図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2021年4月22日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題

ヒトλ可変領域およびマウス定常領域を含む軽鎖発現するマウスの提供。

解決手段

ヒトλ可変(hVλ)配列を発現する遺伝的に改変されたマウス(内在性マウスλ軽鎖遺伝子座からhVλ配列を発現するマウス、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座からhVλ配列を発現するマウス、および導入遺伝子またはエピソームからhVλ配列を発現するマウスを含む)が提供され、ここで、そのhVλ配列は、マウス定常配列に接続されている。抗原結合タンパク質の作製に有用な体細胞変異したヒトλ可変配列の起源となるマウスが提供される。ヒト抗体を含むヒトλ可変配列を含む抗原結合タンパク質を作製するための組成物および方法が提供される。

概要

背景

背景
完全にヒトの抗体、または部分的にヒトの抗体でありかつ部分的にマウスの抗体である抗体を発現するマウスが、当該分野で公知である。例えば、ヒト軽鎖および重鎖免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現するトランスジェニックマウスが、報告されている。同様に、ヒト重鎖可変領域(HCVR)および軽鎖可変領域(LCVR)遺伝子セグメントによる内在性マウスHCVR遺伝子セグメントおよびカッパーκ)LCVR遺伝子セグメントの置換を含み、キメラヒト/マウスカッパー鎖を有するキメラ抗体を産生する、遺伝的に改変されたマウスも公知である。

抗体軽鎖は、2個の別個遺伝子座:カッパー(κ)およびラムダ(λ)のうちの1つによってコードされる。マウス抗体軽鎖は、主にκタイプである。ヒトにおけるκとλの軽鎖の使用比は、約60:40であり、一方マウスでは、約95:5である。報告によると、マウスでのκ軽鎖に偏った使用頻度(usage)は、完全ヒト抗体または部分ヒト抗体を発現することができる遺伝的に改変されたマウスにおいても維持される。したがって、完全ヒト抗体または部分ヒト抗体を発現するマウスは、ラムダ可変の使用が抑制されているとみられる。

概要

ヒトλ可変領域およびマウス定常領域を含む軽鎖を発現するマウスの提供。ヒトλ可変(hVλ)配列を発現する遺伝的に改変されたマウス(内在性マウスλ軽鎖遺伝子座からhVλ配列を発現するマウス、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座からhVλ配列を発現するマウス、および導入遺伝子またはエピソームからhVλ配列を発現するマウスを含む)が提供され、ここで、そのhVλ配列は、マウス定常配列に接続されている。抗原結合タンパク質の作製に有用な体細胞変異したヒトλ可変配列の起源となるマウスが提供される。ヒト抗体を含むヒトλ可変配列を含む抗原結合タンパク質を作製するための組成物および方法が提供される。A

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

図面に記載の発明。

技術分野

0001

分野
マウスまたはヒト軽鎖定常領域(λまたはカッパーκ))と作動可能に接続されたマウスまたはヒトラム可変(Vλ)軽鎖配列を含む遺伝的に改変されたマウス。ヒトラムダ可変(hVλ)遺伝子セグメント、ヒトラムダJ(hJλ)遺伝子セグメントに由来する可変ドメインおよびマウス軽鎖定常(CL)ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を含むエピトープ結合タンパク質発現する遺伝的に改変されたマウス。内在性マウス軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンラムダ(λ)軽鎖可変核酸配列を含む遺伝的に改変されたマウス。1つ以上のhVλ遺伝子セグメントおよび1つ以上のhJλ遺伝子セグメントによるすべての内在性マウス軽鎖可変領域遺伝子セグメント置換を含む内在性軽鎖遺伝子座からキメラヒトλ/マウスCL軽鎖を再配列し、発現することができるマウス。hVλドメインおよびマウスCLドメインを含む体細胞変異した抗体。

背景技術

0002

背景
完全にヒトの抗体、または部分的にヒトの抗体でありかつ部分的にマウスの抗体である抗体を発現するマウスが、当該分野で公知である。例えば、ヒト軽鎖および重鎖免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現するトランスジェニックマウスが、報告されている。同様に、ヒト重鎖可変領域(HCVR)および軽鎖可変領域(LCVR)遺伝子セグメントによる内在性マウスHCVR遺伝子セグメントおよびカッパー(κ)LCVR遺伝子セグメントの置換を含み、キメラヒト/マウスカッパー鎖を有するキメラ抗体を産生する、遺伝的に改変されたマウスも公知である。

0003

抗体軽鎖は、2個の別個の遺伝子座:カッパー(κ)およびラムダ(λ)のうちの1つによってコードされる。マウス抗体軽鎖は、主にκタイプである。ヒトにおけるκとλの軽鎖の使用比は、約60:40であり、一方マウスでは、約95:5である。報告によると、マウスでのκ軽鎖に偏った使用頻度(usage)は、完全ヒト抗体または部分ヒト抗体を発現することができる遺伝的に改変されたマウスにおいても維持される。したがって、完全ヒト抗体または部分ヒト抗体を発現するマウスは、ラムダ可変の使用が抑制されているとみられる。

発明が解決しようとする課題

0004

当該分野では、マウスであってもヒトであっても、エピトープ結合タンパク質を作製する際に使用するために、ラムダ可変領域を作製することが必要とされている。当該分野では、高いラムダ可変(Vλ)使用頻度を示す、完全ヒト抗体または部分ヒト抗体を発現するマウスが必要とされている。

0005

当該分野では、高いλ可変(Vλ)使用頻度を示す、完全ヒト抗体または部分ヒト抗体を発現するマウスが必要とされている。

課題を解決するための手段

0006

要旨
遺伝的に改変されたマウス、細胞組織ならびにマウスを改変するための核酸構築物、ならびにそれらを作製するためおよび使用するための方法および組成物が提供される。カッパー(κ)軽鎖という背景においてラムダ(λ)可変領域(ヒトまたは非ヒト)を産生するマウスおよび細胞が提供される。例えば、内在性マウス軽鎖遺伝子座から、κまたはλ軽鎖という背景においてヒトλ可変領域を産生するマウスおよび細胞も提供される。ラムダ可変領域を含む抗体を作製するための方法も提供される。同族のラムダ可変領域とともに発現する重鎖を選択するための方法も提供される。

0007

体細胞変異した可変領域を含むキメラおよびヒト抗原結合タンパク質(例えば、抗体)(マウス軽鎖定常ドメインに融合されたヒトVλおよびヒトJλ遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む軽鎖を有する抗体を含む)およびそれらをコードする核酸が提供される。

0008

1つの態様において、マウス定常領域を含む軽鎖においてヒトλ可変領域配列を発現するマウスが提供される。1つの態様において、κ定常領域を含む軽鎖においてヒトλ可変領域配列を発現するマウスが提供される。1つの態様において、内在性マウス軽鎖遺伝子座から、ヒトλ可変領域配列を含む軽鎖を発現するマウスが提供される。1つの態様において、マウス定常領域配列に接続されたヒトλ可変配列を含む再配列された軽鎖遺伝子を含むマウスが提供され;1つの実施形態において、そのマウス定常領域配列は、λ定常配列であり;1つの実施形態において、そのマウス定常領域配列は、κ定常配列である。

0009

1つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、再配列されていないヒトλ軽鎖可変遺伝子セグメント(hVλ)およびヒトλ連結遺伝子セグメント(hJλ)を含む。1つの実施形態において、その再配列されていないhVλおよびhJλは、マウス軽鎖遺伝子座に存在する。1つの実施形態において、その再配列されていないhVλおよび再配列されていないhJλは、導入遺伝子上に存在し、ヒトまたはマウス定常領域配列に作動可能に接続されている。1つの実施形態において、その再配列されていないhVλおよび再配列されていないhJλは、エピソーム上に存在する。1つの実施形態において、そのマウスは、再配列されていないhVλ配列およびhJλ配列ならびにマウス軽鎖定常領域(CL)核酸配列に由来する軽鎖を含む免疫グロブリンを産生することができる。遺伝的に改変されたマウスを作製するためおよび使用するための方法および組成物も提供される。(a)マウス重鎖定常領域に融合されたヒト重鎖可変ドメイン(hVH)、および(b)マウスCLドメインに融合されたヒトVλを含む抗体が提供され、ここで、例えば、本発明のマウスにおける抗体または免疫細胞の選択中に、それらの可変ドメインの1つ以上が体細胞変異したものも含まれる。1つの実施形態において、再配列されていないhVλおよび再配列されていないhJλは、ヒトまたはマウスκ定常領域(Cκ)と作動可能に接続される。1つの実施形態において、その再配列されていないhVλおよび再配列されていないhJλは、ヒトまたはマウスλ定常領域(Cλ)と作動可能に接続される。

0010

1つの態様において、生殖細胞系列において内在性マウス軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖可変領域配列を含むマウスが提供され、ここで、そのヒトラムダ可変領域配列は、マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子配列を含む軽鎖において発現される。

0011

1つの実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、λ遺伝子座である。1つの実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。

0012

1つの実施形態において、上記マウスは、内在性マウス軽鎖遺伝子座において内在性軽鎖可変配列を欠く

0013

1つの実施形態において、すべてまたは実質的にすべての内在性マウス軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、1つ以上のヒトλ可変領域遺伝子セグメントで置換される。

0014

1つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、ヒトJλ配列を含む。1つの実施形態において、そのヒトJλ配列は、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。

0015

1つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、ヒト軽鎖遺伝子座のクラスターAのフラグメントを含む。特定の実施形態において、そのヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターAのフラグメントは、hVλ3−27からhVλ3−1にわたる。

0016

1つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、ヒト軽鎖遺伝子座のクラスターBのフラグメントを含む。特定の実施形態において、そのヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターBのフラグメントは、hVλ5−52からhVλ1−40にわたる。

0017

1つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、クラスターAのゲノムフラグメントおよびクラスターBのゲノムフラグメントを含む。1つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、クラスターAの少なくとも1つの遺伝子セグメントおよびクラスターBの少なくとも1つの遺伝子セグメントを含む。

0018

1つの実施形態において、上記マウスの軽鎖ナイーブレパートリーの10%超が、2−8、2−23、1−40、5−45および9−49から選択される少なくとも2つのhVλ遺伝子セグメントに由来する。1つの実施形態において、上記マウスの軽鎖ナイーブレパートリーの20%超が、2−8、2−23、1−40、5−45および9−49から選択される少なくとも3つのhVλ遺伝子セグメントに由来する。1つの実施形態において、上記マウスの軽鎖ナイーブレパートリーの30%超が、2−8、2−23、1−40、5−45および9−49から選択される少なくとも4つのhVλ遺伝子セグメントに由来する。

0019

1つの態様において、マウス定常領域と融合されたヒトλ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスが提供され、ここで、そのマウスは、約1:1というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す。

0020

1つの実施形態において、その免疫グロブリン軽鎖は、内在性マウス軽鎖遺伝子座から発現される。

0021

1つの態様において、マウスκ軽鎖定常領域配列と連続する、λ軽鎖可変領域配列(Vλ)および少なくとも1つのJ配列(J)を含むマウスが提供される。

0022

1つの実施形態において、そのマウスは、機能的なマウスVκおよび/またはマウスJκ遺伝子セグメントを欠く。

0023

1つの実施形態において、そのVλは、ヒトVλ(hVλ)であり、そのJは、ヒトJλ(hJλ)である。1つの実施形態において、そのhVλおよびhJλは、再配列されていない遺伝子セグメントである。

0024

1つの実施形態において、上記マウスは、複数の再配列されていないhVλ遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのhJλ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、その複数の再配列されていないhVλ遺伝子セグメントは、少なくとも12個の遺伝子セグメント、少なくとも28個の遺伝子セグメントまたは少なくとも40個の遺伝子セグメントである。

0025

1つの実施形態において、その少なくとも1つのhJλ遺伝子セグメントは、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。

0026

1つの実施形態において、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座は、全体的にまたは部分的に欠失される。

0027

1つの実施形態において、マウスκ軽鎖定常領域配列は、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に存在する。

0028

1つの実施形態において、上記マウスのB細胞の約10%〜約45%は、ヒトλ軽鎖可変(Vλ)ドメインおよびマウスκ軽鎖定常(Cκ)ドメインを含む軽鎖を含む抗体を発現する。

0029

1つの実施形態において、そのヒトλ可変ドメインは、3−1/1、3−1/7、4−3/1、4−3/7、2−8/1、3−9/1、3−10/1、3−10/3、3−10/7、2−14/1、3−19/1、2−23/1、3−25/1、1−40/1、1−40/2、1−40/3、1−40/7、7−43/1、7−43/3、1−44/1、1−44/7、5−45/1、5−45/2、5−45/7、7−46/1、7−46/2、7−46/7、9−49/1、9−49/2、9−49/7および1−51/1からなる群より選択される再配列されたhVλ/hJλ配列に由来する。

0030

1つの実施形態において、上記マウスは、ヒトκ軽鎖遺伝子座由来のヒトVκ−Jκ遺伝子間領域をさらに含み、ここで、そのヒトVκ−Jκ遺伝子間領域は、Vλ配列およびJ配列と連続する。特定の実施形態において、ヒトVκ−Jκ遺伝子間領域は、Vλ配列とJ配列との間に配置される。

0031

1つの態様において、(a)内在性マウス軽鎖遺伝子座に、少なくとも12個〜少なくとも40個の再配列されていないヒトλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのヒトJλ遺伝子セグメント;(b)少なくとも12個〜少なくとも40個のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントと少なくとも1つのヒトJλ配列との間に配置されたヒトVκ−Jκ遺伝子間配列を含むマウスが提供され;ここで、そのマウスは、ヒトVλドメインおよびマウスCκドメインを含む軽鎖を含む抗体を発現する。

0032

1つの態様において、λ可変配列およびκ定常配列を含む軽鎖を含む抗体を発現するマウスが提供される。

0033

1つの実施形態において、そのマウスは、約1:1というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す。

0034

1つの実施形態において、そのマウスの骨髄から得られる未熟B細胞の集団は、約1:1というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す。

0035

1つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、マウスCL遺伝子を含むマウス軽鎖遺伝子座に作動可能に接続された再配列されていない免疫グロブリンVλおよびJλ遺伝子セグメントを含む。

0036

1つの実施形態において、上記Vλおよび/またはJλ遺伝子セグメントは、ヒトの遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記Vλおよび/またはJλ遺伝子セグメントは、マウスの遺伝子セグメントであり、CLは、マウスCκである。

0037

1つの実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、κ軽鎖遺伝子座である。1つの実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、λ軽鎖遺伝子座である。

0038

1つの実施形態において、再配列されていないVλおよびJλ遺伝子セグメントは、内在性マウス軽鎖遺伝子座に存在する。

0039

1つの実施形態において、再配列されていない免疫グロブリンVλおよびJλ遺伝子セグメントは、導入遺伝子上に存在する。

0040

1つの実施形態において、上記マウスは、内在性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座に、1つ以上のヒトV、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントによる1つ以上の重鎖V、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの置換をさらに含む。

0041

1つの実施形態において、上記マウスは、マウスCκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンVλおよびJλ遺伝子セグメントを含む。

0042

1つの実施形態において、上記マウスは、マウスCλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていないヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子セグメント(Vλ)およびλ連結遺伝子セグメント(Jλ)を含む。

0043

1つの実施形態において、軽鎖可変遺伝子の遺伝子座(「VL遺伝子座」)は、少なくとも1つのヒトVλ(hVλ)遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、そのVL遺伝子座は、少なくとも1つのヒトJλ(hJλ)遺伝子セグメントを含む。別の実施形態において、VL遺伝子座は、最大4個のhJλ遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、そのVL遺伝子座は、ヒトλおよびヒトκゲノム配列を含む連続する配列を含む。

0044

1つの実施形態において、κ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座(「κ遺伝子座」)は、少なくとも1つのヒトVλ(hVλ)遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、そのκ遺伝子座は、少なくとも1つのヒトJλ(hJλ)遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、そのκ遺伝子座は、最大4個のhJλ遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、そのκ遺伝子座は、少なくとも1つのhVλおよび少なくとも1つのhJλを含み、機能的なVκ領域遺伝子セグメントを欠くかまたは実質的に欠き、機能的なJκ領域遺伝子セグメントを欠くかまたは実質的に欠く。1つの実施形態において、上記マウスは、機能的なVκ領域遺伝子セグメントを含まない。1つの実施形態において、上記マウスは、機能的なJκ領域遺伝子セグメントを含まない。

0045

1つの実施形態において、λ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座(「λ遺伝子座」)は、少なくとも1つのhVλ遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、そのλ遺伝子座は、少なくとも1つのヒトJλ(hJλ)遺伝子セグメントを含む。別の実施形態において、そのλ遺伝子座は、最大4個のhJλ遺伝子セグメントを含む。

0046

1つの実施形態において、VL遺伝子座は、複数のhVλを含む。1つの実施形態では、ヒトにおいて観察される約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%もしくは約90%またはそれ以上のVλ使用頻度を反映するλ軽鎖可変領域レパートリーの発現がもたらされるように、複数のhVλが選択される。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、遺伝子セグメントhVλ1−40、1−44、2−8、2−14、3−21およびそれらの組み合わせを含む。

0047

1つの実施形態において、hVλは、3−1、4−3、2−8、3−9、3−10、2−11および3−12を含む。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、Vλ3−12からVλ3−1に及ぶヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する配列を含む。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のhVλを含む。特定の実施形態において、hVλは、3−1、4−3、2−8、3−9、3−10、2−11および3−12を含む。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、Vλ3−12からVλ3−1に及ぶヒトλ遺伝子座の連続する配列を含む。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在し、内在性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在し、内在性κ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。

0048

1つの実施形態において、VL遺伝子座は、13〜28個またはそれ以上のhVλを含む。特定の実施形態において、それらのhVλは、2−14、3−16、2−18、3−19、3−21、3−22、2−23、3−25および3−27を含む。特定の実施形態において、κ遺伝子座は、Vλ3−27からVλ3−1に及ぶヒトλ遺伝子座の連続する配列を含む。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在し、内在性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。別の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在し、内在性κ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。

0049

1つの実施形態において、VL遺伝子座は、29〜40個のhVλを含む。特定の実施形態において、κ遺伝子座は、Vλ3−29からVλ3−1に及ぶヒトλ遺伝子座の連続する配列およびVλ5−52からVλ1−40に及ぶヒトλ遺伝子座の連続する配列を含む。特定の実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおけるhVλ1−40とhVλ3−29との間のすべてまたは実質的にすべての配列は、hVλ1−40遺伝子セグメントの下流(3’非翻訳部分の下流)に天然に(例えば、ヒト集団において)見られるおよそ959bpのヒトλ配列、制限酵素部位(例えば、PI−SceI)、それに続いて天然に見られるhVλ3−29遺伝子セグメントのおよそ3,431bp上流のヒトλ配列から本質的になる。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、内在性マウスκ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性マウスκ遺伝子座に存在し、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。別の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性マウスλ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性マウスλ遺伝子座に存在し、内在性マウスκ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。

0050

1つの実施形態において、VL遺伝子座は、少なくとも1つのhJλを含む。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、複数のhJλを含む。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、少なくとも2、3、4、5、6または7個のhJλを含む。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、4個のhJλを含む。特定の実施形態において、その4個のhJλは、hJλ1、hJλ2、hJλ3およびhJλ7である。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、κ遺伝子座である。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在し、内在性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、1個のhJλを含む。特定の実施形態において、その1個のhJλは、hJλ1である。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性κ遺伝子座に存在し、内在性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。別の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、VL遺伝子座は、内在性λ遺伝子座に存在し、内在性κ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失される。

0051

1つの実施形態において、VL遺伝子座は、少なくとも1つのhVλ、少なくとも1つのhJλおよびマウスCκ遺伝子を含む。1つの実施形態において、VL遺伝子座は、少なくとも1つのhVλ、少なくとも1つのhJλおよびマウスCλ遺伝子を含む。特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、Cλ2である。特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%または少なくとも99%同一である。

0052

1つの実施形態において、上記マウスは、内在性マウスκ遺伝子座に、1つ以上のhVλ遺伝子セグメントによる内在性マウスVκ遺伝子セグメントの置換を含み、ここで、そのhVλ遺伝子セグメントは、内在性マウスCκ領域遺伝子に作動可能に接続されており、そのマウスは、ヒトVλ遺伝子セグメントを再配列し、ヒトVλドメインおよびマウスCκを含むリバースキメラ(reverse chimeric)免疫グロブリン軽鎖を発現する。1つの実施形態において、再配列されていないマウスVκ遺伝子セグメントの90〜100%が、少なくとも1つの再配列されていないhVλ遺伝子セグメントで置換される。特定の実施形態において、内在性マウスVκ遺伝子セグメントのすべてまたは実質的にすべてが、少なくとも1つの再配列されていないhVλ遺伝子セグメントで置換される。1つの実施形態において、その置換は、少なくとも12個、少なくとも28個または少なくとも40個の再配列されていないhVλ遺伝子セグメントによる置換である。1つの実施形態において、その置換は、少なくとも7個の機能的な再配列されていないhVλ遺伝子セグメント、少なくとも16個の機能的な再配列されていないhVλ遺伝子セグメントまたは少なくとも27個の機能的な再配列されていないhVλ遺伝子セグメントによる置換である。1つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも1つの再配列されていないhJλ遺伝子セグメントによるすべてのマウスJκ遺伝子セグメントの置換を含む。1つの実施形態において、その少なくとも1つの再配列されていないhJλ遺伝子セグメントは、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ4、Jλ5、Jλ6、Jλ7およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、1つ以上のhVλ遺伝子セグメントは、3−1、4−3、2−8、3−9、3−10、2−11、3−12、2−14、3−16、2−18、3−19、3−21、3−22、2−23、3−25、3−27、1−40、7−43、1−44、5−45、7−46、1−47、5−48、9−49、1−50、1−51、5−52hVλ遺伝子セグメントおよびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、その少なくとも1つの再配列されていないhJλ遺伝子セグメントは、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7およびそれらの組み合わせから選択される。

0053

1つの実施形態において、上記マウスは、内在性マウスλ遺伝子座に、1つ以上のヒトVλ遺伝子セグメントによる内在性マウスVλ遺伝子セグメントの置換を内在性マウスλ遺伝子座に含み、ここで、そのhVλ遺伝子セグメントは、マウスCλ領域遺伝子に作動可能に接続されており、そのマウスは、hVλ遺伝子セグメントを再配列し、hVλドメインおよびマウスCλを含むリバースキメラ免疫グロブリン軽鎖を発現する。特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、Cλ2である。特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である。1つの実施形態において、再配列されていないマウスVλ遺伝子セグメントの90〜100%が、少なくとも1つの再配列されていないhVλ遺伝子セグメントで置換される。特定の実施形態において、内在性マウスVλ遺伝子セグメントのすべてまたは実質的にすべてが、少なくとも1つの再配列されていないhVλ遺伝子セグメントで置換される。1つの実施形態において、その置換は、少なくとも12個、少なくとも28個または少なくとも40個の再配列されていないhVλ遺伝子セグメントによる置換である。1つの実施形態において、その置換は、少なくとも7個の機能的な再配列されていないhVλ遺伝子セグメント、少なくとも16個の機能的な再配列されていないhVλ遺伝子セグメントまたは少なくとも27個の機能的な再配列されていないhVλ遺伝子セグメントによる置換である。1つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも1つの再配列されていないhJλ遺伝子セグメントによるすべてのマウスJλ遺伝子セグメントの置換を含む。1つの実施形態において、その少なくとも1つの再配列されていないhJλ遺伝子セグメントは、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ4、Jλ5、Jλ6、Jλ7およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、その1つ以上のhVλ遺伝子セグメントは、3−1、4−3、2−8、3−9、3−10、2−11、3−12、2−14、3−16、2−18、3−19、3−21、3−22、2−23、3−25、3−27、1−40、7−43、1−44、5−45、7−46、1−47、5−48、9−49、1−50、1−51、5−52hVλ遺伝子セグメントおよびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、その少なくとも1つの再配列されていないhJλ遺伝子セグメントは、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7およびそれらの組み合わせから選択される。

0054

1つの態様において、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に配置されたヒトVκ−Jκ遺伝子間領域配列を含む遺伝的に改変されたマウスが提供される。

0055

1つの実施形態において、そのヒトVκ−Jκ遺伝子間領域配列は、hVλおよびhJλ遺伝子セグメントを含むマウスの内在性κ軽鎖遺伝子座に存在し、そのヒトVκ−Jκ遺伝子間領域配列は、hVλ遺伝子セグメントとhJλ遺伝子セグメントとの間に配置される。特定の実施形態において、そのhVλおよびhJλ遺伝子セグメントは、そのマウスにおいて、機能的なヒトλ軽鎖可変ドメインを形成するように組み換わることができる。

0056

1つの実施形態において、複数のhVλおよび1つ以上のhJλを含むマウスが提供され、転写の点から、ヒトVκ−Jκ遺伝子間領域配列は、近位または最も3’側のhVλ配列の下流かつ最初のhJλ配列の上流または5’側に配置される。

0057

1つの実施形態において、ヒトVκ−Jκ遺伝子間領域は、ヒトVκ4−1遺伝子セグメントの約130bp下流または3’側、すなわち、ヒトVκ4−1遺伝子セグメントの3’非翻訳領域の約130bp下流に位置する領域であり、ヒトJκ1遺伝子セグメントの約600bp上流または5’側までに及ぶ。特定の実施形態において、ヒトVκ−Jκ遺伝子間領域は、約22.8kbのサイズである。1つの実施形態において、Vκ−Jκ遺伝子間領域は、ヒトVκ4−1遺伝子セグメントの3’非翻訳領域の末端からヒトJκ1遺伝子セグメントの約600bp上流にわたるヒトVκ−Jκ遺伝子間領域と約90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上または約95%以上同一である。1つの実施形態において、Vκ−Jκ遺伝子間領域は、配列番号100を含む。特定の実施形態において、Vκ−Jκ遺伝子間領域は、配列番号100の機能的なフラグメントを含む。特定の実施形態において、Vκ−Jκ遺伝子間領域は、配列番号100である。

0058

1つの態様において、列挙されたヒトVκ−Jκ遺伝子間領域配列を含むマウス、マウス細胞(例えば、マウス胚性幹細胞)、マウス胚およびマウス組織が提供され、ここで、その遺伝子間領域配列は、異所性のものである。特定の実施形態において、その異所性の配列は、ヒト化された内在性マウス免疫グロブリン遺伝子座に配置されている。

0059

1つの態様において、列挙されたヒトVκ−Jκ遺伝子間領域配列を含む単離された核酸構築物が提供される。1つの実施形態において、その核酸構築物は、ヒトVκ−Jκ遺伝子間領域配列をマウス軽鎖遺伝子座に標的化する標的化アーム(targeting arm)を含む。特定の実施形態において、そのマウス軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。特定の実施形態において、その標的化アームは、ヒトVκ−Jκ遺伝子間領域を改変された内在性マウスκ遺伝子座に標的化し、ここで、その標的化は、hVλ配列とhJλ配列との間の位置に対するものである。

0060

1つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、2つ以下の軽鎖対立遺伝子を含み、ここで、その軽鎖対立遺伝子は、(a)マウスCL遺伝子を含む内在性マウス軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンヒトVλおよびJλ遺伝子セグメント;および(b)マウスCL遺伝子を含む内在性マウス軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンVLおよびJL遺伝子セグメントを含む。

0061

1つの実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。別の実施形態において、内在性マウス軽鎖遺伝子座は、λ遺伝子座である。

0062

1つの実施形態において、上記2つ以下の軽鎖対立遺伝子は、κ対立遺伝子およびλ対立遺伝子、2つのκ対立遺伝子ならびに2つのλ対立遺伝子から選択される。特定の実施形態において、その2つの軽鎖対立遺伝子のうちの1つは、Cλ2遺伝子を含むλ対立遺伝子である。

0063

1つの実施形態において、上記マウスは、1つの機能的な免疫グロブリン軽鎖遺伝子座および1つの非機能的な軽鎖遺伝子座を含み、ここで、その機能的な軽鎖遺伝子座は、マウスCκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントを含む。

0064

1つの実施形態において、上記マウスは、1つの機能的な免疫グロブリン軽鎖遺伝子座および1つの非機能的な軽鎖遺伝子座を含み、ここで、その機能的な軽鎖遺伝子座は、マウスCλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、そのCλ遺伝子は、Cλ2である。特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である。

0065

1つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子をさらに含む。1つの実施形態において、その少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子は、ヒト/マウス重鎖を発現するヒト重鎖遺伝子を含む内在性マウス重鎖遺伝子座に、ヒトVH遺伝子セグメント、ヒトDH遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記マウスは、2つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子を含み、そのマウスは、ヒト/マウス重鎖を発現する。

0066

1つの実施形態において、上記マウスは、内在性Cκ遺伝子を含む内在性マウスκ遺伝子座に、再配列されていないhVκおよび再配列されていないhJκを含む第1の軽鎖対立遺伝子;ならびに内在性Cκ遺伝子を含む内在性マウスκ遺伝子座に、再配列されていないhVλおよび再配列されていないhJλを含む第2の軽鎖対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、その遺伝的に改変されたマウスにおいて機能的な軽鎖対立遺伝子は、その第1および第2の軽鎖対立遺伝子だけである。特定の実施形態において、上記マウスは、非機能的なλ遺伝子座を含む。1つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、λ定常領域を含む軽鎖を発現しない。

0067

1つの実施形態において、上記マウスは、内在性Cκ遺伝子を含む内在性マウスκ遺伝子座に、再配列されていないhVκおよび再配列されていないhJκを含む第1の軽鎖対立遺伝子;ならびに内在性Cλ遺伝子を含む内在性マウスλ遺伝子座に、再配列されていないhVλおよび再配列されていないhJλを含む第2の軽鎖対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、その遺伝的に改変されたマウスにおいて機能的な軽鎖対立遺伝子は、その第1および第2の軽鎖対立遺伝子だけである。1つの実施形態において、その内在性Cλ遺伝子は、Cλ2である。特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である。

0068

1つの実施形態において、上記マウスは、6個の免疫グロブリン対立遺伝子を含み、ここで、第1の対立遺伝子は、マウスCκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンVλおよびJλ遺伝子セグメントを含み、第2の対立遺伝子は、マウスCκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンVκおよびJκ遺伝子セグメントを含み、第3の対立遺伝子は、マウスCλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンVλおよびJλ遺伝子セグメントを含み、第4および第5の対立遺伝子は、各々独立して、マウス重鎖遺伝子を含む内在性マウス重鎖遺伝子座に、再配列されていないVHおよびDHおよびJH遺伝子セグメントを含み、そして第6の対立遺伝子は、(a)マウスCλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンVλおよびJλ遺伝子セグメントを含むか、(b)非機能的なλ遺伝子座を含むか、または(c)全体的にもしくは部分的にλ遺伝子座の欠失を含む。

0069

1つの実施形態において、上記の第1の対立遺伝子は、再配列されていないhVλおよびhJλを含む。1つの実施形態において、上記の第2の対立遺伝子は、再配列されていないhVκおよびhJκを含む。1つの実施形態において、上記の第3の対立遺伝子は、再配列されていないhVλおよびhJλを含む。1つの実施形態において、上記の第4および第5の対立遺伝子は、各々独立して、再配列されていないhVHおよびhDHおよびhJHを含む。1つの実施形態において、上記の第6の対立遺伝子は、全体的にまたは部分的に欠失された内在性マウスλ遺伝子座を含む。

0070

1つの実施形態において、上記マウスは、6個の免疫グロブリン対立遺伝子を含み、ここで、第1の対立遺伝子は、マウスCλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンVλおよびJλ遺伝子セグメントを含み、第2の対立遺伝子は、マウスCλ遺伝子を含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンVλおよびJλ遺伝子セグメントを含み、第3の対立遺伝子は、マウスCκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンVκおよびJκ遺伝子セグメントを含み、第4および第5の対立遺伝子は、各々独立して、マウス重鎖遺伝子を含む内在性マウス重鎖遺伝子座に、再配列されていないVHおよびDHおよびJH遺伝子セグメントを含み、そして第6の対立遺伝子は、(a)マウスCκ遺伝子を含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列されていない免疫グロブリンVκおよびJκ遺伝子セグメントを含むか、(b)非機能的なκ遺伝子座を含むか、または(c)κ遺伝子座の1つ以上のエレメントの欠失を含む。

0071

1つの実施形態において、上記の第1の対立遺伝子は、再配列されていないhVλおよびhJλ遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記の第2の対立遺伝子は、再配列されていないhVλおよびhJλ遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記の第3の対立遺伝子は、再配列されていないhVκおよびhJκ遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記の第4および第5の対立遺伝子は、各々独立して、再配列されていないhVHおよびhDHおよびhJH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記の第6の対立遺伝子は、機能的にサイレンシングされた内在性マウスκ遺伝子座を含む。

0072

1つの実施形態において、上記遺伝的に改変されたマウスは、マウスCLドメインに作動可能に接続された再配列されたhVλドメインを含む再配列された抗体遺伝子を含むB細胞を含む。1つの実施形態において、そのマウスCLドメインは、マウスCκおよびマウスCλドメインから選択される。特定の実施形態において、そのマウスCλドメインは、Cλ2遺伝子に由来する。特定の実施形態において、そのマウスCλドメインは、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一であるCλドメインに由来する。

0073

1つの態様において、CκであるCLにおいてVλ領域を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供される。1つの態様において、ヒトCκ、ヒトCλまたはマウスCκから選択されるCLにおいてhVλ領域を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供される。1つの態様において、マウスCκにおいてhVλ領域を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供される。

0074

1つの実施形態において、上記マウスの脾細胞の約10〜50%は、B細胞(すなわち、CD19陽性)であるか、またはその約9〜28%は、マウスCκドメインに融合されたhVλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

0075

特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約23〜34%は、B細胞(すなわち、CD19陽性)であるか、またはその約9〜11%は、マウスCκドメインに融合されたhVλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

0076

特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約19〜31%は、B細胞(すなわち、CD19陽性)であるか、またはその約9〜17%は、マウスCκドメインに融合されたhVλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

0077

特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約21〜38%は、B細胞(すなわち、CD19陽性)であるか、またはその約24〜27%は、マウスCκドメインに融合されたhVλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

0078

特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約10〜14%は、B細胞(すなわち、CD19陽性)であるか、またはその約9〜13%は、マウスCκドメインに融合されたhVλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

0079

特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約31〜48%は、B細胞(すなわち、CD19陽性)であるか、またはその約15〜21%は、マウスCκドメインに融合されたhVλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約30〜38%は、B細胞(すなわち、CD19陽性)であり、その約33〜48%は、マウスCκドメインに融合されたhVλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

0080

1つの実施形態において、上記マウスの骨髄の約52〜70%は、B細胞(すなわち、CD19陽性)であるか、またはその約31〜47%の未熟B細胞(すなわち、CD19陽性/B220中等度陽性(intermediate positive)/IgM陽性)は、マウスCκドメインに融合されたhVλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

0081

1つの実施形態において、上記マウスの骨髄の約60%は、B細胞(すなわち、CD19陽性)であるか、またはその約38.3%の未熟B細胞(すなわち、CD19陽性/B220中等度陽性/IgM陽性)は、マウスCκドメインに融合されたhVλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

0082

1つの実施形態において、上記マウスは、ヒトVおよびヒトJ遺伝子セグメントに由来する可変ドメインならびにマウス定常領域遺伝子に由来する定常ドメインを含む軽鎖を含む抗体を発現する。1つの実施形態において、そのマウス定常領域遺伝子は、Cκ遺伝子である。別の実施形態において、そのマウス定常領域遺伝子は、Cλ遺伝子である。特定の実施形態において、そのCλ領域は、Cλ2である。特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一であるCλ遺伝子に由来する。特定の実施形態において、上記抗体は、ヒトV、ヒトDおよびヒトJ遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む重鎖、ならびにマウス重鎖定常領域遺伝子に由来する重鎖定常ドメインをさらに含む。1つの実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのヒンジ−CH2−CH3配列を含む。別の実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのCH1−ヒンジ−CH2−CH3配列を含む。別の実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのCH1−CH2−CH3−CH4配列を含む。別の実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのCH2−CH3−CH4配列を含む。

0083

1つの実施形態において、上記マウスは、再配列されたヒトVλ−Jλ配列およびマウスCκ配列を含む軽鎖を含む抗体を発現する。1つの実施形態において、その再配列されたヒトVλ−Jλ配列は、3−1、4−3、2−8、3−9、3−10、2−14、3−19、2−23、3−25、1−40、7−43、1−44、5−45、7−46、1−47、9−49および1−51遺伝子セグメントから選択されるhVλ遺伝子セグメントの再配列に由来する。1つの実施形態において、その再配列されたヒトVλ−Jλ配列は、Jλ1、Jλ2、Jλ3およびJλ7遺伝子セグメントから選択されるhJλ遺伝子セグメントの再配列に由来する。

0084

1つの実施形態において、上記マウスは、3−1/1、3−1/7、4−3/1、4−3/7、2−8/1、3−9/1、3−10/1、3−10/3、3−10/7、2−14/1、3−19/1、2−23/1、3−25/1、1−40/1、1−40/2、1−40/3、1−40/7、7−43/1、7−43/3、1−44/1、1−44/7、5−45/1、5−45/2、5−45/7、7−46/1、7−46/2、7−46/7、9−49/1、9−49/2、9−49/7および1−51/1から選択されるヒトVλ/Jλ配列を含む再配列された免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗体を発現する。特定の実施形態において、B細胞は、マウス重鎖定常ドメインと融合されたヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよびマウスκ軽鎖定常ドメインと融合されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する。

0085

1つの態様において、(a)再配列されていないヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントに由来する重鎖可変ドメインを含む重鎖(ここで、その重鎖可変ドメインは、マウス重鎖定常(CH)領域に融合されている);および(b)再配列されていないhVλおよびhJλに由来する軽鎖可変ドメインを含む軽鎖(ここで、その軽鎖可変ドメインは、マウスCL領域に融合されている)を含む抗体を発現するマウスが提供される。

0086

1つの実施形態において、上記マウスは、(i)すべてまたは実質的にすべての機能的なヒトV、DおよびJ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスV、DおよびJ遺伝子セグメントの置換、マウスCH遺伝子を含む重鎖遺伝子座、(ii)すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なhVλおよびhJλ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスVκおよびJκ遺伝子セグメントの置換、ならびにマウスCκ遺伝子を含む第1のκ軽鎖遺伝子座、(iii)すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なhVκおよびhJκ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスVκおよびJκ遺伝子セグメントの置換、ならびにマウスCκ遺伝子を含む第2のκ軽鎖遺伝子座を含む。1つの実施形態において、上記マウスは、Cλ領域を含む抗体を発現しない。1つの実施形態において、上記マウスは、Cλ遺伝子および/またはVλおよび/またはJλ遺伝子セグメントの欠失を含む。1つの実施形態において、上記マウスは、非機能的なλ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態において、そのλ軽鎖遺伝子座は、全体的にまたは部分的に欠失されている。

0087

1つの実施形態において、上記マウスは、(i)すべてまたは実質的にすべての機能的なヒトV、DおよびJ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスV、DおよびJ遺伝子セグメントの置換、マウスCH遺伝子を含む重鎖遺伝子座、(ii)すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なhVλおよびhJλ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスVλおよびJλ遺伝子セグメントの置換ならびにマウスCλ遺伝子を含む第1のλ軽鎖遺伝子座、(iii)すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なhVλおよびhJλ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内在性マウスVλおよびJλ遺伝子セグメントの置換ならびにマウスCλ遺伝子を含む第2のλ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、Cλ2である。特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一であるCλ遺伝子に由来する。

0088

1つの実施形態において、上記マウスは、Cκ遺伝子および/またはVκおよび/またはJκ遺伝子セグメントの欠失を含む。1つの実施形態において、上記マウスは、非機能的なκ軽鎖遺伝子座を含む。

0089

1つの態様において、抗体を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスによって産生される全IgG抗体の10%超、15%超、20%超、25%超、30%超、35%超、40%超、60%超、70%超、80%超または90%超が、λ由来の可変ドメインを含み、そのマウスは、マウスCκ領域と融合されたκ由来の可変ドメインを含む抗体を発現する。特定の実施形態において、そのマウスによって産生される全抗体の約15〜40%、20〜40%、25〜40%、30〜40%または35〜40%が、λ由来の可変ドメインを含む。

0090

1つの実施形態において、上記のλ由来の可変ドメインは、hVλおよびhJλに由来する。1つの実施形態において、上記のλ由来の可変ドメインは、マウスCκ領域を含む軽鎖に存在する。特定の実施形態において、上記のλ由来の可変領域は、マウスCλ領域を含む軽鎖に存在する。別の特定の実施形態において、そのCλ領域は、Cλ2領域である。1つの実施形態において、κ由来の可変ドメインは、hVκおよびhJκに由来し、特定の実施形態では、マウスCκ領域を含む軽鎖に存在する。

0091

1つの態様において、上流の相同性アーム(homology arm)および下流の相同性アームを含む単離されたDNA構築物が提供され、ここで、その上流および下流の相同性アームは、その構築物をマウスκ遺伝子座に標的化し、その構築物は、機能的な再配列されていないhVλセグメントおよび機能的な再配列されていないhJλセグメントならびに選択配列またはマーカー配列を含む。

0092

1つの態様において、転写の方向に関して5’から3’に向かって、マウスVλ2の上流のマウスλ配列を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と5’側および3’側で隣接した選択カセット、ならびにマウスJλ2の3’側のマウスλ配列を標的化するための標的化アームを含む単離されたDNA構築物が提供される。1つの実施形態において、その選択カセットは、Frtで挟まれた(Frt’ed)Hyg−TKカセットである。1つの実施形態において、その3’標的化アームは、マウスCλ2、Jλ4、Cλ4およびマウスエンハンサー2.4を含む。

0093

1つの態様において、転写の方向に関して5’から3’に向かって、Vλ1に対して5’側のマウスλ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と5’側および3’側で隣接した選択カセット、ならびにマウスCλ1に対して3’側のマウスλ配列を標的化するための3’標的化アームを含む、単離されたDNA構築物が提供される。1つの実施形態において、その選択カセットは、loxで挟まれた(loxed)ネオマイシンカセットである。1つの実施形態において、その3’標的化アームは、マウスλ3’エンハンサーおよびマウスλ3’エンハンサー3.1を含む。

0094

1つの態様において、転写の方向に関して5’から3’に向かって、Vλ2に対して5’側のマウスλ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と5’側および3’側で隣接した選択カセット、ならびにマウスJλ2に対して3’側かつマウスCλ2に対して5’側のマウスλ配列を標的化するための3’標的化アームを含む、単離されたDNA構築物が提供される。1つの実施形態において、その選択カセットは、Frtで挟まれたハイグロマイシン−TKカセットである。1つの実施形態において、その3’標的化アームは、マウスCλ2−Jλ4−Cλ4遺伝子セグメントおよびマウスλエンハンサー2.4を含む。

0095

1つの態様において、転写の方向に関して5’から3’に向かって、Vλ2に対して5’側のマウスλ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と5’側および3’側で隣接した選択カセット、hJλ1の末端に対して下流にhVλ3−12由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含むヒトゲノムフラグメント、ならびにマウスJλ2に対して3’側のマウスλ配列を標的化するための3’標的化アームを含む、単離されたDNA構築物が提供される。1つの実施形態において、その選択カセットは、Frtで挟まれたネオマイシンカセットである。1つの実施形態において、その3’標的化アームは、マウスCλ2−Jλ4−Cλ4遺伝子セグメントおよびマウスλエンハンサー2.4を含む。

0096

1つの態様において、hJλ1の末端に対して下流にhVλ3−12由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む、単離されたDNA構築物が提供される。

0097

1つの態様において、転写の方向に関して5’から3’に向かって、Vλ2に対して5’側のマウスλ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と5’側および3’側で隣接した選択カセット、ならびにhVλ2−8の末端に対して下流のhVλ3−27由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続した領域を含むヒトゲノムフラグメントを含む、単離されたDNA構築物が提供される。1つの実施形態において、その選択カセットは、Frtで挟まれたハイグロマイシンカセットである。1つの実施形態において、そのヒトゲノムフラグメントは、3’標的化アームを構成する。特定の実施形態において、その3’標的化アームは、hVλ2−8の末端に対して下流にhVλ3−12由来の約53kbのヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。

0098

1つの態様において、hVλ3−12の末端に対して下流にhVλ3−27由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む、単離されたDNA構築物が提供される。

0099

1つの態様において、転写の方向に関して5’から3’に向かって、Vλ2に対して5’側のマウスλ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、リコンビナーゼ認識部位と5’側および3’側で隣接した選択カセット、hVλ1−40の末端の下流にhVλ5−52由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む第1のヒトゲノムフラグメント、制限酵素部位、ならびにhVλ82Kの末端に対して下流にhVλ3−29由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む第2のヒトゲノムフラグメントを含む、単離されたDNA構築物が提供される。1つの実施形態において、その選択カセットは、Frtで挟まれたネオマイシンカセットである。1つの実施形態において、その制限酵素部位は、ホーミングエンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)のための部位である。特定の実施形態において、そのホーミングエンドヌクレアーゼは、PI−SceIである。1つの(on)実施形態において、上記の第2のヒトゲノムフラグメントは、3’標的化アームである。特定の実施形態において、その3’標的化アームは、hVλ82Kの末端に対して下流にhVλ3−29由来の約27kbのヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。

0100

1つの態様において、hVλ1−40の末端に対して下流にhVλ5−52由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む、単離されたDNA構築物が提供される。

0101

1つの態様において、転写の方向に関して5’から3’に向かって、内在性Vκ遺伝子セグメントに対して5’側のマウスκ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、2個の並置されたリコンビナーゼ認識部位、その並置されたリコンビナーゼ認識部位に対して3’側の選択カセット、およびκ軽鎖可変遺伝子セグメントに対して5’側のマウスκ配列を標的化するための3’標的化アームを含む、単離されたDNA構築物が提供される。1つの実施形態において、その並置されたリコンビナーゼ認識部位は、互いに対して逆の向きである。特定の実施形態において、上記リコンビナーゼ認識部位は、異なる。別の特定の実施形態において、そのリコンビナーゼ認識部位は、loxP部位およびlox511部位である。1つの実施形態において、選択カセットは、ネオマイシンカセットである。

0102

1つの態様において、転写の方向に関して5’から3’に向かって、マウスJκ遺伝子セグメントに対して5’側のマウスκ遺伝子座を標的化するための標的化アーム、選択カセット、その選択カセットに対して3’側のリコンビナーゼ認識部位、およびマウスJκ遺伝子セグメントに対して3’側かつマウスκイントロンエンハンサーに対して5’側のマウスκ配列を標的化するための3’標的化アームを含む、単離されたDNA構築物が提供される。1つの実施形態において、その選択カセットは、ハイグロマイシン−TKカセットである。1つの実施形態において、そのリコンビナーゼ認識部位は、転写に関して選択カセットと同じ向きである。特定の実施形態において、そのリコンビナーゼ認識部位は、loxP部位である。

0103

1つの態様において、転写の方向に関して5’から3’に向かって、内在性マウスVκ遺伝子セグメントの5’側の配列を含む第1のマウスゲノムフラグメント、第1のリコンビナーゼ認識部位、第2のリコンビナーゼ認識部位、および内在性マウスJκ遺伝子セグメントの3’側かつマウスκイントロンエンハンサーの5’側の配列を含む第2のマウスゲノムフラグメントを含む、単離されたDNA構築物が提供される。

0104

1つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、その遺伝的改変は、上または本明細書中に記載されるDNA構築物の1つ以上による改変を含む。

0105

1つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための単離されたDNA構築物の使用が提供される。1つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための方法における本明細書中に記載されるような単離されたDNA構築物の使用が提供される。

0106

1つの態様において、上および本明細書中に記載されるようなDNA構築物を含む標的化ベクターを含む非ヒト幹細胞が提供される。1つの態様において、非ヒト幹細胞が提供され、ここで、その非ヒト幹細胞は、本明細書中に記載されるマウスに由来する。

0107

1つの実施形態において、上記非ヒト幹細胞は、胚性ES)細胞である。特定の実施形態において、そのES細胞は、マウスES細胞である。

0108

1つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト幹細胞の使用が提供される。1つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト幹細胞の使用が提供される。

0109

1つの態様において、マウス胚が提供され、ここで、そのマウス胚は、本明細書中に提供されるような遺伝的改変を含む。1つの実施形態において、ドナーES細胞を含む宿主マウス胚が提供され、ここで、そのドナーES細胞は、本明細書中に記載されるような遺伝的改変を含む。1つの実施形態において、上記マウス胚は、前桑実胚(pre−morula)の段階の胚である。特定の実施形態において、その前桑実胚の段階の胚は、4細胞期の胚または8細胞期の胚である。別の特定の実施形態において、上記マウス胚は、胚盤胞である。

0110

1つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための本明細書中に記載されるようなマウス胚の使用が提供される。1つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるようなマウス胚の使用が提供される。

0111

1つの態様において、非ヒト細胞が提供され、ここで、その非ヒト細胞は、本明細書中に記載されるような遺伝的に改変されたマウスに由来する再配列された免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列を含む。1つの実施形態において、その細胞は、B細胞である。1つの実施形態において、その細胞は、ハイブリドーマである。1つの実施形態において、その細胞は、体細胞変異した、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび/または免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。

0112

1つの態様において、非ヒト細胞が提供され、ここで、その非ヒト細胞は、本明細書中に記載されるような遺伝的に改変されたマウスに由来する再配列された免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列を含む。1つの実施形態において、その細胞は、B細胞である。1つの実施形態において、その細胞は、ハイブリドーマである。1つの実施形態において、その細胞は、体細胞変異した、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび/または免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。

0113

1つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト細胞の使用が提供される。1つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト細胞の使用が提供される。

0114

1つの態様において、(a)hVλ遺伝子セグメントおよびhJλ遺伝子セグメントに由来する可変領域;ならびに(b)マウスCL遺伝子を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスB細胞が提供される。1つの実施形態において、そのマウスCL遺伝子は、CκおよびCλ遺伝子から選択される。特定の実施形態において、そのCλ遺伝子は、Cλ2である。特定の実施形態において、上記マウスCλ遺伝子は、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一であるCλ遺伝子に由来する。1つの実施形態において、上記マウスB細胞は、さらに、(c)hVH、hDHに由来する可変領域および(d)hJHセグメントを含む同族重鎖を発現する。1つの実施形態において、上記B細胞は、再配列されたλ遺伝子を含まない。別の実施形態において、上記B細胞は、再配列されたκ遺伝子を含まない。

0115

1つの態様において、遺伝的に改変されたマウスにおいて抗体を作製するための方法が提供され、その方法は:(a)遺伝的に改変されたマウスを抗原曝露する工程(ここで、そのマウスは、内在性軽鎖遺伝子座に少なくとも1つのhVλおよび少なくとも1つのhJλを含むゲノムを有し、その内在性軽鎖遺伝子座は、マウスCL遺伝子を含む);(b)その遺伝的に改変されたマウスにその抗原に対する免疫応答を生じさせる工程;および(c)(b)のマウスから、その抗原を特異的に認識する抗体を単離する工程、または(b)のマウスから、その抗原を特異的に認識する免疫グロブリンドメインを含む細胞を単離する工程(ここで、その抗体は、hVλ、hJλおよびマウスCL遺伝子に由来する軽鎖を含む)を包含する。特定の実施形態において、上記マウスCL遺伝子は、マウスCκ遺伝子である。

0116

1つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおいて抗体を作製するための方法が提供され、その方法は:(a)遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程(ここで、そのマウスは、内在性κ遺伝子座に少なくとも1つのhVλを含みかつそのκ遺伝子座に少なくとも1つのhJλを含むゲノムを有し、そのκ遺伝子座は、マウスCκ遺伝子を含む);(b)その遺伝的に改変されたマウスにその抗原に対する免疫応答を生じさせる工程;および(c)(b)のマウスから、その抗原を特異的に認識する抗体を単離する工程、または(b)のマウスから、その抗原を特異的に認識する免疫グロブリンドメインを含む細胞を単離する工程(ここで、その抗体は、hVλ、hJλおよびマウスCκ遺伝子に由来する軽鎖を含む)を包含する。

0117

1つの実施形態において、上記κ軽鎖定常遺伝子は、ヒトCκ遺伝子およびマウスCκ遺伝子から選択される。

0118

1つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおいて抗体を作製するための方法が提供され、その方法は:(a)遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程(ここで、そのマウスは、λ軽鎖遺伝子座に少なくとも1つのhVλを含み、かつそのλ軽鎖遺伝子座に少なくとも1つのJλを含むゲノムを有し、そのλ軽鎖遺伝子座は、マウスCλ遺伝子を含む);(b)その遺伝的に改変されたマウスにその抗原に対する免疫応答を生じさせる工程;および(c)(b)のマウスから、その抗原を特異的に認識する抗体を単離する工程、または(b)のマウスからその抗原を特異的に認識する免疫グロブリンドメインを含む細胞を単離する工程、またはBのマウスにおいて、その抗原に結合する重鎖および/または軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定する工程(ここで、その抗体は、hVλ、hJλおよびマウスCλ遺伝子に由来する軽鎖を含む)を包含する。

0119

1つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、ヒトCλ遺伝子およびマウスCλ遺伝子から選択される。1つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、ヒトCλ遺伝子である。特定の実施形態において、そのヒトCλ遺伝子は、Cλ1、Cλ2、Cλ3およびCλ7から選択される。1つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、マウスCλ遺伝子である。特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、Cλ1、Cλ2およびCλ3から選択される。より特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、Cλ2である。別の特定の実施形態において、そのマウスCλ遺伝子は、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一であるCλ遺伝子に由来する。

0120

1つの態様において、遺伝的に改変されたマウスにおいて再配列された抗体遺伝子を作製するための方法が提供され、その方法は:(a)遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程(ここで、その遺伝的改変は、内在性軽鎖遺伝子座にhVλおよびhJλを含み、その内在性軽鎖遺伝子座は、マウスCL遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む);および(b)前記マウスにおいて再配列された免疫グロブリン遺伝子を特定する工程(ここで、その再配列された免疫グロブリン遺伝子は、λ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびCL遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む)を包含する。

0121

1つの実施形態において、上記方法はさらに、上記マウスから重鎖および/または軽鎖可変領域をコードする核酸配列をクローニングする工程を包含し、ここで、その重鎖および/または軽鎖可変領域は、ヒトVλおよびマウスCLを含む抗体に由来する。

0122

1つの実施形態において、上記マウスCL遺伝子またはその機能的なフラグメントは、ヒトCL遺伝子およびマウスCL遺伝子またはそれらの機能的なフラグメントから選択される。

0123

1つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおいて再配列された抗体遺伝子を作製するための方法が提供され、その方法は:(a)遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程(ここで、その遺伝的改変は、κ軽鎖遺伝子座にhVλおよびhJλを含み、そのκ軽鎖遺伝子座は、マウスCκ遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む);および(b)前記マウスにおいて再配列された免疫グロブリン遺伝子を特定する工程(ここで、その再配列された免疫グロブリン遺伝子は、λ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびCκ遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む)を包含する。

0124

1つの実施形態において、上記κ軽鎖定常遺伝子またはその機能的なフラグメントは、ヒトCκ遺伝子およびマウスCκ遺伝子またはそれらの機能的なフラグメントから選択される。

0125

1つの実施形態において、上記方法はさらに、上記マウスから重鎖および/または軽鎖可変領域をコードする核酸配列をクローニングする工程を包含し、ここで、その重鎖および/または軽鎖可変領域は、ヒトVλおよびマウスCκを含む抗体に由来する。

0126

1つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおいて再配列された抗体遺伝子を作製するための方法が提供され、その方法は:(a)遺伝的に改変されたマウスを抗原に曝露する工程(ここで、その遺伝的改変は、マウスλ軽鎖遺伝子座にhVλおよびhJλを含み、そのλ軽鎖遺伝子座は、マウスCλ遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む);および(b)前記マウスにおいて再配列された免疫グロブリン遺伝子を特定する工程(ここで、その再配列された免疫グロブリン遺伝子は、λ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびCλ遺伝子またはその機能的なフラグメントを含む)を包含する。

0127

1つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子またはその機能的なフラグメントは、ヒトCλ遺伝子およびマウスCλ遺伝子またはそれらの機能的なフラグメントから選択される。特定の実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、マウスCλ遺伝子またはその機能的なフラグメントである。

0128

1つの実施形態において、上記方法は、重鎖および/または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を上記マウスからクローニングする工程をさらに包含し、ここで、その重鎖および/または軽鎖可変領域は、ヒトVλおよびマウスCλを含む抗体に由来する。

0129

1つの態様において、抗体を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程、そのマウスに、その抗原に特異的に結合する抗体の産生を含む免疫応答を開始させる工程、そのマウス内の重鎖をコードする再配列された核酸配列およびそのマウス内の抗体の同族軽鎖可変ドメイン配列をコードする再配列された核酸配列を特定する工程(ここで、その抗体は、その抗原に特異的に結合する)、ならびにヒト定常ドメインに融合された重鎖および軽鎖可変ドメインの核酸配列を使用して、所望の抗体を作製する工程(ここで、その所望の抗体は、CLドメインに融合されたVλドメインを含む軽鎖を含む)を包含する。1つの実施形態において、そのVλドメインは、ヒトのドメインであり、CLドメインは、ヒトまたはマウスのCλドメインである。1つの実施形態において、そのVλドメインは、マウスのドメインであり、CLドメインは、ヒトまたはマウスのCκドメインである。

0130

1つの実施形態において、抗体を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程、そのマウスに、その抗原に特異的に結合する抗体の産生を含む免疫応答を開始させる工程、そのマウス内の重鎖をコードする再配列された核酸配列およびそのマウス内の抗体の同族軽鎖可変ドメイン配列をコードする再配列された核酸配列を特定する工程(ここで、その抗体は、その抗原に特異的に結合する)、ならびにヒト定常ドメインの核酸配列に融合された重鎖および軽鎖可変ドメインの核酸配列を使用して、所望の抗体を作製する工程(ここで、その所望の抗体は、Cκドメインに融合されたVλドメインを含む軽鎖を含む)を包含する。

0131

1つの実施形態において、抗体を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程、そのマウスに、その抗原に特異的に結合する抗体の産生を含む免疫応答を開始させる工程、そのマウス内の重鎖可変ドメインをコードする再配列された核酸配列および抗体の同族軽鎖可変ドメイン配列をコードする再配列された核酸配列を特定する工程(ここで、その抗体は、その抗原に特異的に結合する)、ならびにヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインをコードする核酸配列に融合された核酸配列を使用して、ヒト配列に由来する抗体を作製する工程(ここで、その抗原に特異的に結合する抗体は、マウスCλ領域に融合されたヒトVλドメインを含む軽鎖を含む)を包含する。

0132

1つの実施形態において、上記マウスCλ領域は、Cλ1、Cλ2およびCλ3から選択される。特定の実施形態において、上記マウスCλ領域は、Cλ2である。

0133

1つの態様において、再配列された抗体軽鎖可変領域遺伝子配列を作製するための方法が提供され、その方法は、(a)本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程;(b)そのマウスに免疫応答を開始させる工程;(c)マウスCLドメインと融合された再配列されたヒトVλドメイン配列をコードする核酸配列を含む細胞をそのマウスにおいて特定する工程(ここで、その細胞は、ヒトVHドメインおよびマウスCHドメインを含む同族重鎖もコードし、その細胞は、その抗原に結合する抗体を発現する);(d)その細胞からヒトVλドメインをコードする核酸配列および同族ヒトVHドメインをコードする核酸配列をクローニングする工程;および(e)ヒトVλドメインをコードするクローニングされた核酸配列および同族ヒトVHドメインをコードするクローニングされた核酸配列を使用して、完全ヒト抗体を作製する工程を包含する。

0134

1つの実施形態において、再配列された抗体軽鎖可変領域遺伝子配列を作製するための方法が提供され、その方法は、(a)本開示に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程;(b)そのマウスに免疫応答を開始させる工程;(c)マウスCκドメインをコードする核酸配列と、同じ核酸分子上で連続する再配列されたヒトVλドメイン配列をコードする核酸配列を含む細胞をそのマウスにおいて特定する工程(ここで、その細胞は、ヒトVHドメインおよびマウスCHドメインを含む同族重鎖もコードし、その細胞は、その抗原に結合する抗体を発現する);(d)その細胞からヒトVλドメインをコードする核酸配列および同族ヒトVHドメインをコードする核酸配列をクローニングする工程;および(e)ヒトVλドメインをコードするクローニングされた核酸配列および同族ヒトVHドメインをコードするクローニングされた核酸配列を使用して、完全ヒト抗体を作製する工程を包含する。

0135

1つの実施形態において、再配列された抗体軽鎖可変領域遺伝子配列を作製するための方法が提供され、その方法は、(a)本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程;(b)そのマウスにその抗原に対する免疫応答を開始させる工程;(c)マウスCλドメインと融合された再配列されたヒトVλドメイン配列をコードするDNAを含む細胞をそのマウスにおいて特定する工程(ここで、その細胞は、ヒトVHドメインおよびマウスCHドメインを含む同族重鎖もコードし、その細胞は、その抗原に結合する抗体を発現する);(d)その細胞から、再配列されたヒトVλドメインをコードする核酸配列および同族ヒトVHドメインをコードする核酸配列をクローニングする工程;および(e)ヒトVλドメインをコードするクローニングされた核酸配列および同族ヒトVHドメインをコードするクローニングされた核酸配列を使用して、完全ヒト抗体を作製する工程を包含する。1つの実施形態において、上記マウスCλドメインは、マウスCλ2である。特定の実施形態において、上記マウスCλドメインは、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一であるCλ遺伝子に由来する。

0136

1つの態様において、内在性軽鎖定常領域(CL)に融合されたヒトλ由来の軽鎖を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、抗原で免疫されると、マウスCLドメインに融合されたヒトVλドメインを含む抗体を産生する。1つの実施形態において、そのマウスCLドメインは、CκドメインおよびCλドメインから選択される。1つの実施形態において、そのマウスCLドメインは、Cκドメインである。1つの実施形態において、そのマウスCLドメインは、Cλドメインである。特定の実施形態において、そのCλドメインは、Cλ2である。特定の実施形態において、そのマウスCλドメインは、マウスCλ2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一であるCλ遺伝子に由来する。

0137

1つの態様において、複数の免疫グロブリン重鎖と会合される複数の免疫グロブリンλ軽鎖を発現する、本明細書中に記載されるような改変された内在性κまたはλ軽鎖遺伝子座を含む遺伝的に改変されたマウスが提供される。1つの実施形態において、その重鎖は、ヒト配列を含む。様々な実施形態において、そのヒト配列は、可変配列、CH1、ヒンジ、CH2、CH3およびそれらの組み合わせから選択される。1つの実施形態において、複数の免疫グロブリンλ軽鎖は、ヒト配列を含む。様々な実施形態において、そのヒト配列は、可変配列、定常配列およびそれらの組み合わせから選択される。1つの実施形態において、上記マウスは、無能力にされた(disabled)内在性免疫グロブリン遺伝子座を含み、導入遺伝子または染色体外エピソームから重鎖および/またはλ軽鎖を発現する。1つの実施形態において、上記マウスは、一部もしくは全部の内在性マウス重鎖遺伝子セグメント(すなわち、V、D、J)、および/または一部もしくは全部の内在性マウス重鎖定常配列(例えば、CH1、ヒンジ、CH2、CH3またはそれらの組み合わせ)および/または一部もしくは全部の内在性マウス軽鎖配列(例えば、V、J、定常またはそれらの組み合わせ)の内在性マウス遺伝子座に、1つ以上のヒト免疫グロブリン配列による置換を含む。

0138

1つの態様において、ヒトλ由来の軽鎖を有する抗体の作製に適したマウスが提供され、ここで、そのマウスにおいて産生されるすべてまたは実質的にすべての抗体は、ヒトλ由来の軽鎖とともに発現される。1つの実施形態において、そのヒトλ由来の軽鎖は、内在性軽鎖遺伝子座から発現される。1つの実施形態において、その内在性軽鎖遺伝子座は、κ軽鎖遺伝子座である。特定の実施形態において、そのκ軽鎖遺伝子座は、マウスκ軽鎖遺伝子座である。

0139

1つの態様において、ヒト抗体用のλ由来軽鎖を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるようなマウスから軽鎖配列および重鎖配列を得る工程、ならびにヒト抗体を作製する際にその軽鎖配列および重鎖配列を使用する工程を包含する。

0140

1つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるようなマウスを抗原に曝露する工程;そのマウスに免疫応答を開始させる工程;およびその抗原に結合する抗原結合タンパク質をそのマウスから得る工程、またはその抗原に結合する抗原結合タンパク質を作製する際に使用される配列をそのマウスから得る工程を包含する。

0141

1つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスに由来する細胞が提供される。1つの実施形態において、その細胞は、胚性幹細胞多能性細胞誘導多能性細胞、B細胞およびハイブリドーマから選択される。

0142

1つの態様において、本明細書中に記載されるような遺伝的改変を含む細胞が提供される。1つの実施形態において、その細胞は、マウス細胞である。1つの実施形態において、その細胞は、ハイブリドーマおよびクアドローマから選択される。1つの実施形態において、その細胞は、マウス定常配列と融合されたヒトλ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。特定の実施形態において、そのマウス定常配列は、マウスκ定常配列である。

0143

1つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスに由来する組織が提供される。

0144

1つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるようなマウスまたは細胞の使用が提供される。1つの実施形態において、その抗原結合タンパク質は、ヒトタンパク質である。1つの実施形態において、そのヒトタンパク質は、ヒト抗体である。

0145

1つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウス、細胞、組織または方法によって作製される抗原結合タンパク質が提供される。1つの実施形態において、その抗原結合タンパク質は、ヒトタンパク質である。1つの実施形態において、そのヒトタンパク質は、ヒト抗体である。

0146

別段示されないかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書中に記載されるいずれの実施形態および態様も、互いと組み合わせて使用することができる。他の実施形態は、下記の説明を検討することによって当業者に明らかになるだろう。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目A1)
生殖細胞系列において、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域の核酸配列を含むマウスであって、ここで、該ヒト免疫グロブリンλ可変領域の核酸配列は、マウス免疫グロブリン定常領域の核酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖において発現される、マウス。
(項目A2)
上記内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、免疫グロブリンλ遺伝子座である、項目A1に記載のマウス。
(項目A3)
上記内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、免疫グロブリンκ遺伝子座である、項目A1に記載のマウス。
(項目A4)
上記マウスが、上記内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において内在性免疫グロブリン軽鎖可変配列を欠く、項目A1に記載のマウス。
(項目A5)
すべてまたは実質的にすべての内在性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、1つ以上のヒト免疫グロブリンλ可変領域遺伝子セグメントで置換されている、項目A1に記載のマウス。
(項目A6)
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域配列が、ヒトJλ配列を含む、項目A1に記載のマウス。
(項目A7)
上記ヒトJλ配列が、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目A6に記載のマウス。
(項目A8)
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座のクラスターAのフラグメントを含む、項目A1に記載のマウス。
(項目A9)
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターAのフラグメントが、hVλ3−27からhVλ3−1にわたる、項目A8に記載のマウス。
(項目A10)
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座のクラスターBのフラグメントを含む、項目A1に記載のマウス。
(項目A11)
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターBのフラグメントが、hVλ5−52からhVλ1−40にわたる、項目A10に記載のマウス。
(項目A12)
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域配列が、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターAのゲノムフラグメントおよびクラスターBのゲノムフラグメントを含む、項目A1に記載のマウス。
(項目A13)
上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域配列が、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターAの少なくとも1つの遺伝子セグメントおよびクラスターBの少なくとも1つの遺伝子セグメントを含む、項目A12に記載のマウス。
(項目A14)
上記マウスの免疫グロブリン軽鎖レパートリーの10%超が、2−8、2−23、1−40、5−45および9−49から選択される少なくとも2つのhVλ遺伝子セグメントに由来する、項目A1に記載のマウス。
(項目A15)
上記マウスの免疫グロブリン軽鎖レパートリーの20%超が、2−8、2−23、1−40、5−45および9−49から選択される少なくとも3つのhVλ遺伝子セグメントに由来する、項目A14に記載のマウス。
(項目A16)
上記マウスの免疫グロブリン軽鎖レパートリーの30%超が、2−8、2−23、1−40、5−45および9−49から選択される少なくとも4つのhVλ遺伝子セグメントに由来する、項目A15に記載のマウス。
(項目A17)
マウス定常領域と融合されたヒトラムダ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスであって、ここで、該マウスは、約1:1というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す、マウス。
(項目A18)
上記免疫グロブリン軽鎖が、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現される、項目A17に記載のマウス。
(項目A19)
抗原結合タンパク質を作製するための、前述の項目のいずれか1項に記載されたマウスの使用。
(項目A20)
上記抗原結合タンパク質がヒトの抗原結合タンパク質である、項目A19に記載の使用。(項目A21)
項目A1〜18のいずれか1項に記載のマウスに由来する、細胞または組織であって、該細胞は、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列と連続する、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域の核酸配列を含む、細胞または組織。
(項目A22)
目的の抗原に結合する、体細胞変異した抗体を作製するための方法であって、該方法は、以下:
(a)項目A1〜18のいずれか1項に記載のマウスを、目的の抗原に曝露する工程;
(b)(a)のマウスの1以上のBリンパ球を取得する工程であって、該1以上のBリンパ球は、該目的の抗原に結合する抗体を産生する、工程;ならびに
(c)(b)の抗体の免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列を特定する工程であって、該免疫グロブリン軽鎖は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインおよびマウス免疫グロブリン軽鎖定常ドメインを含む、工程;ならびに
(d)ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列と、(c)の核酸配列を使用して、該目的の抗原に結合するヒト抗体を作製する工程
を包含する、方法。

図面の簡単な説明

0147

図1は、Vλ遺伝子セグメントのクラスター(A、BおよびC)およびJλとCλとの領域対(J−C対)を含むヒトλ軽鎖遺伝子座の一定の拡大比ではない詳細な説明図を示している。
図2は、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座を不活性化するために使用された標的化ストラテジーの一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
図3は、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座を不活性化するために使用された標的化ストラテジーの一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
図4Aは、12個のhVλ遺伝子セグメントおよびhJλ1遺伝子セグメントを含むヒトλ軽鎖配列を用いて内在性マウスλ軽鎖遺伝子座を標的化するための最初の標的化ベクター(12/1−λ標的化ベクター)の一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
図4Bは、12個のhVλ遺伝子セグメントおよびhJλ1遺伝子セグメント(12/1−κ標的化ベクター)、12個のhVλ遺伝子セグメントならびにhJλ1、2、3および7遺伝子セグメント(12/4−κ標的化ベクター)、12個のhVλ遺伝子セグメント、ヒトVκ−Jκゲノム配列およびhJλ1遺伝子セグメント(12(κ)1−κ標的化ベクター)、ならびに12個のhVλ遺伝子セグメント、ヒトVκ−Jκゲノム配列ならびにhJλ1、2、3および7遺伝子セグメント(12(κ)4−κ標的化ベクター)を含むヒトλ軽鎖配列を用いて内在性マウスκ軽鎖遺伝子座を標的化するための4個の最初の標的化ベクターの一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
図5Aは、40個のhVλ遺伝子セグメントおよび単一のhJλ遺伝子セグメントをマウスλ軽鎖遺伝子座に漸進的に挿入するための標的化ストラテジーの一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
図5Bは、40個のhVλ遺伝子セグメントおよび単一のhJλ遺伝子セグメントをマウスκ遺伝子座に漸進的に挿入するための標的化ストラテジーの一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
図6は、ヒトκ遺伝子間配列、複数のhJλ遺伝子セグメントまたはその両方を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座を構築するための独特のヒトλ−κハイブリッド標的化ベクターを作製するために使用された標的化工程および分子操作工程の一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
図7Aは、内在性Cλ2遺伝子に作動可能に接続された40個のhVλ遺伝子セグメントおよび単一のhJλ遺伝子セグメントを含む改変されたマウスλ軽鎖遺伝子座についての遺伝子座の構造の一定の拡大比ではない全体的な説明図を示している。
図7Bは、内在性Cκ遺伝子に作動可能に接続された連続するヒトVκ−Jκゲノム配列ありまたはなしで、40個のhVλ遺伝子セグメントおよび1個または4個のhJλ遺伝子セグメントを含む4個の独立した改変されたマウスκ軽鎖遺伝子座についての遺伝子座の構造の一定の拡大比ではない全般的な説明を示している。
図8Aは、野生型マウス(WT)、ヒトVκ−Jκゲノム配列を含む12個のhVλ遺伝子セグメントおよび4個のhJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(12hVλ−VκJκ−4hJλ)ならびに40個のhVλ遺伝子セグメントおよび1個のhJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−1hJλ)由来の、CD19+に対してゲーティングされたIgλ+およびIgκ+脾細胞のコンタープロット(contour plot)を示している。
図8Bは、野生型(WT)、ヒトVκ−Jκゲノム配列を含む12個のhVλ遺伝子セグメントおよび4個のhJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(12hVλ−VκJκ−4hJλ)ならびに40個のhVλ遺伝子セグメントおよび1個のhJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−1hJλ)から回収された脾臓におけるCD19+B細胞の総数を示している。
図9Aの上のパネルは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)由来の、シングレット(singlet)に対してゲーティングされ、かつBおよびT細胞(それぞれCD19+およびCD3+)について染色された脾細胞のコンタープロットを示している。下のパネルは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)由来の、CD19+に対してゲーティングされ、かつIgλ+およびIgκ+発現について染色された、脾細胞のコンタープロットを示している。
図9Bは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)から回収された脾臓におけるCD19+、CD19+Igκ+およびCD19+Igλ+B細胞の総数を示している。
図9Cは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)由来の、CD19+に対してゲーティングされ、かつ免疫グロブリンDIgD)および免疫グロブリンM(IgM)について染色された、脾細胞のコンタープロットを示している。コンタープロットの各々において、成熟B細胞(WTについては72、40hVλ−VκJκ−4hJλについては51)および移行B細胞(transitional B cell)(WTについては13、40hVλ−VκJκ−4hJλについては22)が表示されている。
図9Dは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)から回収された脾臓におけるCD19+B細胞、移行B細胞(CD19+IgMhiIgDlo)および成熟B細胞(CD19+IgMloIgDhi)の総数を示している。
図10Aの上のパネルは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)由来の、BおよびT細胞(それぞれCD19+およびCD3+)について染色された骨髄のコンタープロットを示している。下のパネルは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)由来の、CD19+に対してゲーティングされ、かつckit+およびCD43+について染色された、骨髄のコンタープロットを示している。下のパネルのコンタープロットでは、プロB細胞(pro B cell)およびプレB細胞(pre B cell)が表示されている。
図10Bは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)の大腿骨から回収された骨髄中のプロB細胞(CD19+CD43+ckit+)およびプレB細胞(CD19+CD43−ckit−)の数を示している。
図10Cは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)由来の、免疫グロブリンM(IgM)およびB220について染色されたシングレットに対してゲーティングされた骨髄のコンタープロットを示している。コンタープロットの各々において、未熟、成熟およびプロ/プレB細胞が表示されている。
図10Dは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)の大腿骨から単離された骨髄中の未熟B細胞(B220intIgM+)および成熟B細胞(B220hiIgM+)の総数を示している。
図10Eは、野生型マウス(WT)ならびにヒトVκ−Jκゲノム配列を含む40個のhVλおよび4個のJλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス(40hVλ−VκJκ−4hJλ)の大腿骨から単離された、IgλおよびIgκ発現について染色された未熟B細胞(B220intIgM+)および成熟B細胞(B220hiIgM+)に対してゲーティングされた骨髄のコンタープロットを示している。
図11は、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞RNAから増幅された18個の独立したRTPCRクローンのVλ−Jλ−Cκジャンクションヌクレオチド配列アラインメントを示している。A6=配列番号57;B6=配列番号58;F6=配列番号59;B7=配列番号60;E7=配列番号61;F7=配列番号62;C8=配列番号63;E12=配列番号64;1−4=配列番号65;1−20=配列番号66;3B43=配列番号67;5−8=配列番号68;5−19=配列番号69;1010=配列番号70;11A1=配列番号71;7A8=配列番号72;3A3=配列番号73;2−7=配列番号74。小文字塩基は、組換え中の変異および/またはN付加に起因する非生殖細胞系列の塩基を示している。hJλ1およびマウスCκのヌクレオチド配列によってコードされるフレームワーク4領域(FWR4)内のコンセンサスアミノ酸が、配列アラインメントの下に表示されている。
図12は、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に、連続するヒトVκ−Jκゲノム配列を含むヒトλ軽鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞RNAから増幅された12個の独立したRT−PCRクローンのVλ−Jλ−Cκジャンクションのヌクレオチド配列アラインメントを示している。5−2=配列番号87;2−5=配列番号88;1−3=配列番号89;4B−1=配列番号90;3B−5=配列番号91;7A−1=配列番号92;5−1=配列番号93;4A−1=配列番号94;11A−1=配列番号95;5−7=配列番号96;5−4=配列番号97;2−3=配列番号98。小文字の塩基は、組換え中の変異および/またはN付加に起因する非生殖細胞系列の塩基を示している。ヒトJλおよびマウスCκの各々のヌクレオチド配列によってコードされるフレームワーク4領域(FWR4)内のコンセンサスアミノ酸が、配列アラインメントの下に表示されている。
図13は、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞RNAから増幅された3個の独立したRT−PCRクローンのVλ−Jλ−Cλジャンクションのヌクレオチド配列アラインメントを示している。2D1=配列番号101;2D9=配列番号102;3E15=配列番号103。小文字の塩基は、組換え中の変異および/またはN付加に起因する非生殖細胞系列の塩基を示している。hJλ1およびマウスCλ2のヌクレオチド配列によってコードされるフレームワーク4領域(FWR4)内のコンセンサスアミノ酸が、配列アラインメントの下に表示されている。

0148

詳細な説明
様々な実施形態の具体的な特徴が、詳細に明らかにされるが、その具体的な態様、実施形態および実施例の記載は、請求項の対象を限定せず;請求項は、本発明の範囲を記載するものである。本開示において使用されるすべての用語および語句は、当該分野において通常それらに与えられている意味を包含する。

0149

用語「連続する」は、同じ核酸分子上に存在することに対する言及を包含し、例えば、2つの核酸配列が、同じ核酸(nucleic)分子上に存在するが別の核酸配列によって中断されている場合、それらは「連続している」。例えば、再配列されたV(D)J配列の最後のコドンは、定常領域配列の最初のコドンに直接続いていないが、そのV(D)J配列は、定常領域遺伝子配列と「連続している」。別の例では、2個のV遺伝子セグメント配列が、同じゲノムフラグメント上に存在する場合、それらは「連続している」が、それらは、V領域のコドンをコードしない配列によって分断されていることがあり、例えば、それらは、制御配列、例えば、プロモーターまたは他の非コード配列によって分断されていることがある。1つの実施形態において、連続する配列は、野生型ゲノムに見られるように配置されたゲノム配列を含むゲノムフラグメントを含む。

0150

語句「〜に由来する」は、言及されている遺伝子または遺伝子セグメント「に由来する」可変領域に関して使用されるとき、特定の再配列されていない遺伝子セグメントまたはその可変ドメインを発現する遺伝子を形成するように再配列された遺伝子セグメントまでその配列をさかのぼることができること(適用可能な場合、スプライシング差異(splice differences)および体細胞変異を説明する)を含む。

0151

語句「機能的」は、可変領域遺伝子セグメントまたは連結遺伝子セグメントに関して使用されるとき、発現される抗体レパートリーの使用のことを指す;例えば、ヒトでは、Vλ遺伝子セグメント3−1、4−3、2−8などが機能的である一方、Vλ遺伝子セグメント3−2、3−4、2−5などは、非機能的である。

0152

「重鎖遺伝子座」は、野生型マウスにおいて重鎖可変(VH)、重鎖多様性(DH)、重鎖連結(JH)および重鎖定常(CH)領域のDNA配列が見られる、染色体上の位置、例えば、マウス染色体上の位置を含む。

0153

「κ遺伝子座」は、野生型マウスにおいてκ可変(Vκ)、κ連結(Jκ)およびκ定常(Cκ)領域のDNA配列が見られる、染色体上の位置、例えば、マウス染色体上の位置を含む。

0154

「λ遺伝子座」は、野生型マウスにおいてλ可変(Vλ)、λ連結(Jλ)およびλ定常(Cλ)領域のDNA配列が見られる、染色体上の位置、例えば、マウス染色体上の位置を含む。

0155

用語「再配列されていない」は、V遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメント(重鎖の場合、D遺伝子セグメントも同様)が、別々に維持されているが、V(D)Jレパートリーのうちの単一のV,(D),Jを含む再配列されたV(D)J遺伝子を形成するように連結されることが可能である、免疫グロブリン遺伝子座の状態を含む。

0156

ヒトλ可変ドメインを発現するマウス
完全にヒトのものである抗体または部分的にヒトのものでありかつ部分的にマウスのものである抗体を発現するマウスが以前に報告されている。VELOCIMMUNE(登録商標遺伝子操作マウスは、内在性マウス遺伝子座に、ヒトV(D)J遺伝子セグメントによる再配列されていないV(D)J遺伝子セグメントの置換を含む。VELOCIMMUNE(登録商標)マウスは、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有するキメラ抗体を発現する(例えば、米国特許第7,605,237号を参照のこと)。他のほとんどの報告は、無能力にされた内在性免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスにおいて、完全ヒト導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現するマウスに関する。

0157

抗体軽鎖は、2個の別個の遺伝子座:カッパー(κ)およびラムダ(λ)のうちの1つによってコードされる。マウス抗体軽鎖は、主にκタイプである。マウス抗体を産生するマウス、および完全ヒト抗体またはキメラヒト−マウス抗体を産生する改変されたマウスは、軽鎖の使用頻度に偏りを示す。ヒトもまた、軽鎖の偏りを示すが、マウスほど顕著でない;マウスにおけるκ軽鎖とλ軽鎖との比は、約95:5である一方で、ヒトのその比は、約60:40である。マウスではまず第一にλ可変遺伝子座がそれほど多様でないので、マウスにおけるより顕著な偏りは、抗体の多様性に深刻な影響を及ぼさないと考えられている。このことは、ヒトではそうではない。ヒトλ軽鎖遺伝子座は、非常に多様である。

0158

ヒトλ軽鎖遺伝子座は、1,000kbに及び、可変(V)または連結(J)セグメントをコードする80を超える遺伝子を含む(図1)。ヒトλ軽鎖遺伝子座のうち、観察されるすべてのVλドメインの過半数が、遺伝子セグメント1−40、1−44、2−8、2−14および3−21によってコードされる。全体的に見て、約30程度のヒトVλ遺伝子セグメントが、機能的であると考えられている。Jλ遺伝子セグメントは7つ存在し、そのうち4つ(Jλ1、Jλ2、Jλ3およびJλ7)だけが、一般的に機能的なJλ遺伝子セグメントとされている。

0159

ヒトλ軽鎖遺伝子座が、機能的な軽鎖タンパク質を形成するように組み換わることができるいくつかの可変領域遺伝子セグメントを有するという点において、ヒトのλ軽鎖遺伝子座は、マウスとヒトの両方のκ遺伝子座と構造が似ている。ヒトλ軽鎖遺伝子座は、およそ70個のV遺伝子セグメントおよび7個のJλ−Cλ遺伝子セグメント対を含む。これらのJλ−Cλ遺伝子セグメント対の4つだけが、機能的であるとみられる。いくつかの対立遺伝子において、第5のJλ−Cλ遺伝子セグメント対は、報告によると偽遺伝子(Cλ6)である。70個のVλ遺伝子セグメントは、38個の機能的な遺伝子セグメントを含むとみられる。70個のVλ配列は、3個のクラスターに配置されており、そのすべてが、異なるV遺伝子ファミリー群の異なるメンバーを含む(クラスターA、BおよびC;図1)。これは、ヒトV領域を有する抗体を非ヒト動物において作製するための、相対的に利用されていない多様性の潜在的に豊富供給源である。

0160

全く対照的に、マウスλ軽鎖遺伝子座は、(系統に応じて)2つまたは3つのマウスVλ領域遺伝子セグメントしか含まない(図2)。少なくともこのために、マウスにおけるκへの大きな偏りは、抗体多様性全体に対して特に不利益でないと考えられている。

0161

マウスλ軽鎖遺伝子座の公開されているマップによると、その遺伝子座は、およそ200kb以内の2つのクラスターの遺伝子セグメントから本質的になる(図2)。その2つのクラスターは、独立した再配列が可能なV、JおよびC遺伝子の2セットを含む:Vλ2−Jλ2−Cλ2−Jλ4−Cλ4およびVλ1−Jλ3−Cλ3−Jλ1−Cλ1。Vλ2は、すべてのJλ遺伝子セグメントと組み換わると見出されているが、Vλ1は、もっぱらCλ1と組み換わるとみられる。Cλ4は、スプライス部位欠損した偽遺伝子であると考えられている。

0162

マウスκ軽鎖遺伝子座は、著しく異なる。組換え事象関与してマウスκ遺伝子座から機能的な軽鎖タンパク質をもたらす遺伝子セグメントの構造および数は、相当に複雑である(図3)。したがって、マウスλ軽鎖は、典型的なマウスでは抗体集団の多様性に大きく寄与しない。

0163

とりわけ、マウスにおいてヒトλ軽鎖遺伝子座の豊富な多様性を利用することは、軽鎖Vドメインのより完全なヒトレパートリーに対して供給源をもたらす可能性がある。この多様性を利用する以前の試みでは、マウスゲノムにランダムに組み込まれたヒトλ軽鎖遺伝子座の塊を含むヒト導入遺伝子が使用された(例えば、米国特許第6,998,514号および米国特許第7,435,871号を参照のこと)。報告によると、これらのランダムに組み込まれた(integrated)導入遺伝子を含むマウスは、完全ヒトλ軽鎖を発現するが、しかしながら、場合によっては、片方または両方の内在性軽鎖遺伝子座がインタクトなまま残る。そのヒトλ軽鎖配列は、マウスの発現抗体レパートリーにおいてマウス軽鎖(κまたはλ)と競合するので、この状況は、望ましくない。

0164

対照的に、本発明者らは、マウス軽鎖遺伝子座から直接1つ以上のλ軽鎖核酸配列を発現すること(内在性マウス軽鎖遺伝子座における置換によるものを含む)ができる遺伝的に改変されたマウスを記載する。内在性遺伝子座からヒトλ軽鎖配列を発現することができる遺伝的に改変されたマウスは、ヒト重鎖遺伝子座を含むマウスとさらに交配され得、それゆえ完全にヒトのものであるV領域(重鎖および軽鎖)を含む抗体を発現するために使用され得る。様々な実施形態において、それらのV領域は、マウス定常領域とともに発現する。様々な実施形態において、内在性マウス免疫グロブリン遺伝子セグメントは存在せず、それらのV領域は、ヒト定常領域とともに発現する。これらの抗体は、数多くの用途(診断的な用途と治療的な用途の両方)において有益であると判明するだろう。

0165

ヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントに由来する結合タンパク質をマウスにおいて発現させる様々な実施形態について、多くの利点を実現することができる。内在性軽鎖遺伝子座、例えば、マウスκまたはλ遺伝子座にヒトλ配列を配置することによって、利点を実現することができる。そのようなマウスから産生される抗体は、マウスCL領域(具体的には、マウスCκまたはCλ領域)に融合されたヒトVλドメインを含む軽鎖を有し得る。そのマウスは、ヒトCL領域(具体的には、Cκおよび/またはCλ領域)とともに使用するための、同定およびクローニングに適したヒトVλドメインも発現し得る。そのようなマウスにおけるB細胞発生は、その他の点では正常であるので、CλまたはCκ領域という背景において適合性のVλドメイン(体細胞変異したVλドメインを含む)を作製することが可能である。

0166

免疫グロブリンκまたはλ軽鎖遺伝子座に再配列されていないVλ遺伝子セグメントを含む遺伝的に改変されたマウスが記載される。Cκおよび/またはCλ領域に融合されたヒトVλドメインを有する軽鎖を含む抗体を発現するマウスが記載される。

0167

免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の無効の(sterile)転写物
マウスにおいてヒト免疫グロブリンλ配列を発現するというテーマバリエーションは、そのような発現が可能な遺伝的に改変されたマウスの様々な実施形態に反映される。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、ヒト遺伝子座由来のある特定の非コード配列を含む。1つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、内在性κ軽鎖遺伝子座にヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントを含み、さらに、ヒトκ軽鎖ゲノムフラグメントを含む。特定の実施形態において、そのヒトκ軽鎖ゲノムフラグメントは、天然にはヒトVκ遺伝子セグメントとヒトJκ遺伝子セグメントとの間に見られる非コード配列である。

0168

上記ヒトおよびマウスκ軽鎖遺伝子座は、開始コドンまたはオープンリーディングフレームのいずれかを欠く無効の転写物をコードし、かつκ軽鎖遺伝子座の転写を制御するエレメントとされている、配列を含む。これらの無効の転写物は、最も近位のVκ遺伝子セグメントの下流または3’側、かつκ軽鎖定常領域遺伝子(Cκ)の上流に存在するκ軽鎖イントロンエンハンサー(Eκi)の上流または5’側に位置する遺伝子間配列から生じる。その無効の転写物は、その遺伝子間配列の再配列から生じ、それにより、Cκに融合されたVκJκ1セグメントが形成される。

0169

Cκ遺伝子の上流のκ軽鎖遺伝子座の置換によって、無効の転写物をコードする遺伝子間領域が除去され得る。それゆえ、様々な実施形態において、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントによるマウスCκ遺伝子の上流のマウスκ軽鎖配列の置換は、ヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントを含むが無効の転写物をコードするκ軽鎖遺伝子間領域を含まないヒト化されたマウスκ軽鎖遺伝子座をもたらし得る。

0170

本明細書中に記載されるように、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントによる内在性マウスκ軽鎖遺伝子座のヒト化(ここで、そのヒト化によって遺伝子間領域が除去される)は、λ軽鎖の使用頻度の著明な増加に加えて、κ軽鎖遺伝子座の使用頻度の著しい低下をもたらす。それゆえ、その遺伝子間領域を欠くヒト化マウスは、そのマウスがヒト軽鎖可変ドメイン(例えば、ヒトλまたはκドメイン)を有する抗体を産生し得る点で有用であるが、その遺伝子座からの使用頻度は低下する。

0171

転写に関して、最終的なヒトVλ遺伝子セグメントと第1のヒトJλ遺伝子セグメントとの間にκ遺伝子間領域を含むVλ遺伝子座を作製するためのヒトκ遺伝子間領域の挿入に加えて、ヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントによる内在性マウスκ軽鎖遺伝子座のヒト化も記載され;それは、κ遺伝子間領域を欠く遺伝子座よりも高発現のB細胞集団を示す。この知見は、その遺伝子間領域が(無効の転写物を介して直接または間接的に)内在性λ軽鎖遺伝子座の使用を抑制するという仮説と一致する。そのような仮説の下では、その遺伝子間領域を含めることによって、内在性λ軽鎖遺伝子座の使用頻度が低下し得、それにより、そのマウスは制限された選択肢となるが、改変された遺伝子座(λをκに)を使用して抗体が産生される。

0172

様々な実施形態において、ヒトλ軽鎖配列によるマウスCκ遺伝子の上流のマウスκ軽鎖配列の置換は、転写の点から最も3’側のVλ遺伝子セグメントの3’非翻訳領域と第1のヒトJλ遺伝子セグメントに対して5’側との間に配置されたヒトκ軽鎖遺伝子間領域をさらに含む。あるいは、そのような遺伝子間領域は、内在性λ軽鎖遺伝子座において欠失を作製することによって、置換される内在性κ軽鎖遺伝子座(マウスCκ遺伝子の上流)から取り除かれ得る。同様に、この実施形態では、それらのマウスは、ヒトλ軽鎖配列を含む内在性κ軽鎖遺伝子座から抗体を産生する。

0173

ヒトVλドメインを発現するようにマウスを操作するアプローチ
内在性CL(例えば、CκまたはCλ)領域に融合されたヒトVλドメインを有する軽鎖を含む抗体を産生する遺伝的に改変されたマウスを作製する様々なアプローチが記載される。様々な実施形態において、片方または両方の内在性軽鎖遺伝子座の欠失を含む遺伝的改変が記載される。例えば、内在性抗体レパートリーからマウスλ軽鎖を排除するために、第1のVλ−Jλ−Cλ遺伝子クラスターの欠失、およびヒトVλ−Jλ遺伝子セグメントによる第2の遺伝子クラスターのVλ−Jλ遺伝子セグメントの全体的または部分的な置換が行われ得る。遺伝的に改変されたマウス胚、細胞、ならびにそのマウス、マウス胚および細胞を作製するための標的化構築物も提供される。

0174

内在性Cλ遺伝子は、インタクトなままであり、ゆえに正常な機能性および内在性重鎖の定常領域と会合する能力を保持するので、様々な実施形態において、1つの内在性Vλ−Jλ−Cλ遺伝子クラスターの欠失および別の内在性Vλ−Jλ−Cλ遺伝子クラスターのVλ−Jλ遺伝子セグメントの置換では、その動物における天然の抗体定常領域の会合および機能の相対的に最小限の破壊が用いられる。したがって、そのような実施形態では、その改変は、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む機能的な抗体分子の組み立てのために機能的な軽鎖定常領域に依存する他の内在性重鎖定常領域に影響しない。さらに、様々な実施形態において、その改変は、内在性重鎖および軽鎖、例えば、マウスCλ領域に接続されたhVλドメインを含む、膜に結合した機能的な抗体分子の組み立てにも影響しない。少なくとも1つの機能的なCλ遺伝子が、内在性遺伝子座に保持されるので、ヒトVλ−Jλ遺伝子セグメントによる内在性Vλ−Jλ−Cλ遺伝子クラスターのVλ−Jλ遺伝子セグメントの置換を含む動物は、その動物の発現抗体レパートリー中に存在するヒトVλ−Jλ遺伝子セグメントによって、免疫応答中に抗原に結合することができる正常なλ軽鎖を産生することができるはずである。

0175

欠失される内在性マウスVλ−Jλ−Cλ遺伝子クラスターの略図(一定の拡大比ではない)が、図2に提供される。図示されるように、マウスλ軽鎖遺伝子座は、2つの遺伝子クラスターに組織化され、その両方が、機能的マウスλ軽鎖を形成するように組み換わることができる機能的遺伝子セグメントを含む。内在性マウスVλ1−Jλ3−Cλ3−Jλ1−Cλ1遺伝子クラスターは、組換え部位に隣接したネオマイシンカセットを有する標的化構築物(標的化ベクター1)によって欠失される。他方の内在性遺伝子クラスター(Vλ2−Vλ3−Jλ2−Cλ2−Jλ4−Cλ4)は、組換え部位に隣接したハイグロマイシン−チミジンキナーゼカセットを有する標的化構築物(標的化ベクター2)によって部分的に欠失される。この第2の標的化事象では、Cλ2−Jλ4−Cλ4内在性遺伝子セグメントは保持される。第2の標的化構築物(標的化ベクター2)は、上記の第1の標的化構築物(標的化ベクター1)における組換え部位とは異なる組換え部位を用いて構築され、それにより、標的化が成功した後にその選択カセットの選択的な欠失が可能になる。得られる二重標的化された(double−targeted)遺伝子座は、内在性λ軽鎖を産生することができないという点において、機能的にサイレンシングされている。この改変された遺伝子座は、ヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントの挿入のために使用され、それにより、ヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントを含む内在性マウスλ遺伝子座が作製され得る(ここで、改変された遺伝子座において組換えが生じると、その動物は、内在性マウスCλ遺伝子セグメントに接続された再配列されたヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントを含むλ軽鎖を産生する)。

0176

内在性λ遺伝子セグメントを非機能的にするようにマウスを遺伝的に改変することは、様々な実施形態において、その抗体レパートリーにおいてもっぱらκ軽鎖を示すマウスをもたらし、そのマウスは、その免疫応答におけるλ軽鎖の役割の評価にとって有用になり、また、Vκドメインを含むがVλドメインを含まない抗体レパートリーの作製にとって有用になる。

0177

内在性マウスλ軽鎖遺伝子座において組み換えられるマウスCλ遺伝子に接続されたhVλを発現する遺伝的に改変されたマウスは、当該分野で公知の任意の方法によって作製され得る。ヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントによる内在性マウスVλ2−Vλ3−Jλ2遺伝子セグメントの置換の略図(一定の拡大比ではない)が図4Aに提供される。図示されるように、非機能的にされた内在性マウスλ軽鎖遺伝子座は、組換え部位に隣接したネオマイシンカセットを含む標的化構築物(12/1−λ標的化ベクター)によって置換される。Vλ2−Vλ3−Jλ2遺伝子セグメントは、12個のhVλ遺伝子セグメントおよび単一のhJλ遺伝子セグメントを含むヒトλ配列を含むゲノムフラグメントで置換される。

0178

したがって、この第1のアプローチによって、1つ以上のhVλ遺伝子セグメントが、単一のhJλ遺伝子セグメントと連続する内在性λ軽鎖遺伝子座に位置づけられる(図4A)。

0179

改変された内在性λ軽鎖遺伝子座に対するさらなる改変は、より多くのhVλ遺伝子セグメントを挿入する同様の手法を用いて達成され得る。例えば、さらなるヒトhVλ遺伝子セグメントの漸進的な挿入のために使用される2つの追加の標的化構築物(+16−λおよび+12−λ標的化ベクター)の略図が図5Aに提供される。図示されるように、特定のヒトhVλ遺伝子セグメントを含む追加のゲノムフラグメントが、ヒトλ軽鎖配列の先の挿入によって提供された相同性を用いて、逐次的な工程で、改変された内在性λ軽鎖遺伝子座に挿入される。図示される各標的化構築物を用いた組換えの際、逐次的な様式で、28個の追加のhVλ遺伝子セグメントが、改変された内在性λ軽鎖遺伝子座に挿入される。これにより、マウスCλ遺伝子に接続されたヒトVλ−Jλ遺伝子セグメントを含むλ軽鎖タンパク質を産生するキメラ遺伝子座が作製される。

0180

ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントをマウスλ遺伝子座に挿入する上記のアプローチは、Cλ2−Jλ4−Cλ4遺伝子セグメントの下流に位置づけられたエンハンサーを維持する(Enh2.4、EnhおよびEnh3.1と命名される、図4Aおよび図5A)。このアプローチによって、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座に単一の改変された対立遺伝子がもたらされる(図7A)。

0181

マウスCλ遺伝子セグメントに作動可能に接続されたhVλおよびJλ遺伝子セグメントを含む軽鎖を発現するマウスを作製するための組成物および方法(内在性マウスλ軽鎖遺伝子座からそのような遺伝子を発現するマウスを作製するための組成物および方法を含む)が提供される。それらの方法は、選択的に、1つの内在性マウスVλ−Jλ−Cλ遺伝子クラスターを非機能的にする工程(例えば、標的化された欠失によって)ならびにその内在性マウスλ軽鎖遺伝子座においてhVλおよびJλ遺伝子セグメントを使用してマウスにおいてhVλドメインを発現させる工程を包含する。

0182

あるいは、第2のアプローチでは、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントが、内在性κ軽鎖遺伝子座に位置づけられ得る。その遺伝的改変は、様々な実施形態において、内在性κ軽鎖遺伝子座の欠失を含む。例えば、内在性抗体レパートリーからマウスκ軽鎖を排除するために、マウスVκおよびJκ遺伝子セグメントの欠失が行われ得る。遺伝的に改変されたマウス胚、細胞、ならびにそのマウス、マウス胚および細胞を作製するための標的化構築物も提供される。

0183

上で述べられた理由のために、マウスVκおよびJκ遺伝子セグメントの欠失では、相対的に最小限の破壊が用いられる。欠失されるマウスVκおよびJκ遺伝子セグメントの略図(一定の拡大比ではない)が図3に提供される。2個の正確に位置づけられた標的化ベクター(各々が部位特異的組換え部位を使用する)の間に位置するマウス配列のリコンビナーゼによって媒介される欠失を介して、内在性マウスVκおよびJκ遺伝子セグメントが欠失される。第1の標的化ベクター(Jκ標的化ベクター)は、マウスJκ遺伝子セグメントを欠失させる第1の標的化事象において使用される。第2の標的化ベクター(Vκ標的化ベクター)は、最も遠位のマウスVκ遺伝子セグメントの5’に位置する配列を欠失させる、第2の逐次的な標的化事象において使用される。両方の標的化ベクターが、部位特異的組換え部位を含み、それにより、標的化が成功した後に、両方の選択カセットおよび介在するすべてのマウスκ軽鎖配列の選択的欠失が可能になる。得られる欠失された遺伝子座は、内在性κ軽鎖を産生することができないという点において、機能的にサイレンシングされている。この改変された遺伝子座は、hVλおよびJλ遺伝子セグメントの挿入のために使用され、それにより、hVλおよびJλ遺伝子セグメントを含む内在性マウスκ遺伝子座が作製され得る(ここで、改変された遺伝子座において組換えが生じると、その動物は、内在性マウスCκ遺伝子セグメントに作動可能に接続された再配列されたhVλおよびJλ遺伝子セグメントを含むλ軽鎖を産生する)。ヒトλ軽鎖配列を含む様々な標的化ベクターが、この欠失されたマウスκ遺伝子座と組み合わせて使用されることにより、マウスCκ領域と作動可能に接続されたヒトλ遺伝子セグメントを含むハイブリッド軽鎖遺伝子座が作製され得る。

0184

したがって、第2のアプローチによって、1つ以上のヒトVλ遺伝子セグメントが、単一のヒトJλ遺伝子セグメントと連続するマウスκ軽鎖遺伝子座に位置づけられる(12/1−κ標的化ベクター,図4B)。

0185

様々な実施形態において、このアプローチに対する変法は、遺伝子セグメントおよび/または制御配列を付加することにより、マウス抗体レパートリー内のマウスκ遺伝子座からのヒトλ軽鎖配列の使用頻度が最適化され得る。

0186

第3のアプローチでは、1つ以上のhVλ遺伝子セグメントが、4個のhJλ遺伝子配列と連続するマウスκ軽鎖遺伝子座に位置づけられる(12/4−κ標的化ベクター,図4B)。

0187

第3のアプローチでは、1つ以上のhVλ遺伝子セグメントが、ヒトκ遺伝子間配列および単一のhJλ遺伝子配列と連続するマウスκ軽鎖遺伝子座に位置づけられる(12(κ)1−κ標的化ベクター,図4B)。

0188

第4のアプローチでは、1つ以上のhVλ遺伝子セグメントが、ヒトκ遺伝子間配列、4個のhJλ遺伝子配列と連続するマウスκ軽鎖遺伝子座に位置づけられる(12(κ)4−κ標的化ベクター図4B)。

0189

マウスκ遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを挿入する上記アプローチのすべてが、Cκ遺伝子の上流にκイントロンエンハンサーエレメント(Eκiと命名される,図4Bおよび図5B)を維持し、かつCκ遺伝子の下流に3’κエンハンサー(Eκ3’と命名される,図4Bおよび図5B)を維持する。このアプローチは、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座に4個の別個の改変された対立遺伝子をもたらす(図7B)。

0190

様々な実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、内在性マウスλ軽鎖遺伝子座のノックアウトを含む。1つの実施形態において、そのλ軽鎖遺伝子座は、Vλ2からJλ2に及ぶ領域およびVλ1からCλ1に及ぶ領域を欠失させるストラテジーによってノックアウトされる(図2)。内在性λ軽鎖遺伝子座が内在性λドメインを発現する能力を低下させるかまたは排除する任意のストラテジーが、本開示における実施形態との使用に適している。

0191

遺伝的に改変されたマウス由来のラムダドメイン抗体
マウスκまたはλ軽鎖遺伝子座にヒトλ配列を含むマウスは、マウスCL(CκまたはCλ)領域に融合されたhVλ領域を含む軽鎖を発現する。これらは、(a)機能的にサイレンシングされた軽鎖遺伝子座(例えば、内在性マウスκまたはλ軽鎖遺伝子座のノックアウト)を含むマウス;(b)内在性マウスCλ遺伝子に作動可能に接続されたhVおよびhJ遺伝子セグメントを含む内在性マウスλ軽鎖遺伝子座を含むマウス;(c)内在性マウスCκ遺伝子に作動可能に接続されたhVκおよびhJκ遺伝子セグメントを含む内在性マウスκ軽鎖遺伝子座を含むマウス;および(d)一方のκ対立遺伝子がhVκおよびhJκを含み;他方のκ対立遺伝子がhVλおよびhJλを含み;一方のλ対立遺伝子がhVλおよびhJλを含み、一方のλ対立遺伝子がサイレンシングされているかもしくはノックアウトされているか、または両方のλ対立遺伝子が、hVλおよびhJλを含み;かつ各々がhVH、hDHおよびhJHを含む2個の重鎖対立遺伝子を含むマウスと都合よく交配される。

0192

CκまたはCλという背景において発現されるhVλドメインを含む抗体は、hVλドメインをコードする核酸を、ヒトCλをコードする遺伝子を有する発現構築物にクローニングすることによって、完全ヒト抗体を作製するために使用される。得られる発現構築物は、hCλに融合された完全なhVλドメインを示す抗体の発現に適した宿主細胞トランスフェクトされる。

0193

以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製するおよび使用する方法を説明するために提供され、本発明者らが本発明者らの発明と見なす範囲を制限することを目的としていない。別段示されない限り、温度は、セルシウス度で示され、圧力は、大気圧または大気圧付近である。

0194

実施例I
マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の欠失
マウスκおよびλ軽鎖遺伝子座を不活性化するためにマウスゲノム細菌人工染色体(BAC)ライブラリーを改変するために、VELOCIGENE(登録商標)技術(例えば、米国特許第6,586,251号およびValenzuelaら(2003)High−throughput engineering of the mouse genome coupled with high−resolution expression analysis,Nature Biotech.21(6):652−659を参照のこと)を用いて様々な標的化構築物を作製した。

0195

マウスλ軽鎖遺伝子座の欠失。Vλ−Jλ−Cλ遺伝子クラスターの標的化欠失によって内在性マウスλ軽鎖遺伝子座を不活性化するために、マウスBACクローンRP23−135k15(Invitrogen)由来のDNAを相同組換えによって改変した(図2)。

0196

簡潔には、Vλ1遺伝子セグメントの5’側の配列を含む5’マウス相同性アームおよびCλ1遺伝子セグメントの3’側の配列を含む3’マウス相同性アームとともにloxP部位に隣接したネオマイシンカセットを含む標的化ベクターを用いて、Vλ1−Jλ3−Cλ3−Jλ1−Cλ1遺伝子セグメントを含む近位のクラスター全体を単一の標的化事象において欠失させた(図2,標的化ベクター1)。

0197

Vλ2−Jλ2−Cλ2−Jλ4−Cλ4を含む遠位の内在性マウスλ遺伝子クラスターを正確に欠失させるために、第2の標的化構築物を調製したが、ただ、その第2の標的化構築物は、Vλ2遺伝子セグメントの5’側の配列を含む5’マウス相同性アームおよび内在性Cλ2遺伝子セグメントに対して5’側の配列を含む3’マウス相同性アームを含んでいた(図2,標的化ベクター2)。したがって、その第2の標的化構築物は、内在性マウスλ遺伝子座にCλ2−Jλ4−Cλ4をインタクトなままで残して、Vλ2−Jλ2を正確に欠失させた。不活性化された内在性λ遺伝子座(上に記載されたような)を含むES細胞を、当該分野で公知の核型分析およびスクリーニング法(例えば、TAQMAN(登録商標))によって確かめた。次いで、その改変されたES細胞からDNAを単離し、CREリコンビナーゼによる処理に供することによって、ネオマイシンマーカー遺伝子を含む近位の標的化カセットの欠失が媒介され、それにより、ただ1つのloxP部位だけが欠失に残った(図2,下)。

0198

マウスκ軽鎖遺伝子座の欠失。上に記載された方法と同様の方法を用いていくつかの標的化構築物を作製して、相同組換えによってマウスBACクローンRP23−302g12およびRP23−254m04(Invitrogen)からのDNAを改変することにより、2工程プロセスでマウスκ軽鎖遺伝子座を不活性化した(図3)。

0199

簡潔には、ハイグロマイシン−チミジンキナーゼ(hyg−TK)カセットに対して3’に単一のloxP部位を含むhyg−TKカセットを含む標的化ベクターを用いて、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座のJκ遺伝子セグメント(1−5)を単一の標的化事象において欠失させた(図3,Jκ標的化ベクター)。この標的化ベクターを作製するために使用された相同性アームは、内在性マウスJκ遺伝子セグメントの5’側および3’側のマウスゲノム配列を含んだ。第2の標的化事象では、最も遠位の内在性マウスVκ遺伝子セグメントに対して上流(5’)のマウスゲノム配列の一部を欠失させるための第2の標的化ベクターを調製した(図3,Vκ標的化ベクター)。この標的化ベクターは、逆向きのlox511部位、loxP部位およびネオマイシンカセットを含んだ。この標的化ベクターを作製するために使用された相同性アームは、最も遠位のマウスVκ遺伝子セグメントの上流のマウスゲノム配列を含んだ。それらの標的化ベクターを、ES細胞においてDNAを標的化するために逐次的な様式で(すなわち、Jκに次いでVκを)使用した。二重標的化染色体(すなわち、両方の標的化ベクターで標的化された単一の内在性マウスκ遺伝子座)を有するESを、当該分野で公知の核型分析およびスクリーニング法(例えば、Taqman(商標))によって確かめた。次いで、その改変されたES細胞からDNAを単離し、Creリコンビナーゼによる処理に供することによって、2つのlox部位が互いに対して逆向きで並置されつつ、内在性マウスVκ遺伝子セグメントおよび両方の選択カセットの欠失が媒介された(図3,下;配列番号1)。

0200

このようにして、下に記載される標的化ベクターを用いて再配列されていないヒトλ生殖細胞系列遺伝子セグメントを正確な様式で漸進的に挿入するための、インタクトなエンハンサーおよび定常領域を含む2つの改変された内在性軽鎖遺伝子座(κおよびλ)が作製された。

0201

実施例II
ヒトλ軽鎖ミニ遺伝子座によるマウス軽鎖遺伝子座の置換
上に記載された方法と同様の方法を用いて内在性マウスκおよびλ軽鎖遺伝子座にヒトλ遺伝子セグメントを漸進的に挿入するための複数の標的化ベクターを作出した。複数の独立した最初の改変を、内在性軽鎖遺伝子座に対して行ったところ、その各々が、マウス軽鎖定常遺伝子およびエンハンサーに作動可能に接続されたhVλおよびJλ遺伝子セグメントを含むキメラ軽鎖遺伝子座をもたらした。

0202

12個のヒトVλおよび1個のヒトJλ遺伝子セグメントを含むヒトλミニ遺伝子座。RP11−729g4と命名されたヒトBACクローン(Invitrogen)を用いて、クラスターAからの初めの12個の連続したヒトVλ遺伝子セグメントおよびhJλ1遺伝子セグメントまたは4個のhJλ遺伝子セグメントを含むように、一連の最初の標的化ベクターを作出した。図4Aおよび4Bは、それぞれマウスλおよびκ軽鎖遺伝子座においてヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの最初の挿入を行うために構築された標的化ベクターを示している。

0203

最初の標的化ベクターの第1のセットについては、12個のhVλ遺伝子セグメントおよびhJλ1遺伝子セグメントを含む729g4BACクローンからの124,125bpのDNAフラグメントを、3’マウス相同性アームのライゲーション用にhJλ1遺伝子セグメントの996bp下流(3’)にPI−SceI部位を含むように作出した。2個の異なるセットの相同性アームを、このヒトフラグメントへのライゲーションに使用した;一方のセットの相同性アームは、135k15BACクローンからの内在性マウスλ配列を含み(図4A)、もう一方のセットは、それぞれマウスBACクローンRP23−302g12およびRP23−254m04のマウスVκおよびJκ遺伝子セグメントの5’側および3’側の内在性κ配列を含んだ(図4B)。

0204

12/1−λ標的化ベクターの場合(図4A)、実施例1に記載された改変されたマウスλ遺伝子座のマウスCλ2−Jλ4−Cλ4およびエンハンサー2.4を含む27,847bpのDNAフラグメントの5’末端にPI−SceI部位を作出した。その約28kbのマウスフラグメントを、約124kbのヒトλフラグメントへのライゲーションによって3’同性アームとして使用することにより、5’から3’に向かって、hJλ1遺伝子セグメント、そのhJλ1遺伝子セグメントの3’側の996bpのヒトλ配列、マウスCλ2遺伝子に対して5’側の1229bpのマウスλ配列、マウスCλ2遺伝子、およびその約28kbのマウスフラグメントの残りの部分を含む3’ジャンクションが作製された。ヒトVλ3−12遺伝子セグメントの上流(5’)には、内在性マウスλ遺伝子座の5’側の配列に対応する23,792bpのマウスゲノムDNAを含む5’マウス相同性アームの開始部(start)より前に、追加の1456bpのヒトλ配列が存在した。5’相同性アームとそのヒトλ配列の始まりとの間に、Frt部位に隣接したネオマイシンカセットが存在した。

0205

したがって、12/1−λ標的化ベクターは、5’から3’に向かって、内在性λ遺伝子座の5’側の約24kbのマウスλゲノム配列を含む5’相同性アーム、5’Frt部位、ネオマイシンカセット、3’Frt部位、初めの12個の連続したhVλ遺伝子セグメントおよびhJλ1遺伝子セグメントを含む約123kbのヒトゲノムλ配列、PI−SceI部位、ならびに内在性Cλ2−Jλ4−Cλ4遺伝子セグメント、マウスエンハンサー2.4配列およびそのエンハンサー2.4の下流(3’)の追加のマウスゲノム配列を含む約28kbのマウスゲノム配列を含む3’相同性アームを含んだ(図4A)。

0206

同様の様式において、12/1−κ標的化ベクター(図4B)は、内在性κ遺伝子座に対する標的化が相同組換えによって達成され得るようにマウスκ配列を含むマウス相同性アームを使用したことを除いて、同じ約124ヒトλフラグメントを使用した。したがって、12/1−κ標的化ベクターは、5’から3’に向かって、内在性κ遺伝子座の5’側の約23kbのマウスゲノム配列を含む5’相同性アーム、I−CeuI部位、5’Frt部位、ネオマイシンカセット、3’Frt部位、初めの12個の連続したhVλ遺伝子セグメントおよびhJλ1遺伝子セグメントを含む約124kbのヒトゲノムλ配列、PI−SceI部位、ならびに内在性マウスCκ遺伝子、EκiおよびEκ3’ならびにそのEκ3’の下流(3’)の追加のマウスゲノム配列を含む約28kbのマウスゲノム配列を含む3’相同性アームを含んだ(図4B,12/1−κ標的化ベクター)。

0207

これらの2つの最初の標的化ベクターのいずれかによる相同組換えによって、内在性マウス軽鎖定常遺伝子およびエンハンサー(CκまたはCλ2およびEκi/Eκ3’またはEnh2.4/Enh3.1)遺伝子に作動可能に接続された12個のhVλ遺伝子セグメントおよびhJλ1遺伝子セグメントを含む改変されたマウス軽鎖遺伝子座(κまたはλ)が作製された(それは、組換えが生じると、キメラλ軽鎖の形成をもたらす)。

0208

12個のヒトVλ遺伝子セグメントおよび4個のヒトJλ遺伝子セグメントを有するヒトλミニ遺伝子座。キメラλ軽鎖遺伝子座に多様性を付加する別のアプローチでは、クラスターA由来の初めの12個の連続したヒトVλ遺伝子セグメントならびにhJλ1、2、3および7遺伝子セグメントをマウスκ軽鎖遺伝子座に挿入するために、第3の最初の標的化ベクターを作出した(図4B,12/4−κ標的化ベクター)。各Jλ遺伝子セグメントならびに各Jλ遺伝子セグメントのすぐ隣りの5’領域と3’領域の両方からの約100bpのヒトゲノム配列を含む、hJλ1、Jλ2、Jλ3およびJλ7遺伝子セグメントを含むDNAセグメントデノボDNA合成(Integrated DNA Technologies)によって作製した。PI−SceI部位を、この約1kbのDNAフラグメントの3’末端に作出し、クロラムフェニコール(chloroamphenicol)カセットにライゲートした。ヒトBACクローン729g4のhJλ1遺伝子セグメントに対して5’位および3’位におけるヒトλ配列から相同性アームをPCR増幅した。この中間体標的化ベクターによる相同組換えを、5’Frt部位に対して5’側にI−CeuI部位も含むFrt部位に隣接したネオマイシンカセットでヒトVλ3−12遺伝子セグメントの上流(5’)に対して事前に標的化された、改変された729g4BACクローンにおいて行った。その二重標的化された729g4BACクローンは、5’から3’に向かって、I−CeuI部位、5’Frt部位、ネオマイシンカセット、3’Frt部位、初めの12個のhVλ遺伝子セグメントを含む約123kbのフラグメント、ヒトJλ1、2、3および7遺伝子セグメントを含む約1kbのフラグメント、PI−SceI部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含んだ。この中間体標的化ベクターを、I−CeuIとPI−SceIとで同時に消化し、続いて、改変されたマウスBACクローン(上に記載されたもの)にライゲートすることにより、第3の標的化ベクターを作製した。

0209

このライゲーションによって、ヒトλ配列を内在性κ軽鎖遺伝子座に挿入するための第3の標的化ベクターがもたらされ、それは、5’から3’に向かって、内在性マウスκ遺伝子座の5’側の約23kbのゲノム配列を含む5’マウス相同性アーム、I−CeuI部位、5’Frt部位、ネオマイシンカセット、3’Frt部位、初めの12個のhVλ遺伝子セグメントを含む約123kbのフラグメント、hJλ1、2、3および7遺伝子セグメントを含む約1kbのフラグメント、PI−SceI部位、ならびに内在性マウスCκ遺伝子、EκiおよびEκ3’ならびにそのEκ3’の下流の(3’)の追加のマウスゲノム配列を含む約28kbのマウスゲノム配列を含む3’相同性アームを含んだ(図4B,12/4−κ標的化ベクター)。この第3の標的化ベクターによる相同組換えによって、内在性マウスCκ遺伝子に作動可能に接続された、12個のhVλ遺伝子セグメントおよび4個のhJλ遺伝子セグメントを含む改変されたマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された(それらは、組換えが生じると、キメラヒトλ/マウスκ軽鎖の形成をもたらす)。

0210

組み込まれたヒトκ軽鎖配列を有するヒトλミニ遺伝子座。同様の様式において、内在性κ軽鎖遺伝子座へのヒトλ遺伝子セグメントの最初の挿入を行うために作出された標的化ベクター(図4B,12/1−κおよび12/4−κ標的化ベクター)と類似の2個の追加の標的化ベクターを作出し、連続するヒトλおよびκゲノム配列を含む独特に構築された標的化ベクターを用いてヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを漸進的に挿入した。これらの標的化ベクターは、ヒトVκ4−1遺伝子セグメントとJκ1遺伝子セグメントとの間に天然に位置する約23kbのヒトκゲノム配列を含むように構築された。このヒトκゲノム配列を、これらの2つの追加の標的化ベクターにおいてヒトVλ遺伝子セグメントとヒトJλ遺伝子セグメントとの間に特異的に位置づけた(図4B,12(κ)1−κおよび12(κ)4−κ標的化ベクター)。

0211

上記ヒトκゲノム配列を含む両方の標的化ベクターを、上に記載された改変されたRP11−729g4BACクローンを用いて作製した(図6)。この改変されたBACクローンを、NotIおよびAsiSI制限酵素認識部位に隣接したスペクチノマイシン選択カセットで標的化した(図6,左上)。スペクチノマイシンカセットによる相同組換えによって、二重標的化された729g4BACクローンがもたらされ、それは、5’から3’に向かって、I−CeuI部位、5’Frt部位、ネオマイシンカセット、3’Frt部位、初めの12個のhVλ遺伝子セグメントを含む約123kbのフラグメント、hVλ3−1遺伝子セグメントの九量体配列の約200bp下流(3’)のNotI部位、スペクチノマイシンカセットおよびAsiSI部位を含んだ。二重標的化された改変された729g4BACクローンに含まれるhVλ遺伝子セグメントとのライゲーション用の約23kbのフラグメントのその後のクローニングを可能にするためにhVκ4−1遺伝子セグメントとhJκ1遺伝子セグメントとの間の位置に制限酵素認識部位を作出するために、ヒトκ配列を含む別個のヒトBACクローン(CTD−2366j12)を独立して2回標的化した(図6,右上)。

0212

簡潔には、2366j12BACクローンは、約132kbのサイズであり、hVκ遺伝子セグメント1−6、1−5、2−4、7−3、5−2、4−1、それらのVκ遺伝子セグメントの下流のヒトκゲノム配列、hJκ遺伝子セグメント1−5、hCκ、およびヒトκ遺伝子座の約20kbの追加のゲノム配列を含む。まず、このクローンを、Frt部位に隣接したハイグロマイシンカセットおよび3’Frt部位の下流(3’)にNotI部位を含む標的化ベクターで標的化した。この標的化ベクターに対する相同性アームは、そのBACクローン内のVκ遺伝子セグメントの5’側および3’側のヒトゲノム配列を含んだ(それにより、この標的化ベクターによる相同組換えが生じると、Vκ遺伝子セグメントは欠失し、hVκ4−1遺伝子セグメントの約133bp下流にNotI部位が作出された)(図6,右上)。この改変された2366j12BACクローンを、3’末端において2つの標的化ベクターで独立して標的化し、クロラムフェニコールカセットでhJκ遺伝子セグメントを欠失させた(このクロラムフェニコールカセットは、hJλ1遺伝子セグメント、PI−SceI部位およびAsiSI部位、または4個のhJλ遺伝子セグメントを含むヒトλゲノムフラグメント(前出)、PI−SceI部位およびAsiSI部位のいずれかも含む)(図6,右上)。これらの2個の類似の標的化ベクターに対する相同性アームは、hJκ遺伝子セグメントの5’側および3’側の配列を含んだ。これらの第2の標的化ベクターおよび改変された2366j12BACクローンによる相同組換えによって二重標的化された2366j12クローンが得られ、それは、5’から3’に向かって、5’Frt部位、ハイグロマイシンカセット、3’Frt部位、NotI部位、Vκ4−1遺伝子セグメントとJκ1遺伝子セグメントとの間の遺伝子間領域を含むヒトκ遺伝子座の22,800bpのゲノムフラグメント、hJλ1遺伝子セグメントまたはhJλ1、Jλ2、Jλ3およびJλ7を含むヒトλゲノムフラグメントのいずれか、PI−SceI部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含んだ(図6,右上)。二重標的化された729g4および2366j12クローンを用いた2つのライゲーション工程によって、2つの追加の改変を行うための2つの最終的な標的化ベクターが得られた。

0213

二重標的化された729g4および2366j12クローンをNotIおよびAsiSIで消化したところ、それぞれ、ネオマイシンカセットおよびhVλ遺伝子セグメントを含む1つのフラグメント、ならびにVκ4−1遺伝子セグメントとJκ1遺伝子セグメントとの間の遺伝子間領域を含むヒトκ遺伝子座の約23kbのゲノムフラグメント、hJλ1遺伝子セグメントまたはhJλ1、Jλ2、Jλ3およびJλ7遺伝子セグメントを含むゲノムフラグメントのいずれか、PI−SceI部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含む別のフラグメントを得た。これらのフラグメントのライゲーションによって2つの独特のBACクローンが生成され、それらは、5’から3’に向かって、hVλ遺伝子セグメント、Vκ4−1遺伝子セグメントとJκ1遺伝子セグメントとの間のヒトκゲノム配列、hJλ1遺伝子セグメントまたはhJλ1、Jλ2、Jλ3およびJλ7遺伝子セグメントを含むゲノムフラグメントのいずれか、PI−SceI部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含んだ(図6,下)。次いで、これらの新しいBACクローンをI−CeuIおよびPI−SceIで消化することにより、上流のネオマイシンカセットおよび連続するヒトλおよびκ配列を含む独特のフラグメントが放出され、それらを、5’から3’に向かって、内在性κ遺伝子座の5’側のマウスゲノム配列、I−CeuI部位、5’Frt部位、ネオマイシンカセット、3’Frt部位、hVλ遺伝子セグメント(3−12から3−1)、Vλ3−1の約200bp下流のNotI部位、ヒトVκ4−1遺伝子セグメントとJκ1遺伝子セグメントとの間に天然に見られる約23kbのヒトκ配列、hJλ1遺伝子セグメントまたはhJλ1、Jλ2、Jλ3およびJλ7遺伝子セグメントを含むゲノムフラグメントのいずれか、マウスEκi、マウスCκ遺伝子およびEκ3’を含む改変されたマウスBACクローン302g12にライゲートした(図4,12hVλ−VκJκ−hJλ1および12hVλ−VκJκ−4hJλ標的化ベクター)。これらの両方の標的化ベクターによる相同組換えによって、内在性マウスCκ遺伝子に作動可能に接続された、12個のhVλ遺伝子セグメント、ヒトκゲノム配列および1個または4個のhJλ遺伝子セグメントを含む2つの別個の改変されたマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された(それらは、組換えが生じると、キメラヒトλ/マウスκ軽鎖の形成をもたらす)。

0214

実施例III
ヒトλ軽鎖ミニ遺伝子座への追加のヒトVλ遺伝子セグメントの操作
同様の標的化ベクターおよび方法(図5A,+16−λ標的化ベクターおよび図5B,+16−κ標的化ベクター)を用いて、追加のhVλ遺伝子セグメントを、実施例2に記載された最初の各改変物に独立して付加した。

0215

16個の追加のヒトVλ遺伝子セグメントの導入。16個の追加のhVλ遺伝子セグメントを実施例2に記載された改変された軽鎖遺伝子座に付加するための標的化ベクターを構築する際に使用された上流の(5’)相同性アームは、内在性κまたはλ軽鎖遺伝子座の5’側のマウスゲノム配列を含んだ。3’相同性アームは、すべての標的化ベクターに関して同じであり、実施例2に記載されたような改変物のヒトλ配列の5’末端と重複するヒトゲノム配列を含んだ。

0216

簡潔には、16個の追加のhVλ遺伝子セグメントを、実施例2に記載された改変されたマウス軽鎖遺伝子座に導入するための2つの標的化ベクターを作出した(図5Aおよび5B,+16−λまたは+16−κ標的化ベクター)。クラスターA由来の21個の連続したhVλ遺伝子セグメントを含むヒトBACクローンRP11−761l13(Invitrogen)由来の約172kbのDNAフラグメントを、内在性κまたはλ軽鎖遺伝子座に対して5’側のマウスゲノム配列を含む5’相同性アームおよびヒトゲノムλ配列を含む3’相同性アームを用いて作出した。これらの標的化構築物において使用された5’マウスκまたはλ相同性アームは、実施例2に記載されたものと同じ5’相同性アームだった(図5Aおよび5B)。3’相同性アームは、実施例2に記載されたヒトゲノムλ配列の約123kbのフラグメントの等価な5’末端に対応するヒトゲノムλ配列の53,057bpの重複を含んだ。これらの2つの標的化ベクターは、5’から3’に向かって、内在性マウスκ軽鎖遺伝子座の5’側の約23kbのゲノム配列または内在性λ軽鎖遺伝子座の5’側の約24kbのマウスゲノム配列を含む5’マウス相同性アーム、5’Frt部位、ハイグロマイシンカセット、3’Frt部位、および21個の連続したhVλ遺伝子セグメントを含む171,457bpのヒトゲノムλ配列(そのうちの約53kbは、実施例3に記載されたヒトλ配列の5’末端と重複し、この標的化構築物に対する3’相同性アームとして働く)を含んだ(図5Aおよび5B,+16−λまたは+16−κ標的化ベクター)。これらの標的化ベクターによる相同組換えによって、独立して改変されたマウスκおよびλ軽鎖遺伝子座(各々が、内在性マウス定常遺伝子(CκまたはCλ2)に作動可能に接続された28個のhVλ遺伝子セグメントおよびhJλ1遺伝子セグメントを含む)が作製された(それらは、組換えが生じると、キメラ軽鎖の形成をもたらす)。

0217

同様の様式において、+16−κ標的化ベクターを使用することによっても、組み込まれたヒトκ配列ありおよびなしで複数のhJλ遺伝子セグメントを組み込む実施例2に記載されたその他の最初の改変物(図4B)に、16個の追加のhVλ遺伝子セグメントを導入した。その他の最初の改変物を含む内在性マウスκ遺伝子座におけるこの標的化ベクターによる相同組換えによって、内在性マウスCκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトVκ−Jκゲノム配列ありおよびなしで28個のhVλ遺伝子セグメントならびにhJλ1、2、3および7遺伝子セグメントを含むマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された(それらは、組換えが生じると、キメラλ−κ軽鎖の形成をもたらす)。

0218

12個の追加のヒトVλ遺伝子セグメントの導入。同様の標的化ベクターおよび方法を用いて、追加のhVλ遺伝子セグメントを、上に記載された各改変物に独立して付加した。追加のhVλ遺伝子セグメントを含む標的化ベクターによる相同組換えから生じる最終的な遺伝子座の構造は、図7Aおよび7Bに示されている。

0219

簡潔には、上に記載された改変されたマウスκおよびλ軽鎖遺伝子座に12個の追加のhVλ遺伝子セグメントを導入するために、標的化ベクターを作出した(図5Aおよび5B,+12−λまたは12−κ標的化ベクター)。クラスターB由来の12個の連続したhVλ遺伝子セグメントを含むヒトBACクローンRP11−22l18(Invitrogen)由来の93,674bpのDNAフラグメントを、内在性マウスκまたはλ軽鎖遺伝子座に対して5’側のマウスゲノム配列を含む5’相同性アームおよびヒトゲノムλ配列を含む3’相同性アームを用いて操作した。この標的化構築物において使用された5’相同性アームは、上に記載された16個のhVλ遺伝子セグメントの付加に使用されたものと同じ5’相同性アームだった(図5Aおよび5B)。BACクローンRP11−761l13由来のヒトλ配列の27,468bpのゲノムフラグメントに含まれるヒトVλ3−29P遺伝子セグメントに対して約3431bpだけ5’側にPI−SceI部位を作出することによって、3’相同性アームを作製した。このPI−SceI部位は、+16−λまたは+16−κ標的化ベクター(図5Aおよび5B)を用いて、追加のヒトλ配列の約94kbのフラグメントと、先の改変におけるヒトλ配列の5’末端と重複するヒトλ配列の約27kbのフラグメントとを連結するライゲーション点として働いた。これらの2つの標的化ベクターは、5’から3’に向かって、内在性κ軽鎖遺伝子座の5’側の約23kbのマウスゲノム配列または内在性λ軽鎖遺伝子座の5’側の約24kbのマウスゲノム配列を含む5’相同性アーム、5’Frt部位、ネオマイシンカセット、3’Frt部位、ならびに16個のhVλ遺伝子セグメントおよびPI−SceI部位を含む121,188bpのヒトゲノムλ配列(そのうちの約27kbは、16個の追加のhVλ遺伝子セグメントの挿入からのヒトλ配列の5’末端と重複し、この標的化構築物に対する3’相同性アームとして働く)を含んだ(図5Aおよび5B,+12−λまたは12−κ標的化ベクター)。これらの標的化ベクターによる相同組換えによって、内在性マウス定常遺伝子(CκまたはCλ2)に作動可能に接続された40個のhVλ遺伝子セグメントおよびヒトJλ1を含む改変されたマウスκおよびλ軽鎖遺伝子座が独立して作製された(それらは、組換えが生じると、キメラ軽鎖の形成をもたらす)(図5Aおよび5Bの下部)。

0220

同様の様式において、+12−κ標的化ベクターを使用することによっても、組み込まれたヒトκ配列ありおよびなしで複数のhJλ遺伝子セグメントを組み込むその他の最初の改変物(図4B)に、12個の追加のhVλ遺伝子セグメントを導入した。その他の改変物を含む内在性マウスκ遺伝子座におけるこの標的化ベクターによる相同組換えによって、内在性マウスCκ遺伝子に作動可能に接続されたヒトVκ−Jκゲノム配列ありおよびなしで40個のhVλ遺伝子セグメントならびにhJλ1、2、3および7遺伝子セグメントを含むマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された(それらは、組換えが生じると、キメラλ−κ軽鎖の形成をもたらす)。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ