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図面 (16)

課題

GHR、IGF−1、及びインスリンを含む成長ホルモン又はそれにより調節される遺伝子の活性により引き起こされる疾患又は病態、具体的には、末端肥大症、正常細胞を損傷させる毒素を含む化学療法又は他の治療法、癌、糖尿病免疫低下免疫抑制免疫老化免疫欠損アルツハイマー病老化、並びに細胞及び組織再生から利益を受ける疾患及び病態からなる群から選択されることを特徴とする、疾患又は病態を治療するための方法を提供する。

解決手段

成長ホルモン受容体、及び/又は成長ホルモンを標的化するモノクローナル抗体を使用する方法とする。

概要

背景

末端肥大症は、下垂体腺腫からのGHの過剰分泌により引き起こされる疾患である。SOMAVERT登録商標)(ペグビソマント、ヒトGHRアンタゴニスト)について推定される世界市場は、1億6000万米ドルを超える。SOMAVERT(登録商標)は、下垂体腺腫手術不成功終わりソマトスタチンアナログ耐性である患者投与される[1]。SOMAVERT(登録商標)治療の大きな欠点は、それが1日1回の注射(Pfizer)として投与されることである。したがって、GHR遮断剤、例えば、本明細書において提起され、hGHRシグナリング遮断し得るものは、末端肥大症の治療において極めて望ましい。

年齢は、高齢者人口において顕著に増加した癌発生率をもたらす多くのタイプの腫瘍についての主要リスク因子である[2〜4]。多くの癌(78%)は、55以上の者において診断される(情報源:American Cancer Society)。年齢は、化学療法毒性の増加にも関連し、それは、標準化学療法の安定性および効力を限定する[5〜7]。臨床報告において、高齢患者はより多くの骨髄抑制を経験し、多くのタイプの癌において若年患者よりも化学療法関連死のより大きなリスクを有した[6]。このことは、多くの癌が化学療法毒性もより受けやすい高齢者個体において生じることを考慮すると、深刻な問題を提示する。新たな低毒性の薬物が、広く使用される毒性化学療法薬とゆっくりと置き換わり、またはそれに追加されているが、高齢者における毒性を低減させるための介入は、確立されていない[8]。近年、Nature Reviews in Clinical Oncologyにおいて表題“Reducing the toxicity of cancer therapy:recognizing needs,taking action”の論文中に強調されるとおり、選択的宿主/患者保護を目的とする新規方針および薬物の開発は、化学療法治療に伴う副作用を低減させ、治療指数も増加させ得る。これらの薬物は、外因性および内因性毒素から保護するため、それらは、加齢に伴う損傷および疾患、例として、癌、糖尿病および神経変性疾患から保護する潜在性も有する。

2030年までに、米国人口のほぼ20%が、65歳以上の個体からなることが推定される(情報源:cdc.gov)。慢性疾患、例えば、心疾患、癌、アルツハイマー病および糖尿病は、高齢者における最も多い死因である。高齢者成人(65歳以上)間の健康管理コストの約95%は慢性疾患に充当され、それらのコストは、2030年までに25%だけ増加することが予測される(CDC.gov)。したがって、高齢者における生活の質を改善するためだけでなく、健康管理コスト上昇を削減するための老齢人口における慢性健康病態の予防および/または遅延がかなり重視される。

成長ホルモン受容体(GHR)の標的化についての基礎は、以下のとおりである。GH/GHR/IGF−1の遺伝子阻害を引き起こす突然変異は、マウスにおいて寿命の50%ほど多くの増加をもたらす[9〜11]。Prop−1遺伝子におけるホモ接合性Ames矮小突然変異(df/df)は、成長ホルモン甲状腺刺激ホルモン、およびプロラクチンを産生する下垂体前葉細胞の生成を予防する。若齢成体df/dfマウスは、対照マウスのほぼ3分の1サイズであるが、50%を超えてより長く生存する[9]。寿命に対する矮小突然変異のこの効果は、肝細胞からのIGF−1の分泌を刺激する血漿GHの不存在により引き起こされると考えられる[12]。実際、IGF−1は、df/dfマウスの血漿中で大幅に低減する。血漿GH欠損は、長寿命に対するProp−1(Ames矮小)およびPit−1(Snell矮小)突然変異の効果を媒介すると考えられる。それというのも、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)に応答してGHを放出し得ないマウスもより長く生存するためである[12]。さらに、高い血漿GHを有するが、90%低い循環IGF−1を有する矮小マウス(成長ホルモン受容体/GH結合タンパク質ノックマウス、GHRKO)は、それらの野生型リッターメイトよりも長く生存する[10]。まとめると、これらの研究は、血漿IGF−1およびおそらくインスリンの低減が、矮小、GH欠損およびGHR/BPヌルマウスにおける寿命増加の大部分を担うことを示唆する。実際、IGF−1受容体の1コピー欠くマウス(IGF−IR+/−)は、それらの野生型対照よりも33%長く生存する[11]。長寿命の下等真核生物において観察されるとおり、酸化防止酵素スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼ活性は、GHまたはIGF−1に曝露されたネズミ肝細胞において、およびGHを過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて減少する[13、14]。GH/IGF−1軸を欠損する突然変異マウスからの線維芽細胞を用いるインビトロ研究は、種々のタイプのストレス、例として、UV、H2O2、パラコートアルキル化剤、熱、およびカドミウムに対する耐性の増加を示す[15]。ラットにおいて、IGF−1は、細胞ストレス応答ならびにストレス応答タンパク質HSP72およびヘムオキシゲナーゼ発現減衰させる[16]。初代ニューロンにおけるLongoらによる研究は、IGF−1により細胞がRas/Erk依存性機序による酸化ストレス感受性になることを示唆する[17]。Longo実験室およびその他の実験室は、Tor/Sch9(哺乳動物AKTおよびS6Kのホモログ経路の活性またはアデニリルシクラーゼcAMPPKA経路の活性を減少させる突然変異が、酵母における寿命およびストレス耐性をいかに増加させるかを記載している[18〜20]。酸化剤および熱に対する耐性の増加は、例えば、両方の経路の突然変異を有する酵母において1,000倍に達し得る[21]。

近年、アデニリルシクラーゼ5(AC5)遺伝子の欠失によるアデニリルシクラーゼ活性の低減も、マウスにおいて寿命を延長し、酸化ストレスに対する耐性を増加させることが示されており[22]、これはAkt、S6キナーゼおよびcAMP/PKAのホモログを含む経路が、酵母からマウスに及ぶ生物における加齢およびストレス耐性の調節において部分的に保存される役割を担い得ることを示唆する(図2)[23]。グルコースによる酵母Sch9およびRasの活性化と類似して、哺乳動物IGF−1受容体は、Akt/mTOR/S6KおよびRasの両方を活性化させ、グルコース代謝および細胞増殖を調節する[24]。蓄積する証拠は、種々の癌におけるリスク因子としてのIGF−1またはIGF−1シグナリングの増加を示し[25]、これはこの有糸分裂促進経路が加齢ならびにさらには腫瘍形成に必要な損傷および突然変異を促進し得ることを示唆する。

ごく最近、GHRの遺伝子阻害(成長ホルモン受容体欠損(Growth Hormone Receptor Deficient)、GHRD)を有する99人の生存および53人の死亡クアドル人の個体の研究は、GH/IGF−1シグナリングの不存在が、2つの主要な加齢に伴う疾患、癌および糖尿病から保護することを示している[26]。極めて低いIGF−1レベルを有するGHRD個体は、それらの非GHRD相当個体と類似する正常の寿命を有することが考えられる[26]。したがって、薬物介入によるGH/IGF−1シグナリングの阻害は、癌および糖尿病の発生率の低減において、特にそれらの疾患の高い発生率を有する家族において有用である潜在性を有する。先に考察されるとおり、GH/IGF−1シグナリングの阻害は、多くの他の用途:末端肥大症(過剰GH産生)の長期治療[27]、化学毒性からの異なる保護[28]、および虚血再灌流誘導性損傷に関連する酸化ストレス[29]を有する。

近年、GHR−IGF−1シグナリングの阻害が、造血再生(Cheng et al.,Cell Stem Cell 2014)および多重系の幹細胞ベース再生(米国特許出願第20140227373号明細書)を促進することも示されている。さらに、GHRの遺伝子阻害は、部分的には、造血幹細胞依存性再生を引き起こすことにより、化学療法誘導性免疫抑制(図3A)ならびに骨髄および単核末梢血細胞中のDNA損傷(図3B)からマウスを保護する(Cheng et al.,Cell Stem Cell 2014)。GHRの遺伝子阻害が、マウスのゼノグラフト腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を低減させ、そのモデル生存率を向上させることも実証されている(図4)。最後に、Parrellaらは、近年、GH−IGF−1シグナリングの阻害が、アルツハイマー病マウスモデルにおいて加齢依存性の認識機能障害および病状から保護することを示している(Parrella et al.,Aging Cell.2013 Apr;12(2):257−68)。

したがって、GHR−IGF−1シグナリングの阻害に基づく新たな疾患治療プロトコルの開発が必要とされている。

概要

GHR、IGF−1、及びインスリンを含む成長ホルモン又はそれにより調節される遺伝子の活性により引き起こされる疾患又は病態、具体的には、末端肥大症、正常細胞を損傷させる毒素を含む化学療法又は他の治療法、癌、糖尿病、免疫低下、免疫抑制、免疫老化免疫欠損、アルツハイマー病、老化、並びに細胞及び組織再生から利益を受ける疾患及び病態からなる群から選択されることを特徴とする、疾患又は病態を治療するための方法を提供する。成長ホルモン受容体、及び/又は成長ホルモンを標的化するモノクローナル抗体を使用する方法とする。

目的

近年、Nature Reviews in Clinical Oncologyにおいて表題“Reducing the toxicity of cancer therapy:recognizing needs,taking action”の論文中に強調されるとおり、選択的宿主/患者保護を目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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この技術が所属する分野

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請求項1

成長ホルモン活性により引き起こされる疾患または病態治療するための医薬の製造における、成長ホルモン受容体および/または成長ホルモンを標的化する抗体の使用であって、前記疾患または病態が、GHR、IGF−1およびインスリンを含む成長ホルモンまたはそれにより調節される遺伝子の活性により引き起こされることを特徴とする使用。

請求項2

請求項1に記載の使用において、前記抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする使用。

請求項3

請求項1に記載の使用において、前記疾患または病態が、末端肥大症、正常細胞を損傷させる毒素を含む化学療法または他の治療法、癌、糖尿病免疫低下免疫抑制免疫老化免疫欠損アルツハイマー病老化、ならびに細胞および組織再生から利益を受ける疾患および病態からなる群から選択されることを特徴とする使用。

技術分野

0001

配列表
テキストファイルは、2016年2月12日に作成された8KBサイズのusc0138_ST25.txtであり、本明細書とともに提出され、参照により本明細書に組み込まれる。

0002

関連出願の相互参照
本出願は、開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる2015年2月12日に出願された米国仮特許出願第62/115,356号明細書の利益を主張する。

0003

連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する記述
本発明は、National Institute of Healthにより助成された契約番号5P01AGO34906−04のもと政府支援を受けて作製された。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

0004

技術分野
少なくとも一態様において、本発明は、GH、GHR、STAT5、IGF−1および/またはSOCSの、ならびにヒトGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1、およびインスリンにより調節されるタンパク質活性または発現阻害を引き起こすことにより治療または病態を治療するための化合物および方法に関する。

背景技術

0005

末端肥大症は、下垂体腺腫からのGHの過剰分泌により引き起こされる疾患である。SOMAVERT登録商標)(ペグビソマント、ヒトGHRアンタゴニスト)について推定される世界市場は、1億6000万米ドルを超える。SOMAVERT(登録商標)は、下垂体腺腫手術不成功終わりソマトスタチンアナログ耐性である患者投与される[1]。SOMAVERT(登録商標)治療の大きな欠点は、それが1日1回の注射(Pfizer)として投与されることである。したがって、GHR遮断剤、例えば、本明細書において提起され、hGHRシグナリング遮断し得るものは、末端肥大症の治療において極めて望ましい。

0006

年齢は、高齢者人口において顕著に増加した癌発生率をもたらす多くのタイプの腫瘍についての主要リスク因子である[2〜4]。多くの癌(78%)は、55以上の者において診断される(情報源:American Cancer Society)。年齢は、化学療法毒性の増加にも関連し、それは、標準化学療法の安定性および効力を限定する[5〜7]。臨床報告において、高齢患者はより多くの骨髄抑制を経験し、多くのタイプの癌において若年患者よりも化学療法関連死のより大きなリスクを有した[6]。このことは、多くの癌が化学療法毒性もより受けやすい高齢者個体において生じることを考慮すると、深刻な問題を提示する。新たな低毒性の薬物が、広く使用される毒性化学療法薬とゆっくりと置き換わり、またはそれに追加されているが、高齢者における毒性を低減させるための介入は、確立されていない[8]。近年、Nature Reviews in Clinical Oncologyにおいて表題“Reducing the toxicity of cancer therapy:recognizing needs,taking action”の論文中に強調されるとおり、選択的宿主/患者保護を目的とする新規方針および薬物の開発は、化学療法治療に伴う副作用を低減させ、治療指数も増加させ得る。これらの薬物は、外因性および内因性毒素から保護するため、それらは、加齢に伴う損傷および疾患、例として、癌、糖尿病および神経変性疾患から保護する潜在性も有する。

0007

2030年までに、米国人口のほぼ20%が、65歳以上の個体からなることが推定される(情報源:cdc.gov)。慢性疾患、例えば、心疾患、癌、アルツハイマー病および糖尿病は、高齢者における最も多い死因である。高齢者成人(65歳以上)間の健康管理コストの約95%は慢性疾患に充当され、それらのコストは、2030年までに25%だけ増加することが予測される(CDC.gov)。したがって、高齢者における生活の質を改善するためだけでなく、健康管理コスト上昇を削減するための老齢人口における慢性健康病態の予防および/または遅延がかなり重視される。

0008

成長ホルモン受容体(GHR)の標的化についての基礎は、以下のとおりである。GH/GHR/IGF−1の遺伝子阻害を引き起こす突然変異は、マウスにおいて寿命の50%ほど多くの増加をもたらす[9〜11]。Prop−1遺伝子におけるホモ接合性Ames矮小突然変異(df/df)は、成長ホルモン甲状腺刺激ホルモン、およびプロラクチンを産生する下垂体前葉細胞の生成を予防する。若齢成体df/dfマウスは、対照マウスのほぼ3分の1サイズであるが、50%を超えてより長く生存する[9]。寿命に対する矮小突然変異のこの効果は、肝細胞からのIGF−1の分泌を刺激する血漿GHの不存在により引き起こされると考えられる[12]。実際、IGF−1は、df/dfマウスの血漿中で大幅に低減する。血漿GH欠損は、長寿命に対するProp−1(Ames矮小)およびPit−1(Snell矮小)突然変異の効果を媒介すると考えられる。それというのも、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)に応答してGHを放出し得ないマウスもより長く生存するためである[12]。さらに、高い血漿GHを有するが、90%低い循環IGF−1を有する矮小マウス(成長ホルモン受容体/GH結合タンパク質ノックマウス、GHRKO)は、それらの野生型リッターメイトよりも長く生存する[10]。まとめると、これらの研究は、血漿IGF−1およびおそらくインスリンの低減が、矮小、GH欠損およびGHR/BPヌルマウスにおける寿命増加の大部分を担うことを示唆する。実際、IGF−1受容体の1コピー欠くマウス(IGF−IR+/−)は、それらの野生型対照よりも33%長く生存する[11]。長寿命の下等真核生物において観察されるとおり、酸化防止酵素スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼの活性は、GHまたはIGF−1に曝露されたネズミ肝細胞において、およびGHを過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて減少する[13、14]。GH/IGF−1軸を欠損する突然変異マウスからの線維芽細胞を用いるインビトロ研究は、種々のタイプのストレス、例として、UV、H2O2、パラコートアルキル化剤、熱、およびカドミウムに対する耐性の増加を示す[15]。ラットにおいて、IGF−1は、細胞ストレス応答ならびにストレス応答タンパク質HSP72およびヘムオキシゲナーゼの発現を減衰させる[16]。初代ニューロンにおけるLongoらによる研究は、IGF−1により細胞がRas/Erk依存性機序による酸化ストレス感受性になることを示唆する[17]。Longo実験室およびその他の実験室は、Tor/Sch9(哺乳動物AKTおよびS6Kのホモログ経路の活性またはアデニリルシクラーゼcAMPPKA経路の活性を減少させる突然変異が、酵母における寿命およびストレス耐性をいかに増加させるかを記載している[18〜20]。酸化剤および熱に対する耐性の増加は、例えば、両方の経路の突然変異を有する酵母において1,000倍に達し得る[21]。

0009

近年、アデニリルシクラーゼ5(AC5)遺伝子の欠失によるアデニリルシクラーゼ活性の低減も、マウスにおいて寿命を延長し、酸化ストレスに対する耐性を増加させることが示されており[22]、これはAkt、S6キナーゼおよびcAMP/PKAのホモログを含む経路が、酵母からマウスに及ぶ生物における加齢およびストレス耐性の調節において部分的に保存される役割を担い得ることを示唆する(図2)[23]。グルコースによる酵母Sch9およびRasの活性化と類似して、哺乳動物IGF−1受容体は、Akt/mTOR/S6KおよびRasの両方を活性化させ、グルコース代謝および細胞増殖を調節する[24]。蓄積する証拠は、種々の癌におけるリスク因子としてのIGF−1またはIGF−1シグナリングの増加を示し[25]、これはこの有糸分裂促進経路が加齢ならびにさらには腫瘍形成に必要な損傷および突然変異を促進し得ることを示唆する。

0010

ごく最近、GHRの遺伝子阻害(成長ホルモン受容体欠損(Growth Hormone Receptor Deficient)、GHRD)を有する99人の生存および53人の死亡クアドル人の個体の研究は、GH/IGF−1シグナリングの不存在が、2つの主要な加齢に伴う疾患、癌および糖尿病から保護することを示している[26]。極めて低いIGF−1レベルを有するGHRD個体は、それらの非GHRD相当個体と類似する正常の寿命を有することが考えられる[26]。したがって、薬物介入によるGH/IGF−1シグナリングの阻害は、癌および糖尿病の発生率の低減において、特にそれらの疾患の高い発生率を有する家族において有用である潜在性を有する。先に考察されるとおり、GH/IGF−1シグナリングの阻害は、多くの他の用途:末端肥大症(過剰GH産生)の長期治療[27]、化学毒性からの異なる保護[28]、および虚血再灌流誘導性損傷に関連する酸化ストレス[29]を有する。

0011

近年、GHR−IGF−1シグナリングの阻害が、造血再生(Cheng et al.,Cell Stem Cell 2014)および多重系の幹細胞ベース再生(米国特許出願第20140227373号明細書)を促進することも示されている。さらに、GHRの遺伝子阻害は、部分的には、造血幹細胞依存性再生を引き起こすことにより、化学療法誘導性免疫抑制図3A)ならびに骨髄および単核末梢血細胞中のDNA損傷図3B)からマウスを保護する(Cheng et al.,Cell Stem Cell 2014)。GHRの遺伝子阻害が、マウスのゼノグラフト腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を低減させ、そのモデル生存率を向上させることも実証されている(図4)。最後に、Parrellaらは、近年、GH−IGF−1シグナリングの阻害が、アルツハイマー病マウスモデルにおいて加齢依存性の認識機能障害および病状から保護することを示している(Parrella et al.,Aging Cell.2013 Apr;12(2):257−68)。

0012

したがって、GHR−IGF−1シグナリングの阻害に基づく新たな疾患治療プロトコルの開発が必要とされている。

0013

本発明は、少なくとも1つの実施形態において、GH、GHR、STAT5、IGF−1および/またはSOCSの、ならびにヒトGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1、およびインスリンにより調節されるタンパク質の活性または発現の阻害を引き起こすことにより、疾患または病態を治療するための化合物を提供することにより、従来技術の1つ以上の課題を解決する。この実施形態の化合物は、式I:

(式中、
R1は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンであり、
R2は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンである)
を有する。

0014

別の実施形態において、GH、GHR、STAT5、IGF−1および/またはSOCSの、ならびにヒトGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1、およびインスリンにより調節されるタンパク質の活性または発現の阻害を引き起こすことにより、疾患または病態の治療に有用な化合物が提供される。この実施形態の化合物は、式II:

(式中、
R1は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンであり、
R2は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンである)
を有する。

0015

別の実施形態において、GH、GHR、STAT5、IGF−1および/またはSOCSの、ならびにヒトGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1、およびインスリンにより調節されるタンパク質の活性または発現の阻害を引き起こすことにより、疾患または病態の治療に有用な化合物が提供される。この実施形態の化合物は、式III:

(式中、
R1は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンであり、
R2は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンである)
を有する。

0016

別の実施形態において、GH、GHR、STAT5、IGF−1および/またはSOCSの、ならびにヒトGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1、およびインスリンにより調節されるタンパク質の活性または発現の阻害を引き起こすことにより、疾患または病態の治療に有用な化合物が提供される。この実施形態の化合物は、式IV:

(式中、
R1は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンであり、
R2は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンである)
を有する。

0017

有利には、式I〜IVの上記の化合物は、末端肥大症、癌、糖尿病、アルツハイマー病、および老化からなる群から選択される疾患または病態の治療に有用である。化合物および化合物による経路の阻害は、化学療法毒性から保護し、多重系幹細胞ベース再生を促進するため、ならびに幹細胞ベース再生から利益を受ける病態および疾患を治療するためにも有用である(C.W.Cheng et al.Cell Stem Cell,2014;14(6):810DOI:10.1016/j.stem.2014.04.014)。

0018

別の実施形態において、成長ホルモン活性に関連する疾患を治療する方法が提供される。この実施形態において、阻害抗成長ホルモン受容体(GHR)モノクローナル抗体を使用して成長ホルモン(GH)作用および結果的にインスリン成長因子1(IGF−1)活性をインビボで低減させる。ある腫瘍細胞に対するGHおよびIGF−1の成長促進効果のため、ならびにGH/IGF−1シグナリングが哺乳動物老化における役割を担うため、本発明は、a)GHおよび/またはIGF−1依存性腫瘍細胞の成長を減衰/遅延させるため;b)急性ストレス、例えば、正常組織に対する化学療法関連毒性、放射線誘導性細胞毒性、または他の毒性薬物および化合物からの生物レベルの保護を誘導するため;c)既存の化学療法の治療指数を向上させるため;d)加齢に伴う疾患に関連するリスク因子をモジュレートするため;e)老化に関連するバイオマーカーの変化を減衰/遅延させるため;f)多重系幹細胞ベース再生を促進するため;g)糖尿病およびアルツハイマー病の発生率を低減または遅延させ、それらの進行を遅滞させるための抗体ベース薬物を提供する大きな潜在性を有する。

図面の簡単な説明

0019

図1は、高齢者の死因を示す棒チャートを示す(CDC,National Center for Health Statistics,National Vital Statistics System,2007より)。
図2は、類似の経路が酵母およびマウスにおいて長寿命およびストレスに対する耐性を調節することを示す(出典、Longo,2003)。
図3Aは、GHRの遺伝子阻害が、マウスにおいて骨髄(BM)および単核末梢血(PB)細胞を化学毒性から保護することを示す。GHRDマウスおよびそれらの野生型リッターメイト(WT)の末梢血中の総白血球(WBC)およびリンパ球カウント数;それぞれの点は、平均±s.e.mを表し;縦点線は、シクロホスファミド(CP)処理を示し;横点線は、ベースラインレベルを示す;*p<0.05、回復期についての二元ANOVA
図3Bは、GHRノックアウト(GHRKO)マウスおよびそれらの同齢野生型(WT)リッターメイトを、6サイクルのシクロホスファミド(CP)(200mg/kg、腹腔内)により処理したことを示す。6サイクルのCP処理後、骨髄(BM)および単核末梢血(PB)細胞におけるCometアッセイを用いてDNA損傷(オリーブテールモーメント)が計測された。
図4Aは、GHRの遺伝子阻害がマウスのゼノグラフト腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を低減させ、担腫瘍生存率を向上させることを示す。GHRKOマウスおよびそれらの同齢野生型リッターメイト(WT)に、B16Flu黒色腫を皮下接種し、シクロホスファミド(CP)処理(腹腔内、200mg/kg体重、縦点線により示す)に供した。3サイクルのCP処理にわたる腫瘍成長。
図4Bは、GHRKOおよびWTマウスの担腫瘍生存率を示す。GHRの遺伝子阻害は、マウスのゼノグラフト腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を低減させ、担腫瘍生存率を向上させる。GHRKOマウスおよびそれらの同齢野生型リッターメイト(WT)に、B16Flu黒色腫を皮下接種し、シクロホスファミド(CP)処理(腹腔内、200mg/kg体重、縦点線により示す)に供した。
図5Aは、ルシフェラーゼレポーターアッセイにより同定されたリード化合物(#34、37、38)を示す。ヒトGHRを発現するマウスL細胞に、c−fosまたはSOCS2レポータールシフェラーゼプラスミド形質移入した。細胞を血清飢餓状態にし、試験化合物(#34、37、38)とインキュベートし、次いでGHにより処理した。データを同時形質移入されたCMVドライブウミシイタケルシフェラーゼに対して正規化し、相対光単位(RLU)として表現した。(A)c−fosレポータールシフェラーゼ活性
図5Bは、ルシフェラーゼレポーターアッセイにより同定されたリード化合物(#34、37、38)を示す。ヒトGHRを発現するマウスL細胞に、c−fosまたはSOCS2レポータールシフェラーゼプラスミドを形質移入した。細胞を血清飢餓状態にし、次いで試験化合物(#34、37、38)とインキュベートしてからGH処理した。データを同時形質移入されたCMVドライブウミシイタケルシフェラーゼに対して正規化し、相対光単位(RLU)として表現した。(B)SOCS2レポータールシフェラーゼ活性。
図6は、リード化合物が、STAT5リン酸化を阻害することを示す。(A)マウスL細胞を、0.5%の血清中で24時間インキュベートした。細胞を、化合物34、37または38により30分間処理してから5nMのhGHにより処理した。成長ホルモンアンタゴニスト(GHA)を陽性対照として使用した。
図7は、GHR阻害剤の同定のためのハイスループットスクリーニングHTS)プラットフォームを示す。ヒトGHRを発現するマウスL細胞に、SOCS2レポータールシフェラーゼプラスミドを形質移入した。細胞を血清飢餓状態にし、試験化合物(示されるとおりの番号付与)により前処理し、次いでGH処理した。データをCMVウミシイタケルシフェラーゼに対して正規化し、相対光単位(RLU)として表現した。
図8Aは、マウス成長ホルモン受容体タンパク質配列を示す。配列番号1を示す:残基1〜24(イタリック)、シグナルペプチド;残基25〜264(下線)、GH結合タンパク質;残基274〜297(太字)、膜貫通ドメイン
図8Bは、エピトープ選択のためのマウス成長ホルモン受容体の構造分析を示す。エピトープスコアは、専有アルゴリズムにより決定した。
図9Aは、ヒト成長ホルモン(GH)と、その可溶性結合タンパク質(GHBP)との複合体を示す(PDB−1HWG、PyMOLにより可視化)。A)5つの選択エピトープ(ヒト相同領域)の表面プロット
図9Bは、5つの選択エピトープのリボンプロットを示す。暗青色:GH;緑色、GHBP;紫色(C562)、淡褐色(C570)、赤色(C592)、白色(C576)および青緑色(C565)の陰影領域は、モノクローナル抗体により標的化される選択エピトープを示す。ヒトGH−GHR複合体結晶構造のみが利用可能であるため、強調領域は選択マウスGHRエピトープのヒト相当領域であることに留意されたい。
図9Cは、モノクローナルGHR抗体(C592)が、膜結合GHRを特異的に認識することを示す(矢印により示す)。
図9Dは、高濃度のモノクローナル抗GHR抗体(C592)処理は、GHRクラスター化およびエンドサイトーシスをもたらすことを示す(矢印により示す)。
図10は、図8および9の実験において使用されたモノクローナル抗体およびそれらの標的エピトープを示す。
図11Aは、GHRに対するアンタゴニストおよびアゴニストモノクローナル抗体のスクリーニングを示す。A)マウスL細胞を、80〜90%のコンフルエンシーに培養した。次いで、細胞を、低グルコース(0.5g/L)および低FBS(0.5%)を有するDMEMに24時間交換した。細胞を、モノクローナル抗体(連続番号により示す)と1時間インキュベートし、次いで5nMの成長ホルモン(GH)により5分間処理し、ウエスタンブロットによりSTAT5リン酸化についてアッセイした。STAT5リン酸化レベルを総STAT5に対して正規化し、データを抗体非処理の割合として示す。
図11Bは、モノクローナル抗体C592によるSTAT5のGH誘導性リン酸化の下方調節を示す。
図12Aは、本出願に記載の新規阻害成長ホルモン抗体を発現するマウスが化学療法から保護されたことを示す。4週齢CD1雄(M)および雌(F)マウスを、ヒトGHにより免疫化し、10週目ブースター用量を注射した。A)マウスは対照と比較して体重損失を示し、これは、それらがマウスGHと交差反応し、次いで成長を減速させる抗ヒトGH抗体を生成したことを示す。
図12Bは、免疫化マウスからの血清スロットプロット分析が、40匹のマウスのうち34匹においてヒトGHに対する反応性を示し、抗体が生成されたことを裏付けたことを示す。
図12Cは、ヒトGH免疫化のブースター用量を6ヵ月において与え、次いで示されるとおりシクロホスファミド(CP)により処理されたGH免疫化マウスが、対照(非免疫化)よりも良好に体重を回復し得たことを示す。
図12Dは、完全血球算定も、GH免疫化マウスがシクロホスファミド(CP)処理7日後により良好な血球プロファイルを示したことを示したことを示す。

実施例

0020

目下、詳細に、本発明者らに現在公知の本発明の最良実施方式を構成する現在好ましい本発明の組成物、実施形態、および方法が参照される。図面は、必ずしも一定の縮尺でない。しかしながら、開示される実施形態は、種々のおよび代替形態で具体化することができる本発明の単なる例示であることを理解すべきである。したがって、本明細書において開示される具体的な詳細は、限定するものとして解釈すべきではなく、本発明の任意の態様についての単に代表的な基礎として、および/または本発明を種々に用いるための当業者への教示のための代表的な基礎として解釈すべきである。

0021

実施例を除き、または特に明記される場合を除き、材料または反応の状態および/または使用の量を示すこの詳細な説明における全ての数値量は、本発明の最も広い範囲の記載における語「約」により修飾されるものとして理解すべきである。記述される数値限界内の実施が、一般に、好ましい。また、逆の内容が明記されない限り、パーセント、「の一部」、および比の値は、重量基準であり;「R」基としては、H、C1〜10アルキル、C2〜10アルケニル、C6〜14アリール(例えば、フェニルハロ、またはC4〜14ヘテロアリールが挙げられ;本発明に関連する所与の目的に好適な、または好ましい材料の群またはクラスの記載は、その群またはクラスのメンバーの任意の2つ以上の混合物が等しく好適または好ましいことを意味し;化学用語中の構成要素の記載は、その記載に規定される任意の組合せへの追加時の構成要素を指し、必ずしも、一度混合された混合物の構成要素間の化学的相互作用を除外せず;頭字語および他の略語の最初の定義は、同一の略語の本明細書における全ての後続の使用に当てはまり、変更すべき箇所は変更し、最初に定義される略記の通常の文法的変形に当てはまり;逆の内容が明記されない限り、特性の計測は、同一の特性について既に参照された、または後に参照されるものと同一の技術により決定される。

0022

本発明は、規定の構成成分および/または条件は、無論、変動し得るため、下記の具体的な実施形態および方法に限定されないことも理解すべきである。さらに、本明細書において使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためにのみ使用され、決して限定するものではない。

0023

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうでないことを明示しない限り、複数の参照対象を含むことも留意しなければならない。例えば、単数形の構成成分への言及は、複数の構成成分を含むものとする。

0024

本出願全体にわたり、刊行物が参照される場合、それらの刊行物の開示は、本発明が関する技術水準をより十分に記載するために全体として、参照により本出願中に組み込まれる。

0025

用語「対象」は、ヒトまたは動物、例として、全ての哺乳動物、例えば、霊長類(特に高等霊長類)、ヒツジイヌげっ歯類(例えば、マウスまたはラット)、モルモットヤギブタネコウサギ、およびウシを指す。

0026

略語:
AKT、V−Aktネズミ胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ、プロテインキナーゼB。
B16Flu、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するB16マウス悪性黒色腫細胞
BM、骨髄。
cAMP、環状アデノシン一リン酸
CMV、サイトメガロウイルス初期プロモーター。
CP、シクロホスファミド。
df/df、Ames矮小。
DNA、デオキシリボ核酸
ERK、細胞外シグナル調節キナーゼ。
FBS、ウシ胎仔血清。
GH、成長ホルモン。
GHA、成長ホルモンアンタゴニスト。
GHR、成長ホルモン受容体。
GHR/BP、成長ホルモン受容体/成長ホルモン結合タンパク質。
GHRD、成長ホルモン受容体欠損。
GHRH、成長ホルモン放出ホルモン。
GHRKO、成長ホルモン受容体ノックアウト。
HEK293、ヒト胚性腎細胞293。
hGH、ヒト成長ホルモン。
HSP72、熱ショックタンパク質72。
IGF−1、インスリン様成長因子1。
IGF−IR、IGF−1受容体。
MEK、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ。
PB、末梢血。
BMC末梢血単核細胞
Pit−1、POUドメイン、クラス1、転写因子1。
PKA、プロテインキナーゼA
Prop−1、Pit1のプロフェット(Prophet Of Pit1)。
RAS、ラット肉腫
RLU、相対光単位。
S6K、リボソームタンパク質S6キナーゼ。
Sch9、セリントレオニン−プロテインキナーゼSCH9。
SOCS、サイトカインシグナリングのサプレッサー(Suppressor of cytokine signaling)。
STAT5、転写シグナルトランスデューサーおよびアクチベーター5(Signal Transducer and Activator of Transcription 5)。
Tor、ラパマイシンの標的(Target of rapamycin)。
UV、紫外線
WBC、白血球。
WT、野生型。

0027

本発明の種々の実施形態において、種々の疾患、病態、および治療の症状を緩和するための化合物および方法が提供される。特に、これらの化合物および方法は、末端肥大症、正常細胞を損傷させる毒素を含む化学療法または他の治療法、癌、糖尿病、免疫低下、免疫抑制、免疫老化免疫欠損、アルツハイマー病、老化、ならびに細胞および組織再生から利益を受ける疾患および病態を治療するために使用することができる。典型的には、本発明の化合物および方法は、GH、GHR、STAT5、IGF−1および/またはSOCSの、ならびにヒトGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1、およびインスリンにより調節されるタンパク質の発現(または過剰発現)に関連し、またはそれにより引き起こされる疾病を治療するために使用される。

0028

本発明は、少なくとも1つの実施形態において、GH、GHR、STAT5、IGF−1および/またはSOCSの、ならびにヒトGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1、およびインスリンにより調節されるタンパク質の活性または発現の阻害を引き起こすことにより、疾患または病態を治療するための化合物を提供することにより、従来技術の1つ以上の課題を解決し、それが提供される。この実施形態の化合物は、式I:

またはその薬学的に許容可能な塩
(式中、
R1は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンであり、
R2は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンである)を有する。改良形態において、R1およびR2は、それぞれ独立して、水素、メチルエチル、n−プロピルイソプロピルn−ブチル、sec−ブチルイソブチル、t−ブチル、またはフェニルである。

0029

別の実施形態において、GH、GHR、STAT5、IGF−1および/またはSOCSの、ならびにヒトGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1、およびインスリンにより調節されるタンパク質の活性または発現の阻害を引き起こすことにより、疾患または病態の治療に有用な化合物が提供される。この実施形態の化合物は、式II:

またはその薬学的に許容可能な塩
(式中、
R1は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンであり、
R2は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンである)を有する。改良形態において、R1およびR2は、それぞれ独立して、水素、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、t−ブチル、またはフェニルである。

0030

別の実施形態において、GH、GHR、STAT5、IGF−1および/またはSOCSの、ならびにヒトGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1、およびインスリンにより調節されるタンパク質の活性または発現の阻害を引き起こすことにより、疾患または病態の治療に有用な化合物が提供される。この実施形態の化合物は、式III:

またはその薬学的に許容可能な塩
(式中、
R1は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンであり、
R2は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンである)を有する。改良形態において、R1およびR2は、それぞれ独立して、水素、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、t−ブチル、またはフェニルである。

0031

別の実施形態において、GH、GHR、STAT5、IGF−1および/もしくはSOCSの、ならびに/またはヒトGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1、およびインスリンにより調節されるタンパク質の活性または発現の阻害を引き起こすことにより、疾患または病態の治療に有用な化合物が提供される。この実施形態の化合物は、式IV:

またはその薬学的に許容可能な塩
(式中、
R1は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲンであり、
R2は、水素、NO2、SO3H、NH3、C1〜8アルキル、またはハロゲン)を有する。改良形態において、R1およびR2は、それぞれ独立して、水素、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、t−ブチル、またはフェニルである。

0032

さらに別の実施形態において、式I〜IVの上記の化合物は、末端肥大症、癌、糖尿病、アルツハイマー病、および老化からなる群から選択される疾患または病態を治療するために使用される。化合物および化合物による経路の阻害は、化学療法毒性から保護し、多重系幹細胞ベース再生を促進するためにも有用である(C.W.Cheng et al.Cell Stem Cell,2014;14(6):810DOI:10.1016/j.stem.2014.04.014)。これに関して、ヒトGH、GHR、STAT5、およびSOCSに関するシグナリング遺伝子の変更により、治療または病態を治療する方法が提供される。これに関して、用語「〜に関する」は、シグナリング遺伝子がGH、GHR、STAT5、およびSOCSの発現をもたらす一部またはシグナリング経路であることを意味する。これは、シグナリング遺伝子またはそれらがコードするタンパク質が、ヒトGH、GHR、STAT5、およびSOCSに関し、または寄与する疾患または病態を有する対象を同定するステップを含む。式I〜IVを有する化合物およびそれらの組合せからなる群から選択される治療有効量の化合物が、対象に投与される。

0033

上記化合物は、末端肥大症、癌、糖尿病、アルツハイマー病、または老化の症状が緩和されるような治療有効量で対象に投与される。改良形態において、このような量は、一般に、使用される規定の化合物およびGH、GHR、STAT5、SOCS、IGF−1およびインスリンの活性または発現に対するその効果に応じて対象の体重1kg当たり約0.1〜約300mgである。典型的な用量は、正常体重の成体対象について1日当たり約1〜約5000mgである。

0034

本発明の化合物は、有機および無機の酸または塩基の両方との薬学的に許容可能な塩を形成し得る。例えば、塩基性化合物酸付加塩は、適切な酸を含有する水溶液または水性アルコール溶液または他の好適な溶媒中で遊離塩基を溶解させ、その溶液蒸発させることにより塩を単離することにより調製される。薬学的に許容可能な塩の例は、塩酸塩臭化水素酸塩硫酸塩など、ならびにナトリウムカリウム、およびマグネシウムなどの塩である。式I〜IVを有する化合物は、1つまたはいくつかの不斉炭素原子を含有し得る。本発明は、個々のジアステレオマーまたはエナンチオマー、およびそれらの混合物を含む。個々のジアステレオマーまたはエナンチオマーは、当技術分野において既に周知の方法により調製または単離することができる。

0035

医薬組成物は、上記化合物またはしたがって塩および医薬担体を含む。典型的には、医薬組成物は、投与単位に分割される。単位剤形の例としては、限定されるものではないが、ピル散剤錠剤カプセル剤水性および非水経口液剤および懸濁液、および非経口液剤が挙げられる。

0036

好適な医薬担体の例としては、限定されるものではないが、水、糖(例えば、ラクトースおよびスクロース)、デンプン(例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン)、セルロース誘導体(例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、およびメチルセルロース)、ゼラチンタルクステアリン酸ステアリン酸マグネシウム植物油(例えば、ピーナッツ油綿実油ゴマ油オリーブ油など)、プロピレングリコールグリセリンソルビトールポリエチレングリコール、水、寒天アルギン酸生理食塩水、および他の薬学的に許容可能な材料が挙げられる。

0037

医薬組成物中の活性成分の割合は、広範囲内で変えることができる。一改良形態において、固体組成物中の少なくとも10%および主な液体組成物中の少なくとも2%の濃度が使用される。最も有益な組成物は、かなり高い割合の活性成分が存在するより高い割合の活性剤を有する。

0038

主題化合物またはその塩の投与経路は、経口または非経口である。例えば、有用な静脈内用量は、1〜50mgであり、有用な経口投与量は、5〜800mgである。

0039

さらに別の実施形態において、成長ホルモン活性に関し、またはそれにより引き起こされる疾患を治療する方法が提供される。成長ホルモンまたはそれにより調節される遺伝子、例として、GHR、IGF−1およびインスリンの活性により引き起こされる疾患または病態を有する対象を同定する。成長ホルモン受容体および/または成長ホルモンを標的化する治療有効量の抗体を、対象に投与する。この実施形態において、阻害抗成長ホルモン(抗GH)または抗成長ホルモン受容体(抗GHR)モノクローナル抗体を使用して成長ホルモン(GH)作用ならびに結果的に、インスリン成長因子1(IGF−1)およびインスリン活性を低減させる。ある腫瘍細胞に対するGHおよびIGF−1の成長促進効果のため、ならびにGH/IGF−1シグナリングは哺乳動物老化における重要な役割を担うため、本発明は、a)GHおよび/またはIGF−1依存性腫瘍細胞の成長を減衰/遅延させるため;b)急性ストレス、例えば、正常組織に対する化学療法または癌治療法関連毒性、放射線誘導性細胞毒性、または他の毒性薬物および化合物からの生物レベルの保護を誘導するため;c)既存の化学療法および癌治療法の治療指数を向上させるため;d)加齢に伴う疾患に関連するリスク因子をモジュレートするため;e)老化に関連するバイオマーカーの変化を減衰/遅延させるため;f)多重系幹細胞ベース再生を促進するため;g)アルツハイマー病の発生率を低減または遅延させ、およびそれらの進行を遅滞させるための抗体ベース薬物を提供する大きな潜在性を有する。

0040

以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を説明する。当業者は、本発明の主旨および特許請求の範囲の範囲内の多くの変形例を認識する。

0041

アッセイ手順:以下のアッセイを使用して活性についてスクリーニングした:1.STAT5リン酸化アッセイおよび2.ルシフェラーゼレポーターアッセイ。

0042

JAK/STATシグナリング経路は、種々の成長因子およびサイトカインのための主要なシグナリング機序である。成長ホルモンシグナリング経路において、GH結合に応答するGHRの二量体化は、リン酸転移によりJAKの活性化をもたらす。活性化JAKはSTAT5をリン酸化し、次いでそれが核に流入し、標的遺伝子の転写を活性化させ得る。STAT5リン酸化の阻害を使用して試験化合物のGHRアンタゴニスト特性を分析する。

0043

マウスGHRを発現するように遺伝子操作されたマウスL線維芽細胞を、John Kopchick博士から入手した。血清飢餓L細胞(0.5%FBS、24時間)を、ルシフェラーゼアッセイからヒットとして同定された10μMのそれぞれの化合物により30分間前処理した。この後、細胞を5または10nMのhGHにより10分間処理した。細胞を回収し、ホスホ−STAT5および総STAT5抗体(Cell Signaling)を用いるウエスタンブロットのために処理した。GHRアンタゴニストのG120Kを、陽性対照として使用する。バンド強度はImageJを使用して分析し、STAT5リン酸化は総STAT5レベルに対して正規化した。STAT5リン酸化を阻害した化合物を、さらなる薬物最適化のために選択した。

0044

GHRの阻害剤についてのハイスループットスクリーニング(HTS)を実施するため、永久的に形質移入されたHEK293細胞系を、c−fosまたはSOCS2プロモーターのいずれかによりドライブされるルシフェラーゼレポーターを用いて樹立した(図7)。

0045

SOCS(サイトカインシグナリングのサプレッサー)タンパク質は、GHにより誘導され、サイトカインシグナリング経路の負の調節因子として作用する[30、31]。癌原遺伝子c−fosの発現も、Ras/MEK/ERK経路を介してGHにより誘導される[32]。ルシフェラーゼ遺伝子がSOCS2またはc−fosのいずれかのプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーター構築物は、ヒト胚性腎臓HEK293細胞中に安定的に形質移入された。細胞を24時間血清飢餓状態(0.5%FBS)にして他の成長因子による妨害を防止し、次いで5または10nMのhGH(用量応答試験において確立した)および10μMのそれぞれの試験化合物により24時間処理した。この後、溶解させ、ルシフェラーゼレポーターアッセイ(Promega)を使用してルシフェラーゼ活性を分析する。それぞれの化合物は、96ウェルプレートフォーマット三つ組で試験する。

0046

本発明者らの初回スクリーニングプロセスを使用してGH−GHRシグナリングを阻害する3つの潜在的リード化合物を同定した(DSR34、37および38)(図5AおよびB)。図5は、3つの化合物、DSR34、37および38についてのルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。3つ全ての化合物が、c−fosおよびSOCS2レポーター活性のGH誘導性増加を阻害した(図5AおよびB)。さらに、化合物は、レポーター活性を未処理対照の活性未満に阻害し得、化合物34、37および38について、それぞれ、c−fosレポーター活性は、未処理対照の57%、27%および46.5%である一方、SOCS2レポーター活性は、未処理対照の76%、61%および57%である。これらの化合物を、ヒトGHRを発現するマウスL細胞におけるSTAT5のGH誘導性リン酸化を阻害するそれらの能力についても試験した(図6)。3つ全ての化合物は、STAT5のリン酸化を阻害し得る(図6)。これらの化合物をさらに最適化し、以下に示される追加のリード(化合物22)を生成した(図7)。

0047

化合物22、34、37、および38の構造は、以下のとおりである:


またはそれらの薬学的に許容可能な塩。

0048

抗GH抗体を使用するGHの阻害によるGH/IGF−1シグナリングの低減が、マウスを化学療法毒性からも保護するか否かを試験するため、マウス成長ホルモンに対する抗体を生成した。4週齢CD1雄および雌マウスをヒトGHにより免疫化し、ブースター用量を10週において注射した。マウスは、対照と比較して体重損失を示し、これは、それらがマウスGHと交差反応し、次いで成長を減速させる抗ヒトGH抗体を生成したことを示す(図12A)。免疫化マウスからの血清のスロット−ブロット分析は、34匹/40匹のマウスにおいてhGHとの反応性を示し、抗体が生成されたことを裏付けた(図12B)。hGHのブースター用量を6ヵ月において与え、次いで示されるとおりシクロホスファミド(CP)により処理されたマウスは、対照よりも良好に体重を回復し得た(図12C)。完全血球算定も、それらのマウスがCP毒性に対してより耐性であることを示した(図12D)。STIは、短期免疫化を示す。

0049

マウスGHR細胞外ドメインの種々の領域に対するモノクローナル抗体が、開発された。成長ホルモンは、成長ホルモン受容体ホモ二量体に非対称に結合し、互いに対するGHRサブユニットの回転をもたらす。GH−GHR結合の現在の理解は、この受容体二量体立体構造変化が膜貫通ドメインを介して伝播し、下流のチロシンキナーゼへのシグナル伝達をもたらすことを示唆する。エピトープ局在および結合親和性に応じて、モノクローナル抗体の結合は、GHRに対する刺激または阻害効果のいずれかをもたらす受容体立体構造変化、凝集、およびタンパク質−タンパク質相互作用変更をもたらし得る(図11参照)。例えば、モノクローナル抗体C562は、GH結合部位近接し、したがって、リガンド受容体相互作用を妨害するGHRのN末端領域(図9および10、標的ペプチド−配列番号2:TEGDNPDLKTPG、薄紫色陰影部)を標的化し;モノクローナル抗体C565は、GHRに、GHRサブユニットの二量体およびGH結合後のサブユニットの再配向の両方を妨害し得る領域(図9および10、標的ペプチド−配列番号3:ESKWKVMGPIWL、水色陰影部)中で結合し;モノクローナル抗体C592は、GHR細胞外ドメインの「ヒンジ」中に位置するGHR領域(図9および10、標的ペプチド−配列番号6:TVDEIVQPDPPI、赤色陰影部)を標的化する。C592結合は、GH結合を妨害し、GHRクラスター化、エンドサイトーシスおよび分解を促進し得る(図9CおよびD)。これらのアンタゴニストおよびアゴニストモノクローナル抗体およびそれらの誘導体(例えば、Fab、F(ab’)2調製物)は、インビボでのGH−GHR作用のモジュレーションにおける強力な治療剤であり得た。したがって、GHRに結合してその活性に影響する新規および有効な抗体が、記載された。

0050

例示的な実施形態が上記される一方、それらの実施形態は、考えられる全ての本発明の形態を記載するものではない。むしろ、本明細書において使用される語は、限定ではない記載の語であり、本発明の主旨および範囲から逸脱せずに種々の変形を行うことができることが理解される。さらに、種々の実行実施形態の特徴部を組み合わせて本発明のさらなる実施形態を形成することができる。

0051

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