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課題・解決手段

本開示は、タウオパチー治療及び/または予防のためのタウタンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原構築物を対象とする。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を作製し、使用する方法、及びペプチド免疫原構築物によって作り出される抗体も対象とする。

概要

背景

タウタンパク質(またはその名を持つギリシャ文字にちなんだτタンパク質)は微小管を安定化するタンパク質である(ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/Tau_proteinにて概説されている)。それらは中枢神経系の神経細胞にて豊富であり、他の場所ではあまり一般的ではないが、CNS星状細胞乏突起膠細胞でも非常に低レベル発現される。たとえば、アルツハイマー病パーキンソン病のような神経系の病態及び認知症には、正常に機能しなくなり、もはや微小管を適正に安定化しないタウタンパク質が関連している。

タウタンパク質は、ヒトではMAPT(微小管関連タンパク質タウ)と名付けられ、第17染色体に位置する単一遺伝子からの選択的スプライシングの産物である。タウタンパク質は微小管重合に必須である熱安定性タンパク質として1975年に同定されたが、以来、天然変性タンパク質として特徴づけられている。

タウタンパク質は高度に可溶性の微小管関連タンパク質(MAP)である。ヒトでは、これらのタンパク質は非神経細胞に比べて神経細胞にて主に見いだされる。タウの主要な機能の1つは軸索微小管の安定性を調節することである。タウノックアウトマウスが脳の発生で異常を示さなかったことによって示唆されたように、他の神経系MAPが、恐らく、他のMAPによるタウ欠損代償のために類似の機能を実施している場合がある。タウは樹状突起には存在せず、それが微小管の安定化を提供するが、必要に応じて柔軟性も提供する軸索の遠位端側にて主として活性がある。これは、微小管を基本的に封じ込める軸索の近位端側におけるMAP6(STOP)タンパク質及び樹状突起にて微小管を安定化するMAP2とは対照的である。

タウタンパク質はチューブリン相互作用して微小管を安定化し、微小管へのチューブリンの重合を促進する。タウは微小管の安定性を制御する2つの手段:アイソフォーム及びリン酸化を有する。

長さ352から441までに及ぶアミノ酸の6つのタウのアイソフォームが成体の脳で発現されている;これらはMAPTからの転写物の選択的mRNAスプライシングによって作り出される(Fitzpatrick,et al.,2017;UniProtKB−P10636)。

アイソフォームは結合ドメインの数によって区別される。3つのアイソフォームは3つの結合ドメインを有し、他の3つは4つの結合ドメインを有する。結合ドメインはタンパク質のカルボキシ末端に位置し、正に荷電する(それが負に荷電した微小管に結合できるようにする)。4つの結合ドメインを持つアイソフォームは3つの結合ドメインを持つものよりも微小管の安定化に優れる。アイソフォームは、N末端半分における29または58のアミノ酸の挿入断片の存在または非存在、及びC末端半分におけるMAPTの第10エクソンによってコードされる31アミノ酸の微小管結合反復の包含または非存在で異なる。第10エクソンの包含は、それぞれ4つの反復(4R)を持つ3つのタウアイソフォームの産生を生じ、その排除はさらにそれぞれ3つの反復(3R)を持つ3つのアイソフォームを生じる。4つの反復(R1〜R4)は441アミノ酸のタウアイソフォームにて残基244〜368を含む。

タウは最長のタウアイソフォームにて79の潜在的なセリン(Ser)及びスレオニン(Thr)のリン酸化部位を伴ったリン酸化タンパク質である。リン酸化は正常なタウタンパク質にておよそ30のこれらの部位で報告されている。タウのリン酸化はPKNである、セリン/スレオニンキナーゼを含む多数のキナーゼによって調節される。PKNが活性化されると、それはタウをリン酸化し、微小管組織化破壊を生じる。タウのリン酸化は発生上でも調節される。たとえば、胎児性タウは成体のタウよりも胚性CNSにてより高度にリン酸化される。6つのアイソフォームすべてにてリン酸化の程度はホスファターゼの活性化に起因して年齢と共に低下する。キナーゼと同様に、ホスファターゼもタウのリン酸化を調節することにおいて役割を担う。たとえば、PP2A及びPP2Bは双方ともヒトの脳組織に存在し、Ser396を脱リン酸化する能力を有する。タウへのこれらホスファターゼの結合はタウのMTとの会合に影響を及ぼす。

タウタンパク質の過剰リン酸化(タウ封入体、pタウ)は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症及び他のタウオパチーの病態形成に関与する対らせんフィラメントと直線状フィラメントのもつれ自己重合を生じる得る。6つのタウアイソフォームのすべてがアルツハイマー病の脳由来の対らせんフィラメントでは大抵過剰リン酸化した状態で存在する。他の神経変性疾患では、特定のタウアイソフォームで豊富な凝集体沈着が報告されている。上手く折り畳まれない場合、さもなければこの非常に可溶性のタンパク質は、多数の神経変性疾患に寄与する極端不溶性の凝集体を形成する場合がある。

最近の研究は、アルツハイマー病におけるエクソソームに基づくメカニズムによってタウが細胞外に放出され得ることを示唆している。ヒト脳の様々な領域にわたる性別特異的なタウ遺伝子の発現は近年になってタウオパチーの兆候及びそのリスクにおける性差に関わっている。疾患がどのように機能するかの一部の態様もそれがプリオンタンパク質に対する若干の類似性を有することを示唆している。

豊富なフィラメント状のタウ封入体を伴った神経変性疾患はタウオパチーと呼ばれる。アルツハイマー病に加えて、これらの疾患には、神経原線維変化優位型認知症、慢性外傷性脳症(CTE)、嗜銀顆粒病、進行性核上麻痺大脳皮質基底核変性症、球状グリア細胞タウオパチー、及びピック病が挙げられる。アルツハイマー病とは異なって、これら他の疾患はアミロイドβプラークを欠いている。アルツハイマー病、神経原線維変化優位型認知症及び慢性外傷性脳症では、6つのタウアイソフォーム(3R及び4R)はすべて疾患のフィラメントに存在する。嗜銀顆粒病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び球状グリア細胞タウオパチーでは、4Rのタウアイソフォームのみが見いだされるのに対してピック病では、3Rタウ封入体だけが存在する。異なるフィラメント形態を持つヒトタウオパチーの存在は、凝集したタウの異なる分子配座異性体が存在するという考えにつながっている。複数の分子配座異性体の存在は、アルツハイマー病の人の脳に由来するフィラメントが、マウスの脳にてタウ病態を誘導することにおいて組換えタンパク質試験管内で重合したフィラメントよりも効果的である理由を説明し得る。

反復性の軽度外傷性脳損傷(TBI)は今や、接触型スポーツ、特にアメリカフットボール、及び隊での爆風の震盪における脳損傷中心的要素として認識されている。それは、過剰リン酸化されたタウの原線維変化を特徴とする慢性外傷性脳症(CTE)につながり得る。脳を浸している流体における高レベルのタウタンパク質は頭部外傷後の不十分な回復に関連付けられている。

タウ仮説は、タウの過剰なまたは異常なリン酸化が正常な成体タウのPHF−タウ(対らせんフィラメント)及びNFT(神経原線維変化)への形質転換を生じると述べている。タウタンパク質は高度に可溶性の微小管関連タンパク質(MAP)である。そのアイソフォーム及びリン酸化を介して、タウタンパク質はチューブリンと相互作用し、微小管重合を安定化する。タウタンパク質は、352〜441アミノ酸の範囲で6つのアイソフォームのファミリーを構成する。CNSにおける最長のアイソフォームは4つの反復(R1、R2、R3及びR4)及び2つの挿入断片を有する(合計441のアミノ酸)のに対して、最小のアイソフォームは3つの反復(R1、R3及びR4)を有し、挿入断片を有さない(合計352のアミノ酸)。6つのタウアイソフォームのすべてはAD由来の対らせんフィラメントにて大抵過剰リン酸化された状態で存在する。

タウの機能及びアイソフォーム発現を変える突然変異は過剰リン酸化につながる。突然変異の非存在下でのタウ凝集過程は知られていないが、上昇したリン酸化、プロテアーゼの作用、または、たとえば、グリコサミノグリカンのようなポリアニオンへの曝露から生じ得る。過剰リン酸化されたタウは微小管を分解し、正常なタウ、MAP1(微小管関連タンパク質1)、MAP2及びユビキチンをPHFのもつれに隔絶する。この不溶性構造は細胞質の機能を損傷し、軸索輸送を妨げ、それは細胞死につながり得る。

現在の時点では、タウオパチーを患っている患者費用効率のよい治療のための部位特異的なペプチド免疫原及びその製剤を開発する満たされていないニーズがまだ存在する。

参考文献
1. “Tau protein,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/wiki/Tau_protein (accessed September 29,2017).
2. Fitzpatrick, AWP, et al., “Cryo-EMstructures of Tau filaments from Alzheimer’s disease”, Nature, 547 (7662): 185-190(2017).

概要

本開示は、タウオパチーの治療及び/または予防のためのタウタンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原構築物を対象とする。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を作製し、使用する方法、及びペプチド免疫原構築物によって作り出される抗体も対象とする。A

目的

タウは樹状突起には存在せず、それが微小管の安定化を提供するが、必要に応じて柔軟性も提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

式:(Th)m−(A)n−(タウ断片)−Xまたは(タウ断片)−(A)n−(Th)m−Xによって表すことができるタウペプチド免疫原構築物であって、式中、Thは異種Tヘルパーエピトープであり;Aは異種スペーサーであり;(タウ断片)は配列番号100の完全長タウタンパク質由来する約15〜約40のアミノ酸残基を有するB細胞エピトープであり;Xはアミノ酸のα−COOHまたはα−CONH2であり;mは1〜約4であり、nは0〜約10である、前記タウペプチド免疫原構築物。

請求項2

前記タウ断片が配列番号1〜21及び101〜124から成る群から選択される請求項1に記載のタウペプチド免疫原構築物。

請求項3

前記Thエピトープが配列番号22〜50から成る群から選択される請求項1または2に記載のタウペプチド免疫原構築物。

請求項4

前記ペプチド免疫原構築物が配列番号51〜71及び125〜155から成る群から選択される請求項1に記載のタウペプチド免疫原構築物。

請求項5

タウペプチド免疫原構築物であって、配列番号100の完全長タウタンパク質配列に由来する約15〜約40のアミノ酸残基を含むB細胞エピトープと、配列番号22〜50から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むTヘルパーエピトープと、アミノ酸、Lys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α、ε−N)Lys、及びε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号102)から成る群から選択される任意の異種スペーサーとを含み、前記B細胞エピトープが直接または前記任意の異種スペーサーを介して前記Tヘルパーエピトープに共有結合される、前記タウペプチド免疫原構築物。

請求項6

前記B細胞エピトープが配列番号1〜21及び101〜124から成る群から選択される、請求項5に記載のタウペプチド免疫原構築物。

請求項7

前記Tヘルパーエピトープが配列番号22〜50から成る群から選択される請求項5に記載のタウペプチド免疫原構築物。

請求項8

前記任意の異種スペーサーが(α、ε−N)Lysまたはε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号102)である請求項5に記載のタウペプチド免疫原構築物。

請求項9

前記Tヘルパーエピトープが前記B細胞エピトープのアミノ末端に共有結合される請求項5に記載のタウペプチド免疫原構築物。

請求項10

前記Tヘルパーエピトープが前記任意の異種スペーサーを介して前記B細胞エピトープの前記アミノ末端に共有結合される請求項5に記載のタウペプチド免疫原構築物。

請求項11

請求項1〜4のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物を含む組成物

請求項12

(a)請求項1〜4のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物と(b)薬学上許容できる送達媒体及び/またはアジュバントとを含む医薬組成物

請求項13

(a)前記タウペプチド免疫原構築物が配列番号51〜71及び125〜155から成る群から選択され、且つ(b)前記タウペプチド免疫原構築物がCpGオリゴデオキシヌクレオチドODN)と混合されて安定化された免疫賦活複合体を形成する請求項12に記載の医薬組成物。

請求項14

請求項1〜10のいずれかに記載のタウペプチド免疫原構築物の前記B細胞エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはそのエピトープ結合断片

請求項15

前記タウペプチド免疫原構築物に結合される請求項14に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。

請求項16

請求項1〜10のいずれかに記載のタウペプチド免疫原構築物の前記B細胞エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。

請求項17

請求項14〜16のいずれかに記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片を含む組成物。

技術分野

0001

本出願は、全体として参照によって本明細書に組み入れられる、2017年10月27日に出願された米国仮特許出願第62/578,124号の利益を主張するPCT国際出願である。

0002

技術分野
本開示は、タウタンパク質の一部に基づくペプチド免疫原構築物及びタウオパチーの予防及び治療のためのその製剤に関する。

背景技術

0003

タウタンパク質(またはその名を持つギリシャ文字にちなんだτタンパク質)は微小管を安定化するタンパク質である(ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/Tau_proteinにて概説されている)。それらは中枢神経系の神経細胞にて豊富であり、他の場所ではあまり一般的ではないが、CNS星状細胞乏突起膠細胞でも非常に低レベル発現される。たとえば、アルツハイマー病パーキンソン病のような神経系の病態及び認知症には、正常に機能しなくなり、もはや微小管を適正に安定化しないタウタンパク質が関連している。

0004

タウタンパク質は、ヒトではMAPT(微小管関連タンパク質タウ)と名付けられ、第17染色体に位置する単一遺伝子からの選択的スプライシングの産物である。タウタンパク質は微小管重合に必須である熱安定性タンパク質として1975年に同定されたが、以来、天然変性タンパク質として特徴づけられている。

0005

タウタンパク質は高度に可溶性の微小管関連タンパク質(MAP)である。ヒトでは、これらのタンパク質は非神経細胞に比べて神経細胞にて主に見いだされる。タウの主要な機能の1つは軸索微小管の安定性を調節することである。タウノックアウトマウスが脳の発生で異常を示さなかったことによって示唆されたように、他の神経系MAPが、恐らく、他のMAPによるタウ欠損代償のために類似の機能を実施している場合がある。タウは樹状突起には存在せず、それが微小管の安定化を提供するが、必要に応じて柔軟性も提供する軸索の遠位端側にて主として活性がある。これは、微小管を基本的に封じ込める軸索の近位端側におけるMAP6(STOP)タンパク質及び樹状突起にて微小管を安定化するMAP2とは対照的である。

0006

タウタンパク質はチューブリン相互作用して微小管を安定化し、微小管へのチューブリンの重合を促進する。タウは微小管の安定性を制御する2つの手段:アイソフォーム及びリン酸化を有する。

0007

長さ352から441までに及ぶアミノ酸の6つのタウのアイソフォームが成体の脳で発現されている;これらはMAPTからの転写物の選択的mRNAスプライシングによって作り出される(Fitzpatrick,et al.,2017;UniProtKB−P10636)。

0008

アイソフォームは結合ドメインの数によって区別される。3つのアイソフォームは3つの結合ドメインを有し、他の3つは4つの結合ドメインを有する。結合ドメインはタンパク質のカルボキシ末端に位置し、正に荷電する(それが負に荷電した微小管に結合できるようにする)。4つの結合ドメインを持つアイソフォームは3つの結合ドメインを持つものよりも微小管の安定化に優れる。アイソフォームは、N末端半分における29または58のアミノ酸の挿入断片の存在または非存在、及びC末端半分におけるMAPTの第10エクソンによってコードされる31アミノ酸の微小管結合反復の包含または非存在で異なる。第10エクソンの包含は、それぞれ4つの反復(4R)を持つ3つのタウアイソフォームの産生を生じ、その排除はさらにそれぞれ3つの反復(3R)を持つ3つのアイソフォームを生じる。4つの反復(R1〜R4)は441アミノ酸のタウアイソフォームにて残基244〜368を含む。

0009

タウは最長のタウアイソフォームにて79の潜在的なセリン(Ser)及びスレオニン(Thr)のリン酸化部位を伴ったリン酸化タンパク質である。リン酸化は正常なタウタンパク質にておよそ30のこれらの部位で報告されている。タウのリン酸化はPKNである、セリン/スレオニンキナーゼを含む多数のキナーゼによって調節される。PKNが活性化されると、それはタウをリン酸化し、微小管組織化破壊を生じる。タウのリン酸化は発生上でも調節される。たとえば、胎児性タウは成体のタウよりも胚性CNSにてより高度にリン酸化される。6つのアイソフォームすべてにてリン酸化の程度はホスファターゼの活性化に起因して年齢と共に低下する。キナーゼと同様に、ホスファターゼもタウのリン酸化を調節することにおいて役割を担う。たとえば、PP2A及びPP2Bは双方ともヒトの脳組織に存在し、Ser396を脱リン酸化する能力を有する。タウへのこれらホスファターゼの結合はタウのMTとの会合に影響を及ぼす。

0010

タウタンパク質の過剰リン酸化(タウ封入体、pタウ)は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症及び他のタウオパチーの病態形成に関与する対らせんフィラメントと直線状フィラメントのもつれ自己重合を生じる得る。6つのタウアイソフォームのすべてがアルツハイマー病の脳由来の対らせんフィラメントでは大抵過剰リン酸化した状態で存在する。他の神経変性疾患では、特定のタウアイソフォームで豊富な凝集体沈着が報告されている。上手く折り畳まれない場合、さもなければこの非常に可溶性のタンパク質は、多数の神経変性疾患に寄与する極端不溶性の凝集体を形成する場合がある。

0011

最近の研究は、アルツハイマー病におけるエクソソームに基づくメカニズムによってタウが細胞外に放出され得ることを示唆している。ヒト脳の様々な領域にわたる性別特異的なタウ遺伝子の発現は近年になってタウオパチーの兆候及びそのリスクにおける性差に関わっている。疾患がどのように機能するかの一部の態様もそれがプリオンタンパク質に対する若干の類似性を有することを示唆している。

0012

豊富なフィラメント状のタウ封入体を伴った神経変性疾患はタウオパチーと呼ばれる。アルツハイマー病に加えて、これらの疾患には、神経原線維変化優位型認知症、慢性外傷性脳症(CTE)、嗜銀顆粒病、進行性核上麻痺大脳皮質基底核変性症、球状グリア細胞タウオパチー、及びピック病が挙げられる。アルツハイマー病とは異なって、これら他の疾患はアミロイドβプラークを欠いている。アルツハイマー病、神経原線維変化優位型認知症及び慢性外傷性脳症では、6つのタウアイソフォーム(3R及び4R)はすべて疾患のフィラメントに存在する。嗜銀顆粒病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び球状グリア細胞タウオパチーでは、4Rのタウアイソフォームのみが見いだされるのに対してピック病では、3Rタウ封入体だけが存在する。異なるフィラメント形態を持つヒトタウオパチーの存在は、凝集したタウの異なる分子配座異性体が存在するという考えにつながっている。複数の分子配座異性体の存在は、アルツハイマー病の人の脳に由来するフィラメントが、マウスの脳にてタウ病態を誘導することにおいて組換えタンパク質試験管内で重合したフィラメントよりも効果的である理由を説明し得る。

0013

反復性の軽度外傷性脳損傷(TBI)は今や、接触型スポーツ、特にアメリカフットボール、及び隊での爆風の震盪における脳損傷中心的要素として認識されている。それは、過剰リン酸化されたタウの原線維変化を特徴とする慢性外傷性脳症(CTE)につながり得る。脳を浸している流体における高レベルのタウタンパク質は頭部外傷後の不十分な回復に関連付けられている。

0014

タウ仮説は、タウの過剰なまたは異常なリン酸化が正常な成体タウのPHF−タウ(対らせんフィラメント)及びNFT(神経原線維変化)への形質転換を生じると述べている。タウタンパク質は高度に可溶性の微小管関連タンパク質(MAP)である。そのアイソフォーム及びリン酸化を介して、タウタンパク質はチューブリンと相互作用し、微小管重合を安定化する。タウタンパク質は、352〜441アミノ酸の範囲で6つのアイソフォームのファミリーを構成する。CNSにおける最長のアイソフォームは4つの反復(R1、R2、R3及びR4)及び2つの挿入断片を有する(合計441のアミノ酸)のに対して、最小のアイソフォームは3つの反復(R1、R3及びR4)を有し、挿入断片を有さない(合計352のアミノ酸)。6つのタウアイソフォームのすべてはAD由来の対らせんフィラメントにて大抵過剰リン酸化された状態で存在する。

0015

タウの機能及びアイソフォーム発現を変える突然変異は過剰リン酸化につながる。突然変異の非存在下でのタウ凝集過程は知られていないが、上昇したリン酸化、プロテアーゼの作用、または、たとえば、グリコサミノグリカンのようなポリアニオンへの曝露から生じ得る。過剰リン酸化されたタウは微小管を分解し、正常なタウ、MAP1(微小管関連タンパク質1)、MAP2及びユビキチンをPHFのもつれに隔絶する。この不溶性構造は細胞質の機能を損傷し、軸索輸送を妨げ、それは細胞死につながり得る。

0016

現在の時点では、タウオパチーを患っている患者費用効率のよい治療のための部位特異的なペプチド免疫原及びその製剤を開発する満たされていないニーズがまだ存在する。

0017

参考文献
1. “Tau protein,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/wiki/Tau_protein (accessed September 29,2017).
2. Fitzpatrick, AWP, et al., “Cryo-EMstructures of Tau filaments from Alzheimer’s disease”, Nature, 547 (7662): 185-190(2017).

0018

本開示は、タウオパチーの治療及び/または予防のためのタウタンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原構築物を対象とする。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を作製し、使用する方法、及びペプチド免疫原構築物によって作られる抗体も対象とする。

0019

開示されているペプチド免疫原構築物は約15以上のアミノ酸を含有する。ペプチド免疫原構築物は、表8に示す配列番号100のアミノ酸配列を有するヒトタウタンパク質の最長アイソフォーム(GenBank:AGF19246.1)の一部に由来するB細胞エピトープを含有する。B細胞エピトープは、任意の異種スペーサーを介して病原体タンパク質に由来する異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに連結することができる。開示されているペプチド免疫原構築物はタウに対して向けられた高度に特異的な抗体の生成を刺激する。開示されているペプチド免疫原構築物はタウオパチーを患っている患者のための免疫療法として使用することができる。

0020

ペプチド免疫原構築物のB細胞エピトープ部分は完全長のタウタンパク質(配列番号100)に由来するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、B細胞エピトープは表1に示すような配列番号1〜21及び101〜124のいずれかを含有する配列を有する。

0021

本開示のペプチド免疫原構築物は、表2に示すような病原体タンパク質に由来する異種Thエピトープのアミノ酸配列(たとえば、配列番号22〜50)を含有することができる。特定の実施形態では、異種Thエピトープは、たとえば、ジフテリア毒素(配列番号26)、Plasmodium Falciparum(配列番号27)、コレラ毒素(配列番号29)のような天然の病原体に由来する。他の実施形態では、異種Thエピトープは、単一配列または組み合わせ配列(たとえば、配列番号33、32及び34)の形態での麻疹ウイルス融合タンパク質(MVF1〜5)またはB型肝炎表面抗原(HBsAg1〜3)に由来する理想的な人工Thエピトープである。

0022

一部の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意の異種スペーサーを介して異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに連結されるタウ由来のB細胞エピトープを含有する。特定の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意の異種スペーサーを介して病原体タンパク質に由来する異種Thエピトープ(たとえば、配列番号22〜50)に連結されるタウ由来のアミノ酸配列(配列番号1〜21及び101〜124)を有するB細胞抗原部位を含有する。一部の実施形態では、任意の異種スペーサーは2つのアミノ酸及び/またはペプチド一緒に連結することができる分子または化学構造である。特定の実施形態では、スペーサーは天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、またはそれらの組み合わせである。具体的な実施形態では、ペプチド免疫原構築物は表3に示す配列番号51〜71及び125〜155のアミノ酸配列を有する。

0023

本開示はまた、タウペプチド免疫原構築物を含有する組成物も対象とする。一部の実施形態では、開示されている組成物はタウ由来の複数のBエピトープを対象にする1を超えるタウペプチド免疫原構築物を含有する。特定の実施形態では、組成物は、患者における広い遺伝的背景を対象にするために病原体タンパク質に由来する1を超える異種Thエピトープを持つタウペプチド免疫原構築物の混合物(たとえば、配列番号51〜71及び125〜155の任意の組み合わせ)を含有する。ペプチド免疫原構築物の混合物を含有する組成物は、単一のThペプチド免疫原構築物のみを含有する組成物と比べて、タウオパチーの治療のための免疫の際の有効率での高い比率につながり得る。

0024

本開示はまた、タウオパチーの治療及び/または予防のための医薬組成物も対象とする。一部の実施形態では、医薬組成物は、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物とCpGオリゴマーを混合することによって静電会合を介して形成される安定化された免疫賦活複合体の形態で開示されているペプチド免疫原構築物を含有する。そのような安定化された免疫賦活複合体はペプチド免疫原構築物の免疫原性をさらに高めることができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、たとえば、ミョウバンゲル(ALHYDROGEL)、リン酸アルミニウム(ADJUPHOS)を含む無機塩、またはMONTANIDEISA51もしくは720を含む油中水エマルションのようなアジュバントを含有する。

0025

本開示はまた、開示されているタウペプチド免疫原構築物に対して向けられた抗体も対象とする。特に、本開示のペプチド免疫原構築物は対象に投与されるとタウのアミノ酸配列(配列番号1〜21及び101〜124)と交差反応性である高度に特異的な抗体の生成を刺激することができる。ペプチド免疫原構築物によって作り出される高度に特異的な抗体は組換えタウ含有タンパク質と交差反応性である。開示されている抗体は高い特異性でタウに結合し、免疫原性強化のために採用される異種Thエピトープに向けられることは多くなく、あってもわずかであり、それはそのようなペプチド抗原性の強化に使用される従来のタンパク質または他の生物学的キャリアとは際立って対照的である。

0026

本開示はまた、開示されているペプチド免疫原構築物及び/またはペプチド免疫原構築物に向けられた抗体を用いてタウオパチーを治療する及び/または予防する方法も含む。一部の実施形態では、開示されているペプチド免疫原構築物を含有する組成物を宿主に投与することを含む、タウオパチーを治療する及び/または予防する方法。特定の実施形態では、方法で利用される組成物は、静電会合を介したCpGオリゴマーのような負に荷電したオリゴヌクレオチドとの安定した免疫賦活複合体の形態で開示されているペプチド免疫原構築物を含有し、その複合体はさらに、タウオパチーの患者に投与するために任意でアジュバントとしての無機塩または油によって補完される。開示されている方法はまた、タウオパチーのリスクがある宿主またはタウオパチーの宿主にペプチド免疫原構築物を投与するための投薬計画剤形、及び経路も含む。

図面の簡単な説明

0027

タウの抗原性領域解析した場合の非リン酸化タウペプチドに対する最初の注射の6週後(wpi)での複数のタウ免疫原構築物から得られた免疫血清についてのLog10力価で表したELISAの結果を示す図である。
タウの抗原性領域で解析した場合のリン酸化タウペプチドに対する最初の注射の6週後(wpi)での複数のタウ免疫原構築物から得られた免疫血清についてのLog10力価で表したELISAの結果を示す図である。
タウタンパク質の単量体二量体三量体及びオリゴマーを含有する細胞溶解物ウエスタンブロット解析を示す図である。種々のレーンは各レーンの上で示す非リン酸化タウペプチド免疫原構築物によって導出されたIgG抗体を示す(左側)。これらのペプチド免疫原構築物は表3に示す構築物に相当する。各抗体の結合特性を解析し、棒グラフで要約した(右側)。タウ免疫原構築物に対する代表的な免疫血清は複数種のタウ(単量体、二量体、三量体、オリゴマー及びポリマー)に対する結合反応性を実証した。
免疫前血清由来の抗体と比べた、各グラフの上に示す0から5μg/mLに及ぶ濃度でのリン酸化タウペプチド免疫原に向けられた種々の抗体に曝露した後の完全長タウ(タウ441アミノ酸)の凝集のレベルを示すグラフである。タウ凝集のレベルは凝集体のチオフラビン−T(ThT)染色によって測定した。
5μg/mLのリン酸化タウペプチド免疫原構築物に向けられた抗体及び陽性対照として使用され、試験管内でタウを脱凝集することが知られるメチレンブルーの存在下での試験管内タウ凝集のレベルを示す棒グラフである。
各グラフの上に示すように、リン酸化タウペプチド免疫原または非リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体への曝露の後のタウ凝集のレベルを示すグラフである。タウ凝集のレベルは凝集体のチオフラビン−T(ThT)染色によって測定した。リン酸化タウ免疫原または非リン酸化タウ免疫原に向けられた抗体について種々の程度の阻害が見いだされた。
各グラフの下に示すように、代表的なリン酸化タウペプチド免疫原または非リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体への曝露の際の予め形成された人工的なタウ原線維のタウ脱凝集のレベルを示すグラフである。タウ凝集のレベルは凝集体のチオフラビン−T(ThT)染色によって測定した。代表的なリン酸化タウ免疫原または非リン酸化タウ免疫原に由来する免疫血清由来の抗体で種々の程度までの脱凝集が見いだされた。
左側に示すように、本開示のタウペプチド免疫原によって作り出された抗リン酸化タウIgG及び抗非リン酸化タウIgGのウエスタンブロット解析(変性条件下)を示す図である。右のパネルに示すように、本開示の代表的なタウペプチド免疫原によって作り出された抗リン酸化タウIgG及び抗非リン酸化タウIgGのドットブロット解析非変性条件下)を示す図である。リン酸化タウペプチド免疫原によって導出された抗体はタウの原線維及びオリゴマーに対して優先的な結合を示した。
本開示のリン酸化タウペプチド免疫原及び非リン酸化タウペプチド免疫原の双方によって生成された代表的な抗体による免疫組織化学染色を示す図である。左のパネルは正常な脳切片に対比したアルツハイマー病特異的切片の結合特性を示すのに対して、右のパネルは正常組織にて交差反応がないことを示す。
本開示のリン酸化タウペプチド免疫原及び非リン酸化タウペプチド免疫原の双方によって生成された代表的な抗体による原線維タウに対する神経細胞の保護を示す組織染色である。
本開示のリン酸化タウペプチド免疫原及び非リン酸化タウペプチド免疫原の双方によって生成された代表的な抗体による原線維タウに対する神経細胞の保護を定量化するグラフである。

0028

本開示は、アルツハイマー病及び/またはタウオパチーの治療及び/または予防のためのタウタンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原構築物を対象とする。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を作製し、使用する方法、及びペプチド免疫原構築物によって作られる抗体も対象とする。

0029

開示されているペプチド免疫原構築物は約15以上のアミノ酸を含有する。ペプチド免疫原構築物は、表8に示す配列番号100のアミノ酸配列を有するヒトタウタンパク質の最長アイソフォーム(GenBank:AGF19246.1)の一部に由来するB細胞エピトープを含有する。B細胞エピトープは、任意の異種スペーサーを介して病原体タンパク質に由来する異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに連結することができる。開示されているペプチド免疫原構築物はタウに対して向けられた高度に特異的な抗体の生成を刺激する。開示されているペプチド免疫原構築物はアルツハイマー病及び/またはタウオパチーを患っている患者のための免疫療法として使用することができる。

0030

ペプチド免疫原構築物のB細胞エピトープ部分は完全長のタウタンパク質(配列番号100)に由来するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、B細胞エピトープは表1に示すような配列番号1〜21及び101〜124のいずれかを含有する配列を有する。

0031

本開示のペプチド免疫原構築物は、表2に示すような病原体タンパク質に由来する異種Thエピトープのアミノ酸配列(たとえば、配列番号22〜50)を含有することができる。特定の実施形態では、異種Thエピトープは、たとえば、ジフテリア毒素(配列番号26)、Plasmodium Falciparum(配列番号27)、コレラ毒素(配列番号29)のような天然の病原体に由来する。他の実施形態では、異種Thエピトープは、単一配列または組み合わせ配列(たとえば、配列番号33、32及び34)の形態での麻疹ウイルス融合タンパク質(MVF1〜5)またはB型肝炎表面抗原(HBsAg1〜3)に由来する理想的な人工Thエピトープである。

0032

一部の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意の異種スペーサーを介して異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに連結されるタウ由来のB細胞エピトープを含有する。特定の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意の異種スペーサーを介して病原体タンパク質に由来する異種Thエピトープ(たとえば、配列番号22〜50)に連結されるタウ由来のアミノ酸配列(配列番号1〜21及び101〜124)を有するB細胞抗原部位を含有する。一部の実施形態では、任意の異種スペーサーは2つのアミノ酸及び/またはペプチドを一緒に連結することができる分子または化学構造である。特定の実施形態では、スペーサーは天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、またはそれらの組み合わせである。具体的な実施形態では、ペプチド免疫原構築物は表4に示す配列番号51〜71及び125〜155のアミノ酸配列を有する。

0033

本開示はまた、タウペプチド免疫原構築物を含有する組成物も対象とする。一部の実施形態では、開示されている組成物はタウ由来の複数のBエピトープを対象にする1を超えるタウペプチド免疫原構築物を含有する。特定の実施形態では、組成物は、患者における広い遺伝的背景を対象にするために病原体タンパク質に由来する1を超える異種Thエピトープを持つタウペプチド免疫原構築物の混合物(たとえば、配列番号51〜71及び125〜155の任意の組み合わせ)を含有する。ペプチド免疫原構築物の混合物を含有する組成物は、単一のペプチド免疫原構築物のみを含有する組成物と比べて、アルツハイマー病及び/またはタウオパチーの治療のための免疫の際の有効率での高い比率につながり得る。

0034

本開示はまた、アルツハイマー病及び/またはタウオパチーの治療及び/または予防のための医薬組成物も対象とする。一部の実施形態では、医薬組成物は、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物とCpGオリゴマーを混合することによって静電会合を介して形成される安定化された免疫賦活複合体の形態で開示されているペプチド免疫原構築物を含有する。そのような安定化された免疫賦活複合体はペプチド免疫原構築物の免疫原性をさらに高めることができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、たとえば、ミョウバンゲル(ALHYDROGEL)、リン酸アルミニウム(ADJUPHOS)を含む無機塩、またはMONTANIDEISA51もしくは720を含む油中水エマルションのようなアジュバントを含有する。

0035

本開示はまた、開示されているタウペプチド免疫原構築物に対して向けられた抗体も対象とする。特に、本開示のペプチド免疫原構築物は対象に投与されるとタウのアミノ酸配列(配列番号1〜21及び101〜124)と交差反応性である高度に特異的な抗体の生成を刺激することができる。ペプチド免疫原構築物によって作り出される高度に特異的な抗体は組換えタウ含有タンパク質と交差反応性である。開示されている抗体は高い特異性でタウに結合し、免疫原性強化のために採用される異種Thエピトープに向けられることは多くなく、あってもわずかであり、それはそのようなペプチド抗原性の向上に使用される従来のタンパク質または他の生物学的キャリアとは際立って対照的である。

0036

本開示はまた、開示されているペプチド免疫原構築物及び/またはペプチド免疫原構築物に向けられた抗体を用いてアルツハイマー病及び/またはタウオパチーを治療する及び/または予防する方法も含む。一部の実施形態では、開示されているペプチド免疫原構築物を含有する組成物を宿主に投与することを含む、アルツハイマー病及び/またはタウオパチーを治療する及び/または予防する方法。特定の実施形態では、方法で利用される組成物は、静電会合を介したCpGオリゴマーのような負に荷電したオリゴヌクレオチドとの安定した免疫賦活複合体の形態で開示されているペプチド免疫原構築物を含有し、その複合体はさらに、アルツハイマー病及び/またはタウオパチーの患者に投与するために任意でアジュバントとしての無機塩または油によって補完される。開示されている方法はまた、アルツハイマー病及び/またはタウオパチーのリスクがある宿主またはアルツハイマー病及び/またはタウオパチーの宿主にペプチド免疫原構築物を投与するための投薬計画、剤形、及び経路も含む。

0037

セクションの見出しは本明細書で使用されるとき、構成目的のみのためのものであって、記載されている主題を限定すると解釈されるべきではない。本出願で引用されている参考文献すべてまたは参考文献の一部はあらゆる目的で全体として参照によって本明細書に明白に組み入れられる。

0038

特に説明されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数表現「a」、「an」及び「the」は文脈が明瞭に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、単語「または」は文脈が明瞭に指示しない限り、「及び」を含むように意図される。従って、「AまたはBを含むこと」はAまたはBまたはA及びBを含むことを意味する。ポリペプチドについて示されるアミノ酸のサイズすべて、及び分子量または分子質量の値すべては近似であり、記載のために提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載されているものと類似するまたは同等である方法及び材料を開示されている方法の実践及び検査で使用することができるが、好適な方法及び材料は以下に記載されている。本明細書で言及されている出版物、特許出願、特許及び他の参考文献はすべて全体として参照によって組み入れられる。矛盾がある場合、用語の説明を含めて本明細書が統制するであろう。加えて、材料、方法及び実施例は説明に役立つだけであり、限定するようには意図されない。

0039

タウペプチド免疫原構築物
本開示は、直接または任意の異種スペーサーを介して異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに共有結合されるタウ由来のアミノ酸配列を持つB細胞エピトープを含有するペプチド免疫原構築物を提供する。

0040

語句「タウペプチド免疫原構築物」または「ペプチド免疫原構築物」は本明細書で使用されるとき、(a)最長のタウアイソフォームの完全長配列(配列番号100)由来の約15以上のアミノ酸残基を有するB細胞エピトープと、(b)異種Thエピトープと、(c)任意の異種スペーサーとを含有するペプチドを指す。

0041

特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物は式
(Th)m−(A)n−(タウ断片)−X
または
(タウ断片)−(A)n−(Th)m−X
によって表すことができ、
式中、
Thは異種Tヘルパーエピトープであり;
Aは異種スペーサーであり;
(タウ断片)は配列番号100に由来する約15〜約40のアミノ酸残基を有するB細胞エピトープであり;
Xはアミノ酸のα−COOHまたはα−CONH2であり;
mは1〜約4であり;
nは0〜約10である。

0042

開示されているタウペプチド免疫原構築物の種々の成分が以下に記載されている。

0043

a.タウ断片
開示されているペプチド免疫原構築物は約15以上のアミノ酸を含有する。ペプチド免疫原構築物は、表8に示す配列番号100のアミノ酸配列を有するヒトのタウタンパク質の最長アイソフォーム(GenBank:AGF19246.1)の一部に由来するB細胞エピトープを含有する。B細胞エピトープは、任意の異種スペーサーを介して病原体タンパク質に由来する異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに連結することができる。開示されているペプチド免疫原構築物は、タウに向けられた高度に特異的な抗体の生成を刺激する。開示されているペプチド免疫原構築物はアルツハイマー病及び/またはタウオパチーを患っている患者のための免疫療法として使用することができる。

0044

ペプチド免疫原構築物のB細胞エピトープの部分は完全長のタウタンパク質(配列番号100)に由来するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、B細胞エピトープは表1に示すような配列番号1〜21及び101〜124のいずれかを含有する配列を有する。

0045

一部の実施形態では、タウ断片は表1に示すように、非リン酸化アミノ酸を含有する(たとえば、配列番号:2、4、6、8、11、13、15、17、19、及び21)。他の実施形態では、タウ断片は表1に示すように、リン酸化されたセリンアミノ酸及び/またはスレオニンアミノ酸を含有する(たとえば、配列番号:1、3、5、7、9、10、12、14、16、18、及び20)。表1のペプチドで示されたタウ断片と同様にリン酸化部位は例示であり、本開示は、配列番号100の完全長タウタンパク質の他の断片及び/またはリン酸化部位を含む。

0046

b.異種Tヘルパー細胞エピトープ(Thエピトープ)
本開示は、直接または任意の異種スペーサーを介して異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに共有結合されるタウ由来のB細胞エピトープを含有するペプチド免疫原構築物を提供する。

0047

タウペプチド免疫原構築物における異種Thエピトープはタウ断片の免疫原性を強化し、それは合理的設計を介して最適化された標的B細胞エピトープ(すなわち、タウ断片)に対して向けられた特異的な力価が高い抗体の産生を促す。

0048

用語「異種の」は本明細書で使用されるとき、タウの野生型配列の一部ではないまたはそれと相同ではないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。従って、異種Thエピトープはタウでは天然に見いだされないアミノ酸配列に由来するThエピトープである(すなわち、Thエピトープはタウに対して自己ではない)。Thエピトープはタウに対して異種なので、異種Thエピトープがタウ断片に共有結合すると、タウの天然のアミノ酸配列は、N末端方向またはC末端方向のいずれかでは伸長されない。

0049

本開示の異種Thエピトープはタウにて天然に見いだされるアミノ酸配列を有さない任意のThエピトープであることができる。Thエピトープは、どんな種(たとえば、ヒト、ブタウシイヌラット、マウス、モルモット、等)に由来するアミノ酸配列も有することができる。Thエピトープは複数の種のMHCクラスII分子に対して無差別結合モチーフも有することができる。特定の実施形態では、Thエピトープは複数の無差別なMHCクラスII結合モチーフを含んで、免疫応答の開始及び調節につながるTヘルパー細胞の最大の活性化を可能にする。Thエピトープは好ましくはそれ自体免疫サイレントであり、すなわち、タウペプチド免疫原構築物によって生成される抗体はThエピトープに向けられることはほとんどなく、あってもわずかなので、タウ断片の標的とされるB細胞エピトープに向けられた非常に集中した免疫応答を可能にする。

0050

本開示のエピトープには、表2で例示されているような外来病原体に由来するアミノ酸配列(配列番号22〜50)が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Thエピトープには、理想的な人工Thエピトープ及び組み合わせの理想的な人工Thエピトープ(たとえば、配列番号23及び30〜36)が含まれる。組み合わせ配列(たとえば、配列番号31〜34)として提示される異種Thエピトープペプチドは、その特定のペプチドについてのホモログ可変残基に基づくペプチドのフレームワーク内での特定の位置で表されるアミノ酸残基の混合物を含有する。合成過程の間で特定された位置にて特定のアミノ酸1つの代わりに指定された保護したアミノ酸の混合物を加えることによって1つのプロセスにて組み合わせペプチドの集合体を合成することができる。そのような組み合わせ異種Thエピトープのペプチド集合体は、多様な遺伝的背景を有する動物についての広いThエピトープの適用範囲を可能にすることができる。異種Thエピトープペプチドの代表的な組み合わせ配列には表2に示される配列番号31〜34が挙げられる。本発明のThエピトープペプチドは遺伝的に多様な集団に由来する動物及び患者に対する広い反応性及び免疫原性を提供する。

0051

Thエピトープを含むタウペプチド免疫原構築物はタウ断片と並行して単一の固相ペプチド合成にて同時に作り出される。ThエピトープはまたThエピトープの免疫類似体も含む。Th免疫類似体には、タウ断片に対する免疫応答を増強するまたは刺激するのに十分であるこれらThエピトープのいずれかの免疫増強類似体、交差反応性類似体及びセグメントが含まれる。

0052

Thエピトープペプチドの機能的な免疫類似体も効果的であり、本発明の一部として含まれる。機能的なTh免疫類似体は、ThエピトープのTh刺激機能を本質的に修飾しない、Thエピトープにおける1〜約5のアミノ酸残基の保存的な置換、付加、欠失及び挿入を含むことができる。保存的な置換、付加、及び挿入はタウ断片について上記に記載されているように天然のアミノ酸及び非天然のアミノ酸によって達成することができる。表2はThエピトープペプチドについての機能的類似体の別の変形型を同定している。特に、MvF1及びMvF2のThの配列番号23及び30は、それらが、それぞれN末端及びC末端における2つのアミノ酸の欠失(配列番号23及び30)または包含(配列番号33及び35)によってアミノ酸の枠組みで異なるという点で、MvF4及びMvF5の配列番号33及び35の機能的類似体である。これら2組の類似体配列の間での差異はこれらの配列内に含有されるThエピトープの機能に影響を及ぼさない。従って、機能的なTh免疫類似体には、麻疹ウイルス融合タンパク質MvF1〜4のTh(配列番号23、30、31、33及び35)及び肝炎表面タンパク質HBsAg1〜3のTh(配列番号32、34及び36)に由来するThエピトープの幾つかのバージョンが含まれる。

0053

タウペプチド免疫原構築物におけるThエピトープはタウペプチドのN末端またはC末端のいずれかに共有結合することができる。一部の実施形態では、ThエピトープはタウペプチドのN末端に共有結合する。他の実施形態では、ThエピトープはタウペプチドのC末端に共有結合する。特定の実施形態では、1を超えるThエピトープがタウ断片に共有結合される。1を超えるThエピトープがタウ断片に結合される場合、各Thエピトープは同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有することができる。加えて、1を超えるThエピトープがタウ断片に結合される場合、Thエピトープはどんな順序でも配置することができる。たとえば、Thエピトープは、タウ断片のN末端に連続して結合することができ、またはタウ断片のC末端に連続して結合することができ、またはThエピトープはタウ断片のN末端に共有結合されることができる一方で、別のThエピトープはタウ断片のC末端に共有結合される。タウ断片に関してThエピトープの配置での制限はない。

0054

一部の実施形態では、Thエピトープはタウ断片に直接共有結合される。他の実施形態では、Thエピトープは、以下でさらに詳細に記載されている異種スペーサーを介してタウ断片に共有結合される。

0055

c.異種スペーサー
開示されているタウペプチド免疫原構築物は任意で、異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープにタウ由来のB細胞エピトープを共有結合する異種スペーサーを含有する。

0056

上記で議論されたように、用語「異種」はタウの野生型配列の一部ではない、またはそれと相同ではないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。従って、スペーサーがタウ配列にとって異種であるので異種スペーサーがタウ由来のB細胞エピトープに共有結合するとタウの天然のアミノ酸配列は、N末端方向またはC末端方向のいずれかで伸長されない。

0057

スペーサーは2つのアミノ酸及び/またはペプチドを一緒に結合することができる任意の分子または化学構造である。スペーサーは適用に応じて長さまたは極性で変化することができる。スペーサーの連結はアミド結合またはカルボキシル結合を介することができるが、他の官能基も同様に可能である。スペーサーは化合物、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。

0058

スペーサーはタウペプチド免疫原構築物に対して構造的な特徴を提供することができる。構造的に、スペーサーはタウ断片のB細胞エピトープからのThエピトープの物理的分離を提供する。スペーサーによる物理的分離はB細胞エピトープにThエピトープを結合することによって作り出される人工的な二次的構造を壊すことができる。さらに、スペーサーによるエピトープの物理的分離はTh細胞及び/またはB細胞の反応間の干渉を排除することができる。さらに、スペーサーはペプチド免疫原構築物の二次構造を作り出すまたは修飾するように設計することができる。たとえば、スペーサーは柔軟なヒンジとして作用してThエピトープとB細胞エピトープの分離を強化するように設計することができる。柔軟なヒンジのスペーサーは提示されるペプチド免疫原と適当なTh細胞及びB細胞との間のさらに効率的な相互作用を可能にしThエピトープ及びB細胞エピトープに対する免疫応答を増強することもできる。柔軟なヒンジをコードする配列の例は、プロリンが豊富であることが多い免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域にて見いだされる。スペーサーとして使用することができる特に有用な柔軟なヒンジの1つは、配列Pro−Pro−Xaa−Pro−Xaa−Pro(配列番号101)によって提供され、その際、Xaaは任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。

0059

スペーサーはタウペプチド免疫原構築物に対して機能的な特徴を提供することもできる。たとえば、スペーサーはタウペプチド免疫原構築物の電荷全体を変えるように設計することができ、それはペプチド免疫原構築物の溶解度に影響を及ぼすことができる。さらに、タウペプチド免疫原構築物の電荷全体を変えることは他の化合物及び試薬と会合するペプチド免疫原構築物の能力に影響を及ぼすことができる。以下でさらに詳細に議論されているように、タウペプチド免疫原構築物は静電会合を介して、たとえば、CpGオリゴマーのような高度に荷電したオリゴヌクレオチドとの安定な免疫賦活複合体を形成することができる。タウペプチド免疫原構築物の電荷全体はこれら安定な免疫賦活複合体の形成にとって重要である。

0060

スペーサーとして使用することができる化合物には、(2−アミノエトキシ酢酸AEA)、5−アミノ吉草酸(AVA)、6−アミノカプロン酸(Ahx)、8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸(AEEA、ミニ−PEG1)、12−アミノ−4,7,10−トリオキサドデカン酸(ミニ−PEG2)、15−アミノ−4,7,10,13−テトラオキサペンタデカン酸(ミニ−PEG3)、トリオキサトリデカンスクシナミン酸(Ttds)、12−アミノ−ドデカン酸、Fmoc−5−アミノ−3−オキサペンタン酸(O1Pen)、等が挙げられるが、これらに限定されない。

0061

天然に存在するアミノ酸には、アラニンアルギニンアスパラギン、アスパラギン酸、システイングルタミン酸グルタミングリシンヒスチジンイソロイシンロイシンリシンメチオニンフェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファンチロシン及びバリンが挙げられる。

0062

天然に存在しないアミノ酸には、ε−Nリシン、β−アラニンオルニチンノルロイシンノルバリンヒドロキシプロリンチロキシンγ−アミノ酪酸ホモセリンシトルリンアミノ安息香酸、6−アミノカプロン酸(Aca;6−アミノヘキサン酸)、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸(MPA)、3−ニトロ−チロシン、ピログルタミン酸、等が挙げられるが、これらに限定されない。

0063

タウペプチド免疫原構築物におけるスペーサーはThエピトープ及びタウペプチドのN末端またはC末端のいずれかで共有結合することができる。一部の実施形態では、スペーサーはThエピトープのC末端に共有結合され、且つタウペプチドのN末端に共有結合される。他の実施形態では、スペーサーはタウペプチドのC末端に共有結合され、且つThエピトープのN末端に共有結合される。特定の実施形態では、たとえば、ペプチド免疫原構築物にて1を超えるThエピトープが存在する場合、1を超えるスペーサーを使用することができる。1を超えるスペーサーが使用される場合、各スペーサーは互いに同一であることができ、または異なることができる。さらに、ペプチド免疫原構築物にて1を超えるThエピトープが存在する場合、B細胞エピトープからThエピトープを分離するのに使用されるスペーサーと同一であることができる、または異なることができるスペーサーでThエピトープを分離することができる。Thエピトープ及びタウ断片との関連でスペーサーの配置には制限はない。

0064

特定の実施形態では、異種スペーサーは天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸である。他の実施形態では、スペーサーは1を超える天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を含有する。具体的な実施形態では、スペーサーはLys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α、ε−N)Lys、またはε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号102)である。

0065

d.タウペプチド免疫原構築物の具体的な実施形態
タウペプチド免疫原構築物は式:
(Th)m−(A)n−(タウ断片)−X
または
(タウ断片)−(A)n−(Th)m−X
によって表すことができ、
式中、
Thは異種Tヘルパーエピトープであり;
Aは異種スペーサーであり;
(タウ断片)は配列番号100の完全長タウタンパク質に由来する約15〜約40のアミノ酸残基を有するB細胞エピトープであり;
Xはアミノ酸のα−COOHまたはα−CONH2であり;
mは1〜約4であり;
nは0〜約10である。

0066

特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物における異種Thエピトープは、表3に示す、配列番号51〜71及び125〜155のいずれか及びそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸配列を有する。具体的な実施形態では、Thエピトープは配列番号30〜36のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物は1を超えるThエピトープを含有する。

0067

特定の実施形態では、任意の異種スペーサーはLys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α、ε−N)Lys、ε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号102)のいずれか、及びそれらの組み合わせから選択される。具体的な実施形態では、異種スペーサーはε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号102)である。

0068

特定の実施形態では、タウ断片は、配列番号100の完全長タウタンパク質に由来する約15〜約40のアミノ酸残基を有する。具体的な実施形態では、タウ断片は、表1に示すような配列番号1〜21及び101〜124によって表されるアミノ酸配列を有する。

0069

特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物は表3に示すような配列番号51〜71及び125〜155のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。

0070

a.変異体、ホモログ及び機能的な類似体
タウタンパク質の好まれるエピトープに対する抗体を誘導する及び/またはそれと交差反応する上記免疫原性ペプチドの変異体及び類似体も使用することができる。対立遺伝子変異体、種変異体及び誘導された変異体を含む類似体は通常、多くは保存的置換によって1、2またはわずかな位置で天然に存在するペプチドとは異なる。類似体は通常、天然のペプチドとの少なくとも80%または90%の配列同一性を示す。一部の類似体は1、2またはわずかな位置で非天然のアミノ酸またはNもしくはC末端アミノ酸の修飾も含む。

0071

機能的な類似体である変異体は、アミノ酸の位置での保存的置換;電荷全体での変化;別の部分への共有結合;またはアミノ酸の付加、挿入、もしくは欠失;及び/またはそれらの任意の組み合わせを有することができる。

0072

保存的置換は、1つのアミノ酸残基が類似の化学的特性を持つもう1つのアミノ酸残基で置換される場合である。たとえば、非極性疎水性)アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ;極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ;正に荷電した(塩基性)アミノ酸にはアルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ;負に荷電した(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。

0073

特定の実施形態では、機能的な類似体は元々のアミノ酸配列に対して少なくとも50%の同一性を有する。別の実施形態では、機能的な類似体は元々のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能的な類似体は元々のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能的な類似体は元々のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有する。

0074

変異体はリン酸化された残基に対する変異も含む。たとえば、変異体はリン酸化されているペプチド内で様々な残基を含むことができる。変異体免疫原性タウペプチドリン酸化ペプチドを含むことができる。偽リン酸化ペプチドはタウペプチドのリン酸化されたセリン残基スレオニン残基及びチロシン残基の1以上を、たとえば、グルタミン酸及びアスパラギン酸のような酸性アミノ酸残基で置換することによって生成される。

0075

組成物
本開示はまた、開示されているタウ免疫原構築物を含む組成物も提供する。

0076

a.ペプチド組成物
開示されているタウペプチド免疫原構築物を含有する組成物は液体形態または固体形態であることができる。液体組成物は水、緩衝液溶媒、塩及び/またはタウペプチド免疫原構築物の構造的特性または機能的特性を変化させない他の許容できる試薬を含むことができる。ペプチド組成物は、開示されているタウペプチド免疫原構築物の1以上を含有することができる。

0077

b.医薬組成物
本開示はまた、開示されているタウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物も対象とする。

0078

医薬組成物は、薬学上許容できる送達系にてキャリア及び/または他の添加剤を含有することができる。さらに、医薬組成物は、薬学上許容できるキャリア、アジュバント及び/または、たとえば、希釈剤、添加剤、安定剤、保存剤可溶化剤、緩衝液、等のような他の賦形剤と一緒に薬学上有効な量のタウペプチド免疫原構築物を含有することができる。

0079

医薬組成物は、それ自体任意の特異的な抗原性効果を有することなく、タウペプチド免疫原構築物に対する免疫応答を加速する、延長するまたは強化するように作用する1以上のアジュバントを含有することができる。医薬組成物で使用されるアジュバントには、油、アルミニウム塩ビロソーム、リン酸アルミニウム(たとえば、ADJU−PHOS(登録商標))、水酸化アルミニウム(たとえば、ALHYDROGEL(登録商標))、リポシンサポニンスクアレン、L121、Emulsigen(登録商標)、モノホスホリル液体A(MPL)、QS21、ISA35、ISA206、ISA50V、ISA51、ISA720、と同様に他のアジュバント及び乳化剤を挙げることができる。

0080

一部の実施形態では、医薬組成物は、MONTANIDE(商標)ISA51(油中水エマルションの製造のための植物油オレイン酸マンニドで構成される油アジュバント組成物)、Tween(登録商標)80(ポリソルベート80またはポリオキシエチレン(20)モノオレイン酸ソルビタンとしても知られる)、CpGオリゴヌクレオチド、及び/またはそれらの任意の組み合わせを含有する。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてのエマルゲンまたはエマルシゲンDを伴った水中油中水(すなわち、w/o/w)エマルションである。

0081

医薬組成物は、即時放出製剤としてまたは徐放性製剤用に製剤化することができる。さらに、医薬組成物は、免疫原の封入及び微粒子との同時投与を介した全身性免疫または局在粘膜免疫の誘導のために製剤化することができる。そのような送達系は当業者によって容易に決定される。

0082

医薬組成物は、液体溶液または懸濁液としての注射剤として調製することができる。注射に先立って、タウペプチド免疫原構築物を含有する液体媒体も調製することができる。医薬組成物は、適用の任意の好適な方式、たとえば、i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、内、経口、皮下、等によって且つ任意の好適な送達用具にて投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与用、皮下投与用、皮内投与用または筋肉内投与用に製剤化される。経口及び鼻内の適用を含む投与の他の方式に好適な医薬組成物も調製することができる。

0083

医薬組成物は、即時放出製剤としてまたは徐放性製剤用に製剤化することができる。さらに、医薬組成物は、免疫原の封入及び微粒子との同時投与を介した全身性免疫または局在粘膜免疫の誘導のために製剤化することができる。そのような送達系は当業者によって容易に決定される。

0084

医薬組成物は、好適な単位剤形にて製剤化することもできる。一部の実施形態では、医薬組成物は、体重kg当たり約0.5μg〜約1mgのタウペプチド免疫原構築物を含有する。医薬組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の身体的状態、患者がヒトであるか、または動物であるか、投与される他の薬物、及び処置が予防的であるか、または治療上であるかを含む多数の様々な因子に応じて変化する。普通、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類も治療することができる。複数回用量で送達される場合、医薬組成物は便宜上、単位剤形当たり適当な量に分割されてもよい。投与される投与量は、治療技術では周知のように対象の年齢、体重及び全身状態に左右されるであろう。

0085

一部の実施形態では、医薬組成物は1を超えるタウペプチド免疫原構築物を含有する。構築物の免疫有効性相乗的な強化を可能にする1を超えるタウペプチド免疫原構築物の混合物を含有する医薬組成物。1を超えるタウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、MHCクラスIIの広い適用範囲によりさらに大きな遺伝的集団ではさらに効果的であり得るので、タウペプチド免疫原構築物に対する改善された免疫応答を提供する。

0086

一部の実施形態では、医薬組成物は配列番号51〜71及び125〜155から選択されるタウペプチド免疫原構築物、と同様にそれらのホモログ、類似体及び/または組み合わせを含有する。具体的な実施形態では、医薬組成物は配列番号51〜71及び125〜155から選択されるタウペプチド免疫原構築物及びそれらの任意の組み合わせを含有する。

0087

タウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物を使用して免疫応答を引き出し、投与の際、宿主にて抗体を作り出すことができる。

0088

c.免疫賦活複合体
本開示はまた、CpGオリゴヌクレオチドとの免疫賦活複合体の形態でタウペプチド免疫原の構築物を含有する医薬組成物も対象とする。そのような免疫賦活複合体は特異的に適合し、アジュバントとして及びペプチド免疫原の安定剤として作用する。免疫賦活複合体は微粒子の形態であり、それは、免疫系の細胞にタウペプチド免疫原を効率的に提示して免疫応答を生じることができる。免疫賦活複合体は非経口投与用に懸濁液として製剤化されてもよい。免疫賦活複合体は、非経口投与に続く宿主の免疫系の細胞へのタウペプチド免疫原の効率的な送達のために、無機塩との組み合わせまたは原位置ゲル化ポリマーとの組み合わせでの懸濁液としてw/oエマルションの形態で製剤化されてもよい。

0089

安定化された免疫賦活複合体は、静電会合を介してアニオン系の分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはそれらの組み合わせと共にタウペプチド免疫原構築物を複合体化することによって形成することができる。安定化された免疫賦活複合体は、免疫原の送達系として医薬組成物に組み込まれてもよい。

0090

特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物は5.0〜8.0の範囲でのpHにて正に荷電するカチオン系の部分を含有するように設計される。タウペプチド免疫原構築物または構築物の混合物のカチオン系部分の正味電荷は、配列内でそれぞれリシン(K)、アルギニン(R)またはヒスチジン(H)に対して+1の電荷を割り当て、それぞれアスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)に対して−1の電荷を割り当て、他のアミノ酸に対して0の電荷を割り当てることによって算出する。タウペプチド免疫原構築物のカチオン系部分内で電荷を合計し、正味平均電荷として表現する。好適なペプチド免疫原は+1の正味の平均正電荷を持つカチオン系部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は+2より大きい範囲での正味の正電荷を有する。一部の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物のカチオン系部分は異種スペーサーである。特定の実施形態では、スペーサー配列が(α,ε−N)Lys、ε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号102)である場合、タウペプチド免疫原構築物のカチオン系部分は+4の電荷を有する。

0091

本明細書に記載されている「アニオン系分子」は5.0〜8.0の範囲のpHにて負に荷電する任意の分子を指す。特定の実施形態では、アニオン系分子はオリゴマーまたはポリマーである。オリゴマーまたはポリマーの正味の負電荷はオリゴマーにおけるそれぞれホスホジエステル基またはホスホロチオエート基に対して−1の電荷を割り当てることによって算出される。好適なアニオン系オリゴヌクレオチドは、1〜10の範囲でのCpGモチーフ反復数を持つ、8〜64のヌクレオチド塩基を伴った一本鎖DNA分子である。好ましくは、CpG免疫賦活一本鎖DNA分子は3〜8の範囲でのCpGモチーフの反復数を持つ18〜48のヌクレオチド塩基を含有する。

0092

さらに好ましくは、アニオン系オリゴヌクレオチドは式5’ X1CGX2 3’によって表され、式中、C及びGはメチル化されず、X1はA(アデニン)、G(グアニン)及びT(チミン)から成る群から選択され、X2はC(シトシン)またはT(チミン)である。または、アニオン系オリゴヌクレオチドは式5’(X3)2CG(X4)23’によって表され、式中、C及びGはメチル化されず、X3はA、TまたはGから成る群から選択され、X4はCまたはTである。

0093

得られる免疫賦活複合体は、通常1〜50ミクロンの範囲でのサイズを持つ粒子の形態であり、相対的な電荷化学量論及び相互作用する種の分子量を含む多数の因子の関数である。微粒子状の免疫賦活複合体は、生体内で特異的な免疫応答のアジュバント処理及び上方調節を提供するという利点を有する。さらに、安定化された免疫賦活複合体は、油中水エマルション、無機塩懸濁液及び高分子ゲルを含む種々のプロセスによって医薬組成物を調製するのに好適である。

0094

抗体
本開示はまた、タウペプチド免疫原構築物によって導出される抗体も提供する。

0095

タウ断片と、異種Thエピトープと、任意で異種スペーサーとを含む開示されているタウペプチド免疫原構築物は、宿主に投与すると免疫応答及び抗体の産生を導出することができる。タウペプチド免疫原構築物の設計は自己タウに対する寛容性を破ることができ、線状ではない立体構造のエピトープを認識する部位特異的な抗体の産生を導出することができる。

0096

タウペプチド免疫原構築物によって作られる抗体は単量体、二量体、三量体及びオリゴマーの形態でのタウを認識し、それに結合する。

0097

タウペプチド免疫原構築物によって導出される抗体は驚くべきことに、タウの凝集を妨げることができ(抗凝集活性)、且つ予め形成されたタウ凝集体を解離することができる(脱凝集活性)。

0098

本発明のタウペプチド免疫原構築物で免疫した動物から得られる免疫応答は、単量体、二量体、三量体及びオリゴマーの形態でのタウと反応性である強力な部位特異的な抗体を作る構築物の能力を実証した。

0099

方法
本開示はまた、タウペプチド免疫原構築物、組成物及び医薬組成物を作製し、使用する方法も提供する。

0100

a.タウペプチド免疫原構築物を製造する方法
本開示のタウペプチド免疫原構築物は当業者に周知の化学合成法(たとえば、Fieldset al.,Chapter 3 in Synthetic Peptides:A User’s Guide,ed.Grant,W.H.Freeman & Co.,New York,NY,1992,p.77を参照のこと)によって作製することができる。タウペプチド免疫原構築物は、たとえば、Applied Biosystems Peptide Synthesizerモデル430Aまたは431にて側鎖保護したアミノ酸を用い、t−Boc化学またはF−moc化学のいずれかよる保護されたα−NH2との固相合成の自動化されたMerrifield法を用いて合成することができる。Thエピトープのための組み合わせライブラリペプチドを含むタウペプチド免疫原構築物の調製は所与可変位置でのカップリングのために代替アミノ酸の混合物を提供することによって達成することができる。

0101

所望のタウペプチド免疫原構築物の完全な重合の後、標準の手順に従って樹脂を処理し、樹脂からペプチドを切断することができ、アミノ酸側鎖における官能基を脱ブロックすることができる。遊離のペプチドをHPLCによって精製し、たとえば、アミノ酸解析または配列決定によって生化学的に特徴付けることができる。ペプチドの精製及び特徴付けの方法は当業者に周知である。

0102

この化学的プロセスによって作製されたペプチドの品質を制御し、規定することができ、その結果、タウペプチド免疫原構築物の再現性、免疫原性及び収率保証することができる。固相ペプチド合成を介してタウペプチド免疫原構築物を製造することの詳細な説明は実施例1に示されている。

0103

意図された免疫学的活性の保持を可能にする構造的変異の範囲は、小分子薬剤による特定の薬剤活性の保持または生物学的に導き出される薬剤と同時に作製される大きな分子で見いだされる所望の活性及び望ましくない毒性の保持を可能にする構造的変異の範囲よりもはるかに融通が利くことが見いだされている。従って、意図されたペプチドに類似するクロマトグラフィー特性及び免疫学的特性を有する生成物による欠失配列の混合物として意図的に設計されたペプチド類似体、またはその混合物の合成過程のエラーによって必然的に生じたペプチド類似体は、所望のペプチドの精製された調製物と同様に効果的であることが多い。これらのペプチドを用いる最終製品の再現性及び有効性を保証するように製造過程及び製品評価過程の双方をモニターするために洞察力のあるQC手順が開発される限り、設計される類似体及び意図されない類似体混合物は有効である。

0104

タウペプチド免疫原構築物は、核酸分子ベクター及び/または宿主細胞を含む組換えDNA法を用いて作製することもできる。そのようなものとして、タウペプチド免疫原構築物をコードする核酸分子及びその免疫学的に機能的な類似体も本発明の一部として本開示によって包含される。同様に、核酸分子を含む発現ベクターを含むベクターと同様にベクターを含有する宿主細胞も本発明の一部として本開示によって包含される。

0105

種々の例となる実施形態はタウペプチド免疫原構築物及びその免疫学的に機能的な類似体を作製する方法も包含する。たとえば、方法は、ペプチド及び/または類似体が発現されるような条件下でタウペプチド免疫原構築物及び/またはその免疫学的に機能的な類似体をコードする核酸分子を含有する発現ベクターを含有する宿主細胞をインキュベートする工程を含むことができる。周知の組換えDNA法によってさらに長い合成ペプチド免疫原を合成することができる。そのような技法は、詳細なプロトコールと共に周知の標準マニュアルにて提供されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳して、好ましくは遺伝子が発現されることになる生物にとって最適であるコドンでの、アミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、通常、ペプチド及び必要に応じて任意の調節要素をコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって合成遺伝子を作製する。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞に形質移入する。次いで選択された発現系及び宿主に適する好適な条件下でペプチドを発現させる。常法によってペプチドを精製し、特徴付ける。

0106

b.免疫賦活複合体の製造方法
種々の例となる実施形態はタウペプチド免疫原構築物とCpGオリゴデオキシヌクレオチドODN)分子とを含む免疫賦活複合体を作製する方法も包含する。安定化した免疫賦活複合体(ISC)はタウペプチド免疫原構築物のカチオン系部分とポリアニオン系CpG ODN分子とに由来する。自己集合系は電荷の静電中和によって推進される。タウペプチド免疫原構築物のカチオン系部分のアニオン系オリゴマーに対するモル電荷比定比性が会合の程度を決定する。タウペプチド免疫原構築物とCpG ODNとの非共有結合性静電会合は完全に再現性のプロセスである。ペプチド/CpG ODNの免疫賦活複合体は凝集し、それは免疫系の「プロの」抗原提示細胞APC)への提示を促すので、複合体の免疫原性をさらに強化する。これらの複合体は製造の間での品質管理のために容易に特徴付けられる。ペプチド/CpG ISCは生体内で上手く認容される。CpG ODNとタウ断片に由来するペプチド免疫原構築物とを含むこの新規の微粒子状の系は、CpG ODNの使用と関連する一般化されたB細胞の分裂促進性を利用し、バランスの取れたTh1/Th2型の反応をさらに促進するように設計された。

0107

開示されている医薬組成物におけるCpGODNは相対する電荷の静電中和が介在するプロセスにて免疫原に100%結合し、結果としてミクロンサイズの微粒子の形成を生じる。微粒子形態は、CpGアジュバントの従来の使用から顕著に低下したCpGの投与量、有害な自然免疫応答の可能性の低下を可能にし、抗原提示細胞(APC)を含む代替の免疫原プロセッシング経路を円滑に進める。その結果、そのような製剤は概念的に新規であり、代替メカニズムにより免疫応答の刺激を促進することによって潜在的な利点を提供する。

0108

c.医薬組成物の製造方法
種々の例となる実施形態はタウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物も包含する。特定の実施形態では、医薬組成物は、油エマルションにて及び無機塩との懸濁液にて水を採用する。

0109

医薬組成物が大きな集団によって使用され、投与の目標の一部でもあるタウ凝集の阻止で使用されるために、安全性が検討事項について別の重要な因子になる。臨床試験における多数の製剤についてヒトでは油中水エマルションが使用されるにもかかわらず、その安全性に起因して製剤での使用についてミョウバンが主要なアジュバントのままである。従って、ミョウバンまたはその無機塩であるリン酸アルミニウム(ADJUPHOS)は臨床応用にための調製にてアジュバントとして使用されることが多い。

0110

他のアジュバント及び免疫賦活剤には、3 De−O−アセチル化モノホスホリル脂質A(MPL)または3−DMP、高分子または単量体のアミノ酸、たとえば、ポリグルタミン酸またはポリリシンが挙げられる。そのようなアジュバントは、他の具体的な免疫賦活剤、たとえば、ムラミルペプチド(たとえば、N−アセチルムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(ノル−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)、N−アセチルグルクサミニル−N−アセチルムラミル−L−Al−D−イソグル−L−Ala−ジパルミトキシプロピルアミド(DTP−DPP) Theramide(商標))、または他の細菌細胞壁成分の有無にかかわらず使用することができる。水中油エマルションには、微小流動化剤を用いてサブミクロンの粒子に製剤化した5%スクアレン、0.5%Tween80、及び0.5%Span85(任意で種々の量のMTP−PEを含有する)を含有するMF59(全体として参照によって本明細書に組み入れられる、Van Nest et al.,へのWO 90/14837を参照のこと);サブミクロンのエマルションに微小流動化した、またはボルテックスしてさらに大きな粒子サイズのエマルションを生成した、10%スクアレン、0.4%ツイーン80、5%プルロニックブロックしたポリマーL121、及びthr−MDPを含有するSAF;ならびに2%スクアレン、0.2%ツイーン80、及びモノホスホリル脂質A(MPL)、ジミコール酸トレハロースTDM)、及び細胞壁骨格(CWS)、好ましくはMPL+CWS(Detox(商標))から成る群から選択される1以上の細菌細胞壁成分を含有するRibi(商標)アジュバント系RAS)(Ribi ImmunoChem、Hamilton、Mont.)が挙げられる。他のアジュバントには、完全フロイントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、ならびにサイトカイン、たとえば、インターロイキンIL−1、IL−2、及びIL−12)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF)、及び腫瘍壊死因子(TNF)が挙げられる。

0111

アジュバントの選択は、アジュバントを含有する免疫原製剤の安定性、投与の経路、投薬スケジュールワクチン接種される種にとってのアジュバントの有効性に左右され、ヒトでは、薬学上許容できるアジュバントは、関連する規制機関によってヒトへの投与について認可されているまたは認可可能であるものである。たとえば、ミョウバン、MPLまたは不完全フロイントアジュバント(全体として参照によって本明細書に組み入れられるChang et al.,Advanced Drug Delivery Reviews,32:173−186(1998))は単独で、または任意でその組み合わせすべてでヒトへの投与に好適である。

0112

組成物は、動物またはヒトへの投与のために医薬組成物を製剤化するのに一般に使用される媒体として定義される、薬学上許容できる非毒性のキャリアまたは希釈剤を含むことができる。希釈剤は組み合わせの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水生理リン酸緩衝化生食塩水リンガー溶液デキストロース溶液及びハンクス溶液である。加えて、医薬組成物または製剤はまた、他のキャリア、アジュバントまたは非毒性で非治療的で非免疫原性の安定剤、等も含んでもよい。

0113

医薬組成物はまた、大型のゆっくり代謝される高分子、たとえば、タンパク質、キトサンのような多糖類ポリ乳酸ポリグリコール酸及びコポリマー(たとえば、ラテックス官能化されたセファロースアガロースセルロース、等)、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び脂質凝集体(たとえば、油液滴またはリポソーム)も含むことができる。さらに、これらのキャリアは免疫賦活剤(すなわち、アジュバント)として機能することができる。

0114

本発明の医薬組成物はさらに、好適な送達媒体を含むことができる。好適な送達媒体には、ウイルス、細菌、生分解性ミクロスフェアマイクロ粒子ナノ粒子、リポソーム、コラーゲンミニペレット、及びコクリエートが挙げられるが、これらに限定されない。

0115

d.医薬組成物を使用する方法
本開示はまた、タウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物を使用する方法も含む。

0116

特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は
(a)宿主にてタウの凝集を阻害すること;
(b)宿主にて予め形成されたタウ凝集体の脱凝集を誘導すること;
(c)宿主にて外来性のタウ凝集体によって引き起こされる神経変性を軽減すること;
(d)タウを過剰発現する細胞における神経変性を軽減すること;
(e)宿主における血清タウのレベルを低下させること;
(f)宿主の脳におけるオリゴマータウのレベルを低下させること;
(g)宿主における神経病変を減らすこと及び運動活動の回復、等
のために使用することができる。

0117

上記の方法は、薬学上有効な量のタウペプチド免疫原構築物を含む医薬組成物をそれを必要とする宿主に投与することを含む。

0118

本明細書で使用されるとき、「タウオパチー」は、脳内での微小管タンパク質タウの病的な凝集が関与する任意の神経変性疾患を包含する。従って、家族性及び散発性双方のアルツハイマー病に加えて、本発明の方法を用いて治療することができる他のタウオパチーには、限定することなく、前頭側頭型認知症、第17染色体に連鎖するパーキンソン病(FTDP−17)、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下グリオーシス、神経原線維変化優位型認知症、石灰沈着を伴ったびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋委縮性側索硬化症パーキンソン認知症複合、ボクサー認知症、ダウン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、封入体筋炎クロイツフェルトヤコブ病多系統萎縮症ニーマン・ピック病C型、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、亜急性硬化性汎脳炎筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴った非グアム運動ニューロン疾患脳炎後パーキンソン病、及び慢性外傷性脳症が挙げられる。

0119

本開示の別の態様は、対象の脳からのタウ凝集体のクリアランスを促進する方法を対象とする。方法には、対象の脳からのタウ凝集体のクリアランスを促進するのに有効な条件下で対象に、配列番号1〜21及び101〜124から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する1以上の免疫原性タウペプチド、または配列番号1〜21及び101〜124及び51〜71及び125〜155から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原性タウエピトープを認識する1以上の抗体を投与することを含む。

0120

タウ凝集体のクリアランスには、神経原線維変化のクリアランス及び/または神経原線維変化に対する病的タウ前駆体のクリアランスが含まれる。神経原線維変化は、たとえば、散発性及び家族性のアルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、嗜銀顆粒性認知症、ボクサー認知症、慢性外傷性脳症、石灰沈着を伴ったびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、遺伝性前頭側頭型認知症、第17染色体に連鎖するパーキンソン病(FTDP−17)、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病C型、ピック病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、散発性大脳皮質基底核変性症、進行性核上麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴った運動ニューロン疾患、神経原線維変化優位型認知症、及び進行性皮質下グリオーシスを含む神経変性疾患に関連することが多い。

0121

本開示の別の態様は、対象にてタウ病理が関連する行動的表現型の進行を減速する方法を対象とする。この方法には、対象にてタウ病理が関連する行動的表現型を減速する有効な条件下で配列番号1〜21及び101〜124及び51〜71及び125〜155から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む1以上の免疫原性タウペプチド、または配列番号1〜21及び101〜124及び51〜71及び125〜155から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原性タウエピトープを認識する1以上の抗体を対象に投与することを含む。

0122

本明細書で使用されるとき、タウ病理が関連する行動的表現型には限定することなく、認知障害、早期の人格の変化及び脱抑制無気力症、無為無言症失行症固執常同運動行動口愛過度無秩序連続作業計画するまたは組織化することができないこと、身勝手さ/無神経さ、非社交的な特質共感欠如、頻繁な錯語型エラーを伴うが、相対的に温存された理解力を持つ途切れがちな失文法型の会話、損傷した理解力及び喚語欠陥緩慢な進行性の歩行不安定性後方突進フリージング、頻繁な転倒レボドパ非応答性軸剛性核上性注視麻痺矩形波眼球運動、緩慢垂直衝動性運動仮性球麻痺四肢失行、筋失調症皮質性感覚消失、及び振戦が挙げられる。

0123

本開示の方法によれば、一実施形態では、免疫原性タウペプチドまたは免疫原性タウペプチドの組み合わせが必要とする対象に投与される。タウタンパク質の好適な免疫原性タウペプチド断片はタウタンパク質の病的形態模倣する1以上の抗原性エピトープを含有する。例となる免疫原性タウエピトープは、タウの病的形態ではリン酸化されるが、タウの正常な形態または非病的形態ではリン酸化されない1以上のアミノ酸にてリン酸化される。

0124

一部の実施形態では、免疫原性タウペプチドの投与は対象にて免疫原性タウペプチド及びタウの病的形態に対する活発な免疫応答を誘導し、それによって関連するタウ凝集体のクリアランスを促し、タウ病理に関連する行動の進行を減速し、基礎にあるタウオパチーを治療する。本発明のこの態様によれば、免疫応答には、免疫原性タウペプチドに向けられた有益な液性(抗体が介在する)の応答及び/または細胞性抗原特異的なT細胞またはその分泌産物が介在する)の応答の発生を含む。

0125

液性免疫応答の存在は、免疫原性タウペプチドに向けられた抗体の存在について対象由来生体試料(たとえば、血液、血漿、血清、尿、唾液糞便、CSFまたはリンパ液)を調べることによって判定し、モニターすることができる。生体試料にて抗体を検出する方法は当該技術で周知である、たとえば、ELISA、ドットブロット、SDS−PAGEゲル、またはELISPOT。細胞介在性の免疫応答の存在は、当該技術で容易に知られる増殖アッセイ(CD4+T細胞)またはCTL細胞傷害性Tリンパ球)アッセイによって判定することができる。

0126

本発明の単離された免疫原性タウペプチドは以下の表1及び表3に示す配列番号1〜21及び101〜124及び51〜71及び125〜155のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。リン酸化されている各配列のアミノ酸残基を太字及び下線で示す。表1におけるペプチドの名称は、表8に示すような配列番号100のアミノ酸配列を有するヒトタウタンパク質の最長アイソフォーム内でのこれらのペプチドのアミノ酸の位置に相当する。

0127

具体的な実施形態
(1)タウペプチド免疫原構築物は、式:
(Th)m−(A)n−(タウ断片)−X
または
(タウ断片)−(A)n−(Th)m−X
によって表すことができ、
式中、
Thは異種Tヘルパーエピトープであり;
Aは異種スペーサーであり;
(タウ断片)は配列番号100の完全長タウタンパク質に由来する約15〜約40のアミノ酸残基を有するB細胞エピトープであり;
Xはアミノ酸のα−COOHまたはα−CONH2であり;
mは1〜約4であり、
nは0〜約10である。
(2)タウ断片が配列番号1〜21及び101〜124から成る群から選択される、(1)に記載のタウペプチド免疫原構築物。
(3)Thエピトープが配列番号22〜50から成る群から選択される、(1)または(2)のいずれかに記載のタウペプチド免疫原構築物。
(4)ペプチド免疫原構築物が配列番号51〜71及び125〜155から成る群から選択される(1)に記載のタウペプチド免疫原構築物。
(5)タウペプチド免疫原構築物であって、
配列番号100の完全長タウタンパク質配列に由来する約15〜約40のアミノ酸残基を含むB細胞エピトープと、
配列番号22〜50から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むTヘルパーエピトープと、
アミノ酸、Lys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α、ε−N)Lys、及びε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号102)から成る群から選択される任意の異種スペーサーとを含み、
B細胞エピトープが直接、または任意の異種スペーサーを介してTヘルパーエピトープに共有結合される、当該タウペプチド免疫原構築物。
(6)B細胞エピトープが配列番号1〜21及び101〜124から成る群から選択される、(5)のタウペプチド免疫原構築物。
(7)Tヘルパーエピトープが配列番号22〜50から成る群から選択される、(5)のタウペプチド免疫原構築物。
(8)任意の異種スペーサーが(α、ε−N)Lysまたはε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号102)である、(5)のタウペプチド免疫原構築物。
(9)TヘルパーエピトープがB細胞エピトープのアミノ末端に共有結合される、(5)のタウペプチド免疫原構築物。
(10)Tヘルパーエピトープが任意の異種スペーサーを介してB細胞エピトープのアミノ末端に共有結合される、(5)のタウペプチド免疫原構築物。
(11)(1)〜(4)のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物を含む組成物。
(12)a.(1)〜(4)のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物と
b.薬学上許容できる送達媒体及び/またはアジュバントと
を含む医薬組成物。
(13)a.タウペプチド免疫原構築物が配列番号51〜71及び125〜155から成る群から選択され、且つ
b.タウペプチド免疫原構築物がCpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)と混合されて安定化された免疫賦活複合体を形成する、(12)の医薬組成物。
(14)(1)〜(10)のいずれかに記載のタウペプチド免疫原構築物のB細胞エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはそのエピトープ結合断片
(15)タウペプチド免疫原構築物に結合される(14)に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
(16)(1)〜(10)のいずれかに記載のタウペプチド免疫原構築物のB細胞エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
(17)請求項(14)〜(16)のいずれかに記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片を含む組成物。

0128

実施例1
非リン酸化タウペプチド免疫原構築物によって導出される抗体及び結合特性
a.タウ断片の合成及び免疫
非リン酸化タウペプチド免疫原構築物及びリン酸化タウペプチド免疫原構築物の開発努力に含まれたデザイナータウ断片を合成する方法は詳細な説明に記載されている。一般に、ペプチドは、血清学的なアッセイ、現場のための実験室での試験的な規模または臨床試験については小規模で、ならびに医薬組成物の工業的な/商業的な製造については大規模(キログラム)で合成された。広範な血清学的スクリーニングと免疫原性のためのタウペプチド免疫原構築物の設計で組み込むための候補B細胞エピトープとしての選択とタウワクチン製剤で使用するための機能検査とのために、およそ10からおよそ40アミノ酸に及ぶ長さの配列を有する大きなレパートリーのタウ関連の抗原性B細胞エピトープペプチドを設計した。

0129

これらの血清学試験で組換えタンパク質として使用した完全長のタウ(表8)はrPeptide Companyから購入した(Tau−441、T−1001−2)。種々の血清学アッセイにおけるエピトープマッピングで採用したタウペプチドのセグメントは表1にて特定されている(配列番号1〜21及び101〜124)。麻疹ウイルス融合タンパク質(MVF)、B型肝炎表面抗原タンパク質(HBsAg)、インフルエンザ、Clostridum tetani、及びエプスタイン・バーウイルス(EBV)を含む病原体タンパク質に由来する慎重に設計したヘルパーT細胞(Th)エピトープにタウペプチドを合成で連結することによって、選択したタウペプチドの断片をタウペプチド免疫原構築物に加工した。設計したThエピトープを表2に示す(配列番号22〜50)。

0130

油中水エマルションを採用する製剤及び無機塩との懸濁液における製剤は詳細な説明に記載されているように調製した。疾患を予防する目的で大集団によって使用される適当な医薬組成物を設計することにおいて、組成物の安全性を考慮することが重要である。臨床試験における多数の医薬組成物へのヒトにおける油中水エマルションの使用にもかかわらず、ミョウバンはその安全性ゆえに医薬組成物での使用のための主要なアジュバントのままである。ミョウバンまたはADJUPHOS(リン酸アルミニウム)のようなその無機塩は臨床応用のための調製でアジュバントとして使用されることが多い。非リン酸化タウペプチド免疫原構築物は、(i)ヒトでの使用について認可された油としてのSeppic MONTANIDE(商標)ISA51を伴った油中水エマルションにて調製した、または(ii)特定されているように、種々の量のペプチド構築物にて無機塩ADJUPHOS(リン酸アルミニウム)またはALHYDROGEL(ミョウバン)とともに混合した。組成物は通常、約400μg/mLにて水にタウペプチド免疫原構築物を溶解することによって調製され、油中水エマルションにおけるMONTANIDE(商標)ISA51(体積で1:1)または無機塩(体積で1:1)と共に製剤化された。組成物は約30分間室温で保持し、免疫に先立って約10〜15秒間ボルテックスで混合した。何匹かの動物に1回を超える用量での具体的な組成物で免疫したが、それは、0時(初回抗原刺激)と、最初の免疫の3週後(wpi)(追加免疫)と、任意で6wpiでの二度目の追加免疫とで筋肉内経路によって投与した。これらの免疫した動物は次いで、選択したB細胞エピトープペプチド(複数可)で試験して製剤に存在する種々のタウペプチド免疫原構築物の免疫原性と同様に関連する標的のペプチドまたはタンパク質との交差反応性を評価した。モルモットにおける最初のスクリーニングにて強力な免疫原性を持つそれらタウペプチド免疫原構築物を次いでさらに、免疫プロトコールによって指示されたように特定の期間にわたって投薬計画について霊長類にて油中水エマルション、無機塩の製剤及びミョウバンに基づく製剤の双方で試験した。

0131

溶媒(ISA51 VG、CpG3 50μg/mL、0.2%TWEEN(登録商標)−80)に溶解した非リン酸化タウペプチド免疫原構築物(配列番号:52、54、56、58、61、63、65、67、69、及び71)を特定されたスケジュールでモルモットに注射し、広範な血清学的な解析のために免疫血清を採取した。

0132

b.ELISAアッセイ及び結果
免疫した動物の血清を最初の免疫後、種々の時点で採取し、先ずELISAによって結合特性を分析し、それ自体のB細胞エピトープ標的に対する対応する構築物の免疫原性を判定した。他の機能的な領域に由来するタウペプチドの間での血清学的な交差反応性の評価を、表9a〜9eに示すものから選択した様々なペプチドでコーティングしたプレートによるELISAによって広範に評価した。

0133

免疫血清試料を評価するためにELISAプロトコールを開発したが、以下の実施例にそれを記載する。手短には、10mMのNaHCO3緩衝液、pH9.5(特に言及されない限り)における2μg/mL(特に言及されない限り)での標的ペプチドタウ断片A145−P160、P172−P189、P182−P200、S195−P213、R209−L224、V228−L243、K257−K274、R379−L408、V275−K311、及びV393−L425ペプチド(それぞれ配列番号:2、4、6、8、11、13、15、17、19、及び21)の100μLによって96ウェルプレートウェルを個々に37℃で1時間コーティングした。ペプチドでコーティングしたウェルをPBS中3重量%のゼラチン250μLと共に37℃で1時間インキュベートして非特異的なタンパク質の結合部位をブロックし、その後、0.05体積%のTWEEN(登録商標)20を含有するPBSで3回洗浄し、次いで乾燥させた。20体積%の正常ヤギ血清と1重量%のゼラチンと0.05体積%のTWEEN(登録商標)20とを含有するPBSで、解析される血清を1:20(特に言及されない限り)に希釈した。希釈した検体(たとえば、血清、血漿)の100マイクロリットル(100μL)をウェルのそれぞれに加え、37℃で60分間反応させた。次いで未結合の抗体を取り除くためにPBS中0.05体積%のTWEEN(登録商標)20でウェルを6回洗浄した。標識したトレーサーとして西ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を結合した種(たとえば、マウス、モルモットまたはヒト)特異的ヤギ抗IgGを使用して、陽性のウェルで形成される抗体/ペプチド抗原の複合体と結合させた。予め滴定した最適な希釈での且つPBS中0.05体積%のTWEEN(登録商標)20を伴った1体積%の正常ヤギ血清におけるペルオキシダーゼ標識したヤギ抗IgGの100マイクロリットル(100μL)を各ウェルに加え、37℃でさらに30分間インキュベートした。PBS中0.05体積%のTWEEN(登録商標)20でウェルを6回洗浄して未結合の抗体を取り除き、クエン酸ナトリウム緩衝液にて0.04重量%の3’,3’,5’,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)と0.12体積%の過酸化水素とを含有する基質混合物100μLとさらに15分間反応させた。この基質混合物を用いて着色生成物を形成することによってペルオキシダーゼ標識を検出した。1.0MのH2SO4100μLの添加によって反応を止め、450nmでの吸光度(A450)を測定した。種々のタウ由来のペプチド免疫原を投与して免疫した動物の抗体力価の決定のために、1:100〜1:10,000の血清の10倍連続希釈を試験し、0.5に設定したカットオフA450を持つA450の線形回帰解析によって、Log10として表現される試験した血清の力価を算出した。表9a〜表9eに示すELISAの結果を図1Aに示すように棒グラフにプロットすることによってさらに解析した。

0134

一般に、それ自体のB細胞エピトープに対して試験すると、高い免疫原性は選択したタウペプチド構築物のそれぞれと関連することが見いだされた(表9a〜表9e及び図1A)。高い交差反応性は配列番号52、54、56、58、及び61のペプチド免疫原構築物によって導出された抗体で見いだされた(図1Aを参照のこと)。

0135

興味深いことに、B細胞エピトープK257〜K274(配列番号15)を含有する配列番号65は設計されたタウペプチド構築物の間で高度に免疫原性の配列であることが見いだされ、さらにこの構築物から導出された抗体は他のB細胞エピトープのいずれに対しても大きな交差反応がなく、最も特異的だった(図1Aを参照のこと)。これに反して、B細胞エピトープR379〜L408(配列番号17)を含有する配列番号67のタウペプチド免疫原構築物はそれ自体のBエピトープとの高い反応性を有して最も免疫原性であったが、また他のタウB細胞エピトープに対して妥当な交差反応性も有した(図1Aを参照のこと)。

0136

実施例2
リン酸化タウペプチド免疫原構築物によって導出された抗体及び結合特性
リン酸化タウペプチド免疫原構築物に対して生成された抗体をそのリン酸化B細胞エピトープに結合するその能力について最初の免疫の6週後(wpi)でのELISAによって評価した。

0137

a.免疫
非リン酸化タウペプチド免疫原についての実施例1にて議論された同じ条件下でリン酸化タウペプチド免疫原(配列番号51、53、55、57、59、60、62、64、66、68、及び70)を製剤化し、モルモットに投与した。リン酸化タウペプチド免疫原を含有する製剤は0、3及び6wpiに投与した。

0138

b.ELISAアッセイ及び結果
10mMのNaHCO3緩衝液、pH9.5(特に言及されない限り)における2μg/mL(特に言及されない限り)でのリン酸化タウ標的ペプチド断片A145−P160、P172−P189、P182−P200、S195−P213、R209−L224、V228−L243、K257−K274、R379−L408、V275−K311及びV393−L425ペプチド(それぞれ配列番号:1、3、5、7、9、10、12、14、16、18、及び20)の100μLによって96ウェルプレートのウェルを個々に37℃で1時間コーティングした。ペプチドでコーティングしたウェルをPBS中3重量%のゼラチン250μLと共に37℃で1時間インキュベートして非特異的なタンパク質の結合部位をブロックし、その後、0.05体積%のTWEEN(登録商標)20を含有するPBSで3回洗浄し、次いで乾燥させた。20体積%の正常ヤギ血清と1重量%のゼラチンと0.05体積%のTWEEN(登録商標)20とを含有するPBSで、解析される血清を1:20(特に言及されない限り)に希釈した。希釈した検体(たとえば、血清、血漿)の100マイクロリットル(100μL)をウェルのそれぞれに加え、37℃で60分間反応させた。次いで未結合の抗体を取り除くためにPBS中0.05体積%のTWEEN(登録商標)20でウェルを6回洗浄した。標識したトレーサーとして西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を結合した種(たとえば、マウス、モルモットまたはヒト)特異的ヤギ抗IgGを使用して、陽性のウェルで形成される抗体/ペプチド抗原の複合体と結合させた。予め滴定した最適な希釈での且つPBS中0.05体積%のTWEEN(登録商標)20を伴った1体積%の正常ヤギ血清におけるペルオキシダーゼ標識したヤギ抗IgGの100マイクロリットル(100μL)を各ウェルに加え、37℃でさらに30分間インキュベートした。PBS中0.05体積%のTWEEN(登録商標)20でウェルを6回洗浄して未結合の抗体を取り除き、クエン酸ナトリウム緩衝液にて0.04重量%の3’,3’,5’,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)と0.12体積%の過酸化水素とを含有する基質混合物100μLとさらに15分間反応させた。この基質混合物を用いて着色生成物を形成することによってペルオキシダーゼ標識を検出した。1.0MのH2SO4100μLの添加によって反応を止め、450nmでの吸光度(A450)を測定した。種々のタウ由来のペプチド免疫原を投与して免疫した動物の抗体力価の決定のために、1:100〜1:10,000の血清の10倍連続希釈を試験し、0.5に設定したカットオフA450を持つA450の線形回帰解析によって、Log10として表現される試験した血清の力価を算出した。免疫した動物の血清を注射後種々の時点で採取し、ELISAによって結合特性を解析した。種々のタウ断片によってELISAプレートをコーティングしたが、結果を表10a〜表10dに示す。

0139

表10a〜表10dに示すELISAの結果を図1Bに示すような棒グラフでプロットすることによってさらに解析した。リン酸化タウペプチド構築物を免疫原として使用した場合、B細胞エピトープの間での交差反応性を含めて類似の免疫原性及び血清学的な特性が見いだされた。

0140

実施例3
リン酸化タウペプチド免疫原構築物によって導出された抗体及びその非リン酸化ペプチド対応物に対する結合特性
リン酸化タウペプチドに対して生成された抗体を対応する非リン酸化対応物ペプチドに結合するその能力について、以下にさらに詳細に記載されているように注射の6週後(6wpi)でのELISAによって評価した。

0141

a.免疫
非リン酸化タウペプチド免疫原についての実施例1にて記載された条件下でリン酸化タウペプチド免疫原(配列番号51、53、55、57、59、60、62、64、66、68、及び70)を製剤化し、モルモットに投与した。

0142

b.ELISAアッセイ及び結果
10mMのNaHCO3緩衝液、pH9.5(特に言及されない限り)における2μg/mL(特に言及されない限り)での標的ペプチドタウ断片A145−P160、P172−P189、P182−P200、S195−P213、R209−L224、V228−L243、K257−K274、R379−L408、V275−K311及びV393−L425ペプチド(それぞれ配列番号:2、4、6、8、11、13、15、17、19、及び21)の100μLによって96ウェルプレートのウェルを個々に37℃で1時間コーティングした。ペプチドでコーティングしたウェルをPBS中3重量%のゼラチン250μLと共に37℃で1時間インキュベートして非特異的なタンパク質の結合部位をブロックし、その後、0.05体積%のTWEEN(登録商標)20を含有するPBSで3回洗浄し、乾燥させた。20体積%の正常ヤギ血清と1重量%のゼラチンと0.05体積%のTWEEN(登録商標)20とを含有するPBSで、解析される血清を1:20(特に言及されない限り)に希釈した。希釈した検体(たとえば、血清、血漿)の100マイクロリットル(100μL)をウェルのそれぞれに加え、37℃で60分間反応させた。次いで未結合の抗体を取り除くためにPBS中0.05体積%のTWEEN(登録商標)20でウェルを6回洗浄した。標識したトレーサーとして西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を結合した種(たとえば、マウス、モルモットまたはヒト)特異的ヤギ抗IgGを使用して、陽性のウェルで形成される抗体/ペプチド抗原の複合体と結合させた。予め滴定した最適な希釈での且つPBS中0.05体積%のTWEEN(登録商標)20を伴った1体積%の正常ヤギ血清におけるペルオキシダーゼ標識したヤギ抗IgGの100マイクロリットル(100μL)を各ウェルに加え、37℃でさらに30分間インキュベートした。PBS中0.05体積%のTWEEN(登録商標)20でウェルを6回洗浄して未結合の抗体を取り除き、クエン酸ナトリウム緩衝液にて0.04重量%の3’,3’,5’,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)と0.12体積%の過酸化水素とを含有する基質混合物100μLとさらに15分間反応させた。この基質混合物を用いて着色生成物を形成することによってペルオキシダーゼ標識を検出した。1.0MのH2SO4100μLの添加によって反応を止め、450nmでの吸光度(A450)を測定した。種々のタウ由来のペプチド免疫原を投与して免疫した動物の抗体力価の決定のために、1:100〜1:10,000の血清の10倍連続希釈を試験し、0.5に設定したカットオフA450を持つA450の線形回帰解析によって、Log10として表現される試験した血清の力価を算出した。免疫した動物の血清を注射後種々の時点で採取し、ELISAによって結合特性を解析した。

0143

ELISAプレートを種々の非リン酸化タウペプチド断片でコーティングしたが、結果を表11a〜表11eに示す。免疫血清を対応する非リン酸化タウのB細胞エピトープペプチドで試験した場合、リン酸化タウペプチド構築物に対して生成された抗体すべてについて類似する血清学的な結合特性が得られた。実施例1、2及び3で実施された広範な免疫原性試験及び血清学的試験から、タウペプチド免疫原構築物によって導出された抗体が類似の特性を示すことは明らかである。これらの特性のほとんどはアミノ酸配列に起因し得る。交差反応性試験を用いた立体構造評価がペプチドのリン酸化によって引き起こされる微妙な差異しかなかったことを示すということは、非リン酸化ペプチド免疫原構築物に対比して対応するリン酸化ペプチド免疫原構築物によって産生させたこれらの免疫血清の類似する機能的特性があることを示唆している。

0144

実施例4
非リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体の結合特性
a.様々なサイズの様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗非リン酸化タウ抗体の特異性
実施例1に記載されているように、非リン酸化タウペプチド免疫原構築物をモルモットに免疫した。様々なサイズのタウ分子複合体に対する結合特異性についてウエスタンブロットを用いて、様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗非リン酸化タウ抗体(抗非p−タウ抗体)を選別した。タウの種々の形態(単量体、二量体、三量体、オリゴマー及びポリマー)(20μM)を12%トリス・グリシンSDS−PAGEで分離し、光誘導架橋(PICUP)処理の前にニトロセルロースNC)膜に移した。モルモットの抗血清から精製した抗非p−タウ抗体1μg/mLと共に膜をインキュベートし、次いでロバ抗モルモット抗体を結合したHRP(706−035−148,Jackson)と共にインキュベートした。化学発光試薬Western LightningECLPro(PerkinElmer)でブロット可視化した。

0145

b.結果
タウの単量体、二量体、三量体、及びオリゴマーを含有する溶解物のウエスタンブロット解析を図2(左のパネル)に示す。単量体タウは60kDa前後であると思われ、二量体、三量体はオリゴマーと同様に相当する分子量で現れた。市販のモノクローナル抗体Mabタウ5及びMabタウ46はタウの単量体形態を検出することができ、わずかに二量体形態を検出することができた(図2のレーン1及び2)。Mabタウ5はタウ全体のマーカーとして採用され、タウ46はタウ404−441のマーカーである。

0146

非リン酸化ペプチド免疫原構築物(配列番号52、54、56、58、61、63、65、67、69、及び71)によって導出されたIgG抗体は様々な効率でタウの単量体、二量体、三量体、及びオリゴマーを検出した(図2のレーン4〜13)。各抗体の結合特性を解析し、棒グラフで定量的に要約した(図2、右のパネル)。一般に、C末端領域からのタウペプチド免疫原構築物に由来する抗体は、N末端領域からのものに対してさらに高い優先的結合特性を持つ抗体を導出することができた(データは示さず)。

0147

実施例5
非リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体はタウの凝集を阻害する
a.免疫及びタウへの曝露
実施例1に記載されているような非リン酸化タウ免疫原構築物(配列番号52、54、56、58、61、63、65、67、69、及び71)または実施例2に記載されているようなリン酸化タウ免疫原構築物(配列番号51、53、55、57、60、62、64、66、68、及び70)のいずれかを動物に免疫した。

0148

次いで、免疫から生成した抗体を、タウの凝集を促進する条件下で市販の完全長タウ441組換えタンパク質を含有する試料に曝露した。タウ441βシート原線維は、10単位/mLのヘパリンによって37℃で7日間、100μLの1×PBSにて凝集させた60μgのタウを使用して生成し、次いで4℃にて300kDaカットオフのフィルター(Pall)に移し、βシート原線維を単離した。これらの凝集はチオフラビン−T(ThT,Sigma)蛍光によって検証した。

0149

タウは、タウペプチド免疫原構築物から導出されたIgG抗体の有無にかかわらず5μMの濃度でのヘパリンによって200μLのPBS緩衝液にて3日間で凝集した。遠心分離(13,000×g、4℃、30分)の後、タウ凝集体を回収し、ThTアッセイで確認した。

0150

b.結果
図3Aは、各グラフの上で示すリン酸化タウペプチド免疫原構築物に向けられた抗体の存在下での完全長タウ(タウ441)凝集のレベルを示すグラフを含有する。図3Aに示す点線は免疫前IgGを用いてタウの凝集を評価した対照試料を表す。結果は、リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体のすべてが免疫前血清対照試料と比べてタウの凝集を阻害したことを示している。抗体は様々な比率でタウの凝集を阻害することができた。

0151

図3Bは、棒グラフの下で示す非リン酸化タウペプチド免疫原構築物に向けられた抗体の存在下での凝集体のThT染色によって完全長タウ(タウ441)の凝集のレベルを定量化している。結果は、非リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体が免疫前血清対照試料と比べてタウの凝集を阻害したことを示している。抗体は様々な比率でタウの凝集を阻害することができた。

0152

結果は、タウのC末端領域にさらに近接するB細胞エピトープを有するタウペプチド免疫原構築物を用いた場合、タウの重合でさらに大きな抗凝集能力があることを示唆している。

0153

実施例6
タウペプチド免疫原に向けられた抗体はタウの凝集を阻害する
a.免疫及びタウへの曝露
実施例1に記載されているように非リン酸化タウ免疫原構築物を動物に免疫した。実施例2に記載されているようにリン酸化タウ免疫原構築物も動物に免疫した。

0154

次いで、免疫から生成された抗体を、(a)過剰リン酸化タウとしてのオカダ酸(OKA)で処理した神経細胞(SH−SY5Y細胞)、または(b)非リン酸化タウとしてのOKA処理していない神経細胞に由来する細胞溶解物に曝露した。wpi6及びwpi9での抗血清の存在下で100nMの最終濃度までOKAを培地に3時間加えてタウの凝集に対する阻害における抗血清の効果の用量依存性効果を測定した。

0155

b.結果
図4は、各グラフの上に示すタウペプチド免疫原に向けられた抗体への曝露後の種々の溶解物のタウ凝集のレベルを示すグラフを含有する。タウ凝集のレベルは凝集体のThT染色によって測定された。再び、リン酸化タウペプチド免疫原構築物または非リン酸化タウペプチド免疫原構築物の双方に由来する抗体はタウの凝集を阻害することができたが、それは前の実施例に記載されている血清学的な解析と一致する。

0156

結果は、タウの中央領域及びC末端領域に由来するタウエピトープによるタウの重合に対するさらに大きな抗凝集能力があることを示唆している。

0157

実施例7
タウペプチド免疫原に向けられた抗体への曝露後の予め形成されたタウ凝集体の脱凝集
a.免疫及び予め形成されたタウ凝集体への曝露
実施例1に記載されているように非リン酸化タウ免疫原構築物を動物に免疫した。実施例2に記載されているようにリン酸化タウ免疫原構築物も動物に免疫した。

0158

免疫から生成した抗体を次いで、予め形成されたタウ原線維に曝露した。次いで、予め形成されたタウ凝集体を、モルモット抗血清から精製した抗p−タウ抗体または抗非p−タウ抗体のいずれかと共にまたはそれを含まずに2日間及び4日間インキュベートした。インキュベートの後、4℃での30分間の13,000×gの遠心分離後、凝集体を回収し、次いでThTアッセイによって定量した。

0159

b.結果
図5は、図5(右のパネル)の上に示すように、タウペプチド免疫原(配列番号66及び67の代表的なペプチド構築物)に向けられた抗体への曝露後のタウの脱凝集のレベルを示すグラフを含有する。タウ凝集のレベルはThT染色及びウエスタンブロットによって測定した。

0160

ウエスタンブロット及びThTアッセイ双方のデータは、配列番号67及び66からそれぞれ導出された抗非p/p−タウ379−408IgGが組換えタウ原線維の凝集を壊す能力を有することを示している。

0161

実施例8
リン酸化タウペプチド免疫原構築物及び非リン酸化タウペプチド免疫原構築物の双方によって生成された代表的な抗体によるタウの原線維、オリゴマー及び単量体の非変性形態の特異的な結合についてのドットブロット解析
a.免疫、抗タウ抗体の結合特性のウエスタンブロット解析及びドットブロット解析
実施例1に記載されているように非リン酸化タウ免疫原構築物を動物に免疫した。実施例2に記載されているようにリン酸化タウ免疫原構築物も動物に免疫した。

0162

タウタンパク質の様々な種(すなわち、αらせん単量体、βシート単量体、βシートオリゴマー及びβシート原線維)を実施例5に記載されているように調製した。様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗p−タウ抗体または抗非p−タウ抗体を一次抗体として用いてタウタンパク質の様々な種によるウエスタンブロット及びドットブロットのアッセイを行った。βシートの原線維、オリゴマー、単量体、αらせん単量体、及び他の対照試薬厳格な特異的対照のためにブロット上でドットにした。血清学的な検査及び評価のためのこれらの試薬の調製についての詳細な手順は実施例11にてさらに記載されている。

0163

b.結果
図6(左のパネル)は、タウペプチド免疫原(配列番号59、66及び70)によって作られた抗p−タウIgG及びタウペプチド免疫原(配列番号67)によって作られた抗非p−タウIgGのウエスタンブロット解析(変性条件下)を含有する。ウエスタンブロットの結果はタウのC末端に向けられた抗p−タウIgGが高分子量のタウ凝集体を特異的に認識するが、タウ単量体を認識しないことを示している。

0164

図6(右のパネル)は、配列番号66及び67のタウペプチド免疫原によってそれぞれ作られた抗p−タウIgG及び抗非p−タウIgGのドットブロット解析(非変性条件下)を含有する。結果は、抗非p−/p−タウ379−408IgGは双方ともタウの種々の形態に対して特異的な結合を有するが、他のアミロイド生成性タンパク質(すなわち、Aβ1−42及びアルファシヌクレイン)に対しては有さないことを示している。また、モノクローナル抗体Mabタウ5及びタウの非C末端領域に対する別のIgGと比べると、本発明(それぞれ配列番号66及び67)に由来する抗p/抗非p−タウ379−408IgGは単量体ではなく原線維及びオリゴマーに対して高い親和性を有する。さらに、抗p−タウ379−408IgGはβシート単量体には結合しない。

0165

実施例9
タウペプチド免疫原に向けられた抗体の組織結合特性
a.免疫及び組織染色
実施例1に記載されているように非リン酸化タウ免疫原構築物を動物に免疫した。実施例2に記載されているようにリン酸化タウ免疫原構築物も動物に免疫した。

0166

次いで、免疫から生成された抗体を用いて健常(正常)な脳及びアルツハイマー病(AD)の脳に由来する組織を染色した。ヒト組織のパネル(Pantomics)をキシレン脱パラフィン化し、エタノール再水和し、次いでPBS中にて0.5%のCaCl2を伴った0.25%トリプシン溶液で30分間処理し、メタノール中1%の過酸化水素にてインキュベートして内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした後、PBS中10%のBlockAce(Sigma)と共にインキュベートし、その後、組織に抗タウ349−408(配列番号66または67)または免疫前血清のいずれかを適用した。切片を3,3’ジアミノベンジジン(DAB)で発色させ、ヘマトキシリン対比染色した後、顕微鏡で調べた。

0167

b.結果
図7はこの実験染色画像を示す。非リン酸化タウ379−408(配列番号67)及びリン酸化タウ379−408(配列番号66)に向けられた抗体は正常組織に由来する切片と交差反応性を有さなかったが、アルツハイマー病の脳組織と交差反応性だった。リン酸化ペプチド(配列番号66)に向けられた抗体はADの脳の海馬領域にてさらに強い結合を示した。

0168

実施例10
タウペプチド免疫原構築物によって導出された抗体及びその製剤:外来性タウ原線維によって誘発される神経変性の軽減に対する神経保護効果
様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体の神経保護効果を評価するために、NGF処理した神経分化したPC12細胞における外来性で予め形成されたタウ凝集体による試験管内での神経変性モデルを採用した。

0169

PC12細胞をNGF(100ng/mL)で6日間処理して神経分化を誘導した。神経分化した細胞の形態をcell3 iMager duos高処理能力画像化システム(Screen)によって確認し、解析した。フルオレセイン色素を用いて細胞死を標識し、細胞数ソフトウェアを用いて細胞を数えた。タウペプチド免疫原構築物によって導出された抗体は細胞に入り、タウ凝集体に結合することができた(データは示さず)。NGFの神経栄養効果は神経突起伸長に反映し、神経分化した細胞の数を定量した。神経突起伸長のレベル及び神経分化した細胞の数を基準化した後、比率(平均値±SEM)で示した。NGF処理を伴った及びNGF処理を伴わないPC12細胞の神経突起の長さをそれぞれ100%及び0%として解釈した。NGF処理の6日間での神経分化したPC12細胞の数を100%に基準化した。

0170

37℃で1週間ヘパリンによって処理した外来性の予め形成されたタウ凝集体を神経分化したPC12細胞に加えることによって神経変性を観察した。予め形成されたタウ凝集体の存在下で、神経分化したPC12細胞では神経突起の長さは短縮し、細胞の数は減少した。このタウ原線維が推進した神経変性は加えた外来性のタウ凝集体の量に濃度依存性に比例した。市販の抗タウ抗体(たとえば、Mabタウ5及びMabタウ46)はタウ原線維が推進する神経変性を減弱したが、無感作のモルモットから精製した抗体は減弱しなかった。このモデルをスクリーニングプラットフォームとして採用して、様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体のどれが濃度依存性に神経細胞の生存を回復することにて神経保護効果を持つのかを同定した(図8A及びB)。

0171

その結果、過半数の様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体が神経突起成長復元した。以前最適化した濃度である5ug/mLでタウ原線維を提供して病変を引き起こした(図8A)。リン酸化タウペプチド構築物または非リン酸化タウペプチド構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体は神経分化したPC12細胞をタウ原線維が引き起こす神経細胞死から保護した。図8Bは、配列番号65、67及び69による免疫から得られた抗非p−タウ抗体からのデータを示す。

0172

図8A及び図8Bからの結果は、抗タウ抗体(配列番号65、67及び69)はタウ原線維の神経毒性に対して神経細胞を保護することができることを実証している。タウペプチド免疫原構築物(配列番号65、67及び69)によって導出された抗タウ抗体の抗神経変性効果が観察され、培養にて生き残った細胞の数についてのCell3 Imager duosソフトウェア(Miteklab)による計算を介してそれを定量した。

0173

試験管内の機能的アッセイの評価を介した抗タウ抗体の神経保護に関して、Yanamandra,K,et al.(Neuron,80:402−414,2013)によって報告されたように、試験管内でのタウ凝集のシーディングは生体内で病変を顕著に減らし、認知力を改善することができたことが示されている。タウ単量体は元々構造化されていないと考えられており、タウの凝集及び関連する細胞の細胞傷害性にて大した機能的役割を有さないかもしれない。最近の知見は、病的な凝集の開始はタウ単量体の不活性形態から凝集核成分の形態への変換で始まり得ることを示している(Mirbaha,H.,et al.,eLife,2018;7:e36584;doi:10.7554/eLife.36584)。これらの知見に基づいて、我々は、シーディング活性を低下させるその能力についてタウペプチド免疫原構築物によって導出した抗タウ抗体を試験した。具体的には、タウペプチド免疫原構築物に向けられた抗タウ抗体をアルツハイマー病(AD)患者に由来する脳ホモジネートと共にインキュベートし、これらの抗体がそのようなシーディング活性を低下させる能力を有することを見いだした(データは示さず)。我々の広範なタウ免疫原の設計、免疫原性解析及び血清学的な解析は、深刻なタウオパチーの治療のための分子レベル及び血清学レベル双方でワクチンとしての神経保護介入の開発を促進している。

0174

実施例11
追加の血清学的アッセイ及び試薬
合成ペプチド構築物及びその製剤の機能的な免疫原性を評価するための血清学的なアッセイ及び試薬が以下で詳細に記載されている。

0175

a.B細胞エピトープクラスターペプチドに基づくELISA検査によるタウ断片に対する詳細な特異性解析及びエピトープマッピング
免疫した宿主における抗タウ抗体の詳細な特異性解析はエピトープマッピングによって判定した。手短には、ウェル当たり0.1mL当たり0.5μgでのマッピングされるタウ275−311領域(配列番号19)に由来する個々のタウ断片ペプチド(配列番号115及び156〜171)によって96ウェルプレートのウェルをコーティングし、次いで2つ組にて100μLの血清試料(PBSにて1:100希釈)をプレートのウェルにてインキュベートし、それに上記に記載されている抗体ELISA法の工程が続いた。タウペプチド免疫原構築物のB細胞エピトープ及び免疫した宿主における免疫血清の抗タウ抗体の関連する詳細な特異性解析も、追加の反応性及び特異性の確認のために、スペーサー及びTh配列を含まない対応するタウペプチド(たとえば、表1に示すような配列番号1〜21及び101〜124、表4〜7に示すような配列番号72〜99、及び表8に示すような配列番号100)で試験した。

0176

b.免疫原性の評価
実験的免疫プロトコールに従って、動物に由来する免疫前血清及び免疫血清の試料を採取し、56℃で30分間加熱して血清の補体因子不活化した。タウペプチド免疫原構築物の投与に続いて、プロトコールに従って血液試料入手し、特異的な標的部位(複数可)に対するその免疫原性を評価した。連続希釈した血清を試験し、陽性の力価を希釈率逆数のLog10として表した。特定のタウペプチド免疫原構築物の免疫原性は、所望のB細胞反応の増強を提供するために採用される「ヘルパーT細胞エピトープ」に向けた低い抗体の反応性から無視できる抗体の反応性を維持する一方で、標的抗原の範囲内で所望のエピトープ特異性に対して向けられた高い力価のB細胞抗体反応を引き出すその能力によって評価した。

0177

c.組換えタウタンパク質によるタウ凝集体(二量体、三量体、オリゴマー、及び原線維)の調製
凝集したタウを調製するために、100μLのPBS/KCl凝集緩衝液(1×PBSにおける2.5mMのMgCl2、50mMのHEES及び150mMのKCl、pH7.4)における精製した組換えタウタンパク質(0.1μg/mL)を1.5mLのエッペンドルフチューブにて37℃で振盪することなくサーモミキサー(Eppendorf)内で7日間インキュベートした。凝集したタウを直ちに−80℃で後の使用まで凍結した。

0178

d.抗タウ抗体の精製
様々な配列(配列番号51〜71及び125〜155)のペプチドを含有するタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの最初の免疫の3〜15週後(wpi)で採取した血清からアフィニティーカラム(Thermo Scientific,Rockford)を使用することによって抗タウ抗体を精製した。手短には、緩衝液(0.1Mのリン酸塩及び0.15Mの塩化ナトリウム、pH7.2)の平衡化の後、400μLの血清をNab Protein G Spinカラムに加え、それに10分間の転倒混合及び5,800×gでの1分間の遠心分離が続いた。カラムを結合緩衝液(400μL)で3回洗浄した。続いて、溶出緩衝液(400μL、0.1Mのグリシン、pH2.0)をスピンカラムに加え、5,800×gで1分間遠心分離した後、抗体を溶出した。溶出した抗体を中和緩衝液(400μL、0.1Mのトリス、pH8.0)と混合し、BSA(ウシ血清アルブミン)を標準としてNan−Dropを用いてOD280にてこれらの精製した抗体の濃度を測定した。

0179

e.様々なサイズの様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体の特異性
様々なサイズのタウ分子複合体に対する結合特異性について、ウエスタンブロットを用いて、様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体を選別した。タウの種々の形態(20μM)を12%トリス・グリシンSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース(NC)膜に移した後、光誘導の架橋(PICUP)処理を行った。モルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体1μg/mLと共に膜をインキュベートし、次いでロバ抗モルモット抗体を結合したHRP(706−035−148,Jackson)と共にインキュベートした。化学発光試薬Western LightningECLPro(PerkinElmer)によってブロットを可視化した。単量体タウが60kDa前後のサイズでブロットした一方で、二量体、三量体またはオリゴマーは単量体タウよりも数倍大きい各分子量を有した。たとえば、二量体、三量体及びさらに大きなオリゴマーのような種々のオリゴマー種を検出することができる市販の抗体、たとえば、Mabタウ5またはMabタウ46を陽性対照として採用した。

0180

f.アミロイド生成性タンパク質の様々な種によるドットブロットアッセイ
Aβ1−42、タウ及びα−Synのαらせん単量体、βシート単量体、βシートオリゴマー、及びβシート原線維の調製を以下のように説明する。
1.Aβ1−42α−らせん単量体:20%のトリフルオロ酢酸と20%のヘキサフルオロイソプロパノール(10μL)とを含有する1×PBSに20μgのAβ1−42βシート単量体(50μL)を加え、4℃で24時間インキュベートしてα−らせん単量体を形成した。
2.Aβ1−42βシート単量体:37℃で24時間凝集させた5%TFAを含有する120μLの1×PBSにおける60μgのAβ1−42を10kDaカットオフのフィルター(Millipore)に移し、βシート単量体を回収した。
3.Aβ1−42βシートオリゴマー:37℃で3日間凝集させた120μLの1×PBSにおける60μgのAβ1−42を上で超音波処理し、10及び30kDaカットオフのフィルター(Millipore)に移し、35kDa未満のβシートオリゴマー原線維を回収した。
4.Aβ1−42βシート原線維:37℃で3日間凝集させた120μLの1×PBSにおける60μgのAβ1−42を氷上で超音波処理し、30kDaカットオフのフィルター(Millipore)に移し、βシート原線維を単離した。
5.α−Synαらせん単量体:40μgの新しく調製したα−Synを4℃にて低温の100μLの1×PBSに溶解し、直ちに10kDaカットオフのフィルター(Millipore)に移し、αらせん単量体を回収した。
6.α−Synβシート単量体:37℃で24時間100μLのPBS/KCl緩衝液にてインキュベートした40μgのα−Synを10kDaカットオフのフィルター(Millipore)に移し、βシート単量体を回収した。
7.α−Synβシートオリゴマー:37℃で8日間100μLのPBS/KCl緩衝液にて凝集させた40μgのα−Synを氷上で超音波処理し、次いで30及び100kDaカットオフのフィルターに移し、βシートオリゴマーを回収した。
8.α−Synβシート原線維:37℃で8日間100μLのPBS/KCl緩衝液にて凝集させた40μgのα−Synを氷上で超音波処理し、次いで30及び100kDaカットオフのフィルターに移し、βシート原線維を単離した。
9.タウ441αらせん単量体:4℃にて100μLの1×PBSで調製した60μgのタウを100kDaカットオフに移してαらせん単量体を回収した。
10.タウ441βシート単量体:25℃で48時間10単位/mLのヘパリンによって100μLの1×PBSにて凝集させた60μgのタウを4℃で100kDaカットオフのフィルターに移し、βシート単量体を回収した。
11.タウ441βシートオリゴマー:37℃で48時間10単位/mLのヘパリンによって100μLの1×PBSにて凝集させた60μgのタウを4℃で100及び300kDaカットオフのフィルター(Pall)に移し、βシートオリゴマーを回収した。
12.タウ441βシート原線維:37℃で6日間10単位/mLのヘパリンによって100μLの1×PBSにて凝集させた60μgのタウを4℃で300kDaカットオフのフィルター(Pall)に移し、βシート原線維を単離した。

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