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技術 起電性細胞における細胞内活動電位を記録するための方法および装置

出願人 フォンダツィオーネ・イスティテュート・イタリアーノ・ディ・テクノロジア
発明者 デアンゲリス,フランチェスコディパロ,ミシェル
出願日 2018年12月12日 (2年11ヶ月経過) 出願番号 2020-531952
公開日 2021年8月12日 (3ヶ月経過) 公開番号 2021-519573
状態 未査定
技術分野 微生物・酵素関連装置 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 表面多孔質 レーザーパルス列 超短レーザーパルス 増幅チェーン マルチ電極 レーザー励起光 電気的記録 光学カップ
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課題・解決手段

オプトポレーションによって形成される細胞(4)の、細胞膜の気孔を通して、起電性細胞(4)における細胞内活動電位を記録するための方法であって:a)マルチ電極アレイ(2)上の前記細胞(4)を含むサンプルの位置決めを行う工程と;b)サンプルのインキュベーション(110)または灌流(111)の工程と;e)表面がサンプルと接触する、アレイ(2)電極(20)の表面にレーザー集束させる(14)工程と;f)サンプルの細胞(4)の膜の局所的な機能不全を起こすため、1以上のアレイ(2)電極(20)に、1以上のレーザーパルス印加する工程と;g)細胞内活動電位の記録の工程と;を含み、電極の表面が空洞と突起ナノスケールで有するように、電極(20)の前記表面が多孔質であり、ここで、レーザーによって作り出される電界が、サンプルの細胞(4)の膜の前記局所的機能不全を起こすように、局地化されかつ増幅される。

概要

背景

方法は、
a)マルチ電極アレイ上の前記細胞を含むサンプルの位置決めを行う工程と;
b)サンプルのインキュベーション(110)または灌流(111)の工程と;
e)表面がサンプルと接する、アレイ電極の表面にレーザー集束させる工程と;
f)サンプルの細胞の膜の局所的な機能不全を起こすため、1以上のアレイ電極に1以上のレーザーパルス印加する工程と;
g)細胞内活動電位の記録の工程と;を含む。

このタイプの方法は現在周知であり、ニューロン心筋細胞網膜などの、起電性細胞における活動電位を記録するために使用される。

細胞の大きなグループの活動電位を記録するためのマルチ電極アレイ(MEA)の使用は、近年大きく発展している。

大きなネットワークの中の、多くの凝集細胞の活動電位は、細胞外または細胞内で測定し得る。第1のケースでは、細胞膜記録用電極電気的に接触していれば十分である。第2のケースでは、電極は、代わりに細胞の細胞質に、電気的に接触する必要がる。これが生じるためには、細胞膜の中に気孔を作る必要がある。最先端技術では、細胞膜中の気孔の生成に使用され得る2つの異なる方法論エレクトロポレーション(electroporation)とオプトポレーション、がある。

エレクトロポレーションは、細胞膜の能力を圧倒する、短く強力な高圧パルスの印加を含み、細胞膜の構造の一時的な緩和と、流動的且つ可逆的な気孔の形成を可能にする。

他方、オプトポレーションは、気孔形成のために細胞膜を一時的に変化させることができる、高い強度のレーザーパルスの使用を含む。

これらの両方法は、細胞質との電気的接触確立するように、気孔が形成される際に気功内部に見られる突起を作り出すために、アレイ電極に置かれる三次元(3D)ナノ構造の使用に基づいている。

現在使用される3Dナノ構造は、一般に、幅に比べて高さがはるかに大きいことによって特徴付けられる。幅が通常50ナノメートルと500ナノメートルの間の範囲にある一方で、高さは通常400ナノメートルと5マイクロメートルの間の範囲にある。

これまで、これらの比率で3D構造を有する電極のナノ構造化は確立された技術で、それにより、三次元形状のほぼあらゆるタイプを作り出すことが可能になっている。

しかしながら、使用される技術はすべて、通常商用半導体産業特権ではなく、かつ、商用レベルに容易に拡張し得ない、特殊且つ非常に高価なツールを必要とする。その結果、細胞内記録のためのMEA上の3Dナノ構造の利用は、これまで低密度パッシブMEAプロトタイプに限定されてきた。

細胞外活動電位の記録に関しては、3Dナノ構造に基づく方法はすべて、標準のMEA電極に比べてパフォーマンス落ちることが実証されている。

ごく最近になって、高解像度CMOSのアクティブMEAに基づく3Dナノ構造が、細胞内活動電位の記録のために、実装されるようになってきた。この種のMEAは、電気的パルス列によるエレクトロポレーションを行なうために使用され得る。この目的のために、CMOS−MEA装置は、記録増幅チェーンに加え、電気的パルスを印加するために使用される並列刺激回路(stimulation circuit)を含む。

しかしながら、このアプローチにはいくつかの欠点がある。第1に、シリコン電子結合回路は、刺激回路と記録回路同一電極上に集積化していることで、著しくより複雑となる。この構成は、大きな基本記録ゾーン、または、通常100×100μm2より大きい画素を有する結果となる。これは、市場現在利用可能な他のCMOS−MEAシステムと比較して、解像度が低下する結果となる。第2に、エレクトロポレーションプロセスは、信頼できる性能のために、いまだに3Dナノ構造の組立てを必要とする。これらの特性は、エレクトロポレーション前の細胞外記録において、信号対ノイズ比率が比較的低くなるという結果をもたらす。さらに、エレクトロポレーションは、どの細胞、またはどの細胞のグループが実行されたかを選択的に認識する可能性を持たず、CMOS電極の完全なセットのみに適用することができる。

3Dナノ構造は、様々な方法で細胞に影響する可能性があり、特に心臓細胞は、機械的な収縮を行い、3Dナノ構造に繋げることによって影響を受ける可能性がある;その結果、3Dナノ構造による細胞内電位および細胞外電位の記録は、非常に侵襲的なものとなる。

さらに、細胞内記録を取得するのに必要な電気的パルスを印加している間は、活動電位を記録できない。細胞は電気的パルスの印加から一時的な外傷を受け、その結果、しばしば、しばらくの間活動電位の生成を停止する。この理由により、これらの既知の方法は、高度の侵襲性を示す。

最近の研究では、電極上の3Dナノ構造を用いるプラズモンオプトポレーションが、特に3Dナノアンテナを用いて、細胞を破損すること無く細胞中に気孔を作り出すための、エレクトロポレーションに代わる非常に効率的な代替手段に相当することが、示されている。この方法は、パッシブMEAを用いる活動電位の細胞内記録のために使用され得る。しかしながら、オプト−プラズモンアプローチの利点にもかかわらず、既知の方法は3Dナノ構造のプラズモン活動に基づく。3Dナノ構造は、作り出すのが非常に高価で、レーザー光線共振させることができるように高度な正確さを以て組み立てられなくてはならず、CMOS−MEAなどの高密度MEA上で組み立てるのは困難である。3Dナノ構造のレーザー励起は、ナノ構造の先端における、レーザーの正確な位置決めおよび集束を必要とする。このことは、装置の表面上のレーザーをスキャンすることによって複数の電極から信頼できる細胞内記録を取得することを、非常に困難にする。レーザーソースの特性は、効率的に3Dプラズモンナノ構造を励起させるために、特定の要件適合しなくてはならず、このことが使用可能なレーザーソースを限定する。これらのすべての理由により、このアプローチは、記録電極からの電気刺激を必要とはしないものの、エレクトロポレーションのアプローチのように、複雑で高価な生産技術を供するという短所を有する。

概要

オプトポレーションによって形成される細胞(4)の、細胞膜の気孔を通して、起電性細胞(4)における細胞内活動電位を記録するための方法であって:a)マルチ電極アレイ(2)上の前記細胞(4)を含むサンプルの位置決めを行う工程と;b)サンプルのインキュベーション(110)または灌流(111)の工程と;e)表面がサンプルと接触する、アレイ(2)電極(20)の表面にレーザーを集束させる(14)工程と;f)サンプルの細胞(4)の膜の局所的な機能不全を起こすため、1以上のアレイ(2)電極(20)に、1以上のレーザーパルスを印加する工程と;g)細胞内活動電位の記録の工程と;を含み、電極の表面が空洞と突起をナノスケールで有するように、電極(20)の前記表面が多孔質であり、ここで、レーザーによって作り出される電界が、サンプルの細胞(4)の膜の前記局所的機能不全を起こすように、局地化されかつ増幅される。

目的

本発明は、現在知られている方法の前述の欠点を、冒頭で説明されている方法で克服することを目的とし、ここでは、ナノスケールにおいて、空洞および突起を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

オプトポレーションによって形成される細胞(4)の、細胞膜の気孔を通して、起電性細胞(4)における細胞内活動電位を記録するための方法であって:a)マルチ電極アレイ(2)上の前記細胞(4)を含むサンプルの位置決めを行う工程と;b)サンプルのインキュベーション(110)または灌流(111)の工程と;e)表面がサンプルと接触する、アレイ(2)電極(20)の表面にレーザー集束させる(14)工程と;f)サンプルの細胞(4)の膜の局所的な機能不全を起こすため、1以上のアレイ(2)電極(20)に、1以上のレーザーパルス印加する工程と;g)細胞内活動電位の記録の工程と;を含み、電極の表面が空洞と突起ナノスケールで有するように、電極(20)の前記表面が多孔質であることを特徴とし、ここで、レーザーによって作り出される電界が、サンプルの細胞(4)の膜の前記局所的機能不全を起こすように、局地化されかつ増幅される、方法。

請求項2

電極(20)が、前記表面を少なくとも部分的に含み、白金または金でできている、請求項1に記載の方法。

請求項3

電極(20)の表面が、100と500nmとの間の範囲で厚さを増す多孔性を有する、請求項1−2の1以上に記載の方法。

請求項4

電極の表面が、好ましくは10nmと300nmとの間の範囲にある入射光波長より、小さいサイズの空間または気孔を備える材料を有する、請求項1−3の1以上に記載の方法。

請求項5

光学顕微鏡(3)の下のアレイ(2)の位置決め(12)工程が提供され、その光学顕微鏡(3)には第1のレーザー励起光経路および第2の光学画像取得経路が提供される、請求項1−4の1以上に記載の方法。

請求項6

アレイ(2)全体からの細胞外活動電位の記録(13)の工程が提供される、請求項1−5の1以上に記載の方法。

請求項7

電極(20)の表面が、突起を作り出すために、特別に且つ巧妙に製造されるべき三次元ナノ構造を持たない、請求項1−6の1以上に記載の方法。

請求項8

起電性細胞(4)において細胞内活動電位を記録するための装置であって、前記細胞(4)を含むサンプルを支援するのに適したマルチ電極アレイ(2)と、レーザーソース(32)と、アレイ(2)の電極(20)の表面上のレーザー光線集束手段と、サンプルの細胞(4)の膜の局所的機能不全をもたらす、アレイ(2)の1以上の電極(20)への1以上のレーザーパルスの印加のためのレーザーソース駆動手段(32)と、電極によって検知される細胞活動電位を記録するための手段と、を含み、電極(20)の前記表面が多孔質であることを特徴とする、装置。

請求項9

電極(20)が、前記表面を少なくとも部分的に含み、白金または金でできている、請求項8に記載の装置。

請求項10

電極(20)の表面が、100と500nmとの間の範囲で厚さを増す多孔性を有する、請求項8または9に記載の装置。

請求項11

レーザーソース(32)、レーザービーム集束手段およびレーザーソース駆動手段が、光学顕微鏡(3)の一部であり、その光学顕微鏡(3)には、第1のレーザー励起光学経路(30)および第2の画像取得光学経路(31)が提供される、請求項8−10の1以上に記載の装置。

技術分野

0001

本発明は、オプトポレーション(optoporation)によって形成される細胞膜中の気孔を通して、起電性細胞における細胞内活動電位を記録する方法に関する。

背景技術

0002

方法は、
a)マルチ電極アレイ上の前記細胞を含むサンプルの位置決めを行う工程と;
b)サンプルのインキュベーション(110)または灌流(111)の工程と;
e)表面がサンプルと接する、アレイ電極の表面にレーザー集束させる工程と;
f)サンプルの細胞の膜の局所的な機能不全を起こすため、1以上のアレイ電極に1以上のレーザーパルス印加する工程と;
g)細胞内活動電位の記録の工程と;を含む。

0003

このタイプの方法は現在周知であり、ニューロン心筋細胞網膜などの、起電性細胞における活動電位を記録するために使用される。

0004

細胞の大きなグループの活動電位を記録するためのマルチ電極アレイ(MEA)の使用は、近年大きく発展している。

0005

大きなネットワークの中の、多くの凝集細胞の活動電位は、細胞外または細胞内で測定し得る。第1のケースでは、細胞膜が記録用電極電気的に接触していれば十分である。第2のケースでは、電極は、代わりに細胞の細胞質に、電気的に接触する必要がる。これが生じるためには、細胞膜の中に気孔を作る必要がある。最先端技術では、細胞膜中の気孔の生成に使用され得る2つの異なる方法論エレクトロポレーション(electroporation)とオプトポレーション、がある。

0006

エレクトロポレーションは、細胞膜の能力を圧倒する、短く強力な高圧パルスの印加を含み、細胞膜の構造の一時的な緩和と、流動的且つ可逆的な気孔の形成を可能にする。

0007

他方、オプトポレーションは、気孔形成のために細胞膜を一時的に変化させることができる、高い強度のレーザーパルスの使用を含む。

0008

これらの両方法は、細胞質との電気的接触確立するように、気孔が形成される際に気功内部に見られる突起を作り出すために、アレイ電極に置かれる三次元(3D)ナノ構造の使用に基づいている。

0009

現在使用される3Dナノ構造は、一般に、幅に比べて高さがはるかに大きいことによって特徴付けられる。幅が通常50ナノメートルと500ナノメートルの間の範囲にある一方で、高さは通常400ナノメートルと5マイクロメートルの間の範囲にある。

0010

これまで、これらの比率で3D構造を有する電極のナノ構造化は確立された技術で、それにより、三次元形状のほぼあらゆるタイプを作り出すことが可能になっている。

0011

しかしながら、使用される技術はすべて、通常商用半導体産業特権ではなく、かつ、商用レベルに容易に拡張し得ない、特殊且つ非常に高価なツールを必要とする。その結果、細胞内記録のためのMEA上の3Dナノ構造の利用は、これまで低密度パッシブMEAプロトタイプに限定されてきた。

0012

細胞外活動電位の記録に関しては、3Dナノ構造に基づく方法はすべて、標準のMEA電極に比べてパフォーマンス落ちることが実証されている。

0013

ごく最近になって、高解像度CMOSのアクティブMEAに基づく3Dナノ構造が、細胞内活動電位の記録のために、実装されるようになってきた。この種のMEAは、電気的パルス列によるエレクトロポレーションを行なうために使用され得る。この目的のために、CMOS−MEA装置は、記録増幅チェーンに加え、電気的パルスを印加するために使用される並列刺激回路(stimulation circuit)を含む。

0014

しかしながら、このアプローチにはいくつかの欠点がある。第1に、シリコン電子結合回路は、刺激回路と記録回路同一電極上に集積化していることで、著しくより複雑となる。この構成は、大きな基本記録ゾーン、または、通常100×100μm2より大きい画素を有する結果となる。これは、市場現在利用可能な他のCMOS−MEAシステムと比較して、解像度が低下する結果となる。第2に、エレクトロポレーションプロセスは、信頼できる性能のために、いまだに3Dナノ構造の組立てを必要とする。これらの特性は、エレクトロポレーション前の細胞外記録において、信号対ノイズ比率が比較的低くなるという結果をもたらす。さらに、エレクトロポレーションは、どの細胞、またはどの細胞のグループが実行されたかを選択的に認識する可能性を持たず、CMOS電極の完全なセットのみに適用することができる。

0015

3Dナノ構造は、様々な方法で細胞に影響する可能性があり、特に心臓細胞は、機械的な収縮を行い、3Dナノ構造に繋げることによって影響を受ける可能性がある;その結果、3Dナノ構造による細胞内電位および細胞外電位の記録は、非常に侵襲的なものとなる。

0016

さらに、細胞内記録を取得するのに必要な電気的パルスを印加している間は、活動電位を記録できない。細胞は電気的パルスの印加から一時的な外傷を受け、その結果、しばしば、しばらくの間活動電位の生成を停止する。この理由により、これらの既知の方法は、高度の侵襲性を示す。

0017

最近の研究では、電極上の3Dナノ構造を用いるプラズモンオプトポレーションが、特に3Dナノアンテナを用いて、細胞を破損すること無く細胞中に気孔を作り出すための、エレクトロポレーションに代わる非常に効率的な代替手段に相当することが、示されている。この方法は、パッシブMEAを用いる活動電位の細胞内記録のために使用され得る。しかしながら、オプト−プラズモンアプローチの利点にもかかわらず、既知の方法は3Dナノ構造のプラズモン活動に基づく。3Dナノ構造は、作り出すのが非常に高価で、レーザー光線共振させることができるように高度な正確さを以て組み立てられなくてはならず、CMOS−MEAなどの高密度MEA上で組み立てるのは困難である。3Dナノ構造のレーザー励起は、ナノ構造の先端における、レーザーの正確な位置決めおよび集束を必要とする。このことは、装置の表面上のレーザーをスキャンすることによって複数の電極から信頼できる細胞内記録を取得することを、非常に困難にする。レーザーソースの特性は、効率的に3Dプラズモンナノ構造を励起させるために、特定の要件適合しなくてはならず、このことが使用可能なレーザーソースを限定する。これらのすべての理由により、このアプローチは、記録電極からの電気刺激を必要とはしないものの、エレクトロポレーションのアプローチのように、複雑で高価な生産技術を供するという短所を有する。

0018

したがって、現在、3Dナノ構造や複雑な電子回路を使用しない、細胞内活動電位を記録する可能性を与える方法に対する、充足されていない必要性が存在する。

0019

本発明は、現在知られている方法の前述の欠点を、冒頭で説明されている方法で克服することを目的とし、ここでは、ナノスケールにおいて、空洞および突起を提供するように、前記電極表面は多孔質であり、サンプルの細胞膜の前記局所的機能不全を起こすために、レーザーによって作り出される電界局地化され且つ増幅される。

0020

したがって、本方法は、MEA電極の多孔質表面のレーザー照射で構成される。多孔質表面に接触している細胞の細胞膜は、多孔質表面を照射するレーザーによって生成される強力な電磁界によって、局所的に破壊される。その結果、細胞の内部が電極と接触し、細胞内活動電位の記録を開始する。

0021

電極の多孔質表面の形態は、2つの理由で基本となる:(i)非多孔質基材によって得られるものに比べ、細胞と、より多くの細胞接着を促す電極との間の結合を増加させる。(ii)レーザー励起中に、多孔質表面のナノ間隙に、高輝度で局所的な電磁界を生成する。第1の特性は基本的な役割を果たしている、なぜならそれは、細胞膜と電極の間の非常に広い空間における接着を非常に強力で継続的なものにし、その後の細胞膜の破壊プロセスにさえも耐え得るものにするからである。膜は、気孔の開口がレーザーによって局所的に誘発された後でさえ、電極に付いたままなので、気孔それ自体は、細胞外の環境と電気的に接触していない。このことは電流漏れを最小化するまたは完全に除去するので、結果として、高品質電位測定を可能にする。第2の理由(多孔性による電磁界の強化)は、いくつかの目立った光学特性にある。第1は、多孔性物質のナノ間隙において、電磁界の局所化現象および増幅現象が存在し得ることである。第2は、多孔質金属光学的性質が、それぞれの当初物質性質とは異なるとことである。特に、多孔性物質の誘電率の実数部虚数部の両者が、当初物質のそれに比べてより低くなる可能性があり、また、多孔性物質におけるプラズモン応答が当初金属におけるそれに比べてより強くなり得る。このことは、電磁界の、一層の且つ有利な増幅をもたらす。最後に、多孔性金属は、通常の金属とは異なり、色が暗めになったり、優れた広帯域吸収体のような挙動をしたりする。要約すると、多孔性金属は、入射放射の結合において、および、広いスペクトル帯域を備えた結合効率として、双方における明らかな光学的長所を有し、電磁界のより大きな増幅および局所化を可能にする。

0022

これらの利点はすべて、現在知られている方法と比較して、はるかに安価且つより簡単な方法で、細胞内記録が行なわれることを可能にする。実際、細胞内活動電位は、3Dナノ構造無しで、また、追加の複雑な電子回路無しで記録することが可能である;これらは、これまでMEAおよびCMOS−MEA上で示されてきた、他のすべての細胞内記録技術について必要な要素である。この違いは、記録プロセスをより迅速に、より制御可能に、そしてより信頼性の高いものにし、且つ、異なるMEAの間の変化に対する脆弱性をおさえるので、非常に重要である。

0023

特に、多孔質表面の使用は、細胞外構成と細胞内構成の両者において最良記録性能を得るために不可欠である。

0024

他のCMOS−MEAの細胞内記録の方法と比較して、この新しいアプローチは、より小さな電極の利用、より単純な回路による多くの電極の利用、および、単一電極のポレーション(poration)の容量のおかげによるより広い汎用性の利用、が可能になり、より優れた空間解像度を提供する。さらに、新しい技術は、使用されている装置の「既に商用品である」という性質により、開発および製造コストをより低くする。

0025

このように、レーザーオプトポレーションは、電極の多孔性表面活用し、刺激回路および3Dナノ構造の必要性を排除して、高密度の商用CMOS−MEAにうまく適用することが可能である。このアプローチは、市場投入後に装置を変更すること無く、高密度の商用MEAを使用して、大きな細胞群の細胞内活動電位を記録することを可能にする。

0026

示される方法の利点は多い。

0027

最初の例では、方法は、多孔性表面を有する電極を備えた、様々なパッシブMEAまたは商用のアクティブMEAと共に使用され得る。

0028

方法はさらに、作成が高価で、且つ、商用デバイス上での集積が容易では無い、3Dナノ構造を作成するケースなどの、装置の高価で複雑な再構成を必要としない。3Dナノ構造を備えた装置を商用化する際の難しさにより、MEA装置上で細胞内記録能力を提供する商品は、現在市販されていない。これに反して、この方法は、既に市場にあるより安価な装置を活用するため、比較的簡単に市場に出すことが可能である。原則として、方法は既に別々に市場に出ている機器や装置を組み合わせることによって実装され得る。

0029

方法はまた、細胞外モードにおいて優れたSNRを維持することを可能にする。

0030

方法はまた、追加的な回路が無いために、より小さな画素を得ることを可能にする。細胞内記録は、CMOS−MEA上の追加的な電気刺激回路無しで取得され得る。このことは、記録性能のためにCMOS電極が最適化されることを可能にする。画素サイズが抑えられるおかげで、記録の空間解像度はより大きくなる。さらに、レーザー励起がMEAの電気記録システムから完全に独立しているので、細胞内活動電位は、任意の培養物から、あるいは正確に識別され得る個々の細胞から、記録され得る。レーザーパルスがどこで印加されるかによって、選択性が与えられる。したがって、方法はCMOS−MEA上で適用される他の方法に関して、高選択性を示す。

0031

最後に、本方法を用いると、レーザーパルス印加はMEAの電気的記録に影響せず、選択された電極上の刺激前、刺激中、および刺激後において、全CMOSアレイの継続的な記録を可能にする。活動電位の記録は、実際に、電極のレーザー照射の間、継続し得る。MEAアレイ全体の記録において、中断は無い。この特徴は、リアルタイムのレーザー励起に対する、細胞培養の反応を研究する可能性を提示する。

0032

MEA上のサンプルの位置決めは、MEA上で細胞を直接インビトロ培養することによって、または、MEA上に適切な厚さの生体サンプルスライスを置くことによって、行われ得る。

0033

電極表面上のレーザーの集束は、自動でまたは手動で行なわれ得る。

0034

典型的な実施形態によると、電極の表面は平面である。

0035

さらに典型的な実施形態によると、電極は、金属、特に白金または金である前記表面を、少なくとも部分的に含む。

0036

金はレーザー励起のための優れた光学カップリングを提供する。

0037

しかしながら白金が望ましい、というのも、白金は一般に、心臓学および電気生理学の分野でよく確立されているからである。白金の表面は、高度のナノスケールの多孔性を備えた構成を有し、多孔性物質の体積における空間の割合が通常30%と70%との間の範囲にある。この表面形態から直接由来する、2つの特すべき好ましい効果がある。一方は、電極の表面における細胞の接着が、既に文献にて実証されている通り、非常に改善されている。他方では、表面はナノ間隙およびナノ端部を呈し、ここではレーザーによって作り出された電界が局所化され且つ増幅される。これらの2つの要因の組み合わせが、細胞膜のポレーション、およびその後のレーザー励起による細胞内記録に対して妥当である。

0038

改良に従い、電極の表面は100nmと500nmとの間の範囲で厚さを増す多孔性を有する。特に、電極の表面は、約400nmの厚さの不規則な突起を備えるように成長する。

0039

典型的な実施形態では、電極の表面は、入射光波長より小さなサイズの、好ましくは10nmと300nmとの間の範囲にある、空間または気孔を備える材料を有する。多孔性物質の体積における空間の割合は、30%と70%との間の範囲にある。

0040

ある実施形態では、配列の位置決め工程は光学顕微鏡下で提供され、この光学顕微鏡には第1のレーザー励起光経路および第2の光学画像取得経路が提供されている。

0041

光学経路の存在は、電極上の細胞を観察することと、ポレーションに使用されるレーザーを正確に集束させることとを可能にする。

0042

さらなる実施形態では、全体の配列から細胞外活動電位を記録する工程が提供される。

0043

このことは、活動電位の細胞外および細胞内の両方の記録を取得することを可能にする。

0044

好ましい例示的な実施形態によれば、電極の表面は、突起を作成するために、特別に且つ巧妙に製造されるべき三次元のナノ構造を持たない。

0045

上に明記される通り、この特徴は、作成が非常に高価であり、且つ、市販の装置に容易に統合できない、3Dナノ構造の製造を回避することを可能にする。さらに、3Dナノ構造は、様々な方法で細胞、特に機械的な収縮を伴う心臓細胞、に影響を与え得る;その結果、3Dナノ構造を備えた細胞内電位および細胞外電位の記録は、極めて侵襲的となる。

0046

本発明の別の目的は、さらに、起電性細胞中の細胞内活動電位を記録するための装置であり、その装置は、前記細胞を含むサンプルを支援するのに適切なマルチ電極アレイ(MEA)と、レーザーソースと、アレイ電極の表面上のレーザービーム集束手段と、サンプルの細胞の膜の局所的機能不全を有効にするための、1以上のアレイ電極に1以上のレーザーパルスを印加するためのレーザーソース駆動手段と、電極によって検知される細胞活動電位記録手段とを含み、ここで、前記電極の表面は多孔質である。

0047

例示的な実施形態では、電極の表面は平面である。

0048

例示的な実施形態では、電極は、少なくとも前記表面を含む部分においては、白金または金で作られている。

0049

例示的な実施形態では、電極の表面には100nmと500nmとの間の範囲で厚さを増す多孔性を有する。

0050

例示的な実施形態では、レーザーソース、レーザービーム集束手段、および、レーザーソース駆動手段は、光学顕微鏡の一部であり、その光学顕微鏡には、第1のレーザー励起光学経路および第2の光学画像取得経路が提供されている。

0051

例示的な実施形態では、電極の表面は、突起を作成するために、特別に且つ巧妙に製造されるべき三次元のナノ構造を持たない。

図面の簡単な説明

0052

本発明の、これらのおよびその他の特徴と利点は、付属の図面にて示される、非限定的な例示的な実施形態の以下の説明から明らかになるだろう:
方法のスキームを示す。
装置の略図を示す。
細胞が接着した状態の、電極の表面の異なる詳細についての図を示す。
細胞が接着した状態の、電極の表面の異なる詳細についての図を示す。
活動電位の記録を示す。

実施例

0053

図1では、本発明の目的である、起電性細胞(4)における活動電位の記録方法ブロック図が示される。

0054

細胞(4)は、MEA装置(2)、例えばCMOS−MEA、のインビトロで育てられ(100)培養される(110)。

0055

あるいは、10ミクロンと500ミクロンの間の範囲にある厚さを備えた生体サンプルのスライスが、MEA上に置かれ得る(101)。スライスは、網膜、脳スライスまたは他の組織のスライスであり得る。この場合、組織スライスの灌流(111)が、細胞外および細胞内の電位記録の実験中に行われる。

0056

電極(20)のレーザー励起については、MEA装置(2)が、第1のレーザー励起光学経路と第2の光学画像取得経路が設けられた光学顕微鏡の下に搭載される(12)。

0057

あるいは、集束レンズを備えたレーザーソース(32)が、MEAシステムの上に搭載される。この構成は、顕微鏡の必要を排除し、自動化を必要とする産業用途理想的である。

0058

随意に、細胞外記録(13)が行われる。

0059

そして、レーザーはMEA装置(2)の電極の表面上に集束され(14)、その表面は細胞(4)と接触する。集束は、手動または自動であり得る。

0060

レーザーパルスが、細胞オプトポレーションを実施するために、MEA装置(2)の1以上の電極(20)に印加される(15)。

0061

最後に、細胞内活動電位が記録される(16)。

0062

記録手順は、ナノスケールレベルで、高い表面多孔質の電極(20)を有するMEA装置(2)上で実施される。

0063

図2に示されるように、MEA装置(2)は、電極(20)、特に記録システム(21)、によって検知される細胞内活動電位記録手段に接続される。

0064

レーザー励磁は、レーザーソース(32)に接続された光学用レンズ(3)によって実施される。光学用レンズは、随意に、細胞培地直接挿入され得る。レーザー励起は、1064nmの波長を備えた8psのパルスレーザーを使用して実施される。

0065

CCD/CMOSカメラ(33)を使用して、レーザーは、MEA装置(2)の電極(20)の多孔質表面に、自動でまたは手動で、集束される。取得システム(21)が完全なMEA装置(2)から細胞外活動電位を記録する間に、電極(20)に接着している細胞膜を局所的に破壊するために、レーザーパルス列が1以上の電極(20)に印加される。その後、これらの電極(20)は、細胞内活動電位を記録する。

0066

レーザーは、手動で向きを変えられ、単一の電極(20)に集束され得る。あるいは、スキャンシステムが、MEA装置(2)のすべての電極(20)からの、細胞内活動電位を記録するために使用され得る。

0067

図2の例で、装置は、記録システムMEA(21)、多孔質表面を備えた電極(20)が設けられたMEA装置(2)、光学システム(3)、レーザーソース(32)、データを取得しレーザーを電極(20)上に集束させるためのコンピュータ(34)を含む。

0068

使用可能なMEA装置(2)の一例は、サイズが21×21μm2で、電極間の距離が21μmの、4096の記録電極(20)を装備したCMOS−MEAである。

0069

システムは、心筋細胞の活動電位を記録するために有利に使用され得る。ニューロンなどの他の起電性細胞より大きい、心筋細胞の典型的なサイズを考慮すると、電極の前述のサイズは、一細胞解像度の記録(single cell resolution recording)を可能にする。電極は、サイズ2.6×2.6mm2の作用面積カバーする、64×64のアレイに配置される。

0070

方法の1つの例示的な実施形態では、レーザー励起は、細胞培地に直接挿入された60×の液浸レンズを使用して実施された。レーザーによる細胞膜の局所的な機能不全化は、8psのパルスレーザーおよび1064nmの波長を使用して実施された。

0071

図3と、より詳細な図4は、電極(20)および、電極(20)の上表面に接触している起電性細胞(4)の横断面図を示す。電極(20)は、好ましくは白金である。白金の表面は、ナノスケール粗さが大きい、多孔性物質の典型的な構成を有する。2日間のインビトロ培養後の細胞は、電極(20)の多孔質表面に密接に結合している:図は、細胞と白金との間に強い結合があり、この密接な接着は連続的であり、細胞と電極との間の接触面全体に広がっていることを示す。約400nmの厚さの不規則な突起と共に成長する、白金表面層プロファイルを観察することが可能である。

0072

図5は、CMOS−MEA電極からの心筋細胞の活動電位の記録を表わす略図を示す。左側には、支配的な逆相によって認識し得る、5つの細胞外活動電位がある。これらの5つのピークの後、電極のレーザー照射が印加される。その後に続く活動電位は、完全に異なる形状を有する:ここでは正相が支配的であり、振幅ははるかに大きい。レーザー照射後のピークの形状は、文献に説明される細胞内活動電位のピークの形状を正確に再生している。

0073

ポレーション効果に起因する、白金表面の多孔性によって果たされる重要な役割が、実験とシミュレーションの両方で評価された。

0074

細胞内活動電位を記録する実験が、多孔質の白金層または滑らかな白金層、を含む電極を備えたCMOS−MEA上で、平行して実施された。細胞は両タイプの装置に置かれ、同日に記録が実施された。多孔性表面を備えた電極のレーザー励起は、数mW(〜0.5−2mW)のレーザー電力を使用する細胞内記録をもたらした。滑らかな電極を備えたCMOS−MEAでは、ピークの変化を観察すること無く30mWまでのレーザー電力を使用し、細胞外特性を維持した。さらに、平面的な電極上での高電力によるレーザー励起ですら、細胞およびそれらの電気的活動頻度に対して、その他の影響を生じなかった。レーザーを介した細胞内記録のプロセスにおいて、白金の多孔質表面が果たす基本的な役割を評価することに加え、この実験は2つ目の重要な結果も有す。実際、多孔質の白金層の影響以外では、高速パルスレーザーを使用する細胞の直接照射は、著しく高電力なレベルであっても、細胞活動に悪影響を及ぼさないことが確認されている。これは、実験で使用されるレーザーの特性に起因し、特に超短レーザーパルスおよび著しく低い作業サイクル(0.064%のオンオフ)による。

0075

実験と平行して、滑らかで多孔質の白金上における、レーザー照射の影響を評価するために、シミュレーションが実施された。シミュレーションは、電界がレーザーの集束点で均等に分けられている時には、滑らかな白金表面の場合と比較して、多孔質の白金の場合の電界が、大幅に高い値に達することを実証している。

0076

単一の8ピコ秒のレーザーパルスの間の、瞬間的な熱挙動もシミュレーションされた;多孔質表面の結果、および0.5から5mWの間の範囲にあるレーザー電力の結果は、表面温度が、たった5−10℃だけ増加することを示す。さらに重要なのは、次のレーザーパルスを開始する前に、温度が平衡値に非常に急速に落ちるため、完全なレーザーパルス列における熱の蓄積は無視できる程度であることを説明していることである。温度勾配は、約10ナノ秒時間枠に制限され、それはTRPチャネルの一般的な反応時間よりもはるかに低い。

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