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技術 癌胎児性抗原結合タンパク質、関連する化合物および方法

出願人 アプティーボリサーチアンドデベロップメントエルエルシーアリゲーター・バイオサイエンス・アーベー
発明者 ビアンヴニュ,デビッドヘルナンデス-ホヨス,ガブリエラミッシャー,リンダミッシェル,ダニエルフリッツェル,サラヴァラス,ローラエルマーク,ピーターサール,アンナフュルブリング,クリスティーナフォンシャンツ,ローラ
出願日 2018年7月20日 (2年6ヶ月経過) 出願番号 2020-503056
公開日 2020年10月29日 (3ヶ月経過) 公開番号 2020-530770
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 ペプチド又は蛋白質 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理
主要キーワード プロダクションラン 絶対平均値 応答測定値 中間点温度 対象障害 エアゾール発生器 申請番号 回リピート
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課題・解決手段

本開示は、5T4および/または4−1BBに特異的に結合するタンパク質分子に関する。これらの分子は、ヒト型化された5T4結合ドメインまたは4−1BB結合ドメインを少なくとも1つ有し得る。このような分子はがん治療に有用である。5T4または4−1BBに結合する前記タンパク質分子は、別の標的に結合する第二結合ドメインを有し得る。前記分子は、5T4発現細胞と、エフェクター細胞発現する細胞表面分子と、の両方に結合することで、エフェクター細胞の活性化、増殖、生存、および/またはエフェクター細胞を介した細胞毒性を増強し得る。本開示はまた、前記5T4結合性または4−1BB結合性のポリペプチド分子またはタンパク質分子を含む医薬組成物、これらのポリペプチドをコードする核酸分子、並びにこれらの分子の作製法および使用法を提供する。

概要

背景

5T4(別名:トロホブラスト糖タンパク質TPBG、M6P1、およびWaif1)は、詳細な定義がなされている腫瘍関連抗原(TAA)であり、マンチェスター大学のPeter Stern教授によって最初に同定された(Hole and Stern, 1988)。5T4は、非小細胞肺がん腎がん膵がん前立腺がん乳がん結腸直腸がん胃がん卵巣がん、および子宮頚がんをはじめとする種々の悪性腫瘍、並びに急性リンパ性白血病患者において高い割合で発現されている癌胎児性抗原であり、腫瘍始原細胞で発現されていることも示されている(Castro et al., 2012; Damelin et al., 2011; Elkord et al., 2009; Southall et al., 1990)。

胎盤や特殊な上皮など、いくつかの健常組織低レベルの5T4発現が検出されているが、腫瘍における発現レベルはそれよりもかなり高い。

5T4がCXCR4の機能活性を制御することを示唆するデータがある(Castro et al., 2012; Southgate et al., 2010)。5T4に結合する抗体または5T4のノックダウンは、腫瘍の成長および転移関与する経路である、CXCR4を介した細胞遊走の阻害をもたらした。すなわち、5T4の標的化は、様々ながん治療において、治療上の利点を与える可能性がある。現在、5T4を特異的に標的とする、またはそれと特異的に結合する、FDAに認可された治療薬は存在しない。5T4が発現される悪性腫瘍を治療するための新規治療薬が必要とされている。

4−1BB(別名:CD137またはTNFRSF9)は、腫瘍壊死因子(TNF)受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバーである。4−1BBは、活性化されたCD4+T細胞、活性化されたCD8+T細胞、調節性T細胞(Treg)、樹状細胞(DC)、単球マスト細胞好酸球、および腫瘍血管内皮細胞をはじめとする様々な細胞集団上に発現されている。4−1BBの活性化は受容体のオリゴマー化に依存しており(Rabu et al., 2005; Wyzgol et al., 2009)、このオリゴマー化は、抗原提示細胞APC)および他の細胞型の細胞表面上に三量体として発現される4−1BBL(別名:CD137L)への結合により誘導される。CD8+T細胞上の4−1BBの活性化は、CD8+T細胞のエフェクター機能持続および増強し、Th1型サイトカイン産生を選択的に補助する(Shuford et al., 1997; Lee et al., 2002; Pulle et al., 2006)。CD4+T細胞上の4−1BBの活性化では、4−1BB刺激がまず活性化を引き起こして、その後、この活性化により細胞死が誘導されるが、このことは、4−1BB作動薬抗体が自己免疫だけでなく腫瘍免疫においても治療効果を示した理由を説明していると考えられる(Zhang, JCI, 2007; Sun, TrendsMol Med, 2003)。4−1BBの活性化は、Tregの機能を抑制したり、あるいはTregを細胞傷害性CD4+T細胞に変換することも報告されている(Akhmetzyanova et al., 2016; So et al., 2008)。

T細胞上に発現しT細胞のエフェクター機能を調節していることに加え、4−1BBは、CD16やサイトカインで活性化されたナチュラルキラー(NK)細胞上でも発現上昇している。4−1BBの活性化は、マウス細胞およびヒト細胞の両方で、NK細胞抗体依存性細胞傷害ADCC)活性を増加させることが示されている(Kohrt 2012 and 2014 J Clin Invest、Hout 2012, Oncoimmによるレビュー)。さらに、DCおよびマクロファージなどのAPC上に発現された4−1BBの活性化は、免疫活性化の誘導および/または調節も引き起こし得る。

免疫細胞活性化の調節における4−1BBの役割は、4−1BBが、複数種のがんの治療において好ましい免疫治療標的になり得ることを示唆している。実際に、2種類の4−1BB抗体が臨床開発中である:ブリストルマイヤーズスクイブ社によって開発されたウレルマブ(BMS−66513)、およびファイザー社によって開発されたPF−05082566。それぞれの抗体について、様々な適応症で第I相試験および第II相試験が進行中である。しかし、4−1BBの活性化後、患者およびマウスモデルにおいて、肝臓および皮膚における毒性が確認されている(Ascierto et al., 2010; Dubrot et al., 2010; Niu et al., 2007)。さらに、転移性黒色腫における第二選択療法としてウレルマブを用いる第II相試験が、肝臓における毒性を原因に2009年に中止された(Garber et al., 2011; Li and Liu, 2013)。

すなわち、当該技術分野では、適応となる腫瘍の治療で使用するための、安全且つ効果的に4−1BBを活性化する治療薬が必要とされている。

概要

本開示は、5T4および/または4−1BBに特異的に結合するタンパク質分子に関する。これらの分子は、ヒト型化された5T4結合ドメインまたは4−1BB結合ドメインを少なくとも1つ有し得る。このような分子はがん治療に有用である。5T4または4−1BBに結合する前記タンパク質分子は、別の標的に結合する第二結合ドメインを有し得る。前記分子は、5T4発現細胞と、エフェクター細胞が発現する細胞表面分子と、の両方に結合することで、エフェクター細胞の活性化、増殖、生存、および/またはエフェクター細胞を介した細胞毒性を増強し得る。本開示はまた、前記5T4結合性または4−1BB結合性のポリペプチド分子またはタンパク質分子を含む医薬組成物、これらのポリペプチドをコードする核酸分子、並びにこれらの分子の作製法および使用法を提供する。 なし

目的

いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインと4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記5T4結合ドメインは、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み、(a)前記HCDR1は配列番号30のアミノ酸配列を含み;(b)前記HCDR2は配列番号32のアミノ酸配列を含み;(c)前記HCDR3は配列番号34のアミノ酸配列を含み;(d)前記LCDR1は配列番号42のアミノ酸配列を含み;(e)前記LCDR2は配列番号10のアミノ酸配列を含み;(f)前記LCDR3は配列番号36のアミノ酸配列を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインと4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記5T4結合ドメインは、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み、(a)前記HCDR1は配列番号30のアミノ酸配列を含み;(b)前記HCDR2は配列番号32のアミノ酸配列を含み;(c)前記HCDR3は配列番号34のアミノ酸配列を含み;(d)前記LCDR1は配列番号42のアミノ酸配列を含み;(e)前記LCDR2は配列番号10のアミノ酸配列を含み;(f)前記LCDR3は配列番号36のアミノ酸配列を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項2

前記5T4結合ドメインが配列番号38および46からなる群から選択される配列に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項3

前記5T4結合ドメインが配列番号38および46からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項4

前記5T4結合ドメインが配列番号44、48、および50からなる群から選択される配列に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項5

前記5T4結合ドメインが配列番号44、48、および50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項6

前記5T4結合ドメインが、i)配列番号38に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;ii)配列番号46に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;iii)配列番号46に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項1に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項7

前記5T4結合ドメインが、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;iii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項1に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項8

ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインとヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインおよび5T4結合ドメインのそれぞれが、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と;(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記5T4結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域フレームワーク領域に1または複数の変異を含み;前記5T4結合ドメインが、(a)配列番号30のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHCDR2と;(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号8のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号36のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項9

前記5T4結合ドメインが配列番号38に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項8に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項10

前記5T4結合ドメインが配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項8に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項11

前記5T4結合ドメインが配列番号40に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項8に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項12

前記5T4結合ドメインが配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項8に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項13

前記5T4結合ドメインが、配列番号38に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号40に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項8に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項14

前記5T4結合ドメインが、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項8に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項15

ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインとヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインおよび5T4結合ドメインのそれぞれが、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と;(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記4−1BB結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域がフレームワーク領域に1または複数の変異を含み;前記5T4結合ドメインが、(a)配列番号30のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHCDR2と;(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号42のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号36のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項16

前記5T4結合ドメインが配列番号38および46からなる群から選択される配列に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項15に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項17

前記5T4結合ドメインが配列番号38および46からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項15に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項18

前記5T4結合ドメインが配列番号44、48、および50からなる群から選択される配列に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項15に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項19

前記5T4結合ドメインが配列番号44、48、および50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項15に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項20

前記5T4結合ドメインが、i)配列番号38に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;ii)配列番号46に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;iii)配列番号46に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、を含む、請求項15に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項21

前記5T4結合ドメインが、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と;ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と;iii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項15に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項22

ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインとヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインおよび5T4結合ドメインのそれぞれが、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と;(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記4−1BB結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域がフレームワーク領域に1または複数の変異を含み;前記5T4結合ドメインが、(a)配列番号52のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHCDR2と;(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号54のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号36のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項23

前記5T4結合ドメインが配列番号56に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項22に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項24

前記5T4結合ドメインが配列番号56のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項22に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項25

前記5T4結合ドメインが配列番号58に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項22に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項26

前記5T4結合ドメインが配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項22に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項27

前記5T4結合ドメインが、配列番号56に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項22に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項28

前記5T4結合ドメインが、配列番号56のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項22に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項29

ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインとヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインおよび5T4結合ドメインのそれぞれが、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と;(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記4−1BB結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域がフレームワーク領域に1または複数の変異を含み;前記5T4結合ドメインが、(a)配列番号60のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号62のアミノ酸配列を含むHCDR2と;(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号54のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号36のアミノ酸配列を含むLCDR3と;を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項30

前記5T4結合ドメインが配列番号64に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項29に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項31

前記5T4結合ドメインが配列番号64のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項29に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項32

前記5T4結合ドメインが配列番号58に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項29に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項33

前記5T4結合ドメインが配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項29に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項34

前記5T4結合ドメインが、配列番号64に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項29に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項35

前記5T4結合ドメインが、配列番号64のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項29に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項36

前記4−1BB結合ドメインがヒト4−1BBに特異的に結合する、請求項1〜35のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項37

前記4−1BB結合ドメインが結合ドメインリンカーを介して前記5T4結合ドメインに連結されている、請求項36に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項38

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記5T4結合ドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記4−1BB結合ドメインと、を含む、請求項36に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項39

前記5T4結合ドメインが単鎖可変領域フラグメント(scFv)である、請求項36のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項40

前記scFvの軽鎖可変領域が前記scFvの重鎖可変領域のカルボキシ末端側である、請求項39に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項41

前記scFvの軽鎖可変領域が前記scFvの重鎖可変領域のアミノ末端側である、請求項39に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項42

前記scFvがリンカーポリペプチドを含む、請求項39に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項43

前記リンカーポリペプチドが前記scFvの軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に存在する、請求項42に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項44

前記リンカーポリペプチドがGly4Serリンカーを含む、請求項42に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項45

前記リンカーポリペプチドがn=1〜5である式(Gly4Ser)nを含む、請求項43に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項46

前記リンカーポリペプチドが配列番号85〜108から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項45に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項47

前記リンカーポリペプチドが配列番号98に記載のアミノ酸配列(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)を含む、請求項44に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項48

前記scFvが配列番号118、120、122、124、126、128、130、132、134、および170からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項39に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項49

scFvが配列番号118、120、122、124、126、128、130、132、134、および170からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項48に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項50

前記5T4結合ドメインがヒト5T4の細胞外ドメインに結合する、請求項1〜49のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項51

ヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインと5T4結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインは、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と、(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、(a)前記HCDR1は配列番号2のアミノ酸配列を含み;(b)前記HCDR2は配列番号4のアミノ酸配列を含み;(c)前記HCDR3は配列番号6のアミノ酸配列を含み;(d)前記LCDR1は配列番号8のアミノ酸配列を含み;(e)前記LCDR2は配列番号10のアミノ酸配列を含み;(f)前記LCDR3は配列番号12のアミノ酸配列を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項52

前記4−1BB結合ドメインが配列番号14に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項51に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項53

前記4−1BB結合ドメインが配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項51に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項54

前記4−1BB結合ドメインが配列番号16に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項51に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項55

前記4−1BB結合ドメインが配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項51に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項56

前記4−1BB結合ドメインが、配列番号14に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項51に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項57

前記4−1BB結合ドメインが、配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項51に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項58

ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインと4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインは、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と、(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記4−1BB結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域がフレームワーク領域に1または複数の変異を含み;前記4−1BB結合ドメインが、(a)配列番号18のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号4のアミノ酸配列を含むHCDR2と;(c)配列番号6のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号8のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号12のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項59

前記4−1BB結合ドメインが配列番号20に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項58に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項60

前記4−1BB結合ドメインが配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項58に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項61

前記4−1BB結合ドメインが配列番号22に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項58に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項62

前記4−1BB結合ドメインが配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項58に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項63

前記4−1BB結合ドメインが、配列番号20に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号22に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項58に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項64

前記4−1BB結合ドメインが、配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項58に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項65

ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインと4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインは、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と、(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記4−1BB結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域がフレームワーク領域に1または複数の変異を含み、前記4−1BB結合ドメインが、(a)配列番号24のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号4のアミノ酸配列を含むHCDR2と;(c)配列番号6のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号8のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号12のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項66

前記4−1BB結合ドメインが配列番号26に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項65に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項67

前記4−1BB結合ドメインが配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項65に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項68

前記4−1BB結合ドメインが配列番号16に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項65に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項69

前記4−1BB結合ドメインが配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項65に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項70

前記4−1BB結合ドメインが、配列番号26に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項65に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項71

前記4−1BB結合ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項65に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項72

前記4−1BB結合ドメインが単鎖可変領域フラグメント(scFv)である、請求項51〜71のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項73

前記4−1BB結合ドメインが配列番号110、112、114、および116からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項72に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項74

前記4−1BB結合ドメインが配列番号110、112、114、および116からなる群から選択される配列を含む、請求項72に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項75

前記scFvの軽鎖可変領域が前記scFvの重鎖可変領域のカルボキシ末端側である、請求項72に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項76

前記scFvの軽鎖可変領域が前記scFvの重鎖可変領域のアミノ末端側である、請求項72に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項77

前記scFvがリンカーポリペプチドを含む、請求項72に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項78

前記リンカーポリペプチドが前記scFvの軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に存在する、請求項77に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項79

前記リンカーポリペプチドがGly4Serリンカーを含む、請求項77に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項80

前記リンカーポリペプチドがn=1〜5である式(Gly4Ser)nを含む、請求項79に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項81

前記リンカーポリペプチドが配列番号85〜108から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項79に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項82

前記リンカーポリペプチドが配列番号98に記載のアミノ酸配列(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)を含む、請求項79に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項83

前記4−1BB結合ドメインがヒト4−1BBの細胞外ドメインに結合する、請求項51〜82のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項84

前記4−1BB結合ドメインが薬剤または毒素複合化している、請求項51〜83のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項85

前記4−1BB結合ドメインが結合ドメインリンカーを介して前記5T4結合ドメインに連結されている、請求項51〜84のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項86

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記5T4結合ドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(ii)前記4−1BB結合ドメインと、を含む、請求項85に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項87

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記4−1BB結合ドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記5T4結合ドメインと、を含む、請求項85に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項88

前記5T4結合ドメインが免疫グロブリン定常領域に融合または複合化している、請求項87に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項89

前記免疫グロブリン定常領域がヒトFcドメインである、請求項88に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項90

前記ヒトFcドメインが配列番号158または配列番号160に記載の配列を含む、請求項89に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項91

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記5T4結合ドメインと、(ii)ヒンジ領域と、(iii)免疫グロブリン定常領域と、(iv)結合ドメインリンカーと、(v)前記4−1BB結合ドメインと、を含む、請求項85に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項92

前記結合ドメインリンカーがGly4Ser配列を含む、請求項85〜91のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項93

前記結合ドメインリンカーがn=1〜5である式(Gly4Ser)nを含む、請求項92に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項94

前記結合ドメインリンカーが配列番号85〜108から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項92に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項95

前記結合ドメインリンカーが配列番号107に記載のアミノ酸配列(SGGGGSGGGGSGGGGSPS)を含む、請求項94に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項96

第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインが結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第二scFvドメインが、ヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ、(i)配列番号2、18、および24からなる群から選択されるHCDR1アミノ酸配列、配列番号4のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号6のHCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号8のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号12のLCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項97

第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインが結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第二scFvドメインが、ヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ、(i)配列番号2のHCDR1アミノ酸配列、配列番号4のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号6のHCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号8のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号12のLCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項98

第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインが結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第一scFvドメインが、ヒト5T4に特異的に結合し、且つ、(i)配列番号30のHCDR1アミノ酸配列、配列番号32のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号34のHCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号42のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号36のLCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項99

第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインが結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第一scFvドメインがヒト5T4に特異的に結合し、且つ配列番号30のHCDR1アミノ酸配列、配列番号32のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号34のHCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号42のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号36のLCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み;前記第二scFvドメインがヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ配列番号2のHCDR1アミノ酸配列、配列番号4のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号6のHCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;配列番号8のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号12のLCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項100

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第一scFvドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記第二scFvドメインと、を含む、請求項96〜99のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項101

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第二scFvドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記第一scFvドメインと、を含む、請求項96〜99のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項102

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第一scFvドメインと、(ii)ヒンジ領域と、(iii)免疫グロブリン定常領域と、(iv)結合ドメインリンカーと、(v)前記第二scFvドメインと、を含む、請求項96〜99のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項103

前記結合ドメインリンカーがGly4Ser配列を含む、請求項96〜99のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項104

前記結合ドメインリンカーがn=1〜5である式(Gly4Ser)nを含む、請求項96〜99のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項105

前記結合ドメインリンカーが配列番号85〜108から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項96〜99のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項106

前記結合ドメインリンカーが配列番号107に記載のアミノ酸配列(SGGGGSGGGGSGGGGSPS)を含む、請求項105に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項107

前記第二scFvドメインが、(a)配列番号2に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項96または97に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項108

前記第二scFvドメインが、(a)配列番号18に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項96または97に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項109

前記第二scFvドメインが、(a)配列番号24に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項96または97に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項110

前記第二scFvドメインが配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域とを含む、請求項96または97に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項111

前記第二scFvドメインが配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号22の軽鎖可変領域とを含む、請求項96または97に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項112

前記第二scFvドメインが配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域とを含む、請求項96または97に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項113

前記第二scFvドメインが配列番号28のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域とを含む、請求項96または97に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項114

前記第一scFvドメインが、(i)配列番号30、52、および60からなる群から選択されるHCDR1アミノ酸配列、配列番号32および62からなる群から選択されるHCDR2アミノ酸配列、および配列番号34のHCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号8、42、および54からなる群から選択されるLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号36のLCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と;を含み、前記第二scFvドメインが、(i)配列番号2、18、および24からなる群から選択されるHCDR1アミノ酸配列、配列番号4のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号6のHCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号8のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号12のLCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、請求項96に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項115

前記第二scFvドメインが、(a)配列番号2に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項114に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項116

前記第一scFvドメインが、(a)配列番号30に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項115に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項117

前記第一scFvドメインが、(a)配列番号30に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号42に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項115に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項118

前記第一scFvドメインが、(a)配列番号30に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号42に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項115に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項119

前記第一scFvドメインが、(a)配列番号52に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号54に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項115に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項120

前記第一scFvドメインが、(a)配列番号60に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号62に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号54に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項115に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項121

前記第二scFvドメインが、(a)配列番号18に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項114に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項122

前記第一scFvドメインが、(a)配列番号30に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号42に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項121に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項123

前記第二scFvドメインが、(a)配列番号24に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項114に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項124

前記第一scFvドメインが、(a)配列番号52に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号54に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項123に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項125

前記第二scFvドメインが、(a)配列番号24に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項114に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項126

前記第一scFvドメインが、(a)配列番号30に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む、請求項125に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項127

前記第一scFvドメインが、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号40のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインが、ii)配列番号14のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項128

前記第一scFvドメインが、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号44のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインが、ii)配列番号14のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項129

前記第一scFvドメインが、i)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号48のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインが、ii)配列番号14のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項130

前記第一scFvドメインが、i)配列番号56のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号58のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインが、ii)配列番号14のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項131

前記第一scFvドメインが、i)配列番号64のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号58のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインが、ii)配列番号14のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項132

前記第一scFvドメインが、i)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号50のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインが、ii)配列番号20のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号22の軽鎖可変領域と、を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項133

前記第一scFvドメインが、i)配列番号56のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号58のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインが、ii)配列番号26のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項134

前記第一scFvドメインが、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号68のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインが、ii)配列番号28のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチドにおいて。

請求項135

前記第一scFvドメインが、i)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号70のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインが、ii)配列番号28のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項136

前記第一scFvドメインが、ヒト5T4に特異的に結合し、且つ、配列番号118、120、122、124、126、128、130、132、134、および170からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが、ヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ配列番号110、112、114、および116からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項137

前記第一scFvドメインが配列番号118に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号110に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項138

前記第一scFvドメインが配列番号120に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号110に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項139

前記第一scFvドメインが配列番号122に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号110に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項140

前記第一scFvドメインが配列番号124に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号112に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項141

前記第一scFvドメインが配列番号126に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号114に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項142

前記第一scFvドメインが配列番号126に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号110に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項143

前記第一scFvドメインが配列番号128に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号110に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項144

前記第一scFvドメインが配列番号130に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号116に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項145

前記第一scFvドメインが配列番号170に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号116に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項146

前記第一scFvドメインが配列番号132に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号116に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項147

前記第一scFvドメインが配列番号134に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインが配列番号116に記載のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項148

配列番号136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、172、および174からなる群から選択される配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項149

配列番号136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、172、および174からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項150

配列番号136、138、および146からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項96または102に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項151

前記第一scFvドメインが5T4の細胞外ドメインに結合し、前記第二scFvドメインが4−1BBの細胞外ドメインに結合する、請求項96〜147のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項152

第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインが結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記多特異性ポリペプチドは第二の同一の多特異性ポリペプチドとの結合によるホモ二量体の形成が可能であり;前記第一scFvドメインが、ヒト5T4に特異的に結合し、且つ、(i)配列番号30のHCDR1アミノ酸配列、配列番号32のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号34のHCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号42のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号36のLCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項153

前記第一scFvドメインが、配列番号130または170のフレームワーク領域との比較で、フレームワーク領域に変異を含む、請求項152に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項154

前記変異によってジスルフィド結合の安定化がもたらされる、請求項153に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項155

前記第一scFvドメインが、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項152に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項156

前記第二scFvドメインが、ヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ、(i)配列番号2のHCDR1アミノ酸配列、配列番号4のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号6のHCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号8のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号12のLCDR3アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、請求項152〜155のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項157

前記第二scFvドメインが、i)配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項156に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項158

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第一scFvドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記第二scFvドメインと、を含む、請求項152〜157のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項159

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第二scFvドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記第一scFvドメインと、を含む、請求項152〜157のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項160

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第一scFvドメインと、(ii)ヒンジ領域と、(iii)免疫グロブリン定常領域と、(iv)結合ドメインリンカーと、(v)前記第二scFvドメインと、を含む、請求項152〜157のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項161

前記結合ドメインリンカーがGly4Ser配列を含む、請求項149〜157のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項162

前記結合ドメインリンカーがn=1〜5である式(Gly4Ser)nを含む、請求項161に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項163

前記結合ドメインリンカーが配列番号85〜108から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項161に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項164

前記結合ドメインリンカーが配列番号107に記載のアミノ酸配列(SGGGGSGGGGSGGGGSPS)を含む、請求項161に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項165

第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインが結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第一scFvドメインがヒト5T4に特異的に結合し、且つ配列番号120と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含み;前記第二scFvドメインがヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ配列番号110と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項166

第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインが結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第一scFvドメインがヒト5T4に特異的に結合し、且つ配列番号120を含むか、それからなり;前記第二scFvドメインがヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ配列番号110を含むか、それからなり;前記結合ドメインリンカーが配列番号107を含むか、それからなる、前記多特異性ポリペプチド。

請求項167

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)第二scFvドメインと、(ii)免疫グロブリンFcドメインと、(iii)結合ドメインリンカーと、(iv)第一scFvドメインと、を含む多特異性ポリペプチドであって;前記第一scFvドメインがヒト5T4に特異的に結合し、且つ配列番号120を含むか、それからなり;前記第二scFvドメインがヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ配列番号110を含むか、それからなり;前記免疫グロブリンFcドメインが配列番号160を含むか、それからなり;前記結合ドメインリンカーが配列番号107を含むか、それからなる、前記多特異性ポリペプチド。

請求項168

配列番号172と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含み、ヒト5T4およびヒト4−1BBに特異的に結合する、多特異性ポリペプチド。

請求項169

配列番号172を含むかそれからなり、ヒト5T4およびヒト4−1BBに特異的に結合する、多特異性ポリペプチド。

請求項170

第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインが結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第一scFvドメインがヒト5T4に特異的に結合し、且つ配列番号122と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含み;前記第二scFvドメインがヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ配列番号110と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含む、前記多特異性ポリペプチド。

請求項171

第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインが結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第一scFvドメインがヒト5T4に特異的に結合し、且つ配列番号122を含むか、それからなり;前記第二scFvドメインがヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ配列番号110を含むか、それからなり;前記結合ドメインリンカーが配列番号107を含むか、それからなる、前記多特異性ポリペプチド。

請求項172

アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)第二scFvドメインと、(ii)免疫グロブリンFcドメインと、(iii)結合ドメインリンカーと、(iv)第一scFvドメインと、を含む多特異性ポリペプチドであって;前記第一scFvドメインがヒト5T4に特異的に結合し、且つ配列番号122を含むか、それからなり;前記第二scFvドメインがヒト4−1BBに特異的に結合し、且つ配列番号110を含むか、それからなり;前記免疫グロブリンFcドメインが配列番号160を含むか、それからなり;前記結合ドメインリンカーが配列番号107を含むか、それからなる、前記多特異性ポリペプチド。

請求項173

配列番号174と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含み、ヒト5T4およびヒト4−1BBに特異的に結合する、多特異性ポリペプチド。

請求項174

配列番号174を含むかそれからなり、ヒト5T4およびヒト4−1BBに特異的に結合する、多特異性ポリペプチド。

請求項175

多特異性ポリペプチドのエフェクター細胞への結合が、エフェクター細胞の活性化を増強する、請求項96〜174のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項176

多特異性ポリペプチドのエフェクター細胞への結合が、エフェクター細胞の活性化および/またはエフェクター細胞の増殖を増大させる、請求項96〜174のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項177

多特異性ポリペプチドのエフェクター細胞および5T4発現細胞への結合が、エフェクター細胞依存的な、5T4発現細胞の溶解を増強する、請求項96〜174のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項178

前記5T4結合ドメインが50nM未満のkD値で5T4に結合できる、請求項1〜177のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項179

前記5T4結合ドメインの前記軽鎖可変領域および/または前記重鎖可変領域がヒト型化されている、請求項1〜178のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項180

前記4−1BB結合ドメインの前記軽鎖可変領域および/または前記重鎖可変領域がヒト型化されている、請求項1〜179のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。

請求項181

2つの同一のポリペプチドを含み、前記2つのポリペプチドがそれぞれ請求項1〜180のいずれか一項に記載のポリペプチドである、二量体

請求項182

請求項1〜180のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項181に記載のタンパク質と、薬剤的許容できる担体希釈剤、または賦形剤と、を含む医薬組成物

請求項183

経口投与用単位剤形静脈内投与単位剤形鼻腔内投与用単位剤形、坐剤用単位剤形、皮内投与用単位剤形、筋肉内投与用単位剤形、腹腔内投与用単位剤形、皮下投与用単位剤形、硬膜外投与用単位剤形、舌下投与用単位剤形、および脳内投与用単位剤形からなる群から選択される剤形に製剤化された、請求項182に記載の医薬組成物。

請求項184

錠剤丸剤ペレット剤カプセル剤散剤菓子錠剤粒剤水剤懸濁剤乳剤シロップ剤エリキシル剤徐放性製剤エアゾール剤、および噴霧剤からなる群から選択される経口投与用単位剤形として製剤化された、請求項182に記載の医薬組成物。

請求項185

5T4発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化を増強するための方法であって、前記5T4発現細胞を請求項1〜180のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項181に記載のタンパク質と接触させることを含み、前記接触が前記5T4発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化の増強が誘導される条件下で行われる、前記方法。

請求項186

対象における、5T4の発現を特徴とする障害治療するための方法であって、治療有効量の、請求項1〜180のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項181に記載のタンパク質、または請求項182〜184のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与すること、を含む前記方法。

請求項187

前記障害ががんである、請求項186に記載の方法。

請求項188

前記がんが、乳がん膵がん卵巣がん非小細胞肺がん中皮腫慢性リンパ球性白血病(CLL)、マントル細胞白血病(mantlecellleukemia)(MCL)、急性リンパ芽球白血病(ALL)、扁平上皮癌メラノーマ副腎がん、膀胱がん子宮頸がん腎がん胃がん前立腺がん甲状腺がん肝臓がん子宮がん神経線維腫肉腫癌腫、または頭頚部がんである、請求項187に記載の方法。

請求項189

対象における、5T4の発現を特徴とする障害を治療するための医薬の製造における、請求項1〜180のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項181に記載のタンパク質の使用。

請求項190

前記障害ががんである、請求項189に記載の使用。

請求項191

前記がんが、乳がん、膵がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、中皮腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、マントル細胞白血病(mantlecellleukemia)(MCL)、急性リンパ芽球白血病(ALL)、扁平上皮癌、メラノーマ、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がん、肝臓がん、子宮がん、神経線維腫、肉腫、癌腫、または頭頚部がんである、請求項190に記載の使用。

請求項192

対象における、5T4の発現を特徴とする障害の治療において使用される、請求項1〜180のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項181に記載のタンパク質。

請求項193

前記障害ががんである、請求項192に記載のポリペプチドまたはタンパク質。

請求項194

前記がんが、乳がん、膵がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、中皮腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、マントル細胞白血病(mantlecellleukemia)(MCL)、急性リンパ芽球白血病(ALL)、メラノーマ、扁平上皮癌、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がん、肝臓がん、子宮がん、神経線維腫、肉腫、癌腫、または頭頚部がんである、請求項193に記載のポリペプチドまたはタンパク質。

請求項195

請求項1〜180のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項181に記載のタンパク質をコードする、単離された核酸分子

請求項196

配列番号109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、171、および173からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項195に記載の単離された核酸分子。

請求項197

請求項195または請求項196に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター

請求項198

前記核酸分子が、宿主細胞における前記核酸セグメントの発現に好適な制御配列作動可能なように連結されている、請求項197に記載の発現ベクター。

請求項199

請求項197または請求項198に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞

請求項200

5T4結合ドメインを含むポリペプチドを製造するための方法であって、請求項197または請求項198に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を、前記核酸セグメントが発現される条件下で培養することで、前記5T4結合ドメインを含むポリペプチドを産生させることを含む、前記方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本願は、2017年7月20日に出願された米国仮特許出願第62/535,107号;2017年10月23日に出願された同第62/575,820号;および2018年3月26日に出願された同第62/648,072号に基づく優先権を主張し、各米国仮特許出願の全内容を参照により援用するものである。

0002

電子ファイル提出されたテキストファイルの説明
本願で電子ファイルで提出されたテキストファイルの全内容は参照によって本明細書に援用される。コンピューター読み取り可能な書式配列表コピーファイル名:APVO_057_03WO_SeqList_ST25.txt、保存日:2018年7月20日、ファイルサイズ:260キロバイト)。

0003

開示の分野
本開示は、トロホブラスト糖タンパク質(trophoblast glycoprotein)(5T4)に特異的に結合する分子に関する。これらの分子は、ヒト型化された5T4結合ドメインを少なくとも1つ有し得る。これらの分子は、5T4の発現を特徴とする障害(例えば、がん)の特性評価治療に有用である。5T4に結合するタンパク質治療薬は、単一特異性のタンパク質治療薬である場合と、多特異性のタンパク質治療薬である場合がある。本開示はまた、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9(tumor necrosis factor receptor superfamily member 9)(4−1BBまたはCD137)に特異的に結合するタンパク質治療薬に関する。多特異性のタンパク質治療薬が、5T4発現細胞と、エフェクター細胞上に発現された4−1BBと、の両方に結合することで、エフェクター細胞の活性化、増殖、および/またはエフェクター細胞を介した細胞毒性が増強され得る。

背景技術

0004

5T4(別名:トロホブラスト糖タンパク質、TPBG、M6P1、およびWaif1)は、詳細な定義がなされている腫瘍関連抗原(TAA)であり、マンチェスター大学のPeter Stern教授によって最初に同定された(Hole and Stern, 1988)。5T4は、非小細胞肺がん腎がん膵がん前立腺がん乳がん結腸直腸がん胃がん卵巣がん、および子宮頚がんをはじめとする種々の悪性腫瘍、並びに急性リンパ性白血病患者において高い割合で発現されている癌胎児性抗原であり、腫瘍始原細胞で発現されていることも示されている(Castro et al., 2012; Damelin et al., 2011; Elkord et al., 2009; Southall et al., 1990)。

0005

胎盤や特殊な上皮など、いくつかの健常組織低レベルの5T4発現が検出されているが、腫瘍における発現レベルはそれよりもかなり高い。

0006

5T4がCXCR4の機能活性を制御することを示唆するデータがある(Castro et al., 2012; Southgate et al., 2010)。5T4に結合する抗体または5T4のノックダウンは、腫瘍の成長および転移関与する経路である、CXCR4を介した細胞遊走の阻害をもたらした。すなわち、5T4の標的化は、様々ながんの治療において、治療上の利点を与える可能性がある。現在、5T4を特異的に標的とする、またはそれと特異的に結合する、FDAに認可された治療薬は存在しない。5T4が発現される悪性腫瘍を治療するための新規治療薬が必要とされている。

0007

4−1BB(別名:CD137またはTNFRSF9)は、腫瘍壊死因子(TNF)受容体(TNFR)スーパーファミリーメンバーである。4−1BBは、活性化されたCD4+T細胞、活性化されたCD8+T細胞、調節性T細胞(Treg)、樹状細胞(DC)、単球マスト細胞好酸球、および腫瘍血管内皮細胞をはじめとする様々な細胞集団上に発現されている。4−1BBの活性化は受容体のオリゴマー化に依存しており(Rabu et al., 2005; Wyzgol et al., 2009)、このオリゴマー化は、抗原提示細胞APC)および他の細胞型の細胞表面上に三量体として発現される4−1BBL(別名:CD137L)への結合により誘導される。CD8+T細胞上の4−1BBの活性化は、CD8+T細胞のエフェクター機能持続および増強し、Th1型サイトカイン産生を選択的に補助する(Shuford et al., 1997; Lee et al., 2002; Pulle et al., 2006)。CD4+T細胞上の4−1BBの活性化では、4−1BB刺激がまず活性化を引き起こして、その後、この活性化により細胞死が誘導されるが、このことは、4−1BB作動薬抗体が自己免疫だけでなく腫瘍免疫においても治療効果を示した理由を説明していると考えられる(Zhang, JCI, 2007; Sun, TrendsMol Med, 2003)。4−1BBの活性化は、Tregの機能を抑制したり、あるいはTregを細胞傷害性CD4+T細胞に変換することも報告されている(Akhmetzyanova et al., 2016; So et al., 2008)。

0008

T細胞上に発現しT細胞のエフェクター機能を調節していることに加え、4−1BBは、CD16やサイトカインで活性化されたナチュラルキラー(NK)細胞上でも発現上昇している。4−1BBの活性化は、マウス細胞およびヒト細胞の両方で、NK細胞抗体依存性細胞傷害ADCC)活性を増加させることが示されている(Kohrt 2012 and 2014 J Clin Invest、Hout 2012, Oncoimmによるレビュー)。さらに、DCおよびマクロファージなどのAPC上に発現された4−1BBの活性化は、免疫活性化の誘導および/または調節も引き起こし得る。

0009

免疫細胞活性化の調節における4−1BBの役割は、4−1BBが、複数種のがんの治療において好ましい免疫治療標的になり得ることを示唆している。実際に、2種類の4−1BB抗体が臨床開発中である:ブリストルマイヤーズスクイブ社によって開発されたウレルマブ(BMS−66513)、およびファイザー社によって開発されたPF−05082566。それぞれの抗体について、様々な適応症で第I相試験および第II相試験が進行中である。しかし、4−1BBの活性化後、患者およびマウスモデルにおいて、肝臓および皮膚における毒性が確認されている(Ascierto et al., 2010; Dubrot et al., 2010; Niu et al., 2007)。さらに、転移性黒色腫における第二選択療法としてウレルマブを用いる第II相試験が、肝臓における毒性を原因に2009年に中止された(Garber et al., 2011; Li and Liu, 2013)。

0010

すなわち、当該技術分野では、適応となる腫瘍の治療で使用するための、安全且つ効果的に4−1BBを活性化する治療薬が必要とされている。

0011

いくつかの態様において、本開示は、5T4および/または4−1BBに特異的に結合する多特異性ポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、本開示の5T4結合ドメインが、ヒト5T4の細胞外ドメインに結合する。特定の実施形態では、本開示の4−1BB結合ドメインが、ヒト4−1BBの細胞外ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインと4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記5T4結合ドメインは、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み、(a)前記HCDR1は配列番号30のアミノ酸配列を含み;(b)前記HCDR2は配列番号32のアミノ酸配列を含み;(c)前記HCDR3は配列番号34のアミノ酸配列を含み;(d)前記LCDR1は配列番号42のアミノ酸配列を含み;(e)前記LCDR2は配列番号10のアミノ酸配列を含み;(f)前記LCDR3は配列番号36のアミノ酸配列を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号38および46からなる群から選択される配列に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、前記5T4結合ドメインは、配列番号38および46からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号44、48、および50からなる群から選択される配列に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記5T4結合ドメインは、配列番号44、48、および50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、i)配列番号38に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;ii)配列番号46に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;iii)配列番号46に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、前記5T4結合ドメインは、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;または、ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;または、iii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

0012

特定の態様では、本開示は、ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインとヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインおよび前記5T4結合ドメインはそれぞれ、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と;(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記5T4結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域は、フレームワーク領域に1または複数の変異を含んでおり;前記5T4結合ドメインは、(a)配列番号30のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHCDR2と;(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号8のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号36のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号38に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。1つの実施形態では、前記5T4結合ドメインは、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号40に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、前記5T4結合ドメインは、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号38に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号40に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、5T4結合ドメインは、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

0013

本開示はさらに、ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインとヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインおよび前記5T4結合ドメインはそれぞれ、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と;(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記4−1BB結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域は、フレームワーク領域に1または複数の変異を含んでおり;前記5T4結合ドメインは、(a)配列番号30のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHCDR2と;c)配列番号34のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号42のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号36のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号38および46からなる群から選択される配列に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、前記5T4結合ドメインは、配列番号38および46からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号44、48、および50からなる群から選択される配列に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、前記5T4結合ドメインは、配列番号44、48、および50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、i)配列番号38に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;ii)配列番号46に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;iii)配列番号46に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、前記5T4結合ドメインは、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;または、ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;または、iii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

0014

いくつかの態様において、本開示は、ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインとヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインおよび前記5T4結合ドメインはそれぞれ、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と;(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記4−1BB結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域は、フレームワーク領域に1または複数の変異を含んでおり;前記5T4結合ドメインは、(a)配列番号52のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHCDR2と;c)配列番号34のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号54のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号36のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号56に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、前記5T4結合ドメインは、配列番号56のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号58に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記5T4結合ドメインは、配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号56に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、5T4結合ドメインは、配列番号56のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

0015

本開示はまた、ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインとヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインおよび前記5T4結合ドメインはそれぞれ、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と;(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記4−1BB結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域は、フレームワーク領域に1または複数の変異を含んでおり;前記5T4結合ドメインは、(a)配列番号60のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号62のアミノ酸配列を含むHCDR2と;c)配列番号34のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号54のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号36のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号64に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記5T4結合ドメインは、配列番号64のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の態様では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号58に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記5T4結合ドメインは、配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記5T4結合ドメインは、配列番号64に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、5T4結合ドメインは、配列番号64のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

0016

特定の態様では、本開示は、ヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインを含む多特異性ポリペプチドを提供する。本開示はまた、4−1BB結合ドメインと5T4結合ドメインとを含み、前記4−1BB結合ドメインが結合ドメインリンカーを介して前記5T4結合ドメインに結合している、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)5T4結合ドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)4−1BB結合ドメインと、を含む。特定の態様では、前記5T4結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント(scFv)である。いくつかの実施形態では、前記scFvの軽鎖可変領域は、前記scFvの重鎖可変領域のカルボキシ末端側である。他の実施形態では、前記scFvの軽鎖可変領域は、前記scFvの重鎖可変領域のアミノ末端側である。特定の態様では、前記scFvは、リンカーポリペプチドを含む。いくつかの例で、前記リンカーポリペプチドは、前記scFvの軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に存在する。特定の実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、Gly4Serリンカーを含む。いくつかの実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、n=1〜5である式(Gly4Ser)nを含む。いくつかの態様において、前記リンカーポリペプチドは、配列番号85〜108から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、配列番号98に記載のアミノ酸配列(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)を含む。

0017

特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含むscFvは、配列番号118、120、122、124、126、128、130、132、134、および170からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、scFvは、配列番号118、120、122、124、126、128、130、132、134、および170からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0018

いくつかの態様において、本開示は、ヒト4−1BBに特異的に結合する4−1BB結合ドメインと5T4結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインは、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と、(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、(a)前記HCDR1は配列番号2のアミノ酸配列を含み;(b)前記HCDR2は配列番号4のアミノ酸配列を含み;(c)前記HCDR3は配列番号6のアミノ酸配列を含み;(d)前記LCDR1は配列番号8のアミノ酸配列を含み;(e)前記LCDR2は配列番号10のアミノ酸配列を含み;(f)前記LCDR3は配列番号12のアミノ酸配列を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記4−1BB結合ドメインは、配列番号14に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記4−1BB結合ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記4−1BB結合ドメインは、配列番号16に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記4−1BB結合ドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記4−1BB結合ドメインは、配列番号14に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの態様において、4−1BB結合ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

0019

本開示はさらに、ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインと4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインは、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と;(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記4−1BB結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域は、フレームワーク領域に1または複数の変異を含んでおり、前記4−1BB結合ドメインは、(a)配列番号18のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号4のアミノ酸配列を含むHCDR2と;(c)配列番号6のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号8のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号12のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記4−1BB結合ドメインは、配列番号20に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記4−1BB結合ドメインは、配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記4−1BB結合ドメインは、配列番号22に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記4−1BB結合ドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記4−1BB結合ドメインは、配列番号20に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号22に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、4−1BB結合ドメインは、配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

0020

本開示はまた、ヒト5T4に特異的に結合する5T4結合ドメインと4−1BB結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記4−1BB結合ドメインが、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と;(ii)LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、を含み、前記4−1BB結合ドメインの前記VH領域および/または前記VL領域は、フレームワーク領域に1または複数の変異を含んでおり、前記4−1BB結合ドメインは、(a)配列番号24のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号4のアミノ酸配列を含むHCDR2と;(c)配列番号6のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号8のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号12のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記4−1BB結合ドメインは、配列番号26に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記4−1BB結合ドメインは、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記4−1BB結合ドメインは、配列番号16に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記4−1BB結合ドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記4−1BB結合ドメインは、配列番号26に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16に対し少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、4−1BB結合ドメインは、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

0021

特定の実施形態では、本開示は、4−1BB結合ドメインを含み、前記4−1BB結合ドメインが単鎖可変領域フラグメント(scFv)である、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、前記scFvの軽鎖可変領域は、前記scFvの重鎖可変領域のカルボキシ末端側である。他の態様では、前記scFvの軽鎖可変領域は、前記scFvの重鎖可変領域のアミノ末端側である。特定の態様では、前記scFvは、リンカーポリペプチドを含む。いくつかの例で、前記リンカーポリペプチドは、前記scFvの軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に存在する。特定の実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、Gly4Serリンカーを含む。いくつかの実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、n=1〜5である式(Gly4Ser)nを含む。いくつかの態様において、前記リンカーポリペプチドは、配列番号85〜108から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、配列番号98に記載のアミノ酸配列(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)を含む。特定の態様では、本開示の多特異性ポリペプチドは、結合ドメインリンカーを介して5T4結合ドメインに連結されている4−1BB結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記5T4結合ドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記4−1BB結合ドメインと、を含む。

0022

いくつかの実施形態では、上記の各CDR配列を含む前記4−1BB結合ドメインは、配列番号110、112、114、および116からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、前記4−1BB結合ドメインは、配列番号110、112、114、および116からなる群から選択される配列を含む。

0023

特定の態様では、本開示の多特異性ポリペプチドは、薬剤または毒素複合化した4−1BB結合ドメインを含む。

0024

本開示はさらに、免疫グロブリン定常領域に融合または複合化した5T4結合ドメインを含む多特異性ポリペプチドを提供する。免疫グロブリン定常領域はヒトFcドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、前記ヒトFcドメインは、配列番号158または配列番号160に記載の配列を含む。特定の実施形態では、本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)5T4結合ドメインと、(ii)ヒンジ領域と、(iii)免疫グロブリン定常領域と、(iv)結合ドメインリンカーと、(v)4−1BB結合ドメインと、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、Gly4Ser配列を含む。いくつかの例で、前記結合ドメインリンカーは、n=1〜5である式(Gly4Ser)nを含む。いくつかの態様において、前記結合ドメインリンカーは、配列番号85〜108から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、配列番号107に記載のアミノ酸配列(SGGGGSGGGGSGGGGSPS)を含む。

0025

いくつかの態様において、本開示はまた、第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインは結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第二scFvドメインは、ヒト4−1BBに特異的に結合し、(i)配列番号2、18、24からなる群から選択されるHCDR1アミノ酸配列、配列番号4のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号6のHCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号8のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号12のLCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインは結合ドメインリンカーによってまたは結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって結合しており、前記免疫グロブリンFcドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、このポリペプチドは、配列番号136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、および156からなる群から選択される配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、および156からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号136、138、および146からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0026

いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第一scFvドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記第二結合ドメインと、を含む。他の実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第二scFvドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記第一scFvドメインと、を含む。特定の態様では、前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第一scFvドメインと、(ii)ヒンジ領域と、(iii)免疫グロブリン定常領域と、(iv)結合ドメインリンカーと、(v)前記第二scFvドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、Gly4Ser配列を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、n=1〜5である式(Gly4Ser)nを含む。特定の態様では、前記結合ドメインリンカーは、配列番号85〜108から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、配列番号107に記載のアミノ酸配列(SGGGGSGGGGSGGGGSPS)を含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二scFvドメインは、(a)配列番号2に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。他の実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二scFvドメインは、(a)配列番号24に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二scFvドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む。他の実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二scFvドメインは、配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号22の軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二scFvドメインは、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む。他の実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二scFvドメインは、配列番号28のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む。

0027

本開示はさらに、第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインは結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第二scFvドメインはヒト4−1BBに特異的に結合し;前記第一scFvドメインは、(i)配列番号30、52、および60からなる群から選択されるHCDR1アミノ酸配列、配列番号32および62からなる群から選択されるHCDR2アミノ酸配列、および配列番号34のHCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号8、42、および54からなる群から選択されるLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号36のLCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み;前記第二scFvドメインは、(i)配列番号2、18、24からなる群から選択されるHCDR1アミノ酸配列、配列番号4のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号6のHCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号8のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号12のLCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインは結合ドメインリンカーによってまたは結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって結合しており、前記免疫グロブリンFcドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、第二scFvドメインは、(a)配列番号2に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。特定の実施形態では、第一scFvドメインは、(a)配列番号30に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第一scFvドメインは、(a)配列番号30に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号42に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。特定の態様では、第一scFvドメインは、(a)配列番号30に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号42に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第一scFvドメインは、(a)配列番号52に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号54に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第一scFvドメインは、(a)配列番号60に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号62に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号54に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。特定の実施形態では、いくつかの実施形態では、第二scFvドメインは、(a)配列番号18に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第一scFvドメインは、(a)配列番号30に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号42に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第二scFvドメインは、(a)配列番号24に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第一scFvドメインは、(a)配列番号52に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号54に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第二scFvドメインは、(a)配列番号24に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号4に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号6に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号12に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含み、所望により、前記第一scFvドメインは、(a)配列番号30に記載のHCDR1アミノ酸配列と;(b)配列番号32に記載のHCDR2アミノ酸配列と;(c)配列番号34に記載のHCDR3アミノ酸配列と;(d)配列番号8に記載のLCDR1アミノ酸配列と;(e)配列番号10に記載のLCDR2アミノ酸配列と;(f)配列番号36に記載のLCDR3アミノ酸配列と、を含む。

0028

本開示はまた、第一scFvドメインが、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号40のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、第二scFvドメインが、ii)配列番号14のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインは、ii)配列番号14のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、前記第一scFvドメインは、i)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインは、ii)配列番号14のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、前記第一scFvドメインは、i)配列番号56のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインは、ii)配列番号14のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、前記第一scFvドメインは、i)配列番号64のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインは、ii)配列番号14のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、前記第一scFvドメインは、i)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインは、ii)配列番号20のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号22の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。さらに他の実施形態では、前記第一scFvドメインは、i)配列番号56のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号58のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインは、ii)配列番号26のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号68のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインは、ii)配列番号28のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは、i)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号70のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二scFvドメインは、ii)配列番号28のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号16の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。

0029

いくつかの実施形態において、本開示はまた、第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインは結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第一scFvドメインは、ヒト5T4に特異的に結合し、(i)配列番号30のHCDR1アミノ酸配列、配列番号32のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号34のHCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号42のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号36のLCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。

0030

いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;または、ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;または、iii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

0031

いくつかの実施形態では、本開示は、第一scFvドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一scFvドメインおよび第二scFvドメインは結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンFcドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記第一scFvドメインはヒト5T4に特異的に結合し、前記第二scFvドメインの前記VH領域および/または前記VL領域は、フレームワーク領域に1または複数の変異を含んでおり;前記第一scFvドメインは、(a)配列番号30のアミノ酸配列を含むHCDR1と;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHCDR2と;(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むHCDR3と;(d)配列番号42のアミノ酸配列を含むLCDR1と;(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むLCDR2と;(f)配列番号36のアミノ酸配列を含むLCDR3と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは、i)配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;または、ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか;または、iii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号50のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。

0032

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第一scFvドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記第二結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第二scFvドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)前記第一scFvドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第一scFvドメインと、(ii)ヒンジ領域と、(iii)免疫グロブリン定常領域と、(iv)結合ドメインリンカーと、(v)前記第二scFvドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、Gly4Ser配列を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、n=1〜5である式(Gly4Ser)nを含む。いくつかの実施形態において、前記結合ドメインリンカーは、配列番号85〜108から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、配列番号107に記載のアミノ酸配列(SGGGGSGGGGSGGGGSPS)を含む。

0033

特定の態様では、本開示の多特異性ポリペプチドの前記第一scFvドメインは、ヒト5T4に特異的に結合し、配列番号118、120、122、124、126、128、130、132、134、および170からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み;前記第二scFvドメインは、ヒト4−1BBに特異的に結合し、配列番号110、112、114、および116からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号118に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号110に記載のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号120に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号110に記載のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号122に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号110に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号124に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号112に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号126に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号114に記載のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号126に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号110に記載のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号128に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号110に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号170に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号116に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号130に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号116に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号132に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号116に記載のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、前記第一scFvドメインは配列番号134に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二scFvドメインは配列番号116に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、172、174、および176からなる群から選択される配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、172、174、および176からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0034

いくつかの実施形態では、本開示は、5T4および4−1BBに特異的に結合し、配列番号136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、172、174、および176からなる群から選択される配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、5T4および4−1BBに特異的に結合する前記ポリペプチドは、配列番号136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、172、174、および176からなる群から選択される配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは、上記のそれぞれの配列番号と同じCDRアミノ酸配列を含むか、または、前記ポリペプチドは、上記のそれぞれの配列番号との比較でただ1つのアミノ酸だけ異なるCDRアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、172、174、および176からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0035

本開示はさらに、第一scFvドメインが5T4の細胞外ドメインに結合し、第二scFvドメインが4−1BBの細胞外ドメインに結合する、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、前記ポリペプチドは、エフェクター細胞の活性化をもたらす。いくつかの態様において、本開示の多特異性ポリペプチドは、エフェクター細胞の活性化および/またはエフェクター細胞の増殖を増大させる。他の態様において、多特異性ポリペプチドは、エフェクター細胞依存性の、5T4発現細胞の溶解を増強する。いくつかの実施形態において、本開示の5T4結合ドメインは、50nM未満のkD値で5T4と結合できる。いくつかの態様において、5T4結合ドメインおよび/または4−1BB結合ドメインの軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域はヒト型化されている。

0036

いくつかの実施形態では、本開示は、結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンFcドメインによって連結された第一単鎖可変領域フラグメント(scFv)ドメインと第二scFvドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記免疫グロブリンFcドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み;前記多特異性ポリペプチドは第二の同一の多特異性ポリペプチドとの結合によるホモ二量体の形成が可能であり;前記第一scFvドメインは、ヒト5T4に特異的に結合し、(i)配列番号30の重鎖相補性決定領域(HCDR)−1アミノ酸配列、配列番号32のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号34のHCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号42の軽鎖相補性決定領域(LCDR)−1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号36のLCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み;前記第二scFvドメインは、ヒト4−1BBに特異的に結合し、(i)配列番号2のHCDR1アミノ酸配列、配列番号4のHCDR2アミノ酸配列、および配列番号6のHCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と;(ii)配列番号8のLCDR1アミノ酸配列、配列番号10のLCDR2アミノ酸配列、および配列番号12.2のLCDR3アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)前記第一scFvドメインと、(ii)前記ヒンジ領域と、(iii)前記免疫グロブリン定常領域と、(iv)前記結合ドメインリンカーと、(v)前記第二scFvドメインと、を含む、請求項1に記載の多特異性ポリペプチド。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインは、配列番号130または170のフレームワーク領域との比較で、フレームワーク領域に変異を含む。いくつかの実施形態では、前記変異はジスルフィド結合の安定化をもたらす。

0037

いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの前記第一scFvドメインは、配列番号38の前記免疫グロブリン重鎖可変領域と配列番号44の前記免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの前記第一scFvドメインは、配列番号46の前記免疫グロブリン重鎖可変領域と配列番号48の前記免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの前記第二scFvドメインは、配列番号14の免疫グロブリン重鎖可変領域と配列番号16の前記免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドの前記第一scFvドメインは、配列番号46の前記免疫グロブリン重鎖可変領域と配列番号48の前記免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含み、前記第二scFvドメインは、配列番号14の前記免疫グロブリン重鎖可変領域と配列番号16の前記免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインのアミノ酸配列は、配列番号120と少なくとも97%同一であり、前記第二scFvドメインのアミノ酸配列は配列番号110と少なくとも97%同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号172と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号172と同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一scFvドメインのアミノ酸配列は、配列番号122と少なくとも97%同一であり、前記第二scFvドメインのアミノ酸配列は配列番号110と少なくとも97%同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号174と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号174のアミノ酸配列を含む。

0038

いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドがエフェクター細胞に結合することで、エフェクター細胞の活性化の増大、エフェクター細胞の増殖の増大、がもたらされ、または、前記多特異性ポリペプチドがエフェクター細胞、5T4発現細胞に結合することで、エフェクター細胞依存性の5T4発現細胞の溶解の増強がもたらされる。

0039

本開示はまた、それぞれが本開示に記載の多特異性ポリペプチドである、2つの同一のポリペプチドを含む二量体を包含する。

0040

特定の態様では、本開示は、本開示に記載のポリペプチドまたはタンパク質と、薬剤的許容できる担体希釈剤、または賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、経口投与用単位剤形静脈内投与単位剤形鼻腔内投与用単位剤形、坐剤用単位剤形、皮内投与用単位剤形、筋肉内投与用単位剤形、腹腔内投与用単位剤形、皮下投与用単位剤形、硬膜外投与用単位剤形、舌下投与用単位剤形、および脳内投与用単位剤形からなる群から選択される剤形の医薬組成物が製剤化され得る。経口投与用単位剤形の例としては、錠剤丸剤ペレット剤カプセル剤散剤菓子錠剤粒剤水剤懸濁剤乳剤シロップ剤エリキシル剤徐放性製剤エアゾール剤、および噴霧剤が挙げられるが、これらに限定はされない。

0041

本開示はさらに、5T4を発現する細胞に対するエフェクター細胞の活性化を増強するための方法であって、前記5T4発現細胞を本開示のポリペプチドまたはタンパク質と接触させることを含み、前記接触が前記5T4発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化の増強が誘導される条件下で行われる、前記方法を包含する。いくつかの態様において、本開示は、対象の5T4の発現を特徴とする障害を治療するための方法であって、前記対象に治療有効量の本開示のポリペプチドまたはタンパク質または医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。本開示はまた、対象の5T4の発現を特徴とする障害を治療するための医薬の製造における本開示のポリペプチドまたはタンパク質の使用を包含する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象の5T4の発現を特徴とする障害の治療に使用される、本開示のポリペプチドまたはタンパク質に関する。いくつかの実施形態では、前記障害はがんである。特定の態様では、前記がんは、乳がん、膵がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、中皮腫慢性リンパ球性白血病(CLL)、マントル細胞白血病(mantle cell leukemia)(MCL)、急性リンパ芽球白血病(ALL)、扁平上皮癌メラノーマ副腎がん、膀胱がん子宮頸がん、腎がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がん肝臓がん子宮がん神経線維腫肉腫、または頭頚部がんである。

0042

いくつかの実施形態では、上記の方法で使用される多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、(i)第一scFvドメインと、(ii)ヒンジ領域と、(iii)免疫グロブリン定常領域と、(iv)結合ドメインリンカーと、(v)第二scFvドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、上記の方法で使用される多特異性ポリペプチドは、配列番号14の免疫グロブリン重鎖可変領域および配列番号16の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む第二scFvドメインと、(i)配列番号38の免疫グロブリン重鎖可変領域および配列番号44の免疫グロブリン軽鎖可変領域;または(ii)配列番号46の免疫グロブリン重鎖可変領域および配列番号48の免疫グロブリン軽鎖可変領域、を含む第一scFvドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドの前記第二scFvドメインのアミノ酸配列は、配列番号110と少なくとも97%同一であり、前記多特異性ポリペプチドの前記第一scFvドメインのアミノ酸配列は、配列番号120(209の場合、抗5T4 scFv)または配列番号122と少なくとも97%同一である。いくつかの実施形態では、配列番号28を含む重鎖可変領域(variable heavy chain)および配列番号16を含む軽鎖可変領域(variable light chain)を含む抗4−1BB抗体と、配列番号46を含む重鎖可変領域および配列番号66を含む軽鎖可変領域を含む抗5T4 scFvと、を含むIgG−scFv構造体である第二の多特異性ポリペプチドと比較した場合に、前記ポリペプチドは、エフェクター細胞の活性化の統計的に有意な増強を示す。いくつかの実施形態では、配列番号28を含む重鎖可変領域および配列番号16を含む軽鎖可変領域を含む抗4−1BB抗体と、配列番号46を含む重鎖可変領域および配列番号66を含む軽鎖可変領域を含む抗5T4 scFvと、を含むIgG−scFv構造体である第二の多特異性ポリペプチドと比較した場合に、前記ポリペプチドは、エフェクター細胞増殖の統計的に有意な増加を誘導する。

0043

本開示のいくつかの態様は、本開示のポリペプチドをコードする単離された核酸分子を包含する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、171、173、および175からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。本開示は、本明細書に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクターを包含する。いくつかの実施形態では、前記発現ベクター内核酸分子は、宿主細胞における前記核酸セグメントの発現に好適な制御配列作動可能なように連結されている。本開示は、本明細書に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、本開示は、5T4結合ドメインを含むポリペプチドを製造するための方法であって、本明細書に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を、核酸セグメントが発現される条件下で培養することで、前記5T4結合ドメインを含むポリペプチドを産生させることを含む、前記方法を提供する。

図面の簡単な説明

0044

5T4(+)細胞の存在下における、7種類のコンストラクトALG.APV−004、ALG.APV−006、ALG.APV−099、ALG.APV−127、ALG.APV−148、およびALG.APV−150)の、作動薬としての機能を示している。

0045

7種類のscFv−Fc−scFv分子(ALG.APV−006、ALG.APV−178、ALG.APV−179、ALG.APV−187、ALG.APV−191、ALG.APV−196、およびALG.APV−198)の、ヒト4−1BBを発現するCHO−K1細胞株に対する結合曲線を示している。

0046

7種類のscFv−Fc−scFv分子(ALG.APV−006、ALG.APV−178、ALG.APV−179、ALG.APV−187、ALG.APV−191、ALG.APV−196、およびALG.APV−198)の、カニクイザル4−1BBを発現するCHO−K1細胞株に対する結合曲線を示している。

0047

7種類のscFv−Fc−scFv分子(ALG.APV−006、ALG.APV−178、ALG.APV−179、ALG.APV−187、ALG.APV−191、ALG.APV−196、およびALG.APV−198)の、ヒト5T4を発現するCHO−K1細胞株に対する結合曲線を示している。

0048

CHO−K1細胞株およびSKOV−3細胞株におけるヒト5T4の発現レベルを示している。

0049

コンストラクトALG.APV−006、ALG.APV−178、ALG.APV−179、ALG.APV−187、ALG.APV−196、およびALG.APV−198の、SKOV−3細胞に対する結合曲線を示している。

0050

ALG.APV−006、ALG.APV−178、ALG.APV−179、ALG.APV−187、ALG.APV−191、ALG.APV−196、およびALG.APV−198の、カニクイザル5T4を発現するCHO−K1細胞株に対する結合曲線を示している。

0051

抗5T4×抗4−1BBコンストラクトの、4−1BBレポーターアッセイにおける活性を示している。

0052

抗5T4×抗4−1BBコンストラクトの、PBMCおよびCHO−K1の共培養物からのIFNγ放出に対する影響を示している。

0053

scFv−Fc−scFvフォーマット(ADAPTIR(商標)フォーマット)のタンパク質の例示的な実施形態を図示している。

0054

図11A〜図11Bは、二重特異性scFv−Fc−scFvコンストラクトと共に培養されたヒトCD8+T細胞における、インターフェロンγ(IFNγ)応答を示している。図11Aは、5T4−Fc抗原被覆されたプレート内で培養した場合のT細胞の応答を示している。図11Bは、5T4−Fc抗原なしで培養された場合のT細胞応答を示している。図11は2人のドナーからの平均値を示している。

0055

ALG.APV−004、ALG.APV−178、ALG.APV−179、ALG.APV−187、ALG.APV−208、ALG.APV−209、およびALG.APV−210の、ヒトCD137発現CHO−K1細胞株に対する結合曲線を示している。

0056

ALG.APV−004、ALG.APV−178、ALG.APV−179、ALG.APV−187、ALG.APV−208、ALG.APV−209、およびALG.APV−210の、ヒト5T4発現マウスCT26細胞(ATCC)に対する結合曲線を示している。

0057

ALG.APV−004、ALG.APV−178、ALG.APV−179、ALG.APV−187、ALG.APV−208、ALG.APV−209、およびALG.APV−210の、カニクイザル5T4トランスフェクトCHO−K1に対する結合曲線を示している。

0058

ALG.APV−004、ALG.APV−178、ALG.APV−179、ALG.APV−187、ALG.APV−208、ALG.APV−209、およびALG.APV−210の、CD137も5T4もどちらも発現しないヒト細胞株(MOLM13細胞、ATCC)に対する結合曲線を示している。

0059

5T4(+)細胞(HCC1143)または5T4(−)細胞(MOLM13)の存在下で5時間インキュベートした後の、NF−κBレポーター発現Jurkat細胞における、二重特異性コンストラクトの活性を示している。曲線上の全ての点は2連ウェルの平均を表す。Y軸は相対蛍光単位(RLU)の値を示す。

0060

ALG.APV−178、ALG.APV−179、ALG.APV−187、ALG.APV−208、ALG.APV−209、ALG.APV−210、およびMorrison型対照コンストラクトのALG.APV−004により、72の時点で初代PBMC培養物において誘導された、IFN−γのレベルを示している。曲線上の全ての点は2連ウェルの平均を表す。

0061

図18A〜図18Bは、二重特異性コンストラクトであるALG.APV−209、ALG.APV−210、およびALG.APV−004の、抗原発現腫瘍への5T4依存的な局在の、FACS解析を示している。局在は、抗ヒトFc抗体(図18A)またはビオチン化4−1BB(図18B)を用いた染色により検出した。

0062

図19A〜図19Bは、二重特異性コンストラクトであるALG.APV−209、ALG.APV−210、およびALG.APV−004の、5T4+腫瘍(図19A)および5T4−腫瘍(図19B)に対する5T4依存的な局在の、免疫組織学的解析を示している。

0063

異なるレベルの5T4を発現するCT26細胞の存在下で、二重特異性抗体ALG.APV−210と共に培養されたヒトCD8 T細胞の、IFNγ応答を示している。

0064

図21A〜図21Bは、異なるレベルの5T4を発現するCT26細胞の存在下で、二重特異性抗体ALG.APV−210と共に培養されたヒトCD8 T細胞の、最大IFNγ放出を示している。

0065

図22A〜図22Cは、CD3で刺激された、または未刺激の、ヒトPBMCおよびカニクイザルPBMCからゲーティングされた一次CD8 T細胞に対する、ALG.APV−210またはANC107(アイソタイプ対照)の結合を示している。図22Aおよび図22Bは、2つの独立した実験からの平均蛍光強度MFI)(および平均値の標準誤差(SEM))を示している。図22Cは、2つの独立した実験から得られた、ALG.APV−210についての、正規化されたプールデータを示している。n=3ドナー/群/実験。

0066

図23A〜図23Cは、CD3で刺激された、または未刺激の、ヒトPBMCおよびカニクイザルPBMCからゲーティングされた初代CD8 T細胞に対する、ALG.APV−210またはANC107(アイソタイプ対照)の結合を示している。図23Aおよび図23Bは、2つの独立した実験から得られた、CD8 T細胞に結合しているALG.APV−210の割合およびSEMを示している。図23Cは、実験1および実験2から得られた正規化されたプールデータを示している。n=3ドナー/群/実験。

0067

ヒトCD8 T細胞に対するALG.APV−210の作動薬的な働きを示している。

0068

図25A〜図25Bは、個々の代表的なドナーから得られた、ヒトCD8 T細胞に対するALG.APV−210の作動薬的な働きを示している。

0069

カニクイザルCD8 T細胞に対するALG.APV−210の作動薬的な働きを示している。

0070

図27A〜図27Cは、個々の代表的なドナーから得られた、カニクイザルCD8 T細胞に対するALG.APV−210の作動薬的な働きを示している。これらの図は、5T4−Fcの存在下でALG.APV−210で活性化されたカニクイザルCD8 T細胞による、用量反応に基づくIFNγ産生を示している。

0071

5T4陽性ヒト結腸癌であるHCT−116の異種移植片腫瘍のSCIDベージュマウスモデルにおける、二重特異性抗体ALG.APV−210の抗腫瘍活性を示している。

0072

ALG.APV−210またはALG.APV−209のPK解析を示している。

0073

図30A〜図30Bは、ALG.APV−210のFc部分の、FcγRへの結合性を示している。漸増量の(titrated)ALG.APV−210をFcγR−発現細胞と共にインキュベートし、蛍光標識抗ヒトIgG二次抗体プローブした(図30A)。ヒトIgG1分子を陽性対照として用いた(図30B)。

0074

図31A〜図31Bは、ヒト5T4を発現しているCHO−K1細胞および抗CD3 抗体の存在下、二重特異性分子のALG.APV−209およびALG.APV−210によって誘導されたCD8+T細胞およびCD4+T細胞の増殖を示している。

0075

図32A〜図32Bは、2人の異なるヒトPBMCドナー(AおよびB)由来のPBMC全培養物における、二重特異性分子ALG.APV−210によるIFN−γ分泌の誘導を示している。

0076

図33A〜図33Bは、2人の異なるヒトPBMCドナー由来のPBMC全培養物における、二重特異性分子ALG.APV−210によって誘導されたCD8+T細胞の増殖を示している。

0077

ALG.APV−210の5T4発現細胞株への結合性を示している。

0078

ある密度範囲で5T4表面タンパク質を発現している細胞の存在下でインキュベートした後の、NF−κBレポーター発現Jurkat細胞における二重特異性コンストラクトALG.APV−210の作動薬的な働きを示している。

0079

5T4発現ヒトHCT116細胞の存在下、二重特異性抗体ALG.APV−210と共に培養されたヒトCD8+T細胞のIFNγ応答を示している。

0080

5T4発現ヒトHCT116細胞の存在下、二重特異性抗体ALG.APV−210と共に培養されたヒトCD8+T細胞のIFNγ応答を示している。

0081

ヒト5T4発現HCT116細胞の存在下、二重特異性抗体ALG.APV−210と共に培養されたヒトCD8 T細胞の最大IFNγ放出を示している。

0082

図39A〜図39Dは、5T4を発現しているヒト腫瘍細胞またはトランスフェクト細胞株に対するALG.APV−210の結合を示している。

0083

図40A〜図40Dは、5T4を発現しているヒト腫瘍細胞またはトランスフェクト細胞株に対するALG.APV−210の結合を示す実験の、正規化されたMFIを示している。

0084

本開示は、トロホブラスト糖タンパク質(trophoblast glycoprotein)(5T4)に特異的に結合する結合ドメインを含むポリペプチド、および5T4に特異的に結合するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、5T4および別の標的に特異的に結合し得る多特異性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、5T4に特異的に結合し、エフェクター細胞上の標的にも特異的に結合する、多特異性ポリペプチドである。本開示はまた、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9(tumor necrosis factor receptor superfamily member 9)(41BBまたはCD137)に特異的に結合する結合ドメインを含むポリペプチド、および4−1BBに特異的に結合するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、4−1BBおよび別の標的(例えば、腫瘍関連抗原)に特異的に結合し得る多特異性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、4−1BBに特異的に結合し、標的細胞上の標的にも特異的に結合する、多特異性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、5T4に特異的に結合し、且つ4−1BBに特異的に結合する、二重特異性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記二重特異性ポリペプチドは、標的細胞上に発現された5T4とエフェクター細胞上に発現された4−1BBとに結合することで、エフェクター細胞の活性化を増幅し、標的細胞のエフェクター細胞媒介性細胞毒性を増強する。

0085

いくつかの実施形態では、本開示は、従来公知の5T4結合ドメインおよび/または4−1BB結合ドメインとの比較で、非特異的な結合がより少ない、5T4結合ドメインおよび/または4−1BB結合ドメイン(並びにこのような結合ドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質)を提供する。特定の態様では、本明細書に記載の結合ドメインおよび/または前記結合ドメインを含むポリペプチドは、ある特定の構成および/またはある特定の配向において(例えば、VL−VHと比較してVH−VLにおいて)、5T4および/または4−1BBにより効率的に結合することで、5T4の発現と関連した障害の治療における効力の上昇および/または有用性の向上を示す。

0086

いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のそれを必要とする患者への投与は、特定のがんをはじめとする、5T4の発現と関連した特定の障害の治療に有用である。1つの実施形態では、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、5T4を発現する標的細胞およびエフェクター細胞の両方と結合することにより、前記5T4を発現する標的細胞と前記エフェクター細胞とを「架橋結合」する。両方のドメインが各々の標的に結合することで、エフェクター細胞の活性化が増強されて、エフェクター細胞応答(例えば、エフェクター細胞媒介性細胞毒性)がより長期的且つ/またはよりロバストなものとなる。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は患者の治療において様々な利点を提供し、例えば、5T4への効果的な結合、エフェクター細胞活性の効率的な増強、サイトカイン放出レベルの減少、および/または有害事象(例えば、毒性)のリスク低減といった利点がある。いくつかの実施形態では、標的細胞は、5T4を発現する非標的細胞(例えば、同じ対象、臓器、または組織の正常細胞または非がん性細胞)よりも高いレベルで5T4を発現する。他の実施形態では、標的細胞は5T4を発現するが、その一方、非標的細胞(例えば、同じ対象、臓器、または組織の正常細胞または非がん性細胞)は5T4を発現しない。

0087

本明細書で使用される節の見出しは構成のみを目的としており、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事書物、および論文を含むがこれらに限定はされない、本願で引用された全ての文献または文献の一部は、あらゆる目的でその全体が参照によって明示的に援用される。援用された文献または文献の一部のうちの1または複数における用語の定義が本願における当該用語の定義と食い違う場合、本願に記載された定義が優先される。しかしながら、本明細書に引用されたいずれの参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、および特許出願の言及も、それらが有効な先行技術を構成すること、または、それらが世界中のあらゆる国の共通一般知識の一部を形成していること、の承認でもいかなる形の示唆でもなく、またそれと解釈されるべきでもない。

0088

本明細書では、特に記載がない限り、あらゆる濃度範囲パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、記載された範囲に含まれるあらゆる整数の値と、適切な場合には、その分数(整数の10分の1および100分の1など)と、を包含すると理解されたい。特に記載がない限り、本明細書で使用される用語「a」および「an」は、列挙された構成要素が「1または複数」であることを指すと理解されたい。択一(例えば、「または(or)」)の使用は、択一物の一方、両方、またはそのあらゆる組み合わせを意味すると理解されたい。本明細書で使用される場合、用語「包含する(include)」および「含む(comprise)」は同義的に使用される。加えて、本明細書に記載の成分(例えば、ドメインまたは領域)および代替成分の様々な組み合わせを含むポリペプチドが、それぞれのポリペプチドが個別に記載された場合と同程度に、本願により開示されることを理解されたい。すなわち、個々のポリペプチドの特定成分の選択も、本開示の範囲内である。

0089

定義
本明細書で使用される場合、用語「結合ドメイン」または「結合領域」とは、抗原、リガンド、受容体、基質、または阻害物質(例えば、5T4または4−1BB)など、標的分子を特異的に認識しそれに結合することが可能な、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドペプチド、抗体、または抗体由来の結合ドメインのドメイン、領域、部分、または部位を指す。結合ドメインの例としては、抗体、抗体様タンパク質、抗体様ドメイン抗体重鎖可変領域、抗体軽鎖可変領域、および一本鎖抗体可変領域(例えば、ドメイン抗体、sFv、scFv、scFab)が挙げられる。特定の実施形態では、前記結合ドメインは、抗原結合部位を含むか、それからなる(抗原結合部位は、例えば、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列、すなわち、別のフレームワーク領域(FR)(例えば、所望により1または複数のアミノ酸置換を含むヒトFR)内に配置された抗体由来の3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)および3つの重鎖CDR、から構成される)。特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための種々の試験法が知られており、例えば、ウェスタンブロットELISAファージディスプレイライブラリースクリーニング、およびBIACORE(登録商標)による相互作用分析が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、標的細胞によって発現される標的抗原(例えば、5T4などの腫瘍関連抗原)に特異的に結合する結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、エフェクター細胞によって発現される標的抗原(例えば、4−1BB)に特異的に結合する結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、多特異性ポリペプチドであり、結合ドメインを2つ以上含む。

0090

結合ドメインまたは結合ドメインを含むタンパク質は、105M−1以上の親和性またはKa(すなわち、1/Mを単位とする特定の結合相互作用平衡結合定数)で標的と結合する場合、標的と「特異的に結合」するが、試験試料中に存在する他の成分とは顕著な結合を生じない。結合ドメインは「高親和性」結合ドメインおよび「低親和性」結合ドメインに分類できる。「高親和性」結合ドメインとは、少なくとも107M−1、少なくとも108M−1、少なくとも109M−1、少なくとも1010M−1、少なくとも1011M−1、少なくとも1012M−1、または少なくとも1013M−1のKaを有する結合ドメインを指す。「低親和性」結合ドメインとは、107M−1以下、106M−1以下、105M−1以下のKaを有する結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、Mを単位とする特定の結合相互作用の平衡解離定数(Kd)と定義することもできる(例えば、10−5M〜10−13、または約500nM、約300nM、約250nM、約200nM、約150nM、約100nM、約50nM、約25nM、約10nM、もしくは約5nM)。本開示に係る結合ドメインポリペプチドおよび一本鎖ポリペプチドの親和性は、従来技術を用いて容易に測定できる(例えば、Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660;および米国特許第5,283,173号、同第5,468,614号、または対応特許を参照)。

0091

本明細書で使用される「保存的置換」とは、当該技術分野では、1つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸に置換することと認識されている。保存的置換の例としては当該技術分野において周知のものである(例えば、1997年3月13日に公開されたPCT出願公報WO97/09433号の10頁;Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8)。

0092

本明細書で使用される場合、用語「誘導体」とは、化学的手段または生物学的手段によって、酵素を用いて、または酵素を用いずに、例えば、グリコシル化アルキル化アシル化エステル形成、またはアミド形成によって、1または複数のアミノ酸残基が修飾されたペプチドを指す。

0093

本明細書で使用される場合、指定のポリペプチドまたはタンパク質「に由来する」ポリペプチド配列またはアミノ酸配列とは、当該ポリペプチドの起源を言及している。特定の実施形態では、前記ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、特定の配列(「親(parent)」配列または「親(parental)」配列と称される場合もある)に由来し、且つ、前記親配列と本質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または少なくとも10〜20個のアミノ酸、少なくとも20〜30個のアミノ酸、少なくとも30〜50個のアミノ酸、もしくは少なくとも50〜150個のアミノ酸からなるその一部を有し、あるいは、その起源が前記親配列にあると当業者が確認できる。例えば、抗体から結合ドメイン(例えば、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、シングルドメイン抗体(sdAb)など)を派生させることができる。いくつかの実施形態では、コンピューターアルゴリズムまたはコンピュータシミュレーションによって、抗体またはタンパク質から結合ドメイン配列(例えば、5T4結合ドメインまたは4−1BB結合ドメイン)が派生される。

0094

別のポリペプチドから派生したポリペプチドは、その親ポリペプチドとの比較で、1または複数の変異または変化を有し、例えば、1または複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されていたり、あるいは、1または複数のアミノ酸の挿入または欠失を有し得る。そのような実施形態では、親ポリペプチドから派生した、1または複数の変異または変化を含むポリペプチドは、「バリアント」と称される。本明細書で使用される場合、用語「バリアント(variant)」または「バリアント(variants)」とは、参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドの配列と異なる配列を有するが、その重要な特性は保持している、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。通常、バリアントポリヌクレオチド配列またはバリアントポリペプチド配列は、参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドと、全体的に極めて類似しており、多くの領域で同一である。例えば、バリアントポリヌクレオチドまたはバリアントポリペプチドは、活性のある部分または完全長の参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドと比較して、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を示し得る。前記ポリペプチドは自然発生的ではないアミノ酸配列を含むことができる。このような変形物は、親ポリペプチドとの配列同一性または配列類似性が必然的に100%未満となる。1つの実施形態では、前記バリアントは、親ポリペプチドのアミノ酸配列と、約60%から100%未満のアミノ酸配列同一性またはアミノ酸配列類似性を有する、アミノ酸配列を有する。別の実施形態では、前記バリアントは、親ポリペプチドのアミノ酸配列と、約75%から100%未満、約80%から100%未満、約85%から100%未満、約90%から100%未満、約95%から100%未満のアミノ酸配列同一性またはアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。

0095

本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」とは、2以上のポリヌクレオチド配列間または2以上のポリペプチド配列間の関係を指す。ある配列のある位置が比較配列の対応する位置における同じ核酸塩基またはアミノ酸残基によって占められている場合、その配列はその位置において「同一」であると言われる。配列同一性パーセントは、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が出現している位置の数を求め、同一の位置の数を得ることによって、算出される。次に、前記同一の位置の数を比較枠(comparison window)内の位置の総数割り、100を掛けることで、配列同一性パーセントが得られる。配列同一性パーセントは、2本の最適にアラインメントされた配列を比較枠全体で比較することで求められる。ポリヌクレオチド配列の場合の比較枠は、例えば、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、またはそれ以上の核酸長であり得る。ポリペプチド配列の場合の比較枠は、例えば、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも300、またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。比較用に配列を最適にアラインメントするために、参照配列を一定に保ちつつ、比較枠内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分にギャップと呼ばれる付加または欠失が含ませることができる。最適なアラインメントとは、ギャップを用いたとしても、参照配列と比較配列との間で可能な最大数の「同一」位置を生じるアラインメントである。2本の配列間の「配列同一性」パーセントは、2004年9月1日の時点で国立バイオテクノロジー情報センターから入手できた、「BLAST2 Sequences」プログラムバージョンを用いて求めることができる。このプログラムには、BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列比較用)およびBLASTPプログラム(ポリペプチド配列比較用)が組み込まれており、これらのプログラムはKarlin and Altschul(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993)のアルゴリズムに基づいている。「BLAST 2 Sequences」を利用する場合、2004年9月1日の時点でデフォルトパラメータであった、以下のパラメータを用いることができる:ワードサイズ(word size)(3)、ギャップ開始ペナルティ(open gap penalty)(11)、ギャップ伸長ペナルティ(extension gap penalty)(1)、ギャップドロップオフ値(gap dropoff)(50)、期待値(10)、および、マトリックスオプション(matrix option)を含むがこれに限定はされないあらゆる他の必要なパラメータ。2本のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、互いに少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する場合に、「実質的に類似した配列同一性」または「実質的な配列同一性」を有していると見なされる。

0096

本明細書で使用される場合、特に断りがない限り、免疫グロブリン分子の可変領域内のアミノ酸残基の位置は、IMGT基準(Brochet et al, Nucl. AcidsRes. (2008) 36, W503-508)またはEU命名規約(Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94)に従って付番され、免疫グロブリン分子の定常領域内のアミノ酸残基の位置は、EU命名規約(Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94)に従って付番される。本明細書では、カバット付番規約(Kabat、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、ベテスダ、メリーランド州公衆衛生局、アメリカ国立衛生研究所(1991))を、もう1つのシステムとして、免疫グロブリン分子の可変領域内のアミノ酸残基の位置について言及する際に用い、さらに、免疫グロブリン分子の可変領域内のアミノ酸残基の位置について言及する際に用いる場合もある。

0097

本明細書で使用される場合、用語「二量体」とは、共有結合(例えば、ジスルフィド結合)および他の相互作用(例えば、静電的相互作用塩橋水素結合、および疎水性相互作用)を含む1または複数の形態の分子内力を介して互いに結合した2つのサブユニットからなり、適切な条件下(例えば、生理条件下で、組換えタンパク質の発現、精製、および/もしくは保存に適した水溶液中で、または非変性的且つ/もしくは非還元的な電気泳動用の条件下)で安定である、生物学的実体を指す。用語「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、2つの異なるポリペプチドから形成された二量体を指す。ヘテロ二量体には、本明細書に記載の抗5T4×抗4−1BB分子が含まれ得る。ヘテロ二量体に、4つのポリペプチド(すなわち、2つの軽鎖および2つの重鎖)から形成された抗体は含まれない。用語「ホモ二量体」または「ホモ二量体タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、2つの同一のポリペプチドから形成された二量体を指す。

0098

Fc領域」または「Fcドメイン」とは、細胞上のFc受容体および/または補体のC1q成分に結合することで、抗体のエフェクター機能を媒介できる、ソース抗体の一部に対応する、またはそれに由来する、ポリペプチド配列を指す。Fcとは、「結晶性フラグメント(fragment crystalline)」(タンパク質結晶を容易に形成する抗体のフラグメント)を表す。元来タンパク質消化によって表されていた独特タンパク質フラグメントによって、免疫グロブリンタンパク質の全体的な一般構造を明らかにすることができる。本文書で最初に定義した通り、Fc領域は、各々がヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、ジスルフィド結合で結合した2つのポリペプチドを含むホモ二量体タンパク質である。しかし、より最近では、この用語は、CH3と、CH2と、第二の鎖とジスルフィド結合型の二量体を形成するのに十分なヒンジの少なくとも一部と、からなる一本鎖単量体成分にも適用されている。従って、文脈によって、用語「Fc領域」または「Fcドメイン」の使用は、本明細書では、二量体形態、または結合して二量体タンパク質を形成する個々の単量体のいずれかを指す。免疫グロブリンの構造および機能の概説については、Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc., 1987), pp. 49-140;およびPadlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994を参照されたい。本明細書で使用される場合、Fcという用語は、天然配列のバリアントを包含する。

0099

「免疫グロブリン定常領域」または「定常領域」は、本明細書における定義では、免疫グロブリンの1または複数の定常ドメインの一部または全てに一致する、またはそれに由来する、ペプチドまたはポリペプチド配列を指す用語である。特定の実施形態では、前記定常領域は、IgGのCH2ドメインおよびCH3ドメイン、例えばIgG1のCH2ドメインおよびCH3ドメイン、を含む。特定の実施形態では、前記定常領域はCH1ドメインを含まない。特定の実施形態では、前記定常領域を構成する定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。いくつかの実施形態では(例えば、41BB結合ポリペプチド、5T4結合ポリペプチド、またはその多特異性ポリペプチドの特定の変形形態では)、本開示の融合タンパク質の定常領域は、胎児性Fc受容体(FcRn)などのいくつかのFc受容体との結合能を保持しながら、且つ、比較的長い生体内半減期を保持しながら、エフェクター機能を持たないか、最低限しか持たない。例えば、本開示の融合タンパク質の定常領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシスADCP)、補体活性化、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)の誘導をもたらさないか、またはそれを実質的に低減する。他の変形形態では、本開示の融合タンパク質は、ADCCおよびCDCの片方または両方など、1または複数のエフェクター機能を保持する定常ドメインを含む。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインはヒトIgG1定常領域に融合されており、前記IgG1定常領域は以下のアミノ酸のうちの1または複数が変異している:234位のロイシン(L234)、235位のロイシン(L235)、237位のグリシン(G237)、318位のグルタミン酸(E318)、320位のリジン(K320)、322位のリジン(K322)、またはこれらのあらゆる組み合わせ(付番はEU準拠)。例えば、これらのアミノ酸のうちのいずれか1つまたは複数が、アラニンに変化され得る。別の実施形態では、IgG1Fcドメインは、L234、L235、G237、E318、K320、およびK322(EU付番に準拠)のそれぞれが、アラニンに変異しており(すなわち、それぞれ、L234A、L235A、G237A、E318A、K320A、およびK322A)、所望により、N297A変異も有する(すなわち、CH2ドメインのグリコシル化は基本的には除外)。

0100

用語「軽鎖可変領域」(別名「軽鎖可変ドメイン」または「VL」)および「重鎖可変領域」(別名「重鎖可変ドメイン」または「VH」)とは、それぞれ、抗体の軽鎖および重鎖に由来する可変性の結合領域を指す。可変性の結合領域は、「相補性決定領域」(CDR)および「フレームワーク領域」(FR)として知られている、個別の明確に定義された小領域から構成される。1つの実施形態では、前記FRはヒト型化されている。用語「CL」とは、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽鎖由来の定常領域を指す。用語「CH」とは、「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指す。CHは、抗体のアイソタイプに基づいて、CH1ドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン(IgAIgD、IgG)、またはCH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、およびCH4ドメイン(IgEIgM)にさらに分割できる。「Fab」(Fragment antigen binding)は、抗体の一部であって、抗原に結合し、鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖に連結された重鎖の可変領域およびCH1ドメインを含む部分である。

0101

本明細書で使用される場合、用語「リンカー」とは、通常、ポリペプチドの2つのサブドメインを連結する短いポリペプチド配列を指す。リンカーの非限定的な例としては、グリシン−セリンリピートを含む可動性リンカー、並びに(a)膜貫通型タンパク質(例えば、I型膜貫通型タンパク質)のドメイン間領域由来のリンカー;(b)IIC型レクチン(type II C-lectin)の柄領域由来のリンカー;および(c)免疫グロブリンのヒンジ由来のリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、2つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能をリンカーが発揮することで、得られたポリペプチドが、同じ軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対し特異的結合親和性を保持する。特定の実施形態では、リンカーは5〜約35個のアミノ酸から構成され、例えば、約15〜約25個のアミノ酸から構成される。本明細書で使用される場合、「CH3とCH1またはCLとの間のリンカー」というは、CH3ドメイン(例えば、野生型CH3または変異型CH3)のC末端と、CH1ドメインまたはCLドメイン(例えば、Cκ)のN末端との間の、1または複数のアミノ酸残基(例えば、約2〜12、約2〜10、約4〜10、約5〜10、約6〜10、約7〜10、約8〜10、約9〜10、約8〜12、約9〜12、または約10〜12)を指す。

0102

いくつかの実施形態で、リンカーは、文脈によって、(1)一本鎖Fv(scFv)内のVH領域とVL領域との間のポリペプチド領域を指す場合もあれば、(2)2つの結合ドメインを含む多特異性ポリペプチド内の第一結合ドメインと第二結合ドメインとの間のポリペプチド領域を指す場合もある。リンカーが2つ以上の結合ドメインを連結している後者の例では、このようなリンカーは「結合ドメインリンカー」と称される。いくつかの実施形態では、結合ドメインリンカーで2つ以上の結合ドメインを直接的に連結または接続することにより、以下の構造(結合ドメイン−結合ドメインリンカー−結合ドメイン)を含むコンストラクトを得ることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、(i)第一結合ドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)第二結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、(i)第二結合ドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)第一結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインリンカーは、少なくとも1つの結合ドメインを、免疫グロブリンFcドメインなどの結合ドメイン以外のポリペプチド(すなわち、Igヒンジ−Ig定常領域という構造を含むポリペプチド)に連結することによって、2つ以上の結合ドメインを連結または接続し得る。そのような実施形態では、得られたコンストラクトは以下の構造(結合ドメイン−Fcドメイン−結合ドメインリンカー−結合ドメイン)を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、(i)第一結合ドメインと、(ii)ヒンジ領域と、(iii)免疫グロブリン定常領域と、(iv)結合ドメインリンカーと、(v)第二結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、(i)第二結合ドメインと、(ii)結合ドメインリンカーと、(iii)免疫グロブリン定常領域と、(iv)ヒンジ領域と、(v)第一結合ドメインと、を含む。2つの結合ドメインを含む多特異性ポリペプチド内の免疫グロブリン定常領域と第二結合ドメインとの間のポリペプチド領域(例えば、結合ドメインリンカー)は、多特異性ポリペプチド内でのドメインの配向に応じて、「カルボキシル末端側リンカー」または「アミノ末端側リンカー」とも称され得る。リンカーの非限定例を表1に記載する。

0103

いくつかの実施形態では、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」は、免疫グロブリンヒンジ領域に由来し、本明細書に記載のポリペプチドにおいて結合ドメイン(例えば、5T4結合ドメインまたは4−1BB結合ドメイン)と免疫グロブリン定常領域との間に位置する、ポリペプチドを指す。「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の重鎖に存在する、CH1ドメインとCH2ドメインとの間に挿入されそれらを接続している(IgG、IgA、およびIgDの場合)、またはCH1ドメインとCH3ドメインとの間の挿入されそれらを接続している(IgEおよびIgMの場合)、天然の上部および中間部のヒンジアミノ酸配列を指す。特定の実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列は、ヒト由来であり、ヒトIgGヒンジ領域(例えば、IgG1ヒンジ領域、IgG2ヒンジ領域、IgG3ヒンジ領域、またはIgG4ヒンジ領域)を含み得る。

0104

改変型免疫グロブリンヒンジ領域」または「バリアント免疫グロブリンヒンジ領域」とは、対応する親野生型免疫グロブリンヒンジ領域と比較した場合に1または複数の変異、置換、挿入、または欠失を有するヒンジ領域ポリペプチドを指す。特定の実施形態では、改変型免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域に対し少なくとも70%の相同性(例えば、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の相同性)を有する。特定の実施形態では、改変型免疫グロブリンヒンジ領域は、約5個のアミノ酸長(例えば、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、またはそれ以上のアミノ酸長)から約120個までのアミノ酸長(例えば、約10個〜約40個のアミノ酸長、または約15個〜約30個のアミノ酸長、または約15個〜約20個のアミノ酸長、または約20個〜約25個のアミノ酸長)を有する、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のフラグメントである。通常、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のフラグメントとしての改変型免疫グロブリンヒンジ領域は、米国特許出願公開第2013/0129723号および同第2013/0095097号で開示されたような、IgGコアヒンジ領域(例えば、Xが任意のアミノ酸であるC−X−X−C配列を含むポリペプチド)を含む。ヒンジの非限定例を表1に記載する。

0105

本明細書で使用される場合、用語「ヒト型化」とは、元の抗体の抗原結合特性を保持しながらも、ヒトに対する免疫原性が低い、ヒト以外の種(例えば、マウスまたはラット)に由来する、抗体、免疫グロブリン結合タンパク質、または免疫グロブリン結合ポリペプチドを、遺伝子工学技術を用いて作製する方法を指す。いくつかの実施形態では、抗体、免疫グロブリン結合タンパク質、または免疫グロブリン結合ポリペプチドの結合ドメイン(例えば、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、Fab、scFv)は、ヒト型化されたものである。非ヒト結合ドメインは、CDRグラフティング(Jones et al., Nature 321:522 (1986))として知られている技術およびその変法、例えば、「リシェイピング(reshaping)」(Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271)、「超キメラ化(hyperchimerization)」(Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154)、および「べニアリング(veneering)」(Mark, et al., “Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies.” In: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312)を用いてヒト型化できる。ヒト以外の供給源由来である場合、ヒンジ領域ドメインおよび定常領域ドメインなど、抗体、免疫グロブリン結合タンパク質、または免疫グロブリン結合ポリペプチドの他の領域もヒト型化できる。本開示に係るポリペプチドに対して、これらのポリペプチドが抗体でない場合であっても、当該技術分野におけるヒト型化抗体に関する知見を適用できる。

0106

本明細書で使用される場合、用語「必要としている患者」とは、本明細書で提供される5T4結合タンパク質または多特異性ポリペプチドまたはその組成物による治療または改善に適した疾患、障害、または異常のリスクを有する、またはそれに罹っている患者を指す。

0107

本明細書で使用される場合、用語「薬剤的に許容できる」とは、分子体および組成物が、当該技術分野において周知の経路で投与された場合に、アレルギー反応や他の重篤有害反応を通常は発生させないことを指す。動物、特にヒト、での使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認された、または米国薬局方もしくは他の一般的に認知された薬局方に記載された、分子体および組成物が、「薬剤的に許容できる」と見なされる。

0108

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」とは、転写を開始するためのRNAポリメラーゼとの結合に関与するDNAの領域を指す。

0109

本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖形態または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドリボヌクレオチド、またはその重合体を指す。特に限定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチド類似体を含有し、天然ヌクレオチドと同様の代謝を受ける核酸を包含する。特に記載がない限り、ある特定の核酸配列は、明示的に示された配列だけではなく、保存的に改変されたそのバリアント(例えば、縮重コドン置換)および相補的配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1または複数の選択された(または全ての)コドンの第三位が混合塩基残基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することにより、達成できる(Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98)。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子にコードされるmRNAと同義的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)、RNA分子(例えば、mRNA)、核酸アナログを用いて作製されたDNA類似体およびRNA類似体、並びにその誘導体、フラグメント、および相同体を包含することが意図される。

0110

用語「発現」とは、核酸にコードされている産物の生合成を指す。例えば、目的のポリペプチドをコードする核酸セグメントの場合、発現は、核酸セグメントのmRNAへの転写と、mRNAの1または複数のポリペプチドへの翻訳と、を含む。

0111

用語「発現ユニット」および「発現カセット」は、本明細書では同義的に使用されており、目的のポリペプチドをコードしており、且つ、宿主細胞における当該核酸セグメントの発現を実現することが可能な、核酸セグメントを表す。発現ユニットは、全て操作可能な立体配置にある、転写プロモーターと、目的ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターと、を通常含む。転写プロモーターおよび転写ターミネーターの他に、発現ユニットは、例えばエンハンサーまたはポリアデニル化シグナルなどの他の核酸セグメントをさらに含み得る。

0112

用語「発現ベクター」とは、本明細書で使用される場合、1または複数の発現ユニットを含む、直鎖状または環状の、核酸分子を指す。1または複数の発現ユニットの他に、発現ベクターは、例えば1または複数の複製開始点または1または複数の選択マーカーなどの追加の核酸セグメントも含み得る。発現ベクターは、通常はプラスミドDNA由来またはウイルスDNA由来であるが、両方のエレメントを含有する場合もある。

0113

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ポリペプチド鎖」、または「タンパク質」とは、一本鎖の、直鎖状の、且つ連続的な、共有結合的に連結したアミノ酸の並びを指す。ポリペプチドは1または複数の鎖内ジスルフィド結合を形成し得る。本明細書に記載のポリペプチドに関して、配列番号によって指定されたものに対応するアミノ酸残基の修飾または変化について言及がなされる場合、そのような残基の翻訳後修飾も包含される。ポリペプチドおよびタンパク質という用語は、2本のポリペプチド鎖が鎖間ジスルフィド結合などを介して非直鎖状に連結された実施形態も包含する。例えば、ネイティブな免疫グロブリン分子は2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとから構成される。重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの間の鎖間ジスルフィド結合によって各重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドに結合して、2つのヘテロ二量体タンパク質またはヘテロ二量体ポリペプチド(すなわち、2つの非相同ポリペプチド鎖から構成されるタンパク質)を形成する。この2つのヘテロ二量体タンパク質が、重鎖ポリペプチド間のさらなる鎖間ジスルフィド結合によって結合して、免疫グロブリンタンパク質または免疫グロブリンポリペプチドを形成する。本明細書では、タンパク質またはポリペプチドは抗体または抗体の抗原結合性フラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質はscFv−Fc−scFvタンパク質、scFv−scFv二量体、またはダイアボディであり得る。

0114

当業者には理解されることであるが、本明細書では、タンパク質およびポリペプチドは、本開示の全体を通じた配列番号の参照によって示される、個々のポリペプチド鎖のアミノ酸配列によって定義される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のscFv−Fc−scFvタンパク質またはポリペプチドは、鎖間結合(例えば、鎖間ジスルフィド結合)によって結合して、二量体scFv−Fc−scFvタンパク質(例えば、ホモ二量体scFv−Fc−scFvタンパク質またはヘテロ二量体scFv−Fc−scFvタンパク質)を形成する、2本のscFv−Fc−scFvポリペプチド鎖から構成される(例えば、図10を参照)。そのような実施形態では、scFv−Fc−scFvタンパク質は、個々のscFv−Fc−scFvポリペプチド鎖のアミノ酸配列によって定義される。ポリペプチドおよびタンパク質は炭水化物基などの非ペプチド性成分を含むこともできる。タンパク質またはポリペプチドに対して、当該タンパク質を産生する細胞により、炭水化物および他の非ペプチド性置換基を付加可能であるが、この置換基は細胞の種類によって異なる。本明細書では、タンパク質およびポリペプチドはそのアミノ酸骨格構造によって定義され;炭水化物基などの置換基は、通常特に指定はされないが、存在していてもよい。

0115

用語「アミノ末端側」および「カルボキシル末端側」とは、ポリペプチド内の位置を表すために本明細書では使用される。文脈によっては、これらの用語は、ポリペプチドの特定の配列または部分に関して、近接または相対位置を表すために用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、当該参照配列のカルボキシル末端の近位に位置してはいるが、当該完全ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する必要はない。

0116

本明細書で使用される場合、用語「形質転換」、「トランスフェクション」、および「形質導入」とは、核酸(すなわち、ヌクレオチド重合体)の核内への導入を指す。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子形質転換」とは、DNA、特に組換えDNAの、細胞内への導入および取り込みを指す。この導入核酸は発現ベクターを介して細胞内に導入することができる。

0117

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ADCC」とは、本明細書で使用される場合、FcγRを発現する非特異的な細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞およびマクロファージなどの単球系細胞)が、標的細胞上に結合した抗体(またはFcγRと結合することが可能な他のタンパク質)を認識して、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性のプロセスを指す。原則的に、活性化FcγRを有するいかなるエフェクター細胞も、惹起してADCCを媒介させることができる。ADCCを媒介する主要な細胞はNK細胞であり、これはFcγRIIIのみを発現するが、単球は、その活性化、局在、または分化の状態に依存して、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現できる。造血細胞上のFcγR発現の概要に関しては、例えば、Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92を参照されたい。

0118

ポリペプチドまたはタンパク質に関連して本明細書で使用される、用語「ADCC活性を有する」は、当該ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、IgG(例えば、IgG1)などに由来するFcドメイン(例えば、免疫グロブリンヒンジ領域、並びにCH2ドメインおよびCH3ドメインを有する免疫グロブリン定常領域)を含むポリペプチドまたはタンパク質が、Fc受容体を発現する細胞溶解性免疫エフェクター細胞(例えば、NK細胞)上の細胞溶解性Fc受容体(例えば、FcγRIII)の結合を通じて、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を媒介することが可能であること、を意味する。いくつかの実施形態では、Fcドメインを含む多特異性ポリペプチドまたは多特異性タンパク質(例えば、本明細書に記載の抗5T4×抗4−1BB分子)が、CH2および/またはCH3ドメインにおける変異の結果、エフェクター機能を持たない(例えば、ヌルADCC活性)場合がある。

0119

「補体依存性細胞傷害」および「CDC」とは、本明細書で使用される場合、正常血清中の成分(「補体」)が、標的抗原に結合した抗体または他の補体C1q結合タンパク質と共に、標的抗原を発現している標的細胞の溶解を示すプロセスを指す。補体は、共同して順序立てて働いて効果を発揮する、血清タンパク質一群からなる。

0120

用語「古典的補体経路」および「古典的補体系」とは、本明細書で使用される場合、同義語であり、補体を活性化するための特定の経路を指す。古典経路は惹起に抗原抗体複合体を必要とし、C1〜C9と名付けられた9種類の主要なタンパク質成分の順序だった活性化を含む。活性化プロセスのいくつかの段階において、その産物は次の段階を触媒する酵素となる。このカスケードにより、比較的小さな開始シグナルによる、大量の補体の増幅および活性化が実現される。

0121

ポリペプチドまたはタンパク質に関連して本明細書で使用される、用語「CDC活性を有する」は、当該ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、IgG(例えば、IgG1)などに由来するFcドメイン(例えば、免疫グロブリンヒンジ領域、並びにCH2ドメインおよびCH3ドメインを有する免疫グロブリン定常領域)を含むポリペプチドまたはタンパク質が、補体C1qタンパク質の結合および古典的補体系の活性化を通じて、補体依存性細胞傷害(CDC)を媒介することが可能であること、を意味する。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドまたは多特異性タンパク質(例えば、本明細書に記載の抗5T4×抗4−1BB分子)が、CH2および/またはCH3ドメインにおける1または複数の変異の結果、エフェクター機能を持たない(例えば、ヌルCDC活性)場合がある。

0122

「エフェクター細胞の活性化の増強」とは、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質によるエフェクター細胞応答の増加、長期化、および/または相乗を指す。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞の活性化の増強は、エフェクター細胞の細胞障害活性の増大を指す。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞の活性化の増強は、サイトカイン産生、細胞増殖の増加、またはエフェクター細胞の標的細胞を溶解する能力が増強されるような細胞表面分子発現の変化を指す。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質は、Wnt/β−カテニンシグナル伝達の調節することよって、エフェクター細胞の活性化を増強する。

0123

本明細書で使用される場合、用語「エフェクター細胞」とは、腫瘍細胞などの標的細胞を溶解または殺滅することが可能な免疫系の細胞を指す。本明細書では、エフェクター細胞は、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、またはNKT細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または顆粒球などの、リンパ球を指し得る。特定の実施形態では、エフェクター細胞という用語は、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞を指す。

0124

本明細書で使用される場合、用語「治療(treatment)」、「治療する(treating)」、または「改善する(ameliorating)」は、治療的処置または予防的(prophylactic/preventative)処置のいずれかを指す。治療は、治療を受けている個体における疾患の少なくとも1つの症状が改善する場合、または治療が個体における進行性疾患の悪化を遅延できる場合、または治療が追加の関連疾患の発症を予防できる場合、治療的処置である。

0125

本明細書で使用される場合、本明細書に記載のポリペプチドもしくはタンパク質またはその組成物の「治療有効量(または用量)」または「有効量(または用量)」という用語は、その量の当該化合物が、治療を受けている疾患の1もしくは複数の症状の統計的に有意な回復、または臓器機能の統計的に有意な改善、をもたらすのに十分であることを指す。単独で投与された個々の活性成分についていう場合、治療有効量はその成分単独を指す。組み合わせについていう場合、治療有効量は、(同一製剤中で、または別々の製剤中で同時に)逐次投与されたか同時投与されたかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の総量を指す。

0126

本明細書において、用語「統計的有意性」とは、ある試験結果の入手が偶然に生じたものである確率を指す。例えば、所見または試験結果は、それが純粋に偶然に発生したものである確率(p)が所定の統計的閾値(a)未満である、すなわちp<aである場合、統計的に有意であるとされる。ある特定の試験の統計的閾値は、データの特徴および当該技術分野において公知の慣習に基づいて設定できる。例えば、所与の結果について、当該結果が統計的に有意と見なされるためにp<0.05となるように、aは従来的には5%(0.05)に設定される。

0127

本明細書で使用される場合、「5T4結合ドメイン」とは、TPBGおよびWAIF1(Wnt-activated inhibitory factor 1)としても知られている、癌胎児性トロホブラスト糖タンパク質(5T4)(例えば、ヒト5T4)に特異的に結合する、本明細書に記載のポリペプチドのドメインを指す。5T4は、72kDの癌胎児性糖タンパク質であり、タンパク質間相互作用に関連するいくつかのロイシンリッチリピートを有する、重度のN−グリコシル化が生じたタンパク質である。用語「5T4」は、5T4の任意のアイソフォームを指す場合がある。例示的なヒト5T4のヌクレオチド配列を配列番号163および配列番号167として、さらに、例示的なヒト5T4のアミノ酸配列を配列番号164および配列番号168として、下記の表1に示す。

0128

本明細書で使用される場合、「4−1BB結合ドメイン」とは、ヒト4−1BB(別名CD137)に特異的に結合することが可能な、本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチドの結合ドメインを指す。用語「4−1BB」は、4−1BBの任意のアイソフォームを指す場合がある。例示的なヒト4−1BBのヌクレオチド配列を配列番号161および配列番号165として、さらに、例示的なヒト4−1BBのアミノ酸配列を配列番号162および配列番号166として、下記の表1に示す。

0129

本明細書で使用される場合、「多特異性ポリペプチド」とは、それぞれ標的抗原に特異的に結合することが可能な2つ以上の結合ドメインを含むポリペプチドを指す。例えば、本明細書に記載のポリペプチドは、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の結合ドメインを含み、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の標的抗原と結合することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドは二重特異性ポリペプチドである。ここで、「二重特異性ポリペプチド」とは、2つの結合ドメインを含み、2つの別個の標的抗原に結合することが可能なものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性ポリペプチドは、5T4などの、標的細胞上に発現した細胞表面抗原に特異的に結合する第一結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性ポリペプチドは、4−1BBなどの、エフェクター細胞上に発現した細胞表面抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む。特定の実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、scFv−Fc−scFvのフォーマットをとるホモ二量体二重特異性ポリペプチドの、ADAPTIR(商標)である。

0130

足場を用いた多特異性ポリペプチドとしては、例えば、PCT国際公開第2007/146968号;同第2010/040105号;同第2010/003108号;同第2016/094873号;同第2017/053469号;米国特許出願公開第2006/0051844号;並びに米国特許第7,166,707号および同第8,409,577号(それぞれその全体が参照によって本明細書に援用される)で開示されたものがある。特定の実施形態では、本明細書に記載の多特異性ポリペプチドは、二重特異性ポリペプチドであり、scFv−Fc−scFv構造、別称ADAPTIR(商標)ポリペプチドまたはフォーマット1、を含み得る。その例示的な実施形態を図10に示す。フォーマット1構造を含むポリペプチドの構造は、N末端からC末端に向かって、第一scFv結合ドメイン−免疫グロブリン(Ig)ヒンジ領域−Ig定常領域−第二scFv結合ドメインを含む(図10)。特定の実施形態では、本明細書に記載の多特異性ポリペプチドは、IgG−scFv構造(別称Morrisonフォーマット、またはフォーマット2)を含み得る。フォーマット2構造を含むポリペプチドの構造は、N末端からC末端に向かって、scFv結合ドメイン−Ig定常領域−Igヒンジ領域−Ig可変領域を含む。フォーマット2は、本質としては、C末端にscFvドメインを含むインタクトIg分子である。

0131

結合ポリペプチドおよび結合タンパク質
いくつかの実施形態において、本開示は、5T4に特異的に結合することが可能なポリペプチド(例えば、5T4結合ポリペプチド)、並びにこれらの結合ドメインを含む多特異性のポリペプチドおよびタンパク質を記載している。このような実施形態は5T4結合ポリペプチドと称される場合がある。特定の実施形態では、本発明は、5T4結合ドメインと、エフェクター細胞上の細胞表面分子に結合することが可能な第二結合ドメインと、を含む多特異的結合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、本発明は、5T4結合ドメインと、4−1BBに結合することが可能な第二結合ドメイン(例えば、4−1BB結合ドメイン)と、を含む二重特異性結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、前記5T4結合ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、5T4結合ドメイン−Fcドメインの構造を含む。

0132

いくつかの実施形態において、本開示は、4−1BBに特異的に結合することが可能なポリペプチド、並びにこれらの結合ドメインを含む多特異性のポリペプチドおよびタンパク質を記載している。このような実施形態は4−1BB結合ポリペプチドと称される場合がある。特定の実施形態では、本発明は、4−1BB結合ドメインと、標的細胞上の細胞表面分子に結合することが可能な第二結合ドメインと、を含む多特異的ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、本発明は、4−1BB結合ドメインと、5T4に結合することが可能な第二結合ドメイン(例えば、5T4結合ドメイン)と、を含む二重特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記4−1BB結合ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、4−1BB結合ドメイン−Fcドメインの構造を含む。

0133

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、免疫グロブリン定常領域、リンカーペプチド、ヒンジ領域、免疫グロブリン二量体形成ヘテロ二量体形成ドメイン、接合部アミノ酸、タグなどをさらに含むことができる。以下、本開示のポリペプチドおよびタンパク質のこれらの成分についてさらに詳細に説明する。

0134

本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質(例えば、5T4結合ポリペプチド、4−1BB結合ポリペプチド、および/またはその多特異的結合タンパク質)は、標的抗原と特異的に結合することが可能な1または複数の結合ドメインを含む。本明細書に記載の結合ドメインは、種々様々なフォーマットのうちのいずれかの抗体または融合タンパク質の形態をとることができる(例えば、前記融合タンパク質は二重特異性分子または多特異性分子の形態をとることができる)。二重特異性分子の非限定的な例として、scFv−Fc−scFv分子(例えば、フォーマット1の構造を含む二重特異性タンパク質)、scFv−Ig分子(例えば、フォーマット2の構造を含む二重特異性タンパク質)、およびscFv−scFv分子が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性分子は、第一結合ドメインscFvとそれに連結された第二結合ドメインscFvとを含むか、これらからなり、免疫グロブリン定常領域などの他の配列を含まない。他の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性タンパク質はダイアボディである。

0135

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質は、薬剤または毒性部分に複合化されている。

0136

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質(例えば、5T4結合ポリペプチド、4−1BB結合ポリペプチド、および/またはその多特異的結合タンパク質)は、表2〜10に示されるアミノ酸配列および/または核酸配列を含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドの結合ドメインは、(i)CDRとしてLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)と、(ii)CDRとしてHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と、を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドコンストラクトの場合に提供されるアミノ酸配列は、ヒト免疫グロブリンリーダー配列を含まない。示されるCDR配列およびアミノ酸置換位置は、IMGT基準(Brochet et al, Nucl. AcidsRes. (2008) 36, W503-508)を用いて規定したものである。場合によっては、表2〜10の配列を含む、本開示に示される配列は、親配列に対してアミノ酸置換を含有する(例えば、PCT国際公開第2016/185016号で開示された、クローン1618/1619などの抗4−1BB抗体もしくはその結合性フラグメント、またはPCT国際公開第2016/185016号で開示されたものなどの抗5T4抗体もしくはその結合性フラグメント)。いくつかの実施形態では、抗5T4結合ドメインの親配列は配列番号38および配列番号68に提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗4−1BB結合ドメインの親配列は配列番号28および配列番号16に提供されるアミノ酸配列を含む。本明細書に記載の抗4−1BB結合ドメインおよび抗5T4結合ドメインの例示的な親配列を下記の表2に示す。下線が引かれたテキストはCDR配列を表している。

0137

特定の実施形態では、本開示の結合ドメインとしてのVL領域および/またはVH領域は、親VL領域および/または親VH領域のVLおよび/またはVHに由来するものであり(例えば、PCT国際公開第2016/185016号に記載された1618/1619)、所望により、既知モノクローナル抗体のVL配列および/またはVH配列と比較して、1または複数個程度(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個程度)の挿入、1または複数個程度(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個程度)の欠失、1または複数個程度(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個程度)のアミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換)、または上記変化の組み合わせ、を含有する。上記の挿入、欠失、または置換は、アミノ末端またはカルボキシル末端または両端をはじめとして、VL領域および/またはVH領域のどこに存在してもよいが、ただし、各CDRが含む変化はゼロであるか、多くても1個、2個、または3個である。いくつかの実施形態では、この改変されたVL領域および/またはVH領域を含有する結合ドメインは、尚も、親結合ドメインと同様またはそれを超える親和性でその標的と特異的に結合できる。

0138

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合ドメインは、抗体由来であり、重鎖可変領域(VH)と軽鎖可変領域(VL)とを含む。例として、VH鎖およびVL鎖を含むscFvが挙げられる。これらの結合ドメインおよび可変領域鎖の配置の順番は、標的への結合性がいくらかでも保持される限り、特に限定はされない。例えば、可変ドメインは以下の順番で配置され得る:VH5T4−VL5T4−VH4−1BB−VL4−1BB;VL5T4−VH5T4−VH4−1BB−VL4−1BB;VH5T4−VL5T4−VL4−1BB−VH4−1BB;VL5T4−VH5T4−VL4−1BB−VH4−1BB;VH4−1BB−VL4−1BB−VH5T4−VL5T4;VL4−1BB−VH4−1BB−VL5T4−VH5T4;VH4−1BB−VL4−1BB−VL5T4−VH5T4;またはVL4−1BB−VH4−1BB−VH5T4−VL5T4。4−1BBに結合する結合ドメインおよび/または5T4に結合する結合ドメインにおけるVH領域およびVL領域の対は、一本鎖抗体(scFv)のフォーマットをとり得る。

0139

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質(例えば、5T4結合ポリペプチド、4−1BB結合ポリペプチド、および/またはその多特異的結合タンパク質)は、scFvsである結合ドメインを含む。そのような実施形態では、前記結合ドメインはscFvドメインと称される場合がある。いくつかの実施形態では、目的の標的に対し特異的なVH領域およびVL領域を含む一本鎖Fvフラグメント(scFv)が結合ドメインとなる。特定の実施形態では、これらのVH領域およびVL領域は、ヒトの、またはヒト型化されたものである。いくつかの変形形態では、ペプチドリンカーで連結されたVL領域およびVH領域を含む一本鎖Fv(scFv)が結合ドメインとなる。

0140

VL領域およびVH領域を連結するためのペプチドリンカーの使用は、当該技術分野において周知であり、この特定の分野の中に多数の刊行物が存在している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Gly−Gly−Gly−Gly−Serが3回反復したアミノ酸配列((Gly4Ser)3)(配列番号96)からなる、15merのものである。他のリンカーも用いられており、ファージディスプレイ技術が、選択的感染性ファージ(selective infective phage)技術と同様に用いられており、適切なリンカー配列多様化および選択される(Tang et al., J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Hennecke et al., Protein Eng. 11, 405-410, 1998)。特定の実施形態では、前記VL領域およびVH領域は、n=1〜5である式(Gly4Ser)nを含むアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって連結されている。例えば、本発明の1つの実施形態では、前記リンカーは(Gly4Ser)4を含む。単一のリンカー(例えば、(Gly4Ser)n)をランダム変異誘発を介して最適化することで、他の好適なリンカーを得ることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のscFvのVH領域は、リンカー配列のN末端側に位置し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のscFvのVL領域は、リンカー配列のC末端側に位置し得る。いくつかの実施形態では、前記scFvは、同じVH領域およびVL領域の配列を同じ配向で含む抗体よりも効率的に5T4および/または4−1BBに結合し得る。特定の実施形態において、前記scFvは、VH−VL配向でよりもVL−VH配向で5T4および/または4−1BBにより効率的に結合する場合もあれば、逆にVL−VH配向でよりもVH−VL配向でより効率的に結合する場合もある。

0141

いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、前記結合ドメインを連結している(例えば、前記scFvドメインを連結している)結合ドメインリンカーを含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーはGly4Serリンカーである。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、Gly−Gly−Gly−Gly−Serが4回反復したアミノ酸配列((Gly4Ser)3)(配列番号98)からなる、20merのものである。いくつかの実施形態において、前記結合ドメインリンカーは、配列番号86〜108から選択されるアミノ酸配列を含む。他のリンカーも用いられており、ファージディスプレイ技術が、選択的感染性ファージ技術と同様に用いられており、適切なリンカー配列が多様化および選択される(Tang et al., J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Hennecke et al., Protein Eng. 11, 405-410, 1998)。特定の実施形態では、前記VL領域およびVH領域は、n=1〜5である式(Gly4Ser)nを含むアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって連結されている。単一のリンカー(例えば、(Gly4Ser)n)をランダム変異誘発を介して最適化することで、他の好適なリンカーを得ることができる。いくつかの例では、二重特異性分子が、4−1BBに結合するscFvに連結された5T4に結合するscFvを含み得る。いくつかの実施形態では、二重特異性分子が、ヒンジ領域も定常領域も含まない。

0142

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質(例えば、5T4結合ポリペプチド、4−1BB結合ポリペプチド、および/またはその多特異的結合タンパク質)は、ヒンジをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ヒンジは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域内の1または複数のシステイン残基が1または複数の他のアミノ酸残基(例えば、セリンまたはアラニン)で置換された、改変型の免疫グロブリンヒンジである。例示的な改変型免疫グロブリンヒンジ、カルボキシル末端側リンカー、およびアミノ末端側リンカーは、野生型ヒトIgG1ヒンジに存在する1、2、または3個のシステイン残基が、1、2、または3個の異なるアミノ酸残基(例えば、セリンまたはアラニン)で置換された、免疫グロブリンヒトIgG1ヒンジ領域を包含する。改変型免疫グロブリンヒンジは、さらにプロリンが、別のアミノ酸(例えば、セリンまたはアラニン)で置換されていてもよい。例えば、前述の改変型ヒトIgG1ヒンジは、さらに、野生型ヒトIgG1ヒンジ領域の3個のシステインのカルボキシル末端側に位置するプロリンが、別のアミノ酸残基(例えば、セリン、アラニン)で置換されていてもよい。1つの実施形態では、コアヒンジ領域のプロリンは置換されない。特定の実施形態では、ヒンジポリペプチド、カルボキシル末端側リンカーポリペプチド、またはアミノ末端側リンカーポリペプチドは、野生型ヒトIgG1ヒンジ、野生型ヒトIgG2ヒンジ、または野生型ヒトIgG4ヒンジなどの、野生型免疫グロブリンヒンジ領域と、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一な配列を含むか、またはそのような配列である。

0143

特定の実施形態では、別のポリペプチド鎖とヘテロ二量体を形成しているポリペプチドに存在するヒンジは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域またはその改変型免疫グロブリンヒンジ領域などの免疫グロブリンヒンジであり得る。特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の一方のポリペプチド鎖のヒンジが、当該ヘテロ二量体の他方のポリペプチド鎖の対応するヒンジと同一である。他の特定の実施形態では、一方の鎖のヒンジが他方の鎖のヒンジと(長さと配列において)異なっている。異なる鎖に異なるヒンジがあることで、これらのヒンジが接続されている各結合ドメインの結合親和性に対して、異なる処置を加えることが可能となり、その結果、ヘテロ二量体を、一方の結合ドメインの標的に対して、他方の結合ドメインの標的よりも優先的に結合させることができるようになる。例えば、特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質が、一方の鎖に4−1BB結合ドメインを有し、別の鎖に5T4結合ドメインを有する。2つの異なる鎖に2つの異なるヒンジがあることで、ヘテロ二量体の、5T4への結合を第一とし、4−1BBへの結合を第二とすることができる。すなわち、このヘテロ二量体は、4−1BB発現エフェクター細胞を5T4発現標的細胞(例えば、5T4を発現している腫瘍またはがん細胞)に動員することで、その5T4発現細胞の傷害または破壊をもたらすことができる。

0144

特定の実施形態では、カルボキシル末端側リンカーまたはアミノ末端側リンカーが、グリシン−セリン(例えば、Gly4Ser)リピートを含む可動性リンカー配列である。特定の実施形態では、前記リンカーは、3つのGly4Serリピート(配列番号96)と、その後にプロリン残基を含む。特定の実施形態では、前記プロリン残基の後に、グリシン、アルギニン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸が続く。いくつかの実施形態では、カルボキシル末端側リンカーまたはアミノ末端側リンカーが、配列番号86〜108から選択される配列を含むか、それからなる。

0145

本開示で用いるのに適した、いくつかの例示的なヒンジ、カルボキシル末端側リンカー、およびアミノ末端側リンカーの配列を、下記の表3に示す。追加の例示的なヒンジ領域およびリンカー領域が、米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号241〜244、601、78、763〜791、228、379〜434、618〜749に記載されている(これらの配列は参照によって本明細書に援用される)。
表3:ヒンジおよびリンカーの例

0146

他の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質は、第二の同一でないポリペプチド鎖内の異なるヘテロ二量体形成ドメインとヘテロ二量体化することが可能な、ヘテロ二量体形成ドメインを含む。特定の変形例では、ヘテロ二量体化のための前記第二のポリペプチド鎖は、第二の結合ドメインを含む。従って、本開示の特定の実施形態では、一方が第一結合ドメインを含むポリペプチドを含み、2本目が所望により第二結合ドメインを含む、2本の同一でないポリペプチド鎖が、二量体化して、ヘテロ二量体結合タンパク質を形成している。二量体形成/ヘテロ二量体形成ドメインは、2本の同一でないポリペプチド鎖からのヘテロ二量体形成が望まれ、片方または両方のポリペプチド鎖が結合ドメインを含む場合に、使用できる。特定の実施形態では、本明細書に記載の特定のヘテロ二量体の一方のポリペプチド鎖メンバーが、結合ドメインを含有しない。ヘテロ二量体の種類の例として、米国特許出願公開第2013/0095097号および同第2013/0129723号、PCT国際公開第2016/094873号に記載されるものが挙げられる。

0147

特定の実施形態では、前記第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖は、「免疫グロブリン二量体形成ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメイン」を含むことにより、二量体化する。「免疫グロブリン二量体形成ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメイン」とは、本明細書では、第二ポリペプチド鎖の異なる免疫グロブリン領域と優先的に相互作用または結合する、第一ポリペプチド鎖の免疫グロブリン領域を指し、この異なる免疫グロブリン領域同士の相互作用が、第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化(すなわち、2本の異なるポリペプチド鎖間の二量体、別名「ヘテロ二量体」、の形成)の実質的な一因となり、またはそれを効率的に促進する。ヘテロ二量体の各ポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、互いに異なっていることで、両方の鎖によるヘテロ二量体化を促進し、どちらかの鎖によるホモ二量体化を最小限にするように、異なる改変を加えることができる。本明細書において提供される免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、異なるポリペプチド間の効率的なヘテロ二量体化を可能にし、得られるヘテロ二量体タンパク質の精製を容易にする。

0148

本明細書で提供されるように、本開示に係る2本の異なるポリペプチド鎖のヘテロ二量体化の促進に有用な免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、野生型および改変型の免疫グロブリンのCH1ドメインおよびCLドメイン、例えばヒトのCH1ドメインおよびCLドメイン、を含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインが、例えば、米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号114、186〜192、および194にそれぞれ記載されるような、または米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号114に記載されるような、野生型のIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、またはIgMのCH1ドメインなどの、野生型CH1ドメインである(前記配列は参照によって本明細書に援用される)。別の実施形態では、改変型CH1ドメインと野生型CLドメインとの間でジスルフィド結合が形成されないように、野生型免疫グロブリンCLドメイン(例えば、ヒトCL)とのジスルフィド結合形成に関与する野生型CH1ドメイン(例えば、ヒトCH1)のシステイン残基が、改変型免疫グロブリンCH1ドメインで欠失または置換されている。

0149

特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、例えば、米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号112および配列番号113(前記配列は参照によって本明細書に援用される)にそれぞれ記載されるような、野生型Cκドメインまたは野生型Cλドメインなどの、野生型CLドメインである。別の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、改変型Cκドメインまたは改変型Cλドメインなどの改変型免疫グロブリンCLドメインであり、例えば、改変型ヒトCκドメインまたは改変型ヒトCλドメインである。特定の実施形態では、前記改変型免疫グロブリンCLドメイン、例えば米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号141に記載のCκドメインまたは米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号140に記載のCλドメイン(前記配列は参照によって本明細書に援用される)において、野生型免疫グロブリンCH1ドメインとのジスルフィド結合の形成に関与する野生型CLドメインのシステイン残基が欠失または置換されている。特定の実施形態では、前記改変型Cκドメインにおいて、前記野生型ヒトCκドメインの最後のシステインのみが欠失しているが、これは、カルボキシル末端にアルギニンを有し且つ改変型Cκドメインのアミノ末端を別のドメイン(例えば、免疫グロブリンCH2ドメインおよび免疫グロブリンCH3ドメインを含む小領域などの、免疫グロブリン小領域)と連結させるリンカーによって、前記野生型ヒトCκドメインから欠失した第1アルギニンが供給され得るためである。

0150

別の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、Cκ−Cκ境界における鎖間水素結合ネットワークの形成に関与し得る位置において、野生型Cκドメインと比較して1または複数のアミノ酸置換を含有する、改変型Cκドメインである。例えば、特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、N29位、N30位、Q52位、V55位、T56位、S68位、またはT70位の1または複数のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換された改変型ヒトCκドメインである。アミノ酸の付番は、米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号141(前記配列は参照によって本明細書に援用される)に記載の改変型ヒトCκ配列における位置に基づいている。特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、N29位、N30位、V55位、またはT70位に1、2、3、または4つのアミノ酸置換を有する改変型ヒトCκドメインである。上記位置の置換基として使用されるアミノ酸は、アラニンか、または、アルギニン、トリプトファンチロシン、グルタミン酸、グルタミン、リジンアスパラギン酸メチオニン、セリンもしくはフェニルアラニンなどの側鎖部分に嵩があるアミノ酸残基であり得る。改変型ヒトCκドメインは、CH1ドメインとのヘテロ二量体化を促進するが、別のCκドメインとのホモ二量体化は最小限にするものである。改変型ヒトCκドメインの代表的なものとして、米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号142〜178;米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号160(N29W V55A T70A)、配列番号161(N29Y V55A T70A)、配列番号202(T70E N29A N30A V55A)、配列番号167(N30R V55A T70A)、配列番号168(N30K V55A T70A)、配列番号170(N30E V55A T70A)、配列番号172(V55R N29A N30A)、配列番号175(N29W N30Y V55A T70E)、配列番号176(N29Y N30Y V55A T70E)、配列番号177(N30E V55A T70E)、配列番号178(N30Y V55A T70E)、配列番号838(N30D V55A T70E)、配列番号839(N30M V55A T70E)、配列番号840(N30S V55A T70E)、および配列番号841(N30F V55A T70E)(前記配列は参照によって本明細書に援用される)に記載のものがある。

0151

特定の実施形態では、本明細書に記載のCκドメインの変異に加えて、またはそれの代わりに、ポリペプチドヘテロ二量体の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインの両方(すなわち、免疫グロブリンCH1ドメインおよび免疫グロブリンCLドメイン)が変異を有し、その結果、得られた免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインが、変異部位のアミノ酸残基間で塩橋(すなわち、イオン性相互作用)を形成する。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、変異型CH1ドメインと変異型Cκドメインとの組み合わせであり得る。前記変異型CH1ドメインでは、野生型ヒトCH1ドメインの68位のバリン(V68)が負電荷を有するアミノ酸残基(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)で置換されており、最初のアルギニンと最後のシステインが欠失している変異型ヒトCκドメインの29位のロイシン(L29)が正電荷を有するアミノ酸残基(例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン)で置換されている。得られた変異型CH1ドメインの負電荷を有するアミノ酸残基と、得られた変異型Cκドメインの正電荷を有するアミノ酸残基と、の間の電荷間の相互作用により、塩橋が形成され、この塩橋が変異型CH1ドメインと変異型Cκドメインとの間のヘテロ二量体の境界面を安定化させる。あるいは、野生型CH1のV68が正電荷を有するアミノ酸残基で置換され、最初のアルギニンおよび最後のシステインが欠失している変異型ヒトCκドメインのL29が負電荷を有するアミノ酸残基で置換されていてもよい。V68が負電荷または正電荷を有するアミノ酸で置換されている変異型CH1配列の例として、米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号844および配列番号845(前記配列は参照によって本明細書に援用される)に記載のものがある。L29が負電荷または正電荷を有するアミノ酸で置換されている変異型Cκ配列の例として、米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号842および配列番号843(前記配列は参照によって本明細書に援用される)に記載のものがある。

0152

CH1ドメインのV68およびCκドメインのL29の変異に加えて、またはそれの代わりに、ヒトCH1ドメインのV68およびヒトCκドメインのL29以外の位置で、相反する電荷を有するアミノ酸による置換を行って、それらのアミノ酸間にイオン性相互作用を生み出すことができる。そのような位置は、あらゆる好適な方法で特定することができ、そのような方法としては、ランダム変異誘発、CH1−Cκ対の結晶構造解析によるCH1−Cκ境界面に位置するアミノ酸残基の特定、さらに、一連判定基準(例えば、イオン性相互作用に対する関与傾向、パートナーになり得る残基との近接性など)を用いたCH1−Cκ境界面に位置するアミノ酸残基間の適切な位置の特定、が挙げられる。

0153

特定の実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロ二量体は、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインを一対だけ含有する。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の第一鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインとしてCH1ドメインを含み、第二鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインとしてCLドメイン(例えば、CκまたはCλ)を含み得る。あるいは、第一鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインとしてCLドメイン(例えば、CκまたはCλ)を含み、第二鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインとしてCH1ドメインを含み得る。本明細書に記載されるように、第一鎖および第二鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、互いに結合することで、本開示のヘテロ二量体タンパク質を形成することが可能である。

0154

他の特定の実施形態では、本開示のヘテロ二量体タンパク質は2対の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインを有し得る。例えば、ヘテロ二量体の第一鎖が2つのCH1ドメインを含み、第二鎖が前記第一鎖内の2つのCH1ドメインと結合する2つのCLドメインを有し得る。あるいは、第一鎖が2つのCLドメインを含み、第二鎖が前記第一鎖内の2つのCLドメインと結合する2つのCH1ドメインを有し得る。特定の実施形態では、第一ポリペプチド鎖がCH1ドメインおよびCLドメインを含み、第二ポリペプチド鎖が前記第一ポリペプチド鎖内のCH1ドメインおよびCLドメインとそれぞれ結合するCLドメインおよびCH1ドメインを含む。

0155

ヘテロ二量体タンパク質が1つのみのヘテロ二量体化対(すなわち、各鎖に1つの免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメイン)を含む実施形態では、各鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、その鎖の免疫グロブリン定常領域のアミノ末端側に位置し得る。あるいは、各鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、その鎖の免疫グロブリン定常領域のカルボキシル末端側に位置し得る。

0156

ヘテロ二量体タンパク質が2つのヘテロ二量体化対(すなわち、各鎖に2つの免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメイン)を含む実施形態では、各鎖の両方の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインが、その鎖の免疫グロブリン定常領域のアミノ末端側に位置し得る。あるいは、各鎖の両方の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインが、その鎖の免疫グロブリン定常領域のカルボキシル末端側に位置し得る。別の実施形態では、各鎖の一方の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインがその鎖の免疫グロブリン定常領域のアミノ末端側に位置し、各鎖の他方の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインがその鎖の免疫グロブリン定常領域のカルボキシル末端側に位置し得る。言い換えれば、これらの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、各鎖の2つの免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインの間に挿入されている。

0157

本明細書で示されるように、いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドおよびタンパク質(例えば、5T4結合ポリペプチド、4−1BB結合ポリペプチド、および/またはその多特異的結合タンパク質)は、ポリペプチド鎖に免疫グロブリン定常領域(別名、定常領域、Fcドメイン、Fc領域など)をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記免疫グロブリン定常領域は、配列番号158のアミノ酸配列、配列番号160のアミノ酸配列、またはそのバリアントを含む。免疫グロブリン定常領域が含まれることで、本発明のポリペプチドおよびタンパク質の、対象への投与後の循環血液からのクリアランスが遅くなる。変異または他の変化により、免疫グロブリン定常領域は、ポリペプチドのエフェクター機能(例えば、ADCC、ADCP、CDC、補体結合、およびFc受容体への結合)の比較的容易なさらなる調節を可能にし、エフェクター機能は、当該技術分野において公知であり且つ本明細書に記載の、治療対象の疾患に基づいて増加または減少され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質は、これらのエフェクター機能のうちの1または複数を調節することが可能な免疫グロブリン定常領域を含む。他の実施形態では、これらのエフェクター機能のうちの1または複数が、対応する野生型免疫グロブリン定常領域と比較して、本開示の、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質の免疫グロブリン定常領域では、低減しているか、または存在しない。例えば、例えば4−1BB結合ドメインを含むことなどにより、エフェクター細胞の活性化を増強するように設計された、二量体型の5T4結合ポリペプチドまたは4−1BB結合ポリペプチドの場合、免疫グロブリン定常領域は、対応する野生型免疫グロブリン定常領域と比較して、エフェクター機能が低減されているか、エフェクター機能がないことが好ましい。

0158

本開示のポリペプチドおよびタンパク質(例えば、5T4結合ポリペプチド、4−1BB結合ポリペプチド、および/またはその多特異的結合タンパク質)に存在する免疫グロブリン定常領域は、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、またはこれらのあらゆる組み合わせ、の一部または全てを含むか、またはそれに由来し得る。例えば、免疫グロブリン定常領域は、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインの両方、CH3ドメインおよびCH4ドメインの両方、2つのCH3ドメイン、CH4ドメイン、2つのCH4ドメイン、並びにCH2ドメインおよびCH3ドメインの一部を含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質は、CH1ドメインを含まない。

0159

本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質は、免疫グロブリンの特定のクラスもしくはサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、またはIgD)由来、または様々な種(ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳類を含む)由来の、野生型免疫グロブリンCH2ドメインまたは改変型免疫グロブリンCH2ドメインを含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のCH2ドメインは、米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号115、199〜201、および195〜197(前記配列は参照によって本明細書に援用される)にそれぞれ記載されるヒトのIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、またはIgDの野生型CH2ドメインなどの、野生型ヒト免疫グロブリンCH2ドメインである。特定の実施形態では、前記CH2ドメインは、米国特許出願公開第2013/0129723号(前記配列は参照によって本明細書に援用される)の配列番号115に記載の野生型ヒトIgG1 CH2ドメインである。

0160

特定の実施形態では、本開示のポリペプチドまたはタンパク質の改変型CH2領域は、野生型のヒトのIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはマウスIgG2a(例えば、IGHG2c)のCH2領域などの、野生型免疫グロブリンCH2領域と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一の配列を含むか、そのような配列である。

0161

本開示のポリペプチドまたはタンパク質の改変型免疫グロブリンCH2領域(例えば、5T4結合ポリペプチド、4−1BB結合ポリペプチド、および/またはその多特異的結合タンパク質)は、様々な種(ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳類を含む)由来の、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、およびIgDなどの、様々な免疫グロブリンアイソタイプの、CH2領域に由来し得る。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の改変型免疫グロブリンCH2領域は、米国特許出願公開第2013/0129723号(前記配列は参照によって本明細書に援用される)の、配列番号115、199、201、および320にその配列が記載される、ヒトのIgG1、IgG2もしくはIgG4、またはマウスIgG2a(例えば、IGHG2c)の、CH2領域に由来し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質(例えば、5T4結合ポリペプチド、4−1BB結合ポリペプチド、および/またはその多特異的結合タンパク質)の改変型CH2ドメインは、ADCC、ADCP、CDC、補体結合、Fc受容体結合、またはこれらのあらゆる組み合わせなどの、免疫学的活性(すなわち、エフェクター機能)を増強または低減する、当該技術分野において公知の変異を有する、改変型ヒトIgG1 CH2ドメインである。

0162

特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のCH2ドメインは、1または複数のアミノ酸の欠失または置換を含む改変型免疫グロブリンCH2領域(例えば、改変型ヒトIgG1 CH2ドメイン)である。いくつかの実施形態では、前記CH2ドメインは、297位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換(例えば、アスパラギンのアラニンへのアミノ酸置換)を含む。このようなアミノ酸置換は、この部位でのグリコシル化を低減または排除し、FcのFcγRおよびC1qへの効率的な結合を抑止する。297位のAsnがAlaに置換された改変型ヒトIgG1 CH2ドメインの配列は、米国特許出願公開第2013/0129723号の配列番号324(前記配列は参照によって本明細書に援用される)に記載されたものである。いくつかの実施形態では、前記改変型CH2ドメインは、234〜238位において少なくとも1つの置換または欠失を含む。例えば、免疫グロブリンCH2領域は、234位、235位、236位、237位、もしくは238位;234位および235位;234位および236位;234位および237位;234位および238位;234〜236位;234位、235位および237位;234位、236位および238位;234位、235位、237位、および238位;236〜238位;または234〜238位の2個、3個、4個、もしくは5個のアミノ酸のあらゆる他の組み合わせに、置換を含み得る。いくつかの実施形態では、改変型CH2領域は、234〜238位に1または複数(例えば、2個、3個、4個、または5個)のアミノ酸欠失を含み、例えば、236位または237位の一方にアミノ酸欠失を含み、他方は置換されている。特定の実施形態では、234〜238位の1または複数におけるアミノ酸残基は、1または複数のアラニン残基で置換されている。別の実施形態では、234〜238位のアミノ酸残基のうち1つのみが欠失しており、234〜238位の1または複数の残りのアミノ酸は別のアミノ酸(例えば、アラニンまたはセリン)で置換されている場合がある。

0163

いくつかの実施形態では、上記の変異は、前記改変型CH2ドメインを含むポリペプチドのADCC活性またはFc受容体結合能を低減または排除する。

0164

他の特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のCH2ドメインは、253位、310位、318位、320位、322位、および331位に1または複数のアミノ酸置換を含む改変型免疫グロブリンCH2領域(例えば、改変型ヒトIgG1 CH2ドメイン)である。例えば、免疫グロブリンCH2領域は、253位、310位、318位、320位、322位、または331位に、318位および320位、318位および322位に、318位、320位および322位に、または、253位、310位、318位、320位、322位、および331位における2個、3個、4個、5個もしくは6個のアミノ酸の他のあらゆる組み合わせに、置換を含み得る。そのような実施形態では、上記の変異は、前記改変型CH2ドメインを含むポリペプチドのCDC活性を低減または排除する。

0165

他の特定の実施形態では、297位のアミノ酸置換に加えて、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質の改変型CH2領域(例えば、改変型ヒトIgG1 CH2ドメイン)は、234〜238位に1または複数(例えば、2個、3個、4個、または5個)の追加の置換をさらに含み得る。例えば、免疫グロブリンCH2領域は、234位および297位に、234位、235位、および297位に、234位、236位および297位に、234〜236位および297位に、234位、235位、237位および297位に、234位、236位、238位および297位に、234位、235位、237位、238位および297位に、236〜238位および297位に、または、297位に加えて234〜238位における2個、3個、4個、もしくは5個のアミノ酸の他のあらゆる組み合わせに、置換を含み得る。さらに、またはあるいは、改変型CH2領域は、236位または237位など、234〜238位に1または複数(例えば、2個、3個、4個、または5個)のアミノ酸欠失を含み得る。この追加の変異は、前記改変型CH2ドメインを含むポリペプチドのADCC活性またはFc受容体結合能を低減または排除する。特定の実施形態では、234〜238位の1または複数におけるアミノ酸残基は、1または複数のアラニン残基で置換されている。別の実施形態では、234〜238位のアミノ酸残基のうち1つのみが欠失しており、234〜238位の1または複数の残りのアミノ酸は別のアミノ酸(例えば、アラニンまたはセリン)で置換されている場合がある。

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