図面 (/)

技術 シヌクレイノパチーの治療のためのアルファ−シヌクレインタンパク質のC末端からのペプチド免疫原及びその製剤

出願人 ユナイテッド ニューロサイエンス
発明者 ワン、チャンイ
出願日 2018年6月15日 (3年0ヶ月経過) 出願番号 2020-519016
公開日 2021年3月11日 (3ヶ月経過) 公開番号 2021-508672
状態 未査定
技術分野 ペプチド又は蛋白質 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード シートα ランウェイ フィルタートラップ 中央領 シート繊維 相対的感度 リボン形 平均電荷
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2021年3月11日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題・解決手段

本開示は、アルファシヌクレイン(αSyn)ペプチド免疫原コンストラクト、コンストラクトを含む組成物、コンストラクトにより誘発される抗体、ならびにコンストラクト及びその組成物を作製及び使用する方法に関する。開示されるαSynペプチド免疫原コンストラクトは、異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して連結されたαSynからのB細胞エピトープを含む。ペプチド免疫原コンストラクトのB細胞エピトープ部分は、全長αSynの111位のグリシン(G111)近辺から(135)位のアスパラギン(D135)近辺までの配列に対応するαSynの約(10)から約(25)アミノ酸残基を含む。α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、モノマーオリゴマー、及び原線維としてのαSynのベータシート交差反応する非常に特異的な抗体の生成を刺激するが、αSynの天然アルファヘリックスと交差反応するものを刺激せず、シヌクレイノパチーリスクがある宿主への治療性免疫応答を提供する。

概要

背景

シヌクレインタンパク質ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/Synucleinにおいて概説される)は、主に神経組織及び特定の腫瘍発現する脊椎動物に共通の可溶性タンパク質ファミリーである。シヌクレインファミリーには、3つの既知タンパク質アルファ−シヌクレイン(ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/Alpha-synucleinにおいて概説される)、ベータ−シヌクレイン(ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/Beta-synucleinにおいて概説される)、及びガンマ−シヌクレインが含まれる。すべてのシヌクレインは、交換可能なアポリポタンパク質クラスA2脂質結合ドメイン類似性のある、高度に保存されたアルファヘリックス脂質結合モチーフ共有している。一部のデータは膜安定性及び/または代謝回転の調節における役割示唆しているが、正常な細胞機能はシヌクレインタンパク質のいずれについても決定されていない。

全長アルファ−シヌクレインタンパク質(α−Syn)は140アミノ酸のタンパク質(受託番号NP_000336)であり、SNCA遺伝子によってコードされている。選択的スプライシングにより、少なくとも3つのα−Synのアイソフォームが生成される。主な形態は、完全長のタンパク質である。他のアイソフォームは、エクソン3の喪失により残基41〜54が欠如しているα−Syn−126、及びエクソン5の喪失により残基103〜130が欠如しているα−Syn−112である。

α−Synの一次構造は、通常3つの異なるドメインに分けられる:(1)残基1〜60:アポリポタンパク質結合ドメインに類似した構造的アルファヘリックス傾向を有するコンセンサス配列KTKEGVを含む4つの11残基リピートが支配的な両親媒性N末端領域;(2)残基61〜95:タンパク質凝集関与する非アミロイドβコンポーネント(NAC)領域を含む中央の疎水性領域;(3)残基96〜140:明確な構造的傾向を有さない高酸性プロリン富む領域。NAC領域の35アミノ酸のα−Synフラグメントは、アミロイドに富む画分にAβとともに存在することが発見された。NACは、その前駆体タンパク質である、現在ヒトのα−Synと呼ばれる、ゴマシビレエイ(Torpedo californica)からのシヌクレインの全長ヒト相同体であると後に決定された、NACPのフラグメントであることが後に示された。

HPLCで精製されたα−Synのin vitroでの高分解能イオン移動度質量分析IMS−MS)の使用により、α−Synが自己タンパク質分解性(自己タンパク質分解性)であり、インキュベーション時にさまざまな低分子量フラグメントを生成することが示された。14.46kDaの完全長タンパク質は、C末端及びN末端の短縮化によって形成される12.16kDaフラグメント(アミノ酸14〜133)及び10.44kDaフラグメント(アミノ酸40〜140)、ならびに7.27kDaフラグメント(アミノ酸72〜140)を含む多数の小さなフラグメントを生成することが見出された。NAC領域の大部分を含む7.27kDaフラグメントは、全長α−Synよりもかなり速く凝集することが示された。これらの自己タンパク質分解性産物は、α−Synの凝集における中間体または補因子としての役割を果たす可能性がある。

α−Synは、ヒトの脳で豊富であり、脳及びグリア細胞細胞質にあるすべてのタンパク質の1%を占めている。α−Synは、新皮質海馬歯状回嗅球線条体視床、及び小脳で広く発現している。また、B細胞、T細胞、及びNK細胞、ならびに単球及び血小板を含む造血細胞でも高度に発現している。少量のα−Synが心臓筋肉、及びその他の組織で見出される。脳では、α−Synは主にシナプス前終末と呼ばれる特殊な構造の神経細胞ニューロン)の先端に見出される。これらの構造内で、α−Synはリン脂質及びタンパク質と相互作用する。シナプス前終末は、シナプス小胞として知られているコンパートメントから、ドーパミンなどの神経伝達物質と呼ばれる化学メッセンジャーを放出する。神経伝達物質の放出は、ニューロン間の信号を中継し、認知を含む正常な脳機能にとって重要である。

溶液中のα−Synは、単一の安定した3D構造を欠いているという点で、天然変性タンパク質であると考えられている。α−Synはチューブリンと顕著に相互作用し、α−Synはタウのような潜在的な微小管関連タンパク質としての活性を持つ可能性があることが示されている。α−Synは古典的に非構造化可溶性タンパク質であると考えられてきたが、非変異α−Synは凝集に抵抗する安定に折り畳まれた四量体を形成する。それにもかかわらず、α−Synは凝集して、レビー小体を特徴とする病態において不溶性原線維を形成し得る。これらの障害シヌクレイノパチー(ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/Synucleinopathiesにおいて概説される)として知られている。

シヌクレイノパチーは、共通の病理学的特徴を共有する神経変性障害の多様なグループであり、神経病理学的検査では、不溶性のα−Synの異常な凝集体を含む特徴的な病変が、ニューロン及びグリア細胞の選択的脆弱集団に存在する。最も一般的なシヌクレイノパチーには、パーキンソン病(PD)、認知症を伴うパーキンソン病(PDD)、及びレビー小体を伴う認知症(DLB)などのレビー小体障害(LBD)、ならびに多系統萎縮症(MSA)または脳鉄蓄積型I(NBIAタイプI)の神経変性が含まれる。これらの疾患の現在の治療選択肢には、L−ドーパなどの対症療法薬、抗コリン薬、及びモノアミンオキシダーゼ阻害薬が含まれる。しかしながら、現在のすべての治療の機会は、症候性緩和につながるだけであり、患者に長期にわたる疾患修飾効果を誘発するものではない。

LBDは、振戦硬直運動緩慢、及び脳内のドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする進行性の神経変性障害である。DLB及びPDDの場合、兆候には認知障害も含まれる。西欧諸国の60を超える人口の2%までがPD/LBDの典型的な兆候を示す。遺伝的感受性環境因子が疾患の発症に関与しているらしい。この疾患に苦しむ患者は、特にドーパミン作動性ニューロンまたはニューロン突起含有量が高い領域の脳の皮質及び皮質下領域に、レビー小体(LB)と呼ばれる特徴的な細胞内封入体発達させる。LBDでは、α−Synは影響を受ける脳領域全体のLBに蓄積する。さらに、α−Syn遺伝子の単一の点変異、及び重複または増殖は、まれな家族型パーキンソン症候群と関連していることが実証できた。

多系統萎縮症(MSA)は、L−ドーパ抵抗性パーキンソン症候群、小脳性運動失調、及び自律神経障害の症状を特徴とする散発性の神経変性障害である。線条体、黒質、小脳、脳橋、ならびに下オリーブ核、及び脊髄を含むさまざまな脳領域で、多系統の神経損失に苦しむ患者が影響を受ける。MSAは、α−Syn陽性グリア細胞質(GCI)及び中枢神経系全体のまれな神経細胞封入体を特徴とする。

さまざまな神経軸索ジストロフィーなどのその他のまれな障害にもα−Syn病態があり、α−Synはレビー小体原線維の主要な構造成分である。しばしば、レビー小体にはタウタンパク質が含まれるが、α−Synとtauは、同一の封入体内のフィラメントの2つの特徴的なサブセットを構成する。α−Syn病理は、アルツハイマー病の散発性と家族性の両方の症例でも見出される。

α−Synの凝集メカニズムは不明である。単量体のα−Synは溶液中において自然に折り畳み構造がほどけるが、αヘリカルの形態で膜に結合することもできる。折り畳み構造がほどけた単量体は、最初に凝集してβ−シートのような相互作用によって安定化できる小さなオリゴマー種になり、次に高分子量の不溶性原線維になる。α−Synは、非構造、アルファヘリックス、及びベータシートに富む配座異性体平衡状態にある混合物として存在する。凝集を改善することが知られている変異または緩衝液条件は、ベータ配座異性体の集団を強く増加させ、したがって、これが病原性凝集に関連する立体配座である可能性を示唆している。凝集、そして最終的にはレビー小体の前駆体となり得るベータ構造に富んで構造化された中間体の証拠が存在する。

(1)1つ以上のキナーゼによるリン酸化;(2)カルパインなどのプロテアーゼによる短縮化;及び(3)炎症中に存在する一酸化窒素(NO)または他の反応性窒素種によるニトロ化を含む、いくつかの生理学要因がα−Synを修飾し、凝集体の形成をもたらす可能性がある。ERゴルジ輸送、シナプス小胞、ミトコンドリアリソソーム、及びその他のタンパク質分解機構は、そのような凝集によるα−Syn媒介毒性に関連する提案された細胞標的の一部である。

シヌクレイノパチーを治療する戦略には、α−Synの凝集を阻害する化合物がある。低分子クミンアルデヒドは、α−Synのフィブリル化を阻害することが示されている。低分子療法に加えて、最近の報告は、α−Syn凝集体が免疫療法の標的となる可能性があることを示唆している(Lee JS and Lee S−J, 2016の総説)。しかしながら、この報告では、(1)α−Synの正常な生理学的機能への潜在的な干渉;(2)脳実質への抗体薬送達の困難性;及び(3)免疫療法の有効性を含む、α−Syn免疫療法の開発に伴ういくつかの潜在的な問題または課題を指摘している。

現在まで、シヌクレイノパチーを患っている患者の費用効果の高い治療のための部位特異的ペプチド免疫原及びその製剤を開発する必要性はまだ満たされていない。

参照文献:
1. ”Alpha-synuclein,”Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Alpha-synuclein&oldid=781366541(2017年5月30日にアクセスされた).
2. ”Synucleinopathies,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Synucleinopathies&oldid=686287116(2017年5月30日にアクセスされた).
3. ”Beta-synuclein,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Beta-synuclein&oldid=763171134(2017年5月30日にアクセスされた).
4. ”Synucleinopathies,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Synucleinopathies&oldid=686287116(2017年5月30日にアクセスされた).
5.LEE, J.S., et al., “Mechanism of Anti-α-synuclein Immunotherapy”,J./Mov Disord:, 9(1): 14-19(2016)
6. TRAGGIAI, E., et al.“An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells:potent neutralization ofSARS coronavirus”, Nat Med:, 10(8):871-875(2004)
7.WANG, C., et al.“Versatile Structures of α-Synuclein”, Front Mol Neurosci.9:48(2016)

概要

本開示は、アルファ−シヌクレイン(αSyn)ペプチド免疫原コンストラクト、コンストラクトを含む組成物、コンストラクトにより誘発される抗体、ならびにコンストラクト及びその組成物を作製及び使用する方法に関する。開示されるαSynペプチド免疫原コンストラクトは、異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して連結されたαSynからのB細胞エピトープを含む。ペプチド免疫原コンストラクトのB細胞エピトープ部分は、全長αSynの111位のグリシン(G111)近辺から(135)位のアスパラギン(D135)近辺までの配列に対応するαSynの約(10)から約(25)アミノ酸残基を含む。α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、モノマー、オリゴマー、及び原線維としてのαSynのベータシートと交差反応する非常に特異的な抗体の生成を刺激するが、αSynの天然のアルファヘリックスと交差反応するものを刺激せず、シヌクレイノパチーのリスクがある宿主への治療性免疫応答を提供する。

目的

それらの独特の特徴及び特性に基づいて、開示される抗体は、シヌクレイノパチーの標的化、同定、及び治療に対する免疫療法的アプローチを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

アルファシヌクレイン(α−Syn)ペプチド免疫原コンストラクトであって、配列番号1のアミノ酸G111近辺からアミノ酸D135近辺までに対応するα−SynのC末端フラグメントからの約10から約25アミノ酸残基を含む、B細胞エピトープと;配列番号70〜98からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTヘルパーエピトープと;アミノ酸Lys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α,ε−N)Lys、及びε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号148)からなる群から選択される必要に応じた異種スペーサーと、を含み、前記B細胞エピトープが、前記Tヘルパー細胞エピトープに直接または前記必要に応じた異種スペーサーを介して共有結合している、前記α−Synペプチド免疫原コンストラクト。

請求項2

前記B細胞エピトープが、配列番号12〜15、17、及び49〜63からなる群から選択される、請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

請求項3

前記Tヘルパーエピトープが、配列番号81、83、及び84からなる群から選択される、請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

請求項4

前記必要に応じた異種スペーサーが、(α,ε−N)Lysまたはε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号148)である、請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

請求項5

前記Tヘルパーエピトープが、前記B細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

請求項6

前記Tヘルパーエピトープが、前記B細胞エピトープのアミノ末端に前記必要に応じた異種スペーサーを介して共有結合している、請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

請求項7

以下の式:(Th)m−(A)n−(α−SynのC末端フラグメント)−Xまたは(α−SynのC末端フラグメント)−(A)n−(Th)m−Xを含み、式中、Thは前記Tヘルパーエピトープであり、Aは前記異種スペーサーであり、(α−SynのC末端フラグメント)は、前記B細胞エピトープであり、Xはアミノ酸のα−COOHまたはα−CONH2であり、mは、1から約4であり、nは1から約10である、請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

請求項8

配列番号107、108、111〜113、及び115〜147からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

請求項9

配列番号107、108、及び111〜113からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

請求項10

請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む、組成物

請求項11

1を超える請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む、組成物。

請求項12

前記α−Synペプチド免疫原コンストラクトが配列番号112及び113のアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の組成物。

請求項13

請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト及び薬学的に許容される送達媒体及び/またはアジュバントを含む医薬組成物

請求項14

a.前記α−Synペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号107、108、111〜113、及び115〜147からなる群から選択され、b.前記アジュバントが、Al(OH)3またはAlPO4からなる群から選択されるアルミニウム無機塩である、請求項13に記載の医薬組成物。

請求項15

a.前記α−Synペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号107、108、111〜113、及び115〜147からなる群から選択され、b.前記α−Synペプチド免疫原コンストラクトがCpGオリゴデオキシヌクレオチドODN)と混合されて、安定化された免疫刺激複合体を形成する、請求項13に記載の医薬組成物。

請求項16

請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクトの前記B細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント

請求項17

前記α−Synペプチド免疫原コンストラクトに結合した、請求項16に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

請求項18

請求項9に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクトの前記B細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

請求項19

請求項16に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む組成物。

請求項20

請求項18に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む組成物。

請求項21

a.配列番号112のB細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと、b.配列番号113のB細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと、の混合物を含む、請求項20に記載の組成物。

請求項22

宿主においてα−Synを認識する抗体を産生する方法であって、請求項1に記載のα−Synペプチド免疫原と送達媒体及び/またはアジュバントとを含む組成物を前記宿主に投与することを含む、前記方法。

請求項23

動物のα−Syn凝集阻害する方法であって、薬理学的に有効な量の請求項1のα−Synペプチド免疫原を前記動物に投与することを含む、前記方法。

請求項24

動物のα−Syn凝集体の量を低減する方法であって、薬理学的に有効な量の請求項1のα−Synペプチド免疫原を前記動物に投与することを含む、前記方法。

請求項25

生体試料中の異なるサイズのα−Syn凝集体を同定する方法であって、a.生体試料を、請求項16に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが前記α−Syn凝集体に結合することを可能にする条件下で曝露することと、b.前記生体試料中の前記α−Syn凝集体に結合した前記抗体またはそのエピトープ結合断片の量を検出することと、を含む、前記方法。

技術分野

0001

本出願は、2017年6月16日に出願された米国仮出願第62/521,287号の権益を主張するPCT国際出願であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

0002

本開示は、シヌクレイノパチー治療のためのアルファシヌクレイン(α−Syn)タンパク質C末端に基づくペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤に関する。

背景技術

0003

シヌクレインタンパク質ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/Synucleinにおいて概説される)は、主に神経組織及び特定の腫瘍発現する脊椎動物に共通の可溶性タンパク質ファミリーである。シヌクレインファミリーには、3つの既知のタンパク質:アルファ−シヌクレイン(ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/Alpha-synucleinにおいて概説される)、ベータ−シヌクレイン(ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/Beta-synucleinにおいて概説される)、及びガンマ−シヌクレインが含まれる。すべてのシヌクレインは、交換可能なアポリポタンパク質クラスA2脂質結合ドメイン類似性のある、高度に保存されたアルファヘリックス脂質結合モチーフ共有している。一部のデータは膜安定性及び/または代謝回転の調節における役割示唆しているが、正常な細胞機能はシヌクレインタンパク質のいずれについても決定されていない。

0004

全長アルファ−シヌクレインタンパク質(α−Syn)は140アミノ酸のタンパク質(受託番号NP_000336)であり、SNCA遺伝子によってコードされている。選択的スプライシングにより、少なくとも3つのα−Synのアイソフォームが生成される。主な形態は、完全長のタンパク質である。他のアイソフォームは、エクソン3の喪失により残基41〜54が欠如しているα−Syn−126、及びエクソン5の喪失により残基103〜130が欠如しているα−Syn−112である。

0005

α−Synの一次構造は、通常3つの異なるドメインに分けられる:(1)残基1〜60:アポリポタンパク質結合ドメインに類似した構造的アルファヘリックス傾向を有するコンセンサス配列KTKEGVを含む4つの11残基リピートが支配的な両親媒性N末端領域;(2)残基61〜95:タンパク質凝集関与する非アミロイドβコンポーネント(NAC)領域を含む中央の疎水性領域;(3)残基96〜140:明確な構造的傾向を有さない高酸性プロリン富む領域。NAC領域の35アミノ酸のα−Synフラグメントは、アミロイドに富む画分にAβとともに存在することが発見された。NACは、その前駆体タンパク質である、現在ヒトのα−Synと呼ばれる、ゴマシビレエイ(Torpedo californica)からのシヌクレインの全長ヒト相同体であると後に決定された、NACPのフラグメントであることが後に示された。

0006

HPLCで精製されたα−Synのin vitroでの高分解能イオン移動度質量分析IMS−MS)の使用により、α−Synが自己タンパク質分解性(自己タンパク質分解性)であり、インキュベーション時にさまざまな低分子量フラグメントを生成することが示された。14.46kDaの完全長タンパク質は、C末端及びN末端の短縮化によって形成される12.16kDaフラグメント(アミノ酸14〜133)及び10.44kDaフラグメント(アミノ酸40〜140)、ならびに7.27kDaフラグメント(アミノ酸72〜140)を含む多数の小さなフラグメントを生成することが見出された。NAC領域の大部分を含む7.27kDaフラグメントは、全長α−Synよりもかなり速く凝集することが示された。これらの自己タンパク質分解性産物は、α−Synの凝集における中間体または補因子としての役割を果たす可能性がある。

0007

α−Synは、ヒトの脳で豊富であり、脳及びグリア細胞細胞質にあるすべてのタンパク質の1%を占めている。α−Synは、新皮質海馬歯状回嗅球線条体視床、及び小脳で広く発現している。また、B細胞、T細胞、及びNK細胞、ならびに単球及び血小板を含む造血細胞でも高度に発現している。少量のα−Synが心臓筋肉、及びその他の組織で見出される。脳では、α−Synは主にシナプス前終末と呼ばれる特殊な構造の神経細胞ニューロン)の先端に見出される。これらの構造内で、α−Synはリン脂質及びタンパク質と相互作用する。シナプス前終末は、シナプス小胞として知られているコンパートメントから、ドーパミンなどの神経伝達物質と呼ばれる化学メッセンジャーを放出する。神経伝達物質の放出は、ニューロン間の信号を中継し、認知を含む正常な脳機能にとって重要である。

0008

溶液中のα−Synは、単一の安定した3D構造を欠いているという点で、天然変性タンパク質であると考えられている。α−Synはチューブリンと顕著に相互作用し、α−Synはタウのような潜在的な微小管関連タンパク質としての活性を持つ可能性があることが示されている。α−Synは古典的に非構造化可溶性タンパク質であると考えられてきたが、非変異α−Synは凝集に抵抗する安定に折り畳まれた四量体を形成する。それにもかかわらず、α−Synは凝集して、レビー小体を特徴とする病態において不溶性原線維を形成し得る。これらの障害はシヌクレイノパチー(ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/Synucleinopathiesにおいて概説される)として知られている。

0009

シヌクレイノパチーは、共通の病理学的特徴を共有する神経変性障害の多様なグループであり、神経病理学的検査では、不溶性のα−Synの異常な凝集体を含む特徴的な病変が、ニューロン及びグリア細胞の選択的脆弱集団に存在する。最も一般的なシヌクレイノパチーには、パーキンソン病(PD)、認知症を伴うパーキンソン病(PDD)、及びレビー小体を伴う認知症(DLB)などのレビー小体障害(LBD)、ならびに多系統萎縮症(MSA)または脳鉄蓄積型I(NBIAタイプI)の神経変性が含まれる。これらの疾患の現在の治療選択肢には、L−ドーパなどの対症療法薬、抗コリン薬、及びモノアミンオキシダーゼ阻害薬が含まれる。しかしながら、現在のすべての治療の機会は、症候性緩和につながるだけであり、患者に長期にわたる疾患修飾効果を誘発するものではない。

0010

LBDは、振戦硬直運動緩慢、及び脳内のドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする進行性の神経変性障害である。DLB及びPDDの場合、兆候には認知障害も含まれる。西欧諸国の60を超える人口の2%までがPD/LBDの典型的な兆候を示す。遺伝的感受性環境因子が疾患の発症に関与しているらしい。この疾患に苦しむ患者は、特にドーパミン作動性ニューロンまたはニューロン突起含有量が高い領域の脳の皮質及び皮質下領域に、レビー小体(LB)と呼ばれる特徴的な細胞内封入体発達させる。LBDでは、α−Synは影響を受ける脳領域全体のLBに蓄積する。さらに、α−Syn遺伝子の単一の点変異、及び重複または増殖は、まれな家族型パーキンソン症候群と関連していることが実証できた。

0011

多系統萎縮症(MSA)は、L−ドーパ抵抗性パーキンソン症候群、小脳性運動失調、及び自律神経障害の症状を特徴とする散発性の神経変性障害である。線条体、黒質、小脳、脳橋、ならびに下オリーブ核、及び脊髄を含むさまざまな脳領域で、多系統の神経損失に苦しむ患者が影響を受ける。MSAは、α−Syn陽性グリア細胞質(GCI)及び中枢神経系全体のまれな神経細胞封入体を特徴とする。

0012

さまざまな神経軸索ジストロフィーなどのその他のまれな障害にもα−Syn病態があり、α−Synはレビー小体原線維の主要な構造成分である。しばしば、レビー小体にはタウタンパク質が含まれるが、α−Synとtauは、同一の封入体内のフィラメントの2つの特徴的なサブセットを構成する。α−Syn病理は、アルツハイマー病の散発性と家族性の両方の症例でも見出される。

0013

α−Synの凝集メカニズムは不明である。単量体のα−Synは溶液中において自然に折り畳み構造がほどけるが、αヘリカルの形態で膜に結合することもできる。折り畳み構造がほどけた単量体は、最初に凝集してβ−シートのような相互作用によって安定化できる小さなオリゴマー種になり、次に高分子量の不溶性原線維になる。α−Synは、非構造、アルファヘリックス、及びベータシートに富む配座異性体平衡状態にある混合物として存在する。凝集を改善することが知られている変異または緩衝液条件は、ベータ配座異性体の集団を強く増加させ、したがって、これが病原性凝集に関連する立体配座である可能性を示唆している。凝集、そして最終的にはレビー小体の前駆体となり得るベータ構造に富んで構造化された中間体の証拠が存在する。

0014

(1)1つ以上のキナーゼによるリン酸化;(2)カルパインなどのプロテアーゼによる短縮化;及び(3)炎症中に存在する一酸化窒素(NO)または他の反応性窒素種によるニトロ化を含む、いくつかの生理学要因がα−Synを修飾し、凝集体の形成をもたらす可能性がある。ERゴルジ輸送、シナプス小胞、ミトコンドリアリソソーム、及びその他のタンパク質分解機構は、そのような凝集によるα−Syn媒介毒性に関連する提案された細胞標的の一部である。

0015

シヌクレイノパチーを治療する戦略には、α−Synの凝集を阻害する化合物がある。低分子クミンアルデヒドは、α−Synのフィブリル化を阻害することが示されている。低分子療法に加えて、最近の報告は、α−Syn凝集体が免疫療法の標的となる可能性があることを示唆している(Lee JS and Lee S−J, 2016の総説)。しかしながら、この報告では、(1)α−Synの正常な生理学的機能への潜在的な干渉;(2)脳実質への抗体薬送達の困難性;及び(3)免疫療法の有効性を含む、α−Syn免疫療法の開発に伴ういくつかの潜在的な問題または課題を指摘している。

0016

現在まで、シヌクレイノパチーを患っている患者の費用効果の高い治療のための部位特異的ペプチド免疫原及びその製剤を開発する必要性はまだ満たされていない。

0017

参照文献:
1. ”Alpha-synuclein,”Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Alpha-synuclein&oldid=781366541(2017年5月30日にアクセスされた).
2. ”Synucleinopathies,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Synucleinopathies&oldid=686287116(2017年5月30日にアクセスされた).
3. ”Beta-synuclein,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Beta-synuclein&oldid=763171134(2017年5月30日にアクセスされた).
4. ”Synucleinopathies,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Synucleinopathies&oldid=686287116(2017年5月30日にアクセスされた).
5.LEE, J.S., et al., “Mechanism of Anti-α-synuclein Immunotherapy”,J./Mov Disord:, 9(1): 14-19(2016)
6. TRAGGIAI, E., et al.“An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells:potent neutralization ofSARS coronavirus”, Nat Med:, 10(8):871-875(2004)
7.WANG, C., et al.“Versatile Structures of α-Synuclein”, Front Mol Neurosci.9:48(2016)

0018

本開示は、アルファ−シヌクレインタンパク質(α−Syn)のペプチド免疫原コンストラクトに関する。本開示はまた、ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物、ペプチド免疫原コンストラクトを作製及び使用する方法、ならびにペプチド免疫原コンストラクトによって産生される抗体に関する。

0019

開示されるペプチド免疫原コンストラクトは、異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して連結されたα−SynからのB細胞エピトープを含む。ペプチド免疫原コンストラクトのB細胞エピトープ部分は、全長α−Syn(配列番号1)のアミノ酸111位のグリシン(G111)近辺からアミノ酸135位のアスパラギン(D135)近辺までの配列に対応するα−SynのC末端領域からの約10から約25アミノ酸残基を含む。ペプチド免疫原コンストラクトの異種Thエピトープ部分は、病原性タンパク質由来するアミノ酸配列に由来する。ペプチド免疫原コンストラクトのB細胞エピトープ部分及びThエピトープ部分は、宿主投与されると一緒に作用して、コンストラクトのα−SynのB細胞エピトープ部分を特異的に認識して結合する抗体の生成を刺激する。

0020

いくつかの実施形態では、α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、(a)配列番号1のアミノ酸G111近辺からアミノ酸D135近辺に対応するα−SynのC末端フラグメントからの約10〜約25個のアミノ酸残基を含むB細胞エピトープと、(b)配列番号70〜98からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTヘルパーエピトープと、(c)アミノ酸、Lys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α,ε−N)Lys、及びε-N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号148)からなる群から選択される必要に応じた異種スペーサーと、を含み、B細胞エピトープは、直接または必要に応じた異種スペーサーを介してTヘルパーエピトープに共有結合している。特定の実施形態では、α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、配列番号107、108、111〜113、及び115〜147からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0021

本開示はまた、医薬組成物を含む、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物に関する。開示される医薬組成物は、宿主において開示されたペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答及び抗体の産生を誘発することができる。開示される組成物は、開示されたペプチド免疫原コンストラクトの1つまたは1つを超えるものの混合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、担体アジュバント、緩衝液、及び他の適切な試薬を含む追加の成分と一緒に、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む。ある特定の実施形態において、組成物は、アジュバントが必要に応じて補充されたCpGオリゴマーとの安定化された免疫刺激複合体の形態で開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む。

0022

特定の実施形態では、組成物は、配列番号107、108、111〜113、115〜147からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、配列番号107、108、111〜113、115〜147からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むα−Synペプチド免疫原コンストラクト、及び薬学的に許容可能な担体またはアジュバントを含む医薬組成物である。

0023

本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクトで免疫化された宿主によって産生される抗体に関する。開示される抗体は、ペプチド免疫原コンストラクトのα−SynのB細胞エピトープ部分を特異的に認識して結合する。開示されるα−Syn抗体は、モノマー、オリゴマー、または原線維の形態でα−Synのβ−シートに対して予想外に高い交差反応性を有する。それらの独特の特徴及び特性に基づいて、開示される抗体は、シヌクレイノパチーの標的化、同定、及び治療に対する免疫療法的アプローチを提供することができる。

0024

特定の実施形態では、抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号107、108、111〜113、115〜147からなる群から選択されるα−Synペプチド免疫原コンストラクトのB細胞エピトープに特異的に結合する。

0025

本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクト、抗体、及び組成物を作製及び使用する方法に関する。開示される方法は、ペプチド免疫原コンストラクト及びコンストラクトを含む組成物の低コストの製造及び品質管理を提供し、これはシノパシー(synopathy)を予防及び治療する方法で使用することができる。

0026

本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクト及び/またはペプチド免疫原コンストラクトに対する抗体を使用してシヌクレイノパチーを治療及び/または予防する方法を含む。いくつかの実施形態では、シヌクレイノパチーを治療及び/または予防する方法は、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を宿主に投与することを含む。ある特定の実施形態では、方法で利用される組成物は、静電結合により、CpGオリゴマーなどの負に帯電したオリゴヌクレオチドとの安定な免疫刺激複合体の形で開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含み、この複合体は、必要に応じて、シヌクレイノパチーの患者への投与のためのアジュバントとしての無機塩または油がさらに補充される。開示される方法は、シヌクレイノパチーのリスクがある、またはシヌクレイノパチーを有する宿主にペプチド免疫原コンストラクトを投与するための投与計画剤形、及び経路も含む。

0027

様々な実施形態では、α−Synペプチド免疫原コンストラクト及び/またはα−Synペプチド免疫原コンストラクトによって誘発された抗体を使用する方法が記載されている。特定の実施形態では、方法は、抗体を産生し、α−Syn凝集を阻害し、α−Syn凝集体の量を低減し、異なるサイズのα−Syn凝集体を同定するためのものであり、それが記載されている。さまざまな方法は、薬理学的に有効な量のα−Synペプチド免疫原を、それを必要とする宿主に投与することを含む。

図面の簡単な説明

0028

α−SynのC末端に対する抗体の存在下(試料1〜4)または媒体対照の存在下(試料5)での6日後のin vitroでのα−Syn凝集のレベルを示すグラフである。具体的には、α−Syn凝集は、α−Syn111−132(試料1);α−Syn121−135(試料2);α−Syn123−135(試料3);α−Syn126−135(試料4)によって誘発される抗α−Syn抗体または媒体対照(試料5)の存在下で実施された。α−Syn凝集のレベルは、凝集体のチオフラビン−T(ThT)染色により測定された。試料1〜4は、試料5の媒体対照に対して標準化された。エラーバーは、二重化された各研究のSEM(平均の標準誤差)を表す。
α−SynのC末端に対する抗体(試料1〜3)または免疫前血清対照(試料4)の存在下で3日間、凝集体をインキュベートした後、事前に形成されたin vitroでのα−Syn凝集体の解離レベルを示すグラフである。具体的には、予め形成されたα−Syn凝集体を、α−Syn111−132(試料1);α−Syn126−135(試料2)によって誘発される抗α−Syn抗体、及びα−Syn111−132及びα−Syn126−135によって誘発される抗体の組み合わせ(試料3)、または免疫前血清対照(試料4)とともにインキュベートした。α−Syn凝集のレベルは、凝集体のチオフラビン−T(ThT)染色により測定された。試料1〜3は、試料4の免疫前血清対照に対して標準化された。エラーバーは、二重化された各研究のSEM(平均の標準誤差)を表す。
α−SynのC末端に対する抗体(試料1〜4)または媒体対照(試料5)の存在下で神経成長因子(NGF)とともにインキュベートされたα−Syn過剰発現PC12細胞におけるα−Syn凝集及びα−Syn脱凝集のレベルを示すグラフである。具体的には、PC12細胞は、α−Syn111−132(試料1);α−Syn121−135(試料2);α−Syn123−135(試料3);α−Syn126−135(試料4)によって誘発される抗α−Syn抗体または媒体対照(試料5)とともにインキュベートされた。試料1〜4は、試料5の媒体対照に対して標準化された。エラーバーは、三重化された各研究のSD(標準誤差)を表す。
α−SynのC末端に対する抗体(試料1〜4)または媒体対照(試料5)の存在下でインキュベートされた細胞からのα−Syn凝集体を介したTNF−α及びIL−6の放出レベルを示すグラフである。具体的には、ミクログリア細胞は、α−Syn111−132(試料1);α−Syn121−135(試料2);α−Syn123−135(試料3);α−Syn126−135(試料4)によって誘発される抗α−Syn抗体または媒体対照(試料5)とともにインキュベートされた。試料1〜4は、試料5の媒体対照に対して標準化された。エラーバーは、三重化された各研究のSD(標準誤差)を表す。
図5A〜図5Cは、NGFで誘導された神経分化PC12細胞における外因性の予め形成されたα−Syn凝集体を有するin vitro神経変性モデルでの抗α−Syn抗体の効果を示すグラフである。図5Aは、NGF単独(濃い実線);外因性の予め形成されたα−Syn凝集体を伴うNGF(点線);免疫前血清を伴うNGF(明るい実線);ならびに外因性の予め形成されたα−Syn凝集体及び免疫前血清を伴うNGF(破線)で処理したPC12細胞の神経突起長を評価する。図5Bは、媒体を伴うNGF(濃い実線);外因性の予め形成されたα−Syn凝集体を伴うNGF(点線);α−Syn111−132(配列番号113)によって誘発された抗α−Syn抗体を伴うNGF(明るい実線);ならびに外因性の予め形成されたα−Syn凝集体及びα−Syn111−132(配列番号113)によって誘発された抗α−Syn抗体を伴うNGF(破線)で処理したPC12細胞の神経突起長を評価する。
図5Cは、媒体を伴うNGF単独(濃い実線);外因性の予め形成されたα−Syn凝集体を伴うNGF(点線);α−Syn126−135(配列番号112)によって誘発された抗α−Syn抗体を伴うNGF(明るい実線);ならびに外因性の予め形成されたα−Syn凝集体及びα−Syn126−135(配列番号112)によって誘発された抗α−Syn抗体を伴うNGF(破線)で処理したPC12細胞の神経突起長を評価する。
図6A及び図6Bは、NGFで誘導された神経分化野生型α−Syn過剰発現PC12細胞を用いたin vitro神経変性モデルにおける細胞数及び神経突起長に対する抗α−Syn抗体の効果を示すグラフである。細胞を媒体対照(試料1);α−Syn101−132(試料2)、α−Syn111−132(試料3)、α−Syn121−135(試料4)、α−Syn123−135(試料5)、α−Syn126−135(試料6)によって誘発される抗α−Syn抗体、α−Syn111−132及びα−Syn126−135によって誘発される抗α−Syn抗体の組み合わせ(試料7);または免疫前血清対照(試料8)によって処理した。図6Aは、PC12細胞の数の回復に対する各試料それぞれの保護効果を評価する。図6Bは、各試料で処理した細胞の神経突起長を評価する。試料1〜8は、NGFで誘導された神経分化野生型PC12細胞に対して標準化された。t検定有意性検定するために使用された(0.05未満のp値は統計的に有意であると定義され、アスタリスク(*)で示されている)。
図7A及び図7Bは、ウエスタンブロット解析により、異なるサイズのα−Syn凝集体を認識及び結合する抗α−Syn抗体の能力を示している。図7Aは、市販の抗α−Syn抗体であるSyn211(レーン1);免疫前血清対照(レーン2);Syn111−132により誘発される抗α−Syn抗体(レーン3);Syn111−135によって誘発される抗α−Syn抗体(レーン4);Syn121−135によって誘発される抗α−Syn抗体(レーン5);Syn123−135によって誘発される抗α−Syn抗体(レーン6);及び、α−Syn126−135によって誘発される抗α−Syn抗体(レーン7)を比較するウエスタンブロットの画像である。
図7Bは、さまざまなサイズのα−Syn分子複合体(単量体、二量体三量体、四量体、及びオリゴマーを含む)に結合する各抗体の相対的能力を示す棒グラフである。図7Aに示したウエスタンブロットのバンド化学発光シグナル定量化し、図7Bの棒グラフに報告した。
図8A〜図8Cは、α−SynのC末端に対する抗体が異なる種のα−Syn(すなわち、αヘリックス単量体、β−シート単量体、β−シートオリゴマー及びβ−シート原線維)のみを認識して結合するが、他のアミロイド形成タンパク質(すなわち、Aβ1−42及びTau441)の同じ種には認識も結合もしないことを示すドットブロットの画像である。図8Aは、モルモットの免疫前血清から精製した抗体が、アッセイしたすべてのタンパク質種に対して検出可能なレベルを示さなかったことを示す対照試料である。図8Bは、α−Syn111−132(配列番号113)によって誘発された抗α−Syn抗体がα−Syn、Aβ1−42、及びTau441タンパク質の異なる種を認識して結合する能力を評価する。図8Cは、α−Syn126−135(配列番号112)によって誘発された抗α−Syn抗体がα−Syn、Aβ1−42、及びTau441タンパク質の異なる種を認識して結合する能力を評価する。
図9は、免疫細胞化学(ICC)研究で陽性シグナルによって測定された、さまざまなPC12細胞株における細胞内α−Synに対するα−SynのC末端に対する抗体の相対的な結合親和性をまとめた表である。具体的には、α−Syn111−132、α−Syn121−135、α−Syn126−135によって誘発された抗α−Syn抗体、または免疫前血清対照試料の相対的結合親和性を、NGF処理時の、親PC12細胞、モック対照PC12細胞、野生型α−Syn過剰発現PC12細胞、及びA53T変異α−Syn過剰発現PC12細胞で評価した。
図10A〜図10Cは、α−SynのC末端に対する抗体がPD脳切片のα−Synにのみ結合し、健康な脳切片では結合しないことを示す。図10Aは、α−Synペプチド免疫原コンストラクトに誘発されたα−Syn抗体及び免疫前抗体が、脳切片を含む正常ヒト組織パネル免疫反応性の検出を示さなかったことを示す。
図10Bは、矢じりで示されるように、PD視床切片のα−Syn凝集体に対する抗体の免疫反応性を示す。
図10Cは、顕微鏡観察下で陽性染色計数することにより決定された、PD及び健常な脳の切片におけるα−Syn凝集体に対するα−SynのC末端に対する抗体及び免疫前血清対照の免疫反応性を報告する表である。
図11A及び図11Bはアジュバント単独(白丸)またはα−Syn111−132(白四角);α−Syn126−135(黒丸);もしくは、α−Syn111−132とα−Syn126−135の組み合わせ(黒四角)を含むペプチド免疫原による3回の免疫化後のPDマウスモデルの血清中の抗α−SynIgGのレベルを示すグラフである。図11Aは、MPP+誘導マウスモデルのIgGレベルを示す。図11Bは、線維性α−Synを接種したマウスモデルのIgGレベルを示す。
図12A及び図12Bは、アジュバント単独(白丸)またはα−Syn111−132(白四角);α−Syn126−135(黒丸);もしくは、α−Syn111−132とα−Syn126−135の組み合わせ(黒四角)を含むペプチド免疫原による3回の免疫化後のPDマウスモデルの末梢循環中のα−Synのレベルを示すグラフである。図12Aは、MPP+誘導マウスモデルのα−Synレベルを示す。図12Bは、線維性α−Synを接種したマウスモデルのα−Synレベルを示す。
図13A及び図13Bは、アジュバント単独(レーン2)またはα−Syn111−132を含むペプチド免疫原(レーン3)による3回の免疫化を行った未処理の健康なマウスモデル(レーン1)またはPDマウスモデル(レーン2〜3)の脳試料中のオリゴマーα−Synのレベルを示す。未処理のBalb/cマウスは健康なマウスモデルを表し、MPP+誘導マウスはPDマウスモデルを表す。図13Aは、試料中のオリゴマーα−Synのレベル及びタンパク質ローディング対照としてのGAPDHのレベルを示すウエスタンブロットである。図13Bは、タンパク質レベルをGAPDHレベルで標準化し、未処理の健康なマウスモデル溶解物比率を比較のために1.00のレベルにさらに標準化した後、図13Aのウエスタンブロットに示される相対的オリゴマーα−Synレベルを比較するグラフである。
図14A〜図14Gは、アジュバント単独(レーン2)またはα−Syn111−132(レーン3)もしくはα−Syn126−135(レーン4)を含むペプチド免疫原による3回の免疫化を行った未処理の健康なマウスモデル(レーン1)またはPDマウスモデル(レーン2〜4)の脳試料中のオリゴマーα−Syn及びチロシンヒドロキシラーゼのレベルを示す。未処理のFVBマウスは健康なマウスモデルを表し、線維性α−Syn接種マウスはPDマウスモデルを表す。図14Aは、同側の黒質の溶解物中のオリゴマーα−Syn及びチロシンヒドロキシラーゼのレベル、ならびにタンパク質ローディング対照としてのGAPDHのレベルを示すウエスタンブロットである。図14Bは、タンパク質レベルをGAPDHレベルで標準化した後、図14Aのウエスタンブロットに示される相対的オリゴマーα−Synレベルを比較するグラフである。図14Cは、タンパク質レベルをGAPDHレベルで標準化した後、図14Aのウエスタンブロットに示される相対的チロシンヒドロキシラーゼタンパク質レベルを比較するグラフである。
図14Dは、同側の線条体の溶解物中のオリゴマーα−Syn及びタンパク質ローディング対照としてのGAPDHのレベルを示すウエスタンブロットである。図14Eは、タンパク質レベルをGAPDHレベルで標準化した後、図14Cのウエスタンブロットに示される相対的オリゴマーα−Synレベルを比較するグラフである。
図14Fは、反対側の線条体の溶解物中のオリゴマーα−Syn及びタンパク質ローディング対照としてのGAPDHのレベルを示すウエスタンブロットである。図14Gは、タンパク質レベルをGAPDHレベルで標準化した後、図14Eのウエスタンブロットに示される相対的オリゴマーα−Synレベルを比較するグラフである。
図15A〜図15Cは、生理食塩水(レーン1)もしくはアジュバント単独(レーン2)で処理した健康なマウスモデル(レーン1〜2)、あるいはアジュバント単独(レーン3)またはα−Syn126−135(レーン4)もしくはα−Syn111−132(レーン5)を含むペプチド免疫原のいずれかで免疫化したPDマウスモデル(レーン3〜5)において、CatWalk(商標)XTで測定したマウスの運動機能を評価するグラフである。t検定は有意性を検定するために使用された(0.05未満のp値は統計的に有意であると定義され、アスタリスク「*」で示されている)。図15Aは、処理マウスの左後肢立ち(秒)を評価し、未処理のFVBマウスは健康なマウスモデルを表し、線維性α−Syn接種マウスはPDマウスモデルを表す。図15Bは、処理マウスの走行時間(秒)を評価し、未処理のFVBマウスは健康なマウスモデルを表し、線維性α−Syn接種マウスはPDマウスモデルを表す。図15Cは、処理マウスの走行時間(秒)を評価し、未処理のBalb/cマウスは健康なマウスモデルを表し、MPP+誘導マウスはPDマウスモデルを表す。
図16Aは、PD−021514(α−Syn85−140、wpi 08)が最高の親和性でα−Synひずみ原線維を認識することを示す。ひずみリボンと原線維−91への良好な結合が観察される。オリゴマー及びフィブリル−65への不十分な結合。α−Syn単量体及びC末端の30アミノ酸残基を欠く原線維(Fib−110)への不十分な結合。
図16Bは、PD−021522(α−Syn85−140、wpi 13)がすべてのひずみ/オリゴマーに結合し、単量体に結合せず、シグナルにおける濃度依存的増加を観察しないことを示す。抗体は、C末端の30アミノ酸残基を欠く原線維(Fib−110)に結合する。したがって、エピトープはこの領域内にない。
図16Cは、PD−100806(α−Syn126−135、wpi 09)がすべてのひずみに結合し、リボンに対して最も高い親和性を示すことを示す。その抗体は、低い効率で天然オリゴマーのα−Synと結合する。グルタルアルデヒド、ドーパミン架橋オリゴマー、及び単量体α−Synへの結合はほとんど観察されない。抗体は、C末端30アミノ酸残基を欠く原線維(Fib−110)に結合しないため、おそらくはα−Syn30C末端アミノ酸残基に対するものである。
図16Dは、市販の抗体Syn1(クローン42、BD bioscience)が、グルタルアルデヒド架橋を除くすべてのα−Synひずみ及びオリゴマーに結合することを示す。その抗体はまた、単量体のasynに結合する。そのエピトープは、残基91から96/99にまたがると記載されている。それと一致して、その抗体は、C末端の30アミノ酸残基を欠く原線維(Fib−110)に結合する。
図16Eは、PRX002が単量体α−Synと比べてわずかに良好な親和性で線維性α−Synを認識することを示す。
図16Fは、モルモットで生成された抗体のバックグラウンドの対照を示す。
図16Gは、抗体Syn1のバックグラウンドの対照を示す。
図16Hは、PRX002のバックグラウンドの対照を示す。
図17A〜図17Dは、レビー小体型認知症(DLB)患者の大脳基底核におけるα−Synに対するUNS抗体特異性のIHC分析である。各抗体(PD062220、PD062205、PD100806、及びNCL−L−ASYN)で染色されたα−Syn凝集体の平均パーセンテージ面積は、被殻図17A)、内包(図17B)、及び島皮質図17C)の総面積7.5mm2について決定された。各抗体による被殻の免疫染色の代表的な顕微鏡画像図17Dに示す。UNS抗体は、被殻(ANOVAによるF(3,7)=1.550、p=0.284)、内包(ANOVAによるF(3,7)=1.356、p=0.332)、及び島皮質(ANOVAによるF(3,8)=2.050、p=0.195)でより高いパーセンテージ面積のα−Syn凝集体を検出した。P<0.05(*);P<0.01(**);P<0.001(***)。データは平均+SD(エラーバー)として示される。
図18A〜図18Dは、パーキンソン病(PD)患者の大脳基底核におけるα−Synに対するUNS抗体の特異性のIHC分析である。各抗体(PD062220、PD062205、PD100806、及びNCL−L−ASYN)で染色されたα−Syn凝集体の平均パーセンテージ面積は、3症例のPDの被殻(図18A)、内包(図18B)、及び島皮質(図18C)の総面積7.5mm2について決定された。免疫染色の代表的な顕微鏡画像を、被殻について図18Dに示す。UNS抗体は、被殻(ANOVAによるF(3,18)=4.152、p=0.047)、内包(ANOVAによるF(3,8)=1.995、p=0.1934)、及び島皮質(ANOVAによるF(3,8)=0.4044、p=0.754)でより高いパーセンテージ面積のα−Syn凝集体を検出した。NCL−L−ASYNと比較して、PD100806ではα−Synの有意に高いパーセンテージ面積が検出された(PD100806対NCL−L−ASYNについてp=0.023;n=3)。P<0.05(*);P<0.01(**);P<0.001(***)。一元配置ANOVAに続いてダネット検定を行った。データは平均+SD(エラーバー)として示される。
図19A〜図19Cは、多系統萎縮症(MSA)患者の大脳基底核におけるα−Synに対するUNS抗体の特異性のIHC分析である。各抗体(PD062220、PD062205、PD100806、及びNCL−L−ASYN)で染色されたα−Syn凝集体の平均パーセンテージ面積は、3症例のMSAの被殻(図19A)、及び内包(図19B)の総面積7.5mm2について決定された。MSA患者の島皮質では病理が検出されなかったため、定量化されなかった。UNS抗体は、被殻(ANOVAによるF(3,8)=1.56、p=0.273)及び内包(ANOVAによるF(3,8)=1.126、p=0.395)でより高いパーセンテージ面積のα−Syn凝集体を検出した。免疫染色の代表的な顕微鏡画像を、被殻について図19Cに示し、各抗体はCに示す。P<0.05(*);P<0.01(**);P<0.001(***)。データは平均+SD(エラーバー)として示される。
図20A〜図20Eは、異なるシヌクレイノパチー患者の中脳におけるα−Synに対するUNS抗体の特異性のIHC分析である。各抗体(PD062220、PD062205、PD100806、及びNCL−L−ASYN)で染色されたα−Syn凝集体の平均パーセンテージ面積は、PD(図20A)、DLB(図20B)、及びMSA(図20C)の患者の黒質の総面積7.5mm2について決定された。各抗体によって染色されたパーセンテージ面積を、診断抗体であるNCL−L−ASYNと比較した。UNS抗体は、MSA(ANOVAによるF(3,8)=0.830、p=0.51)、DLB(ANOVAによるF(3,7)=2.493、p=0.144)、及びPD(ANOVAによるF(3,7)=0.189、p=0.900)の患者の黒質でより高いパーセンテージ面積のα−Syn凝集体を検出した。
各抗体による免疫染色の代表的な顕微鏡画像を図20D(MSA)及び図20E(DLB)に示す。P<0.05(*);P<0.01(**);P<0.001(***)。データは平均+SD(エラーバー)として示される。
図21A〜図21Fは、異なるシヌクレイノパチー患者の側頭皮質白質及び灰白質におけるα−Synに対するUNS抗体の特異性のIHC分析である。各抗体(PD062220、PD062205、PD100806、及びNCL−L−ASYN)で染色されたα−Syn凝集体の平均パーセンテージ面積は、PD(図21A及び21D)、DLB(図21B及び21E)、ならびにMSA(図21C及び21F)の患者の皮質灰白質及び皮質下白質の総面積7.5mm2について決定された。各抗体によって染色されたパーセンテージ面積を、診断抗体であるNCL−L−ASYNと比較した。P<0.05(*);P<0.01(**);P<0.001(***)。一元配置ANOVAに続いてダネット検定を行った。データは平均+SD(エラーバー)として示される。
図22A〜図22Cは、異なるシヌクレイノパチー患者の小脳におけるα−Synに対するUNS抗体の特異性のIHC分析である。各抗体(PD062220、PD062205、PD100806、及びNCL−L−ASYN)で染色されたα−Syn凝集体の平均パーセンテージ面積は、PD(図22A)、DLB(図22B)、及びMSA(図22C)の患者の小脳白質の総面積7.5mm2について決定された。UNS抗体は、MSA(ANOVAによるF(3,8)=0.929、p=0.469)、DLB(ANOVAによるF(3,6)=1.426、p=0.325)、及びPD(ANOVAによるF(3,6)=2.509、p=0.157)でより高いパーセンテージ面積のα−Syn凝集体を検出した。各抗体によって染色されたパーセンテージ面積を、診断抗体であるNCL−L−ASYNと比較した。P<0.05(*);P<0.01(**);P<0.001(***)。データは平均+SD(エラーバー)として示される。
図23A及び図23Bは、各抗体による非罹患対照患者の脳からの黒質(図23A)及び被殻(図23B)の免疫染色の代表的な画像である。いずれのUNS抗体も、NCL−L−ASYN診断抗体に匹敵するα−Syn病理をいっさい検出しなかった。
図24A〜図24Dは、DLB患者またはPD患者の大脳基底核の島皮質におけるLBに対するUNS抗体の特異性のIHC分析である。各抗体(PD062220、PD062205、PD100806、及びNCL−L−ASYN)で検出された免疫陽性LBの平均パーセンテージ面積は、PD(図24A)、及びDLB(図24B)の患者の島皮質の総面積7.5mm2について決定された。LBのパーセンテージ面積は、各抗体で検出された総α−Synの割合として表される。UNS抗体は、DLB(ANOVAによるF(3,7)=0.836、p=0.516)及びPD(ANOVAによるF(3,4)=0.913、p=0.510)の患者の島皮質で、より低い割合のLB(またはより高い割合のLN)を検出した。各抗体によって染色されたパーセンテージ面積を、診断抗体であるNCL−L−ASYNと比較した。
各抗体による免疫染色の代表的な顕微鏡画像を図24C(PD)及び図24D(DLB)に示す。P<0.05(*);P<0.01(**);P<0.001(***)。データは平均+SD(エラーバー)として示される。
図25A〜図25Dは、DLB患者またはPD患者の側頭皮質の灰白質におけるLBに対するUNS抗体の特異性のIHC分析である。各抗体(PD062220、PD062205、PD100806、及びNCL−L−ASYN)で検出された免疫陽性LBの平均パーセンテージ面積は、PD(図25A)、及びDLB(図25B)の患者の灰白質の総面積7.5mm2について決定された。LBのパーセンテージ面積は、各抗体で検出された総α−シヌクレインの割合として表される。UNS抗体は、PD(ANOVAによるF(2,3)=1.983、p=0.282)及びDLB(ANOVAによるF(3,7)=1.906、p=0.217)の患者の灰白質で、より低い割合のLB(またはより高い割合のLN)を検出した。各抗体によって染色されたパーセンテージ面積を、診断抗体であるNCL−L−ASYNと比較した。
各抗体による免疫染色の代表的な顕微鏡画像を図25C(PD)及び図25D(DLB)に示す。P<0.05(*);P<0.01(**);P<0.001(***)。データは平均+SD(エラーバー)として示される。
図26A及び図26Bは、PD(図26B)のDLB(図26A)患者の中脳の黒質におけるUNS抗体及びNCL−L−ASYNによる免疫染色の代表的な画像である。NCL−L−ASYNと比較して、UNS抗体によるLNの高い検出が見られる。
図27A〜図27Cは、α−Synの細胞特異的凝集。PD(図27A)、DLB(図27B)、及びMSA(図27C)を有するヒトの症例の大脳基底核及び中脳からのα−Syn凝集体の最大投オーバーレイ共焦点画像である。α−Syn(PD062205、赤)は、PDとDLBの症例ではニューロン内(HuD、緑)に凝集するが、MSAでは凝集しない。α−Syn(PD062205)及びHuDは、出願とともに提出されるグレースケールの図面でラベル付けされているが、要求に応じてカラーコピーを利用できる。スケールバー:10μM。
図28A〜図28Cは、α−Synの細胞特異的凝集。PD(図28A)、DLB(図28B)、及びMSA(図28C)のヒトの症例からのα−Syn凝集体の最大投影オーバーレイ共焦点画像である。α−Syn(PD062205、赤)凝集体は、MSAの場合は希突起膠細胞(Olig2、緑)内にあるが、PDまたはDLBではそうではない。α−Syn(PD062205)及びOlig2は、出願とともに提出されるグレースケールの図面でラベル付けされているが、要求に応じてカラーコピーを利用できる。スケールバー:10μM。

0029

発明の詳細な説明
本開示は、アルファ−シヌクレインタンパク質(α−Syn)のペプチド免疫原コンストラクトに関する。本開示はまた、ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物、ペプチド免疫原コンストラクトを作製及び使用する方法、ならびにペプチド免疫原コンストラクトによって産生される抗体に関する。

0030

開示されるペプチド免疫原コンストラクトは、異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して連結されたα−SynからのB細胞エピトープを含む。ペプチド免疫原コンストラクトのB細胞エピトープ部分は、全長α−Syn(配列番号1)のアミノ酸111位のグリシン(G111)近辺からアミノ酸135位のアスパラギン(D135)近辺までの配列に対応するα−SynのC末端からの約10から約25アミノ酸残基を含む。ペプチド免疫原コンストラクトの異種Thエピトープ部分は、病原性タンパク質に由来するアミノ酸配列に由来する。ペプチド免疫原コンストラクトのB細胞エピトープ部分及びThエピトープ部分は、宿主に投与されると一緒に作用して、コンストラクトのα−SynのB細胞エピトープ部分を特異的に認識して結合する抗体の生成を刺激する。

0031

本開示はまた、医薬組成物を含む、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物に関する。開示される医薬組成物は、宿主において開示されたペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答及び抗体の産生を誘発することができる。開示される組成物は、開示されたペプチド免疫原コンストラクトの1つまたは1つを超えるものの混合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、担体、アジュバント、緩衝液、及び他の適切な試薬を含む追加の成分と一緒に、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む。ある特定の実施形態において、組成物は、アジュバントが必要に応じて補充されたCpGオリゴマーとの安定化された免疫刺激複合体の形態で開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む。

0032

本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクトで免疫化された宿主によって産生される抗体に関する。開示される抗体は、ペプチド免疫原コンストラクトのα−SynのB細胞エピトープ部分を特異的に認識して結合する。開示されるα−Syn抗体は、モノマー、オリゴマー、または原線維の形態でα−Synのβ−シートに対して予想外に高い交差反応性を有する。それらの独特の特徴及び特性に基づいて、開示される抗体は、シヌクレイノパチーの標的化、同定、及び治療に対する免疫療法的アプローチを提供することができる。

0033

本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクト、抗体、及び組成物を作製及び使用する方法に関する。開示される方法は、ペプチド免疫原コンストラクト及びコンストラクトを含む組成物の低コストの製造及び品質管理を提供し、これはシノパシー(synopathy)を予防及び治療する方法で使用することができる。

0034

本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクト及び/またはペプチド免疫原コンストラクトに対する抗体を使用してシヌクレイノパチーを治療及び/または予防する方法を含む。いくつかの実施形態では、シヌクレイノパチーを治療及び/または予防する方法は、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を宿主に投与することを含む。ある特定の実施形態では、方法で利用される組成物は、静電結合により、CpGオリゴマーなどの負に帯電したオリゴヌクレオチドとの安定な免疫刺激複合体の形で開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含み、この複合体は、必要に応じて、シヌクレイノパチーの患者への投与のためのアジュバントとしての無機塩または油がさらに補充される。開示される方法は、シヌクレイノパチーのリスクがある、またはシヌクレイノパチーを有する宿主にペプチド免疫原コンストラクトを投与するための投与計画、剤形、及び経路も含む。

0035

本明細書に使用される節の見出しは、構成目的のものに過ぎず、記載される主題を限定すると解釈されるものではない。本出願で引用されるすべての参考文献または参考文献の一部は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

0036

別途説明されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。「a」、「an」、及び「the」という単数形の用語には、文脈が他を明確に示さない限り、複数の指示対象が含まれる。同様に、「または」という単語は、文脈で明確に示されていない限り、「及び」を含むことを意図している。したがって、「AまたはBを含むこと」とは、AもしくはB、またはA及びBを含むことを意味する。さらに、ポリペプチドに与えられた全てのアミノ酸サイズ、及び全ての分子量または分子質量値が近似であり、説明のために提供されていることを理解されたい。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法及び物質を開示される方法の実施または試験において使用することができるが、適切な方法及び物質を以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優位となるであろう。更に、物質、方法、及び例は、例示にすぎず、限定を意図しない。

0037

α−Synペプチド免疫原コンストラクト
本開示は、異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して共有結合されたα−SynからのB細胞エピトープを含むペプチド免疫原コンストラクトを提供する。

0038

本明細書で使用されるとき、「α−Synペプチド免疫原コンストラクト」という語句は、(a)全長α−Syn(配列番号1)のアミノ酸111位のグリシン(G111)近辺からアミノ酸135位のアスパラギン(D135)近辺までの配列に対応するα−SynのC末端からの約10から約25アミノ酸残基を有するB細胞エピトープと、(b)異種Thエピトープと、(c)必要に応じた異種スペーサーと、を含む、ペプチドを指す。

0039

ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、式:
(Th)m−(A)n−(α−SynのC末端フラグメント)−X
または
(α−SynのC末端フラグメント)−(A)n−(Th)m−X
で表すことができ、
式中、
Thは異種Tヘルパーエピトープであり、
Aは異種スペーサーであり、
(α−SynのC末端フラグメント)は、α−SynのC末端から約10から約25のアミノ酸残基を持つB細胞エピトープであり、
Xはアミノ酸のα−COOHまたはα−CONH2であり、
mは、1〜約4であり、
nは、0〜約10である。

0040

開示されるα−Synペプチド免疫原コンストラクトのさまざまな構成要素を以下に説明する。

0041

a. α−Syn及びα−SynのC末端フラグメント
本明細書で使用されるとき、「α−Syn」、「アルファ−シヌクレイン」、「α−シヌクレイン」などの用語は、α−Synを発現する任意の生物由来の(a)全長α−Synタンパク質及び/または(b)そのフラグメントを指す。α−Synは、膜結合、細胞質、及びアミロイド凝集の状態でのさまざまな条件に適応し、汎用性の高い機能を果たす、極端立体構造多様性を特徴とする。いくつかの実施形態では、α−Synタンパク質はヒト由来である。ある特定の実施形態では、全長ヒトα−Synタンパク質(受託番号NP_000336)(配列番号1)は140個のアミノ酸を有する。

0042

本明細書で使用されるとき、α−Synの「C末端領域」または「C末端」という語句は、α−Synのカルボキシル末端部分からの任意のアミノ酸配列を指す。特定の実施形態では、α−SynのC末端領域またはC末端は、α−Synの残基96〜140の間のアミノ酸配列、またはそのフラグメントに関する。α−SynのC末端領域は、プロリンと負に帯電した残基に富み、これらは溶解性を維持する天然変性タンパク質に見られる一般的な特性である。α−SynのC末端領域は、疎水性が低く、正味負電荷が大きいため、一般的にランダムコイル構造で存在する。in vitroの研究により、これらの負電荷を中和するpHの低下によってα−Syn凝集が誘発できることが明らかになっている。

0043

本明細書で使用されるとき、「α−SynのC末端フラグメント」または「α−SynのC末端からのB細胞エピトープ」という語句は、全長α−Synのアミノ酸111位のグリシン(G111)近辺からアミノ酸135位のアスパラギン(D135)近辺までの配列に対応するα−SynのC末端からの約10から約25アミノ酸残基を含む全長α−Syn配列の一部を指す。α−SynC末端フラグメントは、本明細書ではα−SynのG111−D135ペプチド及びそのフラグメントとも呼ばれる。本明細書に記載される様々なα−SynのC末端フラグメントは、配列番号1により表されるα−Synの全長配列に対するそれらのアミノ酸位置により言及される。

0044

α−Synペプチド免疫原コンストラクトで使用されるα−SynCの末端フラグメントのアミノ酸配列は、多くの設計原理に基づいて選択された。これらの原理のいくつかには、以下のα−Synペプチド配列の使用が含まれる:
(i)β−Synはα−Synに結合してその凝集を防ぐことができるため、β−Synと交差反応する抗体の生成を避けるために、ベータ−シヌクレイン(β−Syn)と大幅な配列相同性を共有しない。
(ii)アルツハイマー病の治療のためにAβ1−42を標的とするAN1792ワクチンを使用した臨床試験で以前に報告されているように、髄膜炎菌性脳炎を引き起こす脳の炎症をもたらす可能性のある自己細胞活性化を防ぐために、α−Syn内に自己Tヘルパーエピトープを欠く。
(iii)その天然の形態からの立体構造変化の影響を受けやすいα−Synの領域内に含まれる。
(iv)自己分子であるため、それ自体は非免疫原性である。
(v)タンパク質担体または強力なTヘルパーエピトープ(複数可)によって免疫原性を付与できる。
(vi)免疫原性を付与され、宿主に投与されるとき:
(a)タンパク質担体または強力なTヘルパーエピトープ(複数可)ではなく、α−Synペプチド配列(B細胞エピトープ)に対する高力価抗体を誘発する。
(b)単量体、オリゴマー、または原線維の形態で、α−Synの変性β−シートと反応する高力価抗体を誘発し、そのような抗体がα−Synの凝集を防ぎ、あらゆるα−Synの凝集体を脱凝集させ、毒性のあるα−Synオリゴマー、凝集体、及び/または原線維の除去をもたらし、したがって、脳内に負荷されるα−Syn凝集体が軽減または防止される。
(c)天然α−Synは広い組織分布を持つ主要な細胞タンパク質であるため、高い安全性の懸念を呈する天然α−Synと反応する抗体を誘発しない。

0045

これらの設計原理を考慮して、α−SynのC末端領域がペプチド免疫原設計の標的として選択された。さらに、α−SynのC末端領域が選択されたのは、その構造特性に基づいて、この領域がα−Synの他の領域と比較して抗体または他の物理的要因による調節に最も影響を受けやすいと考えられたからである。

0046

実施例でさらに説明するように、α−Synに由来する多数のペプチド配列の評価により、上述の設計原理を満たす複数のα−Synペプチドの同定及び選択がもたらされた。具体的には、設計原理を満たす配列には、全長α−Synのアミノ酸111位のグリシン(G111)近辺からアミノ酸135位のアスパラギン(D135)近辺までの配列に対応するα−SynのC末端領域からの約10から約25アミノ酸残基を有するペプチドが含まれる。

0047

いくつかの実施形態では、α−SynのC末端フラグメントは、配列番号12で表される25アミノ酸のα−SynのG111−D135ペプチドである。他の実施形態では、α−SynのC末端フラグメントは、配列番号12で表されるα−SynG111−D135ペプチドの約10個の連続したアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、α−SynのC末端フラグメントは、配列番号12で表されるα−SynG111−D135ペプチドの、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、α−SynのC末端フラグメントは、表1に示されるように、配列番号12〜15、17、または49〜64によって表されるアミノ酸配列を有する。

0048

本開示のα−SynのC末端フラグメントはまた、α−SynG111−D135ペプチドの免疫学的に機能的な類似体または相同体、及びそのフラグメントを含む。α−SynG111−D135ペプチド及びそのフラグメントの機能的免疫学的類似体または相同体には、元のペプチドと実質的に同じ免疫原性を保持するバリアントが含まれる。免疫学的に機能的な類似体は、アミノ酸位置の保存的置換;全体的な電荷の変更;別の部分への共有結合;またはアミノ酸の付加、挿入、もしくは削除;及び/またはそれらの任意の組み合わせを有することができる。

0049

保存的置換とは、あるアミノ酸残基が、類似の化学的性質を持つ別のアミノ酸残基に置換されるときである。たとえば、非極性(疎水性)アミノ酸には、アラニンロイシンイソロイシンバリン、プロリン、フェニルアラニントリプトファンメチオニンが含まれ;極性中性アミノ酸には、グリシン、セリントレオニンシステインチロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ;正に帯電した(塩基性)アミノ酸には、アルギニンリジン、及びヒスチジンが含まれ;負に帯電した(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸グルタミン酸が含まれる。

0050

免疫学的に機能的な類似体には、α−SynG111−D135ペプチドと交差反応する免疫応答を誘発する1〜約4個のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失、または挿入を含むアミノ酸配列が含まれる。保存的置換、付加、及び挿入は、天然または非天然のアミノ酸により達成できる。非天然アミノ酸には、ε−Nリジン、β−アラニンオルニチンノルロイシンノルバリンヒドロキシプロリンチロキシンγ−アミノ酪酸ホモセリンシトルリンアミノ安息香酸、6−アミノカプロン酸(Aca;6−アミノヘキサン酸)、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸(MPA)、3−ニトロチロシンピログルタミン酸などが含まれるがこれらに限定されない。天然に存在するアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが含まれる。

0051

一実施形態では、特定のペプチドの機能的免疫学的類似体は、元のペプチドと同じアミノ酸配列を含み、α−SynG111−D135ペプチド及びそのフラグメントのB細胞エピトープペプチドアミノ末端に付加された3個のリジン残基(Lys−Lys−Lys)をさらに含む。この実施形態では、元のペプチド配列に3個のリジン残基を含めることにより、元のペプチドの全体的な電荷が変化するが、元のペプチドの機能は変化しない。

0052

ある特定の実施形態では、α−SynのC末端フラグメントの機能的類似体は、元のアミノ酸配列と少なくとも50%の同一性を有する。他の実施形態では、機能的類似体は、元のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する。さらに他の実施形態では、機能的類似体は、元のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有する。さらに他の実施形態では、機能的類似体は、元のアミノ酸配列と少なくとも90%または少なくとも95%の同一性を有する。

0053

b.異種Tヘルパー細胞エピトープ(Thエピトープ)
本開示は、異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して共有結合されたα−SynからのB細胞エピトープを含むペプチド免疫原コンストラクトを提供する。

0054

α−Synペプチド免疫原コンストラクトの異種Thエピトープは、α−SynのC末端フラグメントの免疫原性を増強し、合理的設計を通じて最適化された標的B細胞エピトープ(すなわち、α−SynのC末端フラグメント)に対する特異的高力価抗体の産生を促進する。

0055

本明細書で使用されるとき、「異種」という用語は、α−Synの野生型配列の一部ではない、またはそれと相同ではないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、異種Thエピトープは、α−Synに天然に見られないアミノ酸配列に由来するThエピトープであり(すなわち、Thエピトープはα−Synに対して自己ではない)。Thエピトープはα−Synと異種であるため、異種Thエピトープがα−SynのC末端フラグメントに共有結合しているとき、α−Synの天然アミノ酸配列はN末端またはC末端のいずれの方向にも伸長していない。

0056

本開示の異種Thエピトープは、α−Synに天然に見出されるアミノ酸配列を有さない任意のThエピトープであり得る。Thエピトープは、任意の種(例えば、ヒト、ブタウシイヌラット、マウス、モルモットなど)に由来するアミノ酸配列を有することができる。Thエピトープは、複数の種のMHCクラスII分子に対する無差別結合モチーフも有することができる。ある特定の実施形態では、Thエピトープは、免疫応答の開始及び調節をもたらすTヘルパー細胞の最大活性化を可能にする複数の無差別MHCクラスII結合モチーフを含む。Thエピトープは、それ自体で免疫サイレントであることが好ましく、すなわち、α−Synペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体は、いくらかあるとしても、ほとんどがThエピトープに対するものではないため、α−SynのC末端フラグメントの標的化B細胞エピトープに対する非常に焦点の合った免疫応答を可能にする。

0057

本開示のエピトープには、表2(配列番号70〜98)に例示されるように、外来病原体に由来するアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない。さらに、Thエピトープには、理想化された人工Thエピトープ及び理想化された人工Thエピトープの組み合わせが含まれる(例えば、配列番号71及び78−84)。コンビナトリアル配列として提示される異種Thエピトープペプチド(例えば、配列番号79−82)は、その特定のペプチドの相同体の可変残基に基づいて、ペプチドフレームワーク内の特定の位置に表されるアミノ酸残基の混合物を含む。コンビナトリアルペプチドの集合は、1つの特定のアミノ酸の代わりに、指定された保護アミノ酸の混合物を合成プロセス中の指定された位置で追加することにより、1つのプロセスで合成することができる。そのようなコンビナトリアル異種Thエピトープペプチドの集合は、多様な遺伝的背景を有する動物の広範なThエピトープカバレージを可能にし得る。異種Thエピトープペプチドの代表的なコンビナトリアル配列には、表2に示す配列番号79〜82が含まれる。本発明のエピトープペプチドは、遺伝的に多様な集団の動物及び患者に広範な反応性及び免疫原性を提供する。

0058

Thエピトープを含むα−Synペプチド免疫原コンストラクトは、α−SynのC末端フラグメントと並行して単一の固相ペプチド合成で同時に生成される。Thエピトープには、Thエピトープの免疫学的類似体も含まれる。免疫学的Th類似体には、免疫増強類似体、交差反応性類似体、及びα−SynのC末端フラグメントに対する免疫応答を増強または刺激するのに十分なこれらのThエピトープの任意のセグメントが含まれる。

0059

Thエピトープペプチドの機能的免疫学的類似体も有効であり、本発明の一部として含まれる。機能的免疫学的Th類似体には、ThエピトープのTh刺激機能を本質的に改変しないThエピトープ中の1〜約5個のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失及び挿入が含まれ得る。保存的置換、付加、及び挿入は、α−SynのC末端フラグメントについて上述したように、天然または非天然のアミノ酸で実現できる。表2は、Thエピトープペプチドの機能的類似体の別のバリエーションを同定する。特に、MvF1及びMvF2のThの配列番号71及び78は、それぞれN末端及びC末端の2つのアミノ酸の欠失(配列番号71及び78)または包含(配列番号81及び83)によってアミノ酸フレームにおいて異なる、MvF4及びMvF5の配列番号81及び83の機能的類似体である。これらの2つの一連類似配列間の相違は、これらの配列内に含まれるThエピトープの機能に影響を与えないであろう。したがって、機能性免疫学的Th類似体には、麻疹ウイルス融合タンパク質MvFl−4 Th(配列番号71、78、79、81、及び83)、ならびに肝炎表面タンパク質HBsAg1−3 Th(配列番号80、82、及び84)に由来するThエピトープのいくつかのバージョンが含まれる。

0060

α−Synペプチド免疫原コンストラクトのThエピトープは、α−SynのC末端ペプチドのN末端またはC末端に共有結合し得る。いくつかの実施形態では、Thエピトープは、α−SynのC末端ペプチドのN末端に共有結合している。他の実施形態では、Thエピトープは、α−SynのC末端ペプチドのC末端に共有結合している。ある特定の実施形態では、1を超えるThエピトープがα−SynのC末端フラグメントに共有結合している。1を超えるThエピトープがα−SynのC末端フラグメントに結合しているとき、各Thエピトープは同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有することができる。さらに、1を超えるThエピトープがα−SynC末端フラグメントに結合しているとき、Thエピトープは任意の順序で配置できる。たとえば、Thエピトープは、α−SynのC末端フラグメントのN末端に連続して結合するか、またはα−SynのC末端フラグメントのC末端に連続して結合するか、またはThエピトープをα−SynのC末端フラグメントのN末端に共有結合し得るが、別のThエピトープはα−SynのC末端フラグメントのC末端に共有結合する。α−SynのC末端フラグメントに関連するThエピトープの配置に制限はない。

0061

いくつかの実施形態では、Thエピトープがα−SynのC末端フラグメントに直接共有結合している。他の実施形態では、Thエピトープがα−SynのC末端フラグメントに、以下に詳細に記載される異種スペーサーを介して共有結合している。

0062

c.異種スペーサー
開示されるα−Synペプチド免疫原コンストラクトは、必要に応じて、α−SynからのB細胞エピトープを異種Tヘルパー細胞(Th)エピトープに共有結合させる異種スペーサーを含む。

0063

上述したように、「異種」という用語は、α−Synの野生型配列の一部ではない、またはそれと相同ではないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、異種スペーサーをα−SynからのB細胞エピトープに共有結合させるとき、スペーサーがα−Syn配列に対して異種であるので、α−Synの天然アミノ酸配列はN末端またはC末端のいずれの方向にも伸長していない。

0064

スペーサーは、2つのアミノ酸及び/またはペプチドを一緒に結合できる任意の分子または化学構造である。スペーサーは、用途に応じて長さや極性を変えることができる。スペーサー結合は、アミド結合またはカルボキシル結合を介して行うことができるが、他の官能基も同様に可能である。スペーサーは、化合物、天然に存在するアミノ酸、または天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。

0065

スペーサーは、α−Synペプチド免疫原コンストラクトに構造的特徴を提供できる。構造的に、スペーサーは、α−SynのC末端フラグメントのB細胞エピトープからThエピトープを物理的に分離する。スペーサーによる物理的分離は、ThエピトープをB細胞エピトープに結合することによって作成された任意の人工的な二次構造破壊する可能性がある。さらに、スペーサーによるエピトープの物理的分離により、Th細胞応答及び/またはB細胞応答間の干渉を排除することができる。さらに、スペーサーは、ペプチド免疫原コンストラクトの二次構造を作成または改変するように設計できる。例えば、ThエピトープとB細胞エピトープの分離を強化するために、柔軟なヒンジとして機能するようにスペーサーを設計できる。柔軟なヒンジスペーサーは、提示されたペプチド免疫原と適切なTh細胞及びB細胞との間のより効率的な相互作用を可能にし、Thエピトープ及びB細胞エピトープに対する免疫応答を強化することができる。柔軟なヒンジをコードする配列の例は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域に見られ、多くの場合プロリンに富む。スペーサーとして使用できる特に有用な柔軟なヒンジの1つは、Pro−Pro−Xaa−Pro−Xaa−Pro配列(配列番号148)によって提供され、式中、Xaaは任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。

0066

スペーサーはまた、α−Synペプチド免疫原コンストラクトに機能的特徴を提供できる。たとえば、スペーサーは、α−Synペプチド免疫原コンストラクトの全体的な電荷を変更するように設計でき、これは、ペプチド免疫原コンストラクトの溶解性に影響を与える可能性がある。さらに、α−Synペプチド免疫原コンストラクトの全体的な電荷を変更すると、ペプチド免疫原コンストラクトが他の化合物や試薬と結合する能力に影響を及ぼす可能性がある。以下でさらに詳細に記載するように、α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、静電結合を介してCpGオリゴマーなどの高荷電オリゴヌクレオチドと安定した免疫刺激複合体を形成できる。α−Synペプチド免疫原コンストラクトの全体的な電荷は、これらの安定した免疫刺激複合体の形成に重要である。

0067

スペーサーとして使用できる化合物には、(2−アミノエトキシ酢酸AEA)、5−アミノ吉草酸(AVA)、6−アミノカプロン酸(Ahx)、8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸(AEEA、ミニ−PEG1)、12−アミノ−4,7,10−トリオキサドデカン酸(ミニ−PEG2)、15−アミノ−4,7,10,13−テトラオキサペンタデカン酸(ミニ−PEG3)、トリオキサトリデカンコハク酸(Ttds)、12−アミノ−ドデカン酸、Fmoc−5−アミノ−3−オキサペンタン酸(O1Pen)などが含まれるが、これらに限定されない。

0068

天然に存在するアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが含まれる。

0069

非天然アミノ酸には、ε−Nリジン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、6−アミノカプロン酸(Aca;6−アミノヘキサン酸)、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸(MPA)、3−ニトロチロシン、ピログルタミン酸などが含まれるがこれらに限定されない。

0070

α−Synペプチド免疫原コンストラクトのスペーサーは、Thエピトープ及びα−SynのC末端ペプチドのN末端またはC末端に共有結合し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ThエピトープのC末端及びα−SynのC末端ペプチドのN末端に共有結合している。他の実施形態では、スペーサーは、α−SynのC末端ペプチドのC末端及びThエピトープのN末端に共有結合している。ある特定の実施形態では、例えば、ペプチド免疫原コンストラクトに1を超えるThエピトープが存在するとき、1を超えるスペーサーを使用することができる。1を超えるスペーサーを使用するとき、各スペーサーは互いに同一でも異なっていてもよい。さらに、ペプチド免疫原コンストラクトに1を超えるThエピトープが存在するとき、Thエピトープはスペーサーで分離することができ、Thエピトープは、ThエピトープをB細胞エピトープから分離するために使用されるスペーサーと同一でも異なっていてもよい。Thエピトープまたはα−SynのC末端フラグメントに関するスペーサーの配置に制限がない。

0071

ある特定の実施形態では、異種スペーサーは、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸である。他の実施形態では、スペーサーは、1を超える、天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸を含む。特定の実施形態では、スペーサーはLys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α,ε−N)Lys、またはε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号148)である。

0072

d.α−Synペプチド免疫原コンストラクトの特定の実施形態
α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、式:
(Th)m−(A)n−(α−SynのC末端フラグメント)−X
または
(α−SynのC末端フラグメント)−(A)n−(Th)m−X
で表すことができ、
式中、
Thは異種Tヘルパーエピトープであり、
Aは異種スペーサーであり、
(α−SynのC末端フラグメント)は、α−SynのC末端から約10から約25のアミノ酸残基を持つB細胞エピトープであり、
Xはアミノ酸のα−COOHまたはα−CONH2であり、
mは、1〜約4であり、
nは、0〜約10である。

0073

ある特定の実施形態では、α−Synペプチド免疫原コンストラクトの異種Thエピトープは、表2に示す配列番号70〜98のいずれか、またはその組み合わせから選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、Thエピトープは、配列番号78〜84のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、α−Synペプチド免疫原コンストラクトは1を超えるThエピトープを含む。

0074

特定の実施形態では、必要に応じた異種スペーサーは、Lys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α,ε−N)Lys、ε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号148)、及びそれらの組み合わせのいずれかから選択される。特定の実施形態では、異種スペーサーは、ε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号148)である。

0075

特定の実施形態では、α−SynのC末端フラグメントは、全長α−Synのアミノ酸111位のグリシン(G111)近辺からアミノ酸135位のアスパラギン(D135)近辺までの配列に対応するα−SynのC末端領域からの約10から約25アミノ酸残基を有する。特定の実施形態では、α−SynのC末端フラグメントは、表1に示されるように、配列番号12〜15、17、または49〜64によって表されるアミノ酸配列を有する。

0076

ある特定の実施形態では、α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、表3に示す配列番号107〜108、111〜113、及び115〜147のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、配列番号107〜108、及び111〜113のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。

0077

組成物
本開示はまた、開示されるα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を提供する。

0078

a.ペプチド組成物
開示されるα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物は、液体または固体の形態であり得る。液体組成物は、水、緩衝液、溶媒、塩、及び/またはα−Synペプチド免疫原コンストラクトの構造的または機能的特性を変えない他の許容可能な試薬を含むことができる。ペプチド組成物は、開示されるα−Synペプチド免疫原コンストラクトの1つ以上を含むことができる。

0079

b.医薬組成物
本開示はまた、開示されるα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物に関する。

0080

医薬組成物は、薬学的に許容される送達システムに担体及び/または他の添加物を含むことができる。したがって、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、及び/または希釈剤添加剤安定化剤保存剤可溶化剤、緩衝液などの他の賦形剤とともに、医薬有効量のα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含むことができる。

0081

医薬組成物は、特定の抗原効果自体を持たずに、α−Synペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答を加速延長、または増強するように作用する1つ以上のアジュバントを含むことができる。医薬組成物に使用されるアジュバントには、油、アルミニウム塩ウイロソームリン酸アルミニウム(ADJU−PHOS(登録商標)など)、水酸化アルミニウム(ALHYDROGEL(登録商標)など)、リポシンサポニンスクアレン、L121、Emulsigen(登録商標)、モノホスホリルリピドA(MPL)、QS21、ISA35、ISA 206、ISA50V、ISA51、ISA 720、及びその他のアジュバントと乳化剤が含まれ得る。

0082

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、Montanide(商標)ISA51(油中水型エマルジョンの製造のための植物油及びマンニドオレエートからなる油アジュバント組成物)、Tween(登録商標)80(ポリソルベート80またはポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエートとしても知られる)、CpGオリゴヌクレオチド、及び/またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてエムルシゲンまたはエムルシゲンDを含む水中油中水型(すなわち、w/o/w)エマルジョンである。

0083

医薬組成物は、即時放出製剤として、または持続放出製剤用に製剤化することができる。さらに、医薬組成物は、免疫原の捕捉及び微粒子との同時投与による全身性または局所粘膜免疫誘導用に製剤化することができる。そのような送達システムは、当業者によって容易に決定される。

0084

医薬組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製することができる。α−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む液体ビヒクルは、注射の前に調製することもできる。医薬組成物は、例えば、i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻腔内、経口、皮下などの任意の適切な適用様式によって、及び任意の適切な送達装置で投与することができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内投与用に製剤化される。経口及び鼻腔内適用を含む他の投与様式に適した医薬組成物も調製することができる。

0085

医薬組成物は、即時放出製剤として、または持続放出製剤用に製剤化することができる。さらに、医薬組成物は、免疫原の捕捉及び微粒子との同時投与による全身性または局所粘膜免疫の誘導用に製剤化することができる。そのような送達システムは、当業者によって容易に決定される。

0086

医薬組成物は、適切な単位剤形で製剤化することもできる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重1kgあたり約0.5μgから約1mgのα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む。医薬組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、及び治療が予防的または治療的であるかどうかを含む多くの種々の要素に依存して変動する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック動物を含む非ヒト哺乳動物もまた治療できる。複数回投与で送達されるとき、医薬組成物は、単位剤形あたり適切な量に都合よく分割され得る。投与される用量は、治療技術分野でよく知られているように、対象の年齢、体重、及び全体的な健康状態に依存するだろう。

0087

いくつかの実施形態では、医薬組成物は1を超えるα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む。1を超えるα−Synペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含む医薬組成物は、コンストラクトの免疫効果相乗的に増強することができる。1を超えるα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物は、MHCクラスIIが広範囲に及ぶため、より大きな遺伝集団でより効果的であり、したがってα−Synペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答が改善される。

0088

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号107〜108、111〜113、115〜147から選択されるα−Synペプチド免疫原コンストラクト、ならびにその相同体、類似体及び/または組み合わせを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号107〜108、111〜113、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む。

0089

α−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を使用して、投与時に宿主で免疫応答を誘発し、抗体を産生することができる。

0090

c.免疫刺激複合体
本開示はまた、CpGオリゴヌクレオチドとの免疫刺激複合体の形態のα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物に関する。そのような免疫刺激複合体は、アジュバント及びペプチド免疫原安定剤として作用するように特に適合されている。免疫刺激複合体は微粒子の形態であり、免疫系の細胞にα−Synペプチド免疫原を効率的に提示して免疫応答を生じさせることができる。免疫刺激複合体は、非経口投与用の懸濁液として製剤化されてもよい。免疫刺激複合体は、α−Synペプチド免疫原の、非経口投与後の宿主の免疫系細胞への効率的な送達のために、無機塩またはin situゲル化ポリマーと組み合わせた懸濁液として、w/oエマルジョンの形態で製剤化することもできる。免疫刺激複合体は、保護/治療効果があるα−Synのβ−シートに対する免疫応答を生成することができる(例えば、実施例13の図8A、8B、及び8C)。

0091

安定化された免疫刺激複合体は、α−Synペプチド免疫原コンストラクトを陰イオン分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または静電結合を介したそれらの組み合わせと複合化することにより形成できる。安定化された免疫刺激複合体は、免疫原送達システムとして医薬組成物に組み込まれ得る。

0092

ある特定の実施形態では、α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、5.0〜8.0の範囲のpHで正に帯電した陽イオン部分を含むように設計されている。α−Synペプチド免疫原コンストラクト、またはコンストラクトの混合物のカチオン部分正味電荷は、各リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)に+1電荷を割り当て、各アスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)に−1電荷を割り当て、配列内の他のアミノ酸に0の電荷を割り当てることによって計算される。電荷は、α−Synペプチド免疫原コンストラクトのカチオン部分内で合計され、正味の平均電荷として表される。適切なペプチド免疫原は、正味の平均正電荷が+1のカチオン部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は、正味の正電荷が+2より大きい範囲である。いくつかの実施形態では、α−Synペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分は異種スペーサーである。ある特定の実施形態では、スペーサー配列が(a,ε−N)Lys、ε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号148)であるとき、α−Synペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分は、+4の電荷を有する。

0093

本明細書に記載されるとき、「アニオン性分子」は、5.0〜8.0の範囲のpHで負に帯電した任意の分子を指す。特定の実施形態では、アニオン性分子はオリゴマーまたはポリマーである。オリゴマーまたはポリマーの正味の負電荷は、オリゴマーの各ホスホジエステルまたはホスホロチオエート基に−1電荷を割り当てることにより計算される。適切なアニオン性オリゴヌクレオチドは、CpGモチーフ反復数が1〜10の範囲である、8〜64ヌクレオチド塩基一本鎖DNA分子である。好ましくは、CpG免疫刺激性一本鎖DNA分子は、18〜48ヌクレオチド塩基を含み、CpGモチーフの反復数は3〜8の範囲である。

0094

より好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式:5’ X1CGX2 3’で表され、式中、C及びGはメチル化されておらず;X1はA(アデニン)、G(グアニン)、及びT(チミン)からなる群から選択され;X2はC(シトシン)またはT(チミン)である。あるいは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式:5’ (X3)2CG(X4)2 3’で表され、式中、C及びGはメチル化されておらず;X3は、A、T、またはGからなる群から選択され;X4はCまたはTである。

0095

得られる免疫刺激複合体は、典型的には1〜50ミクロンの範囲のサイズの粒子の形態であり、相互作用種の相対電荷化学量論及び分子量を含む多くの要因の関数である。微粒子化された免疫刺激複合体は、in vivoで特定の免疫応答のアジュバント化及び上方制御を提供するという利点を有する。さらに、安定化された免疫刺激複合体は、油中水型エマルジョン、無機塩懸濁液、及びポリマーゲルを含むさまざまなプロセスによって医薬組成物を調製するのに適している。

0096

抗体
本開示はまた、α−Synペプチド免疫原コンストラクトにより誘発される抗体を提供する。

0097

全長α−Synのアミノ酸111位のグリシン(G111)近辺からアミノ酸135位のアスパラギン(D135)近辺までの配列に対応するα−SynのC末端領域からの約10から約25アミノ酸残基を有するα−SynのC末端フラグメントは、それ自体では非免疫原性または弱免疫原性である。しかしながら、α−SynのC末端フラグメント、異種Thエピトープ、及び必要に応じた異種スペーサーを含む開示されるα−Synペプチド免疫原コンストラクトは、宿主に投与されたときに免疫応答及び抗体の産生を誘発することができる。α−Synペプチド免疫原コンストラクトの設計は、自己α−Synに対する寛容を破壊し、線形ではなく立体構造のエピトープを認識する部位特異的抗体の産生を誘発することができる。

0098

驚くべきことに、α−Synペプチド免疫原コンストラクトによって産生された抗体は、天然型のα−Syn単量体の天然のアルファヘリックスに結合しない。代わりに、α−Synペプチド免疫原コンストラクトによって生成された抗体は、単量体、オリゴマー、原線維の形態の、α−Synの変性β−シートを認識して結合する。さらに、a−Synペプチド免疫原コンストラクトによって産生される抗体は、他のアミロイド生成タンパク質(すなわち、Aβ1−42及びTau441)の類似構造に結合しない。したがって、α−Synペプチド免疫原コンストラクト(α−SynのC末端フラグメント、異種Thエピトープ、及び必要に応じた異種スペーサーを含む)の特定の設計により、汎用性の高いα−SynのC末端フラグメントの立体構造を変化させてβシート様の立体構造を可能にする。

0099

α−Synペプチド免疫原コンストラクトで免疫化した動物の免疫血清に由来する抗体の広範な比較は、多くの機能アッセイで行われた。これらの比較により、抗体が神経成長因子(NGF)処理されたPC12細胞のα−Synに、β−シート単量体及びα−Synのオリゴマーのみに対する高い特異性で結合し、他の種のアミロイド生成タンパク質には結合しない能力を実証した(実施例9を参照されたい)。

0100

α−Synペプチド免疫原コンストラクトによって誘発された抗体は、驚くべきことに、α−Synの凝集を防ぎ(抗凝集活性)、予め形成されたα−Syn凝集体を解離(脱凝集活性)できる。さらに、抗体は驚くべきことに、ミクログリア細胞が誘導するTNF−α及びIL6産生を減少させることができ、これはこれらの抗体がα−Syn凝集体または原線維媒介ミクログリア活性化を効果的に減少できることを示す。これらの抗体は、外因性のα−Syn凝集体とα−Syn過剰発現細胞の内因性α−Syn凝集体の両方によって引き起こされる神経変性を減少させることも見出された。さらに、そのような抗体は、病的なα−Synオリゴマー凝集体または原線維を特異的に認識して結合するが、非病的α−Synには反応しない。具体的には、抗体は、アルファシヌクレイノパチーのパーキンソン病の患者から採取した脳切片のレビー小体と反応するが、正常なヒト組織とは反応しない。

0101

また、驚くべきことに、α−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を投与した2つのパーキンソンマウスモデル(MPP+誘発マウスモデル及び線維性α−Syn接種マウスモデル)が、(a)α−Synのβ−シートに高度に交差反応性の抗体を産生し、(b)α−Syn血清レベルが低下し、(c)脳内のオリゴマーα−Synレベルが低下し、(d)神経病理学が低下して運動機能の回復をもたらす。

0102

本発明のα−Synペプチド免疫原コンストラクトで免疫化された動物から得られた免疫応答は、コンストラクトが、天然形態のC末端α−Synのランダムコイル構造ではなく、単量体、オリゴマー、及び原線維の形態のα−Synの変性β−シートと反応する強力な部位特異的抗体を産生する能力を示した。

0103

In vitro機能アッセイ
α−Synペプチド免疫原コンストラクトによって産生される抗体は、in vitro機能アッセイに使用できる。これらの機能アッセイには以下が含まれるが、これらに限定されない:
(a)組換えα−Syn凝集のin vitro阻害;予め形成された組換えα−Syn凝集体を脱凝集する(実施例8を参照されたい);
(b)細胞内のα−Syn凝集のin vitro阻害、及び細胞内での予め形成されたα−Syn凝集体の解離(実施例9を参照されたい);
(c)ミクログリアTNF−α及びIL6分泌の減少(実施例10を参照されたい);
(d)外因性α−Syn凝集体によって引き起こされる神経変性の減少(実施例11を参照されたい);
(e)α−Syn過剰発現細胞における神経変性の減少(実施例12を参照されたい);
(f)血清α−Synレベルの低下、脳のオリゴマーα−Synレベルの低下、神経病理学の低下及び運動活動の回復を示すマウスの線維性α−Syn接種及びMPP+誘発性パーキンソン病モデルでの有効性のin vivo証明(実施例15を参照されたい)。

0104

方法
本開示はまた、α−Synペプチド免疫原コンストラクト、組成物、及び医薬組成物を作製及び使用する方法に関する。

0105

a.α−Synペプチド免疫原コンストラクトの製造方法
本開示のα−Synペプチド免疫原コンストラクトは、当業者によく知られている化学合成法により作製することができる(例えば、Fieldset al., Chapter 3 in Synthetic Peptides:A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p. 77を参照されたい)。α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、例えば、Applied Biosystemsペプチドシンセサイザーモデル430Aまたは431の側鎖保護アミノ酸を使用して、t−BocまたはF−moc化学のいずれかで保護されたα−NH2によって固相合成の自動Merrifield技術を使用して合成できる。Thエピトープのコンビナトリアルライブラリーペプチドを含むα−Synペプチド免疫原コンストラクトの調製は、特定の可変位置カップリングするための代替アミノ酸の混合物を提供することで実現できる。

0106

所望のα−Synペプチド免疫原コンストラクトを完全に組み立てた後、標準的な手順に従って樹脂を処理して、ペプチドを樹脂から切断し、アミノ酸側鎖の官能基を非ブロック化できる。遊離ペプチドは、HPLCにより精製され、例えばアミノ酸分析または配列決定により生化学的に特徴付けられ得る。ペプチドの精製及び特徴付け方法は、当業者に周知である。

0107

この化学プロセスによって生成されるペプチドの品質を制御及び定義することができ、その結果、α−Synペプチド免疫原コンストラクトの再現性、免疫原性、及び収率保証できる。固相ペプチド合成によるα−Synペプチド免疫原コンストラクトの製造の詳細な説明は、実施例1に示される。

0108

意図した免疫学的活性の保持を可能にする構造的変動性の範囲は、小分子薬による特定の薬物活性の保持を可能にする構造的変動性の範囲、または生物由来の薬物と共生成される大きな分子に望ましい活性と望ましくない毒性よりもはるかに順応性があることが見出されている。したがって、意図的に設計されたペプチド類似体、または意図されたペプチドに類似したクロマトグラフィー及び免疫学的特性を有する欠失配列副産物の混合物として合成プロセスのエラーによって必然的に生成されたものは、所望のペプチドの精製調製物と同じくらいしばしば有効である。これらのペプチドを使用した最終製品の再現性と有効性を保証するために、製造プロセスと製品評価プロセスの両方を監視するための識別可能QC手順が開発されている限り、設計された類似体と意図しない類似体の混合物は効果的である。

0109

α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、核酸分子ベクター、及び/または宿主細胞を含む組換えDNA技術を使用して作成することもできる。したがって、α−Synペプチド免疫原コンストラクト及びその免疫学的に機能的な類似体をコードする核酸分子も本発明の一部として本開示に包含される。同様に、核酸分子を含む発現ベクターを含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞も本発明の一部として本開示に包含される。

0110

様々な例示的実施形態はまた、α−Synペプチド免疫原コンストラクト及びα−SynG111−D135フラグメント由来ペプチド免疫原コンストラクトの免疫学的に機能的な類似体の製造方法を包含する。例えば、方法は、α−Synペプチド免疫原コンストラクト及び/またはその免疫学的に機能的な類似体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、ペプチド及び/または類似体が発現されるような条件下でインキュベートするステップを含むことができる。より長い合成ペプチド免疫原は、よく知られた組換えDNA技術によって合成することができる。このような技術は、詳細なプロトコールを備えたよく知られた標準マニュアルで提供されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳して、好ましくは遺伝子が発現される生物にとって最適なコドンを有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、典型的には、ペプチド及び必要に応じて任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することにより、合成遺伝子が作製される。合成遺伝子は、適切なクローニングベクターに挿入され、宿主細胞にトランスフェクトされる。次いで、ペプチドは、選択された発現系及び宿主に適切な条件下で発現される。ペプチドは精製され、標準的な方法で特徴付けられる。

0111

b.免疫刺激複合体の製造方法
様々な例示的な実施形態はまた、α−Synペプチド免疫原コンストラクト及びCpGオリゴデオキシヌクレオチドODN)分子を含む免疫刺激複合体を生成する方法を包含する。安定化された免疫刺激複合体(ISC)は、α−Synペプチド免疫原コンストラクトのカチオン部分とポリアニオンCpG ODN分子に由来する。自己集合システムは、電荷の静電中和によって駆動される。α−Synペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分とアニオン性オリゴマーのモル電荷比の化学量論は、会合の程度を決定する。α−Synペプチド免疫原コンストラクトとCpG ODNの非共有静電的結合は、完全に再現可能なプロセスである。ペプチド/CpG ODN免疫刺激複合体の凝集体は、免疫系の「プロフェッショナル抗原提示細胞APC)への提示を促進し、したがって複合体の免疫原性をさらに増強する。これらの複合体は、製造中の品質管理のために容易に特徴付けられる。ペプチド/CpG ISCは、in vivoで十分に許容される。CpG ODNとα−SynG111−D135フラグメント由来ペプチド免疫原コンストラクトとを含むこの新しい微粒子システムは、CpG ODNの使用に関連する一般化されたB細胞マイトジェン性を利用しつつ、バランスのとれたTh−1/Th−2型応答を促進するように設計された。

0112

開示される医薬組成物中のCpGODNは、反対の電荷の静電的中和により媒介されるプロセスで免疫原に100%結合し、ミクロンサイズの微粒子の形成をもたらす。粒子形態は、CpGアジュバントの従来の使用からのCpGの投与量の大幅な削減、有害な自然免疫応答の可能性の低下を可能にし、抗原提示細胞(APC)を含む代替免疫原プロセシング経路を促進する。結果として、そのような製剤は概念的に新規であり、代替メカニズムによる免疫応答の刺激を促進することにより潜在的な利点を提供する。

0113

c.医薬組成物の製造方法
様々な例示的な実施形態はまた、α−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を包含する。特定の実施形態では、医薬組成物は、油中水型エマルジョン及び無機塩を含む懸濁液を使用する。

0114

医薬組成物を大規模な集団で使用し、α−Syn凝集の予防も投与の目標の一部とするために、安全性は考慮すべき別の重要な要素となる。臨床試験の多くの製剤にヒトの油中水エマルジョンを使用しているにもかかわらず、ミョウバンはその安全性のために製剤で使用するための主要な補助剤のままである。したがって、ミョウバンまたはその無機塩であるリン酸アルミニウム(ADJUPHOS)は、臨床応用のための調製においてアジュバントとして頻繁に使用される。

0115

d.医薬組成物を使用する方法
本開示はまた、α−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を使用する方法を含む。

0116

ある特定の実施形態において、α−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物は、以下のために使用することができる:
(a)宿主でのα−Syn凝集を阻害する;
(b)宿主で予め形成されたα−Syn凝集体の分解を誘発する;
(c)宿主のミクログリアTNF−α及びIL6分泌を減少させる;
(d)宿主の外因性α−Syn凝集体によって引き起こされる神経変性を減少させる;
(e)α−Syn過剰発現細胞の神経変性を減少させる;
(f)宿主の血清α−Synレベルを低減する;
(g)宿主の脳内のオリゴマーα−Synレベルを低減する;
(h)神経病理を軽減し、宿主の運動活動の回復;など。

0117

上述の方法は、薬理学的に有効な量のα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含む。

0118

特定の実施形態
本発明の特定の実施形態には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
(1)α−シヌクレイン(α−Syn)ペプチド免疫原コンストラクトであって、
配列番号1のアミノ酸G111近辺からアミノ酸D135近辺までに対応するα−SynのC末端フラグメントからの約10から約25アミノ酸残基を含む、B細胞エピトープと;
配列番号70〜98からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTヘルパーエピトープと;
アミノ酸Lys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α,ε−N)Lys、及びε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号148)からなる群から選択される必要に応じた異種スペーサーと、を含み、
前記B細胞エピトープが、前記Tヘルパー細胞エピトープに直接または前記必要に応じた異種スペーサーを介して共有結合している、前記α−Synペプチド免疫原コンストラクト。

0119

(2)前記B細胞エピトープが、配列番号12〜15、17、及び49〜63からなる群から選択される、(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

0120

(3)前記Tヘルパーエピトープが、配列番号81、83、及び84からなる群から選択される、(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

0121

(4)前記必要に応じた異種スペーサーが、(α,ε−N)Lysまたはε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号148)である、(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

0122

(5)前記Tヘルパーエピトープが、前記B細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

0123

(6)前記Tヘルパーエピトープが、前記B細胞エピトープのアミノ末端に前記必要に応じた異種スペーサーを介して共有結合している、(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

0124

(7)以下の式:
(Th)m−(A)n−(α−SynのC末端フラグメント)−X
または
(α−SynのC末端フラグメント)−(A)n−(Th)m−X
を含み、
式中、
Thは前記Tヘルパーエピトープであり、
Aは前記異種スペーサーであり、
(α−SynのC末端フラグメント)は、前記B細胞エピトープであり、
Xはアミノ酸のα−COOHまたはα−CONH2であり、
mは、1から約4であり、
nは1から約10である、
(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

0125

(8)配列番号107、108、111〜113、及び115〜147からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

0126

(9)配列番号107、108、及び111〜113からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト。

0127

(10)(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物。

0128

(11)1を超える(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む、組成物。

0129

(12)前記α−Synペプチド免疫原コンストラクトが配列番号112及び113のアミノ酸配列を有する、(11)に記載の組成物。

0130

(13)(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクト及び薬学的に許容される送達媒体及び/またはアジュバントを含む医薬組成物。

0131

(14)a.前記α−Synペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号107、108、111〜113、及び115〜147からなる群から選択され、
b.前記アジュバントが、Al(OH)3またはAIPO4からなるグループから選択されるアルミニウムの無機塩である、
(13)に記載の医薬組成物。

0132

(15)a.前記α−Synペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号107、108、111〜113、及び115〜147からなる群から選択され、
b.前記α−Synペプチド免疫原コンストラクトが、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)と混合されて安定化された免疫刺激複合体を形成する、
(13)に記載の医薬組成物。

0133

(16)(1)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクトの前記B細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

0134

(17)前記α−Synペプチド免疫原コンストラクトに結合した、(16)に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

0135

(18)(9)に記載のα−Synペプチド免疫原コンストラクトの前記B細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

0136

(19)(16)に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む組成物。

0137

(20)(18)に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む組成物。

0138

(21)a.配列番号112の前記B細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと、
b.配列番号113の前記B細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと、
の混合物を含む、(20)に記載の組成物。

0139

(22)(1)に記載のα−Synペプチド免疫原と送達媒体及び/またはアジュバントとを含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主においてα−Synを認識する抗体を産生する方法。

0140

(23)薬理学的に有効な量の(1)のα−Synペプチド免疫原を動物に投与することを含む、動物のα−Syn凝集を阻害する方法。

0141

(24)薬理学的に有効な量の(1)のα−Synペプチド免疫原を動物に投与することを含む、動物のα−Syn凝集体の量を低減する方法。

0142

(25)生体試料中の異なるサイズのα−Syn凝集体を同定する方法であって、
a.生体試料を、(16)に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントがα−Syn凝集体に結合することを可能にする条件下で曝露することと、
b.前記生体試料中の前記α−Syn凝集体に結合した前記抗体またはそのエピトープ結合断片の量を検出することと、
を含む、前記方法。

0143

使用される手順の詳細な説明は、次の実施例で提供される。
実施例1
アルファシヌクレイン関連ペプチドの合成及びその製剤の調製
a.α−SynのC末端フラグメントの合成
α−Synペプチド免疫原コンストラクトの開発努力に含まれていたデザイナーα−SynC末端フラグメントの合成方法を説明する。ペプチドは、血清学的アッセイ、実験室でのパイロット及びフィールド研究に有用な少量で、ならびに、医薬組成物の産業商業生産に有用な大規模(キログラム)量で合成された。有効なα−Synペプチド免疫原コンストラクトで使用するための最適なペプチドコンストラクトのスクリーニング及び選択のために、約10から40アミノ酸の長さの配列を持つα−Syn関連抗原ペプチドの大きなレパートリーが設計された。

0144

さまざまな血清学的アッセイでのエピトープマッピングに使用された、代表的な全長α−Syn(配列番号1)及びβ−Syn(配列番号2)、α−Syn111−132、α−Syn126−135などのα−Synセグメント、10merペプチドなどを表1に示す(配列番号1及び3〜69)。表2(配列番号70〜98)で同定される、麻疹ウイルス融合タンパク質(MVF)、B型肝炎表面抗原タンパク質(HBsAg)インフルエンザ、Clostridum tetani、及びエプスタイン・バーウイルスEBV)を含む病原体タンパク質由来の慎重に設計されたヘルパーT細胞(Th)エピトープに合成的に結合することにより、選択されたα−Synフラグメントをα−Synペプチド免疫原コンストラクトにした。Thエピトープは、単一の配列(配列番号70〜78及び83〜98)またはコンビナトリアルライブラリ(配列番号79〜82)のいずれかで使用され、それぞれのα−Synペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性を増強した。

0145

100を超えるペプチドコンストラクトから選択された代表的なα−Synペプチド免疫原コンストラクトは、表3(配列番号99〜147)で同定されている。抗α−Syn抗体の検出及び/または測定のための免疫原性研究または関連する血清学的検査に使用されるすべてのペプチドは、Applied BioSystems Models 430A、431及び/または433のペプチドシンセサイザーによるF−moc化学を使用して小規模で合成された。各ペプチドは、N末端でのF−moc保護及び三官能性アミノ酸の側鎖保護基を使用して、固相支持体上での独立した合成によって生成された。完成したペプチドを固体支持体から切断し、90%トリフルオロ酢酸(TFA)により側鎖保護基を除去した。合成ペプチド調製物は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)質量分析法によって評価され、正しいアミノ酸含有量が確保された。また、各合成ペプチドを逆相HPLC(RP−HPLC)で評価し、合成プロファイルと調製物の濃度を確認した。合成プロセスの厳密な制御(カップリング効率の段階的なモニタリングを含む)にもかかわらず、ペプチド類似体は、アミノ酸の挿入、欠失、置換、及び中途終止などの伸長サイクル中の意図しない事象により生成された。したがって、合成された調製物は、典型的には、標的ペプチドとともに複数のペプチド類似体を含んでいた。そのような意図しないペプチド類似体の包含にもかかわらず、得られた合成ペプチド調製物は、免疫診断(抗体捕捉抗原として)及び医薬組成物(ペプチド免疫原として)を含む免疫学的用途での使用になおも適していた。典型的には、これらのペプチドを使用した最終製品の再現性と有効性を保証するための製造プロセスと製品評価プロセスの両方をモニターするための識別可能なQC手順が開発されている限り、意図的に設計されるかまたは副産物の混合物として合成プロセスで生成されるかのいずれかのそのようなペプチド類似体は、所望のペプチドの精製製剤と同じくらい頻繁に有効である。数百グラムから数キログラムの量での大規模ペプチド合成は、カスタマイズされた自動ペプチドシンセサイザーUBI2003などで15mmoleから50mmoleのスケールで実施された。臨床試験の最終的な医薬組成物に使用される有効成分については、α−Synペプチドコンストラクトは浅い溶離勾配の下で分取RP−HPLCにより精製され、MALDI−TOF質量分析、アミノ酸分析、及びRP−HPLCにより純度と同一性について特徴付けられた。

0146

b.α−Synペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物の調製
油中水型エマルジョン及び無機塩を含む懸濁液を使用する製剤を調製した。医薬組成物を大規模な集団で使用するよう設計し、予防も投与の目標の一部とするために、安全性は考慮すべき別の重要な要素となる。臨床試験の多くの医薬組成物にヒトの油中水エマルジョンを使用しているにもかかわらず、ミョウバンはその安全性のために医薬組成物で使用するための主要な補助剤のままである。したがって、ミョウバンまたはその無機塩であるADJUPHOS(リン酸アルミニウム)は、臨床応用のための調製においてアジュバントとして頻繁に使用される。

0147

簡潔に述べると、以下に説明する各研究群で指定される製剤には、一般的にすべてのタイプのデザイナーα−Synペプチド免疫原コンストラクトが含まれていた。100を超えるデザイナーα−Synペプチド免疫原コンストラクトは、免疫原のBエピトープペプチドを代表する対応するα−Synペプチドとの相対的な免疫原性、及び配列番号1〜153を持つものから選択された異なるペプチドでコーティングされたプレートを用いるELISAアッセイによるさまざまな相同ペプチド間の血清学的交差反応性の評価について、モルモットで最初に評価された。

0148

α−Synペプチド免疫原コンストラクトは、(i)ヒトでの使用に承認されたオイルとしてSeppic Montanide(商標)ISA51を含む油中水型エマルジョン中で、または(ii)無機塩ADJUPHOS(リン酸アルミニウム)またはALHYDROGEL(ミョウバン)と混合し、指定されたペプチドコンストラクトのさまざまな量で調製された。組成物は典型的に、α−Synペプチド免疫原コンストラクトを約20〜800μg/mLで水に溶解して調製し、Montanide(商標)ISA 51で油中水型エマルション体積で1:1)に、または無機塩またはALHYDROGEL(ミョウバン)(体積で1:1)で製剤化された。組成物を室温で約30分間維持し、免疫化の前に約10〜15秒間ボルテックスにより混合した。一部の動物は、筋肉内経路により、特定の組成物の2回から3回の投与で免疫され、それは0時(プライム)及び初期免疫後3週(wpi)(ブースター)、必要に応じて2回目追加免疫のために5または6wpiで投与された。次いで、これらの免疫された動物を選択したBエピトープペプチド(複数可)で試験し、製剤に存在するさまざまなα−Synペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性と、関連する標的ペプチドまたはタンパク質との交差反応性を評価した。モルモットの初期スクリーニングにおいて強力な免疫原性を有するこれらのα−Synペプチド免疫原コンストラクトは、免疫化プロトコールで指示されるように、指定の期間にわたる投与計画の間、霊長類で、油中水型エマルジョン、無機塩、ミョウバンベースの製剤でさらに試験された。

0149

最も有望なα−Synペプチド免疫原コンストラクトのみが、シヌクレイノパチー患者における、治験薬申請及び臨床試験の提出に備えたGLPガイド前臨床研究において、免疫原性、期間、毒性、及び有効性研究の最終製剤に組み込まれる前に、さらに広範囲に評価された。

0150

実施例2
組換えアルファシヌクレインタンパク質の調製
α−Syn遺伝子のpGEX−4T1へのクローニングは、Neurotoxicology and teratology 2004, 26 (3):397-406で、以前記載されていた。標的配列(配列番号1)をBamHIとXhoI制限部位の間でpGEX−4T1ベクターに挿入した。フラグメントは、KAPA HiFiDNAポリメラーゼ(Kapa Biosystems, Inc., Woburn, MA, USA)を使用したポリメラーゼ連鎖反応PCR)によって生成された。プライマー配列は以下の通りである:フォワードプライマー5’−cgggatccgatgtgtttatgaaaggtctgag−3’(配列番号149);リバースプライマー5’−ggaattccgatgtgtttatgaaaggtctgag−3’(配列番号150)。PCR条件は以下の通りであった:94℃で1分間の変性後、94℃で15秒間の30サイクルの変性、60℃で30秒間のアニーリング、68℃で2分間の伸長、さらに68℃で5分間の後終了。Q5 Site−Directed Mutagenesis Kit(New England BioLabs, Beverly, MA, USA)を使用して、A53Tα−Synの部位特異的変異導入を実施した。変異型α−Synのためのプライマー配列は以下のとおりである:フォワードプライマー5’−tcatggtgtgaccaccgttgcag−3’(配列番号151);リバースプライマー5’−accacgccttctttggttttg−3’(配列番号152)。

0151

pGEX−4T1 GSTベクターにクローニングされたα−Synは、タンパク質発現のためにE. coliBL21(DE3)に形質転換された。E. coliを37℃のLBブロスで培養し、OD600が0.8に達したときにイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシドIPTG)を4mMの最終濃度まで添加した。4時間のインキュベーション後、4℃における5,000×gで20分間の遠心分離により細胞を収集した。収集した細胞をPBS再懸濁し、上で超音波処理して破壊し、5,000×gで20分間遠心分離した。上清画分を、PBSで平衡化したグルタチオンセファロース−4Bカラム(GE Healthcare)にロードした。PBSで3回洗浄した後、トロンビン1mL(PBS中20U/mL)を4℃で一晩消化するために添加して、融合タンパク質からGSTを放出させた。次いで、タグフリーのα−Synを溶離し、続いてトロンビンをHiTrap BenzamidineFFカラム(GE Healthcare)で除去した。透析されたα−Synは、直ちに−80℃で凍結された。10%SDS−PAGEで分離した後、14kDa MWの精製α−Synを、抗α−Syn抗体(1:2000、Millipore、α−Syn111−131を標的とする)を用いたウエスタンブロッティングにより同定した。

0152

実施例3
血清学的アッセイ及び試薬
合成ペプチドコンストラクト及びその製剤の機能的免疫原性を評価するための血清学的アッセイ及び試薬について、以下に詳述する。

0153

a.抗体特異性分析のためのペプチドベースのELISA試験
以下の実施例に記載されている免疫血清試料を評価するためのELISAアッセイが開発され、以下に記載されている。96ウェルプレートウェルを、10mMのNaHCO3緩衝液、pH9.5中(特に明記しない限り)、2μg/ml(特に明記しない限り)での、標的ペプチドであるα−SynフラグメントA85−A140、A91−A140、A101−A140、A111−A140、D121−A140、E126−A140、K97−D135、G101−D135、G111−D135、D121−D135、E123−D135、E126−D135、G101−132、及びG111−G132ペプチド(配列番号:4〜17)の100μlで37℃において1時間、個別にコーティングした。

0154

b.ThペプチドベースのELISA試験によるThペプチドに対する抗体反応性の評価
ペプチド(配列番号70〜98)でコーティングされたウェルを、非特異的タンパク質結合部位ブロッキングするために、PBS中の3重量%のゼラチン250μLによって37℃で1時間インキュベートし、その後、0.05体積%のTWEEN(登録商標)20を含むPBSで3回洗浄して乾燥させた。分析対象の血清は、20体積%の正常ヤギ血清、1重量%のゼラチン、及び0.05体積%のTWEEN(登録商標)20を含むPBSで1:20に希釈した(特に明記しない限り)。希釈した検体(例えば、血清、血漿)100マイクロリットル(100μL)を各ウェルに添加し、37℃で60分間反応させた。次いで、結合していない抗体を除去するために、PBSの0.05体積%TWEEN(登録商標)20でウェルを6回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合の種(例えば、マウス、モルモット、またはヒト)に特異的なヤギ抗IgGは、陽性ウェルで形成された抗体/ペプチド抗原複合体と結合する標識トレーサーとして使用された。あらかじめ滴定された最適希釈で、PBS中0.05体積%のTWEEN(登録商標)20を含む1体積%の正常ヤギ血清中のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗IgGの100マイクロリットルを各ウェルに添加して37℃でさらに30分間インキュベートした。ウェルをPBS中の0.05体積%のTWEEN(登録商標)20で6回洗浄して未結合抗体を除去し、0.04重量%の3’,3’,5’,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)を含む基質混合物100μLと反応させ、クエン酸ナトリウム緩衝液中の0.12体積%の過酸化水素をさらに15分間反応させた。この基質混合物を使用して、着色生成物を形成することによりペルオキシダーゼ標識を検出した。100μLの1.0MのH2SO4を添加して反応を停止させ、450nmの吸光度(A450)を決定した。さまざまなα−Syn由来ペプチド免疫原を投与された免疫動物抗体価の決定のために、1:100から1:10,000までの血清の10倍連続希釈が試験され、Log10として表される試験された血清の力価は、カットオフA450を0.5に設定したA450の線形回帰分析によって計算された。

0155

c.B細胞エピトープクラスターの10merペプチドベースのELISA試験によるα−Synフラグメントに対する詳細な特異性分析とエピトープマッピング
免疫された宿主における抗α−Syn抗体の詳細な特異性分析は、エピトープマッピングによって決定された。簡潔に述べると、96ウェルプレートのウェルは、ウェルあたり0.1mLあたり0.5μgで個々のα−Synの10merペプチド(配列番号18〜69)でコーティングされ、その後、100μLの血清試料(PBS中1:100希釈)を、上記の抗体ELISA法のステップに従って、10merプレートウェルで二重化してインキュベートした。α−Synペプチド免疫原コンストラクトのB細胞エピトープと、免疫された宿主における免疫血清の抗α−Syn抗体の関連する詳細な特異性分析は、対応するα−Synペプチド(配列番号99、102、108、110、112、113)もしくはスペーサー及びTh配列なしのそのフラグメント、または追加の反応性と特異性の確認のためのβ−Syn(配列番号153)についても試験された。

0156

d.免疫原性評価
動物から免疫前及び免疫血清試料を実験的免疫プロトコールに従って収集し、56℃で30分間加熱して血清補体因子不活性化した。医薬組成物の投与後、プロトコールに従って血液試料が得られ、特定の標的部位(複数可)に対するそれらの免疫原性が評価された。連続希釈した血清を試験し、正の力価を相互希釈のLog10として表した。特定の医薬組成物の免疫原性は、標的抗原内の所望のエピトープ特異性に対する高い力価のB細胞抗体応答を誘発する一方で、利用される「ヘルパーT細胞エピトープ」に対する抗体反応性を低いものから無視できるものに維持し、所望のB細胞応答の増強をもたらす能力によって評価される。

0157

e.マウス免疫血清のα−Synレベルのイムノアッセイ
α−Syn由来ペプチド免疫原を投与されたマウスの血清α−Synレベルは、捕捉抗体として抗α−Syn抗体及び検出抗体としてビオチン標識抗α−Syn抗体を使用して、サンドイッチELISA(Cloud−clon、SEB222Mu)によって測定された。簡潔に述べると、抗体を96ウェルプレートにコーティング緩衝液(15mMのNa2CO3、35mMのNaHCO3、pH9.6)中100ng/ウェルで固定し、4℃で一晩インキュベートした。コーティングされたウェルは、200μL/ウェルのアッセイ希釈液(PBS中、0.5%BSA、0.05%TWEEN(登録商標)−20、0.02%ProClin 300)により室温で1時間ブロッキングされた。プレートを200μL/ウェルの洗浄緩衝液(0.05%TWEEN(登録商標)−20を含むPBS)で3回洗浄した。精製組換えα−Synを使用して、5%マウス血清を含むアッセイ希釈液で標準曲線(2倍連続希釈で156〜1250ng/mLの範囲)を作成した。50μLの希釈血清(1:20)と標準液をコーティングしたウェルに添加した。インキュベーションは室温で1時間行った。すべてのウェルを吸引し、200μL/ウェルの洗浄緩衝液で6回洗浄した。捕捉されたヒトα−Synを、室温で1時間、100μLの検出抗体溶液(アッセイ希釈液中の50ng/mlのビオチン標識HP6029)とインキュベートした。次いで、ストレプトアビジンpoly−HRP(1:10,000希釈、Thermo Pierce)を1時間(100μL/ウェル)使用して、結合したビオチン−HP6029を検出した。すべてのウェルを吸引し、200μL/ウェルの洗浄緩衝液で6回洗浄し、100μL/ウェルの1MのH2SO4の添加により反応を停止させた。標準曲線は、SoftMax Proソフトウェア(Molecular Devices)を使用して作成され、4つのパラメーターロジスティック曲線適合を生成し、試験されたすべての試料のα−Synの濃度を計算するために使用された。Prismソフトウェアを使用することにより、スチューデントt検定を使用してデータを比較した。

0158

f.組換えα−Synによるα−Syn凝集体の調製
凝集したα−Synを調製するために、精製した野生型またはA53T変異型α−Syn[100μLのPBS/KCl凝集緩衝液(1×PBS、pH7.4中、2.5mMのMgCl2、50mMのHEES、及び150mMのKCl)中、0.1μg/μl]を振とうせずに、サーモミキサー(Eppendorf)で7日間、1.5mLエッペンドルフチューブ中で、37℃でインキュベートした。凝集したα−Synは、後で使用するためにすぐに−80℃で凍結した。

0159

g.抗α−Syn抗体の精製
抗α−Syn抗体は、アフィニティーカラム(Thermo Scientific、Rockford)を使用することによって、異なる配列のペプチド(配列番号99〜121)を含むα−Synペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモットの注射後3〜15週間(WPI)に収集した血清から精製した。簡潔に述べると、緩衝液(0.1Mリン酸及び0.15M塩化ナトリウム、pH 7.2)平衡化後、400μLの血清をNabプロテインスピンカラムに添加し、10分間の転倒混和と5,800×gで1分間の遠心分離を行った。カラムを結合緩衝液(400μL)で3回洗浄した。続いて、溶離緩衝液(400μL、0.1MグリシンpH 2.0)をスピンカラムに添加し、5,800×gで1分間遠心分離した後、抗体を溶離した。溶離した抗体を中和緩衝液(400μL、0.1M Tris pH 8.0)と混合し、これらの精製抗体の濃度を、BSA(ウシ血清アルブミン)を標準として、OD280でNan−Dropを使用して測定した。

0160

h.サイズの異なるα−Synペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモット抗血清から精製した抗α−Syn抗体の特異性
ウエスタンブロットを使用して、異なるサイズのα−Syn分子複合体への結合特異性について、異なるα−Synペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモット抗血清から精製した抗α−Syn抗体をスクリーニングした。20μMのα−Synを12%Tris−グリシンSDS−PAGEで分離し、光誘起架橋(PICUP)処理の前にニトロセルロース(NC)膜に転写した。膜を、モルモット抗血清から精製した1μg/mLでの抗α−Syn抗体とともにインキュベートし、次いで、HRP(706−035−148、Jackson)と結合したロバ抗モルモット抗体とともにインキュベートした。ブロット化学発光試薬Western LightningECLPro(PerkinElmer)で視覚化された。その結果、単量体α−Syn(Mw14,460Da)は14kDaのサイズ付近でブロットされたが、二量体、三量体、またはオリゴマーの分子量は14kDaの単量体α−Synのサイズよりも数倍大きくなった。二量体、三量体、及びより大きなオリゴマーなどのさまざまなオリゴマー種を検出できる市販の抗体、Syn211(Abeam)を陽性対照として使用した。

0161

i.アミロイド形成タンパク質の異なる種を用いたドットブロットアッセイ
Aβ1−42、Tau、及びα−Synのα−ヘリックス単量体、β−シート単量体、β−シートオリゴマー、及びβ−シート原線維の調製は以下のとおりである。
1.Aβ1−42α−ヘリックス単量体:20μgのAP1−42β−シート単量体(50μL)を20%トリフルオロ酢酸及び20%ヘキサフルオロイソプロパノール(10μL)を含む1×PBSに添加し、4℃で24時間インキュベートしてα−ヘリックス単量体を形成した。
2.Aβ1−42β−シート単量体:37℃で24時間凝集した5%TFAを含む120μLのl×PBS中の60μgのAβ1−42を10kDaカットオフフィルター(Millipore)に移し、β−シート単量体を回収した。
3.Aβ1−42β−シートオリゴマー:37℃で3日間凝集した120μLの1×PBS中の60μgのAβ1−42を氷上で超音波処理し、10及び30kDaカットオフフィルター(Millipore)に移して35kDa未満のβシートオリゴマー原線維を回収した。
4.Aβ1−42β−シート原線維:37℃で3日間凝集した120μLの1×PBS中の60μgのAβ1−42を氷上で超音波処理し、30kDaカットオフフィルター(Millipore)に移してβシート原線維を単離した。
5.α−Synα−ヘリックス単量体:新たに調製した40μgのα−Synを4℃の100μLの冷1×PBSに溶解し、直ちに10kDaカットオフフィルター(Millipore)に移してα−ヘリックス単量体を回収した。
6.α−Synβ−シート単量体:100μLのPBS/KCl緩衝液で37℃、24時間インキュベートした40μgのα−Synを10kDaカットオフフィルター(Millpore)に移し、β−シート単量体を回収した。
7.α−Synβ−シートオリゴマー:100μLのPBS/KCl緩衝液で37℃、8日間凝集した40μgのα−Synを氷上で超音波処理した後、30及び100kDaカットオフフィルターに移してβシートオリゴマーを回収した。
8.α−Synβ−シート原線維:100μLのPBS/KCl緩衝液で37℃、8日間凝集した40μgのα−Synを氷上で超音波処理した後、30及び100kDaカットオフフィルターに移してβシート原線維を単離した。Tau441α−ヘリックス単量体: 4℃で100μLのl×PBSで調製した60μgのTauを100kDaカットオフに移し、αヘリックス単量体を回収した。
9.Tau441β−シート単量体:25℃で48時間、10ユニット/mLヘパリンを含む100μLの1×PBSで凝集した60μgのTauを4℃で100kDaカットオフフィルターに移し、βシート単量体を回収した。
10.Tau441β−シートオリゴマー:37℃で48時間、10ユニット/mLヘパリンを含む100μLのl×PBSで凝集した60μgのTauを、4℃で100及び300kDaカットオフフィルター(Pall)に移してβシートオリゴマーを回収した。
11.Tau441β−シート原線維:37℃で6日間、10ユニット/mLヘパリンを含む100μLのl×PBSで凝集した60μgのTauを、4℃で300kDaカットオフフィルター(Pall)に移し、βシート原線維を単離した。

0162

これらの単量体及びオリゴマーは、チオフラビン−T(ThT、Sigma)蛍光またはPAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)によって検証された。アミロイド形成タンパク質の濃度は、市販のアミロイド形成Aβ1−42ストックを標準としてNano−Dropで測定した。これらの単量体とオリゴマーは、Aβ1−42について3μg、α−Synについて4μg、Tauについて7μgの量で、PVDF膜に個別にスポットされた。膜を、一次抗体としてモルモット抗血清から精製した抗α−Syn抗体(1:1000希釈)とインキュベートした後、抗モルモットHRP結合二次抗体(1:5000;Vector Laboratories)とのハイブリダイゼーションを行った。膜をLuminata Western HRP基質(Bio−Rad、Hercules、CA、USA)で処理し、シグナルをChemiDoc−It 810デジタル画像システム(UVP Inc.、Upland、CA、USA)で検出した。

0163

i.神経成長因子(NGF)処理時のα−Syn過剰発現PC12細胞における凝集したα−Synへの結合特異性
NGF処理後の親PC12、モック対照PC12、及びα−Syn過剰発現PC12細胞で、8または9WPIで収集したモルモット抗血清から精製した抗α−Syn抗体を用いた免疫細胞化学(ICC)を行って、免疫後に誘発された抗体の結合親和性を評価した。細胞核をDAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)で対比染色した。蛍光顕微鏡写真撮影し、細胞の総数に対する陽性染色された細胞の数の比率を、1%未満、1〜15%、16〜50%、50%を超えるものを表す、−、+、++、及び+++で分類してスコア化した。

0164

実施例4
免疫原性及び有効性の研究に使用される細胞及び動物
a.α−Syn過剰発現PC12細胞:
全長ヒト野生型α−SynまたはA53T変異型α−SynをコードするcDNA配列を、CMVプロモーターを持つpZD/XOL−Lベクターに挿入することにより、pZD/XOL−L−α−Synプラスミドを構築した。製造業者の手順に従って、リポフェクタミンLTトランスフェクション試薬(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を使用して、コンストラクトをPC12細胞にトランスフェクトした。2.5μLのトランスフェクション混合物、500μLのOpti−MEM培地、2.5μLのPLUS試薬、及び8.75μLのリポフェクタミンLTXを混合し、室温で25分間インキュベートした。培地を1.5mLのRPMI1640増殖培地に交換した後、500μLのトランスフェクション混合物を各ウェルに直接添加し、37℃で1日間インキュベートした。トランスフェクション効率は、PCR及びウエスタンブロッティングで確認された。

0165

b.モルモット:
免疫原性の研究は、成熟した、ナイーブな、成体オス及びメスダンカンハートレー・モルモット(300〜350g/BW)で実施された。実験では、群ごとに少なくとも3匹のモルモットを使用した。ダンカン・ハートレー・モルモット(8〜12週齢;Covance Research Laboratories、Denver、PA、USA)を含むプロトコールは、承認されたIACUC申請の下で、契約動物施設、及びスポンサーとしてUBIで実行された。

0166

c.線維性α−Synを接種したパーキンソンマウスモデル
FVBメスマウス(体重25〜30g)は、12時間の明期:12時間の暗期のサイクルで飼育され、動物のケアはAAALACが承認したガイドラインに従った。繊維性α−Synは、α−Synペプチド(5mg/mL)を0.1%NaN3含有PBS/高KCl緩衝液中で、37℃で振とうせずに7日間インキュベートすることにより調製した。ThT蛍光を測定することによって線維化をモニターし、シグナルが元のα−Syn単量体の3倍を超えて増加したときに確認した。ウエスタンブロット法はまた、イソフルラン麻酔動物の片側黒質(前−後;−3.0mm;内側−外側:−1.3mm;背−腹:ブレグマ及び硬膜から−4.7mm)、ならびに背部新線条体(前−後;+0.2mm、内側−外側;−2mm、背−腹:ブレグマ及び硬膜から−3.2mm)への接種の前にα−Synの凝集を検証するために使用された。

0167

d.MPP+誘導パーキンソンマウスモデル
Balb/cメスマウス(体重18〜20g)は、12時間の明期:12時間の暗期のサイクルで飼育され、動物のケアはAAALACが承認したガイドラインに従った。MPP+ヨージド(Sigma、St. Luis、MO)を生理食塩水に溶解し、18μgのMPP+ヨージド(0.8mg/kg)を含む10μlの溶液を麻酔動物の片側脳室に注射した。注射部位定位座標は、ブレグマ−1.0mm、横1.0mm、深さ2.0mmであった。

0168

実施例5
アルファシヌクレインペプチド免疫原コンストラクトを組み込んだ多成分医薬組成物の設計原理、スクリーニング、同定、及び最適化
a.設計の歴史
各α−Synペプチド免疫原コンストラクトまたは免疫療法製品には、特定の疾患メカニズムと介入に必要な標的タンパク質(複数可)に基づいた独自の設計フォーカスとアプローチが必要である。設計の対象となる標的には、病気の経路に関与する細胞タンパク質、または病原体由来のいくつかのタンパク質が関与する可能性のある感染因子が含まれ得る。研究から商品化までのプロセスは非常に長く、典型的には、達成するまでに10年以上必要とする。

0169

標的分子を選択したら、広範な血清学的検証プロセスが必要である。標的分子内のB細胞及びT細胞エピトープの同定と分布は、分子α−Synペプチド免疫原コンストラクトの設計にとって重要である。標的B細胞エピトープが認識されると、小動物での連続的なパイロット免疫原性研究が実施され、デザイナーペプチドの医薬組成物によって誘発される抗体の機能的特性が評価される。次いで、誘発された抗体のα−Synペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性及び機能特性のさらなる検証のために、そのような血清学的適用が標的種の動物で行われる。すべての研究は複数の並行群で実施され、血清は評価のために免疫された宿主から収集された。標的種またはヒト医薬組成物の場合の非ヒト霊長類における初期の免疫原性研究も実施され、免疫原性及び設計の方向性をさらに検証する。次いで、さまざまな混合物で標的ペプチドを調製し、組み合わせて使用してそれぞれの製剤設計を調製するとき、ペプチドコンストラクト間のそれぞれの相互作用に関連する機能特性の微妙な相違を評価する。追加の評価の後、最終的なペプチドコンストラクト、ペプチド組成物、及びその製剤が、製剤のそれぞれの物理的パラメーターとともに確立され、最終製品開発プロセスをもたらす。

0170

b.シヌクレイノパチー患者を治療する可能性のある医薬組成物のためのα−Syn由来ペプチド免疫原コンストラクトの設計と検証
医薬品組成物に組み込むための最も強力なペプチドコンストラクトを生成するために、麻疹ウイルス融合(MVF)タンパク質配列またはB型肝炎表面抗原(HBsAg)タンパク質からさらに設計された、さまざまな病原体または人工Tヘルパーエピトープに由来する無差別Tヘルパーエピトープの大きなレパートリーは、モルモットの免疫原性研究に組み込まれた。α−Syn126−140、α−Syn121−140、α−Syn111−140、α−Syn101−140、α−Syn91−140、α−Syn85−140、α−Syn121−135、α−Syn111−135、α−Syn101−135、α−Syn97−135、α−Syn123−135、α−Syn126−135、α−Syn111−132、及びα−Syn101−132由来のペプチドコンストラクトの代表的な研究は、表3(配列番号99〜121)に示され、α−Synペプチドは、スペーサー(複数可)としてεK及び/またはKKKを介して、個々の無差別Tヘルパーエピトープと結合していた。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ