IL1R1、IL1R2、IL1RAPL1、IL1RL1、IL1RN、IL20RA、IL20RB、IL21、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL25、IL26、IL27、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL31、IL31RA、IL32、IL33、IL34、IL36A、IL36B、IL36G、IL36RN、IL37、IL6R、IL6ST、INHA、INHBA、INHBB、INHBC、INHBE、ITGA4、ITGAV、ITGB1、ITGB3、KIT、KITLG、KLHL20、LEFTY1、LEFTY2、LIFR、LTA、LTB、LTBP1、LTBP3、LTBP4、MAF、MIFMINOS1−、MSTN、NAMPT、NBL1、NDPNLRP7、NODAL、NOG、NRG1、NRP1、NRP2、OSM、OSMR、PARK7、PDPN、PF4、PF4V1、PGLYRP1、PLP2、PPBP、PXDN、RORC、SCG2、SCGB3A1、SECTM1、SLURP1、SOSTDC1、SP100、SPI1、SPP1、TBX21、TCAP、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、THBS1、THNSL2、THPO、TIMP1、TNF、TNFRSF11、TNFRSF4、TNFRSF1A、TNFRSF9、TNFRSF10、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF12−、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、TNFSF4、TNFSF8、TNFSF9、TRIM16、TSLP、TWSG1、TXLNA、VASNVEGFA、VSTM1、WFIKKN1、WFIKKN2、WNT1、WNT2、WNT5A、WNT7A、及びZFP36、が挙げられるがこれらに限定されない。

0313

一部の実施形態では、サイトカインは、MCP1(CCL2)、MCP−2、GM−CSF、G−CSF、M−CSF、Il−4、及びIFNγ、から選択される。

0314

例えば、Cas9−CRISPRを用いることにより、または、転写因子の遺伝子配列にCARを標的形質導入することにより、本明細書で開示する免疫エフェクター細胞から欠失させることができる転写因子は、AHR、BCL6、FOXP3、GATA3、MAF、RORC、SPI1、及びTBX21、から選択される。

0315

これらの遺伝子の配列は当該技術分野において周知かつ入手可能である。

0316

適応症、及びCAR−T療法における標準治療
一部の実施形態では、本明細書で開示する及び/または本明細書で開示する方法を用いて作製されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、1種または複数種のキメラ抗原受容体(CAR)を発現し、医薬品として、すなわち、疾患の治療用に使用され得る。多くの実施形態では、細胞はCAR−T細胞である。

0317

本明細書で開示する及び/または本明細書で開示する方法を用いて作製される細胞は、がん、自己免疫疾患、感染症、及びその他の症状を治療するために、または、がん、自己免疫疾患、感染症、及びその他の症状を治療するための医薬品を製造するために、免疫療法及び養子細胞移入に使用され得る。

0318

がんは、血液悪性腫瘍または固形腫瘍であってもよい。血液悪性腫瘍としては、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及びそれらの亜型、が挙げられる。リンパ腫は、様々な方法、多くの場合、悪性細胞の基本的なタイプに基づいて分類することができ、ホジキンリンパ腫(リードスタンバーグ細胞のがんであることが多いが、時としてB細胞から発生することもあり、全てのその他のリンパ腫は非ホジキンリンパ腫である)、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫バーキットリンパ腫濾胞性リンパ腫、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のリンパ腫、が挙げられる。

0319

B細胞リンパ腫としては、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、慢性リンパ性白血病(CLL)/小リンパ球性リンパ腫(SLL)、B細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病(ALL)、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のB細胞リンパ腫、が挙げられるがこれらに限定されない。

0320

T細胞リンパ腫としては、T細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫(T−ALL)、末梢T細胞リンパ腫(PTCL)、T細胞慢性リンパ性白血病(T−CLL)、セザリー症候群、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のT細胞リンパ腫、が挙げられる。

0321

白血病としては、急性骨髄性(myeloid)(または骨髄性(myelogenous))白血病(AML)、慢性骨髄性(または骨髄性)白血病(CML)、急性リンパ性(またはリンパ芽球性)白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、毛様細胞性白血病(時として、リンパ腫に分類される)、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他の白血病、が挙げられる。

0322

形質細胞性悪性腫瘍としては、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫、が挙げられる。

0323

一部の実施形態では、患者におけるがんを治療するために、とりわけ、固形腫瘍、例えば、黒色腫神経芽細胞腫神経膠腫など、または、がん、例えば、脳、頭頸部乳房(例えば、非小細胞肺癌、NSCLC)、生殖系(例えば、卵巣)、上部消化管膵臓肝臓腎臓(renal)系(例えば、腎臓(kidney))、膀胱前立腺、及び結腸直腸の腫瘍など、を治療するために、医薬品を使用してもよい。

0324

別の実施形態では、患者におけるがんを治療するために、とりわけ、多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病(AML)から選択される血液悪性腫瘍、ならびに、T細胞急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)、非ホジキンリンパ腫、及びT細胞慢性リンパ性白血病(T−CLL)から選択されるT細胞悪性腫瘍、を治療するために、医薬品を使用してもよい。

0325

一部の実施形態では、自己免疫疾患、例えば、狼瘡自己免疫(関節)リウマチ多発性硬化症移植拒絶反応クローン病潰瘍性大腸炎皮膚炎などの治療に、細胞を使用してもよい。一部の実施形態では、細胞は、抗体フラグメントの代わりに抗原またはそのフラグメントを提示するキメラ自己抗体受容体T細胞、すなわちCAAR−Tであり、このタイプの養子細胞移入では、自己免疫疾患を引き起こすB細胞は、遺伝子改変T細胞を攻撃しようとし、遺伝子改変T細胞を殺傷することで反応する。

0326

一部の実施形態では、HIV及び結核などの感染症の治療に、細胞を使用してもよい。

0327

別の実施形態では、本開示のCAR−T細胞は、強力なin vivoT細胞増殖を受けてもよく、長時間にわたり持続し得る。

0328

一部の実施形態では、本開示のCAR−T細胞を用いた患者の治療は、緩和治癒的または予防的となり得る。その治療は、自家免疫療法治療の一部、または同種異系免疫療法治療の一部のいずれかであってもよい。自家とは、患者の治療に用いる細胞、細胞株、または細胞集団が、上記患者またはヒト白血球抗原HLA)適合ドナーに由来するということを意味する。同種異系とは、患者の治療に用いる細胞または細胞集団が、その患者ではなくドナーに由来するということを意味する。

0329

本開示のCAR−T細胞を用いたがんの治療は、抗体療法化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法遺伝子療法ホルモン療法放射線療法レーザー光線療法、及び放射線療法、から選択される1種または複数種の治療法と組み合わされてもよい。

0330

本開示のCAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、埋め込み、または移植、により実施される。本明細書に記載のCAR−T細胞組成物、すなわち、モノCAR、デュアルCAR、タンデムCARは、皮下、皮膚内、腫瘍内、節内、内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ管内注射、または腹腔内で、患者に投与され得る。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、静脈注射で投与されることが好ましい。

0331

CAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団の投与は、体重1kgあたり104〜109の細胞、好ましくは、105〜106の細胞/kg(体重)(これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む)、の投与で構成され得る。CAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団は、1回または複数回の投与で投与されてもよい。別の実施形態では、有効量のCAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団は、単回投与で投与される。別の実施形態では、有効量の細胞は、ある期間にわたり2回以上の投与で投与される。投与のタイミングは健康管理提供者の良識の範囲内であり、患者の臨床症状によって決まる。CAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団は、任意の供給源、例えば、血液銀行またはドナーなどから得てもよい。患者の要望は様々ではあるが、個々の疾患または症状のための、任意のCAR−T細胞集団(複数可)の有効量の至適範囲の算出は当業者の知るところである。有効量とは、治療効果または予防効果をもたらす量のことを意味する。投与量は、患者レシピエント年齢、健康及び体重、併用治療の種類(ある場合、治療の頻度)、ならびに、望まれる効果の性質によって決まる。

0332

別の実施形態では、有効量の、CAR−T細胞もしくはCAR−T細胞の集団、またはそれらCAR−T細胞を含む組成物は、非経口で投与される。投与は、静脈内投与であってもよい。CAR−T細胞もしくはCAR−T細胞の集団、またはそれらCAR−T細胞を含む組成物の投与は、腫瘍内への注射によって直接実施されてもよい。

0333

本開示の一実施形態では、CAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団は、T細胞の増殖及び持続性を向上させる、サイトカイン、もしくはCAR−T内のサイトカインの発現を用いた治療、ならびに、IL−2、IL−7、及びIL−15を用いることを含むがこれらに限定されない治療、を含むがこれらに限定されない多くの関連治療モダリティと共に、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に、患者に投与される。

0334

第2の実施形態では、本開示のCAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団は、TGFβ、インターロイキン10(IL−10)、アデノシン、VEGF、インドールアミン−2,3−ジオキシゲナーゼ1(IDO1)、インドールアミン−2,3−ジオキシゲナーゼ2(IDO2)、トリプトファン−2,3−ジオキシゲナーゼ(TDO)、乳酸低酸素症アルギナーゼ、及びプロスタグランジンE2の阻害剤、を含むがこれらに限定されない、免疫抑制経路を阻害する薬剤と組み合わせて使用してもよい。

0335

別の実施形態では、本開示のCAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団は、抗CTLA4(イピリムマブ)、抗PD1(ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ)、抗PDL1(アテゾリズマブ、アベルマブ、デュバルマブ)、抗PDL2、抗BTLA、抗LAG3、抗TIM3、抗VISTA、抗TIGIT、及び抗KIR、を含むがこれらに限定されないT細胞チェックポイント阻害薬、と組み合わせて使用してもよい。

0336

別の実施形態では、本開示のCAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団は、CD28、ICOS、OX−40、CD27、4−1BB、CD137、GITR、及びHVEMを刺激する抗体を含むがこれらに限定されないT細胞アゴニストと組み合わせて使用してもよい。

0337

別の実施形態では、本開示のCAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団は、レトロウイルス、ピコルナウイルスラブドウイルスパラミクソウイルスレオウイルスパルボウイルスアデノウイルスヘルペスウイルス、及びポックスウイルス、を含むがこれらに限定されない治療用腫瘍崩壊ウイルス、と組み合わせて使用してもよい。

0338

別の実施形態では、本開示のCAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団は、TLR3、TLR4、TLR7、及びTLR9アゴニスト、を含むがこれらに限定されない、Toll様受容体アゴニストなどの免疫活性化治療薬、と組み合わせて使用してもよい。

0339

別の実施形態では、本開示のCAR−T細胞またはCAR−T細胞の集団は、環状GMP−AMPシンターゼ(cGAS)などのインターフェロン遺伝子刺激因子(STING)アゴニストと組み合わせて使用してもよい。

0340

免疫エフェクター細胞無形成症、とりわけ、T細胞無形成症はまた、養子細胞移入療法後の懸念事である。治療する悪性腫瘍がT細胞悪性腫瘍でありCAR−T細胞がT細胞抗原を標的とする場合、抗原を発現する正常なT細胞及びその前駆細胞が枯渇し、免疫機構が損なわれる。それゆえ、これらの副作用を管理するための方法は、治療の案内係である。このような方法としては、後ほど、CAR−T細胞が枯渇または不活性化した後に、増殖させて患者に再注入するために、自家または同種異系(任意選択的に、拒絶反応を引き起こさないまたは拒絶されないように遺伝子改変された)のいずれかの、非悪性のT細胞または前駆細胞を選択及び保持することが挙げられる。代替的に、TCR保有細胞の亜型、例えば、正常及び悪性のTRBC1+(しかし、TRBC2+細胞ではない)、または代替的に、TRBC2+(しかし、TRBC1+細胞ではない)などを認識して殺傷するCAR−T細胞を使用して、十分な正常T細胞を保持して正常な免疫機構の機能を維持しつつ、T細胞悪性腫瘍を根絶してもよい。

0341

定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は、示された意味を有する。本明細書の全体にわたり、その他の定義が現れる場合もある。

0342

数値の範囲を開示する場合、また表記「n1…〜n2」または「n1…〜n2の間」を使用する場合、n1及びn2は数字であり、そのため、特に明記しない限り、この表記は、数字自体及びそれらの間の範囲を含むことを意図している。この範囲は、数字間における整数または連続であってもよく、末端の数値を含む。例えば、「2〜6個の炭素」の範囲は、炭素が整数単位で存在することから、2、3、4、5、及び6個の炭素を含むことを意図している。対照的に、例えば、「1〜3μM(マイクロモル)」の範囲は、1μM、3μM、及び、数字間における任意数有効数字(例えば、1.255μM、2.1μM、2.9999μMなど)の全てを含むことを意図している。

0343

用語「約」は、本明細書で使用する場合、その用語が修飾する数値を、このような数値が誤差の範囲内で変動することを表すように、限定することを意図している。誤差の範囲が特にない場合、例えば、データのグラフまたは表に記載された平均値に対する標準偏差が列挙されている場合などにおいて、用語「約」は、列挙された数値を包含し得る範囲、及び、同様に、有効数字を考慮して、その数値にまで切り上げるまたは切り下げることにより含まれ得る範囲を意味するものと理解すべきである。

0344

細胞に関する用語「活性化」(及びその別の活用型)は通常、「刺激すること」と同義であると理解すべきであり、本明細書で使用する場合、細胞集団の増殖をもたらす細胞の処理のことを意味する。T細胞において、活性化は、CD2及びCD28(及び同様に、CD2の場合もある)アゴニスト、一般的には、任意選択的に、磁性ビーズ上にコーティングしたまたはコロイド状のポリマーマトリックスコンジュゲートした、抗体、に曝露することによって達成されることが多い。

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