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技術 FcγR非依存性アゴニスト活性がある腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(TNFRSF)受容体活性化抗体融合タンパク質(FcγR非依存性アゴニスト活性があるTNFRSF受容体活性化抗体融合タンパク質;TRAAFFIAA)

出願人 ユリウス・マクシミリアンス-ウニヴェルジテート・ヴュルツブルク
発明者 ベイルハック,アンドレアスクムス,ユリアンネルケ,ヨハネスワヤント,ハラルド
出願日 2018年12月20日 (2年5ヶ月経過) 出願番号 2020-536151
公開日 2021年3月11日 (3ヶ月経過) 公開番号 2021-508478
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 医薬品製剤 微生物による化合物の製造 ペプチド又は蛋白質 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤
主要キーワード 接触表面領域 構造的性 クリック化学 シングルドメイン ゲルろ過分析 核酸セット 自己凝集 成熟度
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、FcγR非依存性アゴニスト活性がある腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(TNFRSF受容体活性抗体融合タンパク質、及びそれに関連する組成物及び方法に関する。

概要

背景

腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリーの受容体とその活性
腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(TNFRSF)の受容体の大部分は、細胞外ドメインに1〜6の構造的に保存されたシステインリッチドメインCRDs)がある1型又は3型膜貫通タンパク質である。さらに、少数分泌型又はGPIアンカー型受容体分子が存在し、それらにはCRDがある事実からTNFRSFの一部と考えられる。上記以外、TNFRSFのすべての受容体に共通する構造的性質はない。構造的及び機能的な類似性によれば、TNFRSF内で、以下の3つのサブグループが定義されうる(図1)。

1.細胞死受容体のサブグループのTNFRSF受容体は、その細胞ドメインの構造的に保存されたタンパク質タンパク質相互作用ドメイン、その名前由来でもある「細胞死ドメイン」(DD)により定義される。当該受容体のすべてではなく、しかしいくつかは、アポトーシス又は壊死誘導しうるが、他の効果/シグナル伝達経路をも誘発しうる。例としては、CD95(Fas又はApo1ともいう)、TRAILR1(DR4)及びTRAILR2(DR5)があげられる。

2.TRAF相互作用サブグループのTNFRSF受容体には、DDはないものの、短いアミノ酸配列モチーフがあり、TNF受容体関連因子(TRAF)ファミリーアダプタータンパク質動員する。当該TNFRSFサブグループの受容体は、当該TRAFタンパク質により、様々なシグナル伝達経路を活性化しうる。例としては、TNFR2、CD40、4−1BB、OX40、CD27、Fn14及びBaffRがあげられる。

3.デコイTNFRSF受容体は、細胞内ドメインがなく、各細胞膜外表面上のGPI部分により、分泌され、固定される。当該TNFRSF受容体は、それ自体はシグナルを伝達しないが、サブグループ1及び2のいくつかの受容体の活性を制御する。

通常、TNFRSFのシグナル伝達能がある受容体は、TNFスーパーファミリー(TNFSF)のリガンドとの相互作用により自然に活性化される。TNFSFへのリガンドの配分は、C末端保存ドメイン、TNF相同性ドメイン(THD)の存在に支配される。TNFSFのリガンドはTHDを介してホモ三量体分子を形成するが、ヘテロ三量体分子を形成する場合もある。分泌されたLTαホモ三量体は別として、TNFファミリーのすべてのリガンドは、最初はII型膜タンパク質として発現される。したがって、THDは細胞外局在する。しかし、これらの場合、THDとTNFSFリガンドの膜貫通ドメインとの間のタンパク質分解プロセシングにより、可溶性三量体リガンド分子も形成される(図1)。単一のTNFRSF受容体分子は、リガンド三量体の隣接プロトマー間で形成される接触表面領域に動員される。したがって、TNFSFリガンド分子はTNFRSFの3つの受容体に結合し、これは可溶性のTNFSFリガンド分子と膜結合型のTNFSFリガンド分子の両方に当てはまる。知られている限りでは、膜結合型TNFSFリガンドの結合は常に強力な受容体活性化をもたらす。しかし、可溶性TNFSFリガンドの結合後の細胞内シグナル伝達経路の安定かつ効率的な活性化の程度は、特異的TNFRSF受容体に依存する。したがって、TNFRSF受容体(例えば、TNFR1、GITR、LTbR又はDR3)は、可溶性リガンド三量体の結合により強く活性化されるが、一方、TNFRSF受容体(例えば、TNFR2、Fn14、TRAILR1、TRAILR2、CD95、OX40、CD27、4−1BB及びCD40)は、可溶性リガンド三量体により刺激されないか、又は刺激されたとしても極めてわずかである。その場合、可溶性TNFリガンドは膜結合型の競合的阻害剤として作用しさえしうる。当該第2グループのTNFRSF受容体の膜結合型リガンドによる刺激が、なぜ可溶性リガンド分子による刺激よりもはるかに優れているのかという課題は、まだ完全には解明されていない。しかしながら、現在では、三量体リガンド−受容体複合体は、ほとんどのシグナル伝達経路の刺激に十分ではないと考えられており、当該複合体のうちの少なくとも2つがシグナル伝達を効率的に開始するには、二次的に相互作用しなければならない。このため、TNFRSFのいくつかの受容体は、微弱ながらもリガンド非依存的自己親和性があることが示された。膜結合型リガンド三量体の膜局在化により、空間的な予備配向がおこり、可溶性リガンドと比較すると拡散は低下し、及びTNFRSF受容体とTNFSFリガンド発現細胞との間の接触領域における相互作用パートナーの濃度は局所的に非常に高くなる。したがって、三量体リガンド−受容体複合体を最初に形成する自然発生的な二次凝集は、おそらく膜結合型リガンドの結合のすべての場合に起こりうる。しかし、可溶性リガンド三量体の結合の場合、おそらく第2グループのTNFRSF受容体の自己親和性は微弱すぎて、この二次凝集は確実ではない。当該モデルによれば、2つ以上の三量体リガンドドメインを含む可溶性融合タンパク質及びTNFSFリガンド複合体は各々、第2グループのTNFRSF受容体を、膜結合型リガンドと同様に活性化しうる。さらに、細胞又は他の表面上へ三量体可溶性TNFSFリガンドの単なる固定により、第2グループのTNFRSF受容体が十分に活性化されることも示された(総説では、非特許文献1参照)。

TNFRSFの受容体を活性化する第2の可能性は、抗体の使用である。これは、様々な臨床概念、特に腫瘍疾患治療との関連で、TNFRSFの細胞死誘導性又は免疫刺激性受容体の活性化を目的とすることを考慮すると、非常に重要である。従って、特に、TNFRSF受容体TRAILR2、CD40、Fn14、CD27、OX40及び4−1BBを標的とする抗体が、臨床試験試験されているか、又は試験されてきた。これに関連して、抗TNFRSF受容体特異的抗体が受容体を刺激させて作用するのは、いつ、どのような状況下であるかという問題は、長い間顧みられなかった。通常、これは主として抗体により具体的に認識されるエピトープの問題であると仮定された。特に、これまで長い間、この点に関して、可溶性TNFSFリガンドと同様に、主として分子が提示される原子価及び方法が、受容体活性化の発生、すなわち、抗体のアゴニストとしての作用性を決定することを示す。従って、可溶性リガンドでは十分には刺激されないTNFRSF受容体を認識する様々な二価IgG1及びIgG2抗体に関して、それらが二次的に第2抗体又はタンパク質Gにより架橋される場合、又は当該抗体が細胞結合Fcγ受容体(FcγR)に同時に結合できる場合にのみ、それらがアゴニストとして効果的に作用することが見出された(総説について、非特許文献2、特に、図2及び3を参照のこと)。

このことは、とりわけ、リガンド結合を遮断するアンタゴニスト抗体が、FcγRへの結合に際して、強力なアゴニストとして作用する、すなわち、認識されたエピトープではなく、むしろ抗体がその抗原に結合する形態が、抗体の効果に主としてかかわるという一見矛盾した状況につながる(全ての目的のために参照により本明細書に援用される非特許文献3を参照のこと)。さらに、本発明者らは、可溶性リガンドにより既に効率的に活性化されているTNFRSF受容体を認識するIgG抗体が、一般に、さらなる架橋又はFcγR結合を伴わず、アゴニスト的に作用することを見出した(図2、αTNF1及びαLTβRに関する例を含むパネルを参照のこと)。

概要

本発明は、FcγR非依存性アゴニスト活性がある腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(TNFRSF)受容体活性化抗体融合タンパク質、及びそれに関連する組成物及び方法に関する。

目的

これは、様々な臨床概念、特に腫瘍疾患の治療との関連で、TNFRSFの細胞死誘導性又は免疫刺激性受容体の活性化を目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

i)抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分、及びii)細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメイン、を含む、融合タンパク質

請求項2

構造が、TNFRSF受容体発現細胞の細胞表面の構造、又はTNFRSF受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞表面の構造である、請求項1に記載の融合タンパク質。

請求項3

構造が、TNFRSF受容体発現細胞の細胞外マトリクスの構造、又はTNFRSF受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞外マトリクスの構造である、請求項1に記載の融合タンパク質。

請求項4

構造が、細胞表面のタンパク質又は糖、好ましくは細胞表面タンパク質である、請求項2に記載の融合タンパク質。

請求項5

構造が、細胞外マトリクスのタンパク質又は糖、好ましくは細胞外マトリクスタンパク質である、請求項3に記載の融合タンパク質。

請求項6

i)の抗体又はその抗原結合部分が、モノクローナルである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項7

i)の抗体又はその抗原結合部分が、全長抗体Fab2断片、Fab断片、又はVH及びVLがTNFRSF受容体特異的scFv断片で置換された抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項8

i)の抗体又はその抗原結合部分が、Fcドメインを含まない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項9

i)の抗体又はその抗原結合部分が、1又はそれ以上のFcγR型、好ましくはN297A変異を含む、全長抗体への結合能が低下した抗体変異体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項10

i)の抗体又はその抗原結合部分が、IgG1、IgG2若しくはIgG4抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項11

i)の抗体又はその抗原結合部分が、二価抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項12

i)の抗体又はその抗原結合部分が、抗TNFR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD40抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD95抗体若しくはその抗原結合部分、抗Fn14抗体若しくはその抗原結合部分、抗TRAILR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗TRAILR1抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD27抗体若しくはその抗原結合部分、抗OX40抗体若しくはその抗原結合部分、抗4−1BB抗体若しくはその抗原結合部分、抗BaffR抗体若しくはその抗原結合部分、抗TACI抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗BCMA抗体又はその抗原結合部分からなる群より選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項13

i)の抗体又はその抗原結合部分が、抗TNFR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD40抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD95抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗Fn14抗体若しくはその抗原結合部分からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項14

ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、前記scTNFSFリガンドが、好ましくはTNFR2、GITR、4−1BB、BaffR、TACI、CD40、Fn14又はOX40のリガンドである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項15

ii)のドメインが、抗体の抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分が、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項16

細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、1又はそれ以上のFcγR型、好ましくはFab2断片、scFv断片又はFab断片、より好ましくはscFv断片又はFab断片への結合能が低下した抗原結合部分である、請求項15に記載の融合タンパク質。

請求項17

細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、Fab断片である、請求項15又は16に記載の融合タンパク質。

請求項18

細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、scFv断片である、請求項15又は16に記載の融合タンパク質。

請求項19

細胞表面の構造及び/若しくは細胞外マトリクスの構造又はその抗原結合部分に結合しうる抗原結合部分が、抗CD20抗原結合部分、抗CD70抗原結合部分、抗CD19抗原結合部分、抗EGFR抗原結合部分、抗Her2抗原結合部分、抗Fn14抗原結合部分、抗CD40L抗原結合部分、又は抗PD1L抗原結合部分からなる群より選択される、請求項15〜18のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項20

ii)のドメインが、Fcドメインを含まない、請求項1〜19のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項21

ii)のドメインが、抗体又はその抗原結合断片を含まない、請求項1〜14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項22

ii)のドメインの細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造への結合が抗原非依存性である、請求項1〜14又は21のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項23

ii)のドメインが、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分を含まない、請求項1〜22のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項24

ii)のドメインが、インターフェロンドメイン又はインターロイキンドメインを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項25

ii)のドメインが、IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγを含み、好ましくは、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうる、IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγの変異体からなり、かつ、ここで、前記IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγは、好ましくは、ヒトIL−2、ヒトIL−4、ヒトIL−10、ヒトIFNα、ヒトIFNβ又はヒトIFNγである、請求項1〜24のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項26

融合タンパク質は、i)の抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分を含むが、ii)のドメインは含まないタンパク質と比較して、TNFRSF受容体の刺激を高めるうる、請求項1〜25のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項27

細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうる、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分の融合タンパク質。

請求項28

構造に結合すると、TNFRSF受容体の刺激を高めうる、請求項27に記載の融合タンパク質。

請求項29

融合タンパク質は、TNFRSF受容体である、TNFR2、CD40、CD95、Fn14、TRAILR2、TRAILR1、CD27、OX40、4−1BB、BaffR、TACI又はBCMAに結合しうる、請求項27又は28に記載の融合タンパク質。

請求項30

融合タンパク質が、細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるscFvドメイン、又は細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるscTNFSFリガンド若しくは他のタンパク質ドメインとの融合である、請求項27〜29のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項31

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fab2又はFab断片である、請求項27〜30のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項32

前記融合タンパク質が、配列番号19及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号21及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号22及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号24及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号25及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号26及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号28及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号29及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号30及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号32及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号34及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号35及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号118及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号119及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号120及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号121及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号122及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号123及び124のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、及び配列番号125及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、から選択される、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項33

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号37のCDR1アミノ酸配列、配列番号38のCDR2アミノ酸配列、及びCDR3アミノ酸配列LDYを含む重鎖を含み、並びに、配列番号39のCDR1アミノ酸配列、配列番号40のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号41のCDR3アミノ酸配列を含む、抗CD40抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項34

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号42のCDR1アミノ酸配列、配列番号43のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号44のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号45のCDR1アミノ酸配列、配列番号46のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号47のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD95抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項35

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号48のCDR1アミノ酸配列、配列番号49のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号50のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号51のCDR1アミノ酸配列、配列番号52のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号53のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗DR5抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項36

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号54のCDR1アミノ酸配列、配列番号55のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号56のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号57のCDR1アミノ酸配列、配列番号58のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号59のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Fn14抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項37

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号84のCDR1アミノ酸配列、配列番号85のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号86のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号87のCDR1アミノ酸配列、配列番号88のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号89のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Fn14抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項38

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号60のCDR1アミノ酸配列、配列番号61のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号62のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号63のCDR1アミノ酸配列、配列番号64のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号65のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗TNFR2抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項39

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号126のCDR1アミノ酸配列、配列番号127のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号128のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号129のCDR1アミノ酸配列、配列番号130のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号131のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗4−1BB抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項40

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、HBBK4又はその4−1BB結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項41

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、CD40への結合について、請求項33に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項42

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、CD95への結合について、請求項34に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項43

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、DR5への結合について、請求項35に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項44

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fn14への結合について、請求項36に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項45

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fn14への結合について、請求項37に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項46

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、TNFR2への結合について、請求項38に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項47

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、請求項39に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項48

抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、請求項40に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項49

ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号66のCDR1アミノ酸配列、配列番号67のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号68のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号69のCDR1アミノ酸配列、配列番号70のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号71のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD20抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項50

ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号72のCDR1アミノ酸配列、配列番号73のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号74のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号75のCDR1アミノ酸配列、配列番号76のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号77のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD19抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項51

ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号78のCDR1アミノ酸配列、配列番号79のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号80のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号81のCDR1アミノ酸配列、配列番号82のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号83のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項52

ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号90のCDR1アミノ酸配列、配列番号91のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号92のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号93のCDR1アミノ酸配列、配列番号94のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号95のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項53

ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、a)CD20への結合について、請求項49に記載の抗CD20抗体と交差競合しうる、抗CD20抗体又はその抗原結合部分、又はb)CD19への結合について、請求項50に記載の抗CD19抗体と交差競合しうる、抗CD19抗体又はその抗原結合部分、又はc)CD70への結合について、請求項51に記載の抗CD70抗体又はその抗原結合部分と交差競合しうる、抗CD70抗体又はその抗原結合部分、又はd)CD70への結合について、請求項52に記載の抗−CD70抗体と交差競合しうる、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項54

ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号96のアミノ酸配列を含む抗CD20scFv断片、又は配列番号96のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD20scFv断片である、請求項1〜26及び33〜53のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項55

ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号98のアミノ酸配列を含む抗CD19scFv断片、又は配列番号98のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD19scFv断片である、請求項1〜26及び33〜53のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項56

ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号144のアミノ酸配列を含む抗CD70scFv断片、又は配列番号144のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD70scFv断片である、請求項1〜26及び33〜53のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項57

ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号145のアミノ酸配列を含む抗CD70scFv断片、又は配列番号145のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD70scFv断片である、請求項1〜26及び33〜53のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項58

ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、ここで、前記scTNFSFリガンドは、TNFR2のリガンドであり、前記リガンドは、アミノ酸配列が、配列番号102のアミノ酸配列又は配列番号102と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscTNF80である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項59

ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、かつscTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号103のアミノ酸配列又は配列番号103と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscBaffである、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項60

ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、前記scTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号104のアミノ酸配列又は配列番号104と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscGITRLである、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項61

ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、かつscTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号105のアミノ酸配列又は配列番号105と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるsc41BBLである、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項62

ii)のドメインが、TNFSFリガンドを含み、前記TNFSFリガンドが、アミノ酸配列が、配列番号106のアミノ酸配列又は配列番号106と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるGITRLである、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。

請求項63

細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、免疫細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、請求項1〜62のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項64

細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、線維芽細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、請求項1〜63のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項65

細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、腫瘍細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、請求項1〜64のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

請求項66

請求項1〜65のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物

請求項67

請求項1〜65のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸又は核酸のセット。

請求項68

少なくとも1のタイプの宿主細胞において、請求項67に記載の核酸又は核酸セット発現させて、前記融合タンパク質を回収することを含む、請求項1〜65のいずれか一項に記載の融合タンパク質を作製する方法。

技術分野

0001

本発明は、FcγR非依存性アゴニスト活性がある腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(TNFRSF受容体活性抗体融合タンパク質略称TRAAFFIAA)、及びそれに関連する組成物及び方法に関する。

背景技術

0002

腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリーの受容体とその活性
腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(TNFRSF)の受容体の大部分は、細胞外ドメインに1〜6の構造的に保存されたシステインリッチドメインCRDs)がある1型又は3型膜貫通タンパク質である。さらに、少数分泌型又はGPIアンカー型受容体分子が存在し、それらにはCRDがある事実からTNFRSFの一部と考えられる。上記以外、TNFRSFのすべての受容体に共通する構造的性質はない。構造的及び機能的な類似性によれば、TNFRSF内で、以下の3つのサブグループが定義されうる(図1)。

0003

1.細胞死受容体のサブグループのTNFRSF受容体は、その細胞ドメインの構造的に保存されたタンパク質タンパク質相互作用ドメイン、その名前由来でもある「細胞死ドメイン」(DD)により定義される。当該受容体のすべてではなく、しかしいくつかは、アポトーシス又は壊死誘導しうるが、他の効果/シグナル伝達経路をも誘発しうる。例としては、CD95(Fas又はApo1ともいう)、TRAILR1(DR4)及びTRAILR2(DR5)があげられる。

0004

2.TRAF相互作用サブグループのTNFRSF受容体には、DDはないものの、短いアミノ酸配列モチーフがあり、TNF受容体関連因子(TRAF)ファミリーアダプタータンパク質動員する。当該TNFRSFサブグループの受容体は、当該TRAFタンパク質により、様々なシグナル伝達経路を活性化しうる。例としては、TNFR2、CD40、4−1BB、OX40、CD27、Fn14及びBaffRがあげられる。

0005

3.デコイTNFRSF受容体は、細胞内ドメインがなく、各細胞膜外表面上のGPI部分により、分泌され、固定される。当該TNFRSF受容体は、それ自体はシグナルを伝達しないが、サブグループ1及び2のいくつかの受容体の活性を制御する。

0006

通常、TNFRSFのシグナル伝達能がある受容体は、TNFスーパーファミリー(TNFSF)のリガンドとの相互作用により自然に活性化される。TNFSFへのリガンドの配分は、C末端保存ドメイン、TNF相同性ドメイン(THD)の存在に支配される。TNFSFのリガンドはTHDを介してホモ三量体分子を形成するが、ヘテロ三量体分子を形成する場合もある。分泌されたLTαホモ三量体は別として、TNFファミリーのすべてのリガンドは、最初はII型膜タンパク質として発現される。したがって、THDは細胞外局在する。しかし、これらの場合、THDとTNFSFリガンドの膜貫通ドメインとの間のタンパク質分解プロセシングにより、可溶性三量体リガンド分子も形成される(図1)。単一のTNFRSF受容体分子は、リガンド三量体の隣接プロトマー間で形成される接触表面領域に動員される。したがって、TNFSFリガンド分子はTNFRSFの3つの受容体に結合し、これは可溶性のTNFSFリガンド分子と膜結合型のTNFSFリガンド分子の両方に当てはまる。知られている限りでは、膜結合型TNFSFリガンドの結合は常に強力な受容体活性化をもたらす。しかし、可溶性TNFSFリガンドの結合後の細胞内シグナル伝達経路の安定かつ効率的な活性化の程度は、特異的TNFRSF受容体に依存する。したがって、TNFRSF受容体(例えば、TNFR1、GITR、LTbR又はDR3)は、可溶性リガンド三量体の結合により強く活性化されるが、一方、TNFRSF受容体(例えば、TNFR2、Fn14、TRAILR1、TRAILR2、CD95、OX40、CD27、4−1BB及びCD40)は、可溶性リガンド三量体により刺激されないか、又は刺激されたとしても極めてわずかである。その場合、可溶性TNFリガンドは膜結合型の競合的阻害剤として作用しさえしうる。当該第2グループのTNFRSF受容体の膜結合型リガンドによる刺激が、なぜ可溶性リガンド分子による刺激よりもはるかに優れているのかという課題は、まだ完全には解明されていない。しかしながら、現在では、三量体リガンド−受容体複合体は、ほとんどのシグナル伝達経路の刺激に十分ではないと考えられており、当該複合体のうちの少なくとも2つがシグナル伝達を効率的に開始するには、二次的に相互作用しなければならない。このため、TNFRSFのいくつかの受容体は、微弱ながらもリガンド非依存的自己親和性があることが示された。膜結合型リガンド三量体の膜局在化により、空間的な予備配向がおこり、可溶性リガンドと比較すると拡散は低下し、及びTNFRSF受容体とTNFSFリガンド発現細胞との間の接触領域における相互作用パートナーの濃度は局所的に非常に高くなる。したがって、三量体リガンド−受容体複合体を最初に形成する自然発生的な二次凝集は、おそらく膜結合型リガンドの結合のすべての場合に起こりうる。しかし、可溶性リガンド三量体の結合の場合、おそらく第2グループのTNFRSF受容体の自己親和性は微弱すぎて、この二次凝集は確実ではない。当該モデルによれば、2つ以上の三量体リガンドドメインを含む可溶性融合タンパク質及びTNFSFリガンド複合体は各々、第2グループのTNFRSF受容体を、膜結合型リガンドと同様に活性化しうる。さらに、細胞又は他の表面上へ三量体可溶性TNFSFリガンドの単なる固定により、第2グループのTNFRSF受容体が十分に活性化されることも示された(総説では、非特許文献1参照)。

0007

TNFRSFの受容体を活性化する第2の可能性は、抗体の使用である。これは、様々な臨床概念、特に腫瘍疾患治療との関連で、TNFRSFの細胞死誘導性又は免疫刺激性受容体の活性化を目的とすることを考慮すると、非常に重要である。従って、特に、TNFRSF受容体TRAILR2、CD40、Fn14、CD27、OX40及び4−1BBを標的とする抗体が、臨床試験試験されているか、又は試験されてきた。これに関連して、抗TNFRSF受容体特異的抗体が受容体を刺激させて作用するのは、いつ、どのような状況下であるかという問題は、長い間顧みられなかった。通常、これは主として抗体により具体的に認識されるエピトープの問題であると仮定された。特に、これまで長い間、この点に関して、可溶性TNFSFリガンドと同様に、主として分子が提示される原子価及び方法が、受容体活性化の発生、すなわち、抗体のアゴニストとしての作用性を決定することを示す。従って、可溶性リガンドでは十分には刺激されないTNFRSF受容体を認識する様々な二価IgG1及びIgG2抗体に関して、それらが二次的に第2抗体又はタンパク質Gにより架橋される場合、又は当該抗体が細胞結合Fcγ受容体(FcγR)に同時に結合できる場合にのみ、それらがアゴニストとして効果的に作用することが見出された(総説について、非特許文献2、特に、図2及び3を参照のこと)。

0008

このことは、とりわけ、リガンド結合を遮断するアンタゴニスト抗体が、FcγRへの結合に際して、強力なアゴニストとして作用する、すなわち、認識されたエピトープではなく、むしろ抗体がその抗原に結合する形態が、抗体の効果に主としてかかわるという一見矛盾した状況につながる(全ての目的のために参照により本明細書に援用される非特許文献3を参照のこと)。さらに、本発明者らは、可溶性リガンドにより既に効率的に活性化されているTNFRSF受容体を認識するIgG抗体が、一般に、さらなる架橋又はFcγR結合を伴わず、アゴニスト的に作用することを見出した(図2、αTNF1及びαLTβRに関する例を含むパネルを参照のこと)。

先行技術

0009

Wajant et al., Cancer Lett. 2013 May 28;332(2):163-74
Wajant 2015, Cell Death Differ. 2015 Nov;22(11):1727-41
Trebing et al., MAbs. 2014 Jan-Feb;6(1):297-308

発明が解決しようとする課題

0010

可溶性TNFリガンド及び抗体によっては、各々刺激されないTNFRSF受容体を認識する二価IgG抗体のアゴニスト活性に対する条件により、臨床的アプローチでそれらを用いるのが困難になるか、又は使用できない場合さえある。当該抗TNFRSF受容体抗体のFcγR結合により、TNFRSF受容体が活性化され、かつFcγ受容体も刺激するため、望ましくない作用が生じる可能性があり、それにより臨床適用が困難になるか、又は適用できない場合さえある。活性化FcγRへ結合した場合、例えば、ADCC、CDC又は食作用を介して、TNFRSF受容体発現細胞が除去/破壊されうる。これを防ぐため、阻害するFcγR、CD32Bと、より強く作用する、又は好ましくは相互作用するIgG突然変異体を用いうる。しかし、CD32Bの免疫抑制活性も同様に問題がある。より詳細には、標的TNFRSF受容体を発現する標的細胞の近傍に、十分数のCD32B発現細胞が常に見出されうるとは限らない。自己凝集しやすいIgM抗体及びIgG3抗体は、結合活性(二次的にオリゴマー化された可溶性リガンド三量体に類似)が高く、FcγR結合の非存在下でアゴニスト的に作用しうるが、当該抗体の開発は、IgG1、IgG2及びIgG4抗体よりも困難であり、確立もされてない。

0011

したがって、TNFRSFの受容体を標的とする改良剤が必要である。特に、TNFRSFの受容体を効果的に、より高い精度で標的化し、既存のTNFRSF標的化剤よりも望ましくない副作用がおこる可能性が低い薬剤を得ることが望ましい。

課題を解決するための手段

0012

本発明は、上記課題を解決し、本技術分野における上記要望応える。

0013

本発明の抗−TNFRSF受容体抗体融合タンパク質は、抗体部分抗原結合ドメイン及びおそらく存在する天然又は変異Fcドメインとは独立して、細胞結合構造又は細胞外マトリクスの構造に結合する。驚くべきことに、本発明者らは、当該融合タンパク質について、これらの融合タンパク質に含まれる抗TNFRSF受容体抗体(又はその抗原結合部分)が、標的化された細胞構造又は細胞外マトリクスと相互作用した後、強力なアゴニストとして、すなわち、FcγR結合とは独立したTNFRSF受容体刺激的に作用することを見出した(例えば、非限定的な例として図4〜12を参照されたい)。

0014

これは、以下のいくつかの理由から有利であり、例えば、FcγR非依存的な刺激は、FcγRが発現される状況に限定されず、有利である。さらに、FcγRの刺激に起因する副作用を回避しうる点でも有利である。当該副作用としては、ADCC、CDC又は食作用を介するTNFRSF受容体発現細胞の除去/破壊、及びFcγR CD32Bの免疫阻害活性があげられる。

0015

従って、一態様では、本発明は、FcγRに結合せず、効率的にTNFRSFの受容体を刺激しうる、抗体融合タンパク質の形態を開示する。抗TNFRSF受容体抗体に融合されるドメインの適当な選択に際して、本発明によるFcγR非依存的なアゴニスト活性(TRAAFFIAA)がある腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(TNFRSF)受容体活性化抗体融合タンパク質には、また、二機能的及び/又はプロドラッグ様特性がありうる。本明細書の記載のように、「二機能的」とは、構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメインにより結合される場合、細胞表面又は細胞外マトリクス(例えば、細胞表面又は細胞外マトリクスのタンパク質)の構造が阻害又は刺激される状態をいう。このような場合、TRAAFFIAAは、TNFRSF受容体シグナル伝達を活性化するだけでなく、標的分子構造の活性を調節するため、二機能的である。本明細書の記載のように、プロドラッグは、腫瘍関連因子(例えば、酵素低酸素症)により活性化される。例えば、腫瘍抗原を標的とするTRAAFFiAAは、腫瘍においてのみアゴニスト活性を獲得するため、プロドラッグのように作用する。

0016

本発明者らの研究から、TRAAFFIAAに用いられる適当に選択された固定化ドメインを用いて、標的構造に限定される局所アゴニスト効果がin vivoで達成されうることは直ちに明らかである。これにより、治療が限定される全身性の副作用を回避しうる。すなわち、TRAAFIAAは、抗体でTNFRSF受容体を有利にFcγR非依存的に刺激し、臨床応用を含む新たな応用分野展開される。

0017

そこで、本発明は、以下の好ましい実施形態を含む。
1. i) 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分、及び
ii)細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメイン、を含む、融合タンパク質。
2.構造が、TNFRSF受容体発現細胞の細胞表面の構造、又はTNFRSF受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞表面の構造である、1に記載の融合タンパク質。
3.構造が、TNFRSF受容体発現細胞の細胞外マトリクスの構造、又はTNFRSF受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞外マトリクスの構造である、1に記載の融合タンパク質。
4.構造が、細胞表面のタンパク質又は糖、好ましくは細胞表面タンパク質である、2に記載の融合タンパク質。
5.構造が、細胞外マトリクスのタンパク質又は糖、好ましくは細胞外マトリクスタンパク質である、3に記載の融合タンパク質。
6.i)の抗体又はその抗原結合部分が、モノクローナルである、1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
7.i)の抗体又はその抗原結合部分が、全長抗体Fab2断片、Fab断片、又はVH及びVLがTNFRSF受容体特異的scFv断片で置換された抗体である、1〜6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
8.i)の抗体又はその抗原結合部分が、Fcドメインを含まない、1〜7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
9.i)の抗体又はその抗原結合部分が、1又はそれ以上のFcγR型、好ましくはN297A変異を含む、全長抗体への結合能が低下した抗体変異体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
10.i)の抗体又はその抗原結合部分が、IgG1、IgG2若しくはIgG4抗体又はその抗原結合部分である、1〜9のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
11.i)の抗体又はその抗原結合部分が、二価抗体又はその抗原結合部分である、1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
12.i)の抗体又はその抗原結合部分が、抗TNFR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD40抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD95抗体若しくはその抗原結合部分、抗Fn14抗体若しくはその抗原結合部分、抗TRAILR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗TRAILR1抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD27抗体若しくはその抗原結合部分、抗OX40抗体若しくはその抗原結合部分、抗4−1BB抗体若しくはその抗原結合部分、抗BaffR抗体若しくはその抗原結合部分、抗TACI抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗BCMA抗体又はその抗原結合部分からなる群より選択される、1〜11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
13.i)の抗体又はその抗原結合部分が、抗TNFR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD40抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD95抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗Fn14抗体若しくはその抗原結合部分からなる群より選択される、1〜12のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
14.ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、前記scTNFSFリガンドが、好ましくはTNFR2、GITR、4−1BB、BaffR、TACI、CD40、Fn14又はOX40のリガンドである、1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
15.ii)のドメインが、抗体又は抗体の抗原結合部分を含み、前記抗体又は抗原結合部分が、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、1〜14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
16.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗体又は抗原結合部分が、PD−L1に結合しうるチェックポイント阻害抗体又はその抗原結合部分、好ましくはアベルマブ(Avelumab)又はそのPD−L1結合部分である、15に記載の融合タンパク質。
17.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗体又は抗原結合部分が、抗CD27抗体又はその抗原結合部分である、15に記載の融合タンパク質。
18.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、1又はそれ以上のFcγR型、好ましくはFab2断片、scFv断片又はFab断片、より好ましくはscFv断片又はFab断片への結合能が低下した抗原結合部分である、15〜17に記載の融合タンパク質。
19.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、Fab断片である、15〜18のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
20.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、scFv断片である、15〜18のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
21.細胞表面の構造及び/若しくは細胞外マトリクスの構造又はその抗原結合部分に結合しうる抗原結合部分が、抗CD20抗原結合部分、抗CD70抗原結合部分、抗CD19抗原結合部分、抗EGFR抗原結合部分、抗Her2抗原結合部分、抗Fn14抗原結合部分、抗CD40L抗原結合部分、又は抗PD1L抗原結合部分からなる群より選択される、15〜20のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
22.ii)のドメインが、Fcドメインを含まない、1〜21のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
23.ii)のドメインが、抗体又はその抗原結合断片を含まない、1〜14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
24.ii)のドメインの細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造への結合が抗原非依存性である、1〜14又は23のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
25.ii)のドメインが、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分を含まない、1〜16、及び18〜22のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
26.ii)のドメインが、インターフェロンドメイン又はインターロイキンドメインを含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
27.ii)のドメインが、IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγを含み、好ましくは、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうる、IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγの変異体からなり、かつ、ここで、前記IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγは、好ましくは、ヒトIL−2、ヒトIL−4、ヒトIL−10、ヒトIFNα、ヒトIFNβ又はヒトIFNγである、1〜26のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
28.融合タンパク質は、i)の抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分を含むが、ii)のドメインは含まないタンパク質と比較して、TNFRSF受容体の刺激を高めるうる、1〜27のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
29.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうる、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分の融合タンパク質。
30.構造に結合すると、TNFRSF受容体の刺激を高めうる、29に記載の融合タンパク質。
31.融合タンパク質は、TNFRSF受容体である、TNFR2、CD40、CD95、Fn14、TRAILR2、TRAILR1、CD27、OX40、4−1BB、BaffR、TACI又はBCMAに結合しうる、29又は30に記載の融合タンパク質。
32.融合タンパク質が、細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるscFvドメイン、又は細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるscTNFSFリガンド若しくは他のタンパク質ドメインとの融合である、29〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
33.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fab2又はFab断片である、29〜32のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
34.前記融合タンパク質が、配列番号19及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号21及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号22及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号24及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号25及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号26及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号28及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号29及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号30及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号32及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号34及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号35及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号118及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号119及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号120及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号121及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号122及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号123及び124のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、及び配列番号125及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、から選択される、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
35.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号37のCDR1アミノ酸配列、配列番号38のCDR2アミノ酸配列、及びCDR3アミノ酸配列LDYを含む重鎖を含み、並びに、配列番号39のCDR1アミノ酸配列、配列番号40のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号41のCDR3アミノ酸配列を含む、抗CD40抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
36.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号42のCDR1アミノ酸配列、配列番号43のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号44のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号45のCDR1アミノ酸配列、配列番号46のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号47のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD95抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
37.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号48のCDR1アミノ酸配列、配列番号49のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号50のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号51のCDR1アミノ酸配列、配列番号52のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号53のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗DR5抗体又はその抗原結合部分である、1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
38.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号54のCDR1アミノ酸配列、配列番号55のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号56のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号57のCDR1アミノ酸配列、配列番号58のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号59のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Fn14抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
39.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号84のCDR1アミノ酸配列、配列番号85のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号86のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号87のCDR1アミノ酸配列、配列番号88のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号89のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Fn14抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
40.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号60のCDR1アミノ酸配列、配列番号61のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号62のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号63のCDR1アミノ酸配列、配列番号64のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号65のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗TNFR2抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
41.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号126のCDR1アミノ酸配列、配列番号127のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号128のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号129のCDR1アミノ酸配列、配列番号130のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号131のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗4−1BB抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
42.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、HBBK4又はその4−1BB結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
43.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号132のCDR1アミノ酸配列、配列番号133のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号134のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号135のCDR1アミノ酸配列、配列番号136のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号137のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗4−1BB抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
44.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、ウレルマブ(urelumab)又はその4−1BB結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
45.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号138のCDR1アミノ酸配列、配列番号139のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号140のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号141のCDR1アミノ酸配列、配列番号142のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号143のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗4−1BB抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
46.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、ウトミルマブ(utomilumab)又はその4−1BB結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
47.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、CD40への結合について、35に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
48.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、CD95への結合について、36に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
49.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、DR5への結合について、37に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
50.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fn14への結合について、38に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
51.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fn14への結合について、39に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
52.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、TNFR2への結合について、40に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
53.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、41に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
54.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、42に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
55.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、43に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
56.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、44に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
57.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、45に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
58.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、46に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
59.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号66のCDR1アミノ酸配列、配列番号67のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号68のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号69のCDR1アミノ酸配列、配列番号70のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号71のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD20抗体又はその抗原結合部分である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
60.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号72のCDR1アミノ酸配列、配列番号73のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号74のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号75のCDR1アミノ酸配列、配列番号76のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号77のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD19抗体又はその抗原結合部分である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
61.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号78のCDR1アミノ酸配列、配列番号79のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号80のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号81のCDR1アミノ酸配列、配列番号82のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号83のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
62.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号90のCDR1アミノ酸配列、配列番号91のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号92のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号93のCDR1アミノ酸配列、配列番号94のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号95のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
63.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、a)CD20への結合について、59に記載の抗CD20抗体と交差競合しうる、抗CD20抗体又はその抗原結合部分、又はb)CD19への結合について、60に記載の抗CD19抗体と交差競合しうる、抗CD19抗体又はその抗原結合部分、又はc)CD70への結合について、61に記載の抗CD70抗体又はその抗原結合部分と交差競合しうる、抗CD70抗体又はその抗原結合部分、又はd)CD70への結合について62に記載の抗−CD70抗体と交差競合しうる、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
64.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号96のアミノ酸配列を含む抗CD20 scFv断片、又は配列番号96のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD20 scFv断片である、1〜28及び35〜63のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
65.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号98のアミノ酸配列を含む抗CD19 scFv断片、又は配列番号98のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD19 scFv断片である、1〜28及び35〜63のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
66.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号144のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片、又は配列番号144のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片である、1〜28及び35〜63のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
67.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号145のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片、又は配列番号145のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片である、1〜28及び35〜63のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
68.ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、ここで、前記scTNFSFリガンドは、TNFR2のリガンドであり、前記リガンドは、アミノ酸配列が、配列番号102のアミノ酸配列又は配列番号102と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscTNF80である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
69.ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、かつscTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号103のアミノ酸配列又は配列番号103と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscBaffである、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
70.ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、前記scTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号104のアミノ酸配列又は配列番号104と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscGITRLである、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
71.ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、かつscTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号105のアミノ酸配列又は配列番号105と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるsc41BBLである、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
72.ii)のドメインが、TNFSFリガンドを含み、前記TNFSFリガンドが、アミノ酸配列が、配列番号106のアミノ酸配列又は配列番号106と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるGITRLである、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
73.細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、免疫細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、1〜72のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
74.細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、線維芽細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、1〜73のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
75.細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、腫瘍細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、1〜74のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
76.1〜75のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物
77.1〜75のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸又は核酸のセット。
78.少なくとも1のタイプの宿主細胞において、77に記載の核酸又は核酸セットを発現させて、前記融合タンパク質を回収することを含む、1〜75のいずれか一項に記載の融合タンパク質を作製する方法。

図面の簡単な説明

0018

TNFSF及びTNFRSFのリガンド及び受容体を示す図である。
受容体特異的IgGによるTNFRSF受容体のFcγR依存性刺激を示すグラフである。
受容体特異的IgGによるTNFRSF受容体TNFR2のFcγR依存性刺激を示すグラフである。
抗CD40 IgG1 G28.5のscBaff融合タンパク質は、BaffR、TACI又はBCMAへの結合後にCD40刺激活性が高まったことを示すグラフ等である。
抗CD95 IgG1 E09のscBaff融合タンパク質は、BaffR、TACI又はBCMAへの結合後にCD95刺激活性が高まったことを示すグラフ等である。
TNFR2結合性抗CD40−IgG1融合タンパク質は、TNFR2結合後にCD40刺激活性が高まったことを示すグラフである。
CD19結合性抗CD95−IgG1融合タンパク質は、CD19発現細胞と共培養したHT1080細胞において細胞死誘導が高まったことを示すグラフである。
TNFR2特異的抗体C4のIL2融合タンパク質は、IL2R依存的にTNFR2をより刺激したことを示すグラフである。
TNFR2特異的抗体C4のGITR及び41BBアンカー融合タンパク質は、GITR及び41BB結合においてTNFR2活性化が高まったことを示すグラフ等である。
細胞表面抗原CD20に固定(アンカー)するCD40特異的抗体G28.5のscFv融合タンパク質は、CD20依存的なCD40への刺激がより高まったことを示すグラフ等である。
抗体E09の抗CD95−IgG1Fab2断片のscFv:CD20融合タンパク質は、CD20発現細胞と共培養したHT1080細胞において細胞死誘導が高まったことを示すグラフである。
TNFR2特異的抗体C4の細胞表面抗原標的scFv融合タンパク質は、抗原依存的なTNFR2への刺激がより高まったことを示すグラフ等である。
抗CD40 G28.5のscBaff融合タンパク質の生化学的特徴を示す写真等である。
抗CD40 G28.5のIgG1(N297A)及びFAB2変異体のscBaff融合タンパク質は、BaffR及びTACIの内因性発現を伴うリンパ腫骨髄腫細胞への結合後に、CD40刺激活性が高まったことを示すグラフである。
可溶性Baff(TNC−Baff)との競合により、抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scBaff及び抗CD40(G28.5)−FAB2−HC:scBaffによるIL8産生が阻害されたことを示すグラフである。
抗CD95 IgG1 E09又はそのFAB2断片のscBaff融合タンパク質は、BaffR及びTACIの内因性発現があるリンパ腫/骨髄腫懸濁細胞に結合後、接着性HT1080細胞において細胞死を誘導することを示すグラフである。
可溶性Baff(TNC−Baff)との競合により、抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff及び抗CD95(E09)−FAB2−HC:scBaffが、HT1080細胞及びBaff相互作用受容体発現細胞の共培養においてHT1080殺傷の誘導が阻害されることを示すグラフである。
抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaffはBaffR発現細胞においてアポトーシスカスパーゼを活性化するが、抗CD95(E09)−IgG1(N297A)は活性化しないことを示す写真である。
細胞表面抗原CD20に固定するIgG2アイソフォーム中のTNFR2特異的抗体C4のscFv融合タンパク質は、CD20依存的にTNFR2をより刺激することを示すグラフである。
細胞表面抗原CD70に固定するIgG1アイソフォーム中のTNFR2特異的抗体C4のscFv融合タンパク質は、CD27L/CD70依存的にTNFR2をより刺激することを示すグラフ等である。
4−1BB特異的抗体HBK4、CD40特異的抗体G28.5及びCD95特異的アニオイE09のIgG1(N297)変異体のscFv:CD20融合タンパク質は、CD20発現細胞と共培養したHT1080−41BB、HT1080−CD40及びHT1080(内因性CD95発現)細胞においてIL8産生を誘導するグラフ等である。
4−1BB特異的抗体HBK4、CD40特異的抗体G28.5及びCD95特異的抗体E09のIgG1(N297)変異体のscFv:CD20融合タンパク質は、CD20陽性BJAB細胞と共培養したHT1080−41BB、HT1080−CD40及びHT1080(内因性CD95発現)細胞によりIL8産生の増強を誘導することを示すグラフである。
CD70特異的scFv 9G2があるIgG1(N297A)アイソフォーム中のTRAILR2特異的抗体コナツムマブ(Conatumumab;Cona)の融合タンパク質は、CD70依存的に炎症誘発性(A)及び細胞毒性(B)TRAILR2シグナル伝達をより刺激することを示すグラフ等である。
CD40特異的抗体CのIgG1(N297A)又はFab2フォーマットと、チェックポイント阻害剤であるアベルマブ(Ave)を標的とするPD−L1から誘導されたscFvとの融合タンパク質は、PD−1L制限的にCD40を活性化することを示すグラフ等である。
IgG1(N297A)又はFab2フォーマットの41BB特異的抗体HBBKと、チェックポイント阻害剤であるアベルマブ(Ave)から誘導されたscFvとの融合タンパク質は、PD−1L制限的に41BBを活性化することを示すグラフ等である。
41BBに特異的なscFvがあるIgG2フォーマットにおけるPD−1L特異的抗体アベルマブ(Ave)の融合タンパク質は、PD−1L制限的に増強された41BB活性化を示すことを示すグラフ等である。
Fn14特異的scFv 18D1があるIgG(N297A)フォーマットのマウスCD27特異的抗体の融合タンパク質は、マウスCD27制限的に増強されたFn14活性化を示すことを示すグラフ等である。

0019

図1は、TNFSF及びTNFRSFのリガンド及び受容体を示す図である。図2は、受容体特異的IgGによるTNFRSF受容体のFcγR依存性刺激を示すグラフである。マウスFcγR2Bの発現プラスミド又は空ベクターのいずれかでトランスフェクトされたHek293細胞を、示されたTNFRSF受容体の刺激がIL8を産生することが示された細胞系の細胞と共培養した。様々なTNFRSF受容体特異的IgG(クローン名を示す)と一晩インキュベートした後、IL8の産生を、ELISAを用いて獲得した。TNFR1及びLTβRは、可溶性リガンド三量体によりすでに強力に活性化されているTNFRSFメンバーの例であり、FcγR発現細胞の非存在下で、受容体特異的抗体によっても強力に活性化され得ることに留意されたい。示される他のTNFRSF受容体は、活性化せず、又は単に限定的に活性化して可溶性TNFリガンドと結合し、FcγR結合の非存在下では抗体により活性化されないか、又は活性化されたとしても非効率的である。しかし、当該抗TNFRSF受容体は、抗体がFcγR結合した場合に強く活性化される。

0020

〔材料及び方法〕
示されたTNFRSF受容体を発現しない(又は発現したとしてもせいぜい中等度)Hek293細胞(ATCC)及びFcγRを、マウスFcγR2B又は空ベクターをコードするpCMV−SPORT6(Source Bicoscience)発現プラスミドで一過性トランスフェクトした。Kums et al.,MAbs.2017 Apr;9(3):506-520に記載されているように、ポリエチレンイミン(PEI)を用いて、FcγR発現プラスミド又は空ベクターによるHek293細胞のトランスフェクションを行った。翌日、Hek293トランスフェクタントを回収し、20000個の細胞のアリコートを、前日の細胞が播種された96穴プレートウェルに加えた(10000〜20000個細胞/穴)。このウェル(穴)には、IL8産生により目的のTNFRSF受容体の活性化に応答する細胞が播種されている。次に、共培養物を、示された抗TNFRSF受容体抗体(3μg/ml)を用いて一晩で三連反復刺激し、最後に、共培養上清のIL8含有量をELISA(BD Biosciences)で評価した。

0021

図3は、受容体特異的IgGによるTNFRSF受容体TNFR2のFcγR依存性刺激を示す。示されたFcγRの発現プラスミドをトランスフェクトしたHek293細胞、又は空ベクターをトランスフェクトしたHek293細胞を、TNFR2の刺激によりIL8の産生が誘導される細胞と共培養した。示されたTNFR2特異的IgGと一晩インキュベートした後、IL8産生を、ELISAを用いて獲得した。

0022

〔材料及び方法〕
TNFR2又はFcγRを発現しないHek293細胞(ATCC)を、ヒト活性化FcγR CD32A(FcγR2IIA)、ヒト阻害性FcγR CD32B(FcγRIIB)又は空ベクターをコードするpCMV−SPORT6(Source Bicoscience)発現プラスミドで一過性トランスフェクトした。Kums et al.,MAbs.2017 Apr;9(3):506-520に記載されているように、ポリエチレンイミン(PEI)を用いて、FcγR発現プラスミド又は空ベクターによるHek293細胞のトランスフェクションを行った。翌日、Hek293トランスフェクタントを回収し、20000細胞のアリコートを、前日のTNFR2が安定発現されたHT1080細胞を20000細胞/穴の密度で播種した96穴プレートのウェルに添加した。次いで、共培養物を、細胞内で生成・産生された、示された抗ヒトTNFR2抗体(1μg/ml)と共に三連反復刺激した。抗体により認識されるTNFR2のシステインリッチドメイン(CRD)サブドメインを示す(CRD1〜CRD4)。用いた細胞でTNFR2を活性化すると、IL8産生が増強される。従って、共培養上清のIL8含量を最終的にELISA(BD Biosciences)で評価して、TNFR2活性を測定した。

0023

図4は、抗CD40IgG1 G28.5のscBaff融合タンパク質は、BaffR、TACI又はBCMAへの結合後、CD40刺激活性が増強したことを示し、具体的には、図4(A)は融合タンパク質の構造を示す。Hek293細胞に空のベクター及びBaffR BCMA及びTACIを各々コードする発現プラスミドをトランスフェクトした。翌日、トランスフェクタントを、BaffR、BCMA及びTACIを発現しないが、CD40刺激後にIL8を強力に産生するHT1080−CD40細胞と共培養した。抗CD40(G28.5)−HC:scBaffを所定の濃度で、共培養物に三連反復刺激した。翌日、様々な共培養物の上清中のヒトIL8の量を測定した(同(B))。BaffR及びTACIを発現するHek293細胞(BaffR、BCMA及びTACI陰性)及びL363細胞を、HT1080−CD40細胞と共培養し、次に、示された濃度の抗CD40(G28.5)−HC:scBaffで共培養物を刺激した。翌日、再度、共培養の上清中のヒトIL8の量を測定した(同(C))。scBaff中のBaffの3つのプロトマーは、全長Baff分子の細胞外TNF相同性ドメインのみを含むことに注意されたい。

0024

〔材料及び方法〕
CD40、BaffR、TACI又はBCMAを発現しないHek293細胞を、Hek293細胞及びFcgR発現ベクター用には、Kums et al.,MAbs.2017Apr;9(3):506-520に記載されるように、BaffR、TACI及びBCMAをコードする発現プラスミド又は空ベクター(=陰性対照)で一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、30.000細胞のアリコートを、前日のHT1080−CD40細胞(CD40で安定トランスフェクトされたHT1080細胞)が20000細胞/穴の密度で播種された96穴プレートのウェルに添加した。あるいは、HT1080−CD40細胞を、BaffR及びTACIを内因性発現する骨髄腫細胞株L363の50.000細胞/穴と共培養した。HT1080−CD40細胞は、CD40の活性化に応答し、大量に産生される。TRAFFIAA抗CD40(G28.5)−IgG1(N297)−scBaffを用いて共培養物を一晩で三連反復刺激し、最後にELISAでIL8産生を測定した。

0025

図5は、抗CD95IgG1 E09のscBaff融合タンパク質は、BaffR、TACI又はBCMAへの結合後、CD95刺激活性が増強することを示す。同(A)は融合タンパク質の構造を示す。Hek293細胞に空ベクター又はBaff、BCMA及びTACIをコードする発現プラスミドをトランスフェクトした。翌日、トランスフェクタントを、BaffR、BCMA及びTACIを発現せず、CD95刺激後にアポトーシスを起こすHT1080細胞と共培養した。共培養物を、示された濃度の抗CD95(E09)−HC:scBaffで処理し、接着増殖HT1080細胞の翌日の生存率を、クリスタルバイオレット染色により評価した(同(B))。Hek293細胞(BaffR、BCMA及びTACI陰性)及びBaffR及びTACIを発現するL363細胞をHT1080細胞と共培養した。共培養物を再び抗CD95(E09)−HC:scBaffで一晩刺激し、HT1080生存率を最終的にクリスタルバイオレット染色により評価した(同(C))。scBaff中のBaffの3つのプロトマーは、全長Baff分子の細胞外TNF相同性ドメインのみを含むことに注意されたい。

0026

〔材料及び方法〕
BaffR、TACI又はBCMAを発現しないHek293細胞及び陰性量のCD95を、BaffR、TACI及びBCMAをコードする発現プラスミド又は空ベクター(=陰性対照)で、Hek293細胞及びFcgR発現ベクター用に、Kums et al.,MAbs.2017Apr;9(3):506-520に記載のように、一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、30,000細胞のアリコートを、前日のHT1080細胞を20000細胞/穴の密度で播種した96穴プレートのウェルに添加した。あるいは、HT1080細胞を、内因性にBaffR及びTACIを発現する骨髄腫細胞株L363の50.000細胞/穴と共培養した。HT1080細胞は、感作物質の非存在下でCD95誘導細胞死に対して感受性を示す。共培養物を、TRAAFFIAA抗−CD95(E09)−IgG1(N297)−scBaffを用いて一晩で三連反復刺激し、最後に、細胞死誘導を、接着成長HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により判定した。

0027

図6は、TNFR2結合性抗CD40−IgG1融合タンパク質は、TNFR2結合後にCD40刺激活性が増強することを示す。TNFR2もCD40も発現しないHeLa細胞、及びTNFR2の刺激後に中等度のレベルのIL8しか産生しないHeLa−TNFR2トランスフェクタントを、TNFR2もCD40も発現しないHT1080細胞、及びCD40刺激後に非常に高レベルのIL8を産生するHT1080−CD40トランスフェクタントと共培養し、示された濃度のTNFR2標的化抗CD40(G28.5)−HC:scTNF80で刺激した。翌日、異なる共培養物の上清中のIL8量を測定した。scTNF80におけるTNF80の3つのプロトマーは、TNFR2特異性を付与する突然変異を含む全長マウスTNF分子の細胞外TNF相同性ドメインのみを含むことに留意されたい。これまで同様、試験は、96穴フォーマットの技術的三連反復で行った。

0028

図7は、CD19結合性抗CD95−IgG1融合タンパク質は、CD19発現細胞と共培養したHT1080細胞において細胞死誘導が高まることを示す。CD19を発現しないCD95感受性細胞株HT1080を、Jurkat(CD19−陰性)細胞及びBJAB(CD19−陽性)細胞と共培養し、指示された濃度でCD19結合抗CD95融合タンパク質抗−CD95(E09)−HC:scFv:CD19と共にインキュベートした。翌日、接着増殖HT1080細胞の生存率を、クリスタルバイオレット染色で測定した。

0029

〔材料及び方法〕
試験は、96穴プレートの技術的三連反復で行った。HT1080細胞をウェル当たり20000細胞で播種した。Jurkat及びBJAB細胞(ウェル当たり30000)を、示された濃度の抗−CD95(E09)−HC:scFv:CD19と共に次の細胞に添加した。細胞死誘導は、接着成長HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により判定した。生存率は、未処理のHT1080細胞(=100%生存率)及びCHX、ベルケイド、及びFc−CD95L(=0生存率)を含む高毒性混合物で処理したHT1080細胞を用いて正規化した。

0030

図8は、TNFR2特異的抗体C4のIL2融合タンパク質は、IL2R依存的にTNFR2を次第に刺激することを示す。TNFR2もIL2Rも発現しないHek293細胞を、IL2Rのサブユニットをコードする発現プラスミドの混合物又は空のベクターでトランスフェクトした。次に、Hek293トランスフェクタントを、TNFR2を発現するHeLaトランスフェクタントと共培養し、示された濃度の抗TNFR2(C4)−HC:IL2で刺激した。翌日、TNFR2を介して誘導され得るIL8の産生を、ELISAを用いて記録した。

0031

〔材料及び方法〕
Hek293細胞を、Hek293細胞及びFcgR発現ベクター用にKums et al.,MAbs.2017Apr;9(3):506-520に記載のように、IL−2受容体のサブユニットをコードする発現プラスミドの混合物、又は陰性対照としての空ベクターで一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、20.000細胞のアリコートを、前日のHeLa−TNFR2細胞を20000細胞/穴の密度で播種した96穴プレートのウェルに添加した。HeLa−TNFR2細胞は、TNFR2活性化に応答してIL8を産生する。TRAFFIAA抗−TNFR2(C4)−HC:IL2を用いて、共培養物を一晩で三連反復刺激し、最後にELISAでIL8産生を測定した。

0032

図9は、TNFR2特異的抗体C4のGITR及び41BBアンカー融合タンパク質は、GITR及び41BB結合において、TNFR2活性化が増強されたことを示す。図9(A)は用いたヒトGITR及びマウス4−1BBをアンカーするTNFR2刺激TRAFFIAAのドメイン構造を示す。同B及びCは、細胞はGITR又は41BBを発現しないが、空のベクター又はヒトGITR(B)又はマウス41BB(C)をコードする発現プラスミドをトランスフェクトしたことを示す。次に、トランスフェクタントを、TNFR2活性化に応答してIL8を産生するHeLa−TNFR2細胞と共培養した。抗TNFR2(C4)−HC:scGITRL(B)及び抗TNFR2(C4)−HC:sc(mu)4−1BBL(C)の指示濃度で共培養を刺激した。翌日、IL8の産生を、IL8特異的ELISAを用いて測定した。図9(D)は、用いたマウスGITRアンカーTNFR2刺激TRAFFIAAのドメイン構造を示す。空ベクター又はマウスGITR発現プラスミドでトランスフェクトした細胞を、HeLa−TNFR2細胞と共培養した(図9(E))。抗TNFR2(C4)−HC:(mu)GITRLによる刺激後、IL8の産生をELISAにより翌日モニターした。マウスのGITRLは、ヒトのGITRL及びTNFSFの他のすべてのヒト及びマウスのリガンドとは対照的に、二量体分子であり、3つの受容体分子ではなく2つの受容体分子と相互作用することに注意されたい。それにより、単一のマウスGITRLプロトマーを重鎖のC末端に融合させて、対応する抗体−(mu)GITRLのアンカードメインとして作用する単一の(mu)GITRL二量体を構成しうる。対照的に、重鎖に融合されたアンカードメインとしてのscTNFSFリガンド(例えば、scGITRL、sc(mu)41BBL、scTNF80)を用いると、1の抗体融合タンパク質あたり2つのアンカードメインが生じる。scGITRL及びsc(mu)41BBL中のGITRL及び(mu)41BBLの3つのプロトマーは、全長リガンド分子の細胞外TNF相同性ドメインのみを含むことに留意されたい。同様に、(mu)GITRLは、マウス全長GITRLのTHDのみをいう。

0033

〔材料及び方法〕
GITR、41BB又はTNFR2を発現しないHek293細胞を、Hek293細胞及びFcgR発現ベクター用に、Kums et al.,MAbs.2017Apr;9(3):506-520に記載のように、ヒト又はマウスGITR又はマウス41BB又は空ベクター(=陰性対照)をコードする発現プラスミドで一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、20000細胞のアリコートを96穴のpleLa−TNFR2のウェルに20000細胞/穴の密度で播種した。HeLa−TNFR2細胞はTNFR2活性化に応答してIL8を産生する。共培養物を、示されたTRAAFFIASを用いて一晩で三連反復刺激し、最後に、ELISAでIL8産生を測定した。

0034

図10は、細胞表面抗原CD20にアンカーするCD40特異的抗体G28.5のscFv融合タンパク質は、CD20依存的にCD40を刺激がより高まったことを示すグラフ等である。CD20陰性Jurkat細胞及びCD20陽性BJAB細胞をCD40応答性HT1080−CD40細胞と共培養し、示された濃度の抗CD40(G28.5)−HC:scFv:CD20で刺激した。翌日、CD40を介して誘導されうるIL8の産生を、ELISAで記録した。インビボでFcドメインのADCC活性を低下させるN297A変異があるIgG1分子の変異体を用いた。

0035

〔材料及び方法〕
試験は、96穴プレートの技術的三連反復で行った。HT1080−CD40細胞をウェル当たり20000細胞で播種した。Jurkat(CD20−)及びBJAB細胞(CD20+)(ウェル当たり30000)を、示された濃度の抗CD40−HC:scFv:CD20と共に翌日に添加した。共培養上清のIL8含量を最終的にELISA(BD Biosciences)で評価した。

0036

図11は、抗体E09の抗CD95−IgG1Fab2断片のscFv:CD20融合タンパク質は、CD20発現細胞と共培養したHT1080細胞において、細胞死誘導を高めることを示す。CD95感受性細胞株HT1080をJurkat細胞(CD20陰性)及びBJAB細胞(CD20陽性)と共培養した。共培養物を、指示された濃度で、CD20結合性抗CD95融合タンパク質抗CD95−Fab2−HC:scFv:CD20で処理した。翌日、接着増殖HT1080細胞の生存率を、クリスタルバイオレット染色で測定した。

0037

〔材料及び方法〕
試験は、96穴プレートの技術的三連反復で行った。HT1080細胞をウェル当たり20000細胞で播種した。Jurkat及びBJAB細胞(ウェル当たり30000)を、示されたTRAAFFIAAと共に次の細胞に添加した。HT1080生存率は、未処理のHT1080細胞(=100%生存率)及びCHX、ベルケイド、及びFc−CD95L(=0生存率)を含む高毒性混合物で処理したHT1080細胞を用いて正規化した。

0038

図12は、TNFR2特異的抗体C4の細胞表面抗原標的scFv融合タンパク質は、抗原依存的にTNFR2を次第に刺激することを示す。CD19及びCD20陰性Jurkat細胞並びにCD19及びCD20陽性Raji細胞を、TNFR2発現HeLaトランスフェクタントと共培養し、示された濃度の抗TNFR2−IgG1(N297A)HC:scFv:CD19(上部)又は抗TNFR2−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(下部)で各々刺激した。翌日、TNFR2を介して誘導されうるIL8の産生を、ELISAを用いて記録した。ADCCを誘発できないIgG1変異体N297Aの変異体を用いた。ここで用いた親TNFR2特異的mAb C4は、細胞内で作製された。

0039

〔材料及び方法〕
試験は、96穴プレートの技術的三連反復で行った。上部:HeLa−TNFR2細胞にウェル当たり20000細胞を播種した。Jurkat(CD19−/CD20−)及びRAJI細胞(CD19−/CD20−)(ウェル当たり30000)を、示された濃度の抗TNFR2−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD19(上部)又は抗TNFR2−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(下部)と共に翌日に添加した。TNFR2活性化により産生されたIL8含量は、最後に共培養上清のELISA(BD Biosciences)分析により評価した。

0040

図13(A)は、抗CD40 G28.5のscBaff融合タンパク質の生化学的特徴を示す。精製された抗CD40(G28.5)−IgG1(N297)(I)、抗CD40(G28.5)−IgG1(N297)−HC:scBaff(II)、抗CD40(G28.5)−FAB2(III)及び抗CD40(G28.5)−FAB2−HC:scBaff(IV)を、SDS−PAGEで分離した。その後、様々な抗体融合タンパク質の重鎖及び軽鎖に存在するフラッグエピトープを認識するmAb M2を用いたウェスタンブロット法左パネル)又は銀染色右パネル)によりタンパク質を可視化した。構築物IIの2つの鎖は、大きさが極めて類似し、したがって、SDS−PAGEによっては分離されないことに注意されたい。図13(B)はマーカータンパク質混合物及びタンパク質I〜IVのゲルろ過分析を示し、同(C)はタンパク質I〜IVの図式である。

0041

〔材料及び方法〕
抗体融合タンパク質を作製し、以下のKumsら、2016に記載されているように精製した。SDS−PAGE、銀染色及びウェスタンブロット法を、Langら、2016に記載のように実施した。

0042

図14は、抗CD40 G28.5のIgG1(N297A)及びFAB2変異体のscBaff融合タンパク質は、BaffR及びTACIの内因性発現を伴うリンパ腫/骨髄腫細胞への結合後、CD40刺激活性が高まることを示す。MM1S(BCMA及び中等度のTACIを発現)、L363(BCMA及び中等度のTACIを発現)及びBJAB(BaffRを発現)細胞、又はすべてのBaff結合受容体の発現が欠損する対照Jurkat細胞を、BaffR、BCMA及びTACIを発現せず、CD40刺激後にIL8を強力に産生するHT1080−CD40細胞と共培養した。示された濃度の抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scBaff又は抗CD40(G28.5)−FAB2−HC:scBaffで、共培養物を三連反復刺激した。翌日、異なる共培養物の上清中のヒトIL8の量を測定した。

0043

〔材料及び方法〕
HT1080−CD40細胞を96穴プレート(ウェル当たり20.000細胞)で一晩培養した。翌日、MM1S、L363、BJAB又はJurkat細胞をウェル当たり20.000個添加し、得られた共培養物を、示された濃度の抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scBaff及び抗CD40(G28.5)−FAB2−HC:scBaffでさらに三連反復刺激した。次いで、細胞上清のIL8産生についてELISAで分析した。MM1S、L363、BJAB及びJurkat細胞は、HT1080−CD40細胞と比較して、IL8は産生されないか、又は産生されたとしても無視できる量であったことに注意されたい。

0044

図15は、可溶性Baff(TNC−Baff)との競合で、抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scBaff及び抗CD40(G28.5)−FAB2−HC:scBaffによるIL8産生が阻害されることを示す。HT1080−CD40細胞を、MM1S(BCMA及び中等度のTACIを発現)、L363(BCMA及び中等度のTACIを発現)及びBJAB(BaffRを発現)細胞と、又は対照Jurkat細胞として共培養した。HT1080−CD40及びJurkat細胞は、Baff−相互作用受容体(BaffR、TACI、BCMA)を発現しないことに注意されたい。過剰の可溶性TNC−Baff(5μg/ml)の存在下及び非存在下で、200ng/mlの抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scBaff又は抗CD40(G28.5)−FAB2−HC:scBaffを用いて、共培養物を三連反復刺激した。翌日、種々の共培養物の上清中のヒトIL8の量を測定した。

0045

〔材料及び方法〕
HT1080−CD40細胞を96穴プレート(ウェル当たり20.000細胞)で一晩培養した。翌日、MM1S、L363、BJAB又はJurkat細胞をウェル当たり20.000個添加し、得られた共培養物を、200ng/mlのCD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scBaff及び抗−CD40(G28.5)−FAB2−HC:scBaffと共に、可溶性TNC−Baff(5μg/ml)の存在下及び非存在下で、テネイシン−Cの三量体化ドメインを含む可溶性Baffの安定化形態(Bergら,2007)でさらに一晩刺激した。次いで、細胞上清のIL8産生についてELISAで分析した。MM1S、L363、BJAB及びJurkat細胞は、HT10890−CD40細胞と比較して、IL8は産生されないか、又は産生されたとしても無視できる量であったことに注意されたい。

0046

図16は、抗CD95IgG1 E09又はそのFAB2断片のscBaff融合タンパク質が、BaffR及びTACIを内因性発現するリンパ腫/骨髄腫懸濁細胞に結合した後、接着性HT1080細胞において細胞死を誘導することを示す。接着増殖HT1080細胞を、MM1S(BCMA及び中等度のTACIを発現する)、L363(BCMA及び中等度のTACIを発現する)及びBJAB(BaffRを発現する)懸濁細胞と、又は対照Jurkat細胞と共培養した。HT1080及びJurkat細胞は、Baff−相互作用受容体(BaffR、TACI、BCMA)を発現しないことに注意されたい。抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff又は抗CD95(E09)−FAB2−HC:scBaffの指示された濃度で、1μg/mlのCHXの存在下で共培養を三連反復刺激した。翌日、残存する付着HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により、細胞生存率を測定した。

0047

〔材料及び方法〕
HT1080細胞を20,000細胞/穴の密度で播種した。翌日、MM1S、L363、BJAB又はJurkat懸濁液細胞をウェル当たり20.000個添加し、得られた共培養物を、1μg/mlの存在下で抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff又は抗CD95(E09)−FAB2−HC:scBaffと一晩刺激した。最後に、接着成長HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により細胞死誘導を判定した。生存率は、0.03%アジド、50μg/mlのCHX及び500ng/mlのFc−CD95L(=0%生存率)の高毒性混合物で処理した未処理のHT1080細胞(=100%生存率)及びHT1080細胞に対して正規化した。

0048

図17は、可溶性Baff(TNC−Baff)との競合で、抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff及び抗CD95(E09)−FAB2−HC:scBaffが、HT1080細胞及びBaff相互作用受容体発現細胞の共培養においてHT1080の細胞死誘導を阻害することを示す。HT1080細胞を、MM1S(BCMA及び中等度のTACIを発現)、L363(BCMA及び中等度のTACIを発現)及びBJAB(BaffRを発現)細胞と、又は対照Jurkat細胞と共培養した。HT1080−CD40及びJurkat細胞は、Baff−相互作用受容体(BaffR、TACI、BCMA)を発現しないことに注意されたい。過剰の可溶性TNC−Baff(5μg/ml)の存在下及び非存在下、抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff又は抗CD95(E09)−FAB2−HC:scBaffを20ng/mlの抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaffを用いて、1μg/mlのCHXの存在下で、共培養を三連反復刺激した。翌日、残存する付着HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により、細胞生存率を測定した。

0049

〔材料及び方法〕
HT1080細胞を20,000細胞/穴の密度で播種した。翌日、MM1S、L363、BJAB又はJurkat懸濁液細胞をウェル当たり20.000個添加し、得られた共培養物を、20ng/mlの抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff又は抗CD95(E09)−FAB2−HC:scBaffで、可溶性TNC−Baff(5μg/ml)の存在下及び非存在下で、三連反復刺激した。最後に、細胞死誘導を、接着成長HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により決定した。生存率は、0.03%アジド、50μg/mlのCHX及び500ng/mlのFc−CD95L(=0%生存率)の高毒性混合物で処理した未処理のHT1080細胞(=100%生存率)及びHT1080細胞に対して正規化した。TNC−Baffは、テネイシンCの三量体化ドメインを含む可溶性Baffの安定化形態である(Bergら,2007)。

0050

図18は、抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaffはBaffR発現細胞においてアポトーシスカスパーゼを活性化するが、抗CD95(E09)−IgG1(N297A)は活性化しないことを示す。BJAB細胞(BaffRを発現)、及びBaff受容体(BaffR、TACI、BCMA)を全く発現しない陰性対照Jurkat細胞として、示された濃度の抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff及び抗CD95(E09)−IgG1(N297A)で一晩処理した。翌日、これらのカスパーゼのアポトーシス活性化を示すカスパーゼ−8のp18断片及びカスパーゼ−3のp17断片の生成に関して、全細胞溶解物をウェスタンブロット法で分析した。陽性対照として、Jurkat及びBJAB細胞に500ng/mlのFc−CD95Lを負荷し、両細胞株でアポトーシスを誘導させた。

0051

図19は、細胞表面抗原CD20にアンカーされるIgG2アイソフォーム中のTNFR2特異的抗体C4のscFv融合タンパク質は、CD20依存的にTNFR2をより刺激することを示す。CD20陰性Jurkat細胞及びCD20陽性BJAB細胞をTNFR2応答性HeLa−TNFR2細胞と共培養し、示された濃度の抗TNFR2(C4)−IgG2−HC:scFv:CD20で刺激した。翌日、TNFR2を介して誘導されたIL8産生を、ELISAを用いて測定した。

0052

〔材料及び方法〕
ウェル当たり20.000のHeLa−TNFR2トランスフェクタント(Weissら、1997)を96穴プレートに播種した。翌日、CD20陽性BJAB細胞又は内因性CD20発現を欠損するJurkat細胞20,000個を陰性対照として添加した。次いで、共培養物を、示された濃度の抗TNFR2(C4)−IgG2−HC:scFvCD20で処理し、その翌日に、IL8産生をELISAで測定した。

0053

図20は、細胞表面抗原CD70に固定化されたIgG1アイソフォーム中のTNFR2特異的抗体C4のscFv融合タンパク質が、CD27L/CD70依存的にTNFR2をより刺激することを示す。図(A)は融合タンパク質の構造を示す。(B)(C)は、Hek293細胞に空のベクター又は発現プラスミドをコードするCD27L(別名CD70)をトランスフェクトしたことを示す。翌日、トランスフェクタントをTNFR2発現時にIL8を産生するHeLa−TNFR2トランスフェクタントと共培養した。共培養物を、示された濃度の抗TNFR2(C4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD70(1F6)(B)又は抗TNFR2(C4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD70(2H5)(C)で処理した。最後に、IL8産生をELISAで評価した。

0054

〔材料及び方法〕
TNFR2又はCD27L(CD70)を発現しないHek293細胞を、Kums et al.,MAbs.2017 Apr;9(3):506-520に記載されているように、CD27L(=陰性対照)をコードする発現プラスミドで一過性トランスフェクトした(Hek293細胞及びFcgR発現ベクター)。トランスフェクタントを回収し、20,000細胞のアリコートを、その前日のHeLa−TNFR2細胞を20,000細胞/穴の密度で播種した96穴プレートのウェルに添加した。TRAAFFIAAs抗TNFR2(C4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD70(1F6)(B)及び抗TNFR2(C4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD70(2H5)(C)を用いて、共培養物を一晩刺激した。2H5及び1F6は、2つの異なるヒトCD70特異的抗体である。

0055

図21は、4−1BB特異的抗体HBK4、CD40特異的抗体G28.5及びCD95特異的アニオイE09のIgG1(N297)変異体のscFv:CD20融合タンパク質は、CD20発現細胞と共培養したHT1080−41BB、HT1080−CD40及びHT1080(内因性CD95発現)細胞においてIL8産生を誘導することを示す。(A)は融合タンパク質を示す。(B)〜(D)は、以下の図式である。すなわち、示されたHT1080変異体を、空のベクター又はCD20発現プラスミドでトランスフェクトしたHek293細胞と共培養した。次いで、共培養物を、指示された濃度で、CD20結合性IgG1(N297A)融合タンパク質抗41BB(HBBK4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(B)、抗CD40(B28.5)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(C)及び抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(D)で処理した。翌日、IL8産生をELISAで測定した。抗CD95変異体の場合、カスパーゼ阻害剤ZVADを添加してアポトーシスを阻害した。

0056

〔材料及び方法〕
HT1080−41BBトランスフェクタント(Wyzgolら,2009)、HT1080−CD40トランスフェクタント(Wyzgolら,2009)及びHT1080細胞(内因性CD95発現)を20.000細胞/穴の密度で播種した。翌日、前日に空ベクター(EV)又はCD27L(=CD70)発現プラスミドをトランスフェクトした20,000個のHek293細胞を添加した。得られた共培養物を、示された濃度の抗41BB(HBBK4)−IgG1(N297A)−HC:scFvCD20(B)、抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scFvCD20(C)及び抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC(D)で一晩刺激した。後者を20μg/mlのZVADの存在下で添加して、アポトーシス誘導を阻害した。IL8をELISAで評価した。

0057

図22は、4−1BB特異的抗体HBK4、CD40特異的抗体G28.5及びCD95特異的抗体E09のIgG1(N297)変異体のscFv:CD20融合タンパク質が、CD20陽性BJAB細胞と共培養したHT1080−41BB、HT1080−CD40及びHT1080(内因性CD95発現)細胞により増強されたIL8産生を誘導することを示す。(A)〜(C)は、示されたHT1080変異体を、CD20陽性BJAB細胞と、又は内因性CD20発現を欠損するJurkat細胞との陰性対照と共培養した。次いで、共培養物を、指示された濃度で、CD20結合性IgG1(N297A)融合タンパク質抗41BB(HBBK4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(A)、抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(B)及び抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(C)で処理した。翌日、IL8産生をELISAで測定した。抗CD95変異体の場合は、カスパーゼ阻害剤ZVADを添加してアポトーシスを阻害した。

0058

〔材料及び方法〕
HT1080−41BBトランスフェクタント(Wyzgolら,2009)、HT1080−CD40トランスフェクタント(Wyzgolら,2009)及びHT1080細胞(内因性CD95発現)を20.000細胞/穴の密度で播種した。翌日、20,000個のBJAB細胞(CD20陽性)又は20,000個のJurkat細胞(CD20陰性)のいずれかを添加した。得られた共培養物を、示された濃度の抗41BB(HBBK4)−IgG1(N297A)−HC:scFvCD20(A)、抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scFvCD20(B)及び抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC(C)で一晩刺激した。後者を20μg/mlのZVADの存在下で添加して、アポトーシス誘導を阻害した。IL8をELISAで評価した。

0059

図23は、CD70特異的scFv 9G2を備えるIgG1(N297A)アイソフォーム中のTRAILR2特異的抗体コナツムマブ(Cona)の融合タンパク質が、CD70依存的に炎症誘発性(A)及び細胞毒性(B)TRAILR2シグナル伝達をますます刺激する。CD70をコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたHek293細胞を一過性トランスフェクトしたHek293細胞を、TRAILR2応答性HT1080細胞と共培養した(CD70発現なし)。共培養物を2.5μg/mlのCHX(B)又はCHX+20μMのカスパーゼ阻害剤ZVAD(A)で処理して、TRAILR2シグナル伝達用のHT1080細胞を感作した。CHXは、代謝回転が高いTRAILR2シグナル伝達阻害性FLPタンパク質の発現を抑制する。ZVADはアポトーシスを予防し、TRAILR2の遺伝子誘導特性の評価が可能となる。次いで、共培養物を、示された濃度の抗−TRAILR2(Cona)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD70(9G2)でさらに処理し、その翌日、IL8産生を、ELISA(A)、又はクリスタルバイオレット染色(B)で、生存率により測定した。

0060

図24は、CD40特異的抗体CのIgG1(N297A)又はFab2フォーマットと、チェックポイント阻害剤であるアベルマブ(Ave)を標的とするPD−L1から誘導されたscFvとの融合タンパク質が、PD−1L制限的にCD40を活性化することを示す。PD−1Lをコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたHek293細胞を一過性トランスフェクトしたHek293細胞を、CD40応答性HT1080−CD40細胞と共培養した。次いで、共培養物を、示された濃度の抗CD40(C)−IgG1(N297A)−HC:scFv:PD−L1(A)又は抗CD40(C)−Fab2−HC:scFv:PD−L1(B)で処理した。翌日、CD40活性化の指標としてのIL8産生をELISAで測定した。

0061

図25は、IgG1(N297A)又はFab2フォーマットの41BB特異的抗体HBBKと、チェックポイント阻害剤であるアベルマブ(Ave)から誘導されたscFvとの融合タンパク質が、PD−1L制限的に41BBを活性化することを示す。PD−1Lをコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたHek293細胞を一過性トランスフェクトしたHek293細胞を、41BB応答性HT1080−41BB細胞と共培養した。次に共培養物を、示された濃度の抗41BB(HBBK)−IgG1(N297A)−HC:scFv:PD−L1(A)又は抗41BB(HBBK)−Fab2−HC:scFv:PD−L1(B)で処理した。翌日、41BB活性化の指標としてのIL8産生をELISAで測定した。

0062

図26は、41BBに特異的なscFvを備えるIgG2フォーマットにおけるPD−1L特異的抗体アベルマブ(Ave)の融合タンパク質が、PD−1L制限的に増強された41BBを活性化することを示す。PD−1Lをコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたHek293細胞を一過性トランスフェクトしたHek293細胞を、41BB応答性HT1080−41BB細胞と共培養した。次に、共培養物を、示された濃度の抗PD−L1(Ave)−IgG2−HC:scFv:41BB(HBBK)で処理した。翌日、41BB活性化の指標としてのIL8産生をELISAで測定した。この実施例は、TNFRSFの受容体に対する抗体から誘導されたscFvが、細胞表面露出抗原を認識する抗体と融合した後、アンカー依存性アゴニスト活性を獲得することを示す。このように、TRAAFFIAAの原理は、抗TNFRSF受容体抗体をTNFRSF受容体刺激エフェクタードメインとして、scFvをアンカードメインとして作用させるが、抗体をアンカードメインとして、TNFRSF受容体特異的scFvをエフェクタードメインとして、ミラーフォーマットで作用する。

0063

図27は、Fn14特異的scFv 18D1を備えるIgG(N297A)フォーマットのマウスCD27特異的抗体の融合タンパク質が、マウスCD27制限的に増強されたFn14を活性化することを示す。マウスCD27をコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたHek293細胞を一過性トランスフェクトしたHek293細胞(Fn14応答性が低い)を、高度にFn14応答性のHT1080細胞と共培養した。次いで、共培養物を、示された濃度の抗muCD27−IgG1(N297A)−HC:scFv14(18D1)で処理した。翌日、Fn14活性化の指標としてのIL8産生をELISAで測定した。この実施例は、TNFRSFの受容体に対する抗体から誘導されたscFvが、細胞表面提示抗原を認識する抗体と融合した後に、アンカー依存性アゴニスト活性を獲得することを再度示す。このように、TRAAFFIAAの原理は、抗TNFRSF受容体抗体をTNFRSF受容体刺激エフェクタードメインとして、scFvをアンカードメインとして作用させるが、抗体をアンカードメインとして、TNFRSF受容体特異的scFvをエフェクタードメインとして、ミラーフォーマットで作用する。

0064

発明の詳細な説明
定義及び一般技術
以下に特段の定めがない限り、本発明で用いられる用語は、当業者に公知の共通の意味に従って理解されるべきである。
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。

0065

明細書中で用いられる用語「scTNFSF」は、単鎖系機能性(受容体結合性を意味する)TNFSFリガンドをいう。通常、scTNFSFは、TNFSFプロトマーの受容体結合ドメインの3つのポリペプチドリンカーにより連結され、分子内三量体を形成するユニットを含む。

0066

用語「抗体」は、本明細書中で用いられる場合、目的の抗原に特異的に結合しうるいかなる機能性抗体をも意味し、Paul, W.E. (Ed.):Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989の第7章に一般的に概説されており、これは、本明細書中に参考として援用される。用語「抗体」は、モノマー抗体(例えば、IgDIgE、IgG)又はオリゴマー抗体(例えば、IgA又はIgM)を包含する。用語「抗体」はまた、特に限定されず、単離された抗体及び修飾された抗体、例えば遺伝子操作された抗体、例えばキメラ抗体又はヒト化抗体を包含する。

0067

抗体のドメインの命名法は、当業界で公知の用語に従う。抗体の各モノマーは、当業界で一般的に公知なように、2つの重鎖及び2つの軽鎖を含む。これらのうち、各重鎖及び軽鎖は、抗原結合に重要な可変ドメイン(重鎖ではVH、軽鎖ではVLという)を含む。当該重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4(FR、フレームワーク領域;CDR、超可変領域としても知られる相補性決定領域)領域を(N末端からC末端の順に)含む。抗体配列内の上記の抗体領域の同定及び譲渡は、一般に、Kabatら(Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1983)、又はChothiaら(Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989 Dec 21-28;342(6252):877-83.)に従うか、又はGiudicelliら(IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic AcidsRes. 2004 Jul 1;32(Web Server issue):W435-40.)に従う。好ましくは、上記の抗体領域は、IMGT/V−QUESTソフトウェアを用いて同定され、割り当てられる。

0068

用語「モノクローナル抗体」は、本質的に均質抗体集団由来の抗体であって、当該抗体は、配列が実質的に同一であり(すなわち、N末端及びC末端におけるアミノ酸修飾等の配列の自然発生修飾を含む抗体の少数の画分を除き、同一である)、単一のエピトープ又は多数の異なるエピトープに対する異なる抗体の混合物を含むポリクローナル抗体と異なり、モノクローナル抗体は、同一のエピトープを指向するため、高度に特異的である。用語「モノクローナル抗体」は、単一の細胞クローンに由来するモノクローナル細胞集団から得られる(ただし、これに限定されない)抗体を含み、例えば、Kohler及びMilstein(Nature, 1975 Aug 7;256(5517):495-7))又はHarlow及びLane(“Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988)に記載されたハイブリドーモノクローナル抗体はまた、Clacksonら(Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8)又はMarksら(J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97)に記載されるようなファージディスプレイ技術を含む他の適当な方法からも獲得しうる。モノクローナル抗体は、当業界で公知の方法により、Kd値の低下、会合の最適化及び解離動態等の抗原結合特性について最適化された抗体でありうる。例えば、Kd値は、ファージディスプレイを含むディスプレイ法により最適化されてよく、その結果、アフィニティー成熟モノクローナル抗体が得られる。用語「モノクローナル抗体」は、特定起源の種又は単一起源の種に由来する抗体配列に限定されず、用語「モノクローナル抗体」は、ヒト化モノクローナル抗体及びヒト抗体等のキメラモノクローナル抗体を包含する。

0069

「ヒト化抗体」とは、ヒト配列及び対象となる抗原に対する結合特異性を付与する非ヒト配列の少数部分を含む抗体である。通常、ヒト化抗体は、ヒト受容体抗体からの超可変領域配列を、目的の抗原に結合する非ヒトドナー抗体(例えば、マウス、ウサギラットのドナー抗体)からの超可変領域配列で置換されて生成される。いくつかの場合、受容体抗体のフレームワーク領域配列はまた、ドナー抗体の対応する配列により置換されうる。「ヒト化抗体」は、ドナー及び受容体の抗体に由来する配列及び、他の(付加された、又は置換された)残基又は配列を含有してよく、又は含有しなくてもよい。当該他の残基又は配列は、結合特性(例えば、Kd値を低下させる)及び/又は免疫原性特性(例えば、ヒトにおける抗原性を低下させる)等の抗体特性のさらなる改善に貢献しうる。ヒト化抗体を作製する方法の非限定的な例は、当業界で公知であり、例えば、Riechmannら(Nature. 1988 Mar 24; 332(6162):323-7)又はJonesら(Nature. 1986 May 29-Jun 4; 321(6069):522-5)から公知である。

0070

用語「ヒト抗体」は、ヒト可変ドメイン配列及び定常ドメイン配列を含む抗体に関し、この定義は、結合特性(例えば、Kd値を低下させる)及び/又は免疫原性特性(例えば、ヒトにおける抗原性を低下させる)等の抗体特性をさらに高めるのに貢献しうる単一アミノ酸が置換又は修飾されたヒト配列を備える抗体を包含し、用語「ヒト抗体」は、非ヒト配列の一部が対象抗原に対して結合特異性を付与するようなヒト化抗体を除く。

0071

本明細書中で用いられる抗体の「抗原結合部分」とは、抗体の抗原に対する特異的結合能が保持された抗体の部分をいう。当該能力は、例えば、当業界で公知の方法で、抗体と競合する抗原結合部分の抗原への特異的結合能を判定して決定しうる。抗原結合部分は、抗体の1又はそれ以上の断片を含んでよい。特に限定されることなく、抗原結合部分は、組換えDNA法及び抗体の化学的又は酵素的断片化による調製を含め、当業界で公知のいかなる適当方法により作製しうる。抗原結合部分は、Fab断片、F(ab’)断片、Fab2断片、一本鎖抗体(scFv)、シングルドメイン抗体、二重特異性抗体、又は抗体の抗原に対する特異的結合能が保持された抗体のいかなる他の部分であってよい。当業界で公知の用語「Fab2」の意味によれば、用語「Fab2」は、用語「Fab2」、「Fab2」、及び「FAB2」と同義であることが理解されるであろう。従って、本出願の目的のため、用語「Fab2」は、「Fab2」、「Fab2」、及び「FAB2」という用語と互換的に用いられる。本発明に関する「細胞表面の前記構造及び/又は細胞外マトリクスの前記構造に結合しうる抗原結合部分」は、特に限定されない。例えば、腫瘍抗原に結合しうる抗原結合部分でありうる。「細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分」は、好ましくは、抗CD20抗原結合部分、抗CD70抗原結合部分、抗CD19抗原結合部分、抗CD19抗原結合部分、EGFR抗原結合部分、抗Her2抗原結合部分、抗Fn14抗原結合部分、抗CD40L抗原結合部分、及び抗PD1L抗原結合部分からなる群から選択される。あるいは、本発明の「細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分」は、抗FAP抗原結合部分、抗BCMA抗原結合部分、又は抗Flt3抗原結合部分であってよい。

0072

「抗体」(例えば、モノクローナル抗体)又は「抗原結合部分」は、誘導体化されていてもよく、又は異なる分子に結合されてよい。例えば、抗体に結合されうる分子は、他のタンパク質(例えば、他の抗体)、分子標識(例えば、蛍光発光、着色又は放射性分子)、医薬である。当該抗体又は抗原結合部分は、直接的に(例えば、2つのタンパク質が融合された形態で)、又はリンカー分子(例えば、当業界で公知のいかなる適当タイプの化学的リンカー)を介して連結されうる。

0073

融合タンパク質に関する本発明の記載「抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分」は、少なくとも1つのTNFRSF受容体に対する抗体又はその抗原結合部分であれば、特に限定されない。本発明の全ての他の態様による好ましい態様では、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分は、単一型のTNFRSF受容体に対する抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分でありうる。本発明の他の全ての態様による別の好ましい態様では、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分は、2つの異なるタイプのTNFRSF受容体に対する二価抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分でありうる。

0074

用語「結合」又は「結合」は、本明細書中で用いられる場合、目的の抗原への特異的結合をいう。好ましくは、Kd値は、100nM未満、より好ましくは50nM未満、さらにより好ましくは10nM未満、さらにより好ましくは5nM未満、最も好ましくは2nM未満である。

0075

用語「エピトープ」は、本明細書中で用いられる場合、抗体の結合部位を形成する抗原の小部分をいう。

0076

本発明の文脈では、抗体又は抗体融合タンパク質の結合特性を特徴付ける目的で、対象の抗原、FcγR、又は細胞表面若しくは細胞外マトリクスの構造に対する本発明の抗体又は融合タンパク質(例えば、TRAAFFIAA)の結合又は競合結合は、好ましくは、抗体又は融合タンパク質のルシフェラーゼ標識(例えば、Gaussia princeps luciferase (GpL))変異体を用いて、細胞結合試験(例えば、Kums et al.,MAbs.2017 Apr;9(3):506-520に記載されているように)により、又は参照標準アッセイとして表面プラズモン共鳴測定により、測定される。

0077

用語「KD」又は「KD値」は、当業界で公知の平衡解離定数に関する。本発明の文脈では、当該用語は、対象の特定の抗原又は対象のFcγRに関して、又は細胞表面若しくは細胞外マトリクスの構造に関して、本発明の抗体又は融合タンパク質(例えば、TRAAFFIAA)の平衡解離定数に関する。平衡解離定数は、複合体(例えば、抗原−抗体複合体)がその成分(例えば、抗原と抗体)に可逆的に解離する傾向の評価基準である。本発明による抗体又は融合タンパク質について、KD値は、好ましくは、抗体又は所望の融合タンパク質(例えば、TRAAFFIAA)及び非修飾抗体又は融合タンパク質(例えば、TRAAFFIAA)のGpLタグ付き変異体を用いた細胞競合結合試験により、又は表面プラズモン共鳴測定を行って、測定される。

0078

本明細書で本発明による抗体又はその抗原結合部分に関連して用いられる、TNFRSF受容体等の特定のタンパク質への結合について「抗体と交差競合しうる」との用語は、一般に、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)等の当業界で公知のアッセイを行う場合に、抗体又はその抗原結合部分が交差競合しうることをいう。当業者であれば、当該特異的結合のための相互競合を検出するための適当な条件を決定しうるであろう。

0079

用語「単離(された)抗体」又は「単離(された)TRAAFFIA」又は「単離(された)融合タンパク質」は、本明細書中で用いられる場合、例えば、その産生に用いたハイブリドーマ細胞培養又は異なる細胞培養の成分(例えば、TRAAFFIA等の抗体又は融合タンパク質を組換え発現するCHO又はHEK293細胞等のプロデューサー細胞)から、その起源環境の大部分の成分(重量)から同定され、分離される。当該分離は、所望の用途(例えば、本発明に関するTRAAFFIA等の抗体又は融合タンパク質の治療用途)に対する抗体又は融合タンパク質の適合性を阻害しうる成分を十分に除去するように行われる。単離された抗体又は抗体融合タンパク質を調製する方法は当業界で公知であり、プロテインAクロマトグラフィーアニオン交換クロマトグラフィーカチオン交換クロマトグラフィーウイルス保持濾過及び限外濾過を含む。好ましくは、TRAAFFIA調製物等の単離された抗体又は融合タンパク質は、Lowryタンパク質アッセイを用いて測定すると、少なくとも70%の純度(w/w)、より好ましくは少なくとも80%の純度(w/w)、さらに好ましくは少なくとも90%の純度(w/w)、さらに好ましくは少なくとも95%の純度(w/w)、最も好ましくは少なくとも99%の純度(w/w)である。

0080

用語「二価抗体」は、本明細書中で用いられる場合、短すぎて同じ鎖上の2つのドメイン間で対合しえないペプチドリンカーにより連結された、同じポリペプチド鎖上の軽鎖可変ドメインに連結された重鎖可変ドメインを含む、小さな二価抗原結合抗体部分である。このため、他鎖の相補的ドメインと対合し、二量体分子が二つの抗原結合部位と会合する。二価抗体は、二価及び一特異的であってよく(例えば、抗原に対する2つの抗原結合部位がある二価抗体)、又は二価及び二特異的であってよい(例えば、2つの抗原結合部位があり、その一方は抗原に対する結合部位であり、他方は異なる抗原に対する結合部位である、二価抗体)。二価抗体の詳細な説明は、Holliger Pら( ““Diabodies”:small bivalent and bispecific antibody fragments.”Proc Natl Acad Sci USA.1993Jul15;90(14):6444-8.)に記載される。

0081

用語「単一ドメイン抗体」(「Nanobody(商標)」ともいう)は、本明細書中で用いられる場合、単一のモノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片である。単一ドメイン抗体の構造及びその作製方法は、当業界で公知であり、例えば、Holt LJら(“Domain antibodies:proteins for therapy.”TrendsBiotechnol.2003Nov;21(11):484-90.)、Saerens Dら(“Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics.”Curr Opin Pharmacol.2008Oct;8(5):600-8.Epub2008Aug22.)、及びArbabi Ghahroudi M ら(“Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.”FEBSLett.1997Sep15;414(3):521-6.)から公知である。

0082

本発明に関連して本明細書中で言及される「融合タンパク質」は、融合タンパク質の部分が共有結合により融合されるのであれば、特定のタイプの融合タンパク質に限定されない。例えば、融合タンパク質の部分は、1又はそれ以上の単一ポリペプチド鎖中での発現、1又はそれ以上のジスルフィド結合、化学的結合(好ましくは、クリック化学を用いた化学的結合)及び/又はタンパク質に適した結合として当業界で公知のいかなる他の共有結合により融合させうる。好ましくは、融合タンパク質の部分は、1又はそれ以上の単一ポリペプチド鎖における発現及び/又は1又はそれ以上のジスルフィド結合により融合される。従って、本発明の融合タンパク質において、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分、及び細胞表面構造及び/又は細胞外マトリクス構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメインは、1又はそれ以上の単一ポリペプチド鎖における発現、1又はそれ以上のジスルフィド結合、化学的結合(好ましくはクリック化学を用いた化学的結合)、及び/又はタンパク質に適した結合として当業界で公知のいかなる他の共有結合によりも融合しうる。好ましくは、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分、及び細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメインを、1又はそれ以上の単一ポリペプチド鎖における発現及び/又は1又はそれ以上のジスルフィド結合により融合させる。本発明の全ての実施形態において、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメインは、以下の:
−抗体の抗原結合部分であって、前記抗原結合部分は、細胞表面の前記構造及び/又は細胞外マトリクスの前記構造に結合でき、前記抗原結合部分は、1又は複数のFcγR型への結合能が低下しており、前記抗原結合部分は、Fab2断片である;又は
−細胞表面の前記構造及び/又は細胞外マトリクスの前記構造に結合しうる全長抗体;
を含む。
抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分は、化学的結合により、好ましくはクリック化学を用いた化学的結合により融合されることが非常に好ましい。

0083

一般に、本発明の全ての融合タンパク質に関して、融合タンパク質の部分(例えば、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分、及び細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメイン)は、リンカー配列を用いて融合されうることが理解されるであろう。その場合、本発明の融合タンパク質は当該リンカー配列を含むであろう。適当なリンカー配列は、当業界で公知であり、例えば、ペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。例えば、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分と、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメインとが、1又は複数の単一ポリペプチド鎖における発現により融合される本発明の融合タンパク質では、前記1又は複数の単一ポリペプチド鎖は、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分と、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメインとの間の1又は複数のペプチドリンカー配列を含みうる。

0084

本発明に関連する用語「細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメイン」は、当該ドメインが、FcγRとは異なる細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうることを意味する。特段の定めがない限り、これは、ドメインがFcγRに結合しうるさらなる部分(例えば、Fcドメイン)も含みうる可能性を除外しない。

0085

本発明によれば、用語「含む」が用いられる各箇所は、用語「からなる(consisted of)」で置換されてもよい。

0086

方法及び技術
一般に、本明細書に特段の定めがない限り、本発明で用いられる方法(例えば、クローニング方法又は抗体に関する方法)は、当業界で公知の方法、例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、Sambrookら(「分子クローニング実験室マニュアル」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York1989)、Ausubelら(“Current Protocols in Molecular Biology.”Greene Publishing Associates and Wiley Interscience;New York 1992)、及びHarlow及びLane(“Antibodies:A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York 1998)に記載される。

0087

融合タンパク質及びそのドメインの各標的タンパク質への結合は、当業界で公知の方法で評価しうる。結合は、好ましくは、表面プラズモン共鳴測定により評価される。

0088

本発明による配列の配列アラインメントには、BLASTアルゴリズム(Altschul et al.(1990) “Basic local alignment search tool.” Journal of Molecular Biology 215. p. 403-410.; Altschul et al.: (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic AcidsRes. 25:3389-3402.これらの全ては、参照により本明細書に援用される)が用いられる。好ましくは、以下のパラメータが用いられる: Max target sequences 10; Word size 3; BLOSUM 62 matrix;ギャップコスト:存在11、拡張1;条件付き組成スコア行列調整。従って、用語「同一性」又は「同一である」等が配列に関して用いられる場合、BLASTアルゴリズムを用いて得られる同一性の値をいう。

0089

本発明による抗体融合タンパク質は、Siegel DL(“Recombinant monoclonal antibody technology.”Transfus Clin Biol.2002Jan;9(1):15-22、これは参照により本明細書に援用される)で記載の方法を含むが、これに限定されない、当業界で公知のいかなる方法により製造しうる。

0090

TNFRSF受容体の刺激は、当業界で公知のいかなる方法でも測定しうる。例えば、TNFRSF受容体TNFR2、CD40、CD95、Fn14の場合、細胞系IL8分泌アッセイ、及びその後の分泌IL8を例えば、ELISAにより検出することで、刺激を測定しうる。当該細胞系IL8分泌アッセイに用いうる細胞の非限定的な例は、CD40刺激測定用HT1080 CD40トランスフェクタント、Fn14刺激測定用Widr細胞、CD95刺激測定用H1080細胞、及びTNFR2刺激測定用TNFR2発現HeLaトランスフェクタントである。当該アッセイの非限定的な例は、実施例1〜3及び対応する図に見出すことができる。CD95等の、刺激されると細胞毒性作用を呈するTNFRSF受容体については、細胞死誘導を阻害するため、ZVAD等の細胞透過性カスパーゼ阻害剤をアッセイに加えることが、好ましい。本発明の融合タンパク質(例えば、TRAAFFIAAS)で処理される様々なTNFRSF受容体の刺激は、古典的NFκ経路の刺激(例えば、IκBαのリン酸化及び分解、IKK活性化、p65のリン酸化及び核移行標的遺伝子の検出)又は代替NFκB経路の検出(例えば、p100プロセシング、NIK蓄積)を可能にするいかなる方法によっても測定しうる。TRAAFFIASによるCD95及びTRAIL細胞死受容体(DR4、DR5)の刺激もまた、様々な方法により測定する細胞死誘導を評価しうる。TRAAFFIAによるCD40刺激は、樹状細胞成熟度を測定することで、さらに評価しうる。

0091

本発明の組成物の調製
本発明による組成物は、医薬組成物の調製のための公知の基準に従って調製される。

0092

例えば、組成物は、例えば、担体賦形剤又は安定剤等の薬学的に許容される成分を添加して調製することで、適当に保存及び投与されうる。

0093

当該薬学的に許容される成分は、当該医薬組成物の患者への投与量では、毒性でない。当該医薬組成物に添加される薬学上許容される成分は、当該医薬組成物の特定の意図される用途及び投与経路に依存してよい。

0094

一般に、本発明に関連して使用される薬学的に許容される成分は、当業界で利用可能な知識、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,Ed.AR Gennaro,20th edition,2000,Williams&Wilkins,PA,USAから入手可能な知識により用いられる。

0095

配列
本出願で記載されるアミノ酸配列は、1文字アミノ酸コードを用いてN末端からC末端の順序で表される。本出願で記載される核酸配列は、標準的な核酸コードを用いて5’から3’の順序で表される。星印タンパク質配列末端を示す。下線がひかれた核酸配列は、制限エンドヌクレアーゼ部位を表す。

0096

本出願の実施例で、以下の非限定的な例示的配列を用いた:

0097

0098

0099

0100

0101

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0114

0115

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0117

0118

0119

表2:CDR配列(Kabatによる)。CDR配列の重鎖及び軽鎖は、各々「−H」及び「−L」で示される。

0120

0121

0122

0123

0124

0125

0126

0127

0128

0129

0130

0131

以下の配列番号126〜143のアミノ酸配列は、抗4−1BBモノクローナル抗体HBBK4(本出願の非限定的な実施例で用いられる)、URELUMAB及びUTMILUMABのCDR配列である。用語「CDR1−H」、「CDR2−H」及び「CDR3−H」は各々、CDR1、CDR2及びCDR3配列の重鎖をいい、用語「CDR1−L」、「CDR2−L」及び「CDR3−L」は各々、CDR1、CDR2及びCDR3配列の軽鎖をいうことに留意されたい。

0132

0133

0134

0135

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0137

0138

0139

0140

0141

0142

本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに例示される。

0143

抗CD40IgG1 G28.5のTNFR2結合融合タンパク質は、TNFR2結合後にCD40刺激活性が高まった。

0144

TNFRSF受容体CD40を認識するIgG1抗体G28.5の融合タンパク質(抗CD40(G28.5)−HC:scTNF80)を、短いペプチドリンカー(scTNF80(mu)ドメイン)により連結されたネズミTNFのTNFR2特異的突然変異体の3つのコピーを含む単一鎖ドメインと共に分析し、当該コピーが分子内に三量体リガンドドメインを形成する際に、本発明者らは以下の驚くべき観察を行った:

FcγR又はTNFR2発現を示さないCD40発現細胞又は細胞共培養物を、抗CD40(G28.5)−HC:scTNF80で刺激すると、その結果は、例えば、IL8の産生により反映されるCD40活性化が著しく低いか、又は単に生じない。対照的に、FcγR発現細胞の存在下では、上記分子は予想通りCD40を極めて良好に活性化する(上記説明参照)。今回、抗CD40(G28.5)−HC:scTNF80は、親のG28.5抗体とは異なり、TNFR2を発現させると、FcγRの非存在下でも強力にCD40を活性化しうることが明らかになった(図6)。抗CD40(G28.5)−HC:scTNF80の細胞結合TNFR2へのscTNF80ドメイン媒介結合は、Fcドメイン媒介性のG28.5のFcγR発現細胞への結合と同様に、アゴニスト抗体効果を呈しうることが明らかである(図2)。これは、抗TNFRSF受容体抗体又は抗体融合タンパク質の細胞への単なる抗原結合ドメイン非依存性結合が各々、抗体及び抗体融合タンパク質に対して高いアゴニスト活性を与えるのに十分であることを示す。

0145

TNFRSF受容体CD40、CD95及びTNFR2に対する抗体の融合タンパク質が、細胞結合分子への結合を介在するタンパク質ドメインと融合すると、強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用する。

0146

抗TNFRSF受容体抗体又は抗体融合タンパク質の細胞への単なる抗原結合ドメイン非依存性結合は各々、抗体及び抗体融合タンパク質に対して高いアゴニスト活性を与えるのに十分であるという仮説に従い、本発明者らは、細胞結合分子への結合を介在するタンパク質ドメインと融合されたTNFRSF受容体CD40、CD95及びTNFR2を認識する抗体ドメインが、強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用する他の抗体融合タンパク質もまた、FcγR非依存的に作用することを実証しえた。当該例の詳細については、図の凡例を含めて図4、5、8、9を参照のこと。

0147

細胞表面抗原を標的とするscFvドメインがあるTNFRSF受容体CD40、CD95及びTNFR2に対する抗体の融合タンパク質は、強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用する。

0148

さらに、本発明者らは、TNFRSF受容体CD40、CD95及びTNFR2に対する抗体の融合タンパク質を各々、CD20(図10、11及び12)及びCD19(図7及び12)を標的とする細胞表面抗原標的scFvドメインと共に試験した。当該融合タンパク質は、強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用することが見出された。当該例の詳細については、引用されている図とその図の説明文を参照されたい。

0149

TNFRSF受容体CD40及びCD95に対する抗体とscBaffとの融合タンパク質は、強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用する。

0150

さらに、本発明者らは、TNFRSF受容体CD40(図13、14及び15)及びCD95(図16、17及び18)に対する抗体の融合タンパク質又は抗体の断片をscBaffで調べた。当該融合タンパク質は、融合タンパク質のscBaffドメインにより認識される細胞表面発現受容体に融合タンパク質が結合しうる場合は、CD40及びCD95に対する強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用することが見出された。当該例の詳細は、上記図及びその図の説明に示される。

0151

TNFRSF受容体CD40、CD95、TNFR2及び4−1BBに対する抗体のscFv融合タンパク質は、FcγR非依存的、scFv依存的に強力なアゴニストとして作用する。

0152

さらに、本発明者らは、TNFRSF受容体TNFR2(図19及び20)、CD40(図21及び22)、CD95(図21及び22)及び4−1BB(図21及び22)に対する抗体のscFv融合タンパク質を試験した。用いたscFv断片はscFv:CD20(図19、21及び22)、scFv:CD70(2H5)(図20)及びscFv:CD70(1F6)(図20)であった。これらの融合タンパク質は、scFvドメインにより認識される細胞表面抗原(CD20、CD70)にそのscFvドメインを介して結合しうる場合は、抗体部分(TNFR2、CD40、CD95、4−1BB)により認識されるTNFRSF受容体に対する強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用することが見出された。当該例の詳細は、上記の図及びその図の説明に示される。

0153

TNFRSF受容体TRAILR2(DR5)のscFv融合タンパク質は、FcγR非依存的、scFv依存的に、強力なアゴニストとして作用する。
さらに、本発明者らは、TNFRSF受容体TRAILR2に対する抗体(コナツムマブ;Conatumumab)のscFv融合タンパク質(DR5としても指定)を試験した(図23)。用いたscFv断片はscFv:CD70であった。この融合タンパク質は、そのscFvドメインを介して、scFvドメインにより認識される細胞表面抗原CD70に結合しうる場合は、抗体部分(TRAILR2)により認識されるTNFRSF受容体に対する強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用することが見いだされた。

0154

アンカードメインとしてPD−1L PD−1相互作用を遮断するチェックポイント阻害剤から誘導されたscFvがある、抗原提示細胞刺激TNFRSF受容体CD40又はT細胞刺激TNFRSF受容体4−1BBに対する抗体の融合タンパク質は、FcγR非依存的、scFv:PD−1L依存的に強力なアゴニストとして作用する。

0155

本発明者らはまた、TNFRSF受容体CD40(図24)及び4−1BB (図25)に対する抗体の融合タンパク質、又は抗体の断片を、PD−1に結合する抗体遮断性PD−1Lであるチェックポイント阻害剤アベルマブ(Avelumab)由来のscFv:PD−1Lを用いて試験した。これらの融合タンパク質は、融合タンパク質のscFv:PD−1Lドメインにより認識される細胞表面発現PD−1Lに融合タンパク質が結合しうる場合は、CD40及び4−1BBに対する強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用することが見出された。すなわち、これらの融合タンパク質は、免疫チェックポイント遮断と、チェックポイント遮断依存性の免疫刺激性TNFRSF受容体の制限された活性化とを組み合わせた二機能的抗体の例である。当該例の詳細は、上記の図及びその図の説明に示される。

0156

TNFRSF受容体Fn14及び4−1BBに特異的なscFvは、細胞表面抗原に固着する完全抗体に融合させると、強力なアゴニストとしてFcγR非依存的に作用する。

0157

さらに、本発明者らは、PD−1L又はマウスCD27を認識する抗体を用いて、TNFRSF受容体4−1BB(図26)及びFn14(図27)に対するscFvの融合タンパク質を試験した。これらの融合タンパク質は、融合タンパク質の抗体部分がそれらの細胞表面発現抗原PD−1L及びマウスCD27に結合しうる場合は、4−1BB及びFn14に対する強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用することが見出された。当該例は、抗TNFRSF受容体抗体断片(ここではscFvs)が、アンカー依存的活性があるアゴニストとして作用しうるには、完全抗体がアンカードメインとして用いられうることを示す。当該例の詳細は、上記の図及びその図の説明に示される。

実施例からの結論
以下固定化ドメインともいう、抗体に融合される、FcγR及び抗原結合ドメインに非依存性の細胞相互作用に用いられるドメインは、特に限定されない。従って、本発明者らは、細胞結合にIL2リガンド又はscTNFSFリガンドを利用するTRAAFFIAAを製造でき、及び当該TRAAFFIAAとしては、この目的のために異種scFv抗体断片が用いられた。アゴニスト活性を得るためには、抗原結合ドメインがFcγR及び抗原非依存的に細胞に結合することも十分であると考えられる。例えば、CD20特異的scFvとの融合により遺伝的に操作されたCD95特異的抗体E09のFab2断片(図11)により、CD20に依存するTNFRSF受容体刺激活性が強力に高まることが示された。

実施例

0158

本発明者らの研究から、TRAAFFIAAに用いられる適当に選択された固定化ドメインを用いると、標的構造に限定される局所アゴニスト効果がin vivoで達成されうることが直ちに明らかである。これにより、治療が限定される全身性の副作用を回避しうる。従って、TRAAFIAAによれば、抗体でTNFRSF受容体は、FcγR非依存的に有利に刺激するだけでなく、臨床応用を含む適用分野を新たに進展させる。

0159

本発明による抗体融合タンパク質及びそれに関連する組成物は、工業的に製造され、市販品、例えば医薬品として販売することができる。従って、本発明は産業利用可能性がある。
〔参考文献〕

0160

0161

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