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技術 インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物

出願人 ハニースト シーオー., エルティーディー.
発明者 クァク、キソンキム、ヒョンジョンイ、ジヘカン、ウンビング、スラン
出願日 2019年12月20日 (1年10ヶ月経過) 出願番号 2020-543804
公開日 2021年7月8日 (3ヶ月経過) 公開番号 2021-516669
状態 未査定
技術分野 化粧料
主要キーワード 変化結果 粘性変形 内部要因 pH測定 当業分野 固体平板 ピッカリングエマルション 重金属粒子
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物に関する。具体的に、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含むことにより、抗菌効能抗炎症効能及び抗公害効能を有し、特に、前記抗公害効能は、空気中の汚染物質微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物、これを含む化粧品組成物、及びインドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物を開示する。

概要

背景

微細粒子状物質は、直径10μm以下の非常に微細粒子状物質であって、皮膚にも多くの影響を及ぼすが、皮膚にくっ付いて油分と絡み付くと老廃物が溜まり、毛穴の中に浸透してヒ素カドミウム、鉛などの重金属が入るとニキビ発疹などの肌トラブルの原因になるおそれがある。微細粒子状物質は、特にニキビなどの肌トラブル疾患を持っている患者には一層致命的である。最近、ニキビ疾患が急増しており、過去の10代中心から20代までへと疾患の年齢層が拡大しているが、食習慣の欧米化、現代人のストレス増加だけでなく、前述した微細粒子状物質などの環境汚染が最も大きな原因として知られている。

現在、微細粒子状物質などによる肌トラブルの改善にはニキビ用化粧品が主に使用されているが、これらのニキビ用化粧品は、殺菌剤を主成分とした製品がほとんどであって、副作用への懸念により市場拡散には限界がある。また、微細粒子状物質による肌トラブルを解決する方法としては、外出後に洗顔をよく行う方法や、微細粒子状物質の接触を防ぐための皮膚保護化粧品を塗る方法などがある。従来開発された微細粒子状物質関連化粧品としては、微細な泡を用いてメイク残余物だけでなく、微細粒子状物質や各種汚染物質まできれいに洗い出す方式のクレンジング製品がほとんどである。しかし、皮膚に接触した微細粒子状物質は、洗顔によって一部除去が可能であるが、毛穴などの経路を介して皮膚の中に浸透した微細粒子状物質を除去することは非常に難しい。よって、微細粒子状物質が皮膚に接触または浸透することを防止して皮膚を保護することがさらに重要である。

また、人間の老化には様々な要因が作用するが、人体内の様々な病気と共に老化を促進する原因の一つである活性酸素が生成されながら、酸化作用を起こしてDNA、細胞膜、及び皮膚の主要構成物質であるタンパク質多糖類、脂質と反応して細胞に損傷を与えるうえ、肌の老化を引き起こすが、このような活性酸素を除去するための機能性食品及び化粧品分野の研究が盛んに行われている。

また、紫外線(Ultraviolet;UV)は、メラニン(melanin)の生成を促進させることが知られているが、過剰なメラニンの合成及び蓄積は、シミソバカスのように視覚的に良くない病気を生むメラノソーム(Melanosome)には、正常なメラニンの合成に必要な酵素を含有しているが、これらの酵素の中で最も代表的なものとしては、チロシナーゼ関連遺伝子1(tyrosinase related protein−1;TRP−1)、チロシナーゼ(tyrosinase)、チロシナーゼ関連遺伝子2(tyrosinase related protein−2;TRP−2)などがある。

過剰な活性酸素種(reactive oxyzen species、ROS)により起こる酸化的ストレスは、外部要因であって細胞損傷を起こし、酸化的ストレスから誘発された炎症(inflammation)は、老化及び内部要因であって病的損傷を誘発する。炎症反応は、外部の刺激に対応するために生体内で起こる正常な防御機作であって、炎症反応が起こると、誘導型一酸化窒素合成酵素(inducible nitric oxide synthase;iNOS)、腫瘍壊死因子−α(tumor necrosis factor−α;TNF−α)、一酸化窒素(Nitric oxide;NO)、インターロイキン−1β(interleukin−1β;IL−1β)及びシクロオキシゲナーゼ−2(cyclooxygenase−2;COX−2)によって生成される。酸化的ストレスにより起こる老化及び炎症性疾患に対応するための研究が続けられている。

肌は、加齢に伴って厚みが益々薄くなり、シワが増加し、皮膚から弾力が減少する。これは、体の中から新陳代謝を調節するホルモン分泌が減少し、肌の細胞活性が低下して皮膚構成タンパク質生合成が減ることにより現れる現象である。また、シワが深まることと厚い肌に起因する光老化皮膚は、紫外線により増加するフリーラジカル(free radical)及び有害な活性酸素種による。これらの老化が進むほど、皮膚を構成するコラーゲン(collagen)、エラスチン(elastin)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)などの構造タンパク質を生成する能力が減少し、I型コラゲナーゼ(type I collagenase)(マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP))の生合成が増えることにより、皮膚構造タンパク質をより多く分解するようにする。また、このように累積される酸化的ストレスは、皮膚の老化をもっと促進する。紫外線により増加するタンパク質酵素の中でも、マトリックスを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ(matrix metalloproteinase;MMPs)は、皮膚の光老化発生過程で重要な役割を果たす。皮膚真皮内の細胞外マトリックス(extracellular matrix)は、皮膚の構造及び弾力機能を維持する役割を果たすが、その中の80%以上がI型プロコラーゲン(type I procollagen)からなっている。紫外線に晒された皮膚では、MMPsの発現が増加し、増加したMMPsが、皮膚を構成している膠原質を分解して基質タンパク質欠乏を招くことにより、肌の老化が起こる。

一方、インドセンダンは、センダン科常緑高木であって、学名がAzadirachta indicaであり、英語では「Neem」または「Nim tree」と呼ばれる。インド、ネパール、パキスタンバングラデシュスリランカモルディブなどの熱帯及び亜熱帯地域に生息し、15〜20mの高さに急成長する特徴を持っており、インド亜大陸害虫防止剤歯科衛生砂漠化防止及び伝統医学に使われている。

概要

本発明は、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物に関する。具体的に、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含むことにより、抗菌効能抗炎症効能及び抗公害効能を有し、特に、前記抗公害効能は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物、これを含む化粧品組成物、及びインドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物を開示する。

目的

本発明は、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含む化粧料組成物、及びこれを含む化粧品組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

インドセンダン(Azadirachtaindica)葉抽出物を有効成分として含むことにより抗菌効能抗炎症効能及び抗公害効能を有することを特徴とし、前記抗公害効能は、空気中の汚染物質微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物

請求項2

前記化粧料組成物は抗酸化効能、美白効能及びシワ改善効能をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載のインドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物。

請求項3

前記インドセンダン葉抽出物は、熱水抽出されたインドセンダン葉抽出物、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物、またはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物であることを特徴とする、請求項1に記載のインドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物。

請求項4

請求項1乃至3のいずれか一項に記載の化粧料組成物を含むことを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含む化粧品組成物

請求項5

インドセンダン(Azadirachtaindica)葉抽出物を有効成分として含み、粉末相水相及び添加剤をさらに含み、抗菌効能、抗炎症効能及び抗公害効能を有することを特徴とし、前記抗公害効能は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物

請求項6

前記ピッカリングエマルジョン組成物は、熱水エタノールまたはアセトンを用いて抽出されたインドセンダン(Azadirachtaindica)葉抽出物、粉末相、水相及び添加剤を含む組成物を10,000rpm〜20,000rpmで30秒〜5分間粉砕処理した後、300〜800rpmで1〜5分間混合処理して製造されることを特徴とする、請求項5に記載のインドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物。

請求項7

前記ピッカリングエマルジョン組成物は抗酸化効能、美白効能及びシワ改善効能をさらに含むことを特徴とする、請求項5に記載のインドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物。

技術分野

0001

本発明は、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物、これを含む化粧品組成物、及びインドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物に関する。

背景技術

0002

微細粒子状物質は、直径10μm以下の非常に微細粒子状物質であって、皮膚にも多くの影響を及ぼすが、皮膚にくっ付いて油分と絡み付くと老廃物が溜まり、毛穴の中に浸透してヒ素カドミウム、鉛などの重金属が入るとニキビ発疹などの肌トラブルの原因になるおそれがある。微細粒子状物質は、特にニキビなどの肌トラブル疾患を持っている患者には一層致命的である。最近、ニキビ疾患が急増しており、過去の10代中心から20代までへと疾患の年齢層が拡大しているが、食習慣の欧米化、現代人のストレス増加だけでなく、前述した微細粒子状物質などの環境汚染が最も大きな原因として知られている。

0003

現在、微細粒子状物質などによる肌トラブルの改善にはニキビ用化粧品が主に使用されているが、これらのニキビ用化粧品は、殺菌剤を主成分とした製品がほとんどであって、副作用への懸念により市場拡散には限界がある。また、微細粒子状物質による肌トラブルを解決する方法としては、外出後に洗顔をよく行う方法や、微細粒子状物質の接触を防ぐための皮膚保護化粧品を塗る方法などがある。従来開発された微細粒子状物質関連化粧品としては、微細な泡を用いてメイク残余物だけでなく、微細粒子状物質や各種汚染物質まできれいに洗い出す方式のクレンジング製品がほとんどである。しかし、皮膚に接触した微細粒子状物質は、洗顔によって一部除去が可能であるが、毛穴などの経路を介して皮膚の中に浸透した微細粒子状物質を除去することは非常に難しい。よって、微細粒子状物質が皮膚に接触または浸透することを防止して皮膚を保護することがさらに重要である。

0004

また、人間の老化には様々な要因が作用するが、人体内の様々な病気と共に老化を促進する原因の一つである活性酸素が生成されながら、酸化作用を起こしてDNA、細胞膜、及び皮膚の主要構成物質であるタンパク質多糖類、脂質と反応して細胞に損傷を与えるうえ、肌の老化を引き起こすが、このような活性酸素を除去するための機能性食品及び化粧品分野の研究が盛んに行われている。

0005

また、紫外線(Ultraviolet;UV)は、メラニン(melanin)の生成を促進させることが知られているが、過剰なメラニンの合成及び蓄積は、シミソバカスのように視覚的に良くない病気を生むメラノソーム(Melanosome)には、正常なメラニンの合成に必要な酵素を含有しているが、これらの酵素の中で最も代表的なものとしては、チロシナーゼ関連遺伝子1(tyrosinase related protein−1;TRP−1)、チロシナーゼ(tyrosinase)、チロシナーゼ関連遺伝子2(tyrosinase related protein−2;TRP−2)などがある。

0006

過剰な活性酸素種(reactive oxyzen species、ROS)により起こる酸化的ストレスは、外部要因であって細胞損傷を起こし、酸化的ストレスから誘発された炎症(inflammation)は、老化及び内部要因であって病的損傷を誘発する。炎症反応は、外部の刺激に対応するために生体内で起こる正常な防御機作であって、炎症反応が起こると、誘導型一酸化窒素合成酵素(inducible nitric oxide synthase;iNOS)、腫瘍壊死因子−α(tumor necrosis factor−α;TNF−α)、一酸化窒素(Nitric oxide;NO)、インターロイキン−1β(interleukin−1β;IL−1β)及びシクロオキシゲナーゼ−2(cyclooxygenase−2;COX−2)によって生成される。酸化的ストレスにより起こる老化及び炎症性疾患に対応するための研究が続けられている。

0007

肌は、加齢に伴って厚みが益々薄くなり、シワが増加し、皮膚から弾力が減少する。これは、体の中から新陳代謝を調節するホルモン分泌が減少し、肌の細胞活性が低下して皮膚構成タンパク質生合成が減ることにより現れる現象である。また、シワが深まることと厚い肌に起因する光老化皮膚は、紫外線により増加するフリーラジカル(free radical)及び有害な活性酸素種による。これらの老化が進むほど、皮膚を構成するコラーゲン(collagen)、エラスチン(elastin)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)などの構造タンパク質を生成する能力が減少し、I型コラゲナーゼ(type I collagenase)(マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP))の生合成が増えることにより、皮膚構造タンパク質をより多く分解するようにする。また、このように累積される酸化的ストレスは、皮膚の老化をもっと促進する。紫外線により増加するタンパク質酵素の中でも、マトリックスを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ(matrix metalloproteinase;MMPs)は、皮膚の光老化発生過程で重要な役割を果たす。皮膚真皮内の細胞外マトリックス(extracellular matrix)は、皮膚の構造及び弾力機能を維持する役割を果たすが、その中の80%以上がI型プロコラーゲン(type I procollagen)からなっている。紫外線に晒された皮膚では、MMPsの発現が増加し、増加したMMPsが、皮膚を構成している膠原質を分解して基質タンパク質欠乏を招くことにより、肌の老化が起こる。

0008

一方、インドセンダンは、センダン科常緑高木であって、学名がAzadirachta indicaであり、英語では「Neem」または「Nim tree」と呼ばれる。インド、ネパール、パキスタンバングラデシュスリランカモルディブなどの熱帯及び亜熱帯地域に生息し、15〜20mの高さに急成長する特徴を持っており、インド亜大陸害虫防止剤歯科衛生砂漠化防止及び伝統医学に使われている。

発明が解決しようとする課題

0009

本発明者は、活性酸素、紫外線、微細粒子状物質などの内外部要因による老化に効果的な抽出物に関する研究の末に、インドセンダン葉抽出物が活性酸素による肌の老化及びシワや、紫外線によるメラニン生成促進、微細粒子状物質などによる皮膚老化及び皮膚疾患などに効能を有することを見出し、本発明を完成した。

0010

そこで、本発明は、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含む化粧料組成物、及びこれを含む化粧品組成物を提供することを技術的課題とする。

0011

また、本発明は、前記インドセンダン葉抽出物の薬理活性効果を利用して食品、化粧品、医薬などの様々な産業活用可能なピッカリングエマルジョンを提供することを技術的課題とする。

0012

ところが、本発明で解決しようとする技術的課題は上述した課題に制限されず、上述していな別の技術的課題は以降の記載から当業者に明確に理解できるだろう。

課題を解決するための手段

0013

上記の技術的課題を解決するために、本発明は、インドセンダン(Azadirachta indica)葉抽出物を有効成分として含むことにより抗菌効能、抗炎症効能及び抗公害効能を有することを特徴とし、前記抗公害効能は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物を提供する。

0014

本発明において、前記抗公害効能は、ヒアルロン酸の分解を防止して皮膚吸着を防止する機能を含み、前記抗菌効能は、Staphylococcus aureus菌及びPropionibacterium acnes菌に対する生育阻害機能であることを特徴とする。

0015

また、本発明において、前記化粧料組成物は、抗酸化効能、美白効能及びシワ改善効能をさらに含むことを特徴とする。

0016

また、本発明において、前記インドセンダン葉抽出物は、熱水抽出されたインドセンダン葉抽出物、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物、またはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物であることを特徴とする。

0017

また、本発明は、前記インドセンダン葉抽出物を有効成分として含む化粧料組成物を含む化粧品組成物を提供する。このとき、好ましくは、前記化粧品組成物は、エッセンスアンプル石鹸トニック及びボディエッセンス、エマルジョンローションクリーム水中油滴型油中水滴型または多重相)、溶液、懸濁液(無水または水系)、無水生成物オイルまたはグリコール系)、ジェルまたは粉末の形態であることを特徴とする。

0018

また、上記の他の技術的課題を解決するために、本発明は、インドセンダン(Azadirachta indica)葉抽出物を有効成分として含み、粉末相水相及び添加剤をさらに含み、抗菌効能、抗炎症効能及び抗公害効能を有することを特徴とし、前記抗公害効能は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物を提供する。

0019

本発明において、前記ピッカリングエマルジョン組成物は、熱水エタノールまたはアセトンを用いて抽出されたインドセンダン(Azadirachta indica)葉抽出物、粉末相、水相及び添加剤を含む組成物を10,000rpm〜20,000rpmで30秒〜5分間粉砕処理した後、300〜800rpmで1〜5分間混合処理して製造されることを特徴とする。

0020

また、本発明において、前記抗公害効能は、ヒアルロン酸の分解を防止して皮膚吸着を防止する機能を含み、前記抗菌効能は、Staphylococcus aureus菌及びPropionibacterium acnes菌に対する生育阻害機能であることを特徴とする。

0021

また、本発明において、前記ピッカリングエマルジョン組成物は、抗酸化効能、美白効能及びシワ改善効能をさらに含むことを特徴とする。

発明の効果

0022

本発明のインドセンダン葉抽出物を有効成分として含む化粧料組成物は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効果を示して抗公害(anti−pollution)効能を示す。したがって、汚染物質、微細粒子状物質、重金属などの吸着による皮膚疾患や皮膚炎症、抗菌などにおける有意な効果を有し、皮膚細胞を改善し、皮膚保湿及び皮膚バリアを維持することができるようにする。したがって、本発明の化粧料組成物は、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含むことにより、抗菌、抗炎、抗公害(anti−pollution)効能だけでなく、抗酸化、美白、シワ改善効果を有する化粧料組成物を提供することができるという効果がある。

0023

また、本発明は、インドセンダン葉抽出物の溶媒による抗酸化効果抗菌効果、抗炎効果(ニキビ改善)、美白効果皮膚色素沈着緩和)、シワ改善効果などを検証し、この結果により要求される用途への活用価値を上昇させることができる。

0024

また、本発明は、インドセンダンの葉から抽出した有効成分を含む組成物を提供して食品、化粧品、医薬品などに使用することができ、特に化粧品に使用される場合、有効成分及びその他の添加成分がより安定な形態で含有できるピッカリングエマルジョン組成物を提供することができる。これにより、有効成分であるインドセンダン葉抽出物の経皮吸収を促進しながら使用感を向上させることができる。

図面の簡単な説明

0025

本発明の一実施例に係るインドセンダン抽出方法を示すもので、以下の図面において、AIWはインドセンダン葉熱水抽出物、AIEはインドセンダン葉エタノール抽出物、AIAはインドセンダン葉アセトン抽出物を意味する。
本発明の実験例1によるインドセンダン葉抽出物の抗酸化効果を測定して示すもので、図2aDPPHラジカル消去能測定結果図2bはABTカチオンラジカル消去能測定結果、図2cはSOD類似活性効果測定結果、図2dスーパーオキシドアニオンラジカル(Superoxide anion radical)消去能測定結果を示すものである。
図3aは本発明の実験例3によるインドセンダン葉抽出物のチロシナーゼ(tyrosinase)阻害活性測定結果を示すものであり、図3bは本発明の実験例4によるインドセンダン葉抽出物のエラスターゼ(elastase)阻害活性効果測定結果を示すものである。
本発明の実験例5によるインドセンダン葉抽出物の細胞毒性及び抗炎症効果を測定した結果を示すもので、図4aマクロファージ細胞(Macrophage cell)のの細胞生存率測定結果、図4bはNO阻害活性測定結果を示すものである。
本発明の実験例5によるインドセンダン葉抽出物の抗炎症効果をウエスタンブロットによって確認した結果を示すものであり、図5aはAIW、図5bはAIE、図5cはAIAのiNOS、COX−2発現阻害測定結果を示すものである。
本発明の実験例5によるAIEに対する測定結果を示すもので、図6aはiNOSmRNA発現抑制率測定結果、図6bメラノーマ細胞(Melanoma cell)(B16F10)の細胞毒性確認結果、図6cはTRP−1(A)、TRP−2(B)及びチロシナーゼ(Tyrosinase)(C)発現抑制確認結果、図6dはTRP−1m RNA発現抑制結果を示すものである。
本発明の実験例7によるAIEのシワ改善効能を測定した結果を示すもので、図7aヒトケラチノサイト細胞(Human keratinocyte cell)の細胞生存率確認結果、図7bはMMP−1とフィラグリン(Filaggrin)タンパク質発現確認結果を示すものである。
本発明の実験例8による細胞毒性確認結果を示すもので、図8a角質形成細胞(HaCaT cell)での細胞生存率、図8b線維芽細胞(CCD−986sk cell)での細胞生存率を示すものである。
本発明の実験例8による抗公害実験結果を示すもので、図9aは角質形成細胞(HaCaT cell)でのBenzo[α]pyrene(BP)処理時のインドセンダン葉抽出物による細胞生存率、図9bはBenzo[α]pyrene(BP)処理時のインドセンダン葉抽出物による線維芽細胞(CCD−986sk cell)での細胞生存率、図9cは微細粒子状物質処理時のインドセンダン葉抽出物による線維芽細胞(CCD−986sk cell)での細胞生存率を確認した結果を示すものである。
本発明の実験例9によるピッカリングエマルジョンの製造方法を示すものである。
本発明の実験例9によるピッカリングエマルジョンの保湿剤含有量による剤形変化を示すものであって、図11aグリセリン(Glycerin)の含有量による剤形変化、図11bは1,3−BGの含有量による剤形変化、図11cプロパンジオール(Propandiol)の含有量による剤形変化を示すものである。
本発明の実験例9によるピッカリングエマルジョンの複合保湿剤の含有量によるTEWL水分蒸発測定結果を示すものである。
本発明の実験例9のpHによる剤形変化を示すもので、図13aはピッカリングエマルジョンのpHによる剤形変化、図13bL−アスコルビン酸原料のpHの含有量による剤形変化、図13cはL−アスコルビン酸の含有量による剤形変化を示すものである。

実施例

0026

以下、本発明を詳細に説明するに先立ち、本明細書に使用された用語は、特定の実施例を記述するためのものに過ぎず、添付する特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。本明細書に使用されるすべての技術用語及び科学用語は、他の記載がない限り、技術的に通常の技術を有する者に一般的に理解されるのと同様の意味を持つ。

0027

本明細書及び請求の範囲全般にわたり、他の記載がない限り、包含(comprise、comprises、comprising)という用語は、記載されたもの、ステップ、または一群のものまたはステップを含むことを意味し、任意の他のもの、ステップ、または一群のものまたは一群のステップを排除する意味で使用されたものではない。

0028

一方、本発明の様々な実施例は、明確な反対の指摘がない限り、その他のある実施例とも組み合わせられ得る。特に好ましい或いは有利であると指示するいずれの特徴も、好ましい或いは有利であると指示したその他のある特徴とも組み合わせられ得る。

0029

本発明の一実施例に係る組成物は、インドセンダン葉抽出物を含み、抽出された植物の有効成分を含むことにより、微細粒子状物質、重金属などから皮膚を保護する化粧品、ニキビの抑制及び皮膚色素沈着の緩和のための機能性化粧品、食品、医薬品などに使用できる。本明細書において、前記「有効成分」とは、単独で目的の活性を示すか、或いはそれ自体は活性のない担体と共に活性を示すことができる成分を意味する。

0030

本発明は、一態様として、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含む化粧料組成物を提供する。

0031

前記本発明に含まれるインドセンダン葉抽出物は、溶媒抽出法によって抽出でき、溶媒抽出法に使用される溶媒は、例えば、水、炭素数1〜4の無水または含水低級アルコール(例えば、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノール)、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、グリセリン、アセトン、ジエチルエーテル酢酸エチル酢酸ブチルジクロロメタンクロロホルムヘキサン及びこれらの混合物よりなる群から選択される溶媒が使用できる。

0032

好ましくは、熱水、エタノールまたはアセトンを用いて抽出され、インドセンダンの有効成分を含有することができる。この場合、前記インドセンダン葉抽出物は、インドセンダンの葉を溶媒である熱水、エタノールまたはアセトンに浸漬させた後、抽出して得る。抽出方法はその溶媒によって異なる。具体的に、前記インドセンダンの葉を熱水を用いて抽出する場合には、乾燥したインドセンダン葉の重量の8〜12倍の熱水に浸漬させた後、90〜110℃で3〜5時間抽出する。このとき、上述した抽出ステップを少なくとも2回、好ましくは少なくとも3回繰り返して抽出物を得るのが良い。また、前記インドセンダンの葉をエタノールまたはアセトンを用いて抽出する場合には、60〜80%のエタノールまたはアセトン溶液を溶媒として用い、乾燥したインドセンダン葉の重量の8〜12倍のエタノールまたはアセトン溶液に浸漬させた後、常温で20〜30時間抽出する。このとき、上述した抽出ステップを少なくとも2回、好ましくは少なくとも3回繰り返して抽出物を得るのが良い。

0033

また、前記インドセンダンの有効成分が抽出されたインドセンダン葉抽出物は、抗菌効果、抗炎効果(ニキビ改善)及び抗公害(anti−pollution)効果を提供する。

0034

まず、抗菌効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、Staphylococcus aureus菌及びPropionibacterium acnes菌に対して生育阻害を示して抗菌効果を有する。さらに具体的には、生育阻害環測定実験でエタノールまたはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物がStaphylococcus aureus菌で2mg/discから1.0±0cm以上のclear zoneが現れ、すべてのインドセンダン葉抽出物がPropionibacterium acnes菌に対して5mg/discから1.1±0cm以上のclear zoneが現れる。

0035

また、抗炎症効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、マクロファージ細胞(Macrophage cell)であるRAW264.7で90%以上の生存率を示し、NO阻害活性を示し、iNOS及びCOX−2タンパク質発現阻害活性を示して抗炎症効果を有する。

0036

特にエタノールまたはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物は、100μg/mLの濃度でNO阻害活性率が65%以上と優れており、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物のNO阻害活性が最も優れている。また、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物はiNOSタンパク質発現阻害活性を有し、アセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物はiNOS及びCOX−2タンパク質発現阻害活性を有する。さらに具体的には、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物の100μg/mLの濃度でiNOSmRNA発現抑制率が97%以上と最も優れている。

0037

また、抗公害効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、ヒト皮膚細胞であるHaCaT cellとCCD−986sk cellにおいてBenzo[α]pyrene(BP)で刺激された細胞がインドセンダン抽出物によって改善され、抗公害効能を有する。このようなベンゾピレンは、化石燃料などの不完全燃焼過程で生成される多環芳香族炭化水素一種であって、煤煙だけでなく、空気中に含まれる汚染物質である。特に、HaCaT cellでは、Benzo[α]pyreneのみを処理した細胞と比較して25μm/mLで92%以上の改善効果を示し、CCD−986sk cellでは、25μg/mLで81%以上の改善効果を示す。

0038

また、インドセンダン葉抽出物は、CCD−986sk cellにおいて微細粒子状物質で刺激された細胞がインドセンダン抽出物によって改善され、皮膚細胞を保護する抗公害効能を有する。具体的には、CCD−986sk cellで微細粒子状物質のみ処理した細胞と比較して100μg/mLで85%以上の改善効果を示す。

0039

また、インドセンダン葉抽出物は、皮膚バリアを形成するヒアルロン酸を保護する効果を持つ。本発明の一実施例によれば、皮膚バリアを形成し、皮膚保湿に関与するヒアルロン酸に鉄分10ppm、1%インドセンダン抽出物及び0.2%EDTA−2Naを反応させた後、ヒアルロン酸の粘度を測定した結果、EDTA−2Naよりもインドセンダン抽出物が鉄と結合する効果がより良いため、粘度がさらに高いことを確認した。これは、インドセンダン葉抽出物によってヒアルロン酸の分解を防止することができ、重金属などを吸着するEDTA−2Naよりもその効果がさらに優れていることを意味する。

0040

したがって、インドセンダン葉抽出物は、化粧品組成物に含まれ、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効果を示して抗公害(anti−pollution)効能を示す。したがって、汚染物質、微細粒子状物質、重金属などの吸着による皮膚疾患や皮膚炎症、抗菌などにおいて有意な効果を有し、皮膚細胞を改善し、皮膚保湿及び皮膚バリアを維持することができるようにする。

0041

また、前記インドセンダンの有効成分が抽出されたインドセンダン葉抽出物は、上述した抗菌効果、抗炎効果(ニキビ改善)、抗公害(anti−pollution)効果だけでなく、抗酸化効果、美白効果、シワ改善効果を提供する。

0042

抗酸化効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、50mg/g以上の高いポリフェノール含有量を有し、DPPHラジカル消去能、ABTS+ラジカル消去能SOD様活性能、スーパーオキシドアニオンラジカル(Superoxide anion radical)消去能を示して抗酸化効果を有する。

0043

特に、熱水抽出されたインドセンダン葉抽出物は、1,000μg/mLの濃度でDPPHラジカル消去能が40%以上であり、ABTS+ラジカル消去能が70%以上と最も優れている。エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物は、1,000μg/mLの濃度でSOD様活性能が20%以上であり、スーパーオキシドアニオンラジカル(Superoxide anion radical)消去能が95%以上と最も優れている。アセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物は、70mg/g以上の最も高いポリフェノール含有量を有する。

0044

また、美白効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、チロシナーゼ(Tyrosinase)阻害活性を示して皮膚色素沈着の緩和、すなわち美白効果を有する。特に、エタノールまたはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物のチロシナーゼ阻害活性率が1,000μg/mLの濃度で45%以上と優れており、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物のチロシナーゼ阻害活性が最も優れている。

0045

さらにチロシナーゼ阻害活性が最も優れた、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物は、メラノーマ細胞(Melanoma cell)であるB16F10で85%以上の生存率を示し、10μg/mLの濃度で85%以上と高いTRP−1mRNA発現抑制能を有する。

0046

また、シワ改善効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、エラスターゼ(Elastase)阻害活性を示してシワ改善効果を有する。特に、エタノールまたはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物のエラスターゼ阻害活性率が1,000μg/mLの濃度で20%以上と優れており、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物のエラスターゼ阻害活性が最も優れている。

0047

さらにエラスターゼ阻害活性に最も優れた、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物は、ヒトケラチノサイト細胞(Human keratinocyte cell)で90%以上の生存率を示し、10μg/mLの濃度でMMP−1発現抑制能を有する。

0048

上述したように、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含むことにより、抗菌・抗炎・抗公害(anti−pollution)効能と抗酸化・美白・シワ改善効能を有する本発明の化粧料組成物を含む化粧品を提供することができる。このようにインドセンダン葉抽出物を含む化粧品は、スキン及びボディケア化粧品であって、エッセンス、アンプル、石鹸、トニック泳ぎボディエッセンス、エマルジョン、ローション、クリーム(水中油滴型、油中水滴型、多重相)、溶液、懸濁液(無水及び水系)、無水生成物(オイル及びグリコール系)、ジェル、粉末などの様々な剤形に製造できる。

0049

このとき、前記化粧品組成物は、インドセンダン葉抽出物以外に、皮膚化粧品製剤において収容可能な担体を含むことができる。前記担体としては、アルコール、オイル、界面活性剤脂肪酸シリコーンオイル防腐剤湿潤剤、保湿剤、粘性変形剤、乳剤、安定剤、紫外線遮断剤発色剤香料希釈剤などが例示できる。

0050

前記アルコール、オイル、界面活性剤、脂肪酸、シリコーンオイル、防腐剤、湿潤剤、保湿剤、粘性変形剤、乳剤、安定剤、紫外線遮断剤、発色剤、香料、希釈剤などとして使用できる具体的な化合物または組成物は、当業分野で既に公知になっているので、当業者であれば、適切な該当化合物または組成物を選択して使用することができる。

0051

ここで幾つかを例示してみると、アルコールとしては、高級アルコール、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、グリセリン、ソルビトールポリエチレングリコールなどの水溶性多価アルコールなどを挙げることができ、オイルとしては、アボカド油パーム油牛脂ホホバ油などを挙げることができ、防腐剤としては、エチルパラベンブチルパラベンなどを挙げることができ、保湿剤としては、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン(chondroitin sulfate)、ピロリドンカルボン酸塩などを挙げることができ、希釈剤としては、エタノール、イソプロパノールなどを挙げることができる。

0052

より具体的に、化粧品の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物線維、植物線維、ワックスパラフィンデンプントラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーンベントナイトシリカタルクまたは酸化亜鉛などが使用できる。

0053

また、剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウムケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが使用でき、特にスプレーである場合には、さらにクロフルオロヒドロカーボンプロパンブタンまたはジメチルエーテルなどの推進体を含むことができる。

0054

また、剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶媒和剤または油濁化剤が使用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタン脂肪酸エステルがある。

0055

また、剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールなどの液状希釈剤エトキシル化イソステアリルアルコールポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁剤微小結晶セルロースアルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラカントなどが使用できる。

0056

また、剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコール硫酸塩、脂肪族アルコールエーテル硫酸塩スルホンコハク酸モノエステルイセチオン酸塩イミダゾニウム誘導体メチルタウレートサルコシネート脂肪酸アミドエーテル硫酸塩、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グルセリド、脂肪酸ジエタノールアミド植物性油、リノリン誘導体またはエトキシ化グリセロール脂肪酸エステルなどが使用できる。

0057

また、本発明の一実施例に係るインドセンダン葉抽出物を含む石鹸の場合、石鹸基材にインドセンダン葉抽出物を含めて製造でき、添加剤として皮膚保湿剤、乳化剤硬水軟化剤などを含めて製造できる。

0058

前記石鹸基材としては、ヤシ油、パーム油、大豆油ヒマシ油オリーブ油パーム核油などの植物油脂、または牛脂、豚脂羊脂魚油などの動物油脂などが使用でき、前記皮膚保湿剤としては、グリセリン、エリトリトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ペンチレングリコールヘキシルグリコール、ミリスチン酸イソプロピルシリコーン誘導体アロエベラ、ソルビトールなどが使用でき、前記乳化剤としては、天然オイル、ワックス、脂肪アルコール炭化水素類天然植物抽出物などが使用でき、前記硬水軟化剤としては、EDTAテトラナトリウムなどが使用できる。

0059

本発明の石鹸組成物は、また、添加剤として抗菌剤分散剤泡抑制剤、溶媒、水垢防止剤、腐食防止剤、香料、色素金属イオン封鎖剤酸化防止剤、防腐剤などをさらに含むことができる。

0060

また、本発明は、別の態様として、インドセンダン葉抽出物を含むことにより、抗菌・抗炎・抗公害(anti−pollution)効能と抗酸化・美白・シワ改善効能を有するピッカリングエマルジョン組成物を提供する。このようなピッカリングエマルジョン組成物は、固体粒子で安定化されたエマルジョンを意味するもので、インドセンダン(Azadirachta indica)葉抽出物を有効成分として含み、粉末相、水相及び添加剤をさらに含むことにより、有効成分であるインドセンダン葉抽出物の経皮吸収を促進しながら使用感を向上させることができる。

0061

このとき、前記インドセンダン葉抽出物は、先立って述べたように、熱水抽出されたインドセンダン葉抽出物、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物、アセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物であり得る。これらの中で、ピッカリングエマルジョン組成物が使用される用途に応じて、当該用途において最も優れた効能を有する抽出物を選択して含めさせることができる。

0062

前記インドセンダン葉抽出物は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して0.5〜5重量%、好ましくは0.5〜3重量%含まれるのが良い。

0063

前記粉末相は、炭酸カルシウム、シリカ、粘土ラポナイト黒鉛ラテックス磁粉(magnetic particle)及びカーボンナノチューブ(CNT)よりなる群から選択される少なくとも1種を含み、好ましくはシリカを使用することが良い。

0064

前記粉末相は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して1〜10重量%、好ましくは3〜8重量%含まれるのが良い。

0065

前記水相は、水及び保湿剤を含み、前記保湿剤は、グリセリン(Glycerin)、1,3−ブチレングリコール(1,3−Butylene Glycol)、ソルビトール(Sorbitol)、エチレングリコール(Ethylene glycol)及びプロパンジオール(Propandiol)よりなる群から選択される少なくとも1種を含む。好ましくは、グリセリン(Glycerin)、1,3−ブチレングリコール(1,3−Butylene Glycol)及びプロパンジオール(Propandiol)の3種を混合して使用するのが良い。

0066

前記水相は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して75〜95重量%、好ましくは80〜85重量%含まれるのが良い。

0067

前記水は、水相の全体重量に対して50〜80重量%、好ましくは60〜70重量%含まれるのが良い。また、前記保湿剤は、水相の全体重量に対して20〜50重量%、好ましくは30〜40重量%含まれるのが良い。

0068

さらに具体的には、保湿剤としてグリセリン(Glycerin)を使用する場合には、水相の全体重量に対して10〜70重量%で含み、保湿剤として1,3−ブチレングリコール(1,3−Butylene Glycol)を使用する場合には、水相の全体重量に対して10〜30重量%で含み、保湿剤としてプロパンジオール(Propandiol)を使用する場合には、水相の全体重量に対して10〜40重量%で含む。最も好ましくは、保湿剤としてグリセリン(Glycerin)、1,3−ブチレングリコール(1,3−Butylene Glycol)及びプロパンジオール(Propandiol)を混合して使用し、このとき、前記3種を1:0.8〜1.2:0.8〜1.2の比率で混合して水相の全体重量に対して30〜40重量%含むのが良い。

0069

前記添加剤は、抗酸化剤、防腐剤及びpH調整剤の少なくとも一つを含み、前記抗酸化剤は、例えば、L−アスコルビン酸(L−ascorbic acid)、α−トコフェロール(α−tocopherol)、ポリフェノール(polyphenol)、カルノシン酸(carnosic acid)、リポ酸(lipoic acid)、2−アミノエタンスルホン酸(2−aminoethanesulfonic acid)、芳香族カルボン酸(aromatic carboxylic acid)及びこれらの組み合わせを含み、前記防腐剤は、例えば、1,2−ヘキサンジオール(1,2−hexanediol)、カプリル酸グリセリル(glyceryl caprylate)、メチルパラベン(methylparaben)、サリチル酸(salicylic acid)、イソプロピルパラベン(isopropylparaben)、フェノキシエタノール(phenoxyethanol)及びこれらの組み合わせを含み、前記pH調整剤は、例えばクエン酸Citric acid)またはL−アルギニン(L−arginine)を含む。

0070

前記添加剤は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して2.2〜12重量%含まれる。より具体的に、前記抗酸化剤は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して2〜10重量%含まれる。前記防腐剤は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して0.1〜1.0重量%、好ましくは0.1〜0.5重量%含まれるのがよい。

0071

前記pH調整剤は、ピッカリングエマルジョン組成物のpHを2〜4の範囲に調整するように含まれ、さらに具体的には、ピッカリングエマルション組成物の全体重量に対して0.1〜1.0重量%、好ましくは0.1〜0.5重量%含まれるのがよい。

0072

前記ピッカリングエマルジョン組成物は、前記成分を前記含有量で混合し、10,000rpm〜20,000rpmで30秒〜5分間粉砕処理した後、300〜800rpmで1〜5分間混合処理して得られる。

0073

前記インドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物を化粧品として使用する場合、スキン及びボディケア化粧品として、エッセンス、アンプル、石鹸、トニック及びボディエッセンス、エマルジョン、ローション、クリーム(水中油滴型、油中水滴型、多重相)、溶液、懸濁液(無水及び水系)、無水生成物(オイル及びグリコール系)、ジェル、粉末などの様々な剤形に製造でき、前記インドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物は、全体化粧品に対して0.05〜100重量%で含まれ、アンプル剤形の場合は、前記インドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン100重量%からなるものであり得る。

0074

また、前記ピッカリングエマルジョン組成物を含む化粧品製剤において収容可能な担体として、アルコール、オイル、界面活性剤、脂肪酸、シリコーン油、防腐剤、湿潤剤、保湿剤、粘性変形剤、乳剤、安定剤、紫外線遮断剤、発色剤、香料、希釈剤などをさらに含むことができるのは、上述したとおりである。

0075

以下、本発明を実施例及び実験例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

0076

<実施例1〜3−インドセンダン葉抽出物の製造>
本発明の実施例で使用したインドセンダン(Azadirachta indica)葉は、TNHH SBJ Viet Nam Co.から購入した。

0077

実施例1による熱水抽出物(AIW)は、乾燥した試料の重量の10倍の超純水を溶媒として用いて100℃で4時間抽出することを3回繰り返し行った後、抽出液ろ紙(No.20 filter paper、Hyundai micro Co.,Ltd.、韓国)で濾過濃縮凍結乾燥させた後、粉末化して得た。

0078

実施例2による70%エタノール抽出物(AIE)及び実施例3による70%アセトン抽出物(AIA)は、それぞれ、乾燥した試料の重量の10倍の溶媒に常温で24時間浸漬して抽出することを3回繰り返し行って抽出液を得、熱水抽出物と同様の方法で残りの抽出物を粉末化して得た(図1)。

0079

熱水抽出物の収率は16.55%、70%エタノール抽出物の収率は29.32%、70%アセトン抽出物の収率は26.38%であった。各抽出物は、4℃の冷蔵室保管し、以下の実験例の試料として使用した。

0080

<実験例1−抗酸化効果の測定>

0081

(1)測定試薬
抗酸化効果測定実験に使用された試薬は、次のとおりである。
2,2−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン6−スルホン酸ジアンモニウム塩(2,2−azino−bis(3−ethylbenzothiazoline−6−sulphonic acid)diammonium salt)、過硫酸カリウム(Potassium peroxodisulfate)、ブチルヒドロキシアニソール(Butylated hydroxy anisole(BHA))、L−アスコルビン酸(L−ascorbic acid)、タンニン酸(Tannic acid)、没食子酸エピガロカテキン(Epigallocatechin gallate(ECGC))、2,2−ジフェニル−1−ピクリルヒドラジル(2,2−diphenyl−1−picrylhydrazyl)、ピロガロール(Pyrogallol)、2,6−ジヒドロキシプリン(2,6−dihydroxypurine)、ニトロブルーテトラゾリウム(Nitro blue tetrazolium)、キサンチンオキシダーゼ(Xanthine oxidase)などは、Sigma aldrich Co.,Ltd.(St.Louis、MO、USA)製の製品を使用した。フォリンチオカルトフェノール試薬(Folin−ciocalteu phenol reagent)は、純正化学(日本)製の製品を使用した。エタノール(Ethanol)、2−アミノ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール(2−Amino−2−(hydroxymethyl)propane−1,3−diol)、塩化水素(Hydrogen chloride)、リン酸カリウム一塩基性(Potassium phosphate monobasic)、リン酸カリウム二塩基性(Potassium phosphate dibasic)などは、Duksan pure chemicals Co.,Ltd.(韓国)製の製品を使用した。

0082

各実験において、試料は、10mg/mLで蒸留水に溶かした後、5、10、50、100、500、1000μg/mLの濃度に希釈して準備する。

0083

(2)総ポリフェノール含有量の測定
フェノール含有量の測定は、Folin−Denisの方法で行う。各試料を10mg/mLで蒸留水に溶かした後、5、10、50、100、500、1000μg/mLの濃度に希釈して準備する。0.2mLのフォリン−チオカルト試薬(Folin ciocalteu reagent)を添加してよく混合した後、3分間室温放置した。3分後に0.7M Na2CO3飽和溶液0.5mLを加えて混ぜた後、各抽出物0.5mLずつ濃度別に入れて1時間反応させた後、725nmで吸光度を測定した。タンニン酸(Tannic acid)を用いた標準曲線を利用して量を換算した後、総ポリフェノール含有量を測定した。

0084

フェノール性画分は、天然物中に多く含有されており、フリーラジカルを消去することがこれらの主要役割であるという研究が多く報告されている。また、このようなフラボノイドフェノール酸アントシアニンなどのフェノール性画分がDPPHラジカル消去活性などの抗酸化活性に非常に重要な因子として作用する。本実験では、基本物質としてタンニン酸を用いて標準曲線を使用してインドセンダン抽出物のポリフェノール含有量を測定した。その結果を下記表1に示した。

0085

0086

表1に示すように、インドセンダン熱水抽出物(AIW)は52.94mg/g、70%エタノール抽出物(AIE)は51.37mg/g、70%アセトン抽出物(AIA)は73.45mg/gであって、各溶媒抽出物の中でもAIAが最も高いポリフェノール含有量を持っていることを確認することができた。薬用植物抽出物のポリフェノール含有量の分析(Shin JH, Jang JR, Kang MJ, Shin JH (2018) Physiological Activity of Five Kindsof Medicinal Plant Extracts with Various Solvents and Their Composites. Journal of life science, 28, 3, 320-330.)から出た葛花(6.46mg/g)、葛根(5.50mg/g)及びハマカンギク(2.48mg/g)などと比較したとき、AIW、AIE、AIAのポリフェノール含有量が高いことを確認した。

0087

(3)DPPHラジカル消去効果の測定
DPPHラジカル消去能の効果測定は、Bloisの方法で行った。2,2−ジフェニル−1−ピクリルヒドラジル(DPPH)を0.45mMの濃度となるように99%エタノールに溶かして準備し、それぞれの抽出物は、5、10、50、100、500、1000μg/mLの濃度に希釈して準備する。陽性対照群としては、ブチルヒドロキシアニソール(Butylated hydroxy anisole(BHA))を使用した。その後、96ウェルプレートに各抽出物120μLとDPPH60μLを添加し、室温で遮光して15分間反応させ、517nmでELISAリーダーを用いて消去活性を測定した。

0088

0089

1,1−ジフェニル−1−ピクリルヒドラジル(DPPH)は、電子供与能の測定に使用され、物質自体が非常に安定なフリーラジカル(free radical)を有し、517nmで他の波長と区別される光吸収を示して紫色を帯びる画分である。DPPHは、有機溶媒であるアルコールなどに安定し、抗酸化メカニズム過程でプロトンラジカル捕捉剤(proton−radical scavenger)によって脱色されるため、抗酸化活性を肉眼で容易に把握することができるという利点がある。DPPHラジカル消去能を測定してインドセンダン葉抽出物の抗酸化効能を測定した。その結果は図2aに示した。

0090

図2aから分かるように、AIW、AIE及びAIAが濃度依存的な抗酸化効果を示し、全体的にAIWが同じ濃度でより良い活性を持つ。さらに、1000μg/mLの濃度でAIWが41.41%の効果を示し、AIE、AIAはそれぞれ34.09%、30.61%の効果を示してAIWが残りの抽出物よりも高い効果を持つ。

0091

(4)ABTS+ラジカル(radical)消去効果の測定
ABTS+ cation decolorization assay方法によってABTSラジカルを用いた抗酸化力を測定した。7mMの2,2−アジノ−ビスと2.4mMの過硫酸カリウム(potassium persulfate)を同じ割合で混ぜ、遮光して12〜24時間放置して反応させた後、実験を行った。それぞれの抽出物は、5、10、50、100、500、1000μg/mLの濃度に希釈して準備し、陽性対照群としては、ブチルヒドロキシアニソール(Butylated hydroxy anisole(BHA))を使用した。その後、96ウェルプレートにABTS+溶液100μLと各抽出物100μLを加えて25℃で7分間反応させた後、波長734nmで吸光度を測定し、阻害率(%)で示した。

0092

0093

ABTSラジカル消去能は、ABTS(2,2−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)が過硫酸カリウム(potassium persulfate)と反応してABTS+ラジカルが生成されることにより、特有の色である青緑色を表すが、試料を添加すると、淡緑色に変わり、水素供与抗酸化物質(hydrogen donating antioxidant)と連鎖破壊型抗酸化物質(chain breaking antioxidant)の両方ともを測定することができるという特徴を持つ。抗酸化物質と反応することにより、吸光度の変化が生じるので、DPPH消去能実験法と共に多くの研究で用いられている。ABTSカチオンラジカル消去能を測定してインドセンダン葉抽出物の抗酸化効能を測定した結果は、図2bに示す。

0094

図2bから分かるように、最高濃度である1000μg/mLにおけるAIWは73.55%、AIE及びAIAは69.60%、62.24%の阻害率を示した。また、同じ濃度でAIWが最も高いABTS+カチオンラジカル捕捉活性(ABTS+ cation radical scavenging activity)を示した。

0095

(5)スーパーオキシドジスムターゼ(Superoxide dismutase)様活性効果の測定
Marklundの方法によってスーパーオキシドジスムターゼ(Superoxide dismutase(SOD))様活性を測定した。それぞれの試料は、5、10、50、100、500、1000μg/mLの濃度に希釈して準備し、陽性対照群としては、L−アスコルビン酸(L−ascorbic acid)を使用した。96ウェルプレートに、各試料溶液20μL、50mM Tris−HClバッファ(pH8.5)130μL、蒸留水に溶かした7.2mMのピロガロール(pyrogallol)20μLを入れ、20分室温で遮光して反応させた後、420nmで吸光度を測定してピロガロールの量を測定した。

0096

0097

スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)は、生体で有害なスーパーオキシドアニオンラジカル(・O2)と反応して過酸化水素(H2O2)を生成する酵素であって、酸素を使用するすべての生物に存在し、生体で活性酸素に対する障害の防御作用をする代表的な活性酸素阻害剤である。また、酸素分子還元されて生じるスーパーオキシドアニオンラジカル(superoxide anion radical)(・O2−・2O2+2e−→2・O2−)を除去する防御メカニズムに関与する酵素(2O2−+2H+→H2O2+O2−)であり、毒性が非常に強いヒドロキシラジカル(hydroxy radical)が生成されることを予防する作用をして抗炎症素材または皮膚老化防止のための美容的な素材であって、化粧品などの添加剤として使用されている。インドセンダン葉抽出物のSOD様活性効果を測定してインドセンダン葉抽出物の抗酸化効果を測定した結果は、図2cに示した。

0098

図2cより、AIW、AIE、AIAで最高濃度1,000μg/mLにおけるそれぞれの抽出物の効果は12.82%、24.13%、7.38%であり、AIE>AIW>AIAの順に効果を示すことを確認した。

0099

(6)スーパーオキシドアニオンラジカル(Superoxide anion radical)消去効果の測定
ニトロブルーテトラゾリウム(Nitroblue tetrazolium(NBT))還元方法によってスーパーオキシドアニオンラジカル(Superoxide anion radical)消去能を測定した。それぞれの試料を5、10、50、100、500、1000μg/mLの濃度に希釈して、各試料0.1mLと0.1Mのリン酸カリウムバッファ(Potassium phosphate buffer)(pH7.5)0.4mLにNBT(0.24mM)とキサンチン(Xanthine)(0.4mM)を溶かした基質(substrate)2mLを添加し、キサンチンオキシダーゼ(Xanthine oxidase)(0.2U/mL)2mLを添加して20分間37℃で反応させた後、1N HCl1mLを添加して吸光度560nmで測定した。陽性対照群としては、没食子酸エピガロカテキン(Epigallocatechin gallate(EGCG))を使用した。

0100

0101

スーパーオキシドアニオンラジカル(Superoxide anion radical)は、好気性細胞の酵素または非酵素的段階で非常に強い毒性が生成されるラジカルであって、老化に関連して酸化反応開始段階に関与する。また、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素などの活性酸素種の生成に関与して脂質、DNA、タンパク質などに酸化的損傷誘導することが知られている。このような過程中に抗酸化物質がスーパーオキシドアニオンラジカル(superoxide anion radical)と反応して消去されると、紫色に発色する現象が減少し、この吸光度の変化を用いて抗酸化効果を測定する方法である。スーパーオキシドアニオンラジカル(Superoxide anion radical)消去能を測定してインドセンダン葉抽出物の抗酸化効果を測定した結果を図2dに示した。

0102

図2dから分かるように、最高濃度1,000μg/mLでAIW、AIE、AIAの順に81.37%、96.04%、52.30%であった。同じ濃度でAIEが最も高い効能を示し、AIW、AIAの順にスーパーオキシドアニオンラジカル(superoxide anion radical)消去能を示した。

0103

<実験例2−抗菌効果の測定>

0104

(1)菌株及び培地
抗菌効果の測定に使用された菌株及び培地は、次のとおりである。
菌株としては、Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Pseudomonas auruginosa、Enterobacter cloace、Propionibacterium acnes、Candida albicansなどが使用された。培地としては、Nutrient broth(NB)、Tryptic soy broth(TSB)、Gifu anaerobic medium(GAM)、Nutrient agar(NA)、Tryptic soy agar(TSA)などが使用された。

0105

(2)菌培養
抗菌力測定実験のために使用した菌株は、Escherichia coli KCTC 2441、Staphylococcus aureus KCTC 1916、Enterobacter cloacae subsp cloacae KCTC 2361、Staphylococcus epidermis KCTC 1917、Pseudomonas aeruginosa KCTC 1750を使用した。ニキビ誘発菌としては、Propionibacterium acnes KCTC 3065を使用した。カビ菌としてCandida albicans KCTC 7965を継代培養して実験に使用した。前処理培養及び本実験の培養のための液体培地の場合、Escherichia coli、Staphylococcus epidermis、Pseudomonas aeruginosa及びEnterobacter cloacae subsp cloacaeの液体培地としてはNutrient broth(NB)をDifco Lab.(Sparks、USA)から購入して使用し、Staphylococcus aureusの液体培地としてはTryptic soy broth(TSB)をDifco Lab.(Sparks、USA)から購入して使用し、Propionibacterium acnesの液体培地としてはGifu anaerobic medium(GAM、Nissui Co.Japan)から購入して使用し、Candida albicans菌の液体培地としてはYeast Mold broth(YMB、Sparks、USA)から購入して使用した。固体培地としては、Nutrient ager(NA)、Tryptic soy Agar(TSA)、Yeast Mold agar(YMA)をDifco Lab.(Sparks、米国)から購入し、Gifu anaerobic medium(GAM)をNissui Co.Japanから購入して使用した。実験において、本培地に寒天末(Agar Powder)を添加して実験に使用した。

0106

(3)生育阻害環(Clear Zone)の測定
ペーパーディスク(Paper disc)を用いて生育阻害力を測定した。すなわち、液体培地15mLに、平板培地で培養された各菌株を1白金耳採取し、18〜24時間培養して活性化させた後、液体培地15mLに菌液を0.1mL接種して4〜8時間本培養した後、平板培地1個あたりの菌数が約1×106cellとなるように接種し、滅菌された綿棒を用いて均一に塗抹した。滅菌されたフィルターペーパーディスク(Filter paper disc)(8mm、東京、日本)を固体平板培地にのせ、試料を濃度別に0.05mL/discとなるように吸収させ、細菌は37℃のインキュベーター真菌は25℃のインキュベーターに12〜48時間培養してディスク周囲のClear zone(mm)の直径を測定することにより、阻害活性を確認した。

0107

ペーパーディスク寒天拡散法(Paper disc agar diffusion assay)によるインドセンダン葉抽出物の抗菌効果を調べ、その結果を生育阻害環(Clear zone)として測定して下記表2に示した。

0108

0109

表2に示すように、インドセンダン葉抽出物は、Escherichia coli、Staphylococcus epidermidis、Pseudomonas aeruginosa、Enterobacter cloace、Candida albicans菌に対して抗菌効果を持っていないことが分かった。Staphylococcus aureus菌に対してAIE及びAIAで2mg/discから1.0±0cm以上のclear zoneが現れ、Propionibacterium acnes菌に対してはAIW、AIE、AIAで5mg/discから1.1±0cm以上のclear zoneが現れたことを確認することができた。

0110

<実験例3−美白効果の測定>

0111

(1)測定試薬

0112

美白効果の測定に使用された試薬は、次のとおりである。
3,4−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキノコ由来チロシナーゼ(Tyrosinase from mushroom)などは、Sigma aldrich Co.,Ltd.(St.Louis、MO、USA)製の製品を使用した。Sodium phosphate monobasicdihydrate、Sodium phosphate dibasic anhydrousなどは、Duksan pure chemicals Co.,Ltd.(韓国)製の製品を使用した。美白効果の測定に使用されたMITF、チロシナーゼ(Tyrosinase)、TRP−1、TRP−2の2次抗体は、Santa Cruz(Biotech、CA、USA)から購入した。

0113

(2)キノコ(Mushroom)由来のチロシナーゼ阻害活性の測定
チロシナーゼ阻害活性をYagi等の方法によって測定した。それぞれの試料は、5、10、50、100、500、1000μg/mLの濃度に希釈して準備し、陽性対照群としてL−アスコルビン酸を使用した。67mMのリン酸ナトリウムバッファ(pH6.8)80μLに10mMのL−DOPAを溶かした基質(substrate)40μLと試料40μLとを混ぜた混合液に、キノコ由来チロシナーゼ(mushroom tyrosinase)[125unit/mL]40μLを添加して、10分間37℃で反応させた後、吸光度を492nmで測定した。

0114

0115

メラニン細胞(melanocyte)は、表皮基底層色素細胞内のメラノソーム(melanosome)で生合成されるが、ここで、メラニン(melanin)は、皮膚の色調を決定する重要な因子として作用する。アミノ酸の一種であるチロシナーゼ(tyrosine)は、メラニンを合成する物質である。チロシナーゼは、メラノーマ細胞(melanoma cell)内でのチロシナーゼによってL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(L−3,4−dihydroxyphenylalanine(DOPA))とDOPAキノン(quinone)に酸化する。その後、再びDOPAキノンが5,6−ジヒドロキシインドール(dihydroxyindole)、DOPAクローム(chrome)、インドール−5,6−キノン(indole−5,6−quinone)になり、インドール−5,6−キノン重合によってメラニンを生成することが知られている。このように皮膚中でのメラニンの重合体生合成を阻害することができるチロシナーゼの阻害活性を測定するために、キノコ(mushroom)由来のチロシナーゼ阻害活性を測定し、その結果を図3aに示した。

0116

図3aに示すように、最高濃度1,000μg/mLでAIWは32.77%、AIEは47.21%、AIAは45.36%であり、同じ濃度でAIEが最も高い活性を示した(ただし、データは3つの個別実験の平均±SDを表す)。陽性対照群として使用されたL−アスコルビン酸よりは低い効果が現れたが、インドセンダン葉抽出物は、天然物として相当な効果が確認され、美白作用に役立てることができると判断される。

0117

<実験例4−シワ改善効果の測定>

0118

(1)測定試薬
シワ改善効果の測定実験に使用された試薬は、次のとおりである。
N−スクシニル−Ala−Ala−Ala−p−ニトロアニリド(N−Succinyl−Ala−Ala−Ala−p−nitroanilide )、ブタ膵臓由来のエラスターゼ(Elastase from porcine pancreas)などは、Sigma aldrich Co.,Ltd.(St.Louis、MO、USA)製の製品を使用した。2−アミノ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール(2−Amino−2−(hydroxymethyl)propane−1,3−diol )、塩化水素(Hydrogen chloride)などは、Duksan pure chemicals Co.,Ltd.(韓国)製の製品を使用した。MMP−1、フィラグリン(Filaggrin)2次抗体は、Santa Cruz(Biotech、CA、USA)から購入した。

0119

(2)エラスターゼ阻害効果の測定
エラスターゼ阻害活性(Elastase inhibition activity)は、Cannellなどの方法を参照して実験を行った。N−スクシニル−(L−Ala)3−p−ニトロアニリド(N−succinyl−(L−Ala)3−p−nitroanilide)を用いて36℃で25分間基質から生成されるp−ニトロアニリド(p−nitroanilide)の生成量を405nmでELISAによって測定した。その後、それぞれの試料は、5、10、50、100、500、1000μg/mLの濃度に希釈して各試料液を40μL採取し、50nm濃度のtris−HClバッファ(pH8.6)に溶かしたブタ膵臓エラスターゼ(Porcine pancreas elastase)[0.5unit/mL]溶液40μLを加えた後、基質として、50mM濃度トリスバッファ(tris buffer)(pH8.6)に溶かしたN−スクシニル−(L−Ala)3−p−ニトロアニリドを添加して20分間反応させた後、結果を測定した。陽性対照群としては、没食子酸エピガロカテキン(Epigallocatechin gallate(ECGC))を使用した。

0120

0121

エラスチン(Elastin)は、真皮内で皮膚弾力を維持するのに非常に重要なタンパク質であり、皮膚の結合組織に存在して組織伸縮性と柔軟性に関与している。エラスターゼ(elastase)は、このようなエラスチン(elastin)を分解する酵素であり、シワやたるみなどの皮膚老化を発生させる原因の一つである。したがって、エラスターゼ(elastase)阻害剤は、皮膚のシワ改善によって老化を防止する作用をするが、インドセンダン葉抽出物のエラスターゼ阻害活性効果を測定した結果を図3bに示した。

0122

図3bから分かるように、最高濃度1000μg/mLにおけるAIW、AIE、AIAの順に17.56%、24.24%、21.92%であって、AIEが最も高い活性を示した(ただし、データは3つの個別実験の平均±SDを表す)。

0123

<実験例5−抗炎症効果の測定>

0124

(1)細胞株及び試薬
細胞生存率の測定に使用された細胞株Murine macrophage cell(RAW264.7)、Mouse melanoma cell(B16F10)は、American type culture collection(Manassas、VA、USA)製の製品を使用した。ヒトケラチノサイト細胞(Human Keratinocyte cell)(HacaT)は、韓国漢方振興院から分譲を受けた細胞を使用した。Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)、Fetal bovine serum(FBS)などは、LONZA Co.から製品を購入して使用した。0.25%トリプシン(trypsin)−EDTA、0.4%トリパンブルー染色剤(trypan blue stain)は、gibcoBRLCo.(Grand Island、NY、USA)から購入して使用し、3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド(3−[4,5−dimethylthiazol−2−yl]−2,5−diphenyl−tetrazolium bromide(MTT))試薬は、sigma chemical Co.Ltd(St.Louis、MO、USA)から購入した。

0125

(2)細胞毒性の測定

0126

1)細胞培養
本実験に用いたRAW264.7マクロファージ細胞、B16F10メラノーマ細胞、HacaTケラチノサイト細胞は、1%ペニシリンストレプトマイシン(100unit/mL)と10%FBSを添加したDMEM培地を用いて37℃、5%CO2インキュベーター適応させて継代培養した。

0127

2)MTTアッセイによる細胞生存率の測定
Carmichaelの方法によって細胞生存率を測定した。96ウェルプレートに細胞株RAW264.7、B16F10、HaccaT cellを1x104cells/wellとなるように分注し、インキュベーターで37℃、5%CO2の条件で24時間培養する。AIW、AIE、AIAをそれぞれ5、10、25、50、100、250、500μg/mLの濃度別に希釈した後、200μL/wellで採取し、24時間処理した。その後、2.5mg/mLの濃度で製造したMTT溶液を20μL/wellで添加して3〜4時間培養した後、培養液を除去し、ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide(DMSO))を100μL/wellで添加して室温で10分間反応させた後、540nmでの吸光度から結果を導出した。

0128

0129

インドセンダン(Azadirachta indica)によるマクロファージ細胞(macrophage cell)の細胞生存率をMTTアッセイで確認し、その結果を図4aに示した。

0130

図4aに示すように濃度別に測定した結果、濃度5、10、50、100μg/mLでAIW、AIE、AIAの全ては90%以上の生存率を示し、ウエスタンブロット(Western blot)、リアルタイム(Real−time)PCRは10、50、100μg/mLの3つの区間に設定して実験を行った(ただし、CはLPS処理群を意味する。データは3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005)。

0131

(3)一酸化窒素(Nitric oxide)生成阻害効果の測定
一酸化窒素(Nitric oxide(NO))の測定は、細胞の上澄み液の一酸化窒素(Nitric oxide(NO))の量を亜硝酸塩(Nitrite)及び硝酸塩(nitrate)で測定した。96ウェルプレートに細胞株RAW264.7を4x104cells/wellとなるように分注し、インキュベーターで37℃、5%CO2の条件で24時間培養する。その後、培養液を血清無添加DMEM培地に交換し、リポ多糖類(Lipopolysaccharide(LPS))を処置して炎症反応を誘導する。したがって、LPS 1ppm/wellとなるように処理し、それぞれの試料溶液を濃度別に処理した後、インキュベーターで37℃、5%CO2の条件で24時間培養する。その後、新しい96ウェルプレートに細胞培養液を100μL移し、グリース試薬(griess reagent)を100μL添加して常温で5分間反応させた後、540nmで吸光度を測定して結果を計算した。

0132

0133

インドセンダン(Azadirachta indica)によるマクロファージ細胞(macrophage cell)であるRAW264.7でグルコン酸キトサン(Chitosan Gluconate)の一酸化窒素(Nitric oxide)の抑制程度を測定するために、溶媒別、濃度別にサンプルを処理してNO量を測定した結果を図4bに示した。

0134

図4bに示すように、最高濃度100μg/mLでAIW、AIE、AIAの順に35.7%、68.86%、66.45%の阻害効果を示した。同じ濃度であるとき、AIEが最も多いNO阻害活性を示した(ただし、NはLPS未処理群、CはLPS処理群を意味する。データは3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005)。

0135

(4)ウエスタンブロット(Western blot)によるタンパク質発現の測定
iNOSとCOX−2、チロシナーゼ(Tyrosinase)、TRP−1、TRP−2、MMP−1、フィラグリン(Fillagrin)タンパク質発現を確認するために、6ウェルプレートに細胞株RAW264.7、HacaT cellを3x105cells/well、B16F10が2x105cells/wellとなるように分注し、37℃、5%CO2インキュベーター(incubator)で24時間培養する。その後、培養液を血清無添加DMEM培地に交換した後、細胞の炎症、美白処理、シワ改善反応を誘導するために、RAW264.7はリポ多糖類(lipopolysaccharide(LPS))、B16F10はα−メラノサイト刺激ホルモン(Alpha−Melanocyte−stimulating hormone(α−MSH))を1ppm/wellとなるように処理し、各試料溶液を濃度別に処理し、インキュベーター(incubator)で37℃、5%CO2の条件で24時間培養する。HacaT cellは、無処理群を除いたすべての実験群PBSで1回洗浄した後、PBSを入れてUV−B(300mJ/cm2)を照射した。照射後、試料溶液を濃度別に処理し、24時間〜48時間培養する。その後、培地を除去した後、PBSで1回洗浄し、ホスファターゼ(phosphatase)とプロテアーゼ阻害剤(protease inhibitor)をそれぞれ0.1%含有させたRIPAバッファを60μL/wellで処理して細胞を溶解させ、遠心分離器を用いて4℃、12,000rpmで1分間遠心分離させ、得られた上澄み液を新しいチューブに移す。メンブレイン(membrane)は、デジタル往復シェーカー(Digital reciprocating shaker)機器を用いて5%スキムミルク(skim milk)2時間、1次抗体(Primary antibody)2時間、1X TBST溶液10分(3回繰り返し)、2次抗体(Secondary antibody)1時間、1X TBST溶液10分(3回繰り返し)の順のブロッキング(blocking)過程を経た後、HRP基質(substrate)発色試薬で2分間反応させ、その後、ウエスタンイメージングシステム(western imaging system)(CAS−400SM、Davinch−K Co.,Ltd.、韓国)機器を用いてバンドを確認し、定量及び結果を算出した。

0136

インドセンダン(Azadirachta indica)がiNOS、COX−2に及ぼす影響を見るために、LPSにより誘導されたmouse macrophages cell(RAW264.7)にAIW、AIE、AIAは10、50、100μg/mLの濃度で処理した後、24時間後に回収してウエスタンブロット(western blot)を介して発現を確認した。対照群としては、ピロリジンカルボジチオ酸アンモニウム(Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate(PDTC))を使用した。ハウスキーピング遺伝子(Housekeepinggene)としてはβ−actinを使用した。AIW、AIE、AIAに対するそれぞれの結果を図5a図5b及び図5cに示した。

0137

図5a図5b及び図5cに示すように、AIEはiNOS、AIAはiNOS、COX−2タンパク質の発現阻害が現れたことを確認することができた(ただし、NはLPS未処理群、CはLPS処理群を意味する。データは3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005)。

0138

(5)mRNA分離及びリアルタイム(Real−time)PCR分析
6ウェルプレートに細胞株RAW264.7、B16F10及びHacaT cellを3x105cells/wellとなるように分注し、インキュベーターで37℃、5%CO2の条件で24時間培養する。その後、培養液を血清無添加DMEM培地に交換した後、細胞の炎症及び美白処理、シワ改善反応を誘導するために、RAW264.7はリポ多糖類(lipopolysaccharide(LPS))、B16F10はα−メラノサイト−刺激ホルモン(Alpha−Melanocyte−stimulatinghormone(α−MSH))を1ppm/wellとなるように処理し、各試料溶液を濃度別に処理した後、37℃、5%CO2インキュベーターで24時間培養する。HacaT cellは、無処理群を除いたすべての実験群ではPBSで1回洗浄した後、PBSを入れてUV−B(300mJ/cm2)を照射した。照射後、試料溶液を濃度別に処理し、24〜48時間培養する。その後、培地を除去した後、PBSで1回洗浄し、その後にTRI−Solutionを1ml/wellとなるように添加して細胞を完全に溶解させ、新しいチューブに移して常温で5分間培養する。次に、クロロホルム(chloroform)をチューブあたり200ml添加して強くボルテックス(vortex)させ、再び5分間培養する。その後、4℃で12000rpmで20分遠心分離し、透明な上澄み液500μLを新しいチューブに移す。上澄み液にイソプロピルアルコール(Isopropyl alcohol)500μLを添加し、数回反転(inverting)させた後、5分間培養し、4℃で12000rpmで20分間遠心分離させて上澄み液を除去する。底に残ったペレットは、75%エタノール1mLで洗浄した後、完全に乾燥させ、50μLのDEPC水を用いて溶解させる。その後、吸光度を用いたRNA定量を経て、TProfessionalbasicthermocycler機器を用いてcDNA合成した。その後、power SYBR green PCR master mix試薬とそれぞれのプライマー(primer)、cDNAを用いてstep one real−time PCR system機器で95℃10秒、60℃15秒、72℃20秒間反応する温度サイクル条件を40回繰り返し行い、解析プログラム(analysis program)を用いて定量分析を行った。実験に使用した配列(sequence)は、下記表3に示す。

0139

0140

リアルタイムPCRは、従来のPCRよりも速く測定が可能であり、汚染率が少なくて広く用いられる。先立ってのウエスタンブロット(Western blot)実験と抗酸化実験の結果に基づいてAIEが最も良い効能を持つことを確認し、本実験ではAIEを選択して実験を行った。AIEをリアルタイムPCRを用いてiNOSのmRNA発現抑制率を示した結果を図6aに示した。

0141

図6aに示すように、AIEのiNOS発現抑制効果は、最高濃度100μg/mLで97.49%の抑制効果を確認することができた(ただし、NはLPS未処理群、CはLPS処理群を意味する。データは3つの個別実験の平均±SDを示す。LPS処理対照群と比較して、*p<0.01は有意な差を示す)。

0142

<実験例6−インドセンダン葉抽出物の美白効能の測定>

0143

(1)メラノーマ細胞(B16F10)の細胞毒性の確認
インドセンダン(Azadirachta indica)(70%エタノール抽出)によるメラノーマ細胞(Melanoma cell)の細胞生存率をMTTアッセイを介して確認した結果を図6bに示した。

0144

図6bに示すように、AIE濃度2.5、5、10、25μg/mLでいずれも85%以上の生存率を示し、ウエスタンブロット(Western blot)は、上位3つの区間に設定して実験を行った(ただし、Nはα−MSH未処理群を意味する。データは、3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01)。

0145

(2)ウエスタンブロット(Western blot)によるTRP−1、TRP−2及びチロシナーゼ(Tyrosinase)発現抑制の確認
メラニン生合成に関与するα−メラノサイト−刺激ホルモン(Alpha−Melanocyte−stimulating hormone(α−MSH))は、cAMP経路を活性化させるメラノコルチン−1受容体(melanocortin−1 receptor(MC1R))が関連してメラニン(melanin)合成を調節するが、細胞でcAMPが増え続けるとき、PKA(cAMP−dependent protein kinase or protein kinase A)がCREB(cAMP Response Element Binding Protein)をリン酸化させてチロシナーゼ(Tyrosinase)遺伝子発現を誘導させるMITF発現を増加させる。インドセンダン抽出物がメラニン(melanin)の生成にどの影響を与えるかを確認するために、メラニン形成に影響を及ぼす因子をウエスタンブロック(Western blot)実験によって確認し、その結果を図6cに示した(ただし、A:TRP−1、B:TRP−2、C:チロシナーゼメラノーマ細胞(Tyrosinase Melanoma cells))

0146

図6cに示すように、メラニン形成阻害関連実験結果、AIEでは、α−MSHによって誘導された最高濃度10μg/mLにおける、TRP−1は36.35%の阻害率を示し、残りの因子であるTRP−2とチロシナーゼ(Tyrosinase)は抑制しないものと判断される(ただし、Nはα−MSH未処理群、Cはα−MSH処理群を意味する。データは、3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01)。

0147

(3)リアルタイム(Real−time)PCRを用いたTRP−1発現抑制の確認
AIEのTRP−1mRNA発現抑制率をリアルタイム(Real−time)PCRを用いて確認し、その結果を図6dに示した。

0148

図6dに示すように、AIEが最高濃度10μg/mLで87.43%のTRP−1発現抑制効果を示し、対照群であるアルブチン(Arbutin)濃度100μg/mLでは14.86%より高い抑制効果を確認することができた(ただし、Nはα−MSH未処理群、Cはα−MSH処理群を意味する。データは3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005)。

0149

<実験例7−インドセンダン葉抽出物のシワ改善効能の測定>

0150

(1)ヒトケラチノサイト細胞(Human keratinocyte cell)(HacaT)の細胞毒性の確認
インドセンダン(Azadirachta indica)(70%エタノール抽出)によるヒトケラチノサイト細胞の細胞生存率をMTTアッセイを介して確認した結果を図7aに示した。

0151

図7aに示すように、AIE濃度1、2.5、5、10、25μg/mLから濃度10μg/mLまで90%以上の生存率を示し、ウエスタンブロット(Western blot)は2.5、5、10μg/mLの3つの区間に設定して実験を行った(ただし、CはDMEMのみ処理された群を意味する。データは、3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01)。

0152

(2)ウエスタンブロット(Western blot)によるMMP−1、フィラグリン(Filaggrin)タンパク質発現の確認
MMPsは、皮膚の線維芽細胞、角質形成細胞を始めとして多くの細胞から分泌され、現在まで約20種の種類があると知られている。MMP−1は、コラゲナーゼ−1(Collagenase−1)として知られており、I型とIII型コラーゲンを基質とする。プロフィラグリン(Profilaggrin)と呼ばれる前駆体は、角質層の角質形成細胞の主要特徴であるケラチノヒアリン顆粒として知られている細胞であり、これは体内に蓄積される。本実験では、MMP−1とフィラグリン(Filaggrin)タンパク質の発現を確認し、その結果を図7bに示した。

0153

図7bに示すように、AIEは、最高濃度10μg/mLにおけるMMP−1では9.93%の抑制率を示し、フィラグリン(Filaggrin)では32.52%の保湿効果を持つことを確認することができた(ただし、NはUV−B未処理群、Cは、UV−B処理群を意味する。データは3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01)。

0154

<実験例8>インドセンダン葉抽出物の抗公害(anti−pollution)効能の測定

0155

(1)細胞毒性の確認
インドセンダン(70%エタノール抽出)による角質形成細胞(HaCaT cell)、線維芽細胞(CCD−986sk cell)での細胞生存率をMTTアッセイを介して確認した結果を、図8a及び図8bに示した。

0156

図8aに示すように、角質形成細胞(HaCaT cell)は、AIE濃度5、10、25、50、100μg/mLで90%以上の生存率を示した(ただし、Cは、UV−Bを処理していない群を意味する。データは3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01)。

0157

図8bに示すように、線維芽細胞(CCD−986sk cell)は、AIE濃度5、10、25、50、100μg/mLで90%以上の生存率を示した(ただし、CはDMEMのみ処理された群を意味する。データは3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01)。

0158

(2)皮膚細胞の保護による抗公害(anti−pollution)効能の確認
角質形成細胞であるHaCaT cell、線維芽細胞であるCCD−986sk cellそれぞれに対してインドセンダン70%エタノール抽出物(ethanol extracts)の抗公害効果実験を行った。

0159

1)まず、HaCaT cellを1×104cells/wellとなるように分注し、インキュベーター(incubator)で37℃、5%CO2の条件で24時間培養する。その後、培養液を血清無添加DMEM培地に交換し、ベンゾ[α]ピレン(Benzo[α]pyrene(BP))を処理して刺激する。したがって、ベンゾ[α]ピレン(Benzo[α]pyrene(BP))100ppm/wellとなるように処理し、それぞれの試料溶液を濃度別に処理した後、インキュベーターで37℃、5%CO2の条件で24時間培養する。その後、2.5mg/mLの濃度で製造したMTT溶液を20μL/wellで添加して3〜4時間培養した後、培養液を除去し、ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide(DMSO))を100μL/wellで添加して室温で10分間反応させた後、540nmでの吸光度を介して結果を導出した。

0160

2)CCD−986sk cellに対しては、上記と同様にBPに対する抗公害実験と、BPの代わりに微細粒子状物質150ppm/wellを処理して抗公害実験を行った。
その結果は、図9に示した。

0161

図9aに示すように、細胞にベンゾ[α]ピレン(Benzo[α]pyrene(BP))のみを処理した場合には、30%程度の死滅を示し、ベンゾ[α]ピレン(Benzo[α]pyrene(BP))を処理した細胞にインドセンダン抽出物を5、10、25、50、100μ/mLで処置した場合には、ベンゾ[α]ピレン(Benzo[α]pyrene)のみを処理した細胞と比較して25μm/mL以上で90%以上の改善効果を示した(ただし、Nはベンゾピレンを処理していない群、Cはベンゾピレンのみを処理した群を意味する。データは、3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01)。

0162

図9bに示すように、CCD−986sk細胞にベンゾ[α]ピレン(Benzo[α]pyrene)のみを処理した場合には、31%程度の死滅を示し、ベンゾ[α]ピレン(Benzo[α]pyrene)を処理した細胞にインドセンダン抽出物を5、10、25、50、100μg/mLで処理した場合には、ベンゾ[α]ピレン(Benzo[α]pyrene)のみを処理した細胞と比較して25μg/mL以上で80%以上の改善効果を示した(ただし、Nはベンゾピレンを処理していない群、Cはベンゾピレンのみを処理した群を意味する。データは3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01)。

0163

図9cに示すように、CCD−986sk細胞に微細粒子状物質のみを処理した場合には、23%程度の死滅を示し、微細粒子状物質を処理した細胞にインドセンダン抽出物を5、10、25、50、100μg/mLで処理した場合には、微細粒子状物質のみを処理した細胞と比較して100μg/mLで85%以上の改善効果を示した(ただし、Nは、微細粒子状物質を処理していない群、Cは微細粒子状物質のみを処理した群を意味する。データは3つの個別実験の平均±SDを示す。対照群と比較して有意である。*p<0.05、**p<0.01)。

0164

(3)ヒアルロン酸分解防止による抗公害(anti−pollution)効能の確認
インドセンダン70%エタノール抽出物(ethanol extracts)が重金属から皮膚保湿に関与するヒアルロン酸を保護することができるかを確認するために、鉄分(325mg)、インドセンダン70%エタノール抽出物0.5g及びEDTA−2Naを反応させた。

0165

0166

ヒアルロン酸分解防止効果はヒアルロン酸の粘度測定によって確認し、その結果は表4に示した。ヒアルロン酸が重金属により分解されると、溶液の粘度が減少するので、粘度が低いほどヒアルロン酸が多く分解されたことを意味する。表4に示すように、一般的に重金属吸着時に使用される錯化合物形成物質であるEDTA−2Naと比較すると、インドセンダン抽出物を含有したときに鉄と結合する効果がより良くて粘度がさらに高いことを確認することができた。これにより、インドセンダン抽出物は、ヒアルロン酸分解防止効果がさらに向上することを確認することができる。

0167

<実験例9−ピッカリングエマルジョンの製造及び安定性の測定>

0168

(1)ピッカリングエマルジョンの製造原料
ピッカリングエマルジョン(Pickering emulsion)剤形の粉末状は、コーティング処理されていないシリカ(シリル化シリカ(Silica silylate)、CABOT)を使用した。水相は、保湿剤としてグリセリン(Glycerin)(植物由来のグリセリン(Vegetable Glycerin)、LG H&H)、1,3−BG(1,3−ブチレングリコール、Cosnet)、プロパンジオール(1,3−プロパンジオール、USA)を使用した。抗酸化剤としてビタミンC(L−アスコルビン酸、DAEJUNG製)を使用した。防腐剤としてヘキサンジオール(1,2−ヘキサンジオール、K1 Solution)、エチルヘキシルグリセリン(エチルヘキシルグリセリン、K1 Solution)を使用した。

0169

(2)ピッカリングエマルジョンの製造
中水型エマルジョン(W/A emulsion)の製造は、下記表5に基づいて水相を計量した後、粉末形態であるシリル化シリカ(Silica Silylate)を粉砕機に入れて15,500rpmで1分間粉砕した後、ビーカーに移し、Agiミキサーで500rpmにて3分間処理してパウダーエッセンス形態のピッカリングエマルジョンを製造した(図10)。

0170

0171

本実験例では、保湿剤、pH調整及びL−アスコルビン酸の含有量に応じて、ピッカリングエマルジョンが最もよく形成された含有量を選択して製造した。ピッカリングエマルジョンは、シリカ(Silica)成分が水相に取り囲まれて空気を防ぎ、安定性をより一層高める。したがって、ピッカリングエマルジョンの複合保湿剤とL−アスコルビン酸の含有量によって酸化安定性に重要な役割を果たすことが分かる。以下の実験例では、それぞれの原料の配合による液晶形成を確認してみた。

0172

(3)保湿剤(グリセリン)の含有量による剤形変化
保湿剤として使用されたグリセリンの含有量によるパウダー形成を確認してみた。下記表6のようにグリセリンの含有量を10%ずつ70%まで増加させながら使用した剤形の変化結果を図11(a)に示した。図11aに示すようにパウダー形成を行うので、70%までグリセリン(Glycerin)を添加しても剤形が良好であることを確認することができた。

0173

0174

(4)保湿剤(1,3−ブチレングリコール)の含有量による剤形変化
保湿剤として使用された1,3−ブチレングリコール(1,3−BG)の含有量によるパウダー形成を確認した。表7ように1,3−BGの含有量を10%ずつ40%まで増加させながら使用した剤形の変化結果を図11bに示した。図11bに示すようにパウダー形成を行うので、30%まで1,3−BGを添加しても剤形が良好であることを確認することができた。

0175

0176

(5)保湿剤(プロパンジオール)の含有量による剤形変化
保湿剤として使用されたプロパンジオールの含有量によるパウダー形成を確認してみた。表8のようにプロパンジオール(Propandiol)の含有量を10%ずつ50%まで増加させながら使用した剤形の変化結果を図11cに示した。図11cに示すようにパウダー形成を行うので、40%までプロパンジオールを添加しても剤形が良好であることを確認することができた。

0177

0178

(6)複合保湿剤の含有量によるTEWL水分蒸発測定の結果
保湿剤として使用されたグリセリン、1,3−ブチレングリコール、プロパンジオールの含有量を表9に示すように混ぜた後、A、B、C、Dでパウダー形成を確認してみた。図12に示すように、TEWL水分蒸発測定計を用いて経皮水分喪失量の差を見たとき、対照群として使用された水よりも4時間後の水分喪失量がA、B、C、Dの順に15.93、4.06、18.86、12.6g/m2/hと低い喪失量を示し、複合保湿剤Cが最も良い保湿力を持つことを確認し、以後の実験で複合保湿剤Cを用いて行った。

0179

0180

(7)pHによる剤形変化
クエン酸(Citric acid)とL−アルギニンを用いて、表10に示すように水相のpHを3〜10までに合わせてpHに応じてシリカのピッカリングエマルジョン(Pickering emulsion)剤形が形成されるかを確認して図13aに示した。その結果、図13aに示すようにpH3〜9までエマルジョン(emulsion)が形成され、pH10では壁面に剤形が滲み出ることを確認することができた。よって、pHの範囲を3〜9に定めて次の実験を行った。

0181

0182

(8)L−アスコルビン酸原料のpH含有量による剤形変化
L−アスコルビン酸を1%に計量して水相のpHをそれぞれ測定し、表11のように、AはpH測定値が2.98であり、BはL−アルギニンを用いてpH値を調整して6.5に合わせ、45℃のチャンバーに一週間放置した後に測定した結果を図13bに示した。図13bに示すように、Bは安定性が壊れたことを確認し、Aは一番目の日と比較して類似の結果を示すことを確認することができた。したがって、次の実験でL−アスコルビン酸を入れた後、pHを2〜4に合わせて実験を行った。

0183

0184

(9)L−アスコルビン酸の含有量による剤形変化
L−アスコルビン酸(ビタミンC)の含有量による剤形変化を確認するために実験を行った。表12に示すように、L−アスコルビン酸の含有量を2.00%、5.00%、10.00%、15.00%に増加させながら使用した結果、図13cに示すようにパウダー形成を行うので、10%まで添加しても剤形が安定的であることを確認することができる。

0185

0186

(10)温度と時間によるpHの測定
皮膚におけるpHは皮膚の皮脂膜を測定して示すが、おおむね弱酸性の範囲を持っている。しかし、このような範囲から外れると、皮膚における微生物の増殖が活発になり、刺激、感染、かゆみなどを誘発することができる。よって、化粧品のpHは、このような範囲内で製造し且つ維持されるべき必要がある。表5に示す組成で製造されたピッカリングエマルジョン組成物のpHの変化を測定するために、60日間25℃と暗室の条件を維持させて確認した。その結果を下記表13に示す。

0187

0188

(11)温度と時間による相変移の測定
表5に示す組成で製造されたピッカリングエマルジョン組成物の相変移、変質及び分離などの安定性を測定するために、60日間0℃、25℃、45℃の条件を維持させながら確認した。その結果を表14に示す。測定した結果、45℃ではL−アスコルビン酸の安定性が壊れながら、黄色パウダーに変わって不安定であることを確認したとともに、残りの温度である0℃、25℃では白色パウダー形態を維持したことを確認することができた。よって、温度が高ければ剤形の安定性が壊れるおそれがあることを確認した。

0189

0190

前述した各実施例で例示された特徴、構造、効果などは、実施例の属する分野における通常の知識を有する者であれば、他の実施例に対しても組み合わせまたは変形させて実施可能である。よって、それらの組み合わせ及び変形に関する内容も本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

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