図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2021年6月3日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (4)

課題・解決手段

列番号1のアミノ酸配列を有する野生型PlySs2溶解素ポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む修飾溶解素ポリペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸置換がCHAPドメイン及び/又はSH3bドメイン中にあり、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる、修飾溶解素ポリペプチドが本明細書に開示される。修飾溶解素ポリペプチドを含む組成物、及び修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターが本明細書に更に開示される。グラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法、細菌感染治療する方法、及び抗生物質の有効性を高めるか、又は抗生物質耐性発現を低減する方法も本明細書に開示される。

概要

背景

抗生物質耐性は、世界的に増加しており、特に、(a)様々な病気及び他の病態治療するために投与される抗生物質の使用の増加及び長期化、(b)低い患者コンプライアンス、並びに(c)既存の抗生物質に対する耐性発現した病原体に対して採用することができる新たな抗微生物剤不足の影響を受ける。

バクテリオファージエンドリシン溶解素)は、細菌感染対抗し、細菌耐性を克服する有望な代替的又は相補的アプローチである。溶解素は、バクテリオファージによって自然に産生され得るペプチドグリカンヒドロラーゼである。外部から細菌と接触することで、組換えにより作製された溶解素ポリペプチドは、細菌を直接溶解し、死滅させる(1)、(2)。溶解素は、病原体への抗生物質剤アクセスを促進することによっても抗生物質耐性を克服することができる。近年、幾つかの研究から、器官限局性(organ-confined)感染及び全身感染において粘膜表面上の病原体を制御する、これらの酵素の人間医学及び獣医学における大きな可能性が示されている。

グラム陽性細菌は、ポリペプチド及び多糖を含有する細胞壁に囲まれている。グラム陽性細胞壁は、約20nm〜80nmの厚さであり得る幅広い緻密な壁のように見え、ペプチドグリカンの多数の相互接続層を含有する。グラム陽性細胞壁の60%〜90%が細胞形状、剛構造、及び浸透圧衝撃に対する耐性をもたらすペプチドグリカンである。細胞壁は、グラム染色クリスタルバイオレットを排除せず、細胞が紫色に染色され、したがって「グラム陽性」に分類される。

バクテリオファージ溶菌酵素は、様々な投与経路を介した被験体における様々なタイプの感染の特異的治療に有用であるとして確立されている。例えば、特許文献1、特許文献2、特許文献3、特許文献4、特許文献5及び特許文献6を参照されたい。Fischetti et al.に対する米国特許第9,034,322号(その全体が引用することにより本明細書の一部をなす)は、溶解素PlySs2を含む、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)細菌に由来するバクテリオファージ溶解素に関する。これらの溶解素ポリペプチドは、ブドウ球菌、B群レンサ球菌腸球菌及びリステリア細菌株等のグラム陽性細菌を含む複数の細菌に対して広範な死滅活性を示す。

PlySs2溶解素は、動物モデルにおいてスタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureus)細菌を死滅させ、抗生物質と相乗作用を示し、抗生物質耐性を克服(又は予防)することが可能である。PlySs2は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)及びバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(VRSA)等の抗生物質耐性スタフィロコッカス・アウレウスに対して効果的であることが示されている。

治療用タンパク質による炎症性免疫応答の誘発は、望ましくない(6)、(8)。タンパク質免疫原性が、合成起源に由来するか又は生物学的(例えば、組み換え)起源に由来するかに関わらず、外因性タンパク質及びペプチドについて懸念される可能性がある。場合によっては、治療用タンパク質は、重度有害事象(例えば、貧血血小板減少症アナフィラキシー及び先天性免疫応答)を引き起こし、これが更に致死的となる場合もある。よく知られている例としては、トロンボポエチンで治療した患者における血小板減少症、及び機能的に冗長でない内因性EPOと交差反応する中和抗体誘導による、認可済みエリトロポエチン(EPO)製剤であるEPREX(商標)で治療した慢性腎疾患患者における赤芽球癆が挙げられる。モノクローナル抗体トロンボキナーゼ及びPULMOZYME(商標)(ドルナーゼアルファ)を含む様々な製品で免疫原性が報告されているため、免疫原性は規制機関、業界及び臨床医による大きな注目を集め続けている。かかる免疫応答は、潜在的な細菌感染のために既に炎症応答を起こしている患者において悪化する可能性がある。

PlySs2等の溶解素は、タンパク質であるため、宿主に投与した場合に免疫応答を引き起こす可能性がある。上で論考される重大な副作用を引き起こすことに加えて、かかる免疫応答は、溶解素の溶菌活性を低下させる可能性もある。実際に、Cpl−1等の他のタイプの溶解素による幾つかの免疫応答が動物において観察されており、これは溶菌活性の遅延を引き起こしたが、実質的には阻害しなかった。しかしながら、他の研究者により、Cpl−1の投与が炎症性サイトカイン分泌の大幅な増加を伴うことが観察された(9)。

コンピューターによる計算ガイドツールがタンパク質のエピトープ領域の特定を容易にし、免疫原性である傾向がより低い変異体を設計するために開発されている(11)〜(18)。かかる手法は有用であり得るが、幾つかの制約を有する。これらの制約には、例えば幾つかの推定細胞エピトープを除外する可能性がある抗原プロセシングT細胞受容体多形性及び三次元複雑性のためにコンピューターによる方法を用いてT細胞受容体親和性を予測することができないこと、T細胞エピトープ表現型を予測することができないこと、個々の患者及び翻訳因子の影響を考慮して患者集団を用いて考案される統計的手法適用性限界、並びにコンピューターによる手法及びその根底にある前提固有の限界が含まれ得る(8)。したがって、ペプチドの免疫原性を低下させるには試行錯誤及び不確実性が残る。

概要

列番号1のアミノ酸配列を有する野生型PlySs2溶解素ポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む修飾溶解素ポリペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸置換がCHAPドメイン及び/又はSH3bドメイン中にあり、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる、修飾溶解素ポリペプチドが本明細書に開示される。修飾溶解素ポリペプチドを含む組成物、及び修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターが本明細書に更に開示される。グラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法、細菌感染を治療する方法、及び抗生物質の有効性を高めるか、又は抗生物質耐性の発現を低減する方法も本明細書に開示される。

目的

幾つかの実施形態では、本開示は、被験体に本明細書に開示の1つ以上の修飾溶解素ポリペプチドを対象の抗生物質と共に投与することによって、グラム陽性細菌に対する1つ以上の抗生物質の抗生物質活性を単独で使用される該抗生物質の活性と比較して高める方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

列番号1のアミノ酸配列システインヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼペプチダーゼCHAP)ドメイン及び細胞壁結合(SH3b)ドメインを有する野生型PlySs2溶解素ポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む修飾溶解素ポリペプチドであって、前記少なくとも1つのアミノ酸置換が前記CHAPドメイン及び/又は前記SH3bドメイン中にあり、該修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる、修飾溶解素ポリペプチド。

請求項2

前記少なくとも1つのアミノ酸置換が前記CHAPドメイン中の配列番号1のアミノ酸残基35、92、104、128及び137から選択される少なくとも1つの位置、及び/又は前記SH3bドメイン中の配列番号1のアミノ酸残基164、184、195、198、204、206、212及び214から選択される少なくとも1つの位置にある、請求項1に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項3

前記CHAPドメイン中の前記少なくとも1つのアミノ酸置換がR35E、L92W、V104S、V128T及びY137Sの少なくとも1つである、請求項2に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項4

前記SH3bドメイン中の前記少なくとも1つのアミノ酸置換がY164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E及びV214Gの少なくとも1つである、請求項2に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項5

R35E、L92W、V104S、V128T及びY137Sからなる群から選択される前記CHAPドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸置換と、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E及びV214Gからなる群から選択される前記SH3bドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸置換とを有する、請求項2に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項6

前記CHAPドメイン中に少なくとも2つのアミノ酸置換を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項7

前記SH3bドメイン中に少なくとも2つのアミノ酸置換又は少なくとも3つのアミノ酸置換を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項8

前記修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1と比較して3つ〜9つのアミノ酸置換を含み、該3つ〜9つのアミノ酸置換がR35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212E、V212A及びV214Gから選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項9

前記少なくとも1つのアミノ酸置換がL92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D及びS198Qを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項10

前記CHAPドメイン中の前記少なくとも1つのアミノ酸置換がL92W、V104S、V128T及びY137Sを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項11

前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、(i)L92W、V104S、V128T及びY137S、(ii)Y164N、N184D、R195E、V204K及びV212E、(iii)L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H及びI206E、(iv)L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A及びV212A、(v)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D及びS198Q、(vi)V128T、Y137S及びY164K、(vii)R35E、L92W、V104S、V128T及びY137S、(viii)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K及びV212E、(ix)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K及びV212E、(x)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N及びN184D、(xi)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N及びR195E、(xii)L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A及びV212A、(xiii)L92W、V104S、V128T、Y137S及びY164K、(xiv)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E及びV214G、並びに、(xv)L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D及びS198H、からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項12

スタフィロコッカスアウレウスリステリアモノサイトゲネス;スタフィロコッカス・アウレウス;スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群及びスタフィロコッカス・ヒイカス群等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌ストレプトコッカス・スイス;ストレプトコッカス・ピオゲネス;ストレプトコッカス・アガラクティアエ;ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ;ストレプトコッカス・ニューモニアエ;ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群等の緑色レンサ球菌群に含まれる種;エンテロコッカスフェカーリス;並びにエンテロコッカス・フェシウムの1つ以上に対して野生型PlySs2溶解素の約2倍、約3倍又は約5倍以下の最小阻止濃度MIC)を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項13

前記MICがスタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、リステリア・モノサイトゲネス及びストレプトコッカス・アガラクティアエの1つ以上に対して野生型PlySs2溶解素の約5倍以下である、請求項12に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項14

前記MICが野生型PlySs2溶解素の約4倍以下である、請求項12又は13に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項15

前記MICが野生型PlySs2溶解素の約2倍以下である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項16

野生型PlySs2溶解素と比較して免疫原性を低下させ、及び/又は炎症応答関連毒性を低下させる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項17

グラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖の阻害、その菌数の減少、又はその死滅がMIC及び/又は最小バイオフィルム根絶濃度(MBEC)としてinvitroで評定される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。

請求項18

許容可能な担体と、抗菌量の請求項1〜17のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチドとを含む組成物

請求項19

前記組成物が医薬組成物であり、前記担体が薬学的に許容可能な担体である、請求項18に記載の組成物。

請求項20

前記抗菌量の修飾溶解素ポリペプチドが、スタフィロコッカス・アウレウス;リステリア・モノサイトゲネス;スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターメディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群及びスタフィロコッカス・ヒイカス群等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌;ストレプトコッカス・スイス;ストレプトコッカス・ピオゲネス;ストレプトコッカス・アガラクティアエ;ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ;ストレプトコッカス・ニューモニアエ;ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群等の緑色レンサ球菌群に含まれる種;エンテロコッカス・フェカーリス;並びにエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される1つ以上のグラム陽性細菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させるのに効果的である、請求項18又は19に記載の組成物。

請求項21

前記グラム陽性細菌がメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス又はバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウスである、請求項18〜20のいずれか一項に記載の組成物。

請求項22

溶液、懸濁液、エマルション吸入用粉末エアロゾル又はスプレーである、請求項18〜21のいずれか一項に記載の組成物。

請求項23

グラム陽性細菌感染治療に適した1つ以上の抗生物質を更に含む、請求項18〜22のいずれか一項に記載の組成物。

請求項24

請求項1〜17のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子

請求項25

請求項24に記載の核酸分子を含むベクター

請求項26

前記ベクターがプラスミドであり、前記核酸異種プロモーターに操作可能に連結する、請求項25に記載のベクター。

請求項27

グラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法であって、前記細菌と請求項18〜23のいずれか一項に記載の組成物とを接触させることを含む、方法。

請求項28

グラム陽性細菌の少なくとも1つの種によって引き起こされる細菌感染を予防又は治療する方法であって、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、(1)第1の量の請求項1〜17のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド、及び(2)第2の量のグラム陽性細菌感染の治療に適した抗生物質を同時投与することを含む、方法。

請求項29

前記グラム陽性細菌感染の治療に適した抗生物質がメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシンムピロシン及びリソスタフィンからなる群から選択される、請求項28に記載の方法。

請求項30

細菌感染の治療に適した抗生物質の有効性を高める方法であって、該抗生物質を請求項1〜17のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチドと組み合わせて同時投与することを含み、同時投与が、細菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる上で、前記抗生物質又は前記修飾溶解素ポリペプチド若しくはそのフラグメントのいずれか個別の投与よりも効果的である、方法。

請求項31

前記抗生物質がメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィンからなる群から選択される、請求項30に記載の方法。

請求項32

ブドウ球菌又はレンサ球菌細菌に感染した被験体においてブドウ球菌又はレンサ球菌細菌の抗生物質耐性発現を低減する方法であって、前記被験体に、請求項1〜17のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチドとメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィンから選択される抗生物質との組合せを投与することを含む、方法。

請求項33

前記修飾溶解素ポリペプチドを、該修飾溶解素ポリペプチドの最小阻止濃度(MIC)を下回る濃度に相当する量で投与する、請求項32に記載の方法。

請求項34

前記修飾溶解素ポリペプチド中の少なくとも1つのアミノ酸置換がL92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A及びV212Aを含む、請求項32又は33に記載の方法。

技術分野

0001

[関連出願の相互参照
本願は、2018年2月26日付で出願された米国仮特許出願第62/635,515号の利益を主張し、その出願日に依拠し、その開示全体引用することにより本明細書の一部をなす。

0002

配列表
本願は、ASCIIフォーマット電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。2019年2月22日付けで作製された上記ASCIIコピー名前は0341_0004−PCT_SL.txtであり、36153バイトのサイズである。

0003

本開示は、概して抗菌剤、より具体的には修飾された非自然発生溶解素ポリペプチド、特に修飾PlySs2溶菌酵素、並びにグラム陽性細菌死滅させ、細菌感染及び汚染対抗する上でのこれらのペプチドの使用に関する。

背景技術

0004

抗生物質耐性は、世界的に増加しており、特に、(a)様々な病気及び他の病態治療するために投与される抗生物質の使用の増加及び長期化、(b)低い患者コンプライアンス、並びに(c)既存の抗生物質に対する耐性発現した病原体に対して採用することができる新たな抗微生物剤不足の影響を受ける。

0005

バクテリオファージエンドリシン(溶解素)は、細菌感染に対抗し、細菌耐性を克服する有望な代替的又は相補的アプローチである。溶解素は、バクテリオファージによって自然に産生され得るペプチドグリカンヒドロラーゼである。外部から細菌と接触することで、組換えにより作製された溶解素ポリペプチドは、細菌を直接溶解し、死滅させる(1)、(2)。溶解素は、病原体への抗生物質剤アクセスを促進することによっても抗生物質耐性を克服することができる。近年、幾つかの研究から、器官限局性(organ-confined)感染及び全身感染において粘膜表面上の病原体を制御する、これらの酵素の人間医学及び獣医学における大きな可能性が示されている。

0006

グラム陽性細菌は、ポリペプチド及び多糖を含有する細胞壁に囲まれている。グラム陽性細胞壁は、約20nm〜80nmの厚さであり得る幅広い緻密な壁のように見え、ペプチドグリカンの多数の相互接続層を含有する。グラム陽性細胞壁の60%〜90%が細胞形状、剛構造、及び浸透圧衝撃に対する耐性をもたらすペプチドグリカンである。細胞壁は、グラム染色クリスタルバイオレットを排除せず、細胞が紫色に染色され、したがって「グラム陽性」に分類される。

0007

バクテリオファージ溶菌酵素は、様々な投与経路を介した被験体における様々なタイプの感染の特異的治療に有用であるとして確立されている。例えば、特許文献1、特許文献2、特許文献3、特許文献4、特許文献5及び特許文献6を参照されたい。Fischetti et al.に対する米国特許第9,034,322号(その全体が引用することにより本明細書の一部をなす)は、溶解素PlySs2を含む、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)細菌に由来するバクテリオファージ溶解素に関する。これらの溶解素ポリペプチドは、ブドウ球菌、B群レンサ球菌腸球菌及びリステリア細菌株等のグラム陽性細菌を含む複数の細菌に対して広範な死滅活性を示す。

0008

PlySs2溶解素は、動物モデルにおいてスタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureus)細菌を死滅させ、抗生物質と相乗作用を示し、抗生物質耐性を克服(又は予防)することが可能である。PlySs2は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)及びバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(VRSA)等の抗生物質耐性スタフィロコッカス・アウレウスに対して効果的であることが示されている。

0009

治療用タンパク質による炎症性免疫応答の誘発は、望ましくない(6)、(8)。タンパク質免疫原性が、合成起源に由来するか又は生物学的(例えば、組み換え)起源に由来するかに関わらず、外因性タンパク質及びペプチドについて懸念される可能性がある。場合によっては、治療用タンパク質は、重度有害事象(例えば、貧血血小板減少症アナフィラキシー及び先天性免疫応答)を引き起こし、これが更に致死的となる場合もある。よく知られている例としては、トロンボポエチンで治療した患者における血小板減少症、及び機能的に冗長でない内因性EPOと交差反応する中和抗体誘導による、認可済みエリトロポエチン(EPO)製剤であるEPREX(商標)で治療した慢性腎疾患患者における赤芽球癆が挙げられる。モノクローナル抗体トロンボキナーゼ及びPULMOZYME(商標)(ドルナーゼアルファ)を含む様々な製品で免疫原性が報告されているため、免疫原性は規制機関、業界及び臨床医による大きな注目を集め続けている。かかる免疫応答は、潜在的な細菌感染のために既に炎症応答を起こしている患者において悪化する可能性がある。

0010

PlySs2等の溶解素は、タンパク質であるため、宿主に投与した場合に免疫応答を引き起こす可能性がある。上で論考される重大な副作用を引き起こすことに加えて、かかる免疫応答は、溶解素の溶菌活性を低下させる可能性もある。実際に、Cpl−1等の他のタイプの溶解素による幾つかの免疫応答が動物において観察されており、これは溶菌活性の遅延を引き起こしたが、実質的には阻害しなかった。しかしながら、他の研究者により、Cpl−1の投与が炎症性サイトカイン分泌の大幅な増加を伴うことが観察された(9)。

0011

コンピューターによる計算ガイドツールがタンパク質のエピトープ領域の特定を容易にし、免疫原性である傾向がより低い変異体を設計するために開発されている(11)〜(18)。かかる手法は有用であり得るが、幾つかの制約を有する。これらの制約には、例えば幾つかの推定細胞エピトープを除外する可能性がある抗原プロセシングT細胞受容体多形性及び三次元複雑性のためにコンピューターによる方法を用いてT細胞受容体親和性を予測することができないこと、T細胞エピトープ表現型を予測することができないこと、個々の患者及び翻訳因子の影響を考慮して患者集団を用いて考案される統計的手法適用性限界、並びにコンピューターによる手法及びその根底にある前提固有の限界が含まれ得る(8)。したがって、ペプチドの免疫原性を低下させるには試行錯誤及び不確実性が残る。

先行技術

0012

米国特許第5,985,271号
米国特許第6,017,528号
米国特許第6,056,955号
米国特許第6,248,324号
米国特許第6,254,866号
米国特許第6,264,945号

発明が解決しようとする課題

0013

このため、所望の抗菌活性を保持するが、低下した免疫原性を有する修飾PlySs2溶解素等の修飾溶解素の発見が有益である。

課題を解決するための手段

0014

本願は、対応する野生型PlySs2溶解素に対して少なくとも1つのアミノ酸置換を有する一方で抗菌活性及び有効性を保つ修飾溶解素ポリペプチドを開示する。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、対応する野生型PlySs2溶解素と比較して低下した免疫原性も有する。野生型PlySs2溶解素は、PlySs2ポリペプチドの酵素活性ドメイン(EAD)であるシステインヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼペプチダーゼCHAP)エンドペプチダーゼドメインと、C末端SH3b_5(SH3b)細胞壁結合ドメイン(CBD)とを有する。或る特定の態様では、修飾溶解素ポリペプチドは、CHAP中の少なくとも1つのアミノ酸置換及び/又はSH3b中の1つ以上のアミノ酸置換を含む。

0015

1つの態様では、本開示は、配列番号1のアミノ酸配列、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ/ペプチダーゼ(CHAP)ドメイン及び細胞壁結合(SH3b)ドメインを有する野生型PlySs2溶解素ポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む修飾溶解素ポリペプチドであって、前記少なくとも1つのアミノ酸置換が前記CHAPドメイン及び/又は前記SH3bドメイン中にあり、該修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる、修飾溶解素ポリペプチドに関する。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施の形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、CHAPドメイン中にある。或る特定の実施の形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、SH3bドメイン中にある。或る特定の実施の形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、CHAPドメイン及びSH3bドメイン中にある。

0016

或る特定の実施の形態では、少なくとも1つの置換は、CHAPドメイン中の配列番号1のアミノ酸残基35、92、104、128及び137から選択される少なくとも1つの位置にある。或る特定の実施の形態では、少なくとも1つの置換は、SH3bドメイン中の配列番号1のアミノ酸残基164、184、195、198、204、206、212及び214から選択される少なくとも1つの位置にある。或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、CHAPドメイン中の配列番号1のアミノ酸35、92、104、128及び137から選択される少なくとも1つの位置に少なくとも1つの置換を有し、SH3bドメイン中の配列番号1のアミノ酸164、184、195、198、204、206、212及び214から選択される少なくとも1つの位置に少なくとも1つの置換を有する。

0017

幾つかの実施の形態では、CHAPドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸置換は、R35E、L92W、V104S、V128T及びY137Sからなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、SH3bドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸置換は、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E及びV214Gからなる群から選択される。

0018

或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、R35E、L92W、V104S、V128T及びY137Sからなる群から選択される前記CHAPドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸置換と、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E及びV214Gからなる群から選択される前記SH3bドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸置換とを有する。

0019

また他の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、CHAPドメイン中に少なくとも2つのアミノ酸置換を有する。更に他の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、SH3bドメイン中に少なくとも2つのアミノ酸置換を有する。他の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、SH3bドメイン中に少なくとも3つのアミノ酸置換を有する。また他の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、CHAPドメインとSH3bドメインとの間に分散した5つ、6つ、7つ又は8つのアミノ酸置換を有し、或る特定の実施の形態では、配列番号1のアミノ酸配列は、R35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212E、V212A及びV214Gからなる群から選択される3つ〜9つのアミノ酸置換によって修飾される。

0020

或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を有する:(i)L92W、V104S、V128T及びY137S(pp55)、(ii)Y164N、N184D、R195E、V204K及びV212E(pp388)、(iii)L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H及びI206E(pp61)、(iv)L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A及びV212A(pp65)、(v)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D及びS198Q(pp296)、(vi)V128T、Y137S及びY164K(pp616)、(vii)R35E、L92W、V104S、V128T及びY137S(pp400)、(viii)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K及びV212E(pp628)、(ix)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K及びV212E(pp632)、(x)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N及びN184D(pp324)、(xi)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N及びR195E(pp325)、(xii)L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A及びV212A(pp341)、(xiii)L92W、V104S、V128T、Y137S及びY164K(pp619)、(xiv)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E及びV214G(pp642)、並びに(xv)L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D及びS198H(pp338)。或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3〜17の1つから選択されるアミノ酸配列を有する。

0021

或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を有する:L92W、V104S、V128T及びY137S。或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を有する:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D及びS198Q(pp296)。

0022

本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドの活性フラグメントであって、CHAPドメイン及び/又はSH3bドメイン中に1つ以上のアミノ酸置換を含む、活性フラグメントも開示される。

0023

本明細書に開示される修飾PlySs2CHAPドメインと、別の溶解素の結合ドメイン又は別の溶解素の触媒ドメインと、本明細書に開示される修飾PlySs2 SH3bドメインとを含むキメラ溶解素も開示される。

0024

幾つかの実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、スタフィロコッカス・アウレウス、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(限定されるものではないが、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス(Staphylococcus saprophyticus)群、スタフィロコッカス・シミュランス(Staphylococcus simulans)群、スタフィロコッカス・インターディウス(Staphylococcus intermedius)群、スタフィロコッカス・シウリ(Staphylococcus sciuri)群、スタフィロコッカス・ヒイカス(Staphylococcus hyicus)群からの少なくとも40の認定種、並びに「不特定種群」と称される任意の分離株を含む)、ストレプトコッカス・スイス、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アガラクティアエ(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、緑色レンサ球菌群に含まれる任意の付加的な種(ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)群、ストレプトコッカス・サングイニス(Streptococcus sanguinis)群、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)(現ガロリティカス(gallolyticus))群、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)群及びストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)群に含まれる全ての種及び株を含むが、これらに限定されない)、エンテロコッカスフェカーリス(Enterococcus faecalis)及びエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)の1つ以上に対して野生型PlySs2溶解素(配列番号1)の約2倍以下の最小阻止濃度MIC)、又は約3倍〜約5倍、例えば約3倍以下、約4倍以下又は約5倍以下のMICを有する。或る特定の実施の形態では、MICは、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、リステリア・モノサイトゲネス及びストレプトコッカス・アガラクティアエの1つ以上に対して野生型PlySs2溶解素(配列番号1)の約2倍以下、約3倍以下、約4倍以下又は約5倍以下である。

0025

幾つかの実施の形態では、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、野生型PlySs2溶解素(配列番号1)と比較して免疫原性を低下させ、及び/又は炎症応答関連毒性を低下させる。本開示の或る特定の実施の形態では、グラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖の阻害、その菌数の減少、又はその死滅は、MIC及び/又は最小バイオフィルム根絶濃度(MBEC)としてin vitroで評定される。

0026

別の態様は、許容可能な担体と本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドとを含む組成物に関する。或る特定の実施の形態では、組成物は医薬組成物であり、担体は薬学的に許容可能な担体である。

0027

本明細書に開示の組成物の特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドの量は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス又はバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス等のグラム陽性細菌の1つ以上の種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させるのに効果的である。或る特定の実施の形態では、組成物は溶液、懸濁液、エマルション吸入用粉末エアロゾル又はスプレーである。或る特定の実施の形態では、組成物は、グラム陽性細菌感染の治療に適した1つ以上の抗生物質を更に含む。

0028

また別の態様では、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。

0029

別の態様は、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターに関する。幾つかの実施の形態では、ベクターは、プラスミドである。幾つかの実施の形態では、核酸分子は、異種プロモーターに操作可能に連結する。

0030

別の態様では、グラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法であって、グラム陽性細菌の少なくとも1つの種と、抗菌有効量の本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドを含む組成物とを接触させることを含む、方法が提供される。

0031

更に別の態様では、グラム陽性細菌の少なくとも1つの種によって引き起こされる細菌感染を予防又は治療する方法であって、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、(1)第1の量の本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチド、及び(2)第2の量のグラム陽性細菌感染の治療に適した抗生物質を同時投与することを含む、方法が提供される。

0032

幾つかの方法の実施の形態では、抗生物質はメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシンムピロシン及びリソスタフィンの1つ以上である。或る特定の実施の形態では、抗生物質はメチシリン、バンコマイシン及びダプトマイシンの1つ以上である。

0033

幾つかの実施の形態では、上述の方法に使用される修飾溶解素ポリペプチドの量は、抗生物質の非存在下で使用される場合の修飾溶解素ポリペプチドのMICに等しい濃度をもたらす量を下回り得る(すなわち、「MIC以下の溶解素量」)。代替的又は付加的には、上述の方法に使用される抗生物質の量は、修飾溶解素ポリペプチドの非存在下で使用される場合の抗生物質のMICに等しい濃度に相当する、すなわち、それをもたらす量を下回り得る(すなわち、「MIC以下の抗生物質量」)。

0034

更に別の態様では、グラム陽性細菌感染の治療に適した抗生物質の有効性を高める方法であって、抗生物質を本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドと組み合わせて同時投与することを含み、同時投与が、グラム陽性細菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる上で、抗生物質又は修飾溶解素ポリペプチドのいずれか個別の投与よりも効果的である、方法が提供される。或る特定の実施の形態では、抗生物質はメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィンからなる群から選択される。

0035

別の態様では、修飾溶解素ポリペプチドと抗生物質とを含む組合せが提供される。或る特定の実施の形態では、組合せで効果的な修飾溶解素ポリペプチド、抗生物質又はその両方の最少量は、修飾溶解素ポリペプチド及び/又は抗生物質のそれぞれのMIC量を下回る。幾つかの実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチド及び抗生物質は、同じ組成物中で提供され、或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチド及び抗生物質は、異なる組成物中で提供される。

0036

幾つかの実施の形態では、表面上のブドウ球菌又はレンサ球菌細菌を含有するバイオフィルムを予防、破壊消散又は処理する方法であって、表面に有効量の本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドを単独で又は抗生物質と組み合わせて送達することを含み、バイオフィルムが効果的に予防、破壊、消散又は処理される、方法が提供される。或る特定の実施の形態では、表面は、医療器具の表面である。更に他の実施の形態では、医療器具は、限定されるものではないが、血液又は他の体液を含むヒトの身体内で又はヒトの身体と接触して使用される。かかる器具の非限定的な例としては、吸入器挿管具、弁、カテーテル人工肛門装置又は他の人工装具が挙げられる。

0037

或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドの活性、例えばグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させるペプチドの能力は、例えばMIC及び/又は最小バイオフィルム根絶濃度(MBEC)としてin vitroで評定することができる。或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドの活性は、例えばマウス好中球減少性大腿感染(MNTI)モデルによってin vivoで評定することができる。更なる実施の形態では、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドとグラム陽性感染の治療に適した抗生物質、例えばメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィンの1つ以上との相乗活性は、チェッカーボードアッセイを用いて評定することができる。

0038

幾つかの或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型PlySs2溶解素と同等の抗生物質耐性プロファイルを示し得る。したがって、抗生物質と、抗生物質に対する耐性の発現を回避する、低減する又は遅らせるのに効果的な量の本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドとを同時投与することを含む、ブドウ球菌又はレンサ球菌感染の治療に適した抗生物質に対する耐性の発現を阻害する方法が提供される。

0039

更なる実施の形態では、抗生物質耐性プロファイルは、連続継代耐性単独、又は例えばメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィン等の抗生物質と組み合わせた連続継代によって評定される。

図面の簡単な説明

0040

実施例3に記載される修飾溶解素ポリペプチドpp53、pp55、pp61、pp65及びpp296、並びに対照である野生型PlySs2溶解素タンパク質pp1149(GMPグレードまで精製した)の精製プロセスの最終工程においてサイズ排除カラムから溶出した画分のSDS−PAGEゲルを示す図である。描かれた円に含まれる画分を、この最終精製工程でプールした。
実施例7に記載されるマウス好中球減少性大腿感染in vivoモデルにおける野生型PlySs2溶解素(CF−301と表す)及び対照の野生型PlySs2ポリペプチドpp1149、並びに修飾溶解素ポリペプチドpp55、pp61、pp65及びpp296の殺菌有効性の用量応答プロットである。細菌負荷(処理した大腿1g当たりのコロニー形成単位)を、投与した溶解素の用量(mg/kg)に対してプロットする。
実施例6に記載されるような21日間又は26日間の継代にわたる各々の指定の作用物質についての経時的なMICの倍率変化を示す一連の連続継代耐性アッセイの結果を示す図である。図3Aでは、MICの倍率変化(MICの増加として測定される)を、pp296で処理した3つの独立した系統(「pp296−1」、「pp296−2」及び「pp296−3」と表す)、及び野生型PlySs2溶解素(CF−301と表す)又はリソスタフィン(LSP)のいずれかで処理した単一系統について示す。図3Bでは、ダプトマイシン(DAP)のMICの倍率増加を、一定のMIC以下の量(1/16×MIC)のpp296と組み合わせたDAP(「DAP+pp296−1」、「DAP+pp296−2」及び「DAP+pp296−3」と表す)及びDAP単独で処理した3つの独立した系統について示す。図3Cでは、バンコマイシン(VAN)のMICの倍率増加を、一定のMIC以下の量(1/8×MIC)のpp296と組み合わせたVAN(「VAN+pp296−1」、「VAN+pp296−2」及び「VAN+pp296−3」と表す)及びVAN単独で処理した3つの独立した系統について示す。

0041

定義
本明細書で使用される場合、以下の用語及びその同語源語は、文脈上そうでないことが明示されない限り、下記の意味を有するものとする。

0042

「担体」は、活性化合物と共に投与される溶媒添加剤賦形剤分散媒可溶化剤コーティング剤保存料等張剤及び吸収遅延剤(absorption delaying agent)、界面活性剤噴射剤希釈剤ビヒクル等を指す。かかる担体は、滅菌液、例えば水、生理食塩水デキストロース水溶液グリセロール水溶液、及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油、例えばラッカセイ油ダイズ油鉱油ゴマ油等であり得る。

0043

「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合するあらゆる溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。担体(複数の場合もある)は、薬剤中で通常使用される量で治療対象の被験体に有害でないという意味で「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容可能な担体は、組成物をその意図される目的に不適なものにすることなく組成物の他の成分に適合する。さらに、薬学的に許容可能な担体は、過度の有害な副作用(毒性、刺激及びアレルギー応答等)なしに本明細書に提示される被験体への使用に適している。副作用は、それらのリスクが組成物によってもたらされる利益を上回る場合に「過度」である。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の非限定的な例としては、任意の標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、並びに油/水エマルション及びマイクロエマルション等のエマルションが挙げられる。好適な医薬担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin, 18th Editionに記載されている。

0044

「殺菌」は、細菌の初期集団において18時間〜24時間にわたって少なくとも3log10(99.9%)以上の減少の程度まで細菌の死滅を引き起こす特性を有するか、又は細菌を死滅させることが可能であることを指す。

0045

静菌」は従来、細菌細胞の増殖を阻害し、それにより細菌の初期集団において18時間〜24時間にわたって2log10(99%)以上かつ最大3log弱の減少を引き起こすことを含む、細菌増殖を阻害する特性を有することを指す。

0046

「抗菌剤」は、静菌剤及び殺菌剤の両方を指す。

0047

「抗生物質」は、細菌に致死性又は増殖の低減等の負の影響を与える特性を有する化合物を指す。抗生物質は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌又はその両方に負の影響を与えることができる。例としては、抗生物質は、細胞壁ペプチドグリカンの生合成細胞膜完全性、又は細菌におけるDNA若しくはタンパク質の合成に影響を及ぼし得る。グラム陽性細菌に対して活性の抗生物質の非限定的な例としては、メチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン、リソスタフィン、ペニシリンクロキサシリンエリスロマイシンカルバペネムセファロスポリングリコペプチドリンコサミド、アジスロマイシンクラリスロマイシンロキシスロマイシンテリスロマイシンスピラマイシン、及びフィダキソマイシンが挙げられる。

0048

薬物耐性」は、概して薬物の抗菌活性に耐性を示す細菌を指す。或る特定の方法で使用される場合、薬物耐性は、特に抗生物質耐性を指し得る。場合によっては、一般に特定の抗生物質の影響を受けやすい細菌は、抗生物質に対する耐性を発現し、それにより薬物耐性微生物又は株となる可能性がある。「多剤耐性」(「MDR」)病原体は、各々が単剤療法として使用される少なくとも2つのクラスの抗微生物薬に対する耐性を発現した病原体である。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス(S. aureus)の或る特定の株は、メチシリン及び/又はバンコマイシンを含む幾つかの抗生物質に耐性を示すことが見出されている(Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention)。当業者は、薬物又は抗生物質に対する細菌の感受性又は耐性を決定する日常的な実験技術を用いて、細菌が薬物耐性であるかを容易に決定することができる。

0049

「有効量」は、適切な頻度又は投与計画で適用又は投与した場合に、細菌増殖若しくは細菌負荷を予防、低減、阻害若しくは解消するか、又は治療される障害(例えば細菌病原体の増殖又は感染)の発症重症度、期間若しくは進行を予防、低減若しくは改善するか、治療される障害の進展を予防するか、治療される障害の退行を引き起こすか、又は抗生物質若しくは静菌療法等の別の療法の予防効果若しくは治療効果(複数の場合もある)を高める若しくは改善するのに十分な量を指す。

0050

「同時投与する」は、順次的な2種類の薬剤、例えば溶解素ペプチド及び抗生物質又は任意の他の抗菌剤の別々の投与、並びに実質的に同時の、例えば単一の混合物/組成物中での、又は別個に与えられるが、それでも実質的に同時に、例えば同日又は24時間中に異なる時点で被験体に投与される用量でのこれらの作用物質の投与を包含することを意図する。このような溶解素ペプチドと1つ以上の付加的な抗菌剤との同時投与は、最大数日、数週間又は数ヶ月続く継続的な治療として行うことができる。さらに、用途に応じて、同時投与は、継続的又は同延的(coextensive)である必要はない。例えば、用途が局所抗菌剤として、例えば細菌性潰瘍又は感染した糖尿病性潰瘍を治療することがであった場合、溶解素ポリペプチドを初めのみ、最初の抗生物質の使用の24時間以内に投与することができ、その後、抗生物質の使用を溶解素ポリペプチドの更なる投与なしに継続してもよい。

0051

「被験体」は、哺乳動物、植物、下等動物、単細胞生物又は細胞培養物を指す。例えば、「被験体」という用語は、細菌感染、例えばグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌感染の影響を受けやすい又はそれを患う生物、例えば原核生物及び真核生物を含むことを意図する。被験体の例としては、哺乳動物、例えばヒト、イヌウシウマブタヒツジヤギネコ、マウス、ウサギラット及びトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。或る特定の実施形態では、被験体はヒト、例えばかかる感染が全身性であるか、局所性であるか、又は別の形で特定の器官若しくは組織に集中若しくは限局しているかに関わらず、グラム陽性細菌による感染を患う、それを患うリスクがある又はその影響を受けやすいヒトである。

0052

「ポリペプチド」は、「タンパク質」、「ペプチド」という用語と区別なく使用され、アミノ酸残基からなるポリマーを指す。或る特定の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも約30個のアミノ酸残基を有する。この用語は、単離形態のポリペプチドだけでなく、その活性フラグメント及び誘導体も含み得る。「ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載の修飾溶解素ポリペプチドを含み、溶解素機能を維持する融合タンパク質又は融合ポリペプチドも包含する。文脈に応じて、ポリペプチドは、自然発生ポリペプチド、又は組換え、改変若しくは合成的に作製されたポリペプチドであり得る。特定の溶解素ポリペプチドは、例えば、酵素的若しくは化学的切断によって天然タンパク質から得るか若しくは取り出しても、又は従来のペプチド合成法(例えば、固相合成)若しくは分子生物学的手法(例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に開示されるもの)を用いて調製しても、又は戦略的に切断若しくはセグメント化して、同じ若しくは少なくとも1つの一般的な標的細菌に対する溶菌活性を維持する活性フラグメントを得てもよい。

0053

「融合ポリペプチド」は、通例、異なる特性又は機能性を有する2つ以上のドメイン又はセグメントを有する融合発現産物を生じる、2つ以上の核酸セグメントの融合から得られる発現産物を指す。或る特定の実施形態では、「融合ポリペプチド」という用語は、直接、又はアミノ酸若しくはペプチドリンカーを介して共有結合的に連結した2つ以上の異種ポリペプチド又はペプチドを含むポリペプチド又はペプチドも指す。融合ポリペプチドを形成するポリペプチドは通例、C末端からN末端に連結されるが、C末端からC末端、N末端からN末端又はN末端からC末端に連結されてもよい。「融合ポリペプチド」という用語は、「融合タンパク質」という用語と区別なく使用される場合もある。このため、或る特定の構造「を含むポリペプチド」というオープンエンド表現は、融合ポリペプチド又は構築物等の列挙される構造よりも大きい分子を含む。本明細書で言及される構築物は、融合ポリペプチド又はコンジュゲート(2つ以上の部分を連結することによる)として作製され得る。

0054

「異種」は、天然では隣接しないヌクレオチド、ペプチド又はポリペプチドの配列を指す。例えば、本開示との関連で、「異種」という用語は、融合ペプチド又はポリペプチドが通常は天然に見られない2つ以上のペプチド及び/又はポリペプチドの組合せ又は融合、例えば増強した溶菌活性を有し得る、修飾溶解素ポリペプチド、並びにカチオン性及び/又はポリカチオン性ペプチド両親媒性ペプチド、sushiペプチド(Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008))、ディフェンシンペプチド(Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003))、疎水性ペプチド及び/又は抗微生物ペプチドを記載するために使用することができる。2つ以上の溶解素ポリペプチド又はその活性フラグメントがこの定義に含まれる。これらを用いて溶菌活性を有する融合ポリペプチドを作製することができる。

0055

「活性フラグメント」は、フラグメントが得られた単離ポリペプチドの1つ以上の機能又は生物活性を保持するポリペプチドの部分を指す。本明細書で使用される場合、修飾溶解素ポリペプチドの活性フラグメントは、スタフィロコッカス・アウレウス等の少なくとも1つのグラム陽性細菌種の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。

0056

「両親媒性ペプチド」は、親水性官能基及び疎水性官能基の両方を有するペプチドを指す。或る特定の実施形態では、二次構造により疎水性及び親水性アミノ酸残基が両親媒性ペプチドの反対側(例えば、ペプチドが水等の溶媒中にある場合、内側対外側)に置かれる。これらのペプチドは、或る特定の実施形態では、αヘリックス二次構造等のヘリックス二次構造を取ることができる。

0057

カチオン性ペプチド」は、正に帯電したアミノ酸残基を高い割合で有するペプチドを指す。或る特定の実施形態では、カチオン性ペプチドは、8.0以上のpKa値を有するのが好ましい。本開示との関連での「カチオン性ペプチド」という用語は、主に正に帯電したアミノ酸残基、例えばリシン及び/又はアルギニン残基で構成される、合成的に作製されたペプチドであるポリカチオン性ペプチドも包含する。正に帯電していないアミノ酸残基は、中性に帯電したアミノ酸残基、負に帯電したアミノ酸残基、及び/又は疎水性アミノ酸残基であり得る。

0058

疎水性基」は、水分子に対する親和性が低いか又は親和性を有しないが、油分子に対してより高い親和性を有するアミノ酸側鎖等の化学基を指す。疎水性物質は、水又は水相への溶解性が低いか又は溶解性を有しない傾向があり、通例非極性であるが、油相への溶解性がより高い傾向がある。疎水性アミノ酸の例としては、グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、プロリン(Pro)、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン(Met)及びトリプトファン(Trp)が挙げられる。

0059

「高める(Augmenting)」は、本明細書で使用される場合、そうでない場合よりも高い抗微生物活性等の作用物質の活性の程度を指す。「高める」は、相加的効果及び相乗(超相加的(superadditive))効果を包含する。

0060

「相乗的」又は「超相加的」は、独立して働く2つの作用物質の効果の総和を超える、組合せでの2つの物質によってもたらされる有益な効果を指す。或る特定の実施形態では、相乗又は超相加的効果は、独立して働く2つの作用物質の効果の総和を有意に、すなわち統計的に有意に超える。一方又は両方の活性成分閾値下ベル、すなわち活性物質が個別に用いられる場合に効果を生じないか、又は非常に限られた効果しか生じないレベルで用いることができる。効果は、本明細書に記載されるチェッカーボードアッセイ等のアッセイによって測定することができる。

0061

「治療」は、ヒトを含む被験体が、直接的又は間接的に、障害を治癒するか、又は病原体を根絶するか、又は被験体の状態を改善する目的で医療を受ける任意のプロセス、行為、適用、療法等を指す。治療は、発生率の低減、若しくは症状の軽減、再発の解消、再発の予防、発生の予防、若しくは発生リスクの低減、症状の改善、予後の改善、又はそれらの組合せも指す。「治療」は、被験体における細菌の集団増殖速度又は病原性を低減することで、被験体における細菌感染、又は器官、組織若しくは環境の細菌汚染を制御又は低減することを更に包含し得る。このため、発生率を低減する「治療」は、被験体であるか又は環境であるかを問わず、特定のミリュー(milieu)での少なくとも1つのグラム陽性細菌の増殖を阻害するのに効果的である。一方、既に確立された感染の「治療」は、感染又は汚染の原因となるグラム陽性細菌の菌数を減少させるか、それを死滅させるか、その増殖を阻害するか、及び/又はそれを根絶することを指す。

0062

「予防する」という用語は、細菌感染等の障害の発生、再発、拡大、発症又は確立の予防を含む。本開示が感染の完全な予防又は感染の確立の予防に限定されることは意図されない。幾つかの実施形態では、発症を遅らせるか、又は続いて発症した(contracted)疾患の重症度若しくはその発症の可能性を低減することが予防例を構成する。特にバイオフィルムの予防に関して、この用語は、例えば対象の表面、例えば医療器具(例えば、吸入器、カテーテル、挿管具、弁又は他の人工器官)の表面への細菌の付着を妨げることによるバイオフィルムの形成の予防を含む。

0063

「発症した疾患」は、発熱敗血症又は菌血症の検出等の臨床症状又は不顕性(subclinical)症状が現れた疾患、並びにかかる病理と関連する症状が未だ現れていない場合の細菌病原体の増殖(例えば、培養物中での)によって検出され得る疾患を指す。特に、医療器具に関して、発症した疾患は、ブドウ球菌又はレンサ球菌細菌等の細菌を含有し、かかる器具の使用時に形成されるバイオフィルムを含むものとする。

0064

ペプチド又はポリペプチド(本明細書で述べられるように活性フラグメントを含む)との関連での「誘導体」という用語は、例えば溶菌活性等のポリペプチドの活性に実質的に悪影響を与えない若しくは溶菌活性等のポリペプチドの活性を損なわない、アミノ酸以外の1つ以上の化学的部分を含有するように修飾されたポリペプチドを包含することを意図する。化学的部分は、例えばアミノ末端のアミノ酸残基、カルボキシ末端のアミノ酸残基又は内部アミノ酸残基を介してペプチドに共有結合的に連結することができる。かかる修飾は、天然であっても又は非天然であってもよい。或る特定の実施形態では、非天然修飾は、反応性部分への保護基若しくはキャップ基(cappinggroup)の付加、抗体及び/又は蛍光標識等の検出可能な標識の付加、グリコシル化の付加若しくは修飾、又はPEG(ペグ化)等の嵩高基(bulking group)の付加、並びに当業者に既知の他の変化を含み得る。或る特定の実施形態では、非天然修飾は、N末端アセチル化及びC末端アミド化等のキャップ修飾であり得る。溶解素ポリペプチドに付加することができる、例示的な保護基としては、t−Boc及びFmocが挙げられるが、これらに限定されない。限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)及びmCherry等の一般に使用される蛍光標識タンパク質は、細胞タンパク質の正常機能に干渉することなく、溶解素ポリペプチドに共有結合的若しくは非共有結合的に結合するか、又は溶解素ポリペプチドに融合させることができる小型のタンパク質である。或る特定の実施形態では、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが溶解素ポリヌクレオチド配列上流又は下流に挿入される。これにより、細胞機能又はそれが結合した溶解素ポリペプチドの機能を妨げない融合タンパク質(例えば、溶解素ポリペプチド::GFP)が生じる。タンパク質へのポリエチレングリコール(PEG)のコンジュゲーションが、多くの医薬タンパク質循環半減期延長する方法として使用されている。このため、溶解素ポリペプチド誘導体との関連で、「誘導体」という用語は、1つ以上のPEG分子の共有結合によって化学修飾された溶解素ポリペプチドを包含する。ペグ化溶解素ポリペプチドは、生物活性及び治療活性を保持した上で非ペグ化溶解素ポリペプチドと比較して延長された循環半減期を示すことが予想される。別の例は、in vitro抗菌活性を改善するために短いポリカチオン性及び両親媒性αヘリックスを溶解素ポリペプチドのN末端又はC末端に付加する、例えばin vitro抗レンサ球菌活性を改善するために短いポリカチオン性及び両親媒性αヘリックスをレンサ球菌溶解素のN末端又はC末端に付加する「artilysin」の使用である。

0065

パーセントアミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、任意の保存的置換を配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列、例えば溶解素ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の能力の範囲内の様々な方法で、例えばBLAST等の公開されているソフトウェア、又は例えばDNASTARにより市販されているソフトウェアを用いて達成することができる。2つ以上のポリペプチド配列は、0%〜100%の間のいずれか、又はその間の任意の整数値で同一であり得る。本開示との関連で、2つのポリペプチドは、アミノ酸残基の少なくとも80%(好ましくは少なくとも約85%、少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約95%、少なくとも約98%又は少なくとも99%)が同一である場合に「実質的に同一」である。本明細書に記載される「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」という用語は、ペプチドにも当てはまる。このため、「実質的に同一」という用語は、本明細書に記載されるもの等の単離ポリペプチド及びペプチドの突然変異型切断型、融合型、又は別の形で配列が修飾された変異体、及びその活性フラグメント、並びに参照(野生型又は他の無傷)ポリペプチドと比較して相当の配列同一性(例えば1つ以上の上記の方法によって測定される、例えば少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性、又は少なくとも99%の同一性)を有するポリペプチドを包含する。2つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約80%(好ましくは少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の同一性、又は少なくとも約99%の同一性)が同一であるか、又は保存的置換を示す場合に「実質的に相同」である。本開示のポリペプチドの配列は、ポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素及び/又は融合ポリペプチドのアミノ酸の1つ以上、又は幾つか、又は最大10%、又は最大15%、又は最大20%が同様の又は保存的アミノ酸置換で置換され、得られるポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素及び/又は融合ポリペプチドが、参照ポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素及び/又は融合ポリペプチドの少なくとも1つの活性、抗菌効果及び/又は細菌特異性を有する場合に実質的に相同である。

0066

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギングルタミンセリントレオニンチロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。

0067

吸入用組成物」は、日常呼吸又は補助呼吸(例えば、気管気管支内(intratracheobronchial)投与、経肺投与及び/又は経鼻投与による)時の、又はそれと同時の気道への直接送達のために配合されている本開示の医薬組成物を指し、霧化噴霧化乾燥粉末及び/又はエアロゾル化配合物が挙げられるが、これらに限定されない。

0068

「バイオフィルム」は、表面に付着し、細菌及び/又は宿主に由来する成分で構成され得る水和したポリマーマトリックス中に凝集した細菌を指す。バイオフィルムは、生物表面又は非生物表面上で細胞が互いに接着した微生物の凝集物である。これらの接着細胞は、限定されるものではないが、細胞外高分子物質EPS)で構成されるマトリックス中に埋め込まれることが多い。バイオフィルムのEPSは、スライム(スライムと記載されたもの全てがバイオフィルムという訳ではない)又はプラークとも称され、一般に細胞外DNA、タンパク質及び多糖で構成されるポリマー集塊である。或る特定の実施形態では、バイオフィルムは、ブドウ球菌及び/又はレンサ球菌細菌を含有し得る。

0069

或る特定の細菌に対する使用に適した抗生物質との関連での「適した、好適な(Suitable)」は、耐性が後に発現する場合であっても、これらの細菌に対して効果的であることが見出された抗生物質を指す。

0070

「野生型PlySs2溶解素」及び「PlySs2溶解素」は、アミノ酸配列:MTTVNEALNNVRAQVGSGVSVGNGECYALASWYERMISDATVGLGAGVGWVSGAIGDISAKNIGSSYNWQANGWTVSTSPFKAGQIVTLGATPGNPYGHVVIVEAVDGDRLTILEQNYGGKRYPVRNYYSAASYRQQVVHYITPPGTVAQSAPNLGSRSYRETGTMTVTVDALNVRRAPNTSGEIVAVYKRGESFDYDTVIIDVNGYVWVSYIGGSGKRNYVATGATKDGKRFGNAWGTFK(配列番号1;翻訳後プロセシング時に除去され、244アミノ酸ペプチドを残す最初のメチオニン残基を含む245個のアミノ酸残基)を有するポリペプチドを指す。

0071

「修飾溶解素ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、野生型PlySs2溶解素の非自然発生の変異体(又はその活性フラグメント)を指す。修飾溶解素ポリペプチドは、CHAPドメイン及び/又はSH3bドメイン中に少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、スタフィロコッカス・アウレウス等のグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。

0072

「免疫原性の」又は「免疫原性」は、(例えば、コンピューターによる計算ガイド方法により)1つ以上のT細胞エピトープの存在を確立することによって免疫原性であるか又は免疫原性を有すると予測されることを意味する。本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドの免疫原性は、TCEスコアを得るための任意の利用可能なコンピューターによる計算ガイド方法を用いてTCEスコアによって測定し、同様に得られた、配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型PlySs2溶解素のTCEスコアと比較することができる。代替的には、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドの免疫原性は、in vitro T細胞応答によって測定することができる。更に言うと、「より免疫原性が低い」、「低下した免疫原性」等は、1つ以上のT細胞エピトープの枯渇(アミノ酸の置換えによる除去又は減衰を含む)によって、より免疫原性が低いか若しくは低下した免疫原性を有する(すなわち、参照ポリペプチドと比較してより低いTCEスコアを有する)と予測されるか、又は本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドが、低下したT細胞応答を引き起こすことを意味する。したがって、本明細書で使用される場合、修飾溶解素ポリペプチドが、1)配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型PlySs2溶解素よりも低いTCEスコア、又は2)低下したT細胞応答のいずれかを有する場合、修飾溶解素ポリペプチドは、「より免疫原性が低い」又は「低下した免疫原性」を有する等である。

0073

「低下したT細胞応答」は、ヒト末梢血単核細胞フルオレセインイソチオシアネート標識抗サイトカイン抗体曝露し、応答を測定する、CD8+枯渇ヒト末梢血単核細胞を用いるin vitro T細胞増殖(3{H}−チミジン取込み)アッセイによって測定されるように、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型PlySs2溶解素よりも低いT細胞活性化を誘導することを意味する。

0074

本開示の修飾溶解素ポリペプチドの溶菌活性(抗微生物活性)との関連で使用される「実質的に」は、少なくとも野生型PlySs2溶解素の抗菌活性の相当部分を意味し、かかる活性に基づいて、修飾溶解素ポリペプチドは、単独で又は1つ以上の抗生物質及び/又はリソスタフィン等の他の抗微生物剤と共に、細菌を死滅させることによってブドウ球菌又はレンサ球菌感染を阻害する、それに対抗する又はそれを解消するのに有用である。野生型PlySs2溶解素と比較して実質的なかかる活性の非限定的な例は、野生型溶解素の約5倍以下、例えば約4倍以下、約3倍以下又は約2倍以下のMICを含む。他の活性の尺度は、例えば最小バイオフィルム除去濃度(MBEC)、又は例えばマウス好中球減少性大腿感染モデル(MNTI)等の動物モデルを用いたin vivo有効性であり得る。更に他の尺度は、野生型PlySs2溶解素と同様のバンコマイシン若しくはダプトマイシン等の抗生物質と相乗作用を示す能力、又はバンコマイシン若しくはダプトマイシン等の抗生物質の細菌耐性の発現を改善する、予防する若しくは遅らせる能力であり得る。低下した免疫原性との関連で使用される同じ「実質的に」という用語は、例えばTCEスコアによって測定されるように、野生型PlySs2溶解素の免疫原性の多くとも65%、例えば多くとも50%、多くとも40%、多くとも30%又は多くとも25%を有することを意味する(19)。

0075

修飾溶解素ポリペプチド
一態様では、本開示は、溶菌活性を有し、野生型PlySs2溶解素と比較して低下した免疫原性を有する修飾溶解素ポリペプチドに関する。本明細書で使用される場合、「溶菌活性」は、細菌を死滅させるか、細菌の菌数を減少させるか、又は細菌増殖を阻害する溶解素の能力を包含する。溶菌活性は、バイオフィルムを除去又は低減する能力、及び/又は抗生物質の最小阻止濃度(MIC)を低下させる能力も包含する。

0076

通例、本修飾溶解素ポリペプチドは、細菌細胞壁の主要な構造成分であるペプチドグリカンを分解し、細胞溶解をもたらすことが可能である。修飾溶解素ポリペプチドは、野生型PlySs2溶解素と比較して免疫原性を低下させ、及び/又は炎症応答関連毒性を低下させることが更に可能である。

0077

本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドの活性を評定するのに適した方法は、当該技術分野で既知であり、実施例に記載されている。簡潔に述べると、MIC値(すなわち、対照と比較して少なくとも80%の細菌増殖を抑制するのに十分なペプチドの最小濃度)を修飾溶解素ポリペプチドについて決定し、例えば野生型PlySs2溶解素又は不活性化合物と比較することができる。例えば、修飾溶解素ポリペプチドのMIC値を、例えばミューラーヒントブロス、又はウマ血清等の血清を添加したミューラーヒントンブロス中で、例えば実験室スタフィロコッカス・アウレウス株に対して決定することができる。

0078

幾つかの実施形態では、本修飾溶解素ポリペプチドは、バイオフィルムを低減することが可能である。修飾溶解素ポリペプチドの最小バイオフィルム根絶濃度(MBEC)を評定する方法では、修正した微量液体希釈MIC法の変法を用いて決定することができる(Ceri et al. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776(その全体が引用することにより本明細書の一部をなす)及びSchuch et al., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, pages 1-18(その全体が引用することにより本明細書の一部をなす)を参照されたい)。この方法では、細菌、例えばメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)及びメチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス(MSSA)等のスタフィロコッカス・アウレウスのコロニー媒体、例えばリン酸緩衝液PBS)に懸濁し、例えばTSBg(0.2%グルコースを添加したトリプシンイブロス)で100倍希釈し、例えば0.15mlアリコートとしてCalgary Biofilm Device(96個のポリカーボネートペグを備える蓋を有する96ウェルプレート;lnnovotech Inc.)に添加し、例えば37℃で24時間インキュベートする。次いで、バイオフィルムを洗浄し、例えばTSBg中の2倍希釈系列の溶解素によって、例えば37℃で24時間処理する。処理後に、ウェルを洗浄し、例えば37℃で風乾し、例えば0.05%クリスタルバイオレットで10分間染色する。染色後に、バイオフィルムを、例えば33%酢酸脱染し、例えば抽出されたクリスタルバイオレットのOD600を決定する。各サンプルのMBECが、クリスタルバイオレット定量化によって評定される、バイオフィルムのバイオマスの95%超を除去するのに必要とされる最小溶解素濃度である。

0079

幾つかの実施形態では、本修飾溶解素ポリペプチドは、抗生物質の最小阻止濃度(MIC)を低下させる。MICを評定する任意の既知の方法を用いることができる。幾つかの実施形態では、チェッカーボードアッセイを用いて、抗生物質濃度に対する溶解素の影響を決定する。チェッカーボードアッセイは、微量液体希釈によるMIC決定のためのCLSIの方法の修正に基づく(Clinical and Laboratory StandardsInstitute (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That GrowAerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA(その全体が引用することにより本明細書の一部をなす)及びCeri et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1771-1776(同様にその全体が引用することにより本明細書の一部をなす)を参照されたい)。

0080

チェッカーボードを、初めに横軸に沿って、例えば各ウェルが同量の2倍希釈した抗生物質を含む96ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートの列を作成することによって構築する。別のプレートに、縦軸に沿って各ウェルが同量の、例えば2倍希釈した溶解素を有する比較用の行を作成する。次いで、各列が一定量の抗生物質及び溶解素の2倍希釈物を含み、各行が一定量の溶解素及び抗生物質の2倍希釈物を含むように、溶解素及び抗生物質の希釈物を組み合わせる。これにより、各ウェルは、溶解素と抗生物質との独自の組合せを有する。細菌を所与の濃度で薬物の組合せに添加する。次いで、単独及び組合せでの各薬物のMICを、例えば周囲空気中にて37℃で16時間の後に記録する。部分阻止濃度の総和(ΣFIC)を各薬物について算出し、最小のΣFIC値(ΣFICmin)を用いて溶解素/抗生物質の組合せの効果を決定する。

0081

本明細書に開示の溶解素ポリペプチドを野生型PlySs2溶解素から修飾した。PlySs2は、ストレプトコッカス・スイス細菌に由来し得るバクテリオファージ溶解素である。PlySs2は、MRSA及びバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(VRSA)等の抗生物質耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含むブドウ球菌、レンサ球菌、エンテロコッカス及びリステリア細菌株を含むグラム陽性細菌を含む複数の細菌に対して広範な死滅活性を示す。野生型PlySs2は、以下のアミノ酸配列を有する:

配列番号1は、翻訳後プロセシング時に除去され、244アミノ酸ポリペプチドを残す最初のメチオニン残基を含む245個のアミノ酸残基を有する。イタリック体のアミノ酸は、CHAPドメイン(アミノ酸1〜146)を示し、点線下線は、SH3bドメイン(アミノ酸157〜245)を示す。2つのドメイン間の自然発生リンカーは、PPGTVAQSAP(配列番号2)である。

0082

本明細書に開示されるように、野生型PlySs2は、CHAPドメイン及びSH3bドメインの両方を含み、その各々が複数のT細胞エピトープ(TCE)を含む。TCE1、TCE2、TCE3及びTCE4は、CHAPドメイン中に位置し、TCE5、TCE6、TCE7及びTCE8は、SH3bドメイン中に位置する。TCE1は、配列番号1のアミノ酸残基32〜45に対応する。TCE2は、配列番号1のアミノ酸残基84〜98に対応する。TCE3は、配列番号1のアミノ酸残基100〜112に対応する。TCE4は、配列番号1のアミノ酸残基128〜145に対応する。TCE5は、配列番号1のアミノ酸残基164〜170に対応する。TCE6は、配列番号1のアミノ酸残基172〜187に対応する。TCE7は、配列番号1のアミノ酸残基189〜201に対応し、TCE8は、配列番号1のアミノ酸残基204〜221に対応する。

0083

或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型PlySs2ポリペプチド(配列番号1)と比較して少なくとも1つの置換を含み、少なくとも1つの置換がTCE1、TCE2、TCE3又はTCE4の1つ以上にあり、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型PlySs2ポリペプチド(配列番号1)と比較して少なくとも1つの置換を含み、少なくとも1つの置換がTCE5、TCE6、TCE7又はTCE8の1つ以上にあり、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型PlySs2ポリペプチド(配列番号1)と比較して少なくとも第1の置換及び少なくとも第2の置換を含み、少なくとも第1の置換がTCE1、TCE2、TCE3又はTCE4の1つ以上にあり、少なくとも第2の置換がTCE5、TCE6、TCE7又はTCE8の1つ以上にあり、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型PlySs2と比較して低下した免疫原性を有する。

0084

或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型PlySs2ポリペプチド(配列番号1)と比較して少なくとも2つの置換を含み、少なくとも2つの置換がTCE4にある。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型PlySs2ポリペプチド(配列番号1)と比較して少なくとも4つの置換を含み、少なくとも1つの置換がTCE2にあり、少なくとも1つの置換がTCE3にあり、少なくとも2つの置換がTCE4にある。

0085

或る特定の実施形態では、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列をCHAPドメイン中のアミノ酸残基35、92、104、128及び137から選択される少なくとも1つの位置でのアミノ酸置換、及び/又はSH3bドメイン中のアミノ酸残基164、184、195、198、204、206、212及び214から選択される少なくとも1つの位置でのアミノ酸置換によって修飾することで得ることができる。したがって、或る特定の実施形態では、野生型PlySs2ポリペプチド(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を有する修飾溶解素ポリペプチドであって、CHAPドメイン中の配列番号1のアミノ酸残基35、92、104、128及び137から選択される少なくとも1つの位置での少なくとも1つのアミノ酸置換、及び/又はSH3bドメイン中の配列番号1のアミノ酸残基164、184、195、198、204、206、212及び214から選択される少なくとも1つの位置での少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる、修飾溶解素ポリペプチドが本明細書に開示される。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸残基92、104、128及び137にアミノ酸置換を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸残基92、104、128、137、164、184及び198にアミノ酸置換を含む。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型PlySs2と比較して低下した免疫原性を有する。

0086

或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、少なくとも3つのアミノ酸置換、例えば少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ又は少なくとも9つのアミノ酸置換を含有し得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1に対して3つ〜9つのアミノ酸置換、例えば4つ〜9つ、5つ〜9つ、6つ〜9つ、7つ〜9つ、8つ〜9つ又は9つのアミノ酸置換を含有し得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1に対してCHAPドメイン中に少なくとも2つ、例えば少なくとも3つ又は少なくとも4つのアミノ酸置換を含み得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1に対してSH3bドメイン中に少なくとも2つ、例えば少なくとも3つ又は少なくとも4つのアミノ酸置換を含み得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1に対してCHAPドメイン中の2つ、3つ又は4つのアミノ酸置換からなり得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1に対してSH3bドメイン中の2つ、3つ又は4つのアミノ酸置換からなり得る。

0087

或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1に対して以下のアミノ酸置換の1つ以上を含む:R35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212E、V212A及びV214G。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、CHAPドメイン中に位置する以下のアミノ酸置換の1つ以上:R35E、L92W、V104S、V128T及びY137S、及び/又はSH3bドメイン中に位置する以下のアミノ酸置換の1つ以上:Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E及びV214Gを含み、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型PlySs2と比較して低下した免疫原性を有する。

0088

明細書中の置換は、置き換えられる配列番号1中の元のアミノ酸の一文字アミノ酸コード、続いて配列番号1中のアミノ酸位置、続いて配列中に置換され、修飾溶解素ポリペプチドをもたらすアミノ酸を用いて表される。したがって、例として、R35Eは、配列番号1のアミノ酸番号35のアルギニンがグルタミン酸で置き換えられる置換を示す。

0089

例示的な修飾溶解素ポリペプチドは、pp55、pp61、pp65、pp296、pp324、pp325、pp341、pp338、pp388、pp400、pp616、pp619、pp628、pp632及びpp642として本明細書に開示される。

0090

例示的な修飾溶解素ポリペプチドは、下記表1に示されるような配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸置換を含む。

0091

0092

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp55であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T及びY137S。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0093

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp61であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H及びI206E。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含み、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも80%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0094

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp65であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A、及びV212A。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0095

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp296であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、及びS198Q。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0096

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp324であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、及びN184D。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0097

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp325であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、及びR195E。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0098

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp381であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、及びS198H。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0099

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp341であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A、及びV212A。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列を含み、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも80%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0100

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp388であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:Y164N、N184D、R195E、V204K、及びV212E。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0101

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp400であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:R35E、L92W、V104S、V128T及びY137S。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0102

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp616であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:V128T、Y137S、及びY164K。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0103

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp619であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、及びY164K。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0104

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp628であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K、及びV212E。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0105

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp632であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K、及びV212E。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0106

本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはpp642であり、配列番号1のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E、及びV214G。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも80%の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0107

CHAP及び/又はCh3bドメイン中の少なくとも1つの置換に加えて、修飾溶解素ポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸挿入及び/又は欠失を、これらの修飾が修飾溶解素ポリペプチドの溶菌活性及び/又は免疫原性の低下を妨げない限りにおいて含んでいてもよい。

0108

キメラ溶解素ポリペプチドも開示される。キメラ溶解素ポリペプチドは、当該技術分野で既知である。例えば、ClyFは、Ply187溶解素の触媒ドメイン(N末端の157アミノ酸残基)とPlySs2の結合ドメイン(C末端の99残基)とを組み合わせたキメラ溶解素である(10)。或る特定の実施形態では、キメラ溶解素ポリペプチドは、本明細書に開示される修飾PlySs2CHAPドメインと別の溶解素の結合ドメインとを含む。或る特定の実施形態では、キメラ溶解素ポリペプチドは、別の溶解素の触媒ドメインと本明細書に開示される修飾PlySs2 SH3bドメインとを含む。

0109

幾つかの実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドの活性フラグメントが得られる。「活性フラグメント」という用語は、参照溶解素の1つ以上の生物活性を保持する完全長溶解素の一部分を指す。このため、本明細書で使用される場合、修飾溶解素ポリペプチドの活性フラグメントは、少なくとも1つのグラム陽性細菌種の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。

0110

ポリヌクレオチド
一態様では、本開示は、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子を含む単離ポリヌクレオチドであって、修飾溶解素ポリペプチドが溶菌活性及び野生型PlySs2溶解素(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する、単離ポリヌクレオチドに関する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントは、グラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。

0111

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがTCE1、TCE2、TCE3又はTCE4の1つ以上に少なくとも1つの置換を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがTCE5、TCE6、TCE7又はTCE8の1つ以上に少なくとも1つの置換を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2ポリペプチド(配列番号1)と比較して少なくとも第1の置換及び少なくとも第2の置換を含み、少なくとも第1の置換がTCE1、TCE2、TCE3又はTCE4の1つ以上にあり、少なくとも第2の置換がTCE5、TCE6、TCE7又はTCE8の1つ以上にある。或る特定の実施形態では、核酸分子は、野生型PlySs2ポリペプチド(配列番号1)と比較して少なくとも2つの置換を含む修飾溶解素ポリペプチドをコードし、少なくとも2つの置換がTCE4にある。或る特定の実施形態では、核酸分子は、野生型PlySs2ポリペプチド(配列番号1)と比較して少なくとも4つの置換を含む修飾溶解素ポリペプチドをコードし、少なくとも1つの置換がTCE2にあり、少なくとも1つの置換がTCE3にあり、少なくとも2つの置換がTCE4にある。

0112

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2ポリペプチド(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、修飾溶解素ポリペプチドがCHAPドメイン中の配列番号1のアミノ酸残基35、92、104、128及び137から選択される少なくとも1つの位置での少なくとも1つのアミノ酸置換、及び/又はSH3bドメイン中の配列番号1のアミノ酸残基164、184、195、198、204、206、212及び214から選択される少なくとも1つの位置での少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸残基92、104、128及び137にアミノ酸置換を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸残基92、104、128、137、164、184及び198にアミノ酸置換を含む。

0113

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換の1つ以上を含む:R35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212E、V212A及びV214G。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがCHAPドメイン中に位置する以下のアミノ酸置換の1つ以上:R35E、L92W、V104S、V128T及びY137S、及び/又はSH3bドメイン中に位置する以下のアミノ酸置換の1つ以上:Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E及びV214Gを含む。

0114

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T及びY137S。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号3のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号3と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0115

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H、及びI206E。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号4のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号4と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0116

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A、及びV212A。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号5のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号5と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号5と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0117

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、及びS198Q。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号6のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号6と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号6と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0118

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、及びN184D。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号7のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号7と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号7と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0119

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、及びR195E。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号8のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号8と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号8と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0120

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、及びS198H。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号9のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号9と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号9と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0121

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A、及びV212A。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号10のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号10と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号10と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0122

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:Y164N、N184D、R195E、V204K、及びV212E。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号11のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号11と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号11と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0123

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:R35E、L92W、V104S、V128T及びY137S。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号12のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号12と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号12と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0124

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:V128T、Y137S、及びY164K。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号13のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号13と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号13と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0125

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、及びY164K。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号14のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号14と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号14と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0126

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K、及びV212E。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号15のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号15と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号15と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0127

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K、及びV212E。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号16のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号16と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号16と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0128

或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号1に対して以下のアミノ酸置換を含む:L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E、及びV214G。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号17のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号17と少なくとも80%の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型PlySs2(配列番号1)と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも85%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも90%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも95%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも98%の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号17と少なくとも99%の配列同一性を有する。

0129

ベクター及び宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子を含む単離ポリヌクレオチド又は本単離ポリヌクレオチドの相補配列を含むベクターに関する。幾つかの実施形態では、ベクターはプラスミド又はコスミドである。他の実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、付加的なDNAセグメントウイルスゲノムライゲートすることができる。幾つかの実施形態では、ベクターは、それが導入された宿主細胞において自律的に複製することができる。幾つかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることで、宿主ゲノムと共に複製され得る。

0130

幾つかの実施形態では、本明細書で「組み換え発現ベクター」又は「発現ベクター」と称される特定のベクターは、それらが操作可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。ポリヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列機能的関係に置かれる場合、「操作可能に連結する」。例えば、プロモーター又は調節DNA配列は、RNA及び/又はタンパク質をコードするDNA配列に、2つの配列が操作可能に連結する、すなわちプロモーター又は調節DNA配列がコード又は構造DNA配列の発現レベルに影響を及ぼすように位置する場合に「操作可能に連結した」と言われる。操作可能に連結したDNA配列は、必ずしもというわけではないが、通例、連続する。

0131

概して、ポリペプチドを宿主内で維持、増加又は発現するのに適した任意の系又はベクターを本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントの発現に使用することができる。適切なDNA/ポリヌクレオチド配列を様々な既知の日常的な手法、例えばSambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に記載される手法のいずれかによって発現系に挿入することができる。さらに、簡便な単離方法を得るためにタグ、例えばc−myc、ビオチン、poly−His等を本開示の修飾溶解素ポリペプチドに付加することもできる。かかる発現系のキットが市販されている。

0132

広範な宿主/発現ベクターの組合せを、本修飾溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の発現に用いることができる。多数の好適なベクターが当業者に既知であり、市販されている。適切なベクターの例は例えば、Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に提示されている。かかるベクターとしては、特に染色体ベクター、エピソームベクター及びウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン酵母エピソーム、挿入因子酵母染色体要素、バキュロウイルスSV40等のパポバウイルスワクシニアウイルスアデノウイルス鶏痘ウイルス仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス等のウイルスに由来するベクター、並びにそれらの組合せに由来するベクター、例えばプラスミドとコスミド及びファージミド等のバクテリオファージ遺伝要素とに由来するベクターが挙げられる。

0133

さらに、上記ベクターは、本開示の修飾溶解素ポリペプチドの構成的又は誘導性発現をもたらすことができる。好適なベクターとしては、SV40の誘導体、並びに既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌プラスミドcolEl、pCR1、pBR322、pMB9及びそれらの誘導体、RP4、pBAD24及びpBAD−TOPO等のプラスミド;ファージDNA、例えばファージAの多数の誘導体、例えばNM989、並びに他のファージDNA、例えばM13及び繊維状一本鎖ファージDNA;2Dプラスミド等の酵母プラスミド又はその誘導体;昆虫又は哺乳動物細胞に有用なベクター等の真核細胞に有用なベクター;ファージDNA又は他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミド等のプラスミドとファージDNAとの組合せに由来するベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。上述のベクターの多くがNew England Biolabs Inc.、Addgene、Takara Bio Inc.、ThermoFisher Scientific Inc.等の供給業者から市販されている。

0134

さらに、ベクターは、様々な調節要素(プロモーター、リボソーム結合部位ターミネーターエンハンサー、発現レベルを制御する様々なシスエレメントを含む)を含んでいてもよく、ベクターは、宿主細胞に応じて構築される。広範な発現制御配列(それに操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を制御する配列)のいずれかを、本開示の修飾溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現するために、これらのベクターに用いることができる。有用な制御配列としては、例えばSV40、CMV、ワクシニアポリオーマ又はアデノウイルスの初期又は後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、LTR系、ファージAの主要オペレーター及びプロモーター領域、fd外被タンパク質の制御領域、3−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ(例えば、Pho5)のプロモーター、酵母接合因子のプロモーター、細菌における発現のための大腸菌プロモーター、並びに原核若しくは真核細胞、又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られる他のプロモーター配列、並びにそれらの様々な組合せが挙げられるが、これらに限定されない。通例、修飾溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、異種プロモーター又は調節要素に操作可能に連結する。

0135

別の態様では、本開示は、本開示の修飾溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む本明細書に開示のベクターのいずれかを含む単離宿主細胞に関する。広範な宿主細胞が本ポリペプチドの発現に有用である。本ポリペプチドの発現に適した宿主細胞の非限定的な例としては、大腸菌、シュードモナス属バシラス属ストレプトミセス属の株、酵母等の真菌、並びに組織培養物中のCHO、R1.1、B−W及びL−M細胞アフリカミドリザル腎臓細胞(例えば、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40及びBMT10)等の動物細胞昆虫細胞(例えば、Sf9)、並びにヒト細胞及び植物細胞等の既知の真核生物及び原核生物宿主が挙げられる。

0136

発現宿主は、任意の既知の発現宿主細胞であってもよいが、典型的な実施形態では、発現宿主は大腸菌株の1つである。これらとしては、Top10(ThermoFisher Scientific, Inc.)、DH5a(Thermo Fisher Scientific, Inc.)、XL1−Blue(Agilent Technologies, Inc.)、SCS110(Agilent Technologies, Inc.)、JM109(Promega, Inc.)、LMG194(ATCC)及びBL21(Thermo Fisher Scientific, Inc.)等の市販の大腸菌株が挙げられるが、これらに限定されない。大腸菌を宿主系として使用することの利点は幾つかあり、最適な環境条件下で、その倍加時間が約20分間である急速な増殖動態(Sezonov et al., J. Bacterial. 189 8746-8749 (2007))、容易に達成される高密度の培養物、外来性DNAによる容易かつ急速な形質転換等が挙げられる。プラスミド選択及び株選択を含む、大腸菌におけるタンパク質発現に関する詳細は、Rosano, G. and Ceccarelli, E., Front Microbial., 5: 172 (2014)に詳細に論考されている。

0137

本修飾溶解素ポリペプチドの効率的な発現は、最適発現シグナル転写及び翻訳の両方のレベルで)、正確なタンパク質フォールディング及び細胞増殖特性等の様々な要因によって決まる。ベクターを構築する方法及び構築した組換えベクターを宿主細胞に形質導入する方法に関して、当該技術分野で既知の従来の方法を利用することができる。全てのベクター、発現制御配列及び宿主が本開示の修飾溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現するよう同様に良好に機能するわけではないことが理解されるが、当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく所望の発現を達成するために過度な実験なしに適当なベクター、発現制御配列及び宿主を選択することが可能である。

0138

本開示の修飾溶解素ポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィーホスホセルロースクロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィーヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法によって組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィーを溶解素ポリペプチド精製に用いることもできる。

0139

代替的には、本開示の修飾溶解素ポリペプチドの作製に用いられるベクター系は、無細胞発現系であってもよい。様々な無細胞発現系が市販されており、限定されるものではないが、Promega、LifeTechnologies、Clonetech等から入手可能なものが挙げられる。

0140

修飾溶解素ポリペプチドを含む組成物
本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、単独で又は1つ以上の従来の抗生物質及び他の殺菌剤と共に抗微生物及び殺菌組成物、並びにその単位剤形に組み込まれ得る。

0141

通例、組成物は、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドをスタフィロコッカス・アウレウス;リステリア・モノサイトゲネス;スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターメディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群及びスタフィロコッカス・ヒイカス群等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌;ストレプトコッカス・スイス;ストレプトコッカス・ピオゲネス;ストレプトコッカス・アガラクティアエ;ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ;ストレプトコッカス・ニューモニアエ;ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群等の緑色レンサ球菌群に含まれる種;エンテロコッカス・フェカーリス;並びにエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択されるグラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量で含有する。

0142

本明細書に開示の組成物は、液剤懸濁剤乳剤錠剤丸剤ペレットカプセル液体を含むカプセル、散剤徐放製剤、坐剤タンポン塗布、エアロゾル、スプレー、ロゼンジ剤トローチ剤キャンディ注射剤チューインガム軟膏、擦り込み剤、時間放出貼付剤、液体を吸収したワイプ、及びそれらの組合せの形態を取り得る。したがって、組成物は、固体、例えば錠剤、再構成のための凍結乾燥散剤、リポソーム若しくはミセルとして利用され得るか、又は組成物は、液体、例えば液剤、懸濁剤、含嗽剤(gargles)、乳剤、若しくは固体若しくは液体を充填した、例えば経口使用のためのカプセルとして利用され得る。或る特定の実施形態では、組成物は、直腸投与のための坐剤若しくはカプセルの形態、又は非経口(例えば、静脈内又は皮下を含む)若しくは局所、例えば皮膚、咽頭若しくはへの使用のための滅菌注射用若しくは吸入用溶液若しくは懸濁液の形態であり得る。かかる組成物には医薬組成物が含まれ、その単位剤形は、付加的な活性化合物又は成分を伴う又は伴わない、従来の又は特別な割合での従来の又は新たな成分を含み得る。かかる単位剤形は、用いるべき意図される1日投与量範囲に応じた任意の好適な有効量の活性成分を含有し得る。

0143

担体及び賦形剤は、ヒト又は動物への使用に許容可能な多種多様の物質から選択することができる。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の非限定的な例としては、標準的な薬学的担体、例えばリン酸緩衝食塩水、水、ポリオール二糖又は多糖、並びにエマルション、例えば油/水エマルション及びマイクロエマルションが挙げられる。他の安定化賦形剤としては、安定化剤及び保護溶液SPS)の保護されたブレンドシクロデキストリン、並びに組換えヒトアルブミン(rHSA)が挙げられる。他の賦形剤としては、充填剤緩衝剤浸透圧調整剤(例えば塩及びアミノ酸)、界面活性剤、保存料、抗酸化剤、及び共溶媒を挙げることができる。本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドを含む固形経口組成物について、好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤滑沢剤結合剤崩壊剤等が挙げられる。液体経口組成物について、好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、水、グリコール、油、アルコール矯味剤、保存料等を挙げることができる。局所固形組成物、例えばクリーム剤ゲル剤フォーム、軟膏、又はスプレーについて、好適な賦形剤としては、限定されないが、セルロース性又は油性のクリーム剤、乳化剤硬化剤レオロジー調整剤又は増粘剤、界面活性剤、皮膚軟化剤、保存料、保湿剤アルカリ化剤又は緩衝剤、及び溶媒を挙げることができる。

0144

例えば、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、液体懸濁液、溶液又はエマルションのpHを修飾溶解素ポリペプチドの活性に実質的に影響を及ぼさない範囲内に維持する緩衝液と組み合わせることができる。例えば、組成物又は投与時に活性成分が見られる環境の望ましいpH範囲は約4.0〜約9.0、例えば約4.5〜約8.5であり得る。

0145

修飾溶解素ポリペプチドが最適化された形で活性を発揮するように安定化緩衝液が任意に含まれていてもよい。緩衝液は、ジチオスレイトール等の還元試薬を含有し得る。安定化緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム塩等の金属キレート試薬であっても若しくはそれを含んでいてもよく、又はリン酸緩衝液若しくはクエン酸リン酸緩衝液、若しくはTris若しくはコハク酸エステル等の任意の他の緩衝剤を含有していてもよい。

0146

温和な界面活性剤が、組成物に使用される修飾溶解素ポリペプチドの治療効果を高めるのに効果的な量で医薬組成物中に含まれていてもよい。好適な温和な界面活性剤としては、特にポリオキシエチレンソルビタン及び脂肪酸エステル(Tweenシリーズ等)、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(Triton−Xシリーズ等)、n−オクチル−β−D−グルコピラノシド、n−オクチル−β−D−チオグルコピラノシド、n−デシル−β−D−グルコピラノシド、n−ドデシル−β−D−グルコピラノシド、ポロキサマーポリソルベート20、ポリソルベート80、ポリエチレングリコール、並びに生物学的に生じる界面活性剤、例えば脂肪酸、グリセリドモノグリセリドデオキシコール酸及びデオキシコール酸のエステルを挙げることができる。

0147

保存料を本明細書に開示の組成物に使用してもよく、例えば全組成物の約0.05重量%〜約0.5重量%を占めることができる。保存料の使用は、製品が微生物で汚染される場合、配合物が微生物の増殖を予防又は軽減する(又は配合物の効力を弱める)ことを確実にし得る。例示的な保存料としては、メチルパラベンプロピルパラベンブチルパラベンクロロキシレノール安息香酸ナトリウムDMDヒダントイン、3−ヨード−2−プロピルブチルカルバメートソルビン酸カリウムクロルヘキシジンジグルコ酸塩、又はそれらの組合せが挙げられる。

0148

経口投与のため、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、固形又は液体の製剤、例えば錠剤、カプセル、散剤、液剤、懸濁剤、及び分散剤に配合される。錠剤又はカプセルの形態での経口投与のため、活性成分は1つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、例えば結合剤(例えばアルファ化トウモロコシデンプンポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース);増量剤(例えばラクトーススクロース、グルコース、マンニトールソルビトール、他の還元及び非還元糖微結晶性セルロース硫酸カルシウム、又はリン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えばステアリン酸マグネシウムタルクシリカステアリン酸フマル酸ステアリルナトリウムベヘン酸グリセリルステアリン酸カルシウム等);崩壊剤(例えばジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム);湿潤剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム)、着色及び矯味剤、ゼラチン甘味料、天然及び合成ガム(例えばアカシアトラガント又はアルギン酸塩)、緩衝塩カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等と組み合わせられ得る。液体形態での経口投与のため、薬物成分は、非毒性の、薬学的に許容可能な不活性の担体(例えばエタノールグリセロール、水)、懸濁化剤(例えばソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体又は水素食用油脂)、乳化剤(例えばレシチン又はアカシア)、非水性ビヒクル(例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分画された植物油)、保存料(例えばメチル若しくはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸)等と組み合わせられ得る。安定化剤、例えば抗酸化剤(例えばBHA、BHTプロピルガレートアスコルビン酸ナトリウム又はクエン酸)を加えて、剤形を安定化させることもできる。

0149

或る特定の実施形態では、錠剤を当該技術分野で既知の方法によってコーティングしてもよい。本明細書に開示の組成物を、例えばポリグリコール酸乳酸(PGLA)から製造されたマイクロスフェア又はマイクロカプセル内に導入することもできる。経口投与用液体製剤は、例えば溶液、シロップ、エマルション若しくは懸濁液の形態を取ることができ、又は使用前に水若しくは他の好適なビヒクルで再構成される乾燥製品として与えることができる。経口投与用の製剤は、活性化合物の制御又は遅延(postponed)放出をもたらすように適切に配合することができる。

0150

活性剤を小型単層ベシクル、大型単層ベシクル及び多層ベシクル等のリポソーム送達系の形態で投与してもよい。リポソームは、既知のコレステロールステアリルアミン又はホスファチジルコリン等の様々なリン脂質から形成することができる。

0151

錠剤及び丸剤等の固体組成物を調製するために、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドを医薬賦形剤と混合し、固体製剤化前(preformulation)組成物を形成することができる。必要に応じて、錠剤を標準的な手法により糖コーティング又は腸溶コーティングしてもよい。錠剤又は丸剤をコーティングするか又は他の形で調合して、持続性又は遅延作用の利点をもたらす剤形を得ることができる。例えば、錠剤又は丸剤が内部投薬成分(dosage component)及び外部投薬成分を含み、後者が前者の外層の形態であってもよい。2つの成分が、胃内での崩壊に対抗し、内部成分が無傷で十二指腸に運ばれるか又は更に放出を遅らせるように働く腸溶層で隔てられてもよい。様々な材料をかかる腸溶層又はコーティングに使用することができ、かかる材料としては、多数のポリマー酸、並びにポリマー酸とセラックセチルアルコール及び酢酸セルロース等の材料との混合物が挙げられる。同様に、経口投与される薬剤を拡散制御系、浸透圧デバイス(osmotic devices)、溶解制御マトリックス及び浸食性分解性マトリックスを含む時間制御放出ビヒクルの形態で投与することができる。

0152

本明細書に開示される局所用組成物は、皮膚科学的に又はに(otically)許容可能な担体等の薬学的又は生理学的に許容可能な担体を更に含み得る。かかる担体は、皮膚科学的に許容可能な担体の場合、皮膚、爪、粘膜、組織及び/又は毛髪に適合することができ、これらの要件を満たす任意の通常使用される皮膚用担体を含み得る。耳に許容可能な担体の場合、担体は耳の全ての部位に適合することができる。かかる担体は、当業者が容易に選択することができる。本明細書に開示の化合物の局所投与用の担体としては、鉱油、流動パラフィン白色ワセリンプロピレングリコール、ポリオキシエチレン及び/又はポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート60、セチルエステルワックスセテアリルアルコール、2−オクチルドデカノールベンジルアルコール及び水が挙げられるが、これらに限定されない。皮膚用軟膏の配合では、本開示の活性成分を油脂性炭化水素基剤、無水吸水性基剤油中水型吸水性基剤、水中油型水除去性(water-removable)基剤及び/又は水溶性基剤中に配合することができる。耳用組成物の配合では、本開示の活性成分を担体、例えばデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、多糖ゲル、Gelrite(商標)、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロースポリマー、及びアクリル酸のポリマー又はコポリマー等のカルボキシ含有ポリマー、並びに他のポリマー粘滑剤を含む水性ポリマー懸濁液中に配合することができる。本明細書に開示される局所用組成物は、水性、水性アルコール性若しくは油性溶液ローション若しくは血清分散液、水性、無水若しくは油性ゲル、水相への脂肪相(fatty phase)の分散(O/W又は水中油型)、若しくは逆に脂肪相への水相の分散(W/O又は油中水型)によって得られるエマルション、マイクロエマルション、若しくは代替的にはマイクロカプセルマイクロ粒子、又はイオン性及び/又は非イオン性脂質ベシクル分散液、クリーム、ローション、ゲル、フォーム(加圧キャニスター、好適なアプリケーター、乳化剤及び不活性噴射剤が用いられ得る)、エッセンス乳液、懸濁液、又はパッチを含む局所適用に適した任意の形態であり得る。本明細書に開示の局所用組成物は、親水性又は親油性ゲル化剤、親水性又は親油性活性剤保存剤酸化防止剤、溶媒、香料、増量剤、日焼け止め剤消臭剤(odor-absorbers)及び染料等の補助剤を含有していてもよい。更なる態様では、本明細書に開示の局所用組成物は、被験体の皮膚、又は他の組織若しくは器官と付着するか又は他の形で結合することが可能であり、治療有効量の本明細書に開示される1つ以上の修飾溶解素ポリペプチドを送達することが可能である経皮パッチ包帯剤パッドラップ、マトリックス及び包帯等の道具と共に投与することができる。

0153

幾つかの実施形態では、本明細書に開示の局所用組成物は、局所熱傷の治療に使用される1つ以上の成分を付加的に含む。かかる成分としては、プロピレングリコールヒドロゲル;グリコール、セルロース誘導体及び水溶性アルミニウム塩の組合せ;防腐剤;抗生物質;並びにコルチコステロイドを挙げることができるが、これらに限定されない。保湿剤(固体又は液体ワックスエステル等)、吸収促進剤(親水性クレイ又はデンプン等)、粘度上昇剤(viscosity building agents)及び皮膚保護剤を添加することもできる。局所用配合物は、洗口液等の洗浄剤の形態であってもよい。例えば、国際公開第2004/004650号を参照されたい。

0154

本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、適切な量の修飾溶解素ポリペプチドと担体とを含む治療剤の注射によって投与することもできる。例えば、修飾溶解素ポリペプチドは、グラム陽性細菌等の細菌による感染を治療するために筋肉内に、脳室内に、髄腔内に、真皮下に(subdermally)、皮下に、腹腔内に、静脈内に、又は直接注射若しくは持続注入によって投与することができる。担体は、蒸留水、生理食塩水、アルブミン、血清又はそれらの任意の組合せで構成され得る。さらに、非経口注射の医薬組成物は、修飾溶解素ポリペプチドの薬学的に許容可能な水溶液又は非水溶液を以下の1つ以上に加えて含み得る:pH緩衝液、補助剤(例えば、保存料、湿潤剤、乳化剤、安定化剤及び分散剤)、リポソーム配合物ナノ粒子、分散液、懸濁液及びエマルション、並びに使用直前に滅菌注射用溶液又は分散液に再構成される滅菌粉末

0155

或る特定の実施形態では、注射用の配合物は単位剤形で、例えばアンプル又は複数回投与容器内で与えることができ、或る特定の実施形態では、保存料が添加され得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の賦形剤、懸濁液、溶液又はエマルション等の形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化剤、充填剤及び/又は分散剤等の調合剤(formulatory agent)を含有し得る。活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で再構成される粉末形態であってもよい。緩衝剤の例としては、ヒスチジン、Tris、リン酸コハク酸クエン酸、メチオニン、シスチン、グリシン、温和な界面活性剤、カルシウム及びマグネシウムを挙げることができる。ジチオスレイトール等の還元剤が含まれていてもよい。

0156

非経口注射が選ばれる投与方法である場合、等張配合物が使用され得る。概して、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張液を使用してもよい。安定化剤としては、ヒスチジン、メチオニン、グリシン、アルギニン、ゼラチン、及びヒト又はウシ血清アルブミン等のアルブミンを挙げることができる。上述の賦形剤の多くが注射用の組成物にも使用され得ることが当業者には容易に理解される。

0157

血管収縮剤を本明細書に開示の組成物に添加することができる。或る特定の実施形態では、組成物は、滅菌かつパイロジェンフリーで提供され得る。

0158

別の実施形態では、本明細書に開示の組成物は、乾燥吸入用粉末、又はエアロゾル若しくはスプレー等の他の吸入用組成物であり得る。本明細書に開示の吸入用組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含み得る。吸入による投与については、修飾溶解素ポリペプチドは、好適な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタントリクロロフルオロメタンジクロロテトラフルオロエタン二酸化炭素又は他の好適なガスを用いた吸入器、加圧エアゾルディスペンサー又はネブライザー等の器具からのエアロゾルスプレーの提供の形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するための弁を設けることによって決定することができる。吸入器又は注入器に使用される、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを、活性成分とラクトース又はデンプン等の好適な粉末基剤との粉末混合物を含有させて配合することができる。

0159

一実施形態では、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、乾燥吸入用粉末、又はエアロゾル若しくはスプレーとして配合することができる。具体的な実施形態では、修飾溶解素ポリペプチド吸入溶液には、エアロゾル送達のための噴射剤を更に配合することができる。或る特定の実施形態では、溶液を噴霧することができる。多くの分注器具が、吸入によるポリペプチドを含む医薬組成物の送達のために当該技術分野で利用可能である。これらにはネブライザー、加圧エアロゾルディスペンサー及び吸入器が含まれる。

0160

薬剤と噴射剤との間の表面張力及び界面張力を低下させるために、界面活性剤を本明細書に開示される吸入用医薬組成物に添加することができる。薬剤、噴射剤及び賦形剤で懸濁液を形成する場合、界面活性剤が必要とされる場合も又は必要とされない場合もある。薬剤、噴射剤及び賦形剤で溶液を形成する場合、特定の薬剤及び賦形剤の溶解性に部分的に依存して、界面活性剤が必要とされる場合も又は必要とされない場合もある。界面活性剤は、薬剤と反応せず、薬剤、賦形剤及び噴射剤間の表面張力を低下させ、及び/又は弁潤滑剤として作用する任意の好適な非毒性の化合物であり得る。

0161

好適な界面活性剤の例としては、限定されないが、オレイン酸ソルビタントリオレエート塩化セチルピリジニウム大豆レシチン;ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート;ポリオキシエチレン(10)ステアリルエーテル;ポリオキシエチレン(2)オレイルエーテル;ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエチレンジアミンブロックコポリマー;ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート;ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート;ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー;ひまし油エトキシレート及びそれらの組合せが挙げられる。

0162

好適な噴射剤の例としては、限定されないが、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン及び二酸化炭素が挙げられる。

0163

吸入用組成物における使用に適した賦形剤の例としては、限定されないが、ラクトース、デンプン、中鎖脂肪酸のプロピレングリコールジエステル中鎖短鎖若しくは長鎖、又はそれらの組合せの脂肪酸のトリグリセリドエステルパーフルオロジメチルシクロブタンパーフルオロシクロブタン;ポリエチレングリコール;メタノール;ラウログリコール;ジエチレングリコールモノエチルエーテル;中鎖脂肪酸のポリグリコール化グリセリド;アルコール;ユーカリ油短鎖脂肪酸;及びそれらの組合せが挙げられる。

0164

幾つかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、鼻腔適用を含む。鼻腔適用としては、例えば、鼻腔用スプレー鼻腔用ドロップ鼻腔用軟膏、鼻腔用洗浄液、鼻腔用注射剤、鼻腔用パッキング気管支スプレー、及び吸入剤、又は咽喉ロゼンジ剤、洗口液若しくは含嗽剤の間接的な使用によるもの、又は鼻孔若しくは顔へ適用される軟膏の適用の使用によるもの、又はこれらの及び類似の適用方法の任意の組合せが挙げられる。

0165

本明細書に開示の組成物は、直腸投与のために、例えば坐剤又は停留浣腸(例えば、ココアバター又は他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含有する)として配合することもできる。

0166

或る特定の実施形態では、本明細書に開示の組成物は、グラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させるのに効果的な少なくとも1つの抗生物質等の少なくとも1つの抗生物質を更に含み得る。或る特定の実施形態では、少なくとも1つの抗生物質は、スタフィロコッカス・アウレウス;リステリア・モノサイトゲネス;スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターメディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群及びスタフィロコッカス・ヒイカス群等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌;ストレプトコッカス・スイス;ストレプトコッカス・ピオゲネス;ストレプトコッカス・アガラクティアエ;ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ;ストレプトコッカス・ニューモニアエ;ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群等の緑色レンサ球菌群に含まれる種;エンテロコッカス・フェカーリス;並びにエンテロコッカス・フェシウムの1つ以上に対して効果的である。

0167

本明細書に開示の組成物の或る特定の実施形態では、少なくとも1つの抗生物質と組み合わせた修飾溶解素ポリペプチドは、相乗作用、例えばグラム陽性細菌の少なくとも1つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる修飾溶解素ポリペプチド又は抗生物質の能力における相乗作用を示すことができる。相乗作用は、2つの活性剤の組合せの阻害活性を指す場合があり、組合せの部分阻止濃度(FIC)指数は1未満、強い相乗作用については、0.5以下である。作用物質のFICは、別の作用物質と組み合わせて使用した場合に細菌を死滅させるその作用物質の最小濃度を、第1の作用物質を単独で使用した場合に同じ効果を有する第1の作用物質の濃度で除算したものである。A及びBの組合せのFIC指数は、それらの個々のFIC値の総和である。

0168

相乗作用は、チェッカーボードアッセイにおいて評価することができる(時間−死滅曲線によって検証することができる)。各チェッカーボードアッセイにより多くの異なる組合せが生成し、慣例により、最も効果的な組合せのFIC値がFIC指数の算出に用いられる。FIC指数により相互作用性質が規定される。相加的相互作用を有する抗微生物剤は、FIC指数が1であり、1未満のFIC指数は、相乗的相互作用を規定し、FIC指数が1を超える組合せは、拮抗する。FIC指数が低いほど、組合せがより相乗的となる。例えば、Singh, P.K. et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279: L799-L805, 2000を参照されたい。相乗作用は、修飾溶解素ポリペプチドと抗生物質との同時投与に基づく効果的な新たな一般的抗感染戦略に影響がある。特に、修飾溶解素ポリペプチド及び抗生物質の両方の各々を、殺菌及び静菌活性を高め、耐性発現のリスクを低下させて、より少ない用量及び量で投与することができる。言い換えると、相乗作用の利点は、一方又は両方の作用物質をMIC以下の濃度で使用する場合に実現されるだけでなく、相乗作用の存在を、MIC以下の濃度の各作用物質を用いて試験することで明らかにすることができる。

0169

方法
その高度の活性及び低い毒性と共に、有利な治療指数を示すことから、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、その影響を受けやすい適応症又は病態の治療、軽減若しくは改善、緩和、又は解消のために、それを必要とする被験体、例えば生きている動物(ヒトを含む)に投与することができる。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ