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課題・解決手段

本発明は、標的細胞におけるGSK3Bの発現を減少させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GSK3BプレmRNAハイブリダイズする。本発明はさらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲート薬学的塩および薬学的組成物、およびがん炎症性疾患神経疾患神経損傷神経変性精神疾患および2型糖尿病等の状態の治療または緩和のための方法に関する。

概要

背景

グリコーゲンシンターゼキナーゼ(GSK)は、α型とβ型の2つのアイソフォームを持つセリンスレオニンキナーゼである。グリコーゲンシンターゼキナーゼ3ベータ(GSK3B)は、初めは、インスリン刺激性のグリコーゲン合成を調節する重要な酵素であるグリコーゲンシンターゼをリン酸化および不活性化するプロテインキナーゼとして同定された(Embiら、Eur. J. Biochem. 107, 519-527, (1980); およびVandenheedeら、Biol. Chem. 255 (11768-11774,1980参照)。GSK−3Bはインスリン活性化時に阻害され、それによりグリコーゲンシンターゼの活性化が可能になる。したがって、GSK−3Bの阻害はインスリン依存性のプロセスを刺激し、2型糖尿病治療に有用である。現在、メトホルミンなどの小分子薬物がこの目的で使用されている。しかし、低血糖および貧血などの多くの副作用のために、その用途は限られている。GSK3B阻害剤の潜在的な治療的用途のレビューは、Beurel et al., 2015 Pharmacol Ther. Vol 148 p. 114に記載されている。疾患へのGSK3Bの関与のさらなる兆候は、以下の開示に記載されている。

Pei et al., J Neuropathol Exp Neurol, 1997, Jan; 56(1); 70-8は、健常な対照較して、アルツハイマー病の脳からのポストシナプトソーム(postsynaptosomal)上清のGSK3のレベルが約50%増加することを測定した。King et al., 2014 Pharmacol Ther. Vol 141 p. 1は、神経疾患神経損傷神経変性および精神疾患との関連で、認知障害救済するGSK3B阻害剤の能力をさらにレビューしている。

Jiang et al., 2015 Cell Death and Disease Vol 6 e1865は、神経細胞におけるGSK3Bキナーゼ活性を低下させ、GSK3Bのタンパク質レベルを低く維持することで、in vivoで哺乳類軸索再生サポートすることを開示している。

Qiao et al., 2014PLOS One Vol 9 e105624は、GSK3BアイソフォームSer9−GSK3Bのリン酸化が2型糖尿病患者肝細胞癌(HCC)のリスク上昇と関連していることを開示している。

国際公開第05083105号は、GSK3Bを調節することができ、数々の疾患に適用される可能性がある化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スクリーニングできる化合物の1種として挙げられているが、実際にGSK3Bを調節する化合物の具体例はこの出願中には存在しない。

Spinnler et al., 2010, Medical Mycology 48 589-597は、成熟したGSK3B RNAを標的とする1つのsiRNA化合物を開示している。

記文献のいずれも、GSK3Bを標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを開示しておらず、特に、GSK3B遺伝子のイントロン配列または反復配列を標的とする概念を開示していない。
同じRNAの反復部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、in vitroの遺伝子導入実験のいくつかのケースで、標的mRNAダウンレギュレーション用量効果を増強したことが示された。これは、GCGR、STST3、MAPT、OGFR、およびBOK RNAの場合であった(Vickers at al.PLOS one, October 2014, Volume 9, Issue 10)。国際公開第2013/120003号もまた、反復ターゲティングによるRNAの調節に言及している。

発明の目的
GSK3Bは、多くの疾患、肝細胞癌(HCC)などのがん炎症性疾患、アルツハイマー病などの神経疾患、神経損傷、神経変性、精神疾患、および2型糖尿病の発症と進行に関与している。

本発明は、in vivoとin vitroの両方でGSK3BのmRNAおよびタンパク質発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。特に、反復部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じ標的配列内の単一領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、より高い用量効果を有する。したがって、本発明は、既知標準治療療法と併用療法で潜在的に使用することができ、アルツハイマー病、HCCおよび2型糖尿病などの様々な疾患の症状を潜在的に緩和することができる。さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、軸索再生を促進するために使用することができ、それにより、外傷性脳損傷、脳卒中、末梢神経系への外傷性損傷および軸索切断を含む関連状態帰結苦しむ患者の状態を改善する。

概要

本発明は、標的細胞におけるGSK3Bの発現を減少させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GSK3BプレmRNAにハイブリダイズする。本発明はさらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲート薬学的塩および薬学的組成物、およびがん、炎症性疾患、神経疾患、神経損傷、神経変性、精神疾患および2型糖尿病等の状態の治療または緩和のための方法に関する。なし

目的

本発明は、in vivoとin vitroの両方でGSK3BのmRNAおよびタンパク質発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する

効果

実績

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請求項1

哺乳類SK3B標的核酸に対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である、10−30ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、10−50ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、細胞内の哺乳類GSK3Bをコードする標的核酸の発現を低下させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項2

連続するヌクレオチド配列が配列番号1、2、3および4からなる群から選択される配列またはその天然に存在する変異体に対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項3

連続するヌクレオチド配列が、哺乳類GSK3B標的核酸(例えば配列番号1)のプレmRNA中に存在するイントロン領域に対し少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である、請求項1または2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項4

連続するヌクレオチド配列が、配列番号1の1072−92178位;配列番号1の92373−147066位;配列番号1の147151−170934位;配列番号1の171046−178243位;配列番号1の178375−181607位;配列番号1の181715−188565位;配列番号1の188664−217909位;配列番号1の218006−230812位;配列番号1の231000−251064位および配列番号1の251164−267562位から選択されるヒトGSK3BのプレmRNAに存在するイントロン領域に対して、少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である、請求項1‐3のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項5

連続するヌクレオチド配列が、哺乳類GSK3B標的核酸、例えば配列番号1のヒトプレmRNA、の1072−92178位、または哺乳類GSK3B標的核酸、例えば配列番号1のヒトプレmRNAの181715−188565位に対し少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である、請求項1−4のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項6

連続するヌクレオチド配列が配列番号5または配列番号20に対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である、請求項1−5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項7

連続するヌクレオチド配列が、配列番号1の184511−184530、184587−184606、184663−184682、184739−184758、184815−184834;184512−184531、184588−184607、184664−184683、184740−184759、184816−184835;184512−184529、184588−184605、184664−184681、184740−184757、184816−184833;184513−184528、184589−184604、184665−184680、184741−184756、184817−184832;184513−184526、184589−184602、184665−184678、184741−184754、184817−184830;184518−184531、184594−184607、184670−184683、184746−184759、184822−184835;56154−56173、56154−56171、56154−56169、56154−56167位からなる群から選択される配列番号1の標的領域に対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である、請求項1−6のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項8

連続するヌクレオチド配列が配列番号1の標的核酸のうちの10−22、例えば14−20ヌクレオチド長の標的領域に対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的であり、標的領域が標的核酸にわたって少なくとも5回反復される、請求項1−7のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項9

連続するヌクレオチド配列が、配列番号10、11、12、13、14および15からなる群から選択される配列と少なくとも90%同一、例えば100%同一である、請求項1−8のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項10

連続するヌクレオチド配列が、配列番号10、11、12、13、14および15からなる群から選択される配列からなるか、またはそれを含む、請求項1−9のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項11

連続するヌクレオチド配列が、1つ以上の2’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項1−10のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項12

1つ以上の2’糖修飾ヌクレオシドが、2’−O−アルキル−RNA、2’−O−メチル−RNA、2’−アルコキシ−RNA、2’−O−メトキシエチル−RNA、2’−アミノ−DNA、2’−フルオロ−DNA、アルビノ核酸(ANA)、2’−フルオロ−ANAおよびLNAヌクレオシドからなる群から独立に選択される、請求項11に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項13

1つ以上の修飾ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである、請求項11または11に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項14

連続するヌクレオチド配列が、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項11−13のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項15

連続するヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも50%、例えば少なくとも75%、例えば少なくとも90%、例えば全てがホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項14に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項16

オリゴヌクレオチドRNaseHを動員することができる、請求項1−15のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項17

アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列が式5’−F−G−F’−3’(式中、領域FおよびF’は独立に、1−8ヌクレオシドを含み、そのうち1−4つは2’糖修飾されており、かつ、FおよびF’領域の5’および3’末端画定し、GはRNaseHを動員することができる6から16の間のヌクレオシド領域、例えば6−16DNAヌクレオシドを含む領域である)のギャップマーからなるか、またはそれを含む、請求項1−16のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項18

アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列が、TAatggtctctattcagTTC化合物番号10_1);CTAatggtctctattcagTT(化合物番号11_1);AATGgtctctattcaGTT(化合物番号12_1);AATggtctctattcAGTT(化合物番号12_2);ATGgtctctattCAGT(化合物番号13_1);ATggtctctattCAGT(化合物番号13_2);GGTctctattcAGT(化合物番号14_1);CTAAtggtctCTAT(化合物番号15_1)からなる群から選択され;ここで大文字ベータ−D−オキシLNAなどのLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、LNACは全て5−メチルシトシンであってもよく、少なくとも1つ、好ましくは全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項1−17のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

請求項19

請求項1−18のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート

請求項20

請求項1−18のいずれか一項に記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドまたは請求項19に記載のコンジュゲートの薬学的に許容される塩。

請求項21

請求項1−18のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項19に記載のコンジュゲート、請求項20に記載の薬学的に許容される塩、ならびに薬学的に許容される希釈剤溶媒担体、塩および/もしくはアジュバントを含む薬学的組成物

請求項22

哺乳類GSK3Bを発現している標的細胞における哺乳類GSK3B発現を減少させるためのinvivoまたはinvitroの方法であって、請求項1−18のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項19に記載のコンジュゲート、請求項20に記載の薬学的に許容される塩、または請求項21に記載の薬学的組成物を、有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。

請求項23

医薬における使用のための、請求項1−18のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項19に記載のコンジュゲート、請求項20に記載の薬学的に許容される塩、または請求項21に記載の薬学的組成物。

請求項24

がん炎症性疾患神経疾患神経損傷神経変性精神疾患および2型糖尿病の予防または緩和における使用のための、請求項1−18のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項19に記載のコンジュゲート、請求項20に記載の薬学的に許容される塩、または請求項21に記載の薬学的組成物。

請求項25

がん、炎症性疾患、神経疾患、神経損傷、神経変性、精神疾患および2型糖尿病の治療または緩和のための医薬の調製のための、請求項1−18のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項19に記載のコンジュゲート、請求項20に記載の薬学的に許容される塩、または請求項21に記載の薬学的組成物の使用。

技術分野

0001

本発明は、グリコーゲンシンターゼキナーゼベータ(GSK3B)プレmRNA相補的であるオリゴヌクレオチドオリゴマー)に関する。このようなオリゴヌクレオチドは、細胞内のGSK3B転写物を減少させ、GSK3Bの発現の減少をもたらするために使用することができる。GSK3B発現の調節は、がん炎症性疾患神経疾患神経損傷神経変性精神疾患2型糖尿病等の様々な医学障害に有益である。

背景技術

0002

グリコーゲンシンターゼキナーゼ(GSK)は、α型とβ型の2つのアイソフォームを持つセリンスレオニンキナーゼである。グリコーゲンシンターゼキナーゼ3ベータ(GSK3B)は、初めは、インスリン刺激性のグリコーゲン合成を調節する重要な酵素であるグリコーゲンシンターゼをリン酸化および不活性化するプロテインキナーゼとして同定された(Embiら、Eur. J. Biochem. 107, 519-527, (1980); およびVandenheedeら、Biol. Chem. 255 (11768-11774,1980参照)。GSK−3Bはインスリン活性化時に阻害され、それによりグリコーゲンシンターゼの活性化が可能になる。したがって、GSK−3Bの阻害はインスリン依存性のプロセスを刺激し、2型糖尿病の治療に有用である。現在、メトホルミンなどの小分子薬物がこの目的で使用されている。しかし、低血糖および貧血などの多くの副作用のために、その用途は限られている。GSK3B阻害剤の潜在的な治療的用途のレビューは、Beurel et al., 2015 Pharmacol Ther. Vol 148 p. 114に記載されている。疾患へのGSK3Bの関与のさらなる兆候は、以下の開示に記載されている。

0003

Pei et al., J Neuropathol Exp Neurol, 1997, Jan; 56(1); 70-8は、健常な対照較して、アルツハイマー病の脳からのポストシナプトソーム(postsynaptosomal)上清のGSK3のレベルが約50%増加することを測定した。King et al., 2014 Pharmacol Ther. Vol 141 p. 1は、神経疾患、神経損傷、神経変性および精神疾患との関連で、認知障害救済するGSK3B阻害剤の能力をさらにレビューしている。

0004

Jiang et al., 2015 Cell Death and Disease Vol 6 e1865は、神経細胞におけるGSK3Bキナーゼ活性を低下させ、GSK3Bのタンパク質レベルを低く維持することで、in vivoで哺乳類軸索再生サポートすることを開示している。

0005

Qiao et al., 2014PLOS One Vol 9 e105624は、GSK3BアイソフォームSer9−GSK3Bのリン酸化が2型糖尿病患者肝細胞癌(HCC)のリスク上昇と関連していることを開示している。

0006

国際公開第05083105号は、GSK3Bを調節することができ、数々の疾患に適用される可能性がある化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スクリーニングできる化合物の1種として挙げられているが、実際にGSK3Bを調節する化合物の具体例はこの出願中には存在しない。

0007

Spinnler et al., 2010, Medical Mycology 48 589-597は、成熟したGSK3B RNAを標的とする1つのsiRNA化合物を開示している。

0008

記文献のいずれも、GSK3Bを標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを開示しておらず、特に、GSK3B遺伝子のイントロン配列または反復配列を標的とする概念を開示していない。
同じRNAの反復部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、in vitroの遺伝子導入実験のいくつかのケースで、標的mRNAのダウンレギュレーション用量効果を増強したことが示された。これは、GCGR、STST3、MAPT、OGFR、およびBOK RNAの場合であった(Vickers at al.PLOS one, October 2014, Volume 9, Issue 10)。国際公開第2013/120003号もまた、反復ターゲティングによるRNAの調節に言及している。

0009

発明の目的
GSK3Bは、多くの疾患、肝細胞癌(HCC)などのがん、炎症性疾患、アルツハイマー病などの神経疾患、神経損傷、神経変性、精神疾患、および2型糖尿病の発症と進行に関与している。

0010

本発明は、in vivoとin vitroの両方でGSK3BのmRNAおよびタンパク質発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。特に、反復部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じ標的配列内の単一領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、より高い用量効果を有する。したがって、本発明は、既知標準治療療法と併用療法で潜在的に使用することができ、アルツハイマー病、HCCおよび2型糖尿病などの様々な疾患の症状を潜在的に緩和することができる。さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、軸索再生を促進するために使用することができ、それにより、外傷性脳損傷、脳卒中、末梢神経系への外傷性損傷および軸索切断を含む関連状態帰結苦しむ患者の状態を改善する。

0011

本発明は、標的哺乳類GSK3B核酸に相補的なギャップマーオリゴヌクレオチドなどのアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびその使用を提供する。

0012

本発明は、特定の領域に相補的である連続するヌクレオチド配列、または標的哺乳類GSK3B核酸に存在する配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

0013

本発明の化合物は、哺乳類GSK3B核酸を発現している細胞中の哺乳類GSK3B標的核酸を阻害することができる。

0014

本発明は、哺乳類GSK3B核酸を標的とするアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド化合物、ならびにそのin vitroおよびin vivoでの使用と、医薬におけるそれらの使用とを提供する。

0015

したがって、第1の態様では、本発明は、哺乳類GSK3B標的核酸に対して、例えば完全に相補的など、少なくとも90%の相補性を有する、10−30ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、10−50ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内の哺乳類GSK3B標的核酸の発現を低下させることができる。

0016

したがって、第1の態様では、本発明は、連続するヌクレオチド配列が配列番号1、2、3および4からなる群から選択される配列またはその天然に存在する変異体に対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

0017

さらなる態様では、本発明は、連続するヌクレオチド配列が、哺乳類GSK3B標的核酸(例えば配列番号1)のプレmRNA中に存在するイントロン領域に対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

0018

さらなる態様では、本発明は、連続するヌクレオチド配列が、配列番号1の84511−184530、184587−184606、184663−184682、184739−184758、184815−184834;184512−184531、184588−184607、184664−184683、184740−184759、184816−184835;184512−184529、184588−184605、184664−184681、184740−184757、184816−184833;184513−184528、184589−184604、184665−184680、184741−184756、184817−184832;184513−184526、184589−184602、184665−184678、184741−184754、184817−184830;184518−184531、184594−184607、184670−184683、184746−184759、184822−184835;56154−56173、56154−56171、56154−56169、56154−56167、267802−267821、267802−267815、267804−26821および267806−267821位からなる群から選択される配列番号1の標的領域に少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

0019

さらなる態様では、本発明は、連続するヌクレオチド配列が配列番号1の標的核酸のうちの10−22、例えば14−20ヌクレオチド長の標的領域に対して95%相補的、例えば完全に相補的であり、標的領域が標的核酸にわたって少なくとも5回以上反復されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

0020

さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列はTTAgttatcataattcacCC(化合物番号6_1);AGTTatcataattcacCC(化合物番号7_1);TTATcataattcACCC(化合物番号8_1);およびATCAtaattcACCC(化合物番号9_1)からなる群から選択され;ここで大文字はベータ−D−オキシLNAなどのLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、LNA Cは全て5−メチルシトシンであってもよく、少なくとも1つ、好ましくは全てのヌクレオシド間結合ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

0021

さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列はTAatggtctctattcagTTC(化合物番号10_1);CTAatggtctctattcagTT(化合物番号11_1);AATGgtctctattcaGTT(化合物番号12_1);AATggtctctattcAGTT(化合物番号12_2);ATGgtctctattCAGT(化合物番号13_1);ATggtctctattCAGT(化合物番号13_2);;GGTctctattcAGT(化合物番号14_1);およびCTAAtggtctCTAT(化合物番号15_1)からなる群から選択され;ここで大文字はベータ−D−オキシLNAなどのLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、LNA Cは全て5−メチルシトシンであってもよく、少なくとも1つ、好ましくは全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

0022

さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列はATGAaattggtttgtaTTTA(化合物番号16_1);TTGGtttgtaTTTA(化合物番号17_1)、ATGAaattggtttgTATT (化合物番号18_1)、ATGAaattggttTGTA(化合物番号19_1)からなる群から選択され;ここで大文字はベータ−D−オキシLNAなどのLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、LNA Cは全て5−メチルシトシンであってもよく、少なくとも1つ、好ましくは全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

0023

さらなる態様では、本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートを提供する。

0024

さらなる態様では、本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドまたは本発明のいくつかの態様によるコンジュゲート、ならびに薬学的に許容される希釈剤溶媒担体、塩および/またはアジュバントを含む薬学的組成物を提供する。

0025

さらなる態様では、本発明は、哺乳類GSK3Bを発現している標的細胞におけるGSK3B発現を阻害するための方法を提供し、前記方法は、本発明によるオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的に許容される塩または薬学的組成物を前記細胞に有効な量で投与することを含む。

0026

さらなる態様では、本発明は、疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に、本発明によるオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的に許容される塩または薬学的組成物の治療的または予防的有効量を投与することを含む、疾患を治療または予防するための方法を提供する。

0027

さらなる態様において、本発明は、がん、炎症性疾患、神経疾患、神経損傷、神経変性、精神疾患および2型糖尿病の治療または予防用医薬の調製のためのオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的に許容される塩、また薬学的組成物の使用を提供する。

0028

定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、2つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者が一般に理解するものを意味する。このような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーと呼ばれることもある。オリゴヌクレオチドは、固相化学合成後に精製することにより、実験室で一般的に製造される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分またはその修飾物の配列または順序に言及する。本発明のオリゴヌクレオチドは人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでいてもよい。

0029

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続する配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってsiRNAまたはshRNAではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部または間の自己相補性の程度が50%未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重構造(同じオリゴヌクレオチドの2つの分子間の二重構造)を形成することができる。

0030

有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。

0031

連続するヌクレオチド配列
「連続するヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書において、「連続する核酸塩基配列」という用語および「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に使用される。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続するヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、FG−F’ギャップマー領域などの連続するヌクレオチド配列を含み、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続するヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であってもなくてもよい。

0032

本発明による連続する配列は、標的核酸の所与の位置で連続するヌクレオチド配列に相補的であり得る。したがって、連続するヌクレオチド配列は、本発明の標的配列の適切な長さに対して少なくとも90%、例えば100%相補的である。したがって、連続するヌクレオチド配列は、標的配列上の12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチドのストレッチに相補的であり得る。

0033

ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明においては、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方が含まれる。自然界では、DNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および1つ以上のリン酸基(ヌクレオシドには存在しない)を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、互換的に「ユニット」または「モノマー」と呼ばれ得る。

0034

修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分または(核酸)塩基部分の1つ以上の修飾の導入により、同等のDNAまたはRNAヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施態様では、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。本明細書では、修飾ヌクレオシドという用語は、「ヌクレオシアナログ」または修飾「ユニット」または修飾「モノマー」という用語と互換的に使用され得る。非修飾DNAまたはRNAの糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではDNAまたはRNAヌクレオシドと呼ばれる。DNAまたはRNAヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、ワトソンクリック塩基対を許容する場合でも、依然として一般的にDNAまたはRNAと称される。

0035

修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、2つのヌクレオシドを共有結合させるホスホジエステル(PO)結合以外の結合として当業者に一般的に理解されているものを指す。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合には、隣接するヌクレオシド間にホスホジエステル結合を形成するリン酸基が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合は、in vivoでの使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化するのに特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのDNAまたはRNAヌクレオシドの領域、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに領域FおよびF’のような修飾ヌクレオシドの領域内でのヌクレアーゼ切断から保護するのに役立ち得る。

0036

ある実施態様では、オリゴヌクレオチドは、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性である1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合などの、天然ホスホジエステルから1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中インキュベートすることによって、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ(例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼSVPD))を使用することによって決定することができ、いずれも当技術分野でよく知られている。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも50%が修飾されており、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも80、または例えば少なくとも90%がヌクレアーゼ耐性のヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てが、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの非ヌクレオチド官能基に連結するヌクレオシドは、ホスホジエステルでもよいことが認識されよう。

0037

本発明のオリゴヌクレオチドにおける使用のための好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。

0038

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも50%がホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも80%、または例えば少なくとも90%がホスホロチオエートである。いくつかの実施態様では、ホスホジチオエートヌクレオシド間結合以外に、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロジチオエートである。いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジチオエート結合(単数または複数)に加えて、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および少なくとも1つのホスホジエステル結合(例えば、2、3または4ホスホジエステル結合)の両方を含む。ギャップマーオリゴヌクレオチドにおいて、ホスホジエステル結合は、存在する場合、ギャップ領域G内の連続するDNAヌクレオシド間に好適には位置していない。

0039

ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、ギャップマーの領域Gなど、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員できるオリゴヌクレオチド領域において特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合はまた、非ヌクレアーゼ動員領域および/またはギャップマーの領域FおよびF’のような親和性増強領域において有用であり得る。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施態様では、領域FもしくはF’、または領域FとF’の両方に1つ以上のホスホジエステル結合を含み得、領域Gのヌクレオシド間結合は、完全にホスホロチオエートであり得る。

0040

有利には、オリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシド間結合、またはオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

0041

EP第2742135号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合(ホスホジエステルおよびホスホロチオエート以外)、例えばアルキルホスホネートメチルホスホネートヌクレオシド間を含んでもよく、これは、EP第2742135号によれば、そうでなければDNAホスホロチオエートのギャップ領域において例えば耐容性を示し得ることが理解される。

0042

核酸塩基
核酸塩基という用語には、核酸ハイブリダイゼーション水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例:アデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例:ウラシルチミンおよびシトシン)部分が含まれる。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である修飾核酸塩基包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と天然に存在しない変異体の両方を指す。このような変異体は、例えばHirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載されている。

0043

いくつかの実施態様では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを、置換プリンまたは置換ピリミジン、例えば、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5−メチルシトシン、5−チオゾロ−シトシン、プロピニル−シトシン、5−プロピニル−ウラシル、5−ブロモウラシル、5−チアゾロ−ウラシル、2−チオ−ウラシル、2’チオ−チミン、イノシンジアミノプリン6−アミノプリン、2−アミノプリン、2,6−ジアミノプリンおよび2−クロロ−6−アミノプリンから選択される核酸塩基など、修飾プリンまたはピリミジンに変更することによって修飾される。

0044

核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基文字コード、例えばA、T、G、CまたはUによって示すことができ、ここで各文字には、同等の機能を持つ修飾核酸塩基を含まれてもよい。例えば、例示的なオリゴヌクレオチドでは、核酸塩基部分は、A、T、G、C、および5−メチルシトシンから選択される。LNAギャップマーには、5−メチルシトシンLNAヌクレオシドを使用してもよい。

0045

修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを説明するために文献で使用されている用語である。

0046

相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド/ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対形成の能力を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン(G)−シトシン(C)とアデニン(A)−チミン(T)/ウラシル(U)である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含み得、例えば5−メチルシトシンは、シトシンの代わりにしばしば使用され、そのような用語としての相補性は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基間のワトソン・クリック塩基対形成を包含することが理解されよう(例えばHirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1参照)。

0047

本明細書で使用される「%相補的」という用語は、核酸分子(例えばオリゴヌクレオチド)における、連続するヌクレオチド配列にわたって参照配列(例えば標的配列または配列モチーフ)に相補的である、連続するヌクレオチド配列のうちのヌクレオチドの割合(パーセント)を指す。
したがって、相補性のパーセンテージは、(標的配列5’−3’およびオリゴヌクレオチド配列3’−5’と整列した場合)2つの配列間で相補的である(ワトソン・クリック塩基対からの)整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数割り、100を掛けることによって計算される。このような比較では、整列(塩基対を形成)しない核酸塩基/ヌクレオチドはミスマッチと呼ばれる。連続するヌクレオチド配列の相補性%の計算では、挿入や欠失は認められない。相補性を決定する際に、ワトソン・クリック塩基対を形成する核酸塩基の機能的能力が保持されている限り、核酸塩基の化学的修飾は無視されることが理解されるであろう(例えば5’−メチルシトシンは、同一性%を計算する目的でシトシンと同一であるとみなされる)。

0048

「完全に相補的」という用語は、100%の相補性を指す。

0049

標的核酸(配列番号5)に完全に相補的なオリゴヌクレオチド(配列番号10)の例を以下に示す。
5’ AGAAGGAACTGAATAGAGACCATTAGCTTTAATCAT 3’ (配列番号5)
3’ CTTGACTTATCTCTGGTAAT 5’ (配列番号10)

0050

同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、核酸分子(例えばオリゴヌクレオチド)における、連続するヌクレオチド配列にわたって参照配列(例えば配列モチーフ)と同一である、連続するヌクレオチド配列のうちのヌクレオチドの割合(パーセントで表される)を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、(本発明の化合物の連続するヌクレオチド配列中および参照配列中の)2つの配列間で同一である(マッチしている)整列した塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド総数で割り、100を掛けることによって計算される。したがって、同一性のパーセンテージ=(マッチ数x100)/整列した領域の長さ(例:連続するヌクレオチド配列)。挿入および欠失は、連続するヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算では認められない。同一性を決定する際に、ワトソン・クリック塩基対を形成する核酸塩基の機能的能力が保持されている限り、核酸塩基の化学的修飾は無視されることが理解されるであろう(例えば5’−メチルシトシンは、同一性%を計算する目的でシトシンと同一であるとみなされる)。

0051

ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される「ハイブリダイズすること」または「ハイブリダイズする」という用語は、対向する鎖の塩基対間に水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成する2つの核酸鎖(例:オリゴヌクレオチドおよび標的核酸)と理解される。2つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強さである。それは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重になる温度である融解温度(Tm)で表される。生理学的条件では、Tmは親和性に厳密には比例しない(Mergny and Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準状態ギブズ自由エネルギーΔG°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔG°=−RTln(Kd)[式中、Rはガス定数であり、Tは絶対温度である]による反応の解離定数(Kd)に関連する。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の反応の非常に低いΔG°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔG°は、水溶液の濃度が1M、pHが7、温度が37°Cである反応に伴うエネルギーである。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは自然発生的な反応であり、自然発生的な反応の場合、ΔG°はゼロ未満である。ΔG°は、例えば、Hansen et al., 1965,Chem. Comm. 36-38およびHoldgate et al., 2005, Drug Discov Todayに記載されている等温滴定熱量測定(ITC)の使用により実験で測定することができる。当業者であれば、市販の装置がΔG°測定のために利用可能であることを知っているであろう。ΔG°はまた、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216およびMcTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405によって記載されている適切に導出された熱力学パラメータを使用する、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465により記載されている最近傍モデルを使用することにより、数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、10−30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−10kcal未満の推定ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態のギブズ自由エネルギーΔG°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、8−30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−10kcalの範囲未満、例えば−15kcal未満、例えば−20kcal未満、例えば−25kcal未満などの推定ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、−10から−60kcal、例えば−12から−40、例えば−15から−30kcal、または−16から−27kcal、例えば−18から−25kcalなどの推定ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズする。

0052

標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳類GSK3Bをコードする核酸であり、例えば遺伝子、RNA、mRNA、およびプレmRNA、成熟mRNAまたはcDNA配列であり得る。したがって、標的は、GSK3B標的核酸と呼ばれる場合がある。

0053

本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば哺乳類GSK3Bのエクソン領域を標的とすることができ、または好ましくは、GSK3BプレmRNAのイントロン領域を標的とすることができる(例えば表1を参照)。

0054

適切には、標的核酸は、ヒト、サルおよびマウスのGSK3Bのゲノム配列、成熟mRNAおよびプレmRNA配列を提供するGSK3Bタンパク質、特にヒトGSK3B(例えば表1および2を参照)などの哺乳類GSK3Bをコードする。

0055

いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号1、2、3および4またはこれらの天然に存在する変異体(例えば、哺乳類GSK3Bタンパク質をコードする配列)からなる群から選択される。

0056

標的核酸は、いくつかの実施態様において、RNAまたはDNA、例えば、成熟mRNAなどのメッセンジャーRNA、またはヒトGSK3Bなどの哺乳類GSK3Bタンパク質をコードするプレmRNA、例えば、配列番号1として開示されているヒトプレmRNA配列、または配列番号2および配列番号3として開示されているヒト成熟mRNAであってもよい。

0057

本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に用いる場合、標的核酸は、cDNAまたはDNAもしくはRNAに由来する合成核酸であってもよい。

0058

in vivoまたはin vitro適用の場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、GSK3B標的核酸を発現している細胞におけるGSK3B標的核酸の発現を阻害することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続する配列は、典型的には、任意選択的に1または2のミスマッチを除いて、また、任意選択的に、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基または他の非相補的末端ヌクレオチド(例えば領域D’またはD’)に連結し得るヌクレオチドベースのリンカー領域を除いて、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定した場合、GSK3B標的核酸に相補的である。

0059

GSK3Bのためのゲノムおよびアセンブリについてのさらなる種横断的情報を表2に、プレmRNAおよびmRNAの配列詳細を表3に示す。

0060

注:配列番号4は複数のNNNNの領域を含み、そこではシーケンシングによって配列を正確に洗練化できなかったため、縮重配列が含まれる。疑義を避けるために、本発明の化合物は、実際のカニクイザル標的配列に相補的であり、したがって変性化合物ではない。

0061

標的配列
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的であり、核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施態様では、標的配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列に相補的である標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、標的ヌクレオチド配列と呼ばれる場合があるいくつかの実施態様では、標的配列は、単一のオリゴヌクレオチドの連続する相補的配列よりも長く、例えば、本発明の複数のオリゴヌクレオチドによって標的化され得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。

0062

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の標的配列などの標的核酸に相補的である連続するヌクレオチド配列を含む。

0063

いくつかの実施態様では、標的配列は、ヒトとサルの間で保存されており、特に配列番号1および配列番号4に存在する配列である。好ましい実施態様では、標的配列は、配列番号5に存在する。

0064

オリゴヌクレオチドが相補的である標的配列は、一般に、少なくとも10ヌクレオチドの連続する核酸塩基配列を含む。連続するヌクレオチド配列は、10から50の間のヌクレオチド、例えば12から30、例えば14から20、例えば15から18の間の連続するヌクレオチドである。

0065

本発明の一実施態様において、標的配列は配列番号5である。

0066

本発明の別の実施態様において、標的配列は配列番号20である。

0067

反復標的領域
標的領域または標的配列は、標的核酸に固有のものであってもよい(一度だけ存在する)。

0068

本発明のいくつかの態様において、標的領域は、標的核酸の範囲にわたって少なくとも2回反復される。本発明に包含されるように反復されるとは、異なる位置で標的核酸中に存在する、少なくとも10、例えば少なくとも11または少なくとも12ヌクレオチド長の、少なくとも2つの同一のヌクレオチド配列(標的領域)があることを意味する。各反復標的領域は、標的核酸の連続する配列上の少なくとも1つの核酸塩基によって同一領域から分離されており、標的核酸内の重複しない異なる位置に位置している。

0069

標的細胞
本明細書で使用される「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施態様では、標的細胞は、in vivoまたはin vitroであってよい。いくつかの実施態様では、標的細胞は、例えばマウス細胞またはラット細胞などのげっ歯類細胞のような哺乳動物細胞、またはサル細胞もしくはヒト細胞などの霊長類細胞である。

0070

いくつかの好ましい実施態様では、標的細胞は、GSK3BプレmRNAまたはGSK3B成熟mRNAなどのGSK3B mRNAを発現する。GSK3B mRNAのポリテールは、通常、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。

0071

天然に存在する変異体
「天然に存在する変異体」という用語は、GSK3B遺伝子の変異体または転写物であって、標的核酸と同じ遺伝子座に由来し、かつ標的核酸と同じ染色体位置および方向からの指向性転写物であるが、例えば、同じアミノ酸をコードするコドン多様性を引き起こす遺伝暗号縮重のために、またはプレmRNAの選択的スプライシングもしくは、一塩基多型などの多型および対立遺伝子変異体の存在のために、異なることがあるGSK3B遺伝子の変異体または転写物を指す。したがって、オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸およびその天然に存在する変異体を標的とすることができる。

0072

いくつかの実施態様では、天然に存在する変異体は、哺乳類GSK3B標的核酸、例えば配列番号1、2、3および4からなる群から選択される標的核酸に対して少なくとも95%、例えば少なくとも98%または少なくとも99%の相同性を有する。

0073

発現の調節
本明細書で使用される「発現の調節」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前のGSK3Bの量と比較したときに、GSK3Bの量を変化させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力の総称として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処理された個体もしくは標的細胞、または非標的化オリゴヌクレオチド(モック)で処理された個体もしくは標的細胞であると一般的に理解されている。

0074

本発明による調節は、例えばmRNAの分解または転写遮断によって、哺乳類GSK3Bの発現を阻害、ダウンレギュレート、低減、抑制、除去、停止、遮断、防止、低減、低下、回避または終了させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力として理解されるべきである。

0075

高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは修飾ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば、融解温度(Tm)によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドあたり、好ましくは+0.5から+12℃の間、より好ましくは+1.5から+10℃の間、最も好ましくは+3から+8℃の間の融解温度の増加をもたらす。多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野で知られており、例えば、多くの2’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸(LNA)が含まれる(例:Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213参照)。

0076

糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾糖部分、すなわち、DNAおよびRNAに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する1つまたは複数のヌクレオシドを含み得る。

0077

リボース糖部分を修飾したヌクレオシドが、親和性および/またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として数多く作製されてきた。

0078

このような修飾には、リボース環構造が修飾されたもの、例えばヘキソース環との置換によって修飾されたもの(HNA)、または典型的にはリボース環上のC2炭素とC4炭素の間にビラジカルブリッジ(biradicle bridge)を有する二環式環(LNA)、または典型的にはC2炭素とC3炭素の間に結合を欠いた未結合のリボース環(例:UNA)が含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸(国際公開第2011/017521号)またはトリシクロ核酸(国際公開第2013/154798号)が含まれる。修飾ヌクレオシドはまた、例えばペプチド核酸(PNA)またはモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分で置換されているヌクレオシドを含む。

0079

糖修飾には、リボース環上の置換基水素以外の基、またはDNAおよびRNAヌクレオシドに自然に見られる2’−OH基に変更することによって行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば2’、3’、4’または5’の位置に導入されてもよい。修飾糖部分を有するヌクレオシドには、2’置換ヌクレオシドなどの2’修飾ヌクレオシドも含まれる。2’置換ヌクレオシドの開発は多くの注目を集めており、実際、複数の2’置換ヌクレオシドで、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、ヌクレオシド耐性の強化や親和性の強化などの有益な特性を持つことが明らかにされた。

0080

2’修飾ヌクレオシド
2’糖修飾ヌクレオシドとは、2’位置にHもしくは−OH以外の置換基を有するヌクレオシド(2’置換ヌクレオシド)、または2’結合ビラジカルを含むヌクレオシドであり、2’置換ヌクレオシドおよびLNA (2’−4’ビラジカル架橋)ヌクレオシドを含む。例えば、2’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに対する強化された結合親和性および/または強化されたヌクレアーゼ耐性を提供し得る。2’置換修飾ヌクレオシドの例は、2’−O−アルキル−RNA、2’−O−メチル−RNA、2’−アルコキシ−RNA、2’−O−メトキシエチル−RNA(MOE)、2’−アミノ−DNA、2’−フルオロ−RNA、および2’−F−ANAヌクレオシドである。さらなる例については、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213およびDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。以下に、いくつかの2’置換修飾ヌクレオシドの図を示す。

0081

ロックド核酸ヌクレオシド(LNA)
「LNAヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のC2’およびC4’を結合するビラジカル(「2’−4’ブリッジ」とも呼ばれる)を含む2’−修飾ヌクレオシドであり、リボース環の立体配座を制限またはロックする。これらのヌクレオシドは、文献では、架橋核酸または二環式核酸(BNA)とも呼ばれている。リボースの立体配座のロックは、LNAが相補的なRNAまたはDNA分子に対するオリゴヌクレオチドに組み込まれるときのハイブリダイゼーションの親和性の強化(二重安定化)に関連している。これは、オリゴヌクレオチド/補体二本鎖の融解温度を測定することによって常套的に決定することができる。

0082

LNAヌクレオシドの非限定的な例は、国際公開第99/014226号、国際公開第00/66604号、国際公開第98/039352号、国際公開第2004/046160号、国際公開第00/047599号、国際公開第2007/134181号、国際公開第2010/077578号、国際公開第2010/036698号、国際公開第2007/090071号、国際公開第2009/006478号、国際公開第2011/156202号、国際公開第2008/154401号、国際公開第2009/067647号、国際公開第2008/150729、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth et al., J. Org. Chem. 2010, 第75(5)巻、1569-81頁、およびMitsuoka et al., Nucleic AcidsResearch 2009, 37(4), 1225-1238に開示されている。

0083

2’−4’ブリッジは、2‐4個の架橋原子を含み、特に、XがC4’に結合し、YがC2’に結合している式−X−Y−のものであり、
式中、
Xは酸素硫黄、−CRaRb−、−C(Ra)=C(Rb)−、−C(=CRaRb)−、−C(Ra)=N−、−Si(Ra)2−、−SO2−、−NRa−;−O−NRa−、−NRa−O−、−C(=J)−、Se、−O−NRa−、−NRa−CRaRb−、−N(Ra)−O−または−O−CRaRb−であり;
Yは酸素、硫黄、−(CRaRb)n−、−CRaRb−O−CRaRb−、−C(Ra)=C(Rb)−、−C(Ra)=N−、−Si(Ra)2−、−SO2−、−NRa−、−C(=J)−、Se、−O−NRa−、−NRa−CRaRb−、−N(Ra)−O−または−O−CRaRb−であるが;
ただし、−X−Y−は−O−O−、Si(Ra)2−Si(Ra)2−、−SO2−SO2−、−C(Ra)=C(Rb)−C(Ra)=C(Rb)、−C(Ra)=N−C(Ra)=N−、−C(Ra)=N−C(Ra)=C(Rb)、−C(Ra)=C(Rb)−C(Ra)=N−または−Se−Se−ではないことを条件とし;
Jは酸素、硫黄、=CH2または=N(Ra)であり;
RaおよびRbは独立に、水素、ハロゲンヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキルアルケニル置換アルケニルアルキニル置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシアルコキシアルキルアルケニルオキシカルボキシルアルコキシカルボニルアルキルカルボニルホルミルアリールヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノカルバモイルアルキルアミノカルボニルアミノアルキルアミノカルボニルアルキルアミノアルキルアミノカルボニルアルキルカルボニルアミノカルバミドアルカノイルオキシスルホニルアルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニルアリールオキシカルボニルアリールオキシアリールカルボニルヘテロアリールヘテロアリールオキシカルボニルヘテロアリールオキシヘテロアリールカルボニル、−OC(=Xa)Rc、−OC(=Xa)NRcRdおよび−NReC(=Xa)NRcRdから選択され;
あるいは、2つのジェミナルRaおよびRbは一緒になって、場合によって置換されているメチレンを形成し;
あるいは、2つのジェミナルRaおよびRbは、それらが結合している炭素原子と一緒になって、−X−Y−の炭素原子を1つだけ有するシクロアルキルまたはハロシクロアルキルを形成し;
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシおよび置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリール、およびヘテロアリールら独立に選択される1から3個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、およびメチレンであり;
Xaは酸素、硫黄または−NRcであり;
Rc、RdおよびReは独立に、水素およびアルキルから選択され;かつ、
nは1、2または3である。

0084

本発明のさらなる特定の実施態様では、Xは酸素、硫黄、−NRa−、−CRaRb−または−C(=CRaRb)−、特に酸素、硫黄、−NH−、−CH2−または−C(=CH2)−、とりわけ酸素である。

0085

本発明の別の特定の実施態様では、Yは−CRaRb−、−CRaRb−CRaRb−または−CRaRb−CRaRb−CRaRb−、特に−CH2−CHCH3−、−CHCH3−CH2−、−CH2−CH2−または−CH2−CH2−CH2−である。

0086

本発明の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−(CRaRb)n−、−S−CRaRb−、−N(Ra)CRaRb−、−CRaRb−CRaRb−、−O−CRaRb−O−CRaRb−、−CRaRb−O−CRaRb−、−C(=CRaRb)−CRaRb−、−N(Ra)CRaRb−、−O−N(Ra)−CRaRb−または−N(Ra)−O−CRaRb−である。

0087

本発明の特定の実施態様では、RaおよびRbは独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキルからなる群から選択される。

0088

本発明の別の実施態様では、RaおよびRbは独立に、水素、フルオロ、ヒドロキシル、メチルおよび−CH2−O−CH3、特に水素、フルオロ、メチルおよび−CH2−O−CH3からなる群から選択される。

0089

有利には、−X−Y−のRaおよびRbのうちの1つは、上で定義された通りであると同時に、他方は全て水素である。

0090

本発明のさらなる特定の実施態様では、Raは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。

0091

本発明の別の特定の実施態様では、Rbまたは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。

0092

本発明の特定の実施態様では、RaおよびRbの一方または両方は水素である。

0093

本発明の特定の実施態様では、RaおよびRbの一方のみが水素である。

0094

本発明のある特定の実施態様では、RaおよびRbの一方はメチルであり、他方は水素である。

0095

本発明の特定の実施態様では、RaおよびRbは両方が同時にメチルである。

0096

本発明の特定の実施態様では、−X−Y−は、−O−CH2−、−S−CH2−、−S−CH(CH3)−、−NH−CH2−、−O−CH2CH2−、−O−CH(CH2−O−CH3)−、−O−CH(CH2CH3)−、−O−CH(CH3)−、−O−CH2−O−CH2−、−O−CH2−O−CH2−、−CH2−O−CH2−、−C(=CH2)CH2−、−C(=CH2)CH(CH3)−、−N(OCH3)CH2−または−N(CH3)CH2−であり;
本発明の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CRaRb−であり、RaおよびRbは独立に、水素、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、および−CH2−O−CH3からなる群から選択される。

0097

特定の実施態様では、−X−Y−は、−O−CH2−または−O−CH(CH3)−、特に−O−CH2−である。

0098

2’−4’ブリッジは、式(A)および式(B)でそれぞれ例示されるように、リボース環の平面の下(ベータ−D−配置)または該環の平面の上(アルファ−L−配置)のいずれかに配置されていてもよい。

0099

本発明によるLNAヌクレオシドは、特に式(A)または(B)のものである。

上式中、
Wは酸素、硫黄、−N(Ra)−または−CRaRb−、特に酸素であり;
Bは核酸塩基または修飾核酸塩基であり;
Zは隣接するヌクレオシドまたは5’末端基へのヌクレオシド間結合であり;
Z*は隣接するヌクレオシドまたは3’末端基へのヌクレオシド間結合であり;
R1、R2、R3、R5およびR5*は独立に、水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アジド、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミルおよびアリールから選択され;
X、Y、RaおよびRbは上で定義した通りである。

0100

特定の実施態様では、−X−Y−の定義において、Raは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施態様では、−X−Y−の定義において、Rbは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。さらなる特定の実施態様では、−X−Y−の定義において、RaおよびRbの一方または両方は水素である。特定の実施態様では、−X−Y−の定義において、RaおよびRbの一方のみが水素である。ある特定の実施態様では、−X−Y−の定義において、RaおよびRbの一方がメチルであり、他方は水素である。特定の実施態様では、−X−Y−の定義において、RaおよびRbは両方が同時にメチルである。

0101

さらなる特定の実施態様では、Xの定義において、Raは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施態様では、Xの定義において、Rbは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。特定の実施態様では、Xの定義において、RaおよびRbの一方または両方は水素である。特定の実施態様では、Xの定義において、RaおよびRbの一方のみが水素である。ある特定の実施態様では、Xの定義において、RaおよびRbの一方がメチルであり、他方は水素である。特定の実施態様では、Xの定義において、RaおよびRbは両方が同時にメチルである。

0102

さらなる特定の実施態様では、Yの定義において、Raは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施態様では、Yの定義において、Rbは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。特定の実施態様では、Yの定義において、RaおよびRbの一方または両方は水素である。特定の実施態様では、Yの定義において、RaおよびRbの一方のみが水素である。ある特定の実施態様では、Yの定義において、RaおよびRbの一方がメチルであり、他方は水素である。特定の実施態様では、Yの定義において、RaおよびRbは両方が同時にメチルである。

0103

本発明の特定の実施態様では、R1、R2、R3、R5およびR5*は独立に、水素およびアルキル、特に水素およびメチルから選択される。

0104

本発明のさらなる特定の有利な実施態様では、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。

0105

本発明の別の特定の実施態様では、R1、R2、R3は全て同時に水素であり、R5およびR5*の一方が水素であり、他方は上で定義した通りであり、特にアルキル、とりわけメチルである。

0106

本発明の特定の実施態様では、R5およびR5*は独立に、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシアルキルおよびアジドから、特に水素、フルオロ、メチル、メトキシエチルおよびアジドから選択される。本発明の特に有利な実施態様では、R5およびR5*iの一方は水素であり、他方はアルキル、特にメチル、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルキル、特にメトキシエチルまたはアジドであり;あるいはR5およびR5*は両方が同時に水素またはハロゲンであり、特に両方が同時に水素またはフルオロである。このような特定の実施態様では、Wは有利には酸素であり、−X−Y−は有利には−O−CH2−である。

0107

本発明の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CH2−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。そのようなLNAヌクレオシドは、国際公開第99/014226号、国際公開第00/66604号、国際公開第98/039352号および国際公開第2004/046160号(これは全て参照により本明細書に援用される)に開示されており、ベータ−D−オキシLNAおよびアルファ−L−オキシLNAヌクレオシドとして当技術分野で一般に知られているものを含む。

0108

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−S−CH2−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。そのようなチオLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第99/014226号および国際公開第2004/046160号に開示されている。

0109

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−NH−CH2−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。そのようなアミノLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第99/014226号および国際公開第2004/046160号に開示されている。

0110

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CH2CH2−または−OCH2CH2CH2−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。そのようなLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第00/047599号およびMorita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76に開示されており、2’−O−4’C−エチレン架橋核酸(ENA)として当技術分野で一般に知られているものを含む。

0111

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CH2−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3は全て同時に水素であり、R5およびR5*の一方が水素であり、他方は水素ではなく、例えばアルキル、例えばメチルである。そのような5’置換LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第2007/1341号に開示されている。

0112

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CRaRb−であり、ここでRaおよびRbの一方または両方は水素ではなく、特にメチルなどのアルキルであり、Wは酸素であり、R1、R2、R3は全て同時に水素であり、R5およびR5*の一方が水素であり、他方は水素ではなく、特にアルキル、例えはメチルである。そのようなビス修飾LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第2010/077578号に開示されている。

0113

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CHRa−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。そのような6’−置換LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第2010/036698号および国際公開第2007/09007号に開示されている。そのような6’−置換LNAヌクレオシドにおいて、Raは特にC1−C6アルキル、例えばメチルである。

0114

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CH(CH2−O−CH3)− (「2’ O−メトキシエチル二環式核酸」、Seth et al., J. Org. Chem. 2010, 第75(5)巻、1569-81頁)である。

0115

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CH(CH2CH3)−(「2’O−エチル二環式核酸」、Seth et al., J. Org. Chem. 2010, 第75(5)巻、1569-81頁)である。

0116

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CH(CH2−O−CH3)−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。そのようなLNAヌクレオシドは、当技術分野で環状MOEs(cMOE)としても知られており、国際公開第2007/090071号に開示されている。

0117

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CH(CH3)−である。

0118

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CH2−O−CH2− (Seth et al.,前掲書、J. Org. Chem 2010)である。
本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CH(CH3)−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。そのような6’−メチルLNAヌクレオシドは、当技術分野でcETヌクレオシドとしても知られており、参照により本明細書に援用される国際公開第2007/090071号(ベータ−D)および国際公開第2010/036698号(アルファ−L)に開示されているように、(S)−cETまたは(R)−cETジアステレオ異性体のいずれでもよい。

0119

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CRaRb−であり、ここでRaもRbも水素ではなく、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。特定の実施態様では、RaおよびRbは両方が同時にアルキルであり、特に両方が同時にメチルである。そのような6’置換LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第2009/006478号に開示されている。

0120

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−S−CHRa−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。そのような6’−置換チオLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第2011/156202号に開示されている。そのような6’−置換チオLNAの特定の実施態様では、Raはアルキル、特にメチルである。

0121

本発明の別の特定の実施態様では、−X−Y−は−C(=CH2)C(RaRb)−、−C(=CHF)C(RaRb)−または−C(=CF2)C(RaRb)−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。有利には、RaおよびRbは独立に、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから選択される。特に、RaおよびRbは両方が同時に水素もしくはメチルであるか、またはRaおよびRbの一方が水素であり、他方がメチルである。そのようなビニルカルボLNAヌクレオシドは、いずれも参照により本明細書に援用される国際公開第2008/154401号および国際公開第2009/067647号に開示されている。

0122

本発明の特定の実施態様では、−X−Y−は−N(ORa)−CH2−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。特定の実施態様では、Raはメチルなどのアルキルである。そのようなLNAヌクレオシドはN置換LNAとしても知られており、参照により本明細書に援用される国際公開第2008/150729号に開示されている。

0123

本発明の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−N(Ra)−、−N(Ra)−O−、−NRa−CRaRb−CRaRb−または−NRa−CRaRb−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。有利には、RaおよびRbは独立に、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから選択される。特定の実施態様では、Raはメチルなどのアルキルであり、Rbは水素またはメチル、特に水素である(Seth et al.,前掲書、J. Org. Chem 2010)。

0124

本発明の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−N(CH3)−である(Seth et al.,前掲書、J. Org. Chem 2010)。

0125

本発明の特定の実施態様では、R5およびR5*は両方が同時に水素である。本発明の別の特定の実施態様では、R5およびR5*の一方は水素であり、他方はアルキル、例えばメチルである。そのような実施態様では、R1、R2およびR3は特に水素であり、−X−Y−は特に−O−CH2−または−O−CHC(Ra)3−、例えば−O−CH(CH3)−である。

0126

本発明の特定の実施態様では、−X−Y−は−CRaRb−O−CRaRb−、例えば−CH2−O−CH2−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。そのような特定の実施態様では、Raは特にメチルなどのアルキルであり、Rbは水素またはメチル、特に水素である。そのようなLNAヌクレオシドはまた、立体配座的に制限されたヌクレオチド(CRN)としても知られており、参照により本明細書に援用される国際公開第2013/036868号に開示されている。

0127

本発明の特定の実施態様では、−X−Y−は−O−CRaRb−O−CRaRb−、例えば−O−CH2−O−CH2−であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は全て同時に水素である。有利には、RaおよびRbは独立に、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから選択される。そのような特定の実施態様では、Raは特にメチルなどのアルキルであり、Rbは水素またはメチル、特に水素である。そのようなLNAヌクレオシドはCOCヌクレオチドとしても知られており、参照により本明細書に援用されるMitsuoka et al., Nucleic AcidsResearch 2009, 37(4), 1225-1238に開示されている。

0128

特に明記しない限り、LNAヌクレオシドはベータ−Dまたはアルファ−L立体異性体であってもよいことが認識されよう。

0129

本発明のLNAヌクレオシドの特定の例は、スキーム1に示されている(ここでBは、上で定義した通りである)。

0130

0131

特定のLNAヌクレオシドは、ベータ−D−オキシ−LNA、6’−メチル−ベータ−D−オキシLNA、例えば(S)−6’−メチル−ベータ−D−オキシ−LNA(ScET)およびENAである。

0132

本発明の出発物質または化合物の1つが1つまたは複数の反応工程の反応条件下で不安定または反応性である1つまたは複数の官能基を含む場合、適切な保護基(例えば、T. W. GreeneおよびP. G. M. Wutsによる「Protective Groups in Organic Chemistry」第3版, 1999, Wiley, New Yorkに記載されているもの)を、当技術分野で既知の方法を適用する重要な工程の前に導入することができる。このような保護基は、合成の後の段階で、前記文献に記載されている標準的な方法を用いて除去することができる。保護基の例は、tert−ブトキシカルボニル(Boc)、9−フルオレニルメチルカルバメート(Fmoc)、2−トリメチルシリルエチルカルバメート(Teoc)、カルボベンジルオキシCbz)およびp−メトキシベンジルオキシカルボニル(Moz)である。

0133

本明細書に記載の化合物は、いくつかの不斉中心を含むことができ、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ化合物、ジアステレオ異性体の混合物ジアステレオマラセミ化合物、またはジアステレオマラセミ化合物の混合物などのエナンチオマーの混合物の形態で存在し得る。

0134

不斉炭素原子」という用語は、4つの異なる置換基を有する炭素原子を意味する。カーンインルド・プレローグ則によると、不斉炭素原子は「R」または「S」配置にすることができる。

0135

化学基の定義
本明細書において、用語「アルキル」は、単独でまたは組み合わせて、1から8個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、特に1から6個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、とりわけ1から4個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖および分岐鎖C1−C8アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピルイソプロピルブチルイソブチル、tert−ブチル、ペンチ異性体、ヘキシル異性体、ヘプチル異性体およびオクチル異性体、特にメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびペンチルである。アルキルの特定の例は、メチル、エチルおよびプロピルである。

0136

「シクロアルキル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、3から8個の炭素原子を有するシクロアルキル環、特に3から6個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチルシクロヘキシルシクロヘプチルおよびシクロオクチル、特にシクロプロピルおよびシクロブチルである。シクロアルキルの特定の例はシクロプロピルである。

0137

「アルコキシ」という用語は、単独または組み合わせて、式アルキル−O−の基を意味し、ここで「アルキル」という用語は、メトキシエトキシ、n−プロポキシイソプロポキシ、n−ブトキシイソブトキシ、sec.ブトキシおよびtert.ブトキシなどの以前に与えられた意味を有する。特定の「アルコキシ」は、メトキシおよびエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の特定の例である。

0138

オキシという用語は、単独でまたは組み合せて、−O−基を意味する。

0139

用語「アルケニル」は、単独でまたは組み合わせて、オレフィン結合と8個まで、好ましくは6個まで、特に好ましくは4個までの炭素原子とを含む直鎖または分岐炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、1−プロペニル、2−プロペニル、イソプロペニル、1−ブテニル、2−ブテニル、3−ブテニルおよびイソブテニルである。

0140

用語「アルキニル」は、単独でまたは組み合わせて、三重結合と8個まで、好ましくは6個まで、特に好ましくは4個までの炭素原子とを含む直鎖または分岐炭化水素残基を意味する。

0141

「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、フッ素塩素臭素またはヨウ素、特にフッ素、塩素または臭素、とりわけフッ素を意味する。用語「ハロ」は、別の基と組み合わせて、少なくとも1つのハロゲンによる前記基の置換、特に1から5個のハロゲン、特に1から4個のハロゲン、すなわち1、2、3または4個のハロゲンで置換されたものを表す。

0142

「ハロアルキル」という用語は、単独または組み合わせて、少なくとも1つのハロゲンで置換された、特に1から5個のハロゲン、特に1から3個のハロゲンで置換されたアルキル基を示す。ハロアルキルの例は、モノフルオロ−、ジフルオロ−またはトリフルオロメチル、−エチルまたは−プロピル、例えば3,3,3−トリフルオロプロピル、2−フルオロエチル、2,2,2−トリフルオロエチルフルオロメチルまたはトリフルオロメチルを含む。フルオロメチル、ジフルオロメチルおよびトリフルオロメチルは特定の「ハロアルキル」である。

0143

「ハロシクロアルキル」という用語は、単独または組み合わせて、少なくとも1つのハロゲンで置換された、特に1から5個のハロゲン、特に1から3個のハロゲンで置換された上で定義したシクロアルキル基を表す。「ハロシクロアルキル」の特定の例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピルおよびトリフルオロシクロプロピルである。

0144

「ヒドロキシル」および「ヒドロキシ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−OH基を意味する。

0145

「チオヒドロキシル」および「チオヒドロキシ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−SH基を意味する。

0146

カルボニルという用語は、単独でまたは組み合せて、−C(O)−基を意味する。

0147

カルボキシ」または「カルボキシル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−COOH基を意味する。

0148

「アミノ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、第一級アミノ基(−NH2)、第二級アミノ基(−NH−)または第三級アミノ基(−N−)を意味する。

0149

「アルキルアミノ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、上で定義した1つまたは2つのアルキル基で置換された、上で定義したアミノ基を意味する。

0150

「スルホニル」という用語は、単独または組み合わせて、−SO2基を意味する。

0151

スルフィニル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−SO−基を意味する。

0152

スルファニル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−S−基を意味する。

0153

「シアノ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−CN基を意味する。

0154

「アジド」という用語は、単独または組み合わせて、−N3基を意味する。

0155

「ニトロ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、NO2基を意味する。

0156

「ホルミル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−C(O)H基を意味する。

0157

「カルバモイル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−C(O)NH2基を意味する。

0158

カバミド」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−NH−C(O)−NH2基を意味する。

0159

用語「アリール」は、単独または組み合わせて、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立に選択される1から3個の置換基で場合によって置換されている、6から10個の炭素環原子を含む一価芳香族炭素環式単環または二環系を表す。アリールの例には、フェニルおよびナフチル、特にフェニルが含まれる。

0160

用語「ヘテロアリール」は、単独でまたは組み合わせて、N、OおよびSから選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素であり、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立に選択される1から3個の置換基で場合によって置換されている、5から12個の環原子からなる一価の芳香族複素環式単環または二環系を表す。ヘテロアリールの例は、ピロリル、フラニルチエニルイミダゾリルオキサゾリルチアゾリルトリアゾリルオキサジアゾリルチアジアゾリル、テトラゾリルピリジニルピラジニルピラゾリルピリダジニルピリミジニルトリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリルベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンズイミダゾリルベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニルイソキノリニルキナゾリニルキノキサリニルカルバゾリルまたはアクリジニルを含む。

0161

用語「ヘテロシクリル」は、単独でまたは組み合わせて、N、OおよびSから選択される1、2、3または4個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素であり、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立に選択される1から3個の置換基で場合によって置換されている、4から12個、特に4から9個の環原子からなる一価の飽和もしくは部分不飽和単環または二環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルの例は、アゼチジニルピロリジニルテトラヒドロフラニル、テトラヒドロ−チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニルテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニルモルホリニル、チオモルホリニル、1,1−ジオキソチオモルホリン−4−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル又はオキサゼパニルである。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、8−アザ−ビシクロ[3.2.1]オクチル、キヌクリジニル、8−オキサ−3−アザ−ビシクロ[3.2.1]オクチル、9−アザ−ビシクロ[3.3.1]ノニル、3−オキサ−9−アザ−ビシクロ[3.3.1]ノニルまたは3−チア−9−アザ−ビシクロ[3.3.1]ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ−オキサゾリル、テトラヒドロ−ピリジニルまたはジヒドロピラニルである。

0162

薬学的に許容される塩
用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的有効性と、遊離塩基または遊離酸の特性とを保持する塩であって、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではないものを指す。塩は、塩酸臭化水素酸硫酸硝酸リン酸等の無機酸、特に塩酸、および酢酸プロピオン酸グリコール酸ピルビン酸シュウ酸マレイン酸マロン酸コハク酸フマル酸酒石酸クエン酸安息香酸桂皮酸マンデル酸メタンスルホン酸エタンスルホン酸p−トルエンスルホン酸サリチル酸、N−アセチルシステイン等の有機酸により形成される。さらに、これらの塩は、遊離酸に無機塩基または有機塩基を添加することから調製され得る。無機塩基から誘導される塩は、ナトリウム塩カリウム塩リチウム塩アンモニウム塩カルシウム塩マグネシウム塩を含むが、これらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、限定されないが、一級二級および三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミントリメチルアミンジエチルアミントリエチルアミントリプロピルアミンエタノールアミンリジンアルギニンN−エチルピペリジンピペリジンポリアミン樹脂の塩が含まれる。式(I)の化合物は、両性イオンの形態で存在することもできる。式(I)の化合物の特に好ましい薬学的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸およびメタンスルホン酸の塩である。

0163

保護基
用語「保護基」は、単独または組み合わせて、別の非保護反応部位において選択的に化学反応を実施できるように、多官能化合物反応部位を選択的にブロックする基を意味する。保護基は除去することができる。例示的保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基又はヒドロキシ保護基である。

0164

ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的ヌクレオチド配列と二本鎖を形成するときに、相補的ヌクレオチド配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。

0165

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解を介して機能することができ、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはRNaseHなどのエンドリボヌクレアーゼ(RNase)を動員することができる。ヌクレアーゼ媒介機構を介して機能するオリゴヌクレオチド設計の例は、典型的には少なくとも5または6のDNAヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマーおよびテイルマーによって片側または両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。

0166

RNaseH活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNase Hは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的RNA分子との二本鎖にあるときにRNase Hを動員するその能力を指す。国際公開第01/23613号は、RNaseH活性を決定するためのin vitroの方法を提供し、この方法はRNaseHを動員する能力を決定するために使用することができる。通常、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列を有するときに、試験される修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するDNAモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、かつ、国際公開第01/23613号(参照により本明細書に援用される)の実施例91−95によって提供される方法を用いたときに決定された初期速度の少なくとも5%、例えば少なくとも10%または20%以上の、pmol/l/minで測定される初期測度を有する場合、RNase Hを動員する能力を有するとみなされる。RNase(RHase)H活性の測定に使用するために、組換えヒトRNase H1がスイスのルツェルンのLubio Science GmbHから入手可能である。

0167

ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列はギャップマーであり得る。アンチセンスギャップマーは、RNaseH媒介分解を介して標的核酸を阻害するために一般的に使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、‘5−>3’方向で、5’フランクギャップ、および3’フランクの少なくとも3つの異なる構造領域、F−G−Fを含む。「ギャップ」領域(G)は、オリゴヌクレオチドがRNase Hを動員することを可能にする連続するDNAヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域の隣には、1または複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む5’フランキング領域(F)と、1または複数の糖修飾ヌクレオシドド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む3’フランキング領域(F’)とがある。領域FおよびF’における1または複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する(すなわち、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである)。いくつかの実施態様では、領域FおよびF’における1または複数の糖修飾ヌクレオシドは、例えばLNAおよび2’−MOEから独立に選択される高親和性2’糖修飾などの2’糖修飾ヌクレオシドである。

0168

ギャップマー設計において、ギャップ領域の5’および3’末端のヌクレオシドはDNAヌクレオシドであり、それぞれ5’(F)または3’(F’)領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置される。これらのフランクは、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち5’フランクの5’末端および3’フランクの3’末端に、少なくとも1の糖修飾ヌクレオシドを有することでさらに定義することができる。

0169

領域F−G−F’は連続するヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、式F−G−F’のギャップマー領域を含んでもよい。

0170

ギャップマー設計−G−F’の全長は、例えば、13から24、14から22ヌクレオシド、1から17、16から18ヌクレオシド等の12から32ヌクレオシドであり得る。

0171

例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式:
F1−8−G5−16−F’1−8、例えば
F1−8−G7−16−F’2−8
によって表すことができるが、但し、ギャップマー領域F−G−F’の全長は少なくとも12、例えば少なくとも14ヌクレオチド長であることを条件とする。

0172

領域F、GおよびF’は以下でさらに定義され、F−G−F’式に組み込むことができる。

0173

ギャップマー−領域G
ギャップマーの領域G(ギャップ領域)は、オリゴヌクレオチドがヒトRNaseH1などのRNaseH(通常はDNAヌクレオシド)を動員できるようにするヌクレオシドの領域である。RNaseHは、DNAとRNAの間の二本鎖を認識し、RNA分子を酵素的に切断する細胞酵素である。適切には、ギャップマーは、少なくとも5または6の連続するDNAヌクレオシド、例えば5−16の連続するDNAヌクレオシド、例えば6−15の連続するDNAヌクレオシド、例えば7−14の連続するDNAヌクレオシド、例えば8−12の連続するDNAヌクレオチド、例えば8−12の連続するDNAヌクレオチド長のギャップ領域(G)を有し得る。ギャップ領域Gは、いくつかの実施態様では、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16の連続するDNAヌクレオシドから構成される。ギャップ領域内のシトシン(C)DNAはメチル化されている場合があり、そのような残基は5−メチル−シトシン(meC、またはcの代わりにeを有する)としてアノテーションが付けられる。ギャップでのシトシンDNAのメチル化は、潜在的な毒性を低減するためにCGジヌクレオチドがギャップに存在する場合に有利であり、修飾はオリゴヌクレオチドの最大効果に大きな影響を及ぼさない。

0174

いくつかの実施態様では、ギャップ領域Gは、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16の連続するホスホロチオエート結合DNAヌクレオシドから構成され得る。いくつかの実施態様では、ギャップ内の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

0175

従来のギャップマーはDNAギャップ領域を有する一方で、ギャップ領域内に使用されたときにRNaseHを動員することを可能にする修飾ヌクレオシドの複数の例が存在する。ギャップ領域内に含まれる場合にRNaseHを動員することが可能であると報告されている修飾ヌクレオシドには、例えばアルファ−L−LNA、C4’アルキル化DNA(いずれも参照により本明細書に援用されるPCT/EP第2009/050349号およびVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300に記載)、ANAおよび2’F−ANAのようなアラビノース由来のヌクレオシド(Mangos et al., 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA(アンロック核酸)(参照により本明細書に援用されるFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039に記載)が含まれる。UNAは、ロックされていない核酸で、典型的には、リボースのC2とC3の間の結合が除去された、アンロックされた「糖」残基を形成するアンロック核酸である。このようなギャップマーで使用される修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域に導入されたときに2’エンド(DNA様)構造、すなわちRNaseH動員を可能にする修飾を採用するヌクレオシドであってもよい。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のDNAギャップ領域(G)は、ギャップ領域に導入されたときに2’エンド(DNA様)構造を採用する1から3の糖修飾ヌクレオシドを場合によって含んでもよい。

0176

領域G−「ギャップブレーカー
代替的には、RNaseH活性をある程度保持しつつ、3’エンド立体配座を付与する修飾ヌクレオシドをギャップマーのギャップ領域に挿入した報告が複数ある。このような、1または複数の3’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップ破壊型」ギャップマーと呼ばれており、例えば国際公開第2013/022984号を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、RNaseH動員を可能にするために、ギャップ領域内にDNAヌクレオシドの十分な領域を保持する。RNaseHを動員するためのギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計の能力は、配列特異的、または化合物特異的でさえある(いくつかの例では標的RNAのより特異的な切断を提供するRNaseHを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している、Rukov et al., 2015 Nucl. AcidsRes. 第43巻、8476-8487頁を参照)。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、2’−O−メチル(OMe)もしくは2’−O−MOE(MOE)ヌクレオシドなどの3’エンド立体配座を付与する修飾ヌクレオシド、またはベータ−D LNAヌクレオシド(ヌクレオシドのリボース糖環のC2’とC4’の間のブリッジがベータ立体配座にある)、例えばベータ−D−オキシLNAまたはScETヌクレオシドであってもよい。

0177

上記の領域Gを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカーまたはギャップ破壊型ギャップマーのギャップ領域は、ギャップの5’末端(領域Fの3’ヌクレオシドに隣接)にDNAヌクレオシドと、ギャップの3’末端(領域F’の5’ヌクレオシドに隣接)にDNAヌクレオシドとを有している。破壊されたギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の5’末端または3’末端のいずれかに少なくとも3または4の連続するDNAヌクレオシドの領域を保持する。

0178

ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的な設計には、
F1−8−[D3−4−E1− D3−4]−F’1−8
F1−8− [D1−4−E1− D3−4]−F’1−8
F1−8− [D3−4−E1− D1−4]−F’1−8
が含まれ、上式中、領域Gは括弧[Dn−Er−Dm]内にあり、DはDNAヌクレオシドの連続する配列であり、Eは修飾ヌクレオシド(ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド)であり、FとF’は本明細書で定義されているフランキング領域であるが、但しギャップマー領域F−G−F’の全長は少なくとも12、例えば少なくとも14ヌクレオチド長であることを条件とする。

0179

いくつかの実施態様では、ギャップ破壊型ギャップマーの領域Gは、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16のDNAヌクレオシドなど、少なくとも6のDNAヌクレオシドを含む。上記のように、ギャップ領域GがRNaseH動員を媒介することができるという条件で、DNAヌクレオシドは連続していてもよいし、または場合によって1もしくは複数の修飾ヌクレオシドが散在していてもよい。

0180

ギャップマー−フランキング領域、FおよびF’
領域Fは、領域Gの5’DNAヌクレオシドのすぐ近くに隣接して配置される。領域Fの3’末端のヌクレオシドは、高親和性糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシド、例えばMOEヌクレオシドまたはLNAヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシドである。

0181

領域Fは、領域Gの3’DNAヌクレオシドのすぐ近くに隣接して配置される。領域Fの5’末端のヌクレオシドは、高親和性糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシド、例えばMOEヌクレオシドまたはLNAヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシドである。

0182

領域Fは、1−8の連続するヌクレオチド長、例えば2−6、例えば3−4の連続するヌクレオチド長である。有利には、領域Fの5’末端のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Fの5’末端の2つのヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Fの5’末端のヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Fの5’末端の2つのヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Fの5’末端の2つのヌクレオシドは、2つの3’MOEヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Fの5’末端のヌクレオシドは、MOEヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシドである。

0183

領域F’は、2−8の連続するヌクレオチド長、例えば3−6、例えば4−5の連続するヌクレオチド長である。有利には、実施態様では、領域F’の3’末端のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域F’の3’末端の2つのヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域F’の3’末端の2つのヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域F’の3’末端のヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域F’の3’末端から2つのヌクレオシドは、2つの3’MOEヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域F’の3’末端のヌクレオシドは、MOEヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシドである。

0184

領域FまたはF’の長さが1である場合、それは有利にはLNAヌクレオシドであることに留意されたい。

0185

‘’
いくつかの実施態様では、領域FおよびF’は独立に、糖修飾ヌクレオシドの連続する配列からなるか、またはそれを含む。いくつかの実施態様では、領域Fの糖修飾ヌクレオシドは、2’−O−アルキル−RNAユニット、2’−O−メチル−RNA、2’−アミノ−DNAユニット、2’−フルオロ−DNAユニット、2’−アルコキシ−RNA、MOEユニット、LNAユニットアラビノ核酸(ANA)ユニット、および2’−フルオロ−ANAユニットから独立に選択されてもよい。

0186

いくつかの実施態様では、領域FおよびF’は独立に、LNAと2’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む(混合ウィング設計)。

0187

いくつかの実施態様では、領域FおよびF’は、MOEのみ、またはベータ−D−オキシLNAのみ、またはScETのみなど、糖修飾ヌクレオシドの1つのタイプのみからなる。このような設計は、均一フランクまたは均一ギャップマー設計とも呼ばれる。

0188

いくつかの実施態様では、領域FもしくはF’、またはFおよびF’の全てのヌクレオシドは、ベータ−D−オキシLNA、ENAまたはScETヌクレオシドから独立に選択されるようなLNAヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Fは、1−5、例えば2−4、例えば3−4、例えば1、2、3、4または5の連続するLNAヌクレオシドからなる。いくつかの実施態様では、領域FおよびF’の全てのヌクレオシドは、ベータ−D−オキシLNAヌクレオシドである。

0189

いくつかの実施態様では、領域FもしくはF’、またはFおよびF’の全てのヌクレオシドは、OMeまたはMOEヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Fは1、2、3、4、5、6、7または8の連続するOMeまたはMOEヌクレオシドからなる。いくつかの実施態様では、フランキング領域の1つのみが、OMeまたはMOEヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシドからなることができる。いくつかの実施態様では、それは、OMeまたはMOEヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシドからなる5’(F)フランキング領域であり、一方、3’(F’)フランキング領域は、ベータ−D−オキシLNAヌクレオシドまたはcETヌクレオシドなどの少なくとも1のLNAヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様では、それは、OMeまたはMOEヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシドからなる3’(F’)フランキング領域であり、一方、5’(F)フランキング領域は、ベータ−D−オキシLNAヌクレオシドまたはcETヌクレオシドなどの少なくとも1のLNAヌクレオシドを含む。

0190

いくつかの実施態様では、領域FおよびF’の全ての修飾ヌクレオシドは、ベータ−D−オキシLNA、ENAまたはScETヌクレオシドから独立に選択されるようなLNAヌクレオシドであり、ここで、領域FもしくはF’、またはFおよびF’は、場合によってDNAヌクレオシドを含んでいてもよい(交互フランク;詳細についてはこれらの定義を参照のこと)。いくつかの実施態様では、領域FおよびF’の全ての修飾ヌクレオシドは、ベータ−D−オキシLNAヌクレオシドであり、ここで、領域FもしくはF’、またはFおよびF’は、DNAヌクレオシドを場合によって含んでいてもよい(交互フランク;詳細についてはこれらの定義を参照のこと)。

0191

いくつかの実施態様では、領域FおよびF’の5’末端および3’末端ヌクレオシドは、ベータ−D−オキシLNAヌクレオシドまたはScETヌクレオシドなどのLNAヌクレオシドである。

0192

いくつかの実施態様では、領域Fと領域Gの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、領域F’と領域Gの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、領域FまたはF’、FおよびF’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

0193

さらなるギャップマー設計は、参照により本明細書に援用される国際公開第2004/046160号、同第2007/146511号および同第2008/113832号に開示されている。

0194

LNAギャップマー
LNAギャップマーは、領域FおよびF’のいずれかまたは両方がLNAヌクレオシドを含むか、またはそれらからなるギャップマーである。ベータ−D−オキシギャップマーは、領域FおよびF’のいずれかまたは両方がベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを含むか、またはそれらからなるギャップマーである。

0195

いくつかの実施態様では、LNAギャップマーは、式:[LNA]1−5−[領域G]−[LNA]1−5のものであり、式中、領域Gはギャップマー領域Gの定義で定義される通りである。

0196

MOEギャップマー
MOEギャップマーは、領域FおよびF’がMOEヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施態様では、MOEギャップマーは、例えば[MOE]2−7−[領域G]5−16−[MOE]2−7、例えば[MOE]3−6−[領域G]−[MOE]3−6のような設計[MOE]1−8−[領域G]−[MOE]1−8のものであり、領域Gは、ギャップマーの定義で定義されている。5−10−5設計(MOE−DNA−MOE)のMOEギャップマーは、当技術分野で広く使用されてきた。

0197

混合ウィングギャップマー
混合ウィングギャップマーはLNAギャップマーであり、領域FおよびF’の一方または両方が、2’−O−アルキル−RNAユニット、2’−O−メチル−RNA、2’−アミノ−DNAユニット、2’−フルオロ−DNAユニット、2’−アルコキシ−RNA、MOEユニット、アラビノ核酸(ANA)ユニットおよび2’−フルオロ−ANAユニットからなる群から独立に選択される2’置換ヌクレオシドなどの2’置換ヌクレオシド、例えばMOEヌクレオシドを含む。領域FおよびF’の少なくとも一方、または領域FおよびF’の両方が少なくとも1のLNAヌクレオシドを含むいくつかの実施態様では、領域FおよびF’の残りのヌクレオシドは、MOEおよびLNAからなる群から独立に選択される。領域FおよびF’の少なくとも一方、または領域FおよびF’の両方が少なくとも2のLNAヌクレオシドを含むいくつかの実施態様では、領域FおよびF’の残りのヌクレオシドは、MOEおよびLNAからなる群から独立に選択される。いくつかの混合ウィングの実施態様では、領域FおよびF’の一方または両方は、1または複数のDNAヌクレオシドをさらに含んでもよい。

0198

混合ウィングギャップマー設計は、いずれも参照により本明細書に援用される国際公開第2008/049085号および同第2012/109395号に開示されている。

0199

交互フランクギャップマー
フランキング領域は、LNAおよびDNAヌクレオシドの両方を含む場合があり、LNA−DNA−LNAヌクレオシドの交互のモチーフを含むため、「交互フランク」と呼ばれる。そのような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と呼ばれる。したがって、「交互(alternative)フランクギャップマー」は、フランクの少なくとも一方(FまたはF’)がLNAヌクレオシドに加えてDNAを含むLNAギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、領域FもしくはF’の少なくとも一方、または領域FおよびF’の両方が、LNAヌクレオシドとDNAヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランキング領域FもしくはF’、またはFおよびF’の両方が少なくとも3のヌクレオシドを含み、Fおよび/またはF’領域の5’および3’末端ヌクレオシドはLNAヌクレオシドである。

0200

交互フランクLNAギャップマーは、国際公開第2016/127002号に開示されている。

0201

交互フランクを持つオリゴヌクレオチドは、フランクの少なくとも一方(FまたはF’)がLNAヌクレオシドに加えてDNAを含むLNAギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、領域FもしくはF’の少なくとも一方、または領域FおよびF’の両方が、LNAヌクレオシドとDNAヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランキング領域FもしくはF’、またはFおよびF’の両方が少なくとも3のヌクレオシドを含み、Fおよび/またはF’領域の5’および3’末端ヌクレオシドはLNAヌクレオシドである。

0202

いくつかの実施態様では、領域FもしくはF’の少なくとも一方、または領域FおよびF’の両方が、LNAヌクレオシドとDNAヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランキング領域FもしくはF’、またはFおよびF’の両方は、少なくとも3のヌクレオシドを含み、FまたはF’領域の5’および3’末端のヌクレオシドはLNAヌクレオシドであり、LNAおよびDNAヌクレオシドの両方含むフランキング領域は、LNA−DNA−LNAヌクレオシドの交互モチーフを含むため、交互フランクと呼ばれる。交互フランクLNAギャップマーは、国際公開第2016/127002号に開示されている。

0203

交互フランク領域は、3までの連続するDNAヌクレオシド、例えば1から2、または1もしくは2もしくは3の連続するDNAヌクレオシドを含み得る。

0204

交互フランクは、LNAヌクレオシド(L)の数に続いてDNAヌクレオシド(D)の数を表す一連整数としてアノテーションを付けることができ、例えば
[L]1−3−[D]1−4−[L]1−3
[L]1−2−[D]1−2−[L]1−2−[D]1−2−[L]1−2

0205

オリゴヌクレオチド設計では、これらは通常、2−2−1が5’[L]2−[D]2−[L]3’を表し、1−1−1−1−1が5’[L]−[D]−[L]−[D]−[L]3’を表すように、数字で表される。交互のフランクを有するオリゴヌクレオチドにおけるフランク(領域FおよびF’)の長さは、独立に、3−10ヌクレオシド、例えば4−8、例えば5−6ヌクレオシド、例えば4、5、6または7修飾ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施態様では、ギャップマーオリゴヌクレオチドのフランクの一方のみが交互であり、他方のフランクはLNAヌクレオチドで構成されている。追加のエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、3’フランク(F’)の3’末端に少なくとも2のLNAヌクレオシドを有することが有利なこともある。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのいくつかの例には以下のものがある:
[L]1−5−[D]1−4−[L]1−3−[G]5−16−[L]2−6
[L]1−2−[D]1−2−[L]1−2−[D]1−2−[L]1−2−[G]5−16−[L]1−2−[D]1−3−[L]2−4
[L]1−5−[G]5−16−[L]−[D]−[L]−[D]−[L]2
但し、ギャップマーの全長が少なくとも12、例えば少なくとも14ヌクレオチド長であることを条件とする。

0206

オリゴヌクレオチドにおける領域D’またはD’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施態様では、ギャップマーF−G−F’、さらに5’および/または3’ヌクレオシドなどの、標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。さらなる5’および/または3’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもなくてもよい。そのようなさらなる5’および/または3’ヌクレオシドは、本明細書において領域D’およびD’’と呼ばれ得る。

0207

領域D’またはD’’の追加は、ギャップマーなどの連続するヌクレオチド配列をコンジュゲート部分または別の官能基に結合する目的で使用することができる。連続するヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と結合するために使用される場合、生体切断可能(biocleavable)リンカーとして機能し得る。あるいは、それは、エキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用され得る。

0208

領域D’とD’’は、領域Fの5’末端または領域F’の3’末端にそれぞれ接続して、次の式D’−F−G−F’、F−G−F’−D’’またはD’−F−G−F’−D’’の設計を生成できる。この例では、F−G−F’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域D’またはD’’はオリゴヌクレオチドの別の部分を構成する。

0209

領域D’またはD’’は独立に、標的核酸に対して相補的または非相補的であり得る、1、2、3、4または5の追加のヌクレオチドを含み得るかまたはそれらからなり得る。FまたはF’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチド、例えばDNAもしくはRNA、またはこれらの塩基修飾型ではない。D’またはD’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能リンカーとして機能し得る(リンカーの定義を参照)。いくつかの実施態様では、追加の5’および/または3’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結されており、DNAまたはRNAである。領域D’またはD’’としての使用に適したヌクレオチドベースの生体切断可能リンカーは、国際公開第2014/076195号に開示されており、これには、例として、ホスホジエステル結合DNAジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能リンカーの使用は、国際公開第2015/113922号に開示されており、単一のオリゴヌクレオチド内の複数のアンチセンス構築物(例:ギャップマー領域)を結合するために使用される。

0210

一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続するヌクレオチド配列に加えて、領域D’および/またはD’’を含む。

0211

いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる。
F−G−F’;特にF1−8−G5−16−F’2−8
D’−F−G−F’、特にD’1−3−F1−8−G5−16−F’2−8
F−G−F’−D’’、特にF1−8−G5−16−F’2−8−D’’1−3
D’−F−G−F’−D’’、特にD’1−3−F1−8−G5−16−F’2−8−D’’1−3

0212

いくつかの実施態様では、領域D’と領域Fの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施態様では、領域F’と領域D’’の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

0213

コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分または領域Cまたは第3の領域)に共有結合されたオリゴヌクレオチドを指す。

0214

本発明のオリゴヌクレオチドの1つ以上の非ヌクレオチド部分へのコンジュゲーションは、例えばオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布細胞取り込みまたは安定性に影響を与えることによって、オリゴヌクレオチドの薬理を改善し得る。いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄透過性および/または細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改変または増強する。特に、該コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官組織または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、該コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えばオフターゲット活性または非標的細胞型、組織または器官における活性を低下させるのに役立ち得る。参照により本明細書に援用される国際公開第93/07883号および国際公開第2013/033230は、適切なコンジュゲート部分を提供する。さらに適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPr)に結合することが可能なものである。特に、三価のN−アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ASGPrrへの結合に適している。例えば、国際公開第2014/076196号、国際公開第2014/207232号および国際公開第2014/179620号(参照により本明細書に援用される。特に国際公開第2014/076196号の図13、または国際公開第2014/179620号の請求項158−164)。

0215

オリゴヌクレオチドコンジュゲートとその合成は、Manoharanによる包括的なレビュー、Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001およびManoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103(それぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される)でも報告されている。

0216

ある実施態様では、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分)は、炭水化物細胞表面受容体リガンド薬物物質ホルモン親油性物質ポリマー、タンパク質、ペプチド毒素(例えば細菌毒素)、ビタミンウイルスタンパク質(例えばカプシド)、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

0217

リンカー
結合またはリンカーは、1つまたは複数の共有結合を介して目的の化学基またはセグメントを別の化学基またはセグメントに連結する、2つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドに直接または連結部分(例えばリンカーまたはテザー)を介して結合させることができる。リンカーは、第3の領域(領域C)、例えばコンジュゲート部分を第1の領域、例えば標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列(領域A)に共有結合させる役割を果たし、これにより、領域Aの一方の末端をCに接続している。

0218

本発明のいくつかの実施態様において、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列(領域Aまたは第1の領域)の間に位置するリンカー領域(第2の領域または領域Bおよび/もしくは領域Y)とコンジュゲート部分(領域Cまたは第3の領域)を場合によって含んでいてもよい。

0219

領域Bは、哺乳類の体内で通常遭遇する条件またはそれに類似する条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むかまたはそれからなる生体切断可能リンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換(例えば切断)を受ける条件には、例えば、哺乳動物細胞で見られるpH、温度、酸化もしくは還元条件または薬剤および塩濃度、またはそれらに類似するもの等の化学条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼ等の哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施態様では、生体切断可能リンカーは、S1ヌクレアーゼ切断されやすい。好ましい実施態様では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10のヌクレオシドなど、1から10の間のヌクレオシド、より好ましくは2から6の間のヌクレオシド、最も好ましくは2から4の間の、例えば少なくとも3または4または5の連続するホスホジエステル結合など、少なくとも2の連続するホスホジエステル結合を含む結合されたヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドは、DNAまたはRNAである。生体切断可能リンカーを含有するホスホジエステルは、国際公開第2014/076195号(参照により本明細書に援用され)により詳しく開示されている。

0220

コンジュゲートはまた、非生体切断可能リンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合されてもよく、またはいくつかの実施態様では、コンジュゲートは、生体切断可能リンカーに共有結合される非切断可能リンカー(領域Y)を含んでもよい。必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分(領域Cまたは第3の領域)をオリゴヌクレオチド(領域Aまたは第1の領域)に共有結合する役割を果たすリンカーは、エチレングリコールアミノ酸単位またはアミノアルキル基等の反復単位鎖状構造またはオリゴマーを含む場合がある。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、次の領域要素、A−C、A−B−C、A−B−Y−C、A−Y−B−CまたはA−Y−Cから構築することができる。いくつかの実施態様では、非切断可能リンカー(領域Y)は、例えばC6−C12アミノアルキル基を含む、C2−C36アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施態様では、該リンカー(領域Y)は、C6アミノアルキル基である。コンジュゲートリンカー基は、アミノ修飾オリゴヌクレオチドとコンジュゲート基上の活性化エステル基との使用を介して、オリゴヌクレオチドに常套的に結合され得る。

0221

治療
本明細書で使用される「治療」という用語は、既存の疾患(例えば、本明細書で言及される疾患または障害)の治療、または疾患の防止、すなわち予防の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施態様では、予防的であり得ることが認識されるであろう。

0222

本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、GSK3Bの発現をダウンレギュレートすることができるオリゴヌクレオチドに関する。該調節は、GSK3Bをコードするか、またはGSK3Bの制御に関与する標的核酸にハイブリダイズすることにより達成される。標的核酸は、配列番号1、2、3および4からなる群から選択される哺乳類GSK3B配列またはその天然に存在する変異体の一部であり得る。

0223

本発明のオリゴヌクレオチドは、GSK3Bを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

0224

いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的発現を阻害または低減することにより、標的の発現を調節することができる。好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも20%の発現の阻害、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%または95%の阻害。いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、HeLa細胞を使用してin vitroで、GSK3BmRNAの発現レベルを少なくとも60%または70%阻害することが可能であり得る。いくつかの実施態様では、本発明の化合物は、HeLa細胞を使用してin vitroで、GSK3Bタンパク質の発現レベルを少なくとも50%阻害することが可能であり得る。適切には、実施例は、GSK3B RNAまたはタンパク質阻害を測定するために使用され得るアッセイを提供する(例えば実施例1)。標的調節は、オリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、GSK3B発現の所望の調節を示すのに依然十分であり得る。ミスマッチに起因する結合親和性の低下は、有利には、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの数の増加によって、および/または、例えば、オリゴヌクレオチド配列内に存在する、LNAを含む2’糖修飾ヌクレオシドなど、標的に対する結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数の増加によって補償され得る。

0225

本発明の一態様は、哺乳類GSK3B標的核酸に対して少なくとも90%の相補性、例えば完全な相補性を有する、10−30ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、10−50、例えば10−30ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内での哺乳類GSK3B標的核酸の発現を減少させることができる。

0226

本発明のある態様は、哺乳類GSK3B標的核酸に対する完全な相補性など、少なくとも90%の相補性を有する、10−22ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、10−30ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内での哺乳類GSK3B標的核酸の発現を減少させることができる。

0227

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーは、標的核酸または標的配列と少なくとも90%相補的、例えば少なくとも91%、例えば少なくとも92%、例えば少なくとも93%、例えば少なくとも94%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%または100%相補的である連続する配列を含む。

0228

好ましい実施態様では、本発明のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、標的核酸または標的配列に対して完全に相補的(100%相補的)であるか、またはいくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に1つまたは2つのミスマッチを含み得る。

0229

本発明の別の態様は、連続するヌクレオチド配列が配列番号1、2、3または4からなる群から選択される配列またはその天然に存在する変異体に少なくとも90%相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

0230

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド配列または連続するヌクレオチド配列は、配列番号1および配列番号4に存在する対応する標的配列に少なくとも90%相補的または少なくとも95%相補的、例えば完全に相補的である。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続する配列は、哺乳類GSK3B標的核酸に完全に相補的である。

0231

好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド配列または連続するヌクレオチド配列は、配列番号1および配列番号4に存在する対応する標的配列に100%相補的である。

0232

本発明の別の態様は、連続するヌクレオチド配列が、哺乳動物標的核酸のプレmRNA(例えば配列番号1)に存在するイントロン領域に対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関しする。

0233

配列番号1のイントロンの位置は、GSK3BプレmRNAの異なるスプライシングに応じて異なり得ることが理解されるべきである。本発明の文脈において、最終RNA産物(成熟mRNA)の成熟中にRNAスプライシングによってプレmRNAから除去される遺伝子配列またはプレmRNA中の任意のヌクレオチド配列は、配列番号1上のそれらの位置に関係なくイントロンである。表1は、配列番号1の最も一般的なイントロン領域を示している。

0234

いくつかの実施態様では、連続するヌクレオチド配列は、配列番号1の1072−92178位;配列番号1の92373−147066位;配列番号1の147151−170934位;配列番号1の171046−178243位;配列番号1の178375−181607位;配列番号1の181715−188565位;配列番号1の188664−217909位;配列番号1の218006−230812位;配列番号1の231000−251064位および配列番号1の251164−267562位から選択されるヒトGSK3BのプレmRNAに存在するイントロン領域に対して、少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である。

0235

いくつかの実施態様では、連続するヌクレオチド配列は、配列番号1の181715−188565位または配列番号1の184509−184845位に対して、少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である。

0236

いくつかの実施態様では、連続するヌクレオチド配列は、配列番号1の1072−92178位または配列番号1の56154−56173位に対して、少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である。

0237

いくつかの実施態様では、連続するヌクレオチド配列は、配列番号5に対して、少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である。

0238

いくつかの実施態様では、連続するヌクレオチド配列は、配列番号20に対して、少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である。

0239

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に相補的であり、標的核酸領域は、配列番号1の184511−184530、184587−184606、184663−184682、184739−184758、184815−184834;184512−184531、184588−184607、184664−184683、184740−184759、184816−184835;184512−184529、184588−184605、184664−184681、184740−184757、184816−184833;184513−184528、184589−184604、184665−184680、184741−184756、184817−184832;184513−184526、184589−184602、184665−184678、184741−184754、184817−184830;184518−184531、184594−184607、184670−184683、184746−184759、184822−184835;56154−56173、56154−56171、56154−56169、56154−56167、267802−267821、267802−267815、267804−26821または267806−267821位からなる群から選択される。

0240

本発明の一態様によれば、標的配列は標的核酸内で反復され、すなわち、少なくとも10ヌクレオチド長の、少なくとも2つの同一の標的ヌクレオチド配列(標的領域)が標的核酸内の異なる位置で生じる。反復標的領域は、一般に、10から50の間のヌクレオチド、例えば11から30の間のヌクレオチド、例えば12から25の間のヌクレオチド、例えば13から22の間のヌクレオチド、例えば14から20の間のヌクレオチド、例えば15から19の間のヌクレオチド、例えば16から18の間のヌクレオチドである。好ましい実施態様では、反復標的領域は、14から20の間のヌクレオチドである。

0241

一態様では、本発明は、連続するヌクレオチド配列が、配列番号1の標的核酸にわたって少なくとも2回反復される標的領域に対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。この効果は、(同じ配列を持つ)複数のオリゴヌクレオチド化合物が同じ標的核酸上の1つ以上の標的領域に(同時に)ハイブリダイズでき、これにより、オリゴヌクレオチドを細胞または動物またはヒトに投与したとき、標的核酸の複数の切断事象が発生する可能性があることである。

0242

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列は、少なくとも3回、例えば少なくとも4、5、6、7、8、9または10回反復されるか、または10回より多く反復される標的領域に対して少なくとも90%の相補的、例えば完全に相補的な配列である。一実施態様では、標的領域は、イントロン6内で2から5回の間反復される。

0243

さらなる実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1の標的核酸のうちの10−22、例えば14−20ヌクレオチド長の標的領域に対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、該標的領域は、標的核酸のイントロンにわたって少なくとも5回以上反復される。

0244

いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号20の少なくとも5の反復標的領域に相補的である。

0245

いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、10−35ヌクレオチド長、例えば10−30、例えば11−22、例えば12−20、例えば14−18または14−16の連続するヌクレオチド長を含むか、またはそれらからなる。有利には、オリゴヌクレオチドは、14−20ヌクレオチド長を含むか、またはそれらからなる。

0246

本明細書で与えられる任意の範囲は、範囲の終点を含むことが理解される。

0247

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、22以下のヌクレオチド、例えば20以下のヌクレオチド、例えば18未満、例えば14、15、16または17のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。

0248

いくつかの実施態様では、連続するヌクレオチド配列は、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30の連続するヌクレオチド長を含むか、またはそれらからなる。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは、14−20ヌクレオチド長を含むか、またはそれらからなる。

0249

いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列は、配列番号6、7、8および9からなる群から選択される配列と少なくとも90%同一、例えば100%同一である。

0250

いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列は、配列番号10、11、12、13、14および15からなる群から選択される配列と少なくとも90%同一、例えば100%同一である。

0251

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号6、7、8または9から選択される配列と少なくとも90%の同一性、好ましくは100%の同一性を有する、10−30の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

0252

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号10、11、12、13、14または15から選択される配列と少なくとも90%の同一性、好ましくは100%の同一性を有する、10−30の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

0253

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号6、7、8または9から選択された配列と少なくとも90%の同一性、好ましくは100%の同一性を有する、12−20の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

0254

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号10、11、12、13、14または15から選択される配列と少なくとも90%の同一性、好ましくは100%の同一性を有する、12−20の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

0255

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号6、7、8および9から選択される配列と少なくとも90%の同一性、好ましくは100%の同一性を有する、14−20の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

0256

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号10、11、12、13、14または15から選択される配列と少なくとも90%の同一性、好ましくは100%の同一性を有する、14−20の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

0257

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号6、7、8または9から選択される配列を含む。

0258

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号10、11、12、13、14または15から選択される配列を含む。

0259

本発明の別の態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここで、連続するヌクレオチド配列が、哺乳類GSK3B標的核酸のプレmRNA(例えば配列番号1)中のエクソンに対して少なくとも90%相補的、例えば完全に相補的である。

0260

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列は、哺乳類GSK3B標的核酸のエクソン11、例えば配列番号1の267563−273095位を標的とする。

0261

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列は、配列番号1の267802−267821位に完全に相補的である。

0262

いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列は、16、17、18および19からなる群から選択される配列と少なくとも90%同一、例えば100%同一である。

0263

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号16、17、18または19から選択される配列と少なくとも90%の同一性、好ましくは100%の同一性を有する、10−30の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

0264

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号16、17、18または19から選択された配列と少なくとも90%の同一性、好ましくは100%の同一性を有する、12−20の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

0265

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号16、17、18または19から選択される配列と少なくとも90%の同一性、好ましくは100%の同一性を有する、14−20の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

0266

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号16、17、18または19から選択される配列を含む。

0267

オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、全てのLNA Cは5−メチルシトシンであり、5−メチルDNAシトシンは「e」で表され、好ましくは、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

0268

連続する核酸塩基配列(モチーフ配列)は、例えばヌクレアーゼ耐性および/または標的核酸への結合親和性を増加させるために修飾され得ることが理解される。修飾は、定義および以下の段落に記載される。表4に、各モチーフ配列の好ましい設計を示す。

0269

修飾ヌクレオシド(高親和性修飾ヌクレオシドなど)がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチド設計と呼ばれる。

0270

本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドを用いて設計される。有利には、高親和性修飾ヌクレオシドが使用される。

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