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課題

インビボエクスビボ、またはインビトロにおける細胞内への機能的なエフェクター蛋白質送達するための組成物、方法、戦略キット、およびシステムを提供する。

解決手段

超荷電(supercharged)蛋白質(例えば、正に荷電した超荷電蛋白質)、カチオン性ポリマー、またはカチオン性脂質を用いて、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を送達する。

概要

背景

発明の背景
哺乳類細胞内への高分子送達細胞操作のための魅力的な手法である。なぜなら、それは遺伝子発現の調節およびゲノム改変を可能とし、翻って研究の新たな道を拓き、低分子による「新薬の開発につながらない」と現行では見られている分子の治療用ターゲット化を可能にするであろうからである。特に、疾患と結びついた遺伝子またはアレルをターゲット化する組み換えヌクレアーゼは、治療薬として大きな可能性を有する。高分子送達の現行の方法は、核酸分子ウイルス送達、核酸または蛋白質受容体によって媒介される送達、および蛋白質の送達のためのTAT、Arg9、またはペネトラチンなどの細胞透過ペプチドとの蛋白質融合体の使用を包含する。それらの送達システムのそれぞれは特定の応用に利益を提供する。しかしながら、大部分の場合では、有効性細胞毒性、および調製の容易さに関する問題が残っている。有意な細胞毒性または他の有害な副作用無しに種々の細胞株に高分子(例えば、機能的なエフェクター蛋白質)を有効に送達することができる容易に調製される試薬は、相当の課題のまま残っている。

大部分の蛋白質は哺乳類細胞に自発的には入らず、それゆえに、研究ツールとしてのそれらの使用および治療薬としてのそれらの可能性は天然には限定される。哺乳類細胞内への蛋白質の送達のための技術が、細胞内ターゲット対処するために最近になって開発された。それらの技術は、脂質に基づく試薬(Zelphati et al., J. Biol. Chem. 276, 35103-35110, 2001)、ナノ粒子(Hasadsri et al., J. Biol. Chem., 2009)、ヴォールトリボヌクレオ蛋白質粒子(Lai et al., ACS Nano 3, 691-699, 2009)、受容体リガンドへの遺伝学的または化学的融合(Gabel et al., J. Cell Biol. 103, 1817-1827, 1986、Rizk et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11011-11015, 2009)、および細胞透過ペプチドへの融合(Wadia et al., Curr. Protein Pept. Sci. 4, 97-104, 2003、Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009)の使用を包含する。恐らく、蛋白質送達のための最も普通の方法は、HIV−1のTat(転写トランス活性化因子ペプチドおよびポリアルギニンペプチドを包含する蛋白質形質導入ドメイン(PTD)への遺伝学的融合である。これらのカチオン性PTDは、外来性蛋白質の負に荷電した細胞表面構造との結びつきおよびその後のエンドサイトーシスを促進する。Tatおよびポリアルギニン両方ともインビトロおよびインビボの両方の細胞内に種々の高分子を送達するために用いられて来た(Wadia et al., Curr. Protein Pept. Sci. 4, 97-104, 2003、Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009、Myou et al, J. Immunol. 169, 2670-2676, 2002、Bae et al., Clin. Exp. Immunol. 157, 128-138, 2009、Schwarze et al., Science 285, 1569-1572, 1999)。これらの進歩にもかかわらず、細胞内ターゲットは外来性蛋白質を用いて影響を及ぼすことが困難なまま残っている。わずかな成功でさえも、蛋白質が細胞内に機能的に送達される低い効率が原因で、それぞれの形質導入剤の有毒な濃度を要求し得る(Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009、Wang et al., Nat. Biotechnol. 26, 901-908, 2008)。そのため、細胞内生体分子をターゲット化するために細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を入らせるためのより良好な送達システムの必要が残っている。

概要

インビボ、エクスビボ、またはインビトロにおける細胞内への機能的なエフェクター蛋白質を送達するための組成物、方法、戦略キット、およびシステムを提供する。超荷電(supercharged)蛋白質(例えば、正に荷電した超荷電蛋白質)、カチオン性ポリマー、またはカチオン性脂質を用いて、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を送達する。なし

目的

本開示は、超荷電(supercharged)蛋白質(例えば、正に荷電した超荷電蛋白質)、カチオン性ポリマー、またはカチオン性脂質を用いて、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質(例えば、核酸に結合する部位特異的な蛋白質など)を送達するための新規のシステム、組成物、調製物、キット、および関連する方法を提供する

効果

実績

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請求項1

機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む組成物であって、超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも大きくかつ充分量である正の総電荷を有し、細胞内への透過のために処方される、前記組成物。

請求項2

機能的なエフェクター蛋白質がヌクレアーゼである、請求項1に記載の組成物。

請求項3

ヌクレアーゼが、RNAによってプログラミング可能なヌクレアーゼである、請求項2に記載の組成物。

請求項4

ヌクレアーゼがTALEヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項3に記載の組成物。

請求項5

ヌクレアーゼが核酸配列に特異的に結合して切断する、請求項2〜4のいずれか一項に記載の組成物。

請求項6

核酸配列が、疾患または障害と結びついた遺伝子またはアレル内に含まれる、請求項5に記載の組成物。

請求項7

組成物が、ヌクレアーゼによって結合および切断される核酸配列と同一のまたは相同な配列を含む核酸分子をさらに含む、請求項5または6に記載の組成物。

請求項8

核酸配列が、治療ターゲットである遺伝子内に含まれる配列である、請求項5〜7のいずれか一項に記載の組成物。

請求項9

遺伝子が、細胞運命コントロールする遺伝子である、請求項8に記載の組成物。

請求項10

遺伝子が、褐色脂肪細胞の細胞運命に向かう細胞プログラミングを誘導または阻害する遺伝子である、請求項9に記載の組成物。

請求項11

遺伝子がPRDM16またはPPARγである、請求項9または10に記載の組成物。

請求項12

機能的なエフェクター蛋白質が転写因子である、請求項1に記載の組成物。

請求項13

機能的なエフェクター蛋白質がTALE転写活性化因子または抑制因子である、請求項1に記載の組成物。

請求項14

転写因子、転写活性化因子、または転写抑制因子が遺伝子に特異的に結合して活性化または抑制する、請求項12または13に記載の組成物。

請求項15

遺伝子が治療ターゲットである、請求項14に記載の組成物。

請求項16

機能的なエフェクター蛋白質がTALEエフェクターである、請求項1に記載の組成物。

請求項17

超荷電蛋白質が共有結合を介して機能的なエフェクター蛋白質と結びつき、それゆえに融合蛋白質を形成する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物。

請求項18

超荷電蛋白質がリンカーを介して機能的なエフェクター蛋白質と結びつく、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組成物。

請求項19

リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項18に記載の組成物。

請求項20

リンカーが、UVによって切断可能なリンカーまたはリソソーム酵素によって切断されるリンカーである、請求項19に記載の組成物。

請求項21

超荷電蛋白質が非共有結合的相互作用を介して機能的なエフェクター蛋白質と結びつき、それゆえに複合体を形成する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物。

請求項22

超荷電蛋白質が正味の正の総電荷を有する、請求項21に記載の組成物。

請求項23

正味の正の総電荷が約+5である、請求項21に記載の組成物。

請求項24

正味の正の総電荷が約+10である、請求項21に記載の組成物。

請求項25

正味の正の総電荷が約+15である、請求項21に記載の組成物。

請求項26

正味の正の総電荷が約+20である、請求項21に記載の組成物。

請求項27

正味の正の総電荷が約+25である、請求項21に記載の組成物。

請求項28

正味の正の総電荷が約+30である、請求項21に記載の組成物。

請求項29

正味の正の総電荷が約+35である、請求項21に記載の組成物。

請求項30

正味の正の総電荷が約+40である、請求項21に記載の組成物。

請求項31

超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも生理pHにおいて多く正に荷電する、請求項1〜30のいずれか一項に記載の組成物。

請求項32

対応する未改変蛋白質が天然に存在する蛋白質である、請求項31に記載の組成物。

請求項33

超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも生理pHにおいて少なくとも+5多く正に荷電する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。

請求項34

超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも生理pHにおいて少なくとも+10多く正に荷電する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。

請求項35

超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも生理pHにおいて少なくとも+15多く正に荷電する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。

請求項36

超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも生理pHにおいて少なくとも+5多く正に荷電する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。

請求項37

超荷電蛋白質が蛍光蛋白質である、請求項1〜36のいずれか一項に記載の組成物。

請求項38

超荷電蛋白質が緑色蛍光蛋白質(GFP)である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の組成物。

請求項39

超荷電蛋白質が超正荷電GFPである、請求項1〜38のいずれか一項に記載の組成物。

請求項40

超荷電蛋白質が、配列GGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(配列番号1)の少なくとも20個の連続したアミノ酸残基を含む超正荷電GFP(+36GFP)である、請求項1〜39のいずれか一項に記載の組成物。

請求項41

超荷電蛋白質が、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項40に記載の組成物。

請求項42

組成物が医薬組成物である、請求項1〜41のいずれか一項に記載の組成物。

請求項43

組成物が薬学的に許容可能な賦形剤を含む、請求項42に記載の医薬組成物。

請求項44

組成物が対象への投与のために処方され、対象の少なくとも1つの細胞への送達に有効な量で超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質を含む、請求項42または43に記載の医薬組成物。

請求項45

組成物が、対象への投与後に測定可能治療効果を誘導することに有効な量で超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質を含む、請求項42〜44のいずれか一項に記載の医薬組成物。

請求項46

疾患、障害、または状態の1つもしくは2つ以上の症状を患いやすいか、それを患っているか、またはそれを示す対象を提供すること;および請求項1〜41のいずれか一項に記載の組成物または請求項42〜45のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与し、その結果、少なくとも1つの症状が回復することを含む、方法。

請求項47

投与するステップが、機能的なエフェクター蛋白質が対象の細胞に透過するために充分な条件で実施される、請求項46に記載の方法。

請求項48

疾患、障害、または状態が、mRNA、蛋白質、またはその組み合わせの異常に高まったレベルと結びついている、請求項46または47に記載の方法。

請求項49

組成物が、病原性のRNAもしくは蛋白質をコードする遺伝子または疾患細胞または組織において異常に高いレベルで発現されるRNAもしくは蛋白質をコードする遺伝子に、特異的に結合して切断するヌクレアーゼを含む、請求項46〜48のいずれか一項に記載の方法。

請求項50

投与するステップが、経口、静脈内、筋内、動脈内、皮下、脳室内局所吸入、および粘膜送達からなる群から選択される投与経路を含む、請求項46〜49のいずれか一項に記載の方法。

請求項51

機能的なエフェクター蛋白質が細胞に入るための好適な条件で、請求項1〜41のいずれか一項に記載の組成物または請求項42〜45のいずれか一項に記載の医薬組成物と細胞を接触させることを含み、それによって細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入する、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入する方法。

請求項52

機能的なエフェクター蛋白質が細胞に透過したことを確認することをさらに含む、請求項51に記載の方法。

請求項53

細胞が対象内に含まれ、接触がインビボである、請求項51または52に記載の方法。

請求項54

対象が、遺伝子の異常な発現レベルと結びついた障害を有するかまたは発症するリスクがあると診断され、機能的なエフェクター蛋白質が遺伝子の発現レベルを調節する、請求項53に記載の方法。

請求項55

遺伝子の発現のレベルの変化を検出することまたは対象の治療応答を検出することをさらに含む、請求項54に記載の方法。

請求項56

細胞が体細胞である、請求項51〜55のいずれか一項に記載の方法。

請求項57

細胞が、望まれる細胞運命への細胞のプログラミングを誘導するために充分な量、時間、および条件で組成物または医薬組成物と接触させられる、請求項51〜56のいずれか一項に記載の方法。

請求項58

細胞補充治療手法にプログラミングされた細胞を用いることをさらに含む、請求項57に記載の方法。

請求項59

細胞が疾患と結びついたゲノムアレルを持っている細胞であり、機能的なエフェクター蛋白質がアレルを特異的にターゲット化するヌクレアーゼである、請求項51〜58のいずれか一項に記載の方法。

請求項60

細胞がエクスビボで接触させられ、ヌクレアーゼによる望まれないアレルの成功したターゲット化後に対象に再投与される、請求項59に記載の方法。

請求項61

請求項1〜41のいずれか一項に記載の組成物または請求項42〜45のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、キット

請求項62

請求項46〜60のいずれか一項に記載の方法を実行するためのキット。

請求項63

Cas9蛋白質およびカチオン性脂質を含む組成物であって、Cas9蛋白質がgRNAと結びつき、組成物が細胞の内部にCas9蛋白質を送達することができる、前記組成物。

請求項64

組成物が、細胞の集団に投与されたときに低い毒性を示す、請求項63に記載の組成物。

請求項65

細胞の少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%が、組成物の投与後に生存可能である、請求項63または64に記載の組成物。

請求項66

カチオン性脂質が、Lipofectamine(登録商標)2000、Lipofectamine(登録商標)3000、Lipofectamine(登録商標)RNAiMAX、およびLipofectamine(登録商標)LTXからなる群から選択される、請求項63〜65のいずれか一項に記載の組成物。

請求項67

Cas9蛋白質が、野生型Cas9蛋白質もしくはそのバリアント、Cas9ニッカーゼ、またはヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)もしくはそのバリアントを含む、請求項63〜66のいずれか一項に記載の組成物。

請求項68

dCas9が転写活性化因子または転写抑制因子に融合する、請求項67に記載の組成物。

請求項69

転写活性化因子がVP16、VP64、およびp65からなる群から選択されるか、または転写抑制因子がKRAB蛋白質もしくはSID蛋白質である、請求項68に記載の組成物。

請求項70

dCas9がヌクレアーゼドメインに融合する、請求項67に記載の組成物。

請求項71

ヌクレアーゼドメインがFokIヌクレアーゼドメインを含む、請求項70に記載の組成物。

請求項72

dCas9がリコンビナーゼ触媒ドメインに融合する、請求項67に記載の組成物。

請求項73

リコンビナーゼ触媒ドメインがHinリコンビナーゼ触媒ドメイン、Ginリコンビナーゼ触媒ドメイン、またはTn3リコンビナーゼ触媒ドメインを含む、請求項72に記載の組成物。

請求項74

dCas9がデアミナーゼに融合する、請求項67に記載の組成物。

請求項75

デアミナーゼが、APBEC1、AID、およびACF1/ASEデアミナーゼからなる群から選択されるシチジンデアミナーゼを含むか、または、デアミナーゼが、ADATファミリーデアミナーゼを任意で含むアデノシンデアミナーゼを含む、請求項74に記載の組成物。

請求項76

dCas9がエピジェネティック修飾因子に融合する、請求項67に記載の組成物。

請求項77

エピジェネティック修飾因子が、ヒストン脱メチル化酵素ヒストンメチルトランスフェラーゼヒドロキシラーゼヒストン脱アセチル化酵素、およびヒストンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項76に記載の組成物。

請求項78

エピジェネティック修飾因子が、LSD1ヒストン脱メチル化酵素またはTET1ヒドロキシラーゼを含む、請求項77に記載の組成物。

請求項79

Cas9蛋白質が、正味の負電荷を有する超荷電蛋白質と結びつき、結びつきは正味の負電荷を有し、任意で結びつきは共有結合的な結びつきである、請求項67に記載の組成物。

請求項80

超荷電蛋白質が蛍光蛋白質であり、任意で超荷電蛋白質が超負荷電GFPである、請求項79に記載の組成物。

請求項81

エフェクター蛋白質およびカチオン性脂質、カチオン性ポリマー、またはカチオン性脂質およびカチオン性ポリマーの両方を含む組成物であって、エフェクター蛋白質が正味の負電荷を有する超荷電蛋白質と結びつき、結びつきが正味の負電荷を有し、組成物が細胞の内部にエフェクター蛋白質を送達することができる、前記組成物。

請求項82

組成物が、細胞の集団に投与されたときに低い毒性を示す、請求項81に記載の組成物。

請求項83

細胞の少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%が、組成物の投与後に生存可能である、請求項81または82に記載の組成物。

請求項84

カチオン性脂質が、Lipofectamine(登録商標)2000、Lipofectamine(登録商標)3000、Lipofectamine(登録商標)RNAiMAX、およびLipofectamine(登録商標)LTXからなる群から選択される、請求項81〜83のいずれか一項に記載の組成物。

請求項85

超荷電蛋白質が蛍光蛋白質であり、任意で超荷電蛋白質が超負荷電GFPである、請求項81〜84のいずれか一項に記載の組成物。

請求項86

エフェクター蛋白質がリコンビナーゼである、請求項81〜85のいずれか一項に記載の組成物。

請求項87

リコンビナーゼがCreリコンビナーゼである、請求項86に記載の組成物。

請求項88

エフェクター蛋白質がTALE蛋白質を含む、請求項81〜87のいずれか一項に記載の組成物。

請求項89

TALE蛋白質がVP64転写活性化因子を含む、請求項88に記載の組成物。

請求項90

組成物が医薬組成物である、請求項81〜89のいずれか一項に記載の組成物。

請求項91

その必要がある対象に請求項90に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

請求項92

細胞内にCas9蛋白質を導入する方法であって、Cas9蛋白質が細胞内に入るための好適な条件で請求項81〜90のいずれか一項に記載の組成物と細胞を接触させることを含み、それによって細胞内にCas9蛋白質を導入する、前記方法。

技術分野

0001

関連出願
本願は、2014年8月18日出願のU.S.出願U.S.S.N.14/462,189および2014年8月18日出願のU.S.出願U.S.S.N.14/462,163の米国特許法第365条(c)の下で優先権を主張し、かつ2013年9月6日出願のU.S.仮特許出願U.S.S.N.61/874,746の米国特許法第119条(e)の下で優先権をもまた主張し、そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。

背景技術

0002

発明の背景
哺乳類細胞内への高分子送達細胞操作のための魅力的な手法である。なぜなら、それは遺伝子発現の調節およびゲノム改変を可能とし、翻って研究の新たな道を拓き、低分子による「新薬の開発につながらない」と現行では見られている分子の治療用ターゲット化を可能にするであろうからである。特に、疾患と結びついた遺伝子またはアレルをターゲット化する組み換えヌクレアーゼは、治療薬として大きな可能性を有する。高分子送達の現行の方法は、核酸分子ウイルス送達、核酸または蛋白質受容体によって媒介される送達、および蛋白質の送達のためのTAT、Arg9、またはペネトラチンなどの細胞透過ペプチドとの蛋白質融合体の使用を包含する。それらの送達システムのそれぞれは特定の応用に利益を提供する。しかしながら、大部分の場合では、有効性細胞毒性、および調製の容易さに関する問題が残っている。有意な細胞毒性または他の有害な副作用無しに種々の細胞株に高分子(例えば、機能的なエフェクター蛋白質)を有効に送達することができる容易に調製される試薬は、相当の課題のまま残っている。

0003

大部分の蛋白質は哺乳類細胞に自発的には入らず、それゆえに、研究ツールとしてのそれらの使用および治療薬としてのそれらの可能性は天然には限定される。哺乳類細胞内への蛋白質の送達のための技術が、細胞内ターゲット対処するために最近になって開発された。それらの技術は、脂質に基づく試薬(Zelphati et al., J. Biol. Chem. 276, 35103-35110, 2001)、ナノ粒子(Hasadsri et al., J. Biol. Chem., 2009)、ヴォールトリボヌクレオ蛋白質粒子(Lai et al., ACS Nano 3, 691-699, 2009)、受容体リガンドへの遺伝学的または化学的融合(Gabel et al., J. Cell Biol. 103, 1817-1827, 1986、Rizk et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11011-11015, 2009)、および細胞透過ペプチドへの融合(Wadia et al., Curr. Protein Pept. Sci. 4, 97-104, 2003、Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009)の使用を包含する。恐らく、蛋白質送達のための最も普通の方法は、HIV−1のTat(転写トランス活性化因子ペプチドおよびポリアルギニンペプチドを包含する蛋白質形質導入ドメイン(PTD)への遺伝学的融合である。これらのカチオン性PTDは、外来性蛋白質の負に荷電した細胞表面構造との結びつきおよびその後のエンドサイトーシスを促進する。Tatおよびポリアルギニン両方ともインビトロおよびインビボの両方の細胞内に種々の高分子を送達するために用いられて来た(Wadia et al., Curr. Protein Pept. Sci. 4, 97-104, 2003、Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009、Myou et al, J. Immunol. 169, 2670-2676, 2002、Bae et al., Clin. Exp. Immunol. 157, 128-138, 2009、Schwarze et al., Science 285, 1569-1572, 1999)。これらの進歩にもかかわらず、細胞内ターゲットは外来性蛋白質を用いて影響を及ぼすことが困難なまま残っている。わずかな成功でさえも、蛋白質が細胞内に機能的に送達される低い効率が原因で、それぞれの形質導入剤の有毒な濃度を要求し得る(Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009、Wang et al., Nat. Biotechnol. 26, 901-908, 2008)。そのため、細胞内生体分子をターゲット化するために細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を入らせるためのより良好な送達システムの必要が残っている。

0004

本開示は、超荷電(supercharged)蛋白質(例えば、正に荷電した超荷電蛋白質)、カチオン性ポリマー、またはカチオン性脂質を用いて、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質(例えば、核酸に結合する部位特異的な蛋白質など)を送達するための新規のシステム、組成物調製物キット、および関連する方法を提供する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼ、RNAによってプログラミング可能な(RNA-programmable)ヌクレアーゼもしくは操作されたRNAによってプログラミング可能なゲノム編集酵素(例えば、Cas9およびそのバリアントまたは融合体)、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである。いくつかの態様において、転写因子はTALE転写活性化因子または抑制因子である。いくつかの態様において、エフェクター蛋白質はリコンビナーゼである。本明細書により詳細に記載される通り、機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)を正に荷電した超荷電蛋白質と融合することまたは結びつけることは、細胞の内部への蛋白質の送達を可能とし、例えば遺伝子発現またはゲノム改変に影響を及ぼす。機能的なエフェクター蛋白質を負に荷電した超荷電蛋白質と融合することまたは結びつけることは、蛋白質がカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーと結びつくことを可能とし、これが細胞の内部への蛋白質の強力な送達を提供するということもまた見いだされた。さらに、天然に負に荷電している機能的なエフェクター蛋白質(例えば、VP64転写活性化因子、アニオン性3×FLAGペプチドタグ、およびその融合体)または本来負に荷電している核酸(例えばガイドRNA、「gRNA」)と結びつく機能的なエフェクター蛋白質(例えば、Cas9蛋白質ならびにそのバリアントおよび融合体)は、(例えば、超荷電蛋白質の非存在下において)細胞への送達のためのカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーと結びつき得る。

0005

エフェクター蛋白質の送達は細胞外ターゲットについては有効だと判明している一方で、細胞内ターゲットに対処するためのそれらの使用は、大部分の蛋白質が自発的に哺乳類細胞に入ることができないことが原因で、比較的未開発である。外来性蛋白質が細胞内ターゲットにアクセスすることを可能にすることは、化学的トランスフェクションエレクトロポレーション、またはウイルス送達を通じたそれらのコードDNA配列の送達によって、最も普通には達成される。しかしながら、細胞内への外来性DNAの導入は、ゲノム中への永久的な組み換え、内在性遺伝子の可能性ある破壊、およびコードされる薬剤に対する長期暴露の可能性を生ずる。いくつかの研究または治療応用(ゲノムDNAの一度きりの永久的な改変を実現しようとするゲノム編集応用を包含する)のためには、複製不能な蛋白質薬剤の機能的な送達は、改善された安全性およびより幅広い応用性を提供し得る。さらに、脂質およびポリマーなどのカチオン性化合物を用いる蛋白質の送達は技術的に難しいまま残っており、かつ多くの場合で細胞毒性を誘導する一方で、本明細書において提供される組成物および方法を用いると、ある種の機能的なエフェクター蛋白質(例えば、Cas9蛋白質ならびにそのバリアントおよび融合体、リコンビナーゼ、転写活性化因子/抑制因子など)が細胞に送達され得て、毒性が無いかまたは最小限の毒性が有り、いくつかの場合では、効率の有意な改善と低減されたオフターゲット効果とを有するゲノム改変を媒介するということが、驚くべきことに見いだされた。例えば、例7に記載される通り、カチオン性脂質によるCas9:gRNA複合体の送達は高度に効率的であり(単一の処置から、培養ヒト細胞の80%までの改変)、プラスミドトランスフェクションと比較してより高いゲノム改変特異性をもまた誘導し、典型的には>10倍高いオンターゲット:オフターゲットDNA改変比をヒト細胞においてもたらす。

0006

従って、1つの側面において、超荷電蛋白質が用いられて、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質(例えばヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、Cas9蛋白質(その融合体およびバリアントを包含する)など)を送達する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、対応する未改変蛋白質と比較してその総表面電荷の増大を示すように操作されている。他の態様において、超荷電蛋白質は、対応する未改変蛋白質と比較してその総表面電荷の減少を示すように操作されている。他の態様において、本開示の文脈で用いられる超荷電蛋白質は、天然に存在する超荷電蛋白質である。超荷電蛋白質は、共有結合的なまたは非共有結合的相互作用を介して、送達されるべき蛋白質と結びつけられ得る。いずれかの特定の理論によって束縛されることを求めるものではないが、gRNAと結びついたCas9蛋白質、バリアント、または融合蛋白質正味負電荷を有し、正に荷電した超荷電蛋白質との結びつきを容易にする。ある種の態様において、超荷電蛋白質と結びついた機能的なエフェクター蛋白質は、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とさらに結びついて、細胞内への送達に好適な組成物を形成する。好適な操作されたまたは天然に存在する超荷電蛋白質の例は国際PCT特許出願PCT/US07/70254(2007年6月1日出願、2007年12月13日にWO2007/143574として公開)、国際PCT出願PCT/US09/041984(2009年4月28日出願、2009年11月5日にWO2009/134808として公開)、および国際PCT出願PCT/US10/001250(2010年4月28日出願、2010年11月11日にWO2010/129023として公開)に記載されており、そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。細胞にヌクレアーゼを送達することへの使用のための超荷電蛋白質のさらなる例が本明細書に記載される。好適な機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼおよびRNAによってプログラミング可能なエフェクター蛋白質、例えばCas9蛋白質)の追加の例は、「Engineered Transcription Activator-Like Effector (TALE) Domains and Uses Thereof」と題する2013年8月22日出願のU.S.仮特許出願U.S.S.N.61/868,846、「Cas9 Variants and Uses Thereof」と題する2013年9月6日出願のU.S.仮特許出願U.S.S.N.61/874,609、「Switchable Cas9 Nucleases and Uses Thereof」と題する2013年9月6日出願のU.S.仮特許出願U.S.S.N.61/874,682、「Engineered Transcription Activator-Like Effector (TALE) Domains and Uses Thereof」と題する2014年6月20日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/320,519、「Cas9-FokI Fusion Proteins And Uses Thereof」と題する2014年6月30日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/320,498、「Cas9-Recombinase Fusion Proteins And Uses Thereof」と題する2014年6月30日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/320,467、「Switchable gRNAs Comprising Aptamers」と題する2014年7月8日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/326,329、「mRNA-Sensing Switchable gRNAs」と題する2014年7月8日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/326,340、「Extended DNA-Sensing gRNAs」と題する2014年7月8日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/326,361、「Fusions Of Cas9 Domains And Nucleic Acid-Editing Domains」と題する2014年7月8日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/325,815、「MethodsFor Nucleic Acid Editing」と題する2014年7月8日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/326,109、「Methods For Correcting PI3K Point Mutations」と題する2014年7月8日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/326,140、「Methods For Correcting Presenilin Point Mutations」と題する2014年7月9日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/326,269、「Methods For Correcting α-Antitrypsin Point Mutations」と題する2014年7月8日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/326,290、「Methods For Correcting Von Willebrand Factor Point Mutations」と題する2014年7月8日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/326,318、「Methods For Correcting Caspase-9 Point Mutations」と題する2014年7月8日出願のU.S.非仮出願U.S.S.N.14/326,303、および「Cas9 Proteins Including Ligand-Dependent Inteins」と題するU.S.仮出願U.S.S.N.62/030,943に記載されており、そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。

0007

いくつかの態様において、操作されたまたは天然に存在する超荷電蛋白質は正に荷電する。他の態様(例えば、カチオン性脂質および/またはカチオン性ポリマーを用いるある種のエフェクター蛋白質の送達が関わるもの)において、超荷電蛋白質は負に荷電する。ある種の態様において、超正荷電または超負荷電蛋白質はエフェクター蛋白質と非共有結合的に結びつけられる。その代わりに、超正荷電または超負荷電蛋白質はエフェクター蛋白質に共有結合し得る。いくつかの態様において、エフェクター蛋白質は超荷電蛋白質に融合する。ある種の態様において、もたらされる融合蛋白質は、超荷電蛋白質とエフェクター蛋白質との間にリンカー(例えば切断可能なリンカー)を含む。

0008

本開示のいくつかの側面は、機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)と結びついた超荷電蛋白質を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はカチオン性脂質をさらに含む。いくつかの態様において、組成物はカチオン性ポリマーをさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、緩衝液または賦形剤をさらに含む。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、その対応する未改変蛋白質よりも大きくかつ充分な量である正の総電荷を有し、細胞への送達および透過のために処方される。他の態様(例えばカチオン性脂質および/またはカチオン性ポリマーを用いるある種のエフェクター蛋白質の送達が関わるもの)において、超荷電蛋白質は、その対応する未改変蛋白質よりも大きい負の総電荷を有する。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質は部位特異的な酵素、例えばヌクレアーゼ、Cas9蛋白質、リコンビナーゼなどである。いくつかの態様において、Cas9蛋白質は野生型Cas9蛋白質、Cas9ニッカーゼであるか、またはヌクレアーゼ不活性型(dCas9)蛋白質を含む。いくつかの態様において、Cas9蛋白質はdCas9を含む融合蛋白質である。いくつかの態様において、融合蛋白質は、転写活性化因子(例えばVP64)、転写抑制因子(例えば、KRAB、SID)、ヌクレアーゼドメイン(例えば、FokI)、リコンビナーゼドメイン(例えば、Hin、Gin、またはTn3)、デアミナーゼ(例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ)、またはエピジェネティック修飾因子ドメイン(例えば、TET1)を含む。ヌクレアーゼが関わるいくつかの態様において、ヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、Cas9ニッカーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは核酸配列に特異的に結合して切断する。いくつかの態様において、ターゲット化される核酸配列は、治療ターゲットである遺伝子(例えば、疾患の処置において不活性化することが望ましい遺伝子)の配列である。いくつかの態様において、ターゲット化される核酸配列はPRDM16、PPARγ、VEGF−A、Oct−4、PI3K、プレセニリン、α−アンチトリプシンフォン・ヴィレブランド因子、またはカスパーゼ−9遺伝子配列である。

0009

いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質は転写因子である。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質はTALE転写活性化因子または抑制因子である。いくつかの態様において、転写因子、転写活性化因子、または転写抑制因子は遺伝子に特異的に結合し、活性化または抑制する。いくつかの態様において、遺伝子は治療ターゲットである。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質はTALEエフェクターである。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は機能的なエフェクター蛋白質に共有結合し、それゆえに融合蛋白質を形成する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質はリンカーを介して機能的なエフェクター蛋白質と結びつく。いくつかの態様において、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、UVによって切断可能なリンカーまたはリソソーム酵素によって切断されるリンカーである。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は機能的なエフェクター蛋白質と非共有結合的に結びつき、それゆえに複合体を形成する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は正味の正の総電荷を有する。他の態様において、超荷電蛋白質は正味の負の総電荷を有し、蛋白質(単数または複数)はカチオン性脂質と結びつく。他の態様において、超荷電蛋白質は正味の負の総電荷を有し、蛋白質(単数または複数)はカチオン性ポリマーと結びつく。いくつかの態様において、正味の正の総電荷は約+5〜約+40であるか、または正味の負の総電荷は約−5〜約−50である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、その対応する未改変蛋白質よりも生理pHにおいて多く正に荷電するかまたは負に荷電する。いくつかの態様において、対応する未改変蛋白質は天然に存在する蛋白質である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、その対応する未改変蛋白質よりも生理pHにおいて少なくとも+5多く正にまたは少なくとも−5多く負に荷電する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は蛍光蛋白質である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は緑色蛍光蛋白質(GFP)である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は超正荷電GFPである。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は超正荷電GFP(+36GFP)であり、配列:
GGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(配列番号1)
の少なくとも20個の連続したアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、配列番号1に示されているアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、配列番号1に示されているアミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、組成物は医薬組成物である。いくつかの態様において、組成物は薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの態様において、組成物は対象への投与のために処方され、対象の少なくとも1つの細胞への送達に有効な量で超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質を含む。いくつかの態様において、組成物は、対象への投与後に測定可能治療効果を誘導するための有効な量で、超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質を含む。

0010

本開示のいくつかの側面は、gRNAおよびカチオン性脂質と結びついたCas9蛋白質を含む組成物を提供する。Cas9蛋白質がgRNAと結びついたときに、複合体はカチオン性脂質によって封入されて細胞に有効に送達され得るということが、驚くべきことに見いだされた。これは、超荷電蛋白質有りまたは無しで成就され得る。いくつかの態様において、組成物は、負の超荷電蛋白質(例えば超負荷電GFP)およびカチオン性脂質と結びついたCas9蛋白質を含み、これもまた細胞への成功した送達を可能にする。いくつかの態様において、組成物は、細胞の集団に送達されたときに低い毒性を示す。例えば、細胞の少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%が、組成物の投与後に生存可能である。いくつかの態様において、Cas9蛋白質は野生型Cas9蛋白質、Cas9ニッカーゼであるか、またはヌクレアーゼ不活性型(dCas9)蛋白質を含む。いくつかの態様において、Cas9蛋白質はdCas9を含む融合蛋白質である。いくつかの態様において、融合蛋白質は、転写活性化因子(例えば、VP64)、転写抑制因子(例えばKRAB、SID)、ヌクレアーゼドメイン(例えば、FokI)、リコンビナーゼドメイン(例えばHin、Gin、またはTn3)、デアミナーゼ(例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ)、またはエピジェネティック修飾因子ドメイン(例えばTET1)を含む。

0011

本開示の他の側面は、gRNAおよびカチオン性ポリマーと結びついたCas9蛋白質を含む組成物を提供する。カチオン性脂質と同じく、Cas9蛋白質がgRNAと結びついたときには、複合体はカチオン性ポリマーと結びついて細胞に有効に送達され得る。これは、超荷電蛋白質有りまたは無しで成就され得る。いくつかの態様において、組成物は、負の超荷電蛋白質(例えば、超負荷電GFP)およびカチオン性ポリマーと結びついたCas9蛋白質を含み、これもまた細胞への成功した送達を可能にする。いくつかの態様において、組成物は、細胞の集団に送達されたときに低い毒性を示す。例えば細胞の少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%が、組成物の投与後に生存可能である。いくつかの態様において、Cas9蛋白質は野生型Cas9蛋白質、Cas9ニッカーゼであるか、またはヌクレアーゼ不活性型(dCas9)蛋白質を含む。いくつかの態様において、Cas9蛋白質はdCas9を含む融合蛋白質である。いくつかの態様において、融合蛋白質は、転写活性化因子(例えば、VP64)、転写抑制因子(例えば、KRAB、SID)、ヌクレアーゼドメイン(例えば、FokI)、リコンビナーゼドメイン(例えば、Hin、Gin、またはTn3)、デアミナーゼ(例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ)、またはエピジェネティック修飾因子ドメイン(例えば、LSD1、TET1)を含む。

0012

本開示のいくつかの側面は、対象に本明細書において提供される組成物を投与するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、対象に本明細書に記載される組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、疾患、障害、または状態の1つもしくは2つ以上の症状を患いやすいか、それを患っているか、またはそれを示す。いくつかの態様において、組成物は、投与の結果として少なくとも1つの兆候または症状が回復するための充分な量および好適な条件で、対象に投与される。いくつかの態様において、投与するステップは、機能的なエフェクター蛋白質が対象の細胞に透過するために充分な条件で実施される。いくつかの態様において、疾患、障害、または状態は、mRNA、蛋白質、またはその組み合わせの異常に高まったレベルと結びついている。いくつかの態様において、組成物は、ゲノム配列(例えば、正常なまたは病原性のアレル、疾患の患いやすさまたは始まりもしくは進行と結びついた遺伝子、病原性のRNAまたは蛋白質をコードする遺伝子、あるいは、疾患細胞または組織において異常に高いレベルで発現されるRNAまたは蛋白質をコードする遺伝子)に特異的に結合して切断するヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、投与するステップは、経口、静脈内、筋内、動脈内、皮下、脳室内局所吸入、および粘膜送達からなる群から選択される投与経路を含む。

0013

本開示のいくつかの側面は、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、機能的なエフェクター蛋白質が細胞に入るための好適な条件で、本明細書に記載される超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質を含む組成物と細胞を接触させることを含み、それによって細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入する。いくつかの態様において、方法は、Cas9蛋白質が細胞に入るための好適な条件で、Cas9蛋白質とカチオン性脂質および/またはカチオン性ポリマーとを含む組成物と細胞を接触させることを含み、それによって細胞内にCas9蛋白質を導入する。いくつかの態様において、Cas9蛋白質は細胞の核に入る。例えば、Cas9蛋白質は、蛋白質中核局在シグナルNLS)を包含することによって核に導かれる。いくつかの態様において、方法は、機能的なエフェクター蛋白質(例えばCas9を包含する)が細胞に透過したことを確認することをさらに含む。いくつかの態様において、細胞は対象内にあり、接触はインビボでなされる。いくつかの態様において、対象は、遺伝子の異常な発現レベルと結びついた疾患を有するかまたは発症するリスクがあると診断され、機能的なエフェクター蛋白質(例えばCas9を包含する)が遺伝子の発現レベルを調節する。いくつかの態様において、方法は、遺伝子の発現のレベルの変化を検出することまたは対象の治療応答を検出することをさらに含む。いくつかの態様において、細胞は体細胞である。いくつかの態様において、細胞は、望まれる細胞運命への細胞のプログラミングを誘導するための充分な量、時間、および条件で組成物または医薬組成物と接触させられる。いくつかの態様において、方法は、細胞補充治療手法にプログラミングされた細胞を用いることをさらに含む。いくつかの態様において、細胞は、疾患と結びついたゲノムアレルを持っている細胞であり、機能的なエフェクター蛋白質はアレルを特異的にターゲット化する。いくつかの態様において、細胞はエクスビボで接触させられ、機能的なエフェクター蛋白質による望まれないアレルの成功したターゲット化後に対象に再投与される。

0014

本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載される組成物(例えば、機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む組成物)を含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、Cas9蛋白質および超荷電蛋白質を含む。いくつかの態様において、キットは、Cas9蛋白質およびカチオン性脂質を含む。いくつかの態様において、キットは、Cas9蛋白質およびカチオン性ポリマーを含む。いくつかの態様において、キットは、キット中に包含される構成物を用いるための取扱説明書をさらに含む。

0015

本発明のこれらおよび他の側面および態様、さらには様々な利点および有用性は、図面および本発明の詳細な記載に関してより明らかになるであろう。

0016

定義
本明細書および特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に別様に示さない限り、単数および複数の参照を包含する。それゆえに、例えば「薬剤」の参照は単一の薬剤および複数の薬剤を包含する。

0017

用語「と結びつく」は、2つまたは3つ以上の部分(例えば、蛋白質または蛋白質ドメイン)の文脈で本明細書において用いられる場合、部分が、直接的にまたは連結剤として働く1つもしくは2つ以上の追加の部分を介して互いに物理的に結びつきまたは繋がって、充分に安定な構造を形成し、その結果、部分は、構造が用いられる条件で(例えば生理条件で)物理的に結びついたまま残るという事実を言う。超荷電蛋白質は、非共有結合的な相互作用(例えば、静電気的相互作用)を介して機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)と結びつき得る。ある種の態様において、超荷電蛋白質は静電気的相互作用を介して機能的なエフェクター蛋白質と結びついて、複合体を形成し得る。いくつかの態様において、より弱い相互作用の充分な数は、部分が種々の異なる条件で物理的に結びついたまま残っているために充分な安定性を提供し得る。ある種の態様において、超荷電蛋白質は、共有結合(例えば、アミド結合)を介して機能的なエフェクター蛋白質と結びつく。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質は、ペプチド結合によって直接的にまたはリンカーを介して間接的に超荷電蛋白質と結びつく。

0018

用語「Cas9」または「Cas9ヌクレアーゼ」は、Cas9蛋白質またはその断片を含む、RNAによってガイドされるヌクレアーゼ(例えば、Cas9の活性もしくは不活性なDNA切断ドメインまたは部分的に不活性なDNA切断ドメイン(例えばCas9「ニッカーゼ」)および/あるいはCas9のgRNA結合ドメインを含む蛋白質)を言う。いくつかの態様において、用語「Cas9」はCas9またはその断片を含む融合蛋白質を言う。

0019

いくつかの態様において、Cas9は、Corynebacterium ulcerans(NCBIのRef:NC_015683.1、NC_017317.1)、Corynebacterium diphtheria(NCBIのRef:NC_016782.1、NC_016786.1)、Spiroplasma syrphidicola(NCBIのRef:NC_021284.1)、Prevotella intermedia(NCBIのRef:NC_017861.1)、Spiroplasma taiwanense(NCBIのRef:NC_021846.1)、Streptococcus iniae(NCBIのRef:NC_021314.1)、Belliella baltica(NCBIのRef:NC_018010.1)、Psychroflexus torquisl(NCBIのRef:NC_018721.1)、Streptococcus thermophilus(NCBIのRef:YP_820832.1)、Listeria innocua(NCBIのRef:NP_472073.1)、Campylobacter jejuni(NCBIのRef:YP_002344900.1)、またはNeisseria meningitidis(NCBIのRef:YP_002342100.1)からのCas9を言う。

0020

用語「カチオン性脂質」は、生理pHにおいてカチオン性の(または正の)電荷を有する脂質を言う。カチオン性脂質は種々の形態をとり得、リポソームまたはミセルを包含するが、これに限定されない。本開示のある種の側面に有用なカチオン性脂質は当分野において公知であり、一般的に極性および非極性ドメインを両方含み、ポリアニオン(例えば核酸分子または負の超荷電蛋白質)に結合し、典型的には細胞内への核酸の送達を容易にすることが公知である。有用なカチオン性脂質の例は、ポリエチレンイミンポリアミドアミン(PAMAM)スターバーストデンドリマー、Lipofectin(DOTMAおよびDOPEの組み合わせ)、Lipofectase、LIPOFECTAMINE(登録商標)(例えば、LIPOFECTAMINE(登録商標)2000、LIPOFECTAMINE(登録商標)3000、LIPOFECTAMINE(登録商標)RNAiMAX、LIPOFECTAMINE(登録商標)LTX)、SAINT-RED(Synvolux Therapeutics, Groningen Netherlands)、DOPE、Cytofectin(Gilead Sciences, FosterCity, Calif.)、およびEufectin(JBL, San Luis Obispo, Calif.)を包含する。例示的なカチオン性リポソームは、N−[1−(2,3−ジオレオルオキシ(dioleoloxy))−プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N−[1−(2,3−ジオレオールオキシ(dioleoloxy))−プロピル]−Ν,Ν,Ν−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート(DOTAP)、3β−[Ν−(Ν’,Ν’−ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール(DC−Chol)、2,3,−ジオレイルオキシ−N−[2(スペルミンカルボキサミドエチル]−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸(DOSPA)、1,2−ジミリスチルオキシプロピル−3−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)から作られ得る。カチオン性脂質は、細胞に核酸分子を送達するために当分野において用いられて来た(例えば、U.S.Pat.No.5,855,910、5,851,548、5,830,430、5,780,053、5,767,099、8,569,256、8,691,750、8,748,667、8,758,810、8,759,104、8,771,728、Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3176、Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15: 1参照)。加えて、他の脂質組成物もまた当分野において公知であり、例えばU.S.Pat.No.4,235,871、U.S.Pat.No.4,501,728、4,837,028、4,737,323において教示されるものを包含する。

0021

用語「カチオン性ポリマー」は、本明細書において用いられる場合、正味の正電荷を有するポリマーを言う。カチオン性ポリマーは当分野において周知であり、Samal et al., Cationic polymers and their therapeutic potential. Chem Soc Rev. 2012 Nov 7;41(21):7147-94、公開U.S.特許出願U.S.2014/0141487A1、U.S.2014/0141094A1、U.S.2014/0044793A1、U.S.2014/0018404A1、U.S.2014/0005269A1、およびU.S.2013/0344117A1、ならびにU.S.Pat.No.8,709,466、8,728,526、8,759,103、および8,790,664に記載されているものを包含し、それぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。例示的なカチオン性ポリマーは、ポリアリルアミン(PAH)、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリ(L−リシン)(PLL)、ポリ(L−アルギニン)(PLA)、ポリビニルアミンホモまたはコポリマー、ポリ(ビニルベンジルトリ−C1−C4−アルキルアンモニウム塩)、脂肪族または芳香脂肪族ジハライドおよび脂肪族N,N,N’,N’−テトラ−C1−C4−アルキルアルキレンジアミンのポリマー、ポリ(ビニルピリジン)またはポリ(ビニルピリジニウム塩)、ポリ(N,N−ジアリル−N,N−ジ−C1−C4−アルキル−アンモニウムハライド)、四級化ジ−C1−C4−アルキル−アミノエチルアクリレートまたはメタクリレートのホモまたはコポリマー、POLYQUAD(商標)、ポリアミノアミド、および同類を包含するが、これに限定されない。

0022

用語「デアミナーゼ」は、脱アミノ反応触媒する酵素を言う。いくつかの態様において、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼであり、シチジンまたはデオキシシチジンからそれぞれウラシルまたはデオキシウラシルへの加水分解的脱アミノを触媒する。

0023

用語「有効量」は、本明細書において用いられる場合、望まれる生体応答惹起するために充分である生物活性剤の量を言う。例えば、いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)の有効量は、検出可能な効果(例えば、ターゲット部位の切断、ターゲット部位の改変、遺伝子発現の調節など)を誘導するために充分である蛋白質の量を言い得る。かかる効果は好適なアッセイにおいて(例えば、無細胞系アッセイにおいて、またはターゲット細胞、組織、もしくは対象生物において)検出され得る。当業者によって認められるであろう通り、薬剤(例えば機能的なエフェクター蛋白質)の有効量は、例えば、望まれる生体応答、ターゲット化されるべき特定のアレル、ターゲット化されようとするゲノム、ターゲット部位、細胞、または組織、および用いられようとする超荷電蛋白質のようなさまざまな因子に依存して変わり得る。

0024

用語「エフェクター蛋白質」は、細胞内に導入されたときに、細胞の生物学的機能を調節する蛋白質を言う(例えば、細胞内の核酸分子の改変(例えば、切断、脱アミノ、組み換えなど)、または調節(例えば、増大もしくは減少)細胞内の遺伝子の発現もしくは発現レベル)。

0025

用語「操作された」は、本明細書において用いられる場合、ヒトによって設計、生成、調製、合成、および/または製造された蛋白質分子、複合体、物質、または実体を言う。従って、操作された産物は、天然に存在しない産物である。いくつかの態様において、操作された蛋白質または組成物(例えば、ヌクレアーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)などの機能的なエフェクター蛋白質と結びついた操作された超荷電蛋白質)は、特定の要件に合うかまたは特定の望まれる特徴を有するように(例えば、規定の正味電荷を有するように、興味あるターゲット配列に特異的に結合および/もしくは切断または改変するように、特定の最小限もしくは最大限の切断もしくは酵素活性を有するように、および/または特定の安定性を有するように)設計された超荷電蛋白質である。

0026

用語「エピジェネティック修飾因子」は、本明細書において用いられる場合、DNA(例えば染色体DNA)のエピジェネティックな修飾をもたらす酵素活性を有する蛋白質またはその触媒ドメインを言う。エピジェネティックな修飾はDNAメチル化および脱メチル化ヒストン修飾メチル化および脱メチル化(例えば、モノ、ジ、およびトリメチル化)、ヒストンアセチル化および脱アセチル化、さらにはヒストンユビキチン化リン酸化、およびSUMO化を包含する)を包含するが、これに限定されない。

0027

用語「機能的な蛋白質」は、それが特徴づけられる特性および/または活性を示す形態にある蛋白質を言う。

0028

用語「融合蛋白質」は、ペプチド結合を介して互いに結びつきそれゆえに単一のアミノ酸配列を形成する複数の異種蛋白質、蛋白質ドメイン、またはペプチド(例えば、超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質)を含む、蛋白質を言う。ある種の態様において、融合蛋白質は遺伝子によってコードされる。

0029

用語「遺伝子」は、当分野において理解される通りのその意味を有する。用語「遺伝子」が遺伝子制御配列(例えば、プロモーターエンハンサーなど)および/またはイントロン配列を包含し得るということは当業者によって認められるであろう。遺伝子の定義が、蛋白質をコードせずにむしろ機能性RNA分子(例えば、RNAi薬剤、リボザイムtRNAなど)をコードする核酸への参照を包含するということは、さらに認められるであろう。明確さの目的のために、本願において用いられる場合、用語「遺伝子」は、蛋白質をコードする核酸の部分を一般的に言うということが注意されるべきである。用語は制御配列を任意で包含し得、これは当業者には文脈から明確であろう。この定義は、蛋白質をコードしない発現単位への用語「遺伝子」の適用を除外することではなく、むしろ大部分の場合で、用語は、本文書において用いられる場合、蛋白質をコードする核酸を言うということを明確にすることを意図されている。

0030

用語「単離された」は、(1)(天然においてか実験の設定においてかにかかわらず)当初生成したときにそれが結びついていた構成物の少なくともいくつかから分離された、ならびに/または(2)ヒトによって生成、調製、合成、および/もしくは製造された、分子、複合体、物質、または実体を言う。単離された物質および/または実体は、それらが当初結びついていた他の構成物の少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%以上から分離されており得る。いくつかの態様において、単離された薬剤は約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約99%よりも純粋である。本明細書において用いられる場合、物質は、他の構成物を実質的に含まない場合に「純粋」である。

0031

用語「リンカー」は、本明細書において用いられる場合、2つの分子または部分(例えば超荷電蛋白質およびヌクレアーゼ)を連結する化学基または分子を言う。典型的には、リンカーは、2つの基、分子、または他の部分の間に配置されるかまたはそれらによってフランキング(脇に接続)され、共有結合を介して互いに繋がり、それゆえに2つを繋ぐ。いくつかの態様において、リンカーは一アミノ酸または複数のアミノ酸(例えば、ペプチドまたは蛋白質)を含む。いくつかの態様において、リンカーは有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。いくつかの態様において、リンカーは切断可能なリンカーである。例えば、リンカーは、切断活性(例えば、UV光または加水分解酵素、例えばリソソームプロテアーゼ)に対する暴露によって切断され得る結合を含む。いくつかの態様において、リンカーはアミノ酸のいずれかのストレッチであり、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、または51個以上のアミノ酸を有する。いくつかの態様において、ペプチドリンカートリペプチドGly−Gly−Serのリピート(反復)を含み、例えば配列(GGS)nを含み、nは少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11個以上のリピートを表す。いくつかの態様において、リンカーは配列(GGS)6(配列番号2)を含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは16残基「XTEN」リンカーまたはそのバリアントである(例えば、Schellenberger et al. A recombinant polypeptide extendsthe in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009)参照)。いくつかの態様において、XTENリンカーは配列SGSETPGSESATPES(配列番号3)、SGSETPGTSESA(配列番号4)、またはSGSETPGTSESATPEGGSGGS(配列番号5)を含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、VPFLLEPDNINGKTC(配列番号6)、GSAGSAAGSGEF(配列番号7)、SIVAQLSRPDPA(配列番号8)、MKIIELPSA(配列番号9)、VRHKLKRVGS(配列番号10)、GHGTGSTGSSS(配列番号11)、MSRPDPA(配列番号12)、またはGGSM(配列番号13)から選択される1つまたは2つ以上である。

0032

用語「ヌクレアーゼ」は、本明細書において用いられる場合、核酸分子中ヌクレオチド残基を繋ぐホスホジエステル結合を切断することができる薬剤(例えば蛋白質または低分子)を言う。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは蛋白質(例えば、核酸分子に結合して、核酸分子中のヌクレオチド残基を繋ぐホスホジエステル結合を切断し得る酵素)である。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内でホスホジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼ、またはポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであり得る。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは部位特異的ヌクレアーゼであり、特異的なヌクレオチド配列中の特異的なホスホジエステル結合を結合および/または切断し、これは本明細書において「認識配列」、「ヌクレアーゼターゲット部位」、または「ターゲット部位」ともまた言われる。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは一本鎖ターゲット部位を認識し、一方、他の態様において、ヌクレアーゼは二本鎖ターゲット部位(例えば二本鎖DNAターゲット部位)を認識する。多くの天然に存在するヌクレアーゼ(例えば、多くの天然に存在するDNA制限ヌクレアーゼ)のターゲット部位は当業者に周知である。多くの場合では、DNAヌクレアーゼ(例えばEcoRI、HindIII、またはBamHI)は長さ4〜10塩基対パリンドローム二本鎖DNAターゲット部位を認識し、ターゲット部位内の特異的な位置において2つのDNA鎖のそれぞれを切断する。いくつかのエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸ターゲット部位を対称的に切断し、すなわち、両方の鎖を同じ位置で切断して、その結果、末端は塩基対形成したヌクレオチド(本明細書においては平滑末端ともまた言われる)を含む。他のエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸ターゲット部位を非対称的に切断し、すなわち各鎖を異なる位置で切断して、その結果、末端は非対合ヌクレオチドを含む。二本鎖DNA分子の末端の非対合ヌクレオチドは「オーバーハング」(例えば、非対合ヌクレオチド(単数または複数)がそれぞれのDNA鎖の5’または3’末端を形成するかどうかに依存して「5’オーバーハング」または「3’オーバーハング」)ともまた言われる。非対合ヌクレオチド(単数または複数)で終わる二本鎖DNA分子末端は粘着末端ともまた言われる。なぜなら、それらは、相補的な非対合ヌクレオチド(単数または複数)を含む他の二本鎖DNA分子末端に「粘着」し得るからである。ヌクレアーゼ蛋白質は、「結合ドメイン」(これは、核酸基質との蛋白質の相互作用を媒介する)と「切断ドメイン」(これは、核酸バックボーン中のホスホジエステル結合の切断を触媒する)とを典型的には含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ蛋白質は単量体形態で核酸分子に結合して切断し得、一方、他の態様において、ヌクレアーゼ蛋白質はターゲット核酸分子を切断するために二量体化または多量体化しなければならない。天然に存在するヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメイン、さらには、特異的なターゲット部位に結合するヌクレアーゼを作製するために組み合わせられ得るモジュール的な結合ドメインおよび切断ドメインは、当業者に周知である。例えば、転写活性化因子様エレメントが、望まれるターゲット部位に特異的に結合する結合ドメインとして用いられ、切断ドメイン(例えばFokIの切断ドメイン)に融合またはコンジュゲーションされて、望まれるターゲット部位を切断する操作されたヌクレアーゼを作製し得る。

0033

用語「核酸」および用語「核酸分子」は、本明細書において交換可能に用いられ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを含む化合物を言う。典型的には、ポリマー核酸、例えば3または4ヌクレオチド以上を含む核酸分子はリニアな分子であり、隣接したヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いに連結される。いくつかの態様において、「核酸」は個体の核酸残基(例えば、ヌクレオチドおよび/またはヌクレオシド)を言う。いくつかの態様において、「核酸」は、3つまたは4つ以上の個体のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を言う。本明細書において用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー(例えば、少なくとも3ヌクレオチドのストリング)を言うために交換可能に用いられ得る。いくつかの態様において、「核酸」は、RNA、さらには一および/または二本鎖DNAを包含する。核酸は、例えばゲノム、転写物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、プラスミド、コスミド、染色体、クロマチド、または他の天然に存在する核酸分子の文脈において、天然に存在し得る。他方で、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば組み換えDNAもしくはRNA、人工染色体、操作されたゲノムもしくはその断片、または合成DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドであり得、または天然に存在しないヌクレオチドもしくはヌクレオシドを包含しており得る。さらに、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」、および/または類似の用語は、核酸アナログ、すなわちホスホジエステルバックボーン以外を有するアナログを包含する。核酸は天然ソースから精製され得、組み換え発現システムを用いて生成されて任意で精製され得、化学合成などされ得る。適切なところでは、例えば化学合成された分子の場合では、核酸はヌクレオシドアナログ(例えば、化学的に改変された塩基または糖を有するアナログ)およびバックボーン改変を含み得る。核酸配列は、別様に示さない限り5’から3’方向に提出される。いくつかの態様において、核酸は、天然ヌクレオシド(例えば、アデノシンチミジングアノシン、シチジン、ウリジンデオキシアデノシンデオキシチミジンデオキシグアノシン、およびデオキシシチジン)、ヌクレオシドアナログ(例えば、2−アミノアデノシン、2−チオチミジン、イノシンピロロピリミジン、3−メチルアデノシン、5−メチルシチジン、2−アミノアデノシン、C5−ブロモウリジン、C5−フルオロウリジン、C5−ヨードウリジン、C5−プロピニル−ウリジン、C5−プロピニル−シチジン、C5−メチルシチジン、2−アミノアデノシン、7−デアザアデノシン、7−デアザグアノシン、8−オキソアデノシン、8−オキソグアノシン、O(6)−メチルグアニン、および2−チオシチジン)、化学的に改変された塩基、生物学的に改変された塩基(例えば、メチル化された塩基)、インターカレーション塩基、改変された糖(例えば、2’−フルオロリボース、リボース、2’−デオキシリボースアラビノース、およびヘキソース)、および/または改変されたリン酸基(例えば、ホスホロチオエートおよび5’−N−ホスホロアミダイト結合)であるか、またはそれを含む。

0034

用語「医薬組成物」は、本明細書において用いられる場合、例えば疾患または障害の処置の文脈において対象に投与され得る組成物を言う。いくつかの態様において、医薬組成物は、有効成分(例えば、ヌクレアーゼなどの機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質、または、例えば融合蛋白質の形態で超荷電蛋白質と機能的なエフェクター蛋白質とをコードする核酸)と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。

0035

用語「生理pH」は、本明細書において用いられる場合、正常な非病的な(non-pathologic)細胞または対象に見いだされるpH値を言う。いくつかの態様において、生理pHはpH5〜8である。いくつかの態様において、生理pHはpH7〜7.5、例えばpH7.0、pH7.1、pH7.2、pH7.3、pH7.4、またはpH7.5である。いくつかの態様において、生理pHはpH6.5〜7.5である。いくつかの態様において、生理pHはpH5、pH5.5、pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、またはpH8である。

0036

用語「予防」または「予防する」は、対象が疾患、障害、もしくは状態を発症する確率の減少を(予防無しの確率と比較して)もたらす、疾患、障害、もしくは状態を発症するリスクがある(例えば、コントロールの対象もしくは対象のコントロール群と比較して高まったリスクがあるか、または年齢マッチングおよび/もしくは性別をマッチングした対象の平均リスクと比較して高まったリスクがある)対象の予防処置、および/または既に確定した障害のさらなる進展阻害を言う。

0037

用語「増殖性疾患」は、本明細書において用いられる場合、細胞または細胞集団が異常に高まった増殖比率を示すという点で、細胞または組織のホメオスタシスが乱されているいずれかの疾患を言う。増殖性疾患は、前新生物性の過形成状態および新生物疾患などの増殖亢進性疾患を包含する。新生物疾患は細胞の異常な増殖によって特徴づけられ、良性および悪性新生物を両方とも包含する。悪性新生物は癌ともまた言われる。

0038

用語「蛋白質」は本明細書において「ペプチド」および「ポリペプチド」と交換可能に用いられ、ペプチド(アミド)結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを言う。用語は、いずれかのサイズ、構造、または機能の蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドを言う。典型的には、蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは少なくとも3アミノ酸長であろう。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、個体の蛋白質または蛋白質の集まりを言い得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の1つまたは2つ以上は、例えば化学的実体(例えば、コンジュゲーション、官能化、または他の改変のための炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカーなど)の追加によって改変され得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは単一の分子でもまたあり得るか、または多分子複合体であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する蛋白質またはペプチドの単に断片であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する、組み換え、もしくは合成、またはそのいずれかの組み合わせであり得る。蛋白質は異なるドメインを含み得、例えば、TALEエフェクター蛋白質は核酸結合ドメインエフェクタードメイン(例えば、核酸切断ドメインまたは転写活性化因子もしくは抑制因子ドメイン)とを含み得る。いくつかの態様において、蛋白質は蛋白質性部分(例えば、核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列)と有機化合物(例えば、核酸切断薬剤として作用し得る化合物)とを含む。

0039

用語「RNAによってプログラミング可能なヌクレアーゼ」および「RNAによってガイドされるヌクレアーゼ」は本明細書において交換可能に用いられ、切断のターゲットではない1つまたは2つ以上のRNA分子と複合体を形成する(例えば、結合するかまたは結びつく)ヌクレアーゼを言う。いくつかの態様において、RNAによってプログラミング可能なヌクレアーゼは、RNAとの複合体であるときに、ヌクレアーゼ:RNA複合体と言われ得る。RNAによってプログラミング可能なヌクレアーゼはCas9を包含する。典型的には、結合したRNA(単数または複数)はガイドRNA(gRNA)と言われる。gRNAは、2つもしくは3つ以上のRNAの複合体としてまたは単一のRNA分子として存在し得る。単一のRNA分子として存在するgRNAはシングルガイドRNA(sgRNA)と言われ得るが、「gRNA」は、単一の分子としてまたは2つもしくは3つ以上の分子の複合体としていずれかで存在するガイドRNAを言うために交換可能に用いられる。典型的には、単一のRNA種として存在するgRNAは、2つのドメイン(1)ターゲット核酸に対する相同性共有する(例えば、そしてターゲットへのCas9複合体の結合を導く)ドメインと(2)Cas9蛋白質に結合するドメインとを含む。gRNAはターゲット部位を相補するヌクレオチド配列を含み、これが、そのターゲット部位へのヌクレアーゼ/RNA複合体の結合を媒介し、ヌクレアーゼ:RNA複合体の配列特異性を提供する。

0040

用語「リコンビナーゼ」は、本明細書において用いられる場合、リコンビナーゼ認識配列間におけるDNAの組み換えを媒介する部位特異的酵素を言い、これはリコンビナーゼ認識配列間におけるDNA断片切り出し、インテグレーション逆位、または交換(例えば転座)をもたらす。リコンビナーゼは、2つの別個ファミリーセリンリコンビナーゼ(例えば、リゾベースおよびインベルターゼ)およびチロシンリコンビナーゼ(例えばインテグラーゼ)に分類され得る。セリンリコンビナーゼの例は、限定無しに、Hin、Gin、Tn3、β−six、CinH、ParA、γδ、Bxb1、φC31、TP901、TG1、φBT1、R4、φRV1、φFC1、MR11、A118、U153、およびgp29を包含する。チロシンリコンビナーゼの例は、限定無しに、Cre、FLP、R、ラムダ、HK101、HK022、およびpSAM2を包含する。セリンおよびチロシンリコンビナーゼの名前は、リコンビナーゼがDNAを攻撃するために用い、鎖交換中にDNAに共有結合的に連結される保存された求核性アミ酸残基から来ている。リコンビナーゼは数々の応用を有し、遺伝子ノックアウトノックインの作製および遺伝子治療応用を包含する。例えば、Brown et al.,「Serine ricombinases as tools for genome engineering.」Methods. 2011;53(4):372-9、Hirano et al.,「Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration.」Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92(2):227-39、Chavez and Calos,「Therapeutic applications of the φC31 integrase system.」Curr. Gene Ther. 2011;11(5):375-81、Turan and Bode,「Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications.」FASEB J. 2011; 25(12):4088-107、Venken and Bellen,「Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and φC31 integrase.」Methods Mol. Biol. 2012; 859:203-28、Murphy,「Phage recombinases and their applications.」Adv. Virus Res. 2012; 83:367-414、Zhang et al.,「Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era.」J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2012; 13(7):511-24、Karpenshif and Bernstein,「From yeast to mammals: recent advances in genetic control of homologous recombination.」DNA Repair (Amst). 2012; 1;11(10):781-8参照。それぞれの全内容はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる。本明細書において提供されるリコンビナーゼは、本発明の態様に用いられ得るリコンビナーゼの排他的な例であることを意味されてはいない。本発明の方法および組成物は、新たな直交系リコンビナーゼについてデータベースマイニングすることまたは定義されたDNA特異性を有する合成リコンビナーゼを設計することによって拡充され得る(例えば、Groth et al.,「Phage integrases: biology and applications.」J. Mol. Biol. 2004; 335, 667-678、Gordley et al.,「Synthesis of programmable integrases.」Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009; 106, 5053-5058参照。それぞれの全内容はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる)。本明細書に記載される方法および組成物に有用であるリコンビナーゼの他の例は当業者に公知であり、発見または生成されるいずれかの新たなリコンビナーゼは、本発明の異なる態様に用いられる能力があると予想される。いくつかの態様において、リコンビナーゼ(またはその触媒ドメイン)はCas9蛋白質(例えば、dCas9)に融合する。

0041

用語「組み換える」または「組み換え」は、核酸改変(例えばゲノム改変)の文脈で、2つもしくは3つ以上の核酸分子または単一核酸分子の2つもしくは3つ以上の領域がリコンビナーゼ蛋白質の作用によって改変されるプロセスを言うために用いられる。組み換えは、ことに、例えば1つまたは2つ以上の核酸分子内または間における核酸配列の挿入、逆位、切り出し、または転座をもたらし得る。

0042

用語「対象」は、本明細書において用いられる場合、個体生物を言う。いくつかの態様において、対象はいずれかの性または成長のいずれかの段階のヒトである。いくつかの態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象はげ歯類である。いくつかの態様において、対象は実験動物、例えばマウスラットアレチネズミモルモットカエル、またはハエである。いくつかの態様において、対象は家畜、例えばヒツジヤギブタ、またはウシである。いくつかの態様において、対象はコンパニオンアニマル、例えばネコまたはイヌである。いくつかの態様において、対象は脊椎動物両生類爬虫類魚類昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの態様において、対象は遺伝子操作されており、例えば、遺伝子操作された非ヒト対象である。

0043

用語「超荷電させる(supercharge)」は、蛋白質の正味の総電荷の増大または減少をもたらす蛋白質のいずれかの改変を言う。改変は、アミノ酸配列の変化または荷電部分(例えば、カルボン酸基、リン酸基、硫酸基、アミノ基)の追加を包含するが、これに限定されない。超荷電(supercharging)は、薬剤単独とは相対的に増大または減少した電荷を有する複合体を形成することになる、天然に存在するかまたは改変された荷電蛋白質との薬剤の結びつきをもまた言う。

0044

用語「ターゲット部位」は、核酸分子に結合する機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼおよび転写活性化因子または抑制因子)の文脈で本明細書において用いられる場合、エフェクター蛋白質によって結合されて作用される(例えば、ヌクレアーゼによって切断されるか、または転写活性化因子もしくは抑制因子によってそれぞれ転写活性化もしくは抑制される)核酸分子中の配列を言う。ターゲット部位は一本鎖または二本鎖であり得る。RNAによってガイドされる(例えば、RNAによってプログラミング可能な)ヌクレアーゼ(例えばCas9)の文脈では、ターゲット部位は、RNAによってプログラム可能なヌクレアーゼのgRNAに相補的であるヌクレオチド配列と、gRNA相補配列に隣接した3’末端にあるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)とを典型的には含む。RNAによってガイドされるヌクレアーゼCas9(または、gRNA結合活性を有することを含むバリアントもしくは融合体)について、ターゲット部位は、いくつかの態様において、20塩基対+3塩基対PAM(例えばNNN。Nはいずれかのヌクレオチドを表す)であり得る。典型的には、PAMの最初のヌクレオチドはいずれかのヌクレオチドであり得、一方、2つの下流ヌクレオチドは、特定のRNAによってガイドされるヌクレアーゼに依存して規定される。Cas9などのRNAによってガイドされるヌクレアーゼの例示的なターゲット部位は当業者に公知であり、限定無しにNNG、NGN、NAG、およびNGGを包含し、Nはいずれかのヌクレオチドを表す。加えて、異なる種(例えば、S.pyogenesの代わりにS.thermophilus)からのCas9ヌクレアーゼは、配列NGGNGを含むPAMを認識する。追加のPAM配列が公知であり、NNAGAAWおよびNAARを包含するが、これに限定されない(例えば、Esvelt and Wang, Molecular Systems Biology, 9:641 (2013)参照。その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる)。例えば、例えばCas9などのRNAによってガイドされるヌクレアーゼのターゲット部位は構造[NZ]−[PAM]を含み得、各Nは独立していずれかのヌクレオチドであり、Zは1〜50の整数である。いくつかの態様において、Zは少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、または少なくとも50である。いくつかの態様において、Zは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50である。いくつかの態様において、Zは20である。いくつかの態様において、「ターゲット部位」は、ヌクレアーゼによって結合されるが切断はされない核酸分子中の配列をもまた言い得る。例えば、本明細書に記載されるある種の態様は、不活性な(または不活性型の)Cas9のDNA切断ドメインを含む蛋白質を提供する。かかる蛋白質は(例えば、Cas9のRNA結合ドメインをもまた包含するときに)、gRNAによって規定されるターゲット部位に結合する能力がある。しかしながら、DNA切断部位が不活性化されているので、ターゲット部位はこの蛋白質によって切断されない。しかしながら、本明細書に記載されるかかる蛋白質は、典型的には、核酸分子の改変を媒介する別の蛋白質(例えばヌクレアーゼ、転写活性化因子、リコンビナーゼ、デアミナーゼなど)または分子にコンジュゲーション、融合、または結合される。いくつかの態様において、実際に切断される配列は、核酸分子の切断を媒介する蛋白質(例えばヌクレアーゼ)または分子に依存するであろう。いくつかの場合では、例えば、不活性型Cas9蛋白質(単数または複数)が結合している近位または距離に関係するであろう。二量体化するヌクレアーゼ(例えば、不活性なCas9(またはCas9のRNA結合ドメイン)とDNA切断ドメイン(例えば、FokI切断ドメインまたは活性なCas9切断ドメイン)とを含む蛋白質の二量体)の文脈では、ターゲット部位は、左ハーフ部位(1つの蛋白質によって結合される)、右ハーフ部位(第2の蛋白質によって結合される)、およびハーフ部位間のスペーサー配列(ここで切断がなされる)を典型的には含む。いくつかの態様においては、左ハーフ部位または右ハーフ部位いずれか(かつスペーサー配列では無い)が切断される。この構造([左ハーフ部位]−[スペーサー配列]−[右ハーフ部位])は、本明細書においてLSR構造と言われる。いくつかの態様において、左ハーフ部位および/または右ハーフ部位はRNAによってガイドされるターゲット部位(例えばCas9ターゲット部位)に対応する。いくつかの態様において、いずれかまたは両方のハーフ部位は、例えばCas9によってターゲット化される典型的な領域よりも短いかまたは長く、例えば20ヌクレオチドよりも短いかまたは長い。いくつかの態様において、左および右ハーフ部位は異なる核酸配列を含む。いくつかの態様において、ターゲット部位は、3つの(3)RNAによってガイドされるヌクレアーゼのターゲット部位配列(例えばCas9ターゲット部位配列に対応する3つの配列)を含む配列であり、第1および第2ならびに第2および第3のCas9ターゲット部位配列がスペーサー配列によって離間される。いくつかの態様において、スペーサー配列は少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、または少なくとも250bp長である。

0045

用語「転写活性化因子」および「転写抑制因子」は、それぞれ、ターゲット核酸配列に結合して、ターゲット核酸配列と結びついた遺伝子産物の発現のレベルの増大または減少を引き起こす蛋白質(例えば、転写因子またはその断片)などの薬剤を言う。例えば、ターゲット核酸配列が遺伝子の制御領域内に位置する場合に、転写活性化因子は、遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現のレベルの増大を引き起こす(反対に、転写抑制因子は、遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現のレベルの減少を引き起こす)。遺伝子産物は、遺伝子から転写されたRNA(例えばmRNA)、または遺伝子から転写されたmRNAから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的には、mRNAのレベルの増大または減少は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの減少、増大をもたらす。発現のレベルは、mRNAまたは蛋白質を測定するための標準的な技術を用いて決定され得る。

0046

用語「転写活性化因子様エフェクター」(TALE)は、本明細書において用いられる場合、高度に可変の2アミノ酸モチーフ(リピート可変二残基、RVD)を含む高度に保存された33〜34アミノ酸配列を含有するDNA結合ドメインを含むエフェクター蛋白質を言う。RVDモチーフは核酸配列に対する結合特異性を決定し、当業者に周知の方法に従って操作されて、望まれるDNA配列に特異的に結合し得る(例えば、Miller, Jeffrey; et.al. (February 2011). 「A TALE nuclease architecture for efficient genome editing」. Nature Biotechnology 29 (2): 143-8、Zhang, Feng; et.al. (February 2011).「Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription」. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53、Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed.「Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity」.PLoS ONE 6 (5): e19509、Boch, Jens (February 2011).「TALEs of genome targeting」. Nature Biotechnology 29 (2): 135-6、Boch, Jens; et.al. (December 2009). 「Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors」. Science 326 (5959): 1509-12、およびMoscou, Matthew J.; Adam J. Bogdanove (December 2009). 「A SimpleCipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors」. Science 326 (5959): 1501参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる)。アミノ酸配列とDNA認識との間の単純な関係性は、適切なRVDを含有するリピートセグメントの組み合わせを選択することによって、特異的なDNA結合ドメインの操作を可能とした。TALEエフェクター蛋白質は、限定無しに、TALEヌクレアーゼ(TALEN)ならびにTALE転写活性化因子および抑制因子を包含する。

0047

用語「転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ」(TALEN)は、本明細書において用いられる場合、DNA切断ドメイン(例えばFokIドメイン)に転写活性化因子様エフェクターDNA結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼを言う。操作されたTALE構築物を生成するためのいくつものモジュール的なアセンブリスキーム報告されている(Zhang, Feng; et.al. (February 2011).「Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription」. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53、Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed.「Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity」.PLoS ONE 6 (5): e19509、Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C; Bailer, J. A.; Somia, N. V. et al. (2011).「Efficient design and assembly of custom TALEN andotherTAL effector-based constructs for DNA targeting」. Nucleic AcidsResearch、Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011).「Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning」. Nucleic Acids Research、Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (2011).「Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes」. Nucleic Acids Research.、Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed, ed. 「Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning」. PLoS ONE 6 (5): el9722。そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる)。

0048

用語「転写抑制因子」は、核酸配列に結合して、ターゲット核酸配列と結びついた遺伝子産物の発現のレベルの低減を引き起こす転写因子(例えば蛋白質)を言う。例えば、ターゲット核酸配列が遺伝子の制御領域内に位置する場合に、転写抑制因子は、遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現のレベルの低減を引き起こす。遺伝子産物は、遺伝子から転写されたRNA(例えばmRNA)、または遺伝子から転写されたmRNAから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的には、mRNAのレベルの低減は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、mRNAまたは蛋白質を測定するための標準的な技術を用いて決定され得る。

0049

用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、本明細書において用いられる場合、ジンクフィンガーアレイを含む結合ドメインにコンジュゲーションされた核酸切断ドメインを含むヌクレアーゼを示す。いくつかの態様において、切断ドメインはII型制限エンドヌクレアーゼFokIの切断ドメインである。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、切断のために所与の核酸分子中のほとんどいずれかの望まれる配列をターゲット化するように設計され得、複雑なゲノムの文脈でユニークな部位に結合するようにジンクフィンガー結合ドメインを設計する可能性は、生細胞内の単一のゲノム部位のターゲット化された切断を可能とし、例えば、治療上の価値があるターゲット化されたゲノム変化を達成する。望まれるゲノム遺伝子座への二本鎖切断をターゲット化することは、非相同DNA修復経路誤りがち性質が原因で、遺伝子のコード配列中にフレームシフト変異を導入するために用いられ得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、当業者に周知の方法によって興味ある部位をターゲット化するように生成され得る。例えば、望まれる特異性を有するジンクフィンガー結合ドメインは、既知の特異性の個体のジンクフィンガーモチーフを組み合わせることによって設計され得る。DNAに結合したジンクフィンガー蛋白質Zif268の構造は、この分野における研究のかなりに情報を与えた。64個の可能な塩基対トリプレットのそれぞれについてジンクフィンガーを得て、それからそれらのモジュール的なジンクフィンガーを混合およびマッチングし、いずれかの望まれる配列特異性を有する蛋白質を設計するというコンセプトが記載されている(Pavletich NP, Pabo CO (May 1991).「Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A」. Science 252 (5007): 809-17。その全内容は本明細書に組み込まれる)。いくつかの態様において、それぞれ3塩基対DNA配列を認識する別々のジンクフィンガーが組み合わされて、長さ9塩基対〜18塩基対に渡るターゲット部位を認識する3、4、5、または6フィンガーアレイを生成する。いくつかの態様において、より長いアレイが考えられる。他の態様において、6〜8ヌクレオチドを認識する2フィンガーモジュールが組み合わされて、4、6、または8ジンクフィンガーアレイを生成する。いくつかの態様において、細菌またはファージディスプレイが使用されて、望まれる核酸配列(例えば長さ3〜30bpの望まれるヌクレアーゼターゲット部位)を認識するジンクフィンガードメインを開発する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、いくつかの態様において、リンカー(例えばポリペプチドリンカー)を介して互いに融合または別様にコンジュゲーションされたジンクフィンガー結合ドメインと切断ドメインとを含む。リンカーの長さは、ジンクフィンガードメインによって結合される核酸配列からの切断の距離を決定する。より短いリンカーが用いられる場合、切断ドメインは、結合される核酸配列により近接した核酸を切断するであろう。一方、より長いリンカーは、切断および結合される核酸配列間のより大きい距離をもたらすであろう。いくつかの態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、結合した核酸を切断するために二量体化しなければならない。いくつかのかかる態様において、二量体は2つの単量体のへテロ二量体であり、そのそれぞれは異なるジンクフィンガー結合ドメインを含む。例えば、いくつかの態様において、二量体は、FokI切断ドメインにコンジュゲーションされたジンクフィンガードメインAを含む1つの単量体とFokI切断ドメインにコンジュゲーションされたジンクフィンガードメインBを含む1つの単量体とを含み得る。この限定しない例において、ジンクフィンガードメインAはターゲット部位の1つの側の核酸配列に結合し、ジンクフィンガードメインBはターゲット部位のもう一方の側の核酸配列に結合し、二量体化FokIドメインは核酸をジンクフィンガードメイン結合部位間において切断する。

0050

用語「ジンクフィンガー」は、本明細書において用いられる場合、小さい核酸結合蛋白質構造モチーフを言い、フォールドとフォールドを安定化する1つまたは2つ以上の亜鉛イオン配位とによって特徴づけられる。ジンクフィンガーは、さまざまな異なる蛋白質構造を包含する(例えば、Klug A, Rhodes D (1987).「Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition」. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52: 473-82参照。その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる)。ジンクフィンガーは、ヌクレオチドの特異的な配列に結合するように設計され得、一連のジンクフィンガーの融合体を含むジンクフィンガーアレイが、ほとんどいずれかの望まれるターゲット配列に結合するように設計され得る。かかるジンクフィンガーアレイは、蛋白質の(例えば、核酸切断ドメインにコンジュゲーションされた場合には、例えばヌクレアーゼの)結合ドメインを形成し得る。ジンクフィンガーモチーフの異なる型が当業者に公知であり、Cys2His2、Gagナックル、Treble−clef、Zincリボン、Zn2/Cys6、およびTAZ2ドメイン様モチーフを包含するが、これに限定されない(例えば、KrishnaSS, Majumdar I, Grishin NV (January 2003).「Structural classification of zinc fingers: survey and summary」. Nucleic AcidsRes. 31 (2): 532-50参照)。典型的には、単一のジンクフィンガーモチーフは核酸分子の3または4ヌクレオチドに結合する。従って、2つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは6〜8ヌクレオチドに結合し得、3つのジンクフィンガーモチーフ含むジンクフィンガードメインは9〜12ヌクレオチドに結合し得、4つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは12〜16ヌクレオチドに結合し得る、などである。いずれかの好適な蛋白質操作技術が使用されて、長さ3〜30ヌクレオチドのほとんどいずれかの望まれるターゲット配列に結合するように、ジンクフィンガーのDNA結合特異性を変化および/または新規のジンクフィンガー融合体を設計し得る(例えば、Pabo CO, Peisach E, Grant RA (2001).「Design and selection of novel cys2His2 Zinc finger proteins」. Annual Review of Biochemistry 70: 313-340、Jamieson AC, Miller JC, Pabo CO (2003).「Drug discovery with engineered zinc-finger proteins」. Nature Reviews Drug Discovery 2 (5): 361-368、およびLiu Q, Segal DJ, GhiaraJB, Barbas CF (May 1997).「Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes」. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (11)参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる)。操作されたジンクフィンガーアレイと核酸を切断する蛋白質ドメインとの間の融合は、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」を生成するために用いられ得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核酸分子中の特異的なターゲット部位に結合するジンクフィンガードメインと、結合ドメインによって結合されたターゲット部位内またはその近位で核酸分子を切断する核酸切断ドメインとを典型的には含む。典型的な操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼは、3〜6つの個体のジンクフィンガーモチーフを有しかつ長さ9塩基対〜18塩基対に渡るターゲット部位に結合する結合ドメインを含む。より長いターゲット部位は、所与のゲノム中のユニークであるターゲット部位に結合して切断することが望まれる状況において特に魅力的である。

0051

用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは障害またはその1つもしくは2つ以上の症状を逆転する、緩和する、その始まりを遅延させる、またはその進行を阻害することを狙った臨床的措置を言う。本明細書において用いられる場合、用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは障害またはその1つもしくは2つ以上の症状を逆転する、緩和する、その始まりを遅延させる、またはその進行を阻害することを狙った臨床的な措置を言う。いくつかの態様において、処置は、1つまたは2つ以上の症状が発症した後および/または疾患が診断された後に投与され得る。他の態様において、処置は、例えば症状を予防するもしくはその始まりを遅延させるまたは疾患の始まりもしくは進行を阻害するために、症状の非存在下で投与され得る。例えば、処置は、症状の始まりに先立って(例えば、症状の既往に照らしておよび/または遺伝学的もしくは他の患いやすい因子に照らして)患いやすい個体に投与され得る。処置は、例えばそれらの再発を予防するかまたは遅延させるために、症状が消散した後にもまた継続され得る。

図面の簡単な説明

0052

哺乳類細胞内への高分子送達の模式図。
脂肪細胞細胞運命をプログラミングする:白色脂肪組織(WAT)から褐色脂肪組織(BAT)への切り換え
PPARγまたはPRDM16をターゲット化するようにプログラミングされたTALE活性化因子を送達するするために、超荷電送プラットフォームを用いる。
+36GFP融合体、18.5merのTALEドメイン、およびVP64活性化ドメインを含む融合蛋白質の模式図。
+36GFP−TALE活性化因子−融合蛋白質の発現および精製。

0053

+36GFP−PPARγおよびPRDM16−TALE活性化因子融合蛋白質の送達による脂肪細胞制御因子遺伝子の活性化についての試験
異なる濃度での+36GFP−TALE活性化因子融合蛋白質の送達有効性。
NIH3T3細胞における2つの異なる+36GFP−PRDM16−TALE融合蛋白質の送達有効性の比較。
PPARγ−TALE活性化因子融合体の送達後のPPARγ遺伝子発現と、様々なコントロールに対する比較。

0054

RDM16−TALE活性化因子融合体の送達後のPRDM16遺伝子発現と、様々なコントロールに対する比較。
中程度のTALE活性が血清の存在下で観察される。
脂肪生成カクテルによる7日間の処置が続く、PPARγのウイルス送達の検証。
線維芽細胞をWATおよびBATにプログラミングするためのアッセイの模式図。
+36GFP−TALE活性化因子融合蛋白質による処置によって観察された脂肪細胞形成
LipidTOX redによる7日後の様々な処置の染色が、ウイルス送達後、さらには超荷電PPARγ−TALE活性化因子融合蛋白質の送達後の脂肪細胞の形成を示している。

0055

LipidTOX redによる7日後の様々な処置の染色が、ウイルス送達後、さらには超荷電PPARγ−TALE活性化因子融合蛋白質の送達後の脂肪細胞の形成を示している。
ウイルス送達後、さらには超荷電PPARγ−TALE活性化因子融合蛋白質の送達後のWATバイオマーカー遺伝子の発現。
インビボで褐色脂肪の脂肪細胞を誘導するための超荷電PRDM16−TALE活性化因子融合蛋白質の送達。堅牢な脂肪細胞形成が、PPARγおよびPRDM16のウイルス送達後に、かつ超荷電TALE活性化因子蛋白質融合体の送達後にもまた観察された。
PPARγおよびPRDM16の発現による褐色脂肪マーカーのTALE/TALE、ウイルス/TALE、およびウイルス/ウイルスによって誘導される発現の比較。

0056

RT−qPCR評価は、LipidTOX染色によって観察された脂肪細胞分化と一致している。
+36GFPとの複合体としての機能的なTALE活性化因子融合蛋白質の送達は、送達後のTALE活性化因子活性を改善する。
+36GFPとの融合体(+36GFP−PRDM16−TALE−3)または複合体(+36GFP+PRDM16−TALE−3)いずれかとしてのTALE活性化因子融合体送達後の、PRDM16遺伝子発現。複合体の送達はTALE活性化因子活性を増大させる傾向がある。

0057

(+36GFPとの融合体または複合体いずれかとしての)TALE活性化因子融合体送達後のPRDM16遺伝子発現に、+36GFPへのAureinペプチド融合が及ぼす効果。
LipofectamineLTXによる融合体(+36GFP−PRDM16−TALE−3)または複合体(+36GFP+PRDM16−TALE−3)いずれかとしてのTALE活性化因子融合体送達後の、PRDM16遺伝子発現。
哺乳類細胞内へのCas9との超荷電融合蛋白質または複合体の送達。(GGS)9−T−ALAL−PKKKRKVは配列番号251に対応する。
野生型Cas9蛋白質ならびに+36GFPおよびAurein−GGS9とのCas9融合蛋白質の精製。

0058

ポリアニオン性高分子との融合または非共有結合的な複合体化、およびカチオン性脂質による封入によって哺乳類細胞内に蛋白質を送達するための戦略が示されている。図27(A)は、リコンビナーゼ、転写活性化因子様エフェクター(TALE)蛋白質、およびCas9エンドヌクレアーゼが核酸に結合し、自然にカチオン性であり(正味の理論上の電荷が黒色で示されている)、カチオン性脂質によって効率的には封入されないということを示している。しかしながら、それらの蛋白質は、(−30)GFPなどの超負荷電蛋白質への融合によって、またはポリアニオン性核酸との複合体化によって高度にアニオン性にされ得る。図27(B)は、DNAおよびRNAをトランスフェクションするために普通に用いられるカチオン性脂質が、もたらされる高度にアニオン性の蛋白質または蛋白質:核酸複合体を封入して、哺乳類細胞内へのそれらの送達を媒介するということを表す模式図を示す。

0059

培養ヒト細胞へのCreリコンビナーゼの送達。図28(A)において、Creリコンビナーゼへの高度にカチオン性の(+36)GFPまたは高度にアニオン性の(−30)GFPいずれかの融合が示されている。Creによって媒介される組み換え時にDsRedを発現するHeLaレポーター細胞株が、Cre送達効率を評価するために用いられた。(GGS)9は配列番号252に対応し、His6は配列番号253に対応する。図28(B)において、HeLa−dsRed細胞は10nMの(−30)GFP−Creおよびカチオン性脂質RNAiMAXによって処置された。細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)を含有する培地中での48時間のインキュベーション後に可視化された。図28(C)は、10%FBS培地または無血清培地における(+36)GFP−Cre、および完全血清培地におけるカチオン性脂質RNAiMAX有りまたは無しでの(−30)GFP−Creの送達を示している。図28(D)は、10%FBSを含有する275μLの培地中での48時間後の機能的な(−30)GFP−Cre送達有効性に及ぼすカチオン性脂質用量の効果を提出している。図28(E)は、(−30)dGFP−Creの機能的な送達有効性についての数個の市販のカチオン性脂質およびポリマーの比較である。図28(F)は、Creに融合された複数のアニオン性ペプチドまたは蛋白質配列の、RNAiMAXによって媒介される送達を示している。エラーバーは、異なる日に実施された3つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。

0060

培養ヒト細胞内へのTALE転写活性化因子の送達。図29(A)は、VP64活性化ドメインにC末端融合されかつ(−30)GFPおよびNLSにN末端融合された18.5リピートTALE活性化因子の設計を示す。(GGS)9は配列番号251に対応し、His6は配列番号252に対応する。融合体の正味の理論上の総電荷は−43である。図29(B)は、NTF3遺伝子内の部位をターゲット化するTALE−VP64活性化因子をコードするプラスミドの従来型のトランスフェクションによる、または、対応するNTF3をターゲット化する(−30)GFP−TALE−VP64蛋白質のRNAiMAXカチオン性脂質によって媒介される送達による、NTF3転写の活性化を実証している。遺伝子発現レベルはqRT−PCRによって測定され、GAPDH発現レベルに対して正規化された。エラーバーは、異なる日に実施された3つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。

0061

培養ヒト細胞へのCas9:sgRNA、Cas9D10Aニッカーゼ、およびdCas9−VP64転写活性化因子の送達。図30(A)は、U2OSのEGFPレポーター細胞への、EGFPをターゲット化するsgRNAまたはVEGFをターゲット化するsgRNAと複合体化したCas9蛋白質バリアントのカチオン性脂質によって媒介される送達を実証している。結果が、Cas9およびsgRNA発現プラスミドの標準的なトランスフェクションのものと比較されている。図30(B)は、EGFPの改変を測定するためのT7エンドヌクレアーゼI(T7EI)アッセイの結果を示している。処置無し(レーン1)、EGFPをターゲット化するsgRNA単独による処置(レーン2)、Cas9蛋白質単独(レーン3)、Cas9蛋白質+VEGFをターゲット化するsgRNA+RNAiMAX(レーン4)、Cas9およびEGFPをターゲット化するsgRNAを発現するプラスミドのトランスフェクション(レーン5)、またはCas9蛋白質+EGFPをターゲット化するsgRNA+RNAiMAX(レーン6)から。密度測定によって計算されたインデル効率がゲル画像の下に示されている。図30(C)は、4つのsgRNAおよびRNAiMAXと複合体化したCas9の単一の送達による、EGFPおよび3つの内在性遺伝子におけるゲノム改変のT7EIアッセイの結果を提出している。密度測定によって計算されたインデル効率がゲル画像の下に示されている。図30(D)は、プラスミドトランスフェクションまたはRNAiMAXによって媒介される蛋白質:RNA複合体送達いずれかによる、sgRNAの対およびCas9D10Aニッカーゼの送達を示している。EGFPを破壊するsgRNAのGFPg1+GFPg5またはGFPg3+GFPg7は遺伝子破壊をもたらすと予想され、一方、GFPg5+GFPg7は同じ鎖をターゲット化し、そのため非機能的であると予想される。図30(E)は、プラスミドトランスフェクションまたはRNAiMAXによって媒介される蛋白質送達いずれかによる、NTF3をターゲット化する触媒不能(dCas9)−VP64転写活性化因子の送達を示す。VEGFg3およびVEGFg5のsgRNA両方の送達は、NTF3遺伝子活性化に負のコントロールとして働いた。エラーバーは、異なる日に実施された6つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。

0062

プラスミドトランスフェクションまたはカチオン性脂質によって媒介される蛋白質:sgRNA送達による、培養ヒト細胞におけるCas9によって媒介される内在性遺伝子切断のDNA配列特異性が示されている。図31(A)において、T7EIアッセイは、内在性CLTA、EMX、およびVEGF遺伝子のオンターゲット改変について実施された。図31(B〜D)において、Cas9:sgRNAからもたらされるオンターゲット:オフターゲットDNA改変比が、プラスミドトランスフェクションまたはカチオン性脂質によって媒介される蛋白質:sgRNA送達について示されている。各処置の条件は、約10%のオンターゲット切断をもたらすように調整され、オンターゲット遺伝子改変効率が同程度である条件での2つの送達法間のDNA切断特異性の比較を可能にした。P値は表2に列挙されている。各オンおよびオフターゲットサンプルは一度シーケンシングされ、>10,000個の配列がオンターゲットサンプルあたり分析され、平均>111,000個の配列がオフターゲットサンプルあたり分析された(表2)。

0063

マウス内耳有毛細胞へのCreリコンビナーゼおよびCas9:sgRNA複合体のインビボ送達が示されている。図32(A)において、P0のfloxP−tdTomatoマウス(n=4)の中央階蝸牛管)が、50%RNAiMAX中の23μMの(−30)GFP−Creの0.3μLをまたはRNAiMAX単独(コントロール)を注射された。5日後に、Creによって媒介される組み換えを示すtdTomato発現が、免疫組織学を用いて可視化された。赤色=tdTomato、緑色=Myo7a、白色=Sox2、青色=DAPI。黄色角括弧外有毛細胞(OHC)層を示している。図32(B)は、コントロール蝸牛における不動毛と類似に、(−30)GFP−Cre送達の10日後に、tdTomato陽性の外有毛細胞の無傷(intact)のespin(Esp)を発現する不動毛が存在した(矢印)ということを示している。赤色=tdTomato、緑色=Esp、白色=Sox2、青色=DAPI。図32(C)は、RNAiMAXの代わりにLipofectamine 2000を用いることを除いて図32(A)と同一である(n=4)。上および下パネルはそれぞれ低および高倍率でのマウス蝸牛の画像であり、送達の効率、さらには蝸牛構造および有毛細胞喪失に及ぼす効果を詳細に示している。図32(D)は、P2のAtoh1−GFPマウス(n=3)の中央階(蝸牛管)が50%のRNAiMAXまたはLipofectamine 2000中の33μMのsgRNA、33μMのCas9の0.3μLを注射されたときの結果を示している。Cas9によって媒介される遺伝子破壊は、10日後に可視化されたときにGFP発現の喪失をもたらす。上パネルはGFPシグナルのみを示しており、一方、下パネルは追加の免疫組織学マーカーを包含している。下パネル中の黄色枠は、GFP発現を喪失した有毛細胞を強調している。赤色=tdTomato、緑色=Myo7a、白色/淡青色=Sox2、青色=DAPI。全てのスケールバーは白色で示されており、10μmである。

0064

Creリコンビナーゼのカチオン性脂質によって媒介される送達の最適化。図33(A)は、BSR−TdTomato細胞(Cre組み換え効率を測定するために用いられる第2のレポーター細胞株)における(−30)GFP−Cre送達の最適化を示している。図33Bは、HeLaのdsRedレポーター細胞における(−30)GFP−Cre組み換え効率と毒性とに及ぼすRNAiMAX用量の効果を実証しており、FACSによって測定された。HeLa細胞前方散乱および側方散乱ゲーティングによってソーティングされ、正常な形態を保持した生細胞を同定した。図33(C)は、Creリコンビナーゼに融合された蛋白質の正味電荷とカチオン性脂質によって媒介される機能的なCre送達効率との間の関係性を例証している。25nMの列挙されたドメインに融合されたCreリコンビナーゼが、1.5μLのRNAiMAXと組み合わせられて、HeLaのdsRedレポーター細胞と一緒にインキュベーションされた。2日後に、組み換え効率がFACSによって測定された。エラーバーは、異なる日に実施された3つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。

0065

カチオン性脂質によって媒介される送達対超正荷電カチオン性蛋白質送達による、蛋白質取り込み。図34(A)は、未結合の蛋白質を取り除くためにPBSヘパリン(20U/mL)によって細胞を洗浄した後に、(−30)GFP−CreおよびRNAiMAXまたは(+36)GFP−Creいずれかによって処置された細胞からのGFP蛍光を定量している。図34(B)は、(+36)GFPとの融合に起因するCreリコンビナーゼ送達効率と相対的に、(−30)GFP−Cre+1.5μLのRNAiMAXの機能的なCreリコンビナーゼ送達効率を示している。図34(C)は、処置の48時間後に合計の細胞集団の平均mCherry蛍光を測定することによって、(−30)GFP融合体+1.5μMのRNAiMAX処置対(+36)GFP融合体によるmCherry取り込みの比較を提供しており、PBS+ヘパリンによって細胞を洗浄している。図34(D)は、RNAiMAXの存在下または非存在下での(−30)GFP−Creまたは(+36)GFP−Creの合計の細胞GFP蛍光を示している。

0066

NTF3遺伝子をターゲット化するように設計されたTALE活性化因子の送達最適化。HEK293T細胞が、トランスフェクションによるNTF3−TALEプラスミドまたはNTF3−TALE蛋白質のリポソーム送達いずれかによって処置された。細胞は、実験上決定された最適なインキュベーション時間の後に両方の処置について集められ、NTF3のmRNAレベルについてqRT−PCRによって分析された。最適な蛋白質(25〜50nM)および脂質用量(1.5μLのRNAiMAX)が、図29Bにおける2つの送達技術の比較のために選ばれた。エラーバーは、異なる日に実施された6つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。

0067

Cas9:sgRNAの送達とフローサイトメトリーによる分析とによる、EGFPレポーター遺伝子の遺伝子破壊頻度の決定。図36(A)は、Cas9二本鎖切断によって誘導されるNHEJによる、U2OS細胞におけるEGFP破壊の模式図を提供している。図36(B)は、RNAiMAXを用いる、(−30)dGFP−Cas9と複合体化したEGFPをターゲット化するsgRNAまたはオフターゲットsgRNAの送達を、プラスミドトランスフェクションの正のコントロール(橙色)と併せて示している。図36(C)は、EGFP蛍光の破壊が細胞毒性の結果ではないという確認を、サンプルをTO-PRO-3 live/dead染色(Life Technologies, Carlsbad CA)によって処置し、もたらされる細胞をフローサイトメトリーによって分析することによって提供している。図36(D)は、細胞透過化性だが完全には膜溶解性でない界面活性剤(0.5%Tween)の追加によるTO-PRO-3染色の試験を示している。

0068

Cas9:sgRNAの機能的な送達の最適化。図37(A)において、2つの試験された構築物のカチオン性脂質によって媒介される送達効率は、よりアニオン性の(−30)dGFP−NLS−Cas9が、自然のCas9と比較して、低い蛋白質およびsgRNA濃度でのより効率的な送達を容易にするということを示している。図37(B)は、蛋白質およびsgRNA濃度の関数として、(−30)dGFP−NLS−Cas9の送達最適化を示している。図37(C)は、蛋白質およびsgRNA濃度の関数として、いずれかの融合体またはタグ無しのCas9蛋白質の送達を示している。図37(D)は、(−30)dGFP−NLS−Cas9および自然のCas9のRNAiMAXによって媒介される送達のための最適なsgRNA対蛋白質比を示している。エラーバーは、異なる日に実施された3つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。

0069

sgRNAおよびCas9濃度両方の関数としての、機能的なCas9送達にNLSおよび/または(−30)dGFPが及ぼす効果。EGFP遺伝子破壊が、3つの固定されたsgRNA濃度10nM(図38(A))、25nM(図38(B))、および50nM(図38(C))において、グラフに示されている各種蛋白質濃度と併せて測定された。送達は0.8μLのRNAiMAXを用いて実施され、EGFP蛍光シグナルの喪失について48時間後にFACSによってアッセイされた。

0070

Cas9:sgRNA送達効率および細胞毒性にRNAiMAXおよびLipofectamine 2000が及ぼす効果。図39(A)においては、RNAiMAXまたはLipofectamine 2000いずれかによって16時間処置されたU2OSのEGFPレポーター細胞において、異なるCas9蛋白質濃度と100nMのEGFPのsgRNAの定常用量とにおけるEGFP遺伝子破壊が示されている。16時間後に培地が取り除かれ、蛋白質送達処置後48〜72時間のアッセイのエンドポイントまで、新鮮な培地が細胞に添加された。生細胞集団はFACSによってTO-PRO-3 Live/Dead染色を用いて決定された。図39(B)は、Lipofectamine 2000用量の関数として、U2OS細胞へのCas9:sgRNA送達について毒性プロファイルを示す。図39(C)は、RNAiMAX用量の関数として細胞に対する毒性プロファイルを提供する。エラーバーは、異なる日に実施された3つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。

0071

蛋白質およびsgRNAの各種濃度における、NTF3遺伝子をターゲット化するdCas9−VP64送達の最適化。HEK293T細胞が、dCas9−VP64活性化因子とNTF3をターゲット化するgRNAg2または全ての6つのNTF3をターゲット化するsgRNAの混合物いずれかとによって16時間、かつ0.8μLのRNAiMAXによって、48ウェルプレートフォーマットで処置された(275μLの終体積)。NTF3のmRNAレベルがqRT−PCRによって決定され、GAPDHのものに対して正規化された。エラーバーは、異なる日に実施された6つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。

0072

モック処置、Cas9プラスミドおよびsgRNAのリニアなDNAのPCR産物のトランスフェクション、またはカチオン性脂質によって媒介される蛋白質:sgRNA送達いずれかによって処置された数個のヒト遺伝子のインデル頻度(ハイスループットシーケンシングによって測定された)が図示されている。モック処置には、EGFPをターゲット化するsgRNAのカチオン性脂質によって媒介される蛋白質:sgRNA送達が、3つのヒト遺伝子をターゲット化するsgRNAの代わりに関わった。図41(A)は、オンターゲットおよびオフターゲットインデル頻度をCLTA遺伝子について示している。図41(B)は、オンターゲットおよびオフターゲットインデル頻度をEMX遺伝子について提供している。図41(C)は、オンターゲットおよびオフターゲットインデル頻度をVEGF遺伝子について実証している。各オンおよびオフターゲットサンプルは一度シーケンシングされ、>10,000個の配列がオンターゲットサンプルあたり分析され、平均>111,000個の配列がオフターゲットサンプルあたり分析された(表2)。

0073

マウス胚性幹細胞へのCas9エンドヌクレアーゼの送達。図42(A)は、Cas9蛋白質およびRNAiMAXによって処置されたがsgRNAによって処置されなかった浮遊スフィア(コントロール)が強いGFP蛍光を保持し(右)、一方、Cas9:sgRNAおよびRNAiMAXによって処置されたものが減少したGFP蛍光を見せた(左)ということを示している。スケールバーは100μmである。図42(B)は細胞接着後のコントロール前駆細胞を示しており、実質的に(virtualy)全てのコントロール前駆細胞はGFP陽性であった(右パネル)。Cas9:sgRNA処置はGFP発現の有意な低減につながり左パネル)、多くの前駆細胞は細胞接着後に完全なGFPノックダウンを示した(矢印)。スケールバーは20μmである。図42(C)は、イメージング後に集められた幹細胞のT7EIアッセイが、GFPレポーターの切断を確認することを示している。類似の遺伝子ターゲット改変効率が、カチオン性脂質によって媒介されるCas9:sgRNA送達ならびにCas9およびEGFPsgRNAプラスミドのトランスフェクションから観察された。

0074

インビボの内在性遺伝子座において、Cas9ヌクレアーゼおよびsgRNAのカチオン性脂質によって媒介される蛋白質送達によって誘導されたゲノム改変。図43(A)は、マウス有毛細胞において、Cas9およびEGFPのsgRNAのカチオン性脂質によって媒介される送達後に改変された、EGFPオンターゲット遺伝子座のゲノムDNA配列の代表的な例を示す。示されている各例について、未改変ゲノム部位は最初の配列であり、欠失を含有する最も豊富な8つの配列と挿入を含有する3つの配列とが続く。各配列の前の数はシーケンシングカウントを示している。sgRNAターゲット部位は太字、緑色で下線を付されている。挿入および欠失は赤色で示されている。PAM部位が青色で示されている。図43(B)は、マウス有毛細胞内のEMXオンターゲット部位について図42(A)と同一の分析を示している。図43(A)に示されている配列は、上から下へ、配列番号223〜236に対応し、図43(B)に示されている配列は、上から下へ、配列番号237〜250に対応する。

0075

本発明は、超荷電蛋白質、カチオン性ポリマー、および/またはカチオン性脂質の1つまたは2つ以上と機能的なエフェクター蛋白質を結びつけることによる、細胞への機能的なエフェクター蛋白質(例えばヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、およびCas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体、例えば、Cas9ニッカーゼおよびデアミナーゼ、遺伝子編集酵素、転写抑制因子および活性化因子、エピジェネティック修飾因子などへのCas9融合体を包含する))の送達のための、複合体、組成物、調製物、キット、システム、および関連する方法を提供する。典型的には、機能的なエフェクター蛋白質は、細胞の内部に送達されて、例えば細胞内で生物学的効果(例えば、ゲノムターゲット配列の切断またはターゲット遺伝子の発現の調節)を引き起こす。いくつかの態様において、生物学的効果は、細胞が見いだされる対象に対して治療上の利益を行使する。機能的なエフェクター蛋白質の送達のための複合体、組成物、調製物、システム、キット、および関連する方法は、例えば、研究または治療目的のために細胞を操作する文脈で、細胞内にエフェクター蛋白質を導入することに有用である。本明細書において提供される機能的なエフェクター蛋白質の送達のための組成物、調製物、システム、キット、および関連する方法は、改善した有効性および低減された細胞毒性、ならびに調製の容易さを現行の技術と比較して示す。本明細書において提供される組成物、調製物、システム、キット、および関連する方法を用いるTALENまたはCas9蛋白質(またはそのバリアントまたは融合体)などの部位特異的な蛋白質の送達は、インビトロまたはインビボのホスト細胞のゲノムのターゲット化された操作/改変を可能とし、一方で、より侵襲的な送達法(例えば、部位特異的な蛋白質をコードするベクターのウイルス送達)の使用を回避する。

0076

いくつかの態様において、本発明の技術は、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を送達するために超荷電蛋白質を用いる。ある種の態様において、超荷電蛋白質は操作された蛋白質である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は天然に存在する超荷電蛋白質である。本発明のいくつかの側面は、超荷電蛋白質が細胞によってエンドサイトーシスされ、超荷電蛋白質と結びつき得る機能的なエフェクター蛋白質が超荷電蛋白質と一緒に細胞によって有効に取り込まれ、かかる機能的なエフェクター蛋白質が細胞内取り込み後にそれらの生物学的機能を保持する(例えば、それらがゲノムターゲット部位を切断もしくは改変するか、またはターゲット遺伝子の転写を調節する能力があるという点で)という認識に基づく。

0077

いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)と結びついた超荷電蛋白質を含む本明細書において提供される組成物は、治療薬、診断剤、または研究ツールとして有用である。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼまたは転写因子)は、例えば、疾患または障害と結びついた遺伝子をターゲット化するという点で治療活性であり得る。いくつかの態様において、超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質(例えばヌクレアーゼまたは転写因子)を含む本明細書において提供される組成物が用いられて、細胞内の遺伝子の発現を調節するか、または細胞内の生物学的経路(例えば、シグナル伝達経路代謝経路)を調節する。いくつかの態様において、細胞は、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入するために本明細書に記載される本発明組成物と接触させられる。いくつかの態様において、本発明組成物は、対象内の細胞内に(例えば、疾患または障害と結びついた細胞内に)機能的なエフェクター蛋白質を導入するために、その必要がある対象に投与される。本開示のいくつかの側面に従う機能的なエフェクター蛋白質の送達のための好適な細胞および細胞型は、ヒト細胞、哺乳類細胞、T細胞、ニューロン、幹細胞、前駆細胞、血球、線維芽細胞、上皮細胞新生物細胞、および腫瘍細胞を包含するが、これに限定されない。

0078

超荷電蛋白質
本発明への使用のための超荷電蛋白質は、蛋白質の表面の保存されていないアミノ酸をより極性のまたは荷電したアミノ酸残基に変化させることによって生成し得る。ある種の態様において、蛋白質の表面の保存されていないアミノ酸は変異導入されて、生理pH(pH約7.4)で正に荷電したアミノ酸になる。改変されるべきアミノ酸残基は、疎水性で、親水性で、荷電して、またはその組み合わせであり得る。超荷電蛋白質は、蛋白質を超荷電させるための蛋白質への荷電部分の取り付けによってもまた生成し得る。超荷電蛋白質は、高頻度凝集に対して耐性であり、リフォールディングする増大した能力を有し、不適切フォールディングに対して抵抗力があり、改善した可溶性を有し、広範囲の条件(熱または界面活性剤の存在などの変性条件を包含する)で一般的により安定である。

0079

本開示の側面に従う使用に好適な超荷電蛋白質は当分野において公知であり、限定無しに、国際PCT特許出願PCT/US07/70254(2007年6月1日出願、2007年12月13日にWO2007/143574として公開)、国際PCT出願PCT/US09/041984(2009年4月28日出願、2009年11月5日にWO2009/134808として公開)、および国際PCT出願PCT/US10/001250(2010年4月28日出願、2010年11月11日にWO2010/129023として公開)に開示されている超荷電蛋白質を包含し、そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は操作された超荷電蛋白質である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は天然に存在する超荷電蛋白質、例えば国際PCT出願PCT/US10/001250(2010年4月28日出願、2010年11月11日にWO2010/129023として公開)に開示されている天然の超荷電蛋白質であり、そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、操作されたまたは天然に存在する超荷電蛋白質は、0.8よりも大きい(例えば≧0.85、≧0.9、≧0.95、≧1、≧1.1、≧1.2、≧1.3、≧1.4、≧1.5、≧1.6、≧1.7、≧1.8、≧1.9、≧2、≧2.5、≧3、≧4、≧5、≧6、≧7、≧8、または≧10)電荷:分子量比を示す。

0080

使用される超荷電蛋白質は植物、動物、および/または微生物のいずれかの種に由来し得る。ある種の態様において、超荷電蛋白質は哺乳類蛋白質である。ある種の態様において、超荷電蛋白質はヒト蛋白質である。ある種の態様において、蛋白質は、典型的には研究に用いられる生物に由来する。例えば、改変されるべき蛋白質は霊長類(例えば、類人猿サル)、げっ歯類(例えば、ウサギハムスター、アレチネズミ)、ブタ、イヌ、ネコ、魚類(例えばDanio rerio)、線虫(例えばC.elegans)、酵母(例えばSaccharomyces cerevisiae)、または細菌(例えばE.coli)からであり得る。ある種の態様において、蛋白質は非免疫原性である。ある種の態様において、蛋白質は非抗原性である。ある種の態様において、蛋白質は本来の生物活性を有さないか、または生物活性を有さないように改変されている。ある種の態様において、蛋白質はそのターゲット化能力に基づいて選ばれる。ある種の態様において、蛋白質は緑色蛍光蛋白質である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は超荷電グルタチオントランスフェラーゼ(GST)である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は超荷電ストレプトアビジンである。

0081

いくつかの態様において、正味の総電荷を増大させるようにまたは蛋白質表面上の荷電残基の合計数を増大させるように改変された超荷電蛋白質が用いられる。ある種の態様において、超荷電蛋白質の理論上の正味電荷は、未改変蛋白質と比較して少なくとも+1、少なくとも+2、少なくとも+3、少なくとも+4、少なくとも+5、少なくとも+10、少なくとも+15、少なくとも+20、少なくとも+25、少なくとも+30、少なくとも+35、または少なくとも+40だけ増大している。ある種の態様において、超荷電蛋白質の理論上の正味電荷は、生理pH(すなわち約7.4)において少なくとも+1、少なくとも+2、少なくとも+3、少なくとも+4、少なくとも+5、少なくとも+10、少なくとも+15、少なくとも+20、少なくとも+25、少なくとも+30、少なくとも+35、または少なくとも+40である。

0082

他の態様(例えば、カチオン性脂質および/またはカチオン性ポリマーの使用が関わるもの)において、正味の総電荷を減少させるようにまたは蛋白質表面上の荷電残基の合計数を減少させるように改変された超荷電蛋白質が用いられる。ある種の態様において、超荷電蛋白質の理論上の正味電荷は、未改変蛋白質と比較して少なくとも−1、少なくとも−2、少なくとも−3、少なくとも−4、少なくとも−5、少なくとも−10、少なくとも−15、少なくとも−20、少なくとも−25、少なくとも−30、少なくとも−35、少なくとも−40、少なくとも−45、または少なくとも−50だけ減少している(「マイナス」または「負」は「−」によって表される)。ある種の態様において、超荷電蛋白質の理論上の正味電荷は少なくとも−1、少なくとも−2、少なくとも−3、少なくとも−4、少なくとも−5、少なくとも−10、少なくとも−15、少なくとも−20、少なくとも−25、少なくとも−30、少なくとも−35、少なくとも−40、少なくとも−45、または少なくとも−50である。

0083

いくつかの例示的な超荷電蛋白質が、本発明の技術を例示するために本明細書に記載される一方で、本開示はこの点で限定されない。当業者は、本開示に基づいて、細胞に機能的なエフェクター蛋白質を送達するための追加の好適な超荷電蛋白質を確かめる能力があるであろう。いくつもの天然に存在する蛋白質が、好適な超荷電蛋白質を生成するために改変され得る。かかる蛋白質中の望まれる改変は、当分野において公知のいずれかの技術を用いて成就され得る。蛋白質配列中のかかる変化を導入するための組み換えDNA技術は当分野において周知である。ある種の態様において、改変は、蛋白質をコードするポリヌクレオチドの部位特異的変異導入によってなされる。変異を導入するための他の技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)、the treatise, Methodsin Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999)において論じられており、そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。

0084

超荷電蛋白質はさらに改変され得る。超荷電蛋白質を包含する蛋白質は当業者に公知の技術を用いて改変され得る。例えば、超荷電蛋白質は化学的にまたは生物学的に改変され得る。1つまたは2つ以上のアミノ酸が、一次配列から追加、欠失、または変化させられ得る。例えば、ポリヒスチジンタグまたは他のタグが、蛋白質の精製を補助するために超荷電蛋白質に追加され得る。他のペプチドまたは蛋白質が、蛋白質の生物学的、生化学的、および/または生物物理学的特性を変化するために超荷電蛋白質に追加され得る。例えば、エンドソーム溶解性ペプチドが超荷電蛋白質の一次配列に追加され得、または、ターゲット化ペプチドが超荷電蛋白質の一次配列に追加され得る。超荷電蛋白質の他の改変は翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化脂質修飾ファルネシル化アセチル化蛋白質加水分解など)を包含するが、これに限定されない。ある種の態様において、超荷電蛋白質は、その免疫原性を低減するために改変される。ある種の態様において、超荷電蛋白質は、細胞に機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)を送達するその能力を向上させるために改変される。ある種の態様において、超荷電蛋白質はポリマーにコンジュゲーションされる。例えば、蛋白質は、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーに蛋白質をコンジュゲーションすることによってPEG化され得る。他の方法が、蛋白質配列の改変無しに超荷電蛋白質を生成させるために用いられ得る。例えば、正味電荷を変化する部分が、超荷電を達成するための表面電荷を提供するために(例えば、化学または酵素反応によって)蛋白質に取り付けられ得る。ある種の態様において、Shaw et al., Protein Science 17: 1446, 2008に記載されている蛋白質を改変する方法が用いられて、本開示の本発明の技術に用いられる蛋白質を超荷電させる。

0085

本開示の技術による使用に好適な数個の異なる超荷電蛋白質のバリアントの設計および作製が、国際PCT特許出願PCT/US07/70254(2007年6月1日出願、2007年12月13日にWO2007/143574として公開)、国際PCT出願PCT/US09/041984(2009年4月28日出願、2009年11月5日にWO2009/134808として公開)、および国際PCT出願PCT/USlO/001250(2010年4月28日出願、2010年11月11日にWO2010/129023として公開)に記載されており、そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。それらに記載された開示された超荷電蛋白質のいくつかは、より安定でありかつそれらの生物学的機能(例えば、蛍光蛋白質の場合ではそれらの蛍光)を保持するということが示されている。例えば、Aequorea victoriaからの緑色蛍光蛋白質(GFP)はGenBank登録番号P42212に記載されており、参照によって本明細書に組み込まれる。この野生型GFPのアミノ酸配列は以下の通りである。
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(配列番号14)

0086

野生型GFPは−7の理論上の正味電荷を有する。−29、−30、−25、+15、+25、+36、+48、および+49の理論上の正味電荷を有するバリアントが、例えば国際PCT出願PCT/USlO/001250(2010年4月28日出願、2010年11月11日にWO2010/129023として公開)において報告されており、その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。+36GFPを95℃まで熱した後でさえも、バリアント蛋白質の100%が可溶性であり、蛋白質はその蛍光の≧70%を保持する。

0087

本開示のいくつかの側面は、+36GFPがターゲット細胞に機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)を効率的に送達し、そのように送達されたエフェクター蛋白質がそれらの生物学的機能を保持するという発見に基づく。そのため、少なくとも+15、少なくとも+25、少なくとも+30、少なくとも+35、または少なくとも+40の正味電荷を有するGFPまたは他の蛋白質は、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入することに特に有用であると考えられる。

0088

いくつかの態様において、特に有用な超荷電蛋白質は、+36GFPのものと類似の電荷分布または表面電荷密度を可能とする蛋白質である。さらに、いくつかの態様において、特に有用な超荷電蛋白質は、超荷電によって容易に撹乱されない安定なフォールディング構造を示す蛋白質であり、それゆえに超荷電蛋白質が良くフォールディングされることを可能とする。いくつかの態様において、特に有用な超荷電蛋白質は、本明細書または国際PCT特許出願PCT/US07/70254(2007年6月1日出願、2007年12月13日にWO2007/143574として公開)、国際PCT出願PCT/US09/041984(2009年4月28日出願、2009年11月5日にWO2009/134808として公開)、および国際PCT出願PCT/US10/001250(2010年4月28日出願、2010年11月11日にWO2010/129023として公開)(そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる)に記載される超荷電蛋白質と構造的特徴を共有する蛋白質である(例えば球状構造またはβバレル構造)。蛋白質フォールディング、蛋白質フォールド構造安定性、および異なって荷電したアミノ酸による特異的なアミノ酸の置換による蛋白質フォールディングの撹乱、電荷分布、ならびに表面電荷密度は、本明細書において提供される方法およびアルゴリズムならびに当業者に公知の他のものによってインシリコモデリングされ得る。従って、問題の超荷電蛋白質が良くフォールディングするかどうかは慣例の実験法のみから当業者に明らかになるであろう。それゆえに、当業者は、所与の超荷電蛋白質が本明細書に記載される技術に従う機能的なエフェクター蛋白質の細胞内送達に有用であるかどうかを、所与のアミノ酸配列から同定する能力があるであろう。

0089

GFPのいくつかの例示的な好適なバリアントは、限定無しに以下を包含する。
+15GFP:
MGHHHHHHGGASKGERLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIELKGRDFKEKGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(配列番号15)
+25GFP:
MGHHHHHHGGASKGERLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(配列番号16)
+36GFP:
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(配列番号17)
+42GFP:
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK(配列番号18)
+48GFP:
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK(配列番号19)
+49GFP:
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLKEFVTAAGIKHGRKERYK(配列番号20)
(−)30GFP:
MGHHHHHHGGASKGEELFDGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTYGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK(配列番号21)
上の配列がN末端His6タグを包含することと、かかるタグ無しまたは異なるタグ有りの配列もまた好適であるということとは当業者には明らかであろう。

0090

細胞への送達後の機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)の生物学的機能を促進するためには、細胞内取り込み後の機能的なエフェクター蛋白質のエンドソーム脱出を向上させることが望ましくあり得る。超荷電蛋白質または機能的なエフェクター蛋白質が、エンドソーム分解またはエンドソームの溶解を向上させることが公知の蛋白質、ペプチド、または他の実体と融合されるかまたは結びつけられ得る。ある種の態様において、ペプチドはヘマグルチニン2(HA2)ペプチドであり、これはエンドソーム分解を向上させることが公知である。ある種の特定の態様において、HA2ペプチドは超荷電GFP(例えば、+36GFP)に融合する。ある種の特定の態様において、融合した蛋白質は以下の配列である。
+36GFP−HA2
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYKGSAGSAAGSGEFGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(配列番号22)
ある種の態様において、エンドソーム溶解性ペプチドはメリチンペプチド(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ。配列番号23)である(Meyer et al., JACS 130(11): 3272-3273, 2008。これは参照によって本明細書に組み込まれる)。ある種の態様において、メリチンペプチドは1、2、3、4、または5つのアミノ酸置換、欠失、および/または追加によって改変される。ある種の態様において、メリチンペプチドは配列CIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(配列番号24)である。ある種の特定の態様において、メリチンペプチドは超荷電GFP(例えば、+36GFP)に融合する。

0091

ある種の態様において、エンドソーム溶解性ペプチドはペネトラチンペプチド(RQIKIWFQNRRMKWKK−アミド。配列番号25)、ウシPrP(1−30)ペプチド(MVKSKIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKP−アミド。配列番号26)、MPGΔNLSペプチド(K−>S置換のため、機能的な核局在配列を欠く)(GALFLGWLGAAGSTMGAPKSKRKV。配列番号27)、TP−10ペプチド(AGYLLGKINLKALAALAKKIL−アミド。配列番号28)、および/またはEB1ペプチド(LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK−アミド。配列番号29)である(Lundberg et al., 2007,FASEB J. 21:2664。参照によって本明細書に組み込まれる)。ある種の態様において、ペネトラチン、PrP(1−30)、MPG、TP−10、および/またはEB1ペプチドは、1、2、3、4、または5つのアミノ酸置換、欠失、および/または追加によって改変される。ある種の特定の態様において、PrP(1−30)、MPG、TP−10、および/またはEB1ペプチドは超荷電GFP(例えば、+36GFP)に融合する。いくつかの態様において、Aureinペプチドは超荷電蛋白質に融合する。

0092

他のペプチドまたは蛋白質もまた、超荷電蛋白質、または超荷電蛋白質と機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)とを含む融合蛋白質に融合され得る。例えば、ターゲット化ペプチドが、特定の細胞型に機能的なエフェクター蛋白質を選択的に送達するために超荷電蛋白質に融合され得る。機能的なエフェクター蛋白質の細胞内取り込みを向上させるペプチドまたは蛋白質もまた用いられ得る。ある種の態様において、超荷電蛋白質に融合されたペプチドはペプチドホルモンである。ある種の態様において、超荷電蛋白質に融合されたペプチドはペプチドリガンドである。

0093

本明細書において詳細に記載される例示的な超荷電蛋白質は本開示を限定することは意味されていない。他の超荷電蛋白質が、機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)の細胞内送達のために用いられ得、他のGFP式蛍光蛋白質を包含するが、これに限定されないということを当業者は認めるであろう。ある種の態様において、超荷電蛋白質は青色蛍光蛋白質の超荷電バージョンである。ある種の態様において、超荷電蛋白質はシアン蛍光蛋白質の超荷電バージョンである。ある種の態様において、超荷電蛋白質は黄色蛍光蛋白質の超荷電バージョンである。例示的な好適な蛍光蛋白質は、エンハンスト緑色蛍光蛋白質(EGFP)、AcGFP、TurboGFP、Emerald、Azami−Green、ZsGreen、EBFP、Sapphire、T−Sapphire、ECFP、mCFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midori−Ishi−Cyan、mTFP1(Teal)、エンハンスト黄色蛍光蛋白質(EYFP)、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、PhiYFP、ZsYellow1、mBanana、Kusabira−Orange、mOrange、dTomato、dTomato−Tandem、DsRed、DsRed2、DsRed−Express(T1)、DsRed−Monomer、mTangerine、mStrawberry、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、HcRed1、mRaspberry、HcRed1、HcRed−Tandem、mPlum、およびAQ143を包含するが、これに限定されない。

0094

超荷電であり、かつ例えば本明細書に開示される機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)の送達に用いられ得るまだ他の蛋白質は、ヒストン構成物またはヒストン様蛋白質、高移動度グループ蛋白質(HMG)、酵素(例えば、アミラーゼペクチナーゼヒドロラーゼ、プロテアーゼ、グルコースイソメラーゼリパーゼフィターゼアルグルセラーゼイミグルセラーゼ、アガルシダーゼベータ、α−1−イズロニダーゼ、酸α−グルコシダーゼ、およびイズロン酸−2−スルファターゼ、N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼを包含する。
蛋白質以外の荷電ポリマーもまた、機能的なエフェクター蛋白質を送達するために用いられ得る。加えて、本明細書により詳細に記載される通り、カチオン性脂質および脂質様材料、さらにはカチオン性ポリマーもまた、機能的なエフェクター蛋白質を送達するために用いられ得る。好適なカチオン性脂質、脂質様材料、およびカチオン性ポリマーは本明細書に開示されており、追加の好適な脂質および脂質様材料は当業者に公知である(例えば、Akinc et al., Nature Biotechnology 26, 561-569 (2008)に記載されているもの参照。その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる)。

0095

超荷電蛋白質を用いる機能的なエフェクター蛋白質の送達
本発明は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロの細胞への機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)の送達のためのシステムおよび方法を提供する。かかるシステムおよび方法には、複合体または融合蛋白質を形成するための超荷電蛋白質との機能的なエフェクター蛋白質の結びつきと、細胞への複合体または融合蛋白質の送達とが典型的には関わる。いくつかの態様において、超荷電蛋白質によって送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質は治療活性を有する。いくつかの態様において、細胞への複合体または融合蛋白質の送達には、その必要がある対象に機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む複合体または融合蛋白質を投与することが関わる。

0096

いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)それ自体は細胞に入る能力がなくあり得るが、例えば共有結合または非共有結合的な相互作用を介して超荷電蛋白質と結びつけられたときには細胞に入る能力がある。いくつかの態様において、超荷電蛋白質に共有結合した機能的なエフェクター蛋白質を包含する組成物が提供される。いくつかの態様において、組成物は、ペプチド結合を介して(例えば、直接的な融合を介してまたはペプチドリンカーを介して)超荷電蛋白質に融合した機能的なエフェクター蛋白質を包含する。いくつかの態様において、組成物は、非共有結合的な相互作用によって超荷電蛋白質に結合した機能的なエフェクター蛋白質を包含する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、機能的なエフェクター蛋白質が細胞に入ることを可能とするために利用される。いくつかの態様において、超荷電蛋白質に結びついた細胞に送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質は、例えば細胞内プロテアーゼ(例えばエンドソームプロテアーゼ)によるリンカーペプチドの切断によって、または特定の細胞内微小環境内における(例えばエンドソーム内における)超荷電蛋白質からの機能的なエフェクター蛋白質の解離によって、細胞への送達後に超荷電蛋白質から分離される。いくつかの態様において、本開示によって提供されるシステムまたは方法によって送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質は、治療活性を有する。

0097

いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)は、本明細書において提供されるシステム、組成物、または方法によってインビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達される。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質は、ターゲット細胞内で生物学的機能を実行する能力がある蛋白質、例えば、その基質に結合してターゲット細胞内で酵素反応を触媒する能力がある酵素、例えば、ターゲット細胞内の核酸分子に結合して切断する能力があるヌクレアーゼ、またはターゲット細胞のゲノムと相互作用して細胞内のターゲット遺伝子の転写を活性化または阻害する能力がある転写因子である。
いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質と超荷電蛋白質との融合体を生成するための方法は、機能的な蛋白質および超荷電蛋白質のコード配列、さらには任意でペプチドリンカーをインフレームで含有する発現核酸構築物の生成、培養中の原核または真核細胞内でのかかる組み換え融合蛋白質の発現、融合蛋白質の融合蛋白質の抽出および精製を包含する。いくつかの態様において、核酸構築物は発現ベクター(例えば、細菌ホスト内での増数および原核または真核細胞内での発現に好適なベクター)の形態で生成される。

0098

いくつかの態様において、融合蛋白質発現に好適なベクターは、両方のコード配列が互いにインフレームであることをもたらすクローニング手法によって、真核生物および/または原核生物プロモーターのコントロール下に超荷電蛋白質をコードするヌクレオチド配列を包含するクローニングベクター中への、送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質をコードするヌクレオチド配列のクローニングによって生成される。いくつかの態様において、クローニングベクターは、超荷電蛋白質をコードするヌクレオチド配列と、リンカーおよび超荷電蛋白質とインフレームで蛋白質をコードするヌクレオチド配列を挿入するために有用な制限部位との間に、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を包含する。いくつかの態様において、クローニングベクターは、原核もしくは真核細胞内での融合蛋白質の発現を向上させるか、またはかかる細胞からの発現された融合蛋白質の精製を容易にする追加の配列をさらに包含する(例えば、融合蛋白質をコードする転写物を安定化する配列、例えばポリAシグナル、スプライシング可能なイントロン、インフレームペプチドまたは蛋白質ドメインタグ(例えば、Argタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、セルロース結合ドメインタグ、DsbAタグ、c−mycタグ、グルタチオンS−トランスフェラーゼタグ、FLAGタグ、HATタグ、Hisタグ、マルトース結合蛋白質タグ、NusAタグ、Sタグ、SBPタグ、Strepタグ、またはチオレドキシンタグ)をコードする配列、または、発現構築物を保有および発現する細胞の同定をならびに/もしくはかかる細胞における発現のレベルを定量することを可能とする選択マーカーもしくはレポーターカセット)。融合蛋白質をクローニングおよび発現するための方法は当業者に周知である。例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Volume 1-3, CSHLPress (1989)、Gellissen et al., Production of recombinant proteins, Wiley-VCH, 2005参照。
いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質は、ターゲット細胞への送達のために超荷電GFP(例えば、+36GFPまたは−30GFP)と結びつけられる。超荷電蛋白質による高分子の送達におけるエンドソーム破壊の利益が以前に実証されており(Wadia et al., Nat. Med. 10, 310-315, 2004)、いくつかの態様において、向上したエンドソーム脱出を実現するための追加のステップが、本明細書において提供されるかまたは当分野において公知の通り実施される。高度に効率的な蛋白質内在化は、有効なエンドソーム放出とカップリングされたときに外来性蛋白質薬剤の要求される用量を最小化する可能性を有しており、研究ツールおよび治療薬開発のためのリードとしてのそれらの可能性を向上させる。

0099

いくつかの態様において、超荷電蛋白質と結びついた機能的なエフェクター蛋白質を含む組成物は、単離および/または精製後にターゲット細胞に投与される。蛋白質単離法および技術は当業者に周知であり、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降を包含する。特定の機能的なエフェクター蛋白質、超荷電蛋白質、および/または融合蛋白質を単離および/または精製するための好適な方法は、それぞれの蛋白質の性質に依存するであろう。例えば、Hisタグ融合蛋白質はNiまたはCoイオンクロマトグラフィーによって難なく単離および精製され得、一方、他のペプチドもしくはドメインによってタグづけされた融合蛋白質またはタグ無し融合蛋白質は、他の良く確立された方法によって精製され得る。
本明細書において提供されるシステムまたは方法によるインビボ、エクスビボ、またはインビトロのターゲット細胞への送達に好適な機能的なエフェクター蛋白質は当業者には明らかであろう。例えば、DNA結合蛋白質(例えば転写因子およびヌクレアーゼ)、さらにはCas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)を包含する。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法、組成物、またはシステムは、細胞に治療用の機能的なエフェクター蛋白質を送達するために用いられる。治療用の蛋白質の例は、疾患または障害と結びついたゲノムアレルをターゲット化するヌクレアーゼおよびCas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)、ならびに有益な遺伝子を活性化するかまたは病原性の遺伝子を抑制する転写因子を包含するが、これに限定されない。

0100

いくつかの態様において、Cas9は、細胞への送達のために超荷電蛋白質に融合される。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は正に荷電する。いくつかの態様において、Cas9に融合される超荷電蛋白質は(+36)GFPである。いくつかの態様において、Cas9と(+36)GFPとの融合体は(例えば、核局在シグナル(NLS)有りまたは無しおよび6×Hisタグ有りまたは無しで)配列番号30のアミノ酸配列を含むか、または(例えば、核局在シグナル(NLS)有りまたは無しおよび6×Hisタグ有りまたは無しで)配列番号30のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Cas9に融合される超荷電蛋白質は(−30)GFPである。いくつかの態様において、Cas9と(−30)GFPとの融合体は、(例えば、核局在シグナル(NLS)有りまたは無しおよび6×Hisタグ有りまたは無しで)配列番号31のアミノ酸配列を含むか、または(例えば、核局在シグナル(NLS)有りまたは無しおよび6×Hisタグ有りまたは無しで)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。

0101

0102

0103

機能的なエフェクター蛋白質およびカチオン性脂質の組成物
本開示のある種の側面は、例えば「の」蛋白質調製物を送達することと対比して、エフェクター蛋白質(例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子/抑制因子、リコンビナーゼ、Cas9蛋白質(そのバリアントおよび融合体を包含する)など)の送達のためのカチオン性脂質の使用に関する。驚くべきことに、DNAおよびRNAなどの核酸の送達のために操作された既存のリポソーム送達試薬が、本明細書に記載される通り、インビトロおよびインビボ両方である種のエフェクター蛋白質(例えば、そのバリアントおよび融合体を包含するCas9蛋白質)を有効に送達するということが見いだされた。核酸送達は、過去20年間のリポソーム試薬の開発から大きく恩恵を受けて来た。カチオン性リポソーム製剤は、DNAおよびRNAトランスフェクションが基礎研究における慣例の技術になることを可能にし、治験においてさえも用いられている。リポソームの脂質二重層は、封入された核酸を分解から保護し、核酸の裸の調製物に結合し得る抗体による特異的な中和を予防し得る。重要なことに、エンドソーム成熟中におけるエンドソーム膜とのリポソームの融合は、カチオン性脂質によって送達されるカーゴ積み荷)の高度に効率的なエンドソーム脱出を可能にし得る。他の非カチオン性だが可逆的にイオン化可能な脂質ナノ粒子製剤は、核酸の効率的な封入および送達を可能にし、一方、非特異的な静電気的相互作用および帰結の隔離を回避した。しかしながら、蛋白質は化学的に多様であり、そのため高度にアニオン性の核酸とは違って、リポソーム製剤は蛋白質の効率的な送達については同様な成功はしなかった。例えば、蛋白質はインビトロの再水和脂質によって非特異的に封入および送達され得る一方で、封入の有効性は蛋白質濃度に依存し、一般的に非効率的であり、それゆえに広汎な応用はなされなかった。本開示の側面は、アニオン性蛋白質または蛋白質複合体(核酸と結びついた蛋白質を包含する)が、核酸送達のためのカチオン性リポソーム試薬によって用いられる同じ静電気学によって駆動される封入を活用する能力があり得るという認識に関する。少ない蛋白質が、核酸のリン酸バックボーン中に見いだされる負電荷の密度を自然に備えている一方で、本明細書に記載される負の超荷電蛋白質または核酸などのアニオン性担体との翻訳融合(translational fusion)または非共有結合的な結びつきは、もたらされるエフェクター蛋白質または蛋白質複合体を充分にアニオン性にして、カチオン性リポソーム試薬によるかかる蛋白質カーゴの効率的な封入を駆動する。

0104

いくつかの態様において、操作された超負荷電GFPとの結びつきまたは融合は、核酸をトランスフェクションするために普通に用いられるカチオン性脂質による培養哺乳類細胞内への蛋白質の効率的な封入および送達を駆動することができる。この手法は低いナノモル蛋白質濃度および血清の存在下でさえも有効であり、カチオン性ペプチドまたは蛋白質への融合を用いる蛋白質送達法よりも1,000倍まで効率的な機能的な蛋白質送達をもたらす。例に示されている通り、送達の有効性は、いくつかの態様において例えば融合タグの理論上の正味電荷に依存し、そのポピュラーな自然にアニオン性のペプチドタグ(例えば、3×FLAGおよびVP64)は同様にリポソーム蛋白質送達を可能にし得る。

0105

例は、ポリアニオン性ガイドRNA(gRNA)と結びついたCas9ヌクレアーゼ蛋白質が、それらの普通のカチオン性リポソーム製剤によって哺乳類細胞内に機能的な形態で効率的に送達され得るということをさらに示す。なぜなら、いずれかの特定の理論によって束縛されることを求めるものではないが、gRNAは、別様にはカチオン性のCas9蛋白質とカチオン性脂質との間のポリアニオン性の仲介物質として作用すると信じられるからである。Cas9:gRNA複合体の送達は高度に効率的である(例えば、単一の処置からの80%までの改変)のみならず、プラスミドトランスフェクションと比較して顕著に高いゲノム改変特異性をもまたもたらし、>10倍高いオンターゲット:オフターゲット改変比を典型的にはもたらす。これは、多分、送達されるCas9:gRNA活性の一過的な性質が原因である。いくつかの態様において、Cas9:gRNA複合体の送達は、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、または25倍以上高いオンターゲット:オフターゲット改変比をもたらす。例は、例えばマウスの内耳の有毛細胞に機能的なCreリコンビナーゼおよび機能的なCas9:gRNA複合体を送達することによって、この蛋白質送達手法がインビボで有効であり得るということをもまた実証している。

0106

従って、本発明のいくつかの側面は、Cas9蛋白質(例えば、本明細書に記載される通り。例えば、下のCas9エフェクター蛋白質参照)と細胞の内部にCas9蛋白質を送達することができるカチオン性脂質とを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、Cas9蛋白質はgRNAと結びつき、これは例えば複合体にアニオン性電荷を提供し、それによって、Cas9:gRNA複合体がカチオン性脂質によって封入されることを可能とする。いくつかの態様において、Cas9蛋白質はカチオン性脂質による有効な封入のためにgRNAと結びつく必要はなく、代わりに、本明細書に記載される負の超荷電蛋白質と結びつけられる。Cas9蛋白質が負の超荷電蛋白質と結びつけられるいくつかの態様において、Cas9蛋白質はgRNAともまた結びつけられる。いくつかの態様において、Cas9蛋白質は野生型Cas9蛋白質、野生型Cas9蛋白質の断片、または野生型Cas9蛋白質のバリアントである。いくつかの態様において、Cas9蛋白質はdCas9ドメイン(例えば、本明細書に記載される通り)を含む。いくつかの態様において、Cas9蛋白質はdCas9ドメイン(例えば、本明細書に記載される通り)を含む融合蛋白質である。いくつかの態様において、Cas9蛋白質はCas9ニッカーゼである。

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