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図面 (13)

課題・解決手段

80〜20重量%のブルーベリー(Vaccinium cyanococcus)種、ビルベリー(Vaccinium myrtillis)種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリーと;20〜80重量%のスピサスモモ(Prunus spinosa)種のスローベリーとの混合物ポリフェノール富む抽出物を含む、下痢症治療のための組成物が提供される。その他の組成物、ならびに下痢症治療のための組成物の作製方法および使用方法が開示される。

概要

背景

下痢症は、世界の大きな社会経済上および医療上の負担となっている。世界保健機関(WHO)は、下痢症が5未満の小児死因の第2位であることを報告している。毎年、5歳未満の小児約525,000人が下痢死亡し、毎年17億例の小児下痢症が認められている(2019年3月19日にアクセスしたWHO公表https://www.who.int/news−room/fact−sheets/detail/diarrhoeal−disease)。

現在市販されている特化した止瀉治療薬は少なく、安全で有効な止瀉薬の開発という満たされていない必要性が存在する。

概要

80〜20重量%のブルーベリー(Vaccinium cyanococcus)種、ビルベリー(Vaccinium myrtillis)種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリーと;20〜80重量%のスピサスモモ(Prunus spinosa)種のスローベリーとの混合物ポリフェノール富む抽出物を含む、下痢症治療のための組成物が提供される。その他の組成物、ならびに下痢症治療のための組成物の作製方法および使用方法が開示される。なし

目的

(いくつかの実施形態の簡単な説明)
一実施形態は、
a)80〜20重量%のブルーベリー(Vaccinium cyanococcus)種、ビルベリー(Vaccinium myrtillis)種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリーと;
b)20〜80重量%のスピノサスモモ(Prunus spinosa)種のスローベリーと
の混合物のポリフェノールに富む抽出物を含む、下痢症治療のための組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

a)80〜20重量%のブルーベリー(Vacciniumcyanococcus)種、ビルベリー(Vacciniummyrtillis)種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリーと、b)20〜80重量%のスピサスモモ(Prunusspinosa)種のスローベリーとの混合物ポリフェノール富む抽出物を含む、下痢症治療のための組成物

請求項2

前記混合物が、c)ブラックチョークベリー(Aroniamelanocarpa)種のチョークベリーをさらに含む、請求項1または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項3

前記混合物が、70〜30重量%のブルーベリーまたはビルベリーを含む、請求項1または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項4

前記混合物が、60〜40重量%のブルーベリーまたはビルベリーを含む、請求項1または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項5

前記混合物が、50:50の重量比のブルーベリーまたはビルベリーとスローベリーとを含む、請求項1または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項6

前記混合物中の前記ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリーのうちの1つまたは複数のものが粉末の形態である、請求項1または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項7

前記混合物中の前記ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリーのうちの1つまたは複数のものが凍結乾燥粉末の形態である、請求項1または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項8

ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークバリー(chokebarry)のうちの1つまたは複数のものが、生鮮ベリー、冷凍ベリー、乾燥ベリー、もしくは凍結乾燥ベリー、またはその組合せの形態である、請求項1または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項9

前記抽出物が、40℃未満の温度で実施したエタノール抽出物である、請求項1または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項10

シアニジンデルフィニジン没食子酸エピカテキン、または没食子酸エピガロカテキンのうちの1つまたは複数のものを含む、請求項1または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項11

薬学的に許容される担体または添加剤をさらに含む、請求項1または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項12

ポリフェノールに富む抽出物を作製する方法であって、1.50〜70%のアルコールとブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリーとを混合して混合物を形成することと、2.前記混合物を室温で1時間〜90日間の範囲の時間にわたって、毎日回転させながらインキュベートして、インキュベートした混合物を形成することと、3.インキュベートした前記混合物から固形物をろ過または遠心分離し、インキュベートした前記混合物のフロースルー収集することと、4.任意選択で、段階3の前記フロースルーとベリー粉末とを混ぜ合わせて、第二の混合物を形成することと、5.任意選択で、前記第二の混合物を室温で1〜3時間インキュベートして、第二のインキュベートした混合物を形成することと、6.任意選択で、前記第二のインキュベートした混合物から固形物をろ過または遠心分離し、上清を収集することと、7.段階3の前記フロースルーまたは段階4の前記上清から真空下、40℃以下の温度で、20%以下などの所望のアルコール濃度までアルコールを蒸発させて、前記ポリフェノールに富む抽出物を形成することとを含む、方法。

請求項13

シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、もしくは没食子酸エピガロカテキン、その塩もしくはそのグリコシラートをそれぞれ少なくとも0.2重量%と、薬学的に許容される担体または添加剤とを含む、下痢症治療のための組成物。

請求項14

シアニジン:デルフィニジン:没食子酸エピカテキン:没食子酸エピガロカテキンの重量比が、300〜700:100〜30:0.5〜2:200〜50である、請求項13または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項15

前記シアニジン:デルフィニジン:没食子酸エピカテキン:没食子酸エピガロカテキンの重量比が、400〜600:90〜50:0.75〜1.5:175〜100である、請求項13または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項16

前記シアニジン:デルフィニジン:没食子酸エピカテキン:没食子酸エピガロカテキンの重量比が、500:70:1:150である、請求項13または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項17

前記エピカテキン、エピガロカテキン、シアニジン、およびデルフィニジンがそれぞれ独立に、グリコシル化型、L−ラムノース、D−グルコースグルコラムノースガラクトースフルクトース、もしくはアラビノース型、アグリコン型結晶化型、水溶液アルコール溶液、塩、塩化物塩没食子酸塩、またはその組合せであり得る、請求項13または特許請求の範囲の任意の請求項に記載の組成物。

請求項18

下痢症に罹患している対象を治療する方法であって、請求項1もしくは13、または特許請求の範囲の他の任意の請求項に記載の組成物を前記対象に投与して前記対象を治療することを含む、方法。

技術分野

0001

(関連出願)
本願は、2018年3月23日に出願された米国特許出願第62/647,622号の利益を主張するものであり、上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

0002

(発明の分野)
本発明は、下痢症治療のための組成物およびその下痢症治療への使用方法に関する。特定の組成物は、ポリフェノール富むベリー抽出物と、特定のポリフェノールの混合物とを含む。組成物の作製方法についても記載する。

背景技術

0003

下痢症は、世界の大きな社会経済上および医療上の負担となっている。世界保健機関(WHO)は、下痢症が5未満の小児死因の第2位であることを報告している。毎年、5歳未満の小児約525,000人が下痢死亡し、毎年17億例の小児下痢症が認められている(2019年3月19日にアクセスしたWHO公表https://www.who.int/news−room/fact−sheets/detail/diarrhoeal−disease)。

0004

現在市販されている特化した止瀉治療薬は少なく、安全で有効な止瀉薬の開発という満たされていない必要性が存在する。

図面の簡単な説明

0005

ポリフェノールに富む抽出物がCTxによって誘発される液体貯留を有意に用量依存性に減少させることを示すデータを示す図である。
ポリフェノールに富む抽出物がCTxによって誘発される液体貯留を有意に用量依存性に減少させることを示すデータを示す図である。
ポリフェノールに富む抽出物がCTxによって誘発される液体貯留を有意に用量依存性に減少させることはなかったことを示すデータを示す図である。
ポリフェノールに富む抽出物がCTxによって誘発される液体貯留を有意に用量依存性に減少させることはなかったことを示すデータを示す図である。
加水分解の前および後の特定のモノマー含有量を示す質量分光測定実験の結果を示すデータを示す図である。
加水分解の前および後の特定のモノマーの含有量を示す質量分光測定実験の結果を示すデータを示す図である。
加水分解の前および後の特定のモノマーの含有量を示す質量分光測定実験の結果を示すデータを示す図である。
加水分解の前および後の特定のモノマーの含有量を示す質量分光測定実験の結果を示すデータを示す図である。
試験のポリフェノールのIC50データを示す図である。
本試験のポリフェノールのIC50データを示す図である。
本試験のポリフェノールのIC50データを示す図である。
本試験のポリフェノールのIC50データを示す図である。
マウス腸のCTx誘発性液体分泌に対して相乗的阻害効果を示し、貯留液体の質量(平均貯留質量)を25%減少させる例示的組成物を示すデータを示す図である。

0006

(いくつかの実施形態の簡単な説明)
一実施形態は、
a)80〜20重量%のブルーベリー(Vaccinium cyanococcus)種、ビルベリー(Vaccinium myrtillis)種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリーと;
b)20〜80重量%のスピサスモモ(Prunus spinosa)種のスローベリーと
の混合物のポリフェノールに富む抽出物を含む、下痢症治療のための組成物を提供する。

0007

別の実施形態は、ポリフェノールに富む抽出物を作製する方法であって、
1.50〜70%のアルコールとブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリーとを混合して、混合物を形成することと;
2.混合物を室温で1時間〜90日間の範囲の時間にわたって、毎日回転させながらインキュベートして、インキュベートした混合物を形成することと;
3.インキュベートした混合物から固形物をろ過または遠心分離し、インキュベートした混合物のフロースルー収集することと;
4.任意選択で、段階3のフロースルーとベリー粉末とを混ぜ合わせて、第二の混合物を形成することと;
5.任意選択で、第二の混合物を室温で1〜3時間インキュベートして、第二のインキュベートした混合物を形成することと;
6.任意選択で、第二のインキュベートした混合物から固形物をろ過または遠心分離し、上清を収集することと;
7.段階3のフロースルーまたは段階4の上清から真空下、40℃以下の温度で、20%以下などの所望のアルコール濃度までアルコールを蒸発させて、ポリフェノールに富む抽出物を形成することと
を含む、方法を提供する。

0008

別の実施形態は、シアニジンデルフィニジン没食子酸エピカテキンもしくは没食子酸エピガロカテキン、またはその塩もしくはそのグリコシラートをそれぞれ少なくとも0.2重量%と;薬学的に許容される担体または添加剤とを含む、下痢症治療のための組成物を提供する。

0009

別の実施形態は、下痢症に罹患している対象を治療する方法であって、本明細書に記載されるいずれかの組成物を対象に投与して、前記対象を治療することを含む、方法を提供する。

実施例

0010

(いくつかの実施形態の詳細な説明)
一実施形態は、a)ブルーベリー(別名ビルベリー)、例えば、ブルーベリー(Vaccinium cyanococcus)、ビルベリー(Vaccinium myrtillis)種、もしくはその両方;b)スローベリー、例えばスピノサスモモ(Prunus spinosa)種;および/またはc)チョークベリー(Aronia melanocarpa)種の混合物を含む、ポリフェノールに富む抽出物を提供する。

0011

一実施形態は、エピカテキンと;エピガロカテキンと;シアニジンと;デルフィニジンとの混合物を含む、組成物を提供する。エピカテキン、エピガロカテキン、シアニジン、およびデルフィニジンはそれぞれ独立に、任意の形態、例えば、グリコシル化型(すなわち、L−ラムノース、D−グルコースグルコラムノースガラクトースフルクトース、もしくはアラビノース)もしくはアグリコン型結晶化型;水溶液アルコール溶液塩化物塩没食子酸塩などの塩;またはその組合せであり得る。

0012

一実施形態は、下痢症に罹患している対象を治療する方法であって、下痢症、例えばコレラ旅行者下痢症、大腸菌(E.coli)性下痢症、コレラ菌(Vibrio cholera)およびその他のビブリオ菌による下痢症、ディフィシル菌(Clostridium difficile)性下痢、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)性下痢症、ロトウイルス(Rotovirus)性下痢症、アデノウィルス性下痢症、パルボウイルス性下痢症、ノーウォークウイルスノロウイルス)性下痢症、ジアルジア性下痢症、アストロウイルス性下痢症、カリシウイルス性下痢症、赤痢菌性下痢症、サルモネラ菌性下痢症、ブドウ球菌性カンピロバクター性、エルシニア性、エロモナス性、シュードモナス性、トロウイルス性コロナウイルス性、ピコビルナウイルス性、ペスチウイルス性、AIDS関連下痢;炎症性腸疾患クローン病過敏性腸症候群などの炎症性下痢障害などに罹患している対象に上記のいずれかの組成物を投与することを含む、方法を提供する。下痢は、毒素、例えばコレラ毒素熱安定性エンテロトキシン熱不安定性エンテロトキシン、志賀毒素細胞毒素などによって誘発される、または悪化するものであり得る。一実施形態では、下痢症は、コレラ毒素によって誘発される、または悪化する、コレラである。

0013

一実施形態は、予め混合し凍結乾燥したブルーベリー(別名ビルベリー)、スローベリー、またはチョークベリー粉末からポリフェノールを抽出する方法を提供し、ここでは、各ベリー粉末の質量分率は独立に1%から99%まで様々であり得;抽出に使用するアルコールは濃度0%〜99%のエチルアルコールであり;さらに、得られた抽出物からアルコールを除去し、アルコールは、液体の状態であっても、薄膜乾燥などの適切な方法によって乾燥させてもよく;抽出、アルコール除去、および脱水を光から保護しながら実施し;いずれの段階も摂氏40度を超えない温度で実施する。

0014

一実施形態では、抽出を以下の通りに実施し得る:
1.50〜70%のアルコール(エチルアルコール)とベリー混合物、例えば、生鮮または冷凍ブルーベリーとスローベリーの混合物とを所望のw/w比で混合する。あるいは、50〜70%のアルコール(エチルアルコール)と乾燥ベリー、粉末化ベリー、または凍結乾燥ベリー粉末混合物、例えばブルーベリーとスローベリーの混合物とを所望のw/w比で混合する。
2.室温で1時間〜90日間、毎日回転させながらインキュベートする。
3.固形物をろ過または遠心分離で除去し、フロースルーを収集する。
4.任意選択で、段階3のフロースルーと凍結乾燥ベリー粉末などのベリー粉末とを、段階3のフロースルー10mlに対して所望のw/v比のグラム数の粉末とを混ぜ合わせる。
5.室温で1〜3時間インキュベートする。
6.固形物をろ過し、上清を収集する。
7.真空下でアルコールを蒸発させる。蒸発させている間、上清の温度が40℃を超えてはいけない。アルコール濃度が5%未満に減少するまで蒸発を継続する。
8.任意選択で、ポリフェノール含有量を測定し、粉末の量、蒸発時間を変化させることによってそれを所望のもの(例えば、15mg/ml)に調節して、得られるポリフェノールに富む抽出物を調製する。

0015

別の実施形態では、抽出を以下の通りに実施し得る:
1.50〜70%のアルコール(エチルアルコール)とスローベリーとを1:1のw/w比で混合する。
2.室温で1時間〜90日間、毎日回転させながらインキュベートする。
3.固形物をろ過または遠心分離で除去し、フロースルーを収集する。
4.フロースルーと、段階3のフロースルー10mlに対して3:10のw/v比のグラム数の粉末で加えたブルーベリー粉末とを混ぜ合わせる。
5.室温で2時間インキュベートする。
6.固形物をろ過し、上清を収集する。
7.真空下でアルコールを蒸発させる。蒸発させている間、上清の温度が40℃を超えてはいけない。アルコール濃度が5%未満に減少するまで蒸発を継続する。
8.任意選択で、ポリフェノール含有量を測定し、必要に応じて粉末の量、蒸発時間を変化させることによってそれを所望のもの(例えば、15mg/ml)に調節して、得られるポリフェノールに富む抽出物を調製する。

0016

別の実施形態では、抽出を以下の通りに実施し得る:
1.50%のアルコール(好ましくはテンサイアルコール)とスローベリーとを1:1のw/w比で混合する。
2.90日間、毎日回転させながらインキュベートする。
3.固形物をろ過して除去し、フロースルーを収集する。
4.フロースルーとブルーベリー粉末とを3:10のw/w比で混合する
5.段階3のフロースルー10mlに対するグラム数の粉末。
6.室温で2時間インキュベートする。
7.固形物をろ過し、上清を収集する。
8.真空下でアルコールを蒸発させる。蒸発させている間、上清の温度が40℃を超えてはいけない。アルコール濃度が5%未満に減少するまで蒸発を継続する。
9.ポリフェノール含有量を測定し、粉末の量、蒸発時間を変化させることによってそれを所望のもの(例えば、15mg/ml)に調節して、得られるポリフェノールに富む抽出物を調製する。

0017

ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリー(粉末または生鮮/冷凍などを問わず)と混合するアルコールの濃度は特に限定されないが、50〜70%アルコール水溶液が望ましい。この範囲には、50%、55%、60%、65%、および70%を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲のアルコール(水溶液)が含まれる。または、いくつかの場合には、100〜140「プルーフ」のアルコール。アルコールは、製薬用途、食品および医薬グレード用途、およびそれと同等のものに適したものが好ましいが、必要条件であるというわけではない。アルコールは、必要に応じて、有機認証を受けたものであり得る。例としては、エチルアルコール、植物性アルコール、テンサイアルコール、またはその組合せが挙げられる。

0018

諸実施形態では、組成物は独立に、80〜20重量%のブルーベリー(Vaccinium cyanococcus)種、ビルベリー(Vaccinium myrtillis)種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリーを含む。この範囲には、ポリフェノールに富む抽出物の重量に基づく80重量%、75重量%、70重量%、65重量%、60重量%、55重量%、50重量%、45重量%、40重量%、35重量%、30重量%、25重量%、および20重量%、またはその中の任意の範囲を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。

0019

諸実施形態では、組成物は独立に、80〜20重量%のブルーベリー(Vaccinium cyanococcus)種、ビルベリー(Vaccinium myrtillis)種、またはその両方のブルーベリーを含む。この範囲には、ポリフェノールに富む抽出物の重量に基づく80重量%、75重量%、70重量%、65重量%、60重量%、55重量%、50重量%、45重量%、40重量%、35重量%、30重量%、25重量%、および20重量%、またはその中の任意の範囲を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。

0020

諸実施形態では、組成物は独立に、20〜80重量%のスピノサスモモ(Prunus spinosa)種のスローベリーを含む。この範囲には、ポリフェノールに富む抽出物の重量に基づく20重量%、25重量%、30重量%、35重量%、40重量%、45重量%、50重量%、55重量%、60重量%、65重量%、70重量%、75重量%、および80重量%、またはその中の任意の範囲を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。

0021

諸実施形態では、組成物は、80〜20重量%のブルーベリー(Vaccinium cyanococcus)種、ビルベリー(Vaccinium myrtillis)種、またはその両方のブルーベリーまたはビルベリー;および20〜80重量%のスピノサスモモ(Prunus spinosa)種のスローベリーを含む。ここでは、これらの範囲にはそれぞれ、本明細書の他の箇所に記載される通り、あらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。

0022

諸実施形態では、組成物は、ブラックチョークベリー(Aronia melanocarpa)種のチョークベリーをさらに含み得る。チョークベリーは必要に応じて、0.1〜40重量%で存在し得る。この範囲には、ポリフェノールに富む抽出物の重量に基づく0.1重量%、0.5重量%、1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、10重量%、15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、35重量%、および40重量%を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。

0023

例えば、混合物(または抽出物)は、70〜30重量%(または70重量%、60重量%、50重量%、40重量%、30重量%)のブルーベリーもしくはビルベリー;60〜40重量%(または60重量%、50重量%、40重量%)のブルーベリーもしくはビルベリー;または重量比50:50のブルーベリーもしくはビルベリーとスローベリーを含み得る。

0024

他の実施形態では、ポリフェノールに富む抽出物また混合物中のブルーベリーもしくはビルベリー:スローベリーの重量比は、80〜20:20〜80の範囲であり、それぞれの範囲には、あらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。例えば、80:20、21、22、24、26、28、30、34、40、42、44、46、50、52、54、60、68、70、72、76、80:20の比が企図される。

0025

諸実施形態では、混合物中のベリー、例えば、ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またチョークベリーは、ベリー粉末(粉末化ベリー)、凍結乾燥粉末、またはその組合せの形態である。

0026

諸実施形態では、混合物中のベリー、例えば、ブルーベリー、ビルベリー、スローベリー、またはチョークベリーは、生鮮ベリー、冷凍ベリー、乾燥ベリー、もしくは凍結乾燥ベリー、またはその組合せの形態である。

0027

アルコールとベリー混合物とを混合する1回目インキュベーションは、1時間〜90日間、好ましくは毎日回転させながら、振盪しながら、または攪拌しながら実施するのが望ましい。この時間の範囲には、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、18時間、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、20日間、40日間、50日間、60日間、70日間、80日間、90日間を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。

0028

アルコールとベリー混合物とを混合するインキュベーションは、室温または約25℃で実施するのが望ましい。

0029

アルコールとベリー混合物とを混合するインキュベーションは、暗所で、例えば、可視光にも紫外線にも曝露せずに実施するのが望ましい。

0030

1回目のインキュベーションの後、固形物をろ過または遠心分離により分離してよく;フロースルーを収集する。諸実施形態では、追加の粉末を加えることを望むのでない限り、この段階で抽出物をポリフェノールに富む抽出物とすることができる。

0031

あるいは、上記のフロースルーをさらに、凍結乾燥ベリー粉末などのベリー粉末と所望のw/v比で混ぜ合わせることができる。例えば、フロースルーにベリー粉末をフロースルーのml数に対して1〜5:10のw/v比のグラム数の粉末に相当する量で加え得る。この範囲には、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、および5:10のw/vを含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。これに対応する量を所望の生産量に合わせてスケールアップし得ることは明らかである。

0032

追加のベリー粉末を加える場合、必要に応じて、1〜3時間にわたる2回目のインキュベーションを室温で実施し得る。その後、固形物をろ過または遠心分離により収集し、上清を収集する。

0033

1回目または2回目のインキュベーションの後、真空下でアルコールを蒸発させる。蒸発させている間、上清の温度が40℃を超えてはいけない。アルコール濃度が20%、15%、10%、または5%未満に減少するまで蒸発を継続する。

0034

ポリフェノールに富む抽出物のポリフェノール濃度を本明細書に記載される通りに測定し得る。その濃度を所望に応じて、添加、希釈、またはさらなる蒸発によって調節し得る。例えば、ポリフェノールに富む抽出物のポリフェノール含有量は、0.2〜60mg/mlの範囲内にあるのが適切であり得、この範囲には、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、および60mg/mlを含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。

0035

諸実施形態では、ポリフェノールに富む抽出物は、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、もしくは没食子酸エピガロカテキン、その塩、そのグリコシラート、またはその組合せのうちの1つまたは複数のものを含む。諸実施形態では、ポリフェノールに富む抽出物は、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキン、その塩、そのグリコシラート、またはその組合せをそれぞれ含む。

0036

一実施形態では、この方法は、ベリー粉末とエタノールとを接触させ、40℃で一定時間インキュベートし、次いで、40℃、約40〜50mbarで真空蒸留によりアルコールを除去して、固体のポリフェノールに富む抽出物になるまで蒸発させることを含む。

0037

本発明者らは、天然の安全で効果的な止瀉化合物作出することを目的に、一般的な食用ベリー種の組合せに由来するポリフェノール抽出物分泌性下痢症を打ち消す能力を試験した。

0038

この組合せには、ブルーベリー(Vaccinium cyanococcus)とビルベリー(Vaccinium myrtillis)植物種のブルーベリー(一部の地域ではビルベリーとしても知られる)、スピノサスモモ(Prunus spinosa)植物種のスローベリー、および/またはブラックチョークベリー(Aronia melanocarpa)植物種のチョークベリーを含めた。上記のベリー種はいずれも、フラバン−3−オールおよびガロタンニンという化学物質類に由来するポリフェノールの豊富な天然源である。本発明者らの試験は、腸分泌阻害に適用可能な抽出物の潜在的有益性を明らかにすることに焦点を当てたものである。

0039

諸実施形態では、シアニジン重量%、デルフィニジン重量%、没食子酸エピカテキン重量%、または没食子酸エピガロカテキン重量%、その塩重量%、またはそのグリコシラートをそれぞれ少なくとも0.2重量%;および薬学的に許容される担体または添加剤を含む、下痢症治療のための組成物が提供される。この範囲には、シアニジン重量%、デルフィニジン重量%、没食子酸エピカテキン重量%、または没食子酸エピガロカテキン重量%、その塩重量%、またはそのグリコシラートそれぞれについて独立に、0.2重量%、0.4重量%、0.6重量%、0.8重量%、1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%、15重量%、20重量%、22重量%、25重量%、27重量%、30重量%、33重量%、35重量%、37重量%、39重量%、40重量%、44重量%、45重量%、50重量%、55重量%、60重量%、65重量%、70重量%、75重量%、80重量%、85重量%、90重量%、95重量%、98重量%、99重量%、99.1重量%、および99.4重量%を含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。

0040

諸実施形態では、組成物は、シアニジン:デルフィニジン:没食子酸エピカテキン:没食子酸エピガロカテキンが、300〜700:100〜30:0.5〜2:200〜50という重量比を有し得る。これらの範囲には、300,350,400,450,500,550,600,650,700:100,90,80,70,60,50,40,30:0.5,0.7,0.9,1,1.5,2:200,175,150,125,100,75,50を含めた各数値およびその間の部分範囲がすべて含まれる。

0041

一実施形態では、シアニジン:デルフィニジン:没食子酸エピカテキン:没食子酸エピガロカテキンの重量比は、400〜600:90〜50:0.75〜1.5:175〜100である。

0042

別の実施形態では、シアニジン:デルフィニジン:没食子酸エピカテキン:没食子酸エピガロカテキンの重量比は、500:70:1:150である。

0043

ここでは、シアニジン:デルフィニジン:没食子酸エピカテキン:没食子酸エピガロカテキンの重量比は、塩、グリコシル化型、またはその組合せのうちのいずれか1つまたは複数のものにも当てはまるものと考える。

0044

エピカテキン、エピガロカテキン、シアニジン、およびデルフィニジンはいずれも独立に、グリコシル化型、L−ラムノース、D−グルコース、グルコラムノース、ガラクトース、フルクトース、もしくはアラビノース型、アグリコン型、結晶化型、水溶液、アルコール溶液、塩、塩化物塩、没食子酸塩、またはその組合せであり得る。

0045

好ましい投与経路は経口であるが、経直腸下、もしくはバッカル、またはその組合せを含めた他の投与経路も企図される。提案される投与スケジュールは、1日当たり3〜4回である。

0046

適応症には、分泌成分が疾患の原因の一部としてみられる任意の下痢障害が含まれる。考えられる対象は、小児集団を含めたあらゆる年齢群のヒトおよび非ヒト動物である。疾患スペクトラムには、下痢の原因物質であるコレラ毒素の投与による実験で例示する細菌性、ウイルス性、または寄生虫性の感染性下痢がある。さらに、炎症性腸疾患、クローン病、および過敏性腸症候群などの炎症性下痢症にも抽出物での治療により臨床的利益がもたらされ得る。

0047

抽出物は、純粋な形態で投与してもよく、あるいは、水、グリセロール、およびその他の添加剤、例えば保存剤(すなわち、安息香酸ナトリウムソルビン酸カリウム、およびその他の許容される等価物);味覚物質(糖、すなわち、ソルビトールエリスリトール、グルコース、フルクトースなど;他の植物(すなわち、チェリー、オレンジイチゴなど)の抽出物;グアーガムキサンタンガムメチルセルロース)などの粘度調整剤、および製薬分野の現時点での基準に合うその他の添加剤などと混合することによって経口液剤にさらに製剤化することも可能である。

0048

(実施例)
以下の実施例は、説明を目的とし、本発明の有益性の一部をさらに理解するために記載するものであって、特に明記されない限り、限定的なものではない。

0049

ポリフェノールを溶出および抽出することがわかっている一般的な溶媒を複数用いて抽出実験を実施した。本発明者らは、抽出剤として、アセトンメタノール、エタノール、および水、ならびにその様々な組合せを試験した。生鮮、冷凍(StopandShop社、ハムデン、コネチカット州、米国)、または乾燥粉末果実(NutriSeed社、ロンドンイギリス)の形態のブルーベリーを購入した。DZ Licores(DZ Licores社、Dicsatillo、スペイン)からスローベリーおよび粉末を購入した。Amazon.com(Amazon社、シアトルワシントン州、米国)からチョークベリーを購入した。抽出後、よく特徴付けられたフォリンチオカルト(FC)比色法により混合物中の総ポリフェノール含有量を求めた。以下の2つの方法を用いたとき、ポリフェノールの収率が最も高かった。

0050

実施例1−方法A.
生鮮果実混合物または新鮮な状態で冷凍した果実混合物を96%テンサイアルコール(DZ Licores社)と50/50のv/v比で混ぜ合わせた。果実混合物は、予め重量を測定し、w/w比で50%のスローベリー、49%のブルーベリー、および1%のチョークベリーの組合せからなるものとした。アルコールを加えた後、抽出物混合物を定期的に攪拌しながら90日間、暗所でインキュベートし、次いで、液相を分離し収集した。抽出物から残留アルコールを除去し、水相総ポリフェノール濃度をFC法により試験した。反応に含まれる水は、生鮮果実および新鮮な状態で冷凍した果実の主要構成要素であり、果実の総重量の最大90%を占めることから、ベリーに由来するものであった。

0051

このような抽出方法により、混合物中の総ポリフェノール濃度が最大15mg/ml抽出物となった。

0052

収率に負の影響を及ぼす主な因子は、光への曝露、および混合物を摂氏40度超まで加熱することであることがわかった。

0053

アセトンまたはメタノールを用いて同様に抽出したところ、効率が低くなった。

0054

ポリフェノールの収率をさらに増大させるため、本発明者らは、抽出の限定要因がa)生鮮果実の水含有量およびb)反応でのエチルアルコールの具体的割合であるとの仮説を立てた。

0055

実施例2−方法B.
抽出反応での水分量の制御を改善するため、本発明者らは、乾燥粉末果実を使用することに戻った。全被験粉末のうち、凍結乾燥ベリーが抽出物中のポリフェノールの収率の点で優れていることが明らかになった。複数のw/w比のベリー粉末を試験し、全体的には50/50のw/w比のブルーベリーとスローベリーの粉末が最も効率が高いことがわかったが、各ベリーの重量パーセントは、得られた抽出物中のポリフェノール濃度をそれほど低下させずに5〜95%まで大幅に変化させることができる。含水エチルアルコール食品製造用)を95%アルコールから純水までの濃度範囲で抽出剤として使用した。ベリー粉末と抽出剤が1:3のv/v比になるよう抽出反応を設定した。暗所、室温にて常時攪拌しながら1〜2時間、反応を実施した。反応時間をさらに増大させたところ、反応効率逓減した。インキュベーション後、反応から液相を分離し、収集した。蒸発によりアルコールを液相から除去した。いずれの相でも反応温度が40℃を超えないよう制御した。ポリフェノール収率(mg/ml)をFC法により測定した。

0056

この抽出方法では、ポリフェノール濃度が30mg/ml抽出物まで大幅に増大した。アルコールの割合の増大に伴って抽出効率が増大し、50%〜70%v/vのアルコールでピークに達し、その後、効率が再び低下し始め、95%アルコールで最小値に達した。

0057

実施例3−ポリフェノール抽出物を用いたマウスモデル。抽出物をさらに、以下の通りに分泌性下痢のマウスモデルを用いた試験に供した:

0058

ブルーベリーとスローベリー凍結乾燥粉末の1:1w/w混合物を用いた方法Bで得た抽出物を、以下に記載する通りに腸分泌マウスモデルを用いた試験に供した。実験に使用した抽出物のバッチはいずれも、総ポリフェノール濃度15mg/mlに標準化したものであり、さらに「ポリフェノール抽出物」と呼ぶ。

0059

目的:コレラ毒素(CTx)で刺激した腸液分泌マウスモデルを用いてポリフェノール抽出物の抗分泌効果を評価する。
マウス:成体C57BL系統
マウスの体重を測定し、Avertin(Sigma−Aldrich社セントルイス、ミズーリ州、米国)(250mg/kgのIP誘導量、次いで、麻酔維持の必要に応じて30〜45分毎に2.6mg IP)で麻酔した。腹部を開いた。小腸および大腸の一部を確認した。近位空腸トライ靱帯の直下から始まる1.5〜3cmのループ結紮した。介在する1〜2cmの小腸によってループが隔てられるようにした。結紮後、近位のループにPBSリン酸緩衝生理食塩水)100μlを注入し(ループ1)、中央のループにCTxのPBS溶液100μlを注入し(ループ2)、遠位のループにCTxとポリフェノール抽出物(記載される通りに希釈したPP抽出物)のPBS溶液100μlを注入した(ループ3)。注入を実施したループを写真撮影し、慎重腹腔内に戻し、次いで、2回の縫合で腹部を閉じた。4〜6時間恒温放置した後、マウスを安楽死させ、小腸全体、盲腸、および上行横行結腸を単一標本として取り出した。ループを切り出し、脂肪切り取り、寸法および重量を測定した。

0060

結果:
A.1ループ当たりCTx 10μg(Sigma−Aldrich社)、(必要に応じてPBSまたはH2Oで)1:10部v/vに希釈したポリフェノール抽出物、計100μl、恒温放置4〜5時間、n=3
1.PBSはループ1から吸収され、外見上、空の腸の外観に戻った。重量/長さの比は3.77±0.66mg/mmであった
2.CTxで刺激したループ2は、明らかに液体で膨張していた。重量/長さの比は9.5±2.23mg/mmであった
3.CTxで刺激しポリフェノール抽出物で処置したループ3は、濃い紫色を呈し、ループ2よりもはるかに膨張が少なかった。長さは32mm、重量は0.1473gと測定された。重量/長さの比は5.33±0.70mg/mmであった

0061

多重比較に合わせて補正した一元配置ANOVAシダック検定を用いて統計解析を実施した。多重性調整p値をCTx処置群に対するPBS処置群(p=0.0074)、CTx+PP抽出物処置群に対するCTx処置群(p=0.0325)およびCTx+ポリフェノール抽出物処置群に対するPBS処置群(p=0.5276)について算出した。処置群はそれぞれN=3である(図1)。

0062

B.1ループ当たりCTx 1μg(Cayman chemical社、アナーバー、ミズーリ州、米国)、1ループ当たりポリフェノール抽出物1:100、総体積100μl、恒温放置5.5〜6時間、n=3
1.PBSはループ1から吸収され、外見上、空の腸の外観に戻った。重量/長さの比は3.128±0.190mg/mmであった
2.CTxで刺激したループ2は、明らかに液体で膨張していた。重量/長さの比は7.316±1.089mg/mmであった
3.CTxで刺激しポリフェノール抽出物で処置したループ3は、濃い紫色を呈し、ループ#2よりもはるかに膨張が少なかった。重量/長さの比は3.804±0.743mg/mmであった。

0063

多重比較に合わせて補正した一元配置ANOVAシダック検定を用いて統計解析を実施した。多重性調整p値をCTx処置群に対するPBS処置群(p=0.0011)およびCTx+ポリフェノール抽出物処置群に対するCTx処置群(p=0.0028)について算出した。処置群はそれぞれN=3である(図2)。

0064

C.1ループ当たりCTx 1μg、1ループ当たりポリフェノール抽出物1:1000、総体積100μl、恒温放置4〜6時間。
1.PBSはループ1から吸収され、外見上、空の腸の外観に戻った。重量/長さの比は3.515±0.994mg/mmであった
2.CTxで刺激したループ2は、明らかに液体で膨張していた。重量/長さの比は7.015±0.979mg/mmであった
3.CTxで刺激しポリフェノール抽出物で処置したループ3は、濃い紫色を呈し、ループ#2よりもはるかに膨張が少なかった。重量/長さの比は6.131±2.044mg/mmであった。

0065

多重比較に合わせて補正した一元配置ANOVAシダック検定を用いて統計解析を実施した。多重性調整p値をCTx処置群に対するPBS処置群(p=0.018)およびCTx+ポリフェノール抽出物処置群に対するCTx処置群(p=0.644)について算出した。処置群はそれぞれN=4である(図3)。

0066

D.1ループ当たりCTx 1μg、1ループ当たりポリフェノール抽出物1:10000、総体積100μl、恒温放置4〜6時間。
1.PBSはループ1から吸収され、外見上、空の腸の外観に戻った。重量/長さの比は3.147±0.0.069mg/mmであった
2.CTxで刺激したループ2は、明らかに液体で膨張していた。重量/長さの比は7.602±2.134mg/mmであった
3.CTxで刺激しポリフェノール抽出物で処置したループ3は、CTxで刺激したループ2と同程度またはそれ以上膨張していた。重量/長さの比は9.571±5.495mg/mmであった。

0067

多重比較に合わせて補正した一元配置ANOVAシダック検定を用いて統計解析を実施した。多重性調整p値をCTx処置群に対するPBS処置群(p=0.295)およびCTx+ポリフェノール抽出物処置群に対するCTx処置群(p=0.755)について算出した。処置群はそれぞれN=3であり(図4)、処置群と未処置群との間に有意差はみられなかった。

0068

結論:ポリフェノール抽出物は、CTxによって誘発される液体貯留を用量依存性に有意に減少させた(図1〜4)。CTxは、cAMP依存性腸内塩化物イオン輸送上方制御を介して分泌を誘導するため、PP抽出物は、マウス近位小腸に対するCTxの作用に拮抗できる抗分泌性止瀉薬として作用した。PP抽出物の効果は、希釈が1:1000部v/vに近づくにつれて減少し(図3)、1:10000希釈で完全に消失する(図4)。

0069

実施例3の結果から、マウスでは、コレラ毒素の腸分泌に対する作用を打ち消すのに適したポリフェノール抽出物の濃度範囲が60マイクログラムキログラム〜600ミリグラム/キログラムであることがわかる。この範囲には、マウスに対する60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、120mg/kg、140mg/kg、160mg/kg、180mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kgを含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれ、必要に応じてヒトにスケールアップ可能である。

0070

ヒト対象に対する用量の再計算から、ポリフェノール抽出物の作用範囲が5マイクログラム/キログラム〜50ミリグラム/キログラムであることが示唆される。この範囲には、ヒトに対する5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kgを含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。単回用量10グラム/kgまで毒性作用予想されない。

0071

実施例4−抽出物の化学的特徴付け。本発明者らは、液体クロマトグラフィー質量分析とともに用いて抽出物を化学的に特徴付けた。

0072

シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンが抽出物中のフラボノイドおよびガロタンニンの主な形態であることがわかった。その構造は以下のものである。

0073

本発明者らはまた、抽出物と、ブルーベリー(V.cyanococcus)、スピノサスモモ(P.spinosa)、およびブラックチョークベリー(A.melanocarpa)の個々の種の両方の酸加水分解を実施することにより、抽出物中のポリマー化学形態とモノマー化学形態の相対比という極めて重要な問題に取り組んだ。

0074

ポリフェノール抽出物の質量分析の結果から、本発明者らが試験した原料中のシアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンの大部分がモノマーであることがわかった。加水分解前および加水分解後の特定のモノマーの含有量を示すMS実験の結果を図5〜8に示す。

0075

諸実施形態では、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンはそれぞれ独立に、モノマーである、実質的に全部がモノマーである、または99%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、またはそれ以下がモノマー(ポリマー)である。

0076

実施例5−マウスモデルを用いたシアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンに関する試験。
同定後、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンの個々の試薬をChromaDex(Chromadex社、アーバインカリフォルニア州、米国)から購入し、上記のものと同じコレラ毒素誘発閉鎖ループマウス下痢モデルで試験した。本発明者らは、コレラ毒素誘発性腸分泌の治療に重要な各個々の成分のIC50濃度を求め、決定した。

0077

本発明者らはさらに、モノマー型のシアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンの組合せの相乗効果を観察し、それは予想外で驚くべきものであった。

0078

目的:コレラ毒素(CTx)刺激腸液分泌モデルを用いてポリフェノールの抗分泌効果を示す。
方法
マウス(19〜35g)を24〜48時間絶食させ、体重を測定し、Avertin(Sigma−Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、米国)(250mg/kgのIP誘導量、次いで、麻酔維持の必要に応じて30〜45分毎に2.6mg IP)で麻酔した。加温パッドを用いて体温を37〜38℃に維持した。

0079

腹部を開き、小腸および大腸の一部を確認した。近位空腸にトライツ靱帯の直下から始まる2〜4cmのループを結紮した。介在する1〜2cmの小腸によってループが隔てられるようにした。結紮後、1つのループにPBS100μlを注入し、2つ目のループにCTx溶液(Cayman chemicals社、PBS 100μl中1μg)を注入し、3つ目のループにPBS 100μlに溶かしたCTxとポリフェノールの溶液(Chromadex社、アーバイン、カリフォルニア州、米国)を注入した。注入を実施したループを写真撮影し、慎重に腹腔内に戻し、次いで、2回の縫合で腹部を閉じた。4〜6時間恒温放置した後、マウスを安楽死させ、小腸全体、盲腸、および上行横行結腸を単一標本として取り出した。ループを切り出し、脂肪を切り取り、寸法および重量を測定した。頸椎脱臼またはAvertinの過量注射によってマウスを安楽死させた。いずれの動物プロトコルも、Vanessa Research社の実験動物倫理委員会による承認を受けたものである。ループの重量/長さの比を算出した。

0080

フラバン−3−オールとガロタンニンのストック溶液ストック希釈物(−20℃で保管))および作業希釈物(PBS)を設計し、以下の通りに調製した:
F1A−塩化シアニジン(Chromadex社、ASB−00003955−005、ロット番号00003955−041)5mgをメタノール(Sigma−Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、米国)1mlに溶かして5mg/mlのストックとした。実験に使用した元の濃度は0.05mg/mlである。実験には、1:10〜1:100,000の1:10ずつの段階希釈物を調製した。

0081

F1B−塩化デルフィニジン(Chromadex社、ASB−00004125−001、ロット番号00004125−504)1mgをメタノール143ulに溶かして7mg/mlのストックとした。実験に使用した元の濃度は0.07mg/mlである。実験には、1:10〜1:100,000の1:10ずつの段階希釈物を調製した。

0082

F1C−没食子酸エピカテキン(Chromadex社、ASB−00005135−005、ロット番号00005135−523)5mgをメタノール1mlに溶かして5mg/mlのストックとした。実験に使用した元の濃度は0.001mg/ml(5mg/mlのストックの1:50希釈)である。実験には、1:10〜1:100,000の1:10ずつの段階希釈物を調製した。

0083

F1D−没食子酸エピガロカテキン(Chromadex社、ASB−00005150−005、ロット番号00005150−008)5mgをメタノール1mlに溶かして5mg/mlのストックとした。実験に使用した元の濃度は0.0015mg/ml(5mg/mlのストックの1:33.4)である。実験には、1:10〜1:100,000の1:10ずつの段階希釈物を調製した。

0084

結果
1.PBSはループから吸収され、外見上、空の腸の外観に戻った。重量/長さの比は2.52±0.61mg/mmであった
2.CTxで刺激したループは、明らかに液体で膨張していた。重量/長さの比は10.14±2.19mg/mmであった
3.CTxで刺激しポリフェノール抽出物で処置したループには、処置濃度/希釈率に応じて重量/長さの比(mg/mm)の減少がみられた
4.図9〜12に示されるように、試験F1A、F1B、およびF1B EC50に使用した各ポリフェノールのIC50はnM〜μMの範囲(1×10−7〜−5)内に収まり、F1CのIC50はnMの範囲(1×10−8)の範囲内に収まっている。図9〜12のx軸は、nthをx軸の数値とする1×10nthとして読み取るべきである。

0085

個々の化合物の以下の希釈率では、CTx誘発性液体分泌に対して何ら効果はみられなかった:

0086

一方、CTxによる液体分泌誘導後の抗分泌効果を発揮する際に、複数のポリフェノールの間に相乗効果があるとする考えを確認または除外するため、本発明者らは、表1に示す濃度の全4種類のポリフェノールの組合せを用いる処置を試みた。組合せの個々のメンバーの濃度(mg/ml)の比(シアニジング(cyaniding):デルフィニジン:没食子酸エピカテキン:没食子酸エピガロカテキン)は、結果として、表1から500:70:1:150(重量比)と導き出した。

0087

データ解析を以下の通りに実施した:
Yamamoto K.、1979を出典とする式を用いた:
貯留質量=Tm−(Cm/CL)×TL
Tm=処置または未処置ループの質量(mg)
Cm=対照ループの質量(mg)
CL=対照ループの長さ(cm)
TL=処置または未処置ループの長さ(cm)
処置または未処置試料の液体貯留を求めた後、上の式から求めた質量を用いて、質量のパーセント減少を実施した
(Um−Cm)−(Tm−Cm)/(Um−Cm)
Um=未処置ループ(Ctxループ)の貯留質量
Cm=対照ループの貯留質量
Tm=処置ループ(Drug+Ctx)の貯留質量
*この式に用いるのは、Yamamotoの方程式から求めた貯留質量であって、実験から明らかになったループの質量ではないことに留意されたい*
5.データ除外基準に基づき、特定の変数を除去した:
a.Ctxループが7.00以下である場合。Ctx−Ctxループ実験の結果に基づく
i.7.00は、近位と遠位のCTx誘発性液体貯留を合わせたものの平均値の下限である
ii.一部のマウスがCTxに対して低応答または無応答個体であったため、データの鑑別には下限のみを用いた。これらの低応答または無応答個体は腸分泌が認められず、考えられる作用機序に当てはまらないため、標的とする集団の特徴ではない。中間応答個体から高応答個体までの鑑別は不要であったため、上限の11.84mg/mmを用いてそれより大きな数値を除外することはしなかった。
b.マウスの術後生存時間が腸ループ切除前4.0時間未満である場合
c.質量測定前の脂肪または結合組織トリミング時、腸ループに著しい漏出がみられた場合
d.PBSのループが3.95mg/mmを超えた場合
e.CTxおよびCTxと処置のループの長さが2cm未満であった場合

0088

0089

データから、シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンの組合せには、マウス腸のCTx誘発性液体分泌に対する阻害効果があり、貯留液質量(平均貯留質量)が25%減少することがわかった。

0090

結果を図13にさらにまとめる。

0091

結論
1.コレラ毒素によりループ内部の分泌が激しくなった結果、生きた個体(マウス)の閉鎖腸ループに著しい液体貯留が認められた。
2.ポリフェノール(塩化シアニジン、塩化デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、没食子酸エピガロカテキン)は4種類とも、CTxによって誘発される液体貯留を用量依存性に有意に減少させた。CTxは、cAMP依存性腸内塩化物イオン輸送の上方制御を介して分泌を誘導するため、ポリフェノールは、マウス近位小腸に対するCTxの作用に拮抗できる抗分泌性止瀉薬として作用した。ポリフェノールの効果は希釈因子に比例して低下し、このことは、薬物の用量応答効果を示している。

0092

ポリフェノールの組合せは、コレラ毒素の刺激による腸分泌の発現および進行に対して個々のポリフェノールよりも効力が高く、効果的であることがわかった。4種類のポリフェノールを、単独では治療効果がみられなかった極めて低い濃度で混合したところ、分泌を阻害する効果がみられた。したがって、ポリフェノールの組合せは個々のポリフェノールよりも治療効力が高いことが明らかになり、このことは、諸成分の相乗効果を示している。ポリフェノールおよびポリフェノールの混合物は、コレラの治療に、可能性として予防にも安全で効果的な方法となるはずである。

0093

本発明者らの実験から得た予想外で驚くべき観察結果は、個々の試薬(シアニジン、デルフィニジン、没食子酸エピカテキン、および没食子酸エピガロカテキンの個々の試薬)を4種類とも組み合わせると抗分泌効果を発揮したのに対し、同じ濃度の個々の成分単独では、分泌に対して観察可能な効果はみられなかったことである。したがって、ポリフェノールの組合せは、同じ濃度で使用するいずれの個々の薬剤よりも効果的である。

0094

表3のB−フェノール環のR3’位、R4’位、およびR5’位に−OHラジカルを有するポリフェノール、ならびに没食子酸残基は、分泌に対する阻害効果を得るのに特に望ましいものであり得る。さらに、表3のR3のグリコシル化は、分子の水への溶解性に有益な影響を及ぼし、製剤を容易にすることが知られている。

0095

0096

本発明者らの実験の結果に基づけば、混合物中の個々の成分の質量分率は、個々の成分の効力に応じて0.2%から99.4%まで変化させることができる。

0097

ヒト対象に対する用量の再計算からナノモルマイクロモルの有効IC50範囲が示唆され、混合物の効果が極めて高いことがわかる。マウス実験から再計算して示唆される用量は、1マイクログラム/キログラム〜10ミリグラム/キログラムの範囲内に収まる。この範囲には、1マイクログラム/キログラム、2マイクログラム/キログラム、3マイクログラム/キログラム、4マイクログラム/キログラム、5マイクログラム/キログラム、6マイクログラム/キログラム、7マイクログラム/キログラム、8マイクログラム/キログラム、9マイクログラム/キログラム、10マイクログラム/キログラム、20マイクログラム/キログラム、30マイクログラム/キログラム、50マイクログラム/キログラム、70マイクログラム/キログラム、90マイクログラム/キログラム、100マイクログラム/キログラム、200マイクログラム/キログラム、500マイクログラム/キログラム、700マイクログラム/キログラム、900マイクログラム/キログラム、1ミリグラム/キログラム、2ミリグラム/キログラム、3ミリグラム/キログラム、4ミリグラム/キログラム、5ミリグラム/キログラム、6ミリグラム/キログラム、7ミリグラム/キログラム、8ミリグラム/キログラム、9ミリグラム/キログラム、10ミリグラム/キログラムを含めたあらゆる数値およびその間の部分範囲が含まれる。用量は、中毒リスクを増大させることから、100mg/kgを超えてはならない。

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