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図面 (15)

課題・解決手段

開示されるのは、CD33発現がん標的治療のための組成物および方法である。具体的には、CD33発現がんを標的とし殺傷するために養子細胞移入を用いて使用することのできる、キメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドが開示される。また開示されるのは、これらのCARを発現するように工学的に作製された免疫エフェクター細胞、例えばT細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞などである。そのため、また開示されるのは、CD33発現がんを有する対象において抗腫瘍免疫を付与する方法であって、この方法は、本開示のCARを発現するように工学的に作製された本開示の免疫エフェクター細胞の養子移入を含む。T細胞にCD33発現悪性細胞破壊させることのできる多価抗体も開示される。

概要

背景

外科手術放射線療法、および化学療法は、白血病固形腫瘍、および転移を含むがん治療のための標準的に受け入れられているアプローチである。免疫療法(時として生物学的療法生物療法、または生物学的応答改変療法とよばれる)は、身体の免疫系を用いて、直接的または間接的のどちらかでがんを縮小または根絶するものであり、従来のがん療法の補助法として長年にわたって研究されている。ヒトの免疫系は、がん療法のための未利用の資源であり、免疫系の構成成分を適正に活用すれば、有効な治療を開発できるものと考えられる。

概要

開示されるのは、CD33発現がんの標的治療のための組成物および方法である。具体的には、CD33発現がんを標的とし殺傷するために養子細胞移入を用いて使用することのできる、キメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドが開示される。また開示されるのは、これらのCARを発現するように工学的に作製された免疫エフェクター細胞、例えばT細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞などである。そのため、また開示されるのは、CD33発現がんを有する対象において抗腫瘍免疫を付与する方法であって、この方法は、本開示のCARを発現するように工学的に作製された本開示の免疫エフェクター細胞の養子移入を含む。T細胞にCD33発現悪性細胞破壊させることのできる多価抗体も開示される。

目的

かなり効率的で比較的簡素な方法は、互いに折り重なり結合することのできないような短さのリンカー配列を、VHドメインとVLドメインとの間に作製することである

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

請求項2

前記CD33抗原結合ドメインが、CD33を特異的に結合する抗体の単鎖可変断片(scFv)である、請求項1に記載のポリペプチド。

請求項3

前記抗CD33scFvのVHドメインが、配列番号22、配列番号23、または配列番号24のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のポリペプチド。

請求項4

前記抗CD33scFvのVLドメインが、配列番号25、配列番号26、配列番号27、または配列番号28のアミノ酸配列を含む、請求項2または3に記載のポリペプチド。

請求項5

前記共刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、4−1BB、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3、CD83に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される共刺激分子細胞質ドメインを含む、請求項1から4のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項6

前記CARポリペプチドが、式:SP−CD33−HG−TM−CSR−ISD;またはSP−CD33−HG−TM−ISD−CSRにより定義され、式中、「SP」は、シグナルペプチドを表し、「CD33」は、CD33結合領域を表し、「HG」は、任意選択ヒンジドメインを表し、「TM」は、膜貫通ドメインを表し、「CSR」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、「ISD」は細胞内シグナル伝達ドメインを表し、「−」は、二価リンカーを表す、請求項1から5のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項7

前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ゼータ(CD3ζ)シグナル伝達ドメインを含む、請求項1から6のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項8

請求項1から7のいずれか1項に記載の組換えポリペプチドをコードする単離された核酸配列

請求項9

請求項8に記載の単離された核酸配列を含むベクター

請求項10

請求項9に記載のベクターを含む細胞。

請求項11

前記細胞が、αβT細胞、γδT細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、B細胞、自然リンパ球系細胞(ILC)、サイトカイン誘導性キラーCIK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、リンフォカイン活性化キラー(LAK)細胞、調節性T細胞、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項10に記載の細胞。

請求項12

前記CARの前記抗原結合ドメインがCD33に結合した際に、前記細胞が抗腫瘍免疫を発揮する、請求項11に記載の細胞。

請求項13

前記細胞は、CD33抗原結合ドメインを含む第2のCARポリペプチドをさらに含み、前記CARの前記抗原結合ドメインがCD33に結合し、かつ前記第2のCARの前記抗原結合ドメインがCD123に結合した際に、前記細胞が抗腫瘍免疫を発揮する、請求項11に記載の細胞。

請求項14

CD33発現がんを有する対象において抗がん免疫を付与する方法であって、請求項1から7のいずれか1項に記載のCARポリペプチドを発現し、それによって哺乳動物において抗腫瘍免疫を付与するように遺伝子改変された有効な量の免疫エフェクター細胞を、前記対象に投与することを含む方法。

請求項15

前記免疫エフェクター細胞が、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、および調節性T細胞からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。

請求項16

チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項14または15に記載の方法。

請求項17

前記チェックポイント阻害剤が、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、抗CTLA−4抗体、またはそれらの組合せを含む、請求項16に記載の方法。

請求項18

前記がんが、骨髄異形成症候群急性骨髄性白血病、または混合表現型白血病を含む、請求項14から17のいずれか1項に記載の方法。

請求項19

以下の式:VLI−VHI−VLT−VHT、VLT−VHT−VLI−VHI、VHT−VLT−VHI−VLI、VHI−VLI−VHT−VLT、VLI−VHI−VHT−VLT、VLT−VHT−VHI−VLI、を含み、式中、「VLI」は、免疫細胞抗原に特異的な軽鎖可変ドメインであり、「VHT」は、CD33に特異的な重鎖可変ドメインであり、「VLT」は、CD33に特異的な軽鎖可変ドメインであり、「VHI」は、免疫細胞抗原に特異的な重鎖可変ドメインであり、「−」は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合からなる、融合ポリペプチド

請求項20

対象におけるがんを治療するための方法であって、医薬的に許容可能な担体中の治療的に有効な量の請求項19に記載の融合ポリペプチドを前記対象に投与することを含む、方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
この出願は、ここに本明細書に参照によりその全体を組み込まれる2017年7月20日出願の米国仮特許出願第62/534,977号、および2017年11月29日出願の第62/592,107号の利益を請求するものである。

背景技術

0002

外科手術放射線療法、および化学療法は、白血病固形腫瘍、および転移を含むがん治療のための標準的に受け入れられているアプローチである。免疫療法(時として生物学的療法生物療法、または生物学的応答改変療法とよばれる)は、身体の免疫系を用いて、直接的または間接的のどちらかでがんを縮小または根絶するものであり、従来のがん療法の補助法として長年にわたって研究されている。ヒトの免疫系は、がん療法のための未利用の資源であり、免疫系の構成成分を適正に活用すれば、有効な治療を開発できるものと考えられる。

発明が解決しようとする課題

0003

CD33発現がんの標的治療のための組成物および方法が開示される。例えば、CD33発現がんを選択的に結合することのできる抗CD33抗体が、本明細書に開示される。そのため、これらの抗体に由来する抗原結合領域を含む組換え抗体および他のタンパク質も開示される。具体的には、ハイブリドーマ27A3、33G3、36C2、6A11、35D5、および38G5に由来する抗CD33モノクローナル抗体が、本明細書に提供される。また開示されるのは、1つまたは複数のこれらの抗体の少なくとも抗原結合領域を含む、組換え抗体、ヒト化抗体、および/またはキメラ抗体である。

課題を解決するための手段

0004

また開示されるのは、T細胞にCD33発現悪性細胞破壊させることのできる多特異性多価抗体である。例えば、この抗体は、二重特異性のT細胞エンゲージャーとすることができる。この抗体は、融合ポリペプチドから工学的に作製することができ、それは例えば、以下の式:
VLI−VHI−VLT−VHT
VLT−VHT−VLI−VHI、
VHT−VLT−VHI−VLI、
VHI−VLI−VHT−VLT、
VLI−VHI−VHT−VLT、
VLT−VHT−VHI−VLI、
を有し、式中、
「VLI」は、免疫細胞抗原に特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「VHT」は、CD33に特異的な重鎖可変ドメインであり、
「VLT」は、CD33に特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「VHI」は、免疫細胞抗原に特異的な重鎖可変ドメインであり、
「−」は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合からなる、
融合ポリペプチドなどである。

0005

免疫細胞抗原は、ヒトのNK細胞、T細胞、単球マクロファージ、または顆粒球上に発現される細胞表面分子であることがある。例えば、細胞表面分子は、抗原CD2、CD3、CD16、CD64、CD89;NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLR−F1)、NKG2C、またはNKG2Dであることがある。

0006

また開示されるのは、本開示の融合ポリペプチドをコードする単離された核酸、ならびに発現制御配列に動作可能に連結されたこの単離された核酸を含有する核酸ベクターである。また開示されるのは、これらのベクターを用いてトランスフェクトされた細胞、および本開示の融合ポリペプチドを産生するためのこれらの細胞の使用である。

0007

また開示されるのは、本明細書に開示される分子医薬的に許容可能な担体に含む医薬組成物である。また開示されるのは、治療的に有効な量の本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象でがんを治療するための方法である。場合によっては、がんは、任意のCD33発現悪性腫瘍であることがある。場合によっては、がんは、骨髄異形成症候群急性骨髄性白血病、または混合表現型白血病を含む。

0008

また開示されるのは、CD33発現がんを標的とし殺傷するために養子細胞移入により使用することのできるキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドである。本開示のCARポリペプチドは、CD33発現がん細胞を結合することのできる抗CD33結合剤外部ドメインに含有する。また開示されるのは、本開示のCARポリペプチドを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞である。

0009

抗CD33結合剤は、実施形態によっては、CD33を特異的に結合する抗体断片である。例えば、抗原結合ドメインは、CD33を特異的に結合する抗体のFabまたは単鎖可変断片(scFv)であることがある。抗CD33結合剤は、実施形態によっては、CD33を特異的に結合するアプタマーである。例えば、抗CD33結合剤は、そのCD33を結合する能力に基づき無作為配列プールから選択されるペプチドアプタマーであることがある。抗CD33結合剤はまた、天然のCD33のリガンド、またはCD33に結合可能なそのバリアントおよび/もしくは断片であることがある。

0010

実施形態によっては、本開示の抗体またはCARの抗CD33領域は、ハイブリドーマ27A3、33G3、36C2、6A11、35D5、38G5、またはそれらの組合せに由来する。実施形態によっては、抗CD33領域(例えばscFv)は、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を有する可変重(VH)ドメインと、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を有する可変軽(VL)ドメインとを含むことがある。

0011

例えば、実施形態によっては、VHドメインのCDR1配列は、アミノ酸配列GFTFSNYG(配列番号1)、GYTFTSYW(配列番号2)、またはGFSLSRYS(配列番号3)を含み、その場合、VHドメインのCDR2配列は、アミノ酸配列ISSGGDT(配列番号4)、IHPSDSET(配列番号5)、またはIWGGGYT(配列番号6)を含み、VHドメインのCDR3配列は、アミノ酸配列ARDYGGTWDYFDY(配列番号7)、AREEGQLGHGGAMDY(配列番号8)、またはARYIDSSGYDY(配列番号9)を含み、VLのCDR1配列は、アミノ酸配列QDISKY(配列番号10)、QTVNDD(配列番号11)、SSVSY(配列番号12)、またはENIYSY(配列番号13)を含み、VLドメインのCDR2配列は、アミノ酸配列YTSx(配列番号14)、YVSx(配列番号15)、DTSx(配列番号16)、またはNAKx(配列番号17)を含み、VLドメインのCDR3配列は、アミノ酸配列QQGDTFPWT(配列番号18)、QQDYSSPYT(配列番号19)、QQWSSNPLT(配列番号20)、もしくはQHHYGTPYT(配列番号21)、またはそれらの任意の組合せを含む。

0012

それゆえ、実施形態によっては、抗CD33 scFv VHドメインは、アミノ酸配列EVKLVESGGGLVKPGASLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTSDKRLEWVASISSGGGDTYYPDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLNSEDTALYYCARDYGGTWDYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号22)、QVQLQQPGAELVRPGSVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCAREEGQLGHGGAMDYWGQGTSVTVSS(配列番号23)、またはQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMIWGGGYTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARYIDSSGYDYWGQGTTLTVSS(配列番号24)を含む。

0013

実施形態によっては、抗CD33 scFv VLドメインは、アミノ酸配列DIQMTQTTSSSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGDTFPWTFGGGTKLEIK(配列番号25)、SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQTVNDDVAWYQQKPGQSPKLLIYYVSNRHTGVPDRTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIK(配列番号26)、QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(配列番号27)、またはDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPYTFGGGTKLEIK(配列番号28)を含む。

0014

重鎖および軽鎖は、好ましくはリンカーによって隔てられている。scFv抗体に適したリンカーは、当技術分野に公知である。実施形態によっては、リンカーは、アミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号39)を含む。

0015

実施形態によっては、抗CD33 scFvは、アミノ酸配列:EVKLVESGGGLVKPGASLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTSDKRLEWVASISSGGGDTYYPDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLNSEDTALYYCARDYGGTWDYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGDTFPWTFGGGTKLEIK(配列番号29、6A11HC1_LC)を含む。

0016

実施形態によっては、抗CD33 scFvは、アミノ酸配列:QVQLQQPGAELVRPGVSVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCAREEGQLGHGGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGDTFPWTFGGGTKLEIK(配列番号30、6A11HC2_LC)を含む。

0017

実施形態によっては、抗CD33 scFvは、アミノ酸配列:QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMIWGGGYTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARYIDSSGYDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQTVNDDVAWYQQKPGQSPKLLIYYVSNRHTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIK(配列番号31、27A3HC_LC1)を含む。

0018

実施形態によっては、抗CD33 scFvは、アミノ酸配列:QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMIWGGGYTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARYIDSSGYDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(配列番号32、27A3HC_LC2)を含む。

0019

実施形態によっては、抗CD33 scFvは、アミノ酸配列:QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMIWGGGYTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARYIDSSGYDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPYTFGGGTKLEIK(配列番号33、27A3HC_LC3)を含む。

0020

実施形態によっては、抗CD33 scFvは、核酸配列
ATGGCCCTCCCGGTAACGGCTCTGCTGCTTCCACTCGCACTGCTCTTGCATGCTGCCAGACCAGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGCGTCTCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTTCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTGGTGACACCTACTATCCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGTAGTCTGAACTCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGACTATGGTGGTACTTGGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAAGTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTGATACGTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG(配列番号34、6A11HC1_LC)によってコードされる。

0021

実施形態によっては、抗CD33 scFvは、核酸配列:
ATGGCCCTCCCGGTAACGGCTCTGCTGCTTCCACTCGCACTGCTCTTGCATGCTGCCAGACCACAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGTTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGCATGATTCATCCTTCCGATAGTGAAACTAGGTTAAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCATATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGAAGAGGGACAGCTCGGGCACGGCGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAAGTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTGATACGTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG (配列番号35、6A11HC2_LC)によってコードされる。

0022

実施形態によっては、抗CD33 scFvは、核酸配列:
ATGGCCCTCCCGGTAACGGCTCTGCTGCTTCCACTCGCACTGCTCTTGCATGCTGCCAGACCACAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACGGTCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGTGGTGGATACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGATATATAGACAGCTCGGGCTACGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTAGTATTGTGATGACCCAGACTCCCAAATTCCTGCTTGTATCAGCAGGAGACAGGGTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGACTGTGAATGATGATGTAGCTTGGTATCAACAGAAGCCAGGACAGTCTCCTAAATTGCTGATATATTATGTATCCAATCGCCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATATGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCACTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG (配列番号36、27A3HC_LC1)によってコードされる。

0023

実施形態によっては、抗CD33 scFvは、核酸配列:
ATGGCCCTCCCGGTAACGGCTCTGCTGCTTCCACTCGCACTGCTCTTGCATGCTGCCAGACCACAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACGGTCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGTGGTGGATACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGATATATAGACAGCTCGGGCTACGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG (配列番号37、27A3HC_LC2)によってコードされる。

0024

実施形態によっては、抗CD33 scFvは、核酸配列:
ATGGCCCTCCCGGTAACGGCTCTGCTGCTTCCACTCGCACTGCTCTTGCATGCTGCCAGACCACAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACGGTCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGTGGTGGATACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGATATATAGACAGCTCGGGCTACGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGTCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG (配列番号38、27A3HC_LC3)によってコードされる。

0025

他のCARと同様に、本開示のポリペプチドも、膜貫通ドメインと、免疫エフェクター細胞を活性化することの可能な内部ドメインとを含有することがある。例えば、この内部ドメインは、シグナル伝達ドメインと1つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域とを含有することがある。

0026

実施形態によっては、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ(CD3ζ)シグナル伝達ドメインである。実施形態によっては、共刺激シグナル伝達領域は、CD28、4−1BB、またはそれらの組合せの細胞質ドメインを含む。場合によっては、共刺激シグナル伝達領域は、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達分子および/または共刺激分子の1個、2個、3個、または4個の細胞質ドメインを含有する。実施形態によっては、共刺激シグナル伝達領域は、シグナル伝達亢進する1つまたは複数の変異を、CD28および/または4−1BBの細胞質ドメインに含有する。

0027

実施形態によっては、CARポリペプチドは、不完全な内部ドメインを含有する。例えば、CARポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインのみまたは共刺激ドメインのみを含有しうるが、両方を含有し得ない。これらの実施形態では、それと、欠けたドメインを含有する第2のCARポリペプチド(または内在性T細胞受容体)との両方が、それらのそれぞれの抗原を結合しない限り、免疫エフェクター細胞は活性化されない。そのため、実施形態によっては、CARポリペプチドは、CD3ゼータ(CD3ζ)シグナル伝達ドメインを含有するが、共刺激シグナル伝達領域(CSR)を含有しない。他の実施形態では、CARポリペプチドは、CD28、4−1BB、またはそれらの組合せの細胞質ドメインを含有するが、CD3ゼータ(CD3ζ)シグナル伝達ドメイン(SD)を含有しない。

0028

また開示されるのは、本開示のCARポリペプチドをコードする単離された核酸配列、これらの単離された核酸を含むベクター、およびこれらのベクターを含有する細胞である。例えば、この細胞は、アルファベータT細胞、ガンマデルタT細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、B細胞、自然リンパ球系細胞(ILC)、サイトカイン誘導性キラーCIK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、リンフォカイン活性化キラー(LAK)細胞、および調節性T細胞からなる群から選択される免疫エフェクター細胞であることがある。実施形態によっては、CARの抗原結合ドメインがCD33に結合する際に、この細胞は抗腫瘍免疫を発揮する。

0029

実施形態によっては、この細胞は、第2の抗原結合ドメインを含む第2のCARポリペプチドをさらに含み、その場合、第1のCARの抗原結合ドメインがCD33に結合し、かつ第2のCARの抗原結合ドメインがその抗原に結合した際に、本細胞は、抗腫瘍免疫を発揮する。これらの実施形態では、第1のCARポリペプチドおよび第2のCARポリペプチドのそれぞれは、不完全な内部ドメインを有することがある。実施形態によっては、第2のCARポリペプチドは、CD123リガンド、TIM3リガンド、CLEC12Aリガンド、CD99リガンド、NKG2Dリガンド、またはそれらの任意の組合せに結合する。

0030

実施形態によっては、細胞は、移入された細胞集団を除去するための分子自殺スイッチシステムをさらに含む。例えば、CARポリペプチドをコードする核酸を、アクセサリー遺伝子も含む発現カセットの一部分とすることができる。例えば、実施形態によっては、アクセサリー遺伝子は、切頭型EGFR遺伝子(EGFRt)である。EGFRtは、非免疫原性の選択ツール(例えば、EGFRt含有構築物レンチウイルスにより形質導入されているT細胞を濃縮するための、ビオチン化セツキシマブ抗ビオチンマイクロビーズと組み合わせて用いる免疫磁性選択)、追跡用マーカー(例えば、T細胞の生着を追跡するためのフローサイトメトリー解析)、または自殺遺伝子[例えば、セツキシマブアービタクス登録商標)により媒介される抗体依存性細胞性細胞傷害性ADCC経路を介する]として使用されることがある。本明細書に記載される実施形態に従って使用されうる切頭型EGFR(EGFRt)遺伝子の一例は、国際特許出願PCT/US2010/055329に記載されており、その主題は、本明細書に十分に明記されているかのようにここで参照により組み込まれている。他の実施形態では、アクセサリー遺伝子は、切頭型CD19遺伝子(CD19t)である。実施形態によっては、アクセサリー遺伝子は、誘導性カスパーゼ−9遺伝子である。

0031

また開示されるのは、CD33発現がんの対象において抗腫瘍免疫を付与する方法であって、この方法は、開示されるCD33特異的なCARにより遺伝子改変された有効な量の免疫エフェクター細胞を、対象に投与することを含む。

0032

本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および下記の記載に明記する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載および図面から、ならびに特許請求の範囲から、明らかとなる。

図面の簡単な説明

0033

図1は、EL4−CD33+細胞およびEL4−CD123+細胞をハイブリドーマ抗体と共にインキュベートした後、ラット抗マウスIgG蛍光抗体によりインキュベートすることによって達成された、抗CD33抗体についての一次スクリーニングの結果を示す。次いで、これをフローサイトメトリーによって検出した。
図2は、機能抗体の二次スクリーニング方法を説明する。
図3は、EL4−CD123標的またはEL4−CD33標的と、ハイブリドーマ抗体と、ヒトの41BBおよびCD3ゼータにコンジュゲートされたCD16またはCD32のどちらかのFc受容体を含むように改変されたJurkat細胞との培養物について、GFPのフローサイトメトリーによって測定されたJurkat T細胞の活性化を示す。
図4Aから図4Eは、6A11HC1_LC(図4A)、6A11HC2_LC(図4B)、27A3HC_LC1(図4C)、27A3HC_LC2(図4D)、および27A3HC_LC3(図4E)のCD33 CARの線図である。
図5は、T細胞内へのCD33遺伝子移入を示す棒グラフである。遺伝子移入を、生きたT細胞上のCD3+およびmcherry+の%として評価した。ビーズ脱離後、T細胞をCD3、CD8、およびCD4(モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターを用いることによって解析した。
図6は、CD33 CAR T細胞の細胞傷害性アッセイの結果を示すグラフである。活性化されたCD33 CAR T細胞またはモック形質導入T細胞を、標的CHO CD33細胞と共培養し、細胞傷害性をリアルタイム細胞分析ステムで測定した。2連のウェルについて経時的な正規化された細胞の指標の平均として、データを提示する。CD33CHO細胞を16時間、xCELLigence Eプレート接着させた。CD33 CAR T細胞または活性化されたモック形質導入T細胞を、Eプレートのウェルに、標的細胞と共にE:T比10:1で6日間添加した。所与の時点での細胞の指標をT細胞添加の1日後の正規化時点での細胞の指標により除算したものとして、正規化された細胞の指標を計算した。
図7は、CD33 CAR T細胞の増殖を示すグラフである。活性化されたCD33 CAR T細胞または非形質導入T細胞を、標的CHO CD33細胞と共培養した。標示された日にCAR T細胞を計数した。
図8Aから図8Cは、CD33 CAR T細胞のサイトカイン産生を示す棒グラフである。CD33 CAR T細胞またはモック形質導入T細胞を、標的CHO CD33細胞と24時間共培養した。上清採集し、Luminexを介してサイトカインIFN−γ(図8A)、TNF−α(図8B)、およびIL−6(図8C)を分析した。

0034

本明細書に開示されるのは、CD33発現がん上の腫瘍関連抗原(TAA)を特異的に認識することのできる組換え抗体、例えば二重特異性抗体およびキメラ抗原受容体(CAR)などである。また開示されるのは、これらのCARを発現するように工学的に作製された免疫エフェクター細胞、例えばT細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞などである。そのため、また開示されるのは、本開示の抗体および免疫エフェクター細胞を用いて、CD33発現がんの対象において抗腫瘍免疫を付与するための方法である。

0035

抗体
本開示の組成物および方法に使用できる抗体としては、任意のクラスのイムノグロブリン全体(すなわち無傷の抗体)、その断片、および少なくとも抗体の抗原結合可変ドメインを含有する合成タンパク質が挙げられる。可変ドメインは、抗体間で配列に差異があり、その具体的な抗原に対する具体的な各抗体の結合性および特異性に用いられる。しかし、可変性は通常、抗体の可変ドメインを介して均一に分配される。それは典型的には、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの両方にある相補性決定領域(CDR)または超可変領域とよばれる3つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのうち高度に保存されている部分は、フレームワーク(FR)とよばれる。生得の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ4つのFR領域を含み、それらの領域は、大部分がベータシート立体配置を採って3つのCDRに接続され、CDRは、上記ベータシート構造を接続し場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖のCDRは、FR領域に近接して共に把持され、他の鎖由来のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。

0036

免疫時に内在性イムノグロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することの可能な、遺伝子導入動物(例えばマウス)を採用することができる。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異マウスにおいて抗体重鎖接合領域[J(H)]遺伝子のホモ接合性欠失が生じる結果、内在性の抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子アレイを移入すると、結果として抗原曝露時にヒト抗体が産生するものとなる[例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993);Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993);Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)を参照]。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいても産生することができる[Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]。CoteらおよびBoernerらの手法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985);Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]。

0037

任意選択的に、抗体が他の種で生成され、ヒトにおける投与のために「ヒト化」される。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形態は、キメラのイムノグロブリン、イムノグロブリン鎖、または非ヒトイムノグロブリンに由来する最小限の配列を含有するその断片[例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、もしくは抗体の他の抗原結合性サブ配列など]である。ヒト化抗体としては、ヒトイムノグロブリンレシピエント抗体)であって、レシピエント抗体の相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性、または能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基に置き換えられたものが挙げられる。場合によっては、ヒトイムノグロブリンのFvフレームワーク残基は、対応の非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または持ち込みのCDRもしくはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含んでいてよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むものとなり、このドメインでは、CDR領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒトイムノグロブリンのものに対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てが、ヒトイムノグロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択的に、イムノグロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分、典型的にはヒトイムノグロブリンの少なくとも一部分[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988);and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]も含むものとなる。

0038

非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野に周知である。一般に、ヒト化抗体は、その中に、非ヒト供給源から1つまたは複数のアミノ酸残基を導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「持ち込み」残基と称され、それは典型的には「持ち込み」可変ドメインから得られる。抗体ヒト化手法は、一般に、抗体分子の1つまたは複数のポリペプチド鎖をコードするDNA配列を操作するための組換えDNA技術を含む。ヒト化は、本質的には、Winterとその共同研究者の方法[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]に従い、齧歯類の1つまたは複数のCDR配列をヒト抗体の対応の配列に代えて置換することによって実施することができる。したがって、非ヒト抗体(またはその断片)のヒト化形態は、キメラ抗体または断片(米国特許第4,816,567号)であり、その場合、実質的に無傷ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応の配列に置換されている。実際には、ヒト化抗体とは、典型的には、いくつかのCDR残基と可能性としていくつかのFR残基とが齧歯類抗体の類似部位由来の残基に置換された、ヒト抗体である。

0039

また開示されるのは、生物活性を有する抗体の断片である。その断片の活性が、非改変の抗体または抗体断片に比べて有意に変更されるかまたは損なわれないならば、この断片は、他の配列に付加されているかいないかに関わらず、具体的な領域または特異的なアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された改変を含む。

0040

手法は、本願開示抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に適応させることもできる。単鎖抗体の産生のための方法は、当業者に周知である。単鎖抗体は、短いペプチドリンカーを用いて重鎖および軽鎖の可変ドメインを合わせて融合し、それにより単一分子上の抗原結合部位を再構成することによって、作製することができる。一方の可変ドメインのC末端が15から25アミノ酸ペプチドまたはリンカーを介して他方の可変ドメインのN末端に繋がっている単鎖抗体の可変断片(scFv)が、抗原結合性またはその結合の特異性を有意に破綻させることなく開発されている。このリンカーは、重鎖および軽鎖が共にそれらの適正な立体構造配向で結合することが可能になるように選ばれる。

0041

二価の単鎖可変断片(di−scFv)は、2つのscFvを連結することによって、工学的に作製することができる。これは、2つのVH領域と2つのVL領域とを有した単一のペプチド鎖を産生し、タンデムのscFvを生じることによって行うことができる。scFvは、リンカーペプチドを用いて設計することもでき、このリンカーペプチドは、2つの可変領域を畳み合わせるには短く(約5アミノ酸)、scFvを二量体化するよう作用する。このタイプは、ダイアボディとして公知である。ダイアボディは、対応のscFvよりも最大40倍低い解離定数を有することが示されており、このことは、標的に対しはるかに高い親和性を有することを意味する。さらに短いリンカー(1または2アミノ酸)は、三量体トリアディまたはトリボディ)の形成をもたらす。テトラボディも生産されている。それらは、標的に対しダイアボディよりもさらに高い親和性を発揮する。

0042

CD3およびCD33に選択的に結合するように設計された二重特異性抗体は、非特異的なT細胞の活性化&サイトカインストームを誘発するものとなりかねない。CD3およびCD33に選択的に結合するように設計された二重特異性のダイアボディは、腎クリアランス閾値よりも小さな分子量(55〜60kD)を有するものとなり、結果として速やかに排除されるものとなりかねない。そのため、ダイアボディを、継続的な輸注によって投与しなければならない。本開示の四価の二重特異性抗体は、顕著なPKの延長を伴って、濾過の閾値よりも大きな分子量(例えば105〜110kD)を有することがある。

0043

提供されるのは、T細胞にCD33発現悪性細胞を破壊させることのできる工学的に作製された多価抗体を形成することの可能な融合ポリペプチドである。この工学的に作製された抗体は、例えば、少なくとも1つのscFv、少なくとも1つのFab断片、少なくとも1つのFv断片などを含むことがある。それは、二価、三価、四価などであることがある。この多価抗体は、任意の形態、例えばダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなどであることがある。

0044

二価および二重特異性の抗体は、抗体の可変ドメインのみを用いて構築することができる。かなり効率的で比較的簡素な方法は、互いに折り重なり結合することのできないような短さのリンカー配列を、VHドメインとVLドメインとの間に作製することである。リンカー長を3〜12残基に低減することによって、scFv分子単量体型立体配置が防止され、60kDaの非共有結合のscFv二量体「ダイアボディ」の形成を伴う分子間のVH−VL対が有利となる。ダイアボディのフォーマットは、組換え二重特異性抗体の生成にも用いることができ、それらの抗体は、2つの単鎖融合産物非共有結合的会合によって得ることができ、この融合産物は、一方の抗体由来のVHドメインが短いリンカーによって別の抗体由来のVLドメインに接続されてなる。リンカー長をさらに3残基未満に低減することで、結果として三量体(「トリアボディ」、約90kDa)または四量体(「テトラボディ」、約120kDa)を形成させることができる。工学的に作製された抗体、具体的には単一ドメイン断片を概観するために、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23:1126-1136を参照されたい。そのような工学的に作製された抗体の全ては、本明細書に提供される融合ポリペプチドに用いることができる。四価のTandab(登録商標)は、実質的には、Tandab(登録商標)分子を作製する方法の教示について参照により組み込まれるWO1999057150A3または米国特許出願公開公報第20060233787号に記載されているように、調製することができる。

0045

工学的に作製された抗体の抗原認識部位または可変領域全体は、任意の目的の抗原(例えばCD33)を指向する1つまたは複数の親抗体に由来する場合がある。親抗体としては、天然に生じた抗体もしくは抗体断片、天然に生じた抗体から適応された抗体もしくは抗体断片、目的の抗原に特異的であることが知られている抗体もしくは抗体断片の配列を用いてde novoで構築された抗体を挙げることができる。親抗体に由来する場合のある配列は、重鎖および/または軽鎖の可変領域および/またはCDR、フレームワーク領域、もしくはそれらの他の部分を含む。

0046

多価の多特異性抗体は、2つ以上の可変領域を含む重鎖および/または1つまたは複数の可変領域を含む軽鎖を含有する場合があり、可変領域のうち少なくとも2つは、同じ抗原上の異なるエピトープを認識する。

0047

融合ポリペプチドに含むための工学的に作製された候補抗体、または融合ポリペプチド自体は、種々の公知のアッセイを用いて、活性についてスクリーニングされることがある。例えば、結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、周知であり、当技術分野で定型的に実践されている。そのようなアッセイに関する包括的な議論については、Harlow et al. (Eds.), ANTIBODIES: A LABORATORYMANUAL; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, Chapter 6を参照されたい。

0048

医薬組成物
また開示されるのは、開示された分子を医薬的に許容可能な担体に含む医薬組成物である。医薬担体は、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、薬剤をヒトに投与するための標準的な担体となるが、そのようなものとしては、滅菌水生理食塩水、および生理的pHの緩衝溶液などの溶液が挙げられる。例えば、適した担体およびそれらの配合は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21 ed.) ed. PP. Gerbino, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. 2005に記載されている。典型的には、適切な量の医薬的に許容可能な塩を配合に使用して、その配合を等張にする。医薬的に許容可能な担体の例としては、以下に限定されないが、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のpHは、好ましくは約5から約8までであり、さらに好ましくは約7から約7.5までである。溶液は、RNAse不含とするべきである。さらに、担体は、持続放出製剤、例えば抗体を含有する固体疎水性ポリマー半透性マトリックスなどを含み、このマトリックスは、造形品、例えばフィルムリポソーム、または微粒子の形態である。例えば投与されている組成物の投与経路および濃度に応じて、ある特定の担体がさらに好ましい場合があることが、当業者には明らかになるものとなる。

0049

医薬組成物は、選択された分子に加えて、担体、増粘剤希釈剤緩衝剤保存剤界面活性剤などを含むことがある。医薬組成物は、1つまたは複数の活性成分、例えば抗微生物剤抗炎症剤麻酔剤なども含むことがある。

0050

非経口投与のための製剤は、滅菌された水系または非水系の溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水系の溶媒の例は、プロピレングリコールポリエチレングリコール植物油、例えばオリーブ油など、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどである。水系の担体としては、水、アルコール水溶液、エマルジョン、または懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝媒質が含まれる。非経口的な媒体としては、塩化ナトリウム溶液リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム乳酸リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内媒体としては、体液および栄養補充物、電解質補充物(リンゲルデキストロースに基づくものなど)などが挙げられる。保存剤および他の添加剤も存在することがあり、そのようなものとしては、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤キレート剤、および不活性ガスなどがある。

0051

組成物のいくつかは、可能性として、医薬的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩として投与されることがあり、それらの塩は、無機酸、例えば塩酸臭化水素酸過塩素酸硝酸チオシアン酸硫酸、およびリン酸など、ならびに有機酸、例えばギ酸酢酸プロピオン酸グリコール酸、乳酸、ピルビン酸シュウ酸マロン酸コハク酸マレイン酸、およびフマル酸との反応によって、または無機塩基、例えば水酸化ナトリウム水酸化アンモニウム水酸化カリウム、ならびに有機塩基、例えばモノアルキルジアルキルトリアルキル、およびアリールアミン、ならびに置換エタノールアミンとの反応によって、形成される。

0052

治療の方法
また開示されるのは、治療的に有効な量の本開示の医薬組成物を対象に投与することによって、対象でCD33発現がんを治療するための方法である。本方法は、化学療法を対象に投与することをさらに含むことがあり、そのような化学療法は、例えばフルダラビンシタラビンシクロホスファミドイダルビシンダウノルビシン、または標的阻害剤、例えばイムブルビカ、ミドスタウリン、イデラリシブなど、または免疫剤、例えばPD1阻害剤もしくはPDL1阻害剤などである。

0053

医薬組成物を含む本開示の組成物は、局所治療が望まれるかまたは全身治療が望まれるかに応じて、および治療される範囲に応じて、複数の方法で投与されてよい。例えば、本開示の組成物は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内に、または経皮的に投与することができる。本組成物は、経口的に、非経口的に(例えば静脈内に)、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外で、眼科的に、経膣的に、直腸に、鼻腔内に、局所的になど、局所的鼻腔内投与または吸入による投与を含めて、投与されてよい。

0054

本組成物の非経口投与は、使用する場合には、一般に注射であるという特徴がある。注射剤は、従来の形態で、すなわち液体溶液もしくは懸濁物のどちらかとして、注射前に液中懸濁物の溶液とするのに適した固形形態、またはエマルジョンとして、調製することができる。非経口投与に適した修正アプローチの1つは、一定の投薬量が維持されるような遅延放出系または持続放出系の使用を含む。

0055

本明細書に開示された組成物は、CD33発現がんのリスクにある患者または対象に予防的に投与されてよい。そのため、本方法は本明細書に開示された組成物の投与の前に、CD33発現がんのリスクにある対象を特定することをさらに含むことがある。

0056

必要な組成物の正確な量は、対象によって、対象の種、年齢、体重、および全身状態、治療されているアレルギー性障害重症度、使用された具体的な核酸またはベクター、その投与様式などに応じて、変わるものとなる。そのため、組成物毎に正確な量を特定することはできない。しかし、適切な量は、本明細書に教示として示された定例の実験作業のみを用いて、当業者が決定することができる。例えば、組成物を投与するための有効な投薬量およびスケジュールは、経験的に決定されることがあり、そのような決定を行うことは、当技術分野の技能の範囲内にある。組成物の投与に用いる投薬量の幅は、症状障害に影響を及ぼす所望の効果を生じるのに十分に大きなものである。投薬量は、不都合副作用、例えば不要な交差反応アナフィラキシー反応などを引き起こすほどに多いものとするべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別、および疾患の程度、投与経路、または他の薬剤がレジメンに含まれているか否かによって変わるものとなり、当業者が決定することができる。投薬量は、いかなる禁忌の場合にも個々の医師が調整することができる。投薬量は変わることがあり、1つまたは複数の用量投与で1日または数日にわたって毎日投与されることがある。所与のクラスの医薬製品に関する適切な投薬量について、文献にガイダンス見出すことができる。単独で使用される本開示の組成物の典型的な一日投薬量は、上述の要因に応じて、1日当たり約1μg/体重kgから最大100mg/体重kg以上に及ぶ可能性がある。

0057

実施形態によっては、分子は、体重kg当たり約0.1ngから約100g、体重kg当たり約10ngから約50g、体重kg当たり約100ngから約1g、体重kg当たり約1μgから約100mgまで、体重kg当たり約1μgから約50mgまで、体重kg当たり約1mgから約500mgまで;および体重kg当たり約1mgから約50mgまでの非経口投与に等しい用量で投与される。あるいは、治療的に有効な用量を達成するために投与されるレナリドミドを含有する分子の用量は、体重kg当たり約0.1ng、1ng、10ng、100ng、1μg、10μg、100μg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、500mg、またはそれを超える。

0058

CD33特異的なキメラ抗原受容体(CAR)
CARは、一般に、リンパ球の活性化に関与する膜貫通シグナル伝達モチーフと共に、モノクローナル抗体(mAb)の単鎖可変断片(scFv)由来の抗原認識ドメインを組み込んでいる(Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45)。本明細書に開示されるのは、免疫エフェクター細胞に発現されてCD33特異的なCARに対する抗腫瘍活性を亢進することのできる、CD33特異的なキメラ抗原受容体(CAR)である。

0059

本開示のCARは、一般に、3つのドメイン:外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインからなる。外部ドメインは、CD33結合領域を含み、抗原認識に関与する。それはまた、任意選択的にシグナルペプチド(SP)を含有し、それゆえにCARは、グリコシル化され、免疫エフェクター細胞の細胞膜係留されることが可能である。膜貫通ドメイン(TD)は、その名称示唆する通りであり、外部ドメインを内部ドメインに接続し、細胞によって発現されると細胞膜内に位置する。内部ドメインは、抗原認識後に活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に伝えるCARの先端部である。例えば、内部ドメインは、シグナル伝達ドメイン(ISD)および共刺激シグナル伝達領域(CSR)を含有することがある。

0060

「シグナル伝達ドメイン(SD)」は、一般に、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含有し、このモチーフは、ITAMがリン酸化されるとシグナル伝達カスケードを活性化する。用語「共刺激シグナル伝達領域(CSR)」とは、T細胞受容体によりT細胞の活性化を亢進することのできる共刺激タンパク質受容体、例えばCD28、41BB、およびICOSなどに由来する、細胞内シグナル伝達ドメインを指す。

0061

また開示されるのは、異なるリガンド結合標的を有する、本開示のCD33特異的なCARと少なくとも1つの他のCARとを含有する、二重CAR T細胞である。これらの実施形態では、1つのCARは、CD3ζドメインのみを含み、他のCARは、共刺激ドメインのみを含むことがある。これらの実施形態では、二重CAR T細胞の活性化は、標的細胞上に双方の標的の共発現を必要とするものとなる。

0062

そのため、実施形態によっては、本開示のCD33特異的なCARポリペプチドは、不完全な内部ドメインを含有する。例えば、CARポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインまたは共刺激ドメインのみを含有しうるが、両方を含有し得ない。これらの実施形態では、それと、欠けたドメインを含有する第2のCARポリペプチド(または内在性T細胞受容体)との両方が、それぞれの標的に結合しない限り、免疫エフェクター細胞は活性化されない。それゆえ、実施形態によっては、CARポリペプチドは、CD3ゼータ(CD3ζ)シグナル伝達ドメインを含有するが、共刺激シグナル伝達領域(CSR)を含有しない。他の実施形態では、CARポリペプチドは、CD28、4−1BB、またはそれらの組合せの細胞質ドメインを含有するが、CD3ゼータ(CD3ζ)シグナル伝達ドメイン(SD)を含有しない。

0063

本開示の二重CAR T細胞は、本開示のCD33特異的なCARと、異なるリガンド結合標的、例えばCD123、TIM3、またはCLEC12Aなどを有する少なくとも1つの他のCARとを、含有することがある。CARは、一般に、リンパ球の活性化に関与する膜貫通シグナル伝達モチーフと共に、モノクローナル抗体(mAb)の単鎖可変断片(scFv)由来の抗原認識ドメインを組み込んでいる(Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45)。これらの追加的なCARは、それゆえ、第2の標的、例えばCD123、TIM3、またはCLEC12Aなどを結合する抗体を含有することがある。

0064

実施形態によっては、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ(CD3ζ)シグナル伝達ドメインである。実施形態によっては、共刺激シグナル伝達領域は、CD28、4−1BB、またはそれらの組合せの細胞質ドメインを含む。場合によっては、共刺激シグナル伝達領域は、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達分子および/または共刺激分子の1個、2個、3個、または4個の細胞質ドメインを含有する。実施形態によっては、共刺激シグナル伝達領域は、シグナル伝達を亢進する、CD28および/または4−1BBの細胞質ドメイン中の1つまたは複数の変異を含有する。

0065

実施形態によっては、本開示のCARは、Y206および/またはY218でのリン酸化が変更されたCD28の細胞質ドメインの変異形態を含む、共刺激シグナル伝達領域を含む。実施形態によっては、本開示のCARは、Y206に減衰の変異を含み、それによりCARの活性が低減するものとなる。実施形態によっては、本開示のCARは、Y218に減衰の変異を含み、それによりCARの発現が低減するものとなる。任意のアミノ酸残基、例えばアラニンまたはフェニルアラニンを、チロシンの代わりに置換し、減衰を達成することができる。実施形態によっては、Y206および/またはY218のチロシンは、リン酸化模倣残基により置換される。実施形態によっては、本開示のリン酸化模倣残基によるY206のCAR置換、それによりCARの活性が増加するものとなる。実施形態によっては、本開示のCARは、リン酸化模倣残基によるY218の置換を含み、それによりCARの発現が増加するものとなる。例えば、リン酸化模倣残基は、リン酸化チロシンとすることができる。実施形態によっては、CARは、同じCARの異なる残基中に、リン酸化模倣アミノ酸とリン酸化不能アミノ酸による置換との組合せを含有することがある。例として、CARは、Y209および/またはY191におけるアラニンまたはフェニルアラニンの置換に加えて、Y206および/またはY218におけるリン酸化模倣置換を含有することがある。

0066

実施形態によっては、本開示のCARは、特異的なTRAFタンパク質、例えばTRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、またはそれらの任意の組合せなどとの結合を亢進する変異を有する、1つまたは複数の41BBドメインを含む。場合によっては、この41BBの変異は、T細胞のTRAF1依存的および/またはTRAF2依存的な増殖および生存を、例えばNF−kBを介して亢進する。場合によっては、41BBの変異は、TRAF3依存的な抗腫瘍効能を、例えばIRF7/INFβを介して亢進する。場合によっては、41BBの細胞質ドメインは、アミノ酸配列KRGRKKLLYIFKQPFMPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号40)を含み、上記配列中、TRAF結合に応答性のあるこのドメインの領域は下線を付されている。それゆえ、本開示のCARは、TRAF結合を亢進するおよび/またはNFκBシグナル伝達を亢進する少なくとも1つの変異をこれらの下線部配列に有する、41BBの細胞質ドメインを含むことがある。

0067

また本明細書に開示されるように、TRAFタンパク質は、場合によっては、NFκBおよび41BBとは独立したCAR T細胞の機能を亢進することがある。例えば、TRAFタンパク質は、場合によっては、T細胞におけるCD28の共刺激を亢進することがある。そのため、また本明細書に開示されるのは、1つまたは複数のTRAFタンパク質、例えばTRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、またはそれらの任意の組合せと併せてCARを共発現する、免疫エフェクター細胞である。場合によっては、CARは、腫瘍抗原を標的とする任意のCARである。例えば、第1世代のCARは、典型的にはCD3ζ鎖由来の細胞内ドメインを有していたのに対して、第2世代のCARは、追加的なシグナルをT細胞にもたらすように、様々な共刺激タンパク質受容体(例えばCD28、41BB、ICOS)由来の細胞内シグナル伝達ドメインをCARの内部ドメインに追加していた。場合によっては、そのCARは、41BBの活性化が亢進された本開示のCARである。

0068

実施形態によっては、本開示のCARは、以下の式:
SP−CD33−HG−TM−CSR−SD;または
SP−CD33−HG−TM−SD−CSR;
により定義され、式中、
「SP」は、任意選択的なシグナルペプチドを表し、
「CD33」は、CD33結合領域を表し、
「HG」は、任意選択的なヒンジドメインを表し、
「TM」は、膜貫通ドメインを表し、
「CSR」は、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域を表し、
「SD」は細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、ペプチド結合またはリンカーを表す。

0069

追加的なCAR構築物は、例えば、これらのCARモデルの教示について参照によりその全体を組み込まれる、Fresnak AD, et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81に記載されている。

0070

例えば、CARは、TRUCK、汎用性CAR(Universal CAR)、自己駆動性CAR(Self-driving CAR)、装甲CAR(Armored CAR)、自己破壊性CAR(Self-destruct CAR)、条件的CAR(Conditional CAR)、標示CAR(Marked CAR)、TenCAR、二重CAR(Dual CAR)、またはsCARとすることができる。

0071

TRUCK(汎用的なサイトカインによる殺傷のために再指向されたT細胞)は、キメラ抗原受容体(CAR)と抗腫瘍性サイトカインとを共発現する。サイトカインの発現は、恒常的であることもT細胞の活性化により誘導されることもある。CAR特異性により標的とされると、炎症促進性サイトカインの局所的な産生によって、内在性免疫細胞が腫瘍部位リクルートされ、抗腫瘍応答を増強することがある。

0072

汎用性の同種異系CAR T細胞は、内在性T細胞受容体(TCR)および/または主要組織適合抗原複合体(MHC)分子を以降発現しないものとし、それにより移植片対宿主病(GVHD)または拒絶をそれぞれ防止するように、工学的に作製される。

0073

自己駆動性CARは、CARとケモカイン受容体とを共発現するものであるが、それらは腫瘍リガンドに結合し、それによって腫瘍のホーミングを亢進する。

0074

免疫抑制抵抗性であるように工学的に作製されたCAR T細胞(装甲CAR)は、免疫チェックポイントスイッチ受容体を用いて、様々な免疫チェックポイント分子[例えば、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)またはプログラム細胞死タンパク質1(PD1)]を以降発現しないように遺伝子改変されるか、または、免疫チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体と共に投与されることがある。

0075

CARをコードするようにエレクトロポレーションによって送達されるRNAを用いた自己破壊性CARが、設計されることがある。あるいは、遺伝子改変リンパ球におけるチミジンキナーゼとのガンシクロビルの結合、またはごく最近に記載された小分子二量体化因子によるヒトカスパーゼ9の活性化の系に基づき、T細胞の誘導性アポトーシスが達成されることがある。

0076

条件的CAR T細胞は、回路を完成させるために小分子が添加されるまで、デフォルトでは応答しないかまたはスイッチ「オフ」されているが、この回路は、シグナル1およびシグナル2の両方の完全な伝達を可能とし、それによってCAR T細胞を活性化する。あるいは、T細胞は、以降に投与される標的抗原を指向する二次抗体に対し親和性を有するアダプター特異的な受容体を発現するように、工学的に作製されることがある。

0077

標示CAR T細胞は、CARに加えて、既存のモノクローナル抗体剤が結合する腫瘍エピトープを発現する。耐え難い有害作用に際し、モノクローナル抗体を投与することにより、追加的な腫瘍外作用を生じることなく、CAR T細胞が一掃され、症状が軽減される。

0078

タンデムCAR(TanCAR)T細胞は、細胞内共刺激ドメインおよびCD3ζドメインに融合された異なる親和性を有する2つの連結された単鎖可変断片(scFv)からなる、単一のCARを発現する。TanCAR T細胞の活性化は、標的細胞が双方の標的を共発現する際にのみ達成される。

0079

二重CAR T細胞は、異なるリガンド結合標的を有する2つの別々のCARを発現し;一方のCARはCD3ζドメインのみを含み、他方のCARは共刺激ドメインのみを含む。二重CAR T細胞の活性化は、腫瘍上での両方の標的の共発現を必要とする。

0080

安全性CAR(sCAR)は、細胞内阻害ドメインに融合された細胞外scFvからなる。標準的なCARを共発現するsCAR T細胞は、標準的なCAR標的を有するがsCAR標的を欠いた標的細胞に遭遇した場合にのみ、活性化されてゆく。

0081

本開示のCARの抗原認識ドメインは、通常はscFvである。しかし、数多くの代替物がある。生得のT細胞受容体(TCR)のアルファ単鎖およびベータ単鎖由来の抗原認識ドメインは、単純な外部ドメイン(例えば、HIV感染細胞を認識するためのCD4外部ドメイン)と、より特異な認識構成成分、例えば連結されたサイトカイン(サイトカイン受容体を有する細胞の認識に繋がる)などとを有するものとして、記載されている。実際には、高い親和性で所与の標的に結合するほぼすべてのものを、抗原認識領域として使用することができる。

0082

内部ドメインは、抗原認識後にシグナルを免疫エフェクター細胞に伝えるCARの先端部であり、このシグナルは、免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも1つを活性化する。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含めて、細胞溶解活性であってもヘルパー活性であってもよい。それゆえ、内部ドメインは、T細胞受容体(TCR)および任意選択的な共受容体の「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含むことがある。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用されうるが、一方で多くの場合、鎖全体を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切頭部分を用いる場合、そのような切頭部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに用いられることがある。

0083

刺激性の様式で作用するTCR複合体の一次活性化を調節する細胞質内シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)として知られるシグナル伝達モチーフを含有することがある。ITAMを含有する細胞質内シグナル伝達配列の例としては、CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD32(FcガンマRIIa)、DAP10、DAP12、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ(FCERIB)、およびFcεRIγ(FCERIG)に由来するものが挙げられる。

0084

具体的な実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ(CD3ζ)(TCRゼータ、GenBank受託番号BAG36664.1)に由来する。T細胞受容体T3ゼータ鎖またはCD247(分化抗原群247)としても知られるT細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ(CD3ζ)鎖は、ヒトでCD247遺伝子によってコードされるタンパク質である。

0085

第1世代CARは、典型的には、内在性TCR由来のシグナルの一次トランスミッターであるCD3ζ鎖由来の細胞内ドメインを有していた。第2世代のCARは、様々な共刺激タンパク質受容体(例えばCD28、41BB、ICOS)由来の細胞内シグナル伝達ドメインを、CARの内部ドメインに追加して、追加的なシグナルをT細胞にもたらす。前臨床研究では、第2世代のCARの設計が、T細胞の抗腫瘍活性を向上することが示されている。さらに最近では、第3世代のCARが、複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせて強度をさらに増大させている。これらのCARを移植されたT細胞は、共刺激受容体/リガンド相互作用とは独立した、拡大、活性化、持続性、および腫瘍根絶効率の向上を実証している(Imai C, et al. Leukemia 2004 18:676-84; Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002 20:70-5)。

0086

例えば、CARの内部ドメインは、それ自体でCD3ζシグナル伝達ドメインを含むように設計されるか、または本発明のCARのコンテクストで有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わされることがある。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことがある。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、CARの一部を指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、CD27、CD28、4−1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド、CD8、CD4、b2c、CD80、CD86、DAP10、DAP12、MyD88、BTNL3、およびNKG2Dが挙げられる。それゆえ、本CARは、共刺激シグナル伝達因子として主にCD28にて例示されるが、他の共刺激因子が、単独でまたは他の共刺激シグナル伝達因子と組み合わせて用いられることがある。

0087

実施形態によっては、CARは、ヒンジ配列を含む。ヒンジ配列は、抗体の可撓性を促進するアミノ酸の短い配列である[例えば、Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004)を参照]。ヒンジ配列は、抗原認識部分(例えば抗CD33 scFv)と膜貫通ドメインとの間に配置されることがある。ヒンジ配列は、任意の適した分子に由来するかまたはそこから得られる、任意の適した配列とすることができる。実施形態によっては、例えば、ヒンジ配列は、CD8a分子またはCD28分子に由来する。

0088

膜貫通ドメインは、天然の供給源または合成の供給源のどちらを由来としてもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通型のタンパク質を由来としてもよい。例えば、膜貫通領域は、T細胞受容体のアルファ鎖ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8(例えばCD8アルファ、CD8ベータ)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、またはCD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA−1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4−1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rベータ、IL2Rガンマ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA−6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA−1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA−1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB−A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO−3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、およびPAG/Cbpを由来とする(すなわち、少なくともその膜貫通領域を含む)ことがある。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であることがあり、その場合、大部分に疎水性の残基、例えばロイシンおよびバリンなどを含むものとなる。場合によっては、合成の膜貫通ドメインの各終端に、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見出されるものとなる。2アミノ酸と10アミノ酸の間の長さなどの短いオリゴまたはポリペプチドリンカーは、CARの膜貫通ドメインと内質ドメインとの間に連結部を形成することがある。

0089

実施形態によっては、CARは、1つを超える膜貫通ドメインを有し、それらは、同じ膜貫通ドメインの繰り返しであることがあるか、または異なる膜貫通ドメインであることがある。

0090

実施形態によっては、CARは、この教示について参照により組み込まれるWO2015/039523に記載されるような、複数鎖のCARである。複数鎖のCARは、異なる膜貫通ポリペプチドに、別々の細胞外リガンド結合ドメインとシグナル伝達ドメインとを含むことがある。シグナル伝達ドメインは、膜近傍の位置に集合するように設計されることがあり、このようなドメインは、最適なシグナル伝達をもたらす可撓性のある構造体を、天然の受容体にさらに近付いて形成する。例えば、複数鎖のCARは、FCERIアルファ鎖の一部分とFCERIベータ鎖の一部分とを含むことがあるが、それによりFCERI鎖が自然に共に二量体化してCARを形成する。

0091

下記の表1、表2、および表3は、本開示のCARに生じる可能性のあるCD33結合領域、共刺激シグナル伝達領域、および細胞内シグナル伝達ドメインの組合せのいくつかの例を示す。

0092

0093

0094

0095

0096

0097

0098

実施形態によっては、抗CD33結合剤は、単鎖可変断片(scFv)抗体である。抗CD33 scFvの親和性/特異性は、重鎖(VH)および軽鎖(VL)の相補性決定領域(CDR)内の特異的な配列によって、大部分が推進される。各VHおよびVL配列は、3つのCDR(CDR1、CDR2、CDR3)を有するものとなる。

0099

実施形態によっては、抗CD33結合剤は、天然の抗体、例えばモノクローナル抗体などに由来する。場合によっては、抗体は、ヒトである。場合によっては、抗体は、ヒトに投与される際に免疫原性が少なくなるように変更を施される。例えば、この変更は、キメラ化、ヒト化、CDR移植、脱免疫化、および最も近いヒト生殖系列配列に対応するフレームワークアミノ酸の変異からなる群から選択される、1つまたは複数の手法を含む。

0100

また開示されるのは、CD33と少なくとも1つの追加的な腫瘍抗原とを標的とする二重特異性CARである。また開示されるのは、腫瘍抗原などの異なる抗原を結合する別のCARと併用した際にのみ動作するように設計されたCARである。例えば、これらの実施形態では、本開示のCARの内部ドメインは、シグナル伝達ドメイン(SD)または共刺激シグナル伝達領域(CSR)のみを含有しうるが、両方を含有し得ない。第2のCAR(または内在性T細胞)は、活性化された場合に、欠けたシグナルをもたらす。例えば、本開示のCARがSDを含有するがCSRを含有しないならば、このCARを含有する免疫エフェクター細胞は、CSRを含有する別のCAR(またはT細胞)がその個別の抗原を結合する場合にのみ、活性化される。同様に、本開示のCARがCSRを含有するがSDを含有しないならば、このCARを含有する免疫エフェクター細胞は、SDを含有する別のCAR(またはT細胞)がその個別の抗原を結合する場合にのみ、活性化される。

0101

腫瘍抗原とは、免疫応答を、具体的にはT細胞媒介性の免疫応答を惹起する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。上記の追加的な抗原結合ドメインは、腫瘍抗原の抗体または天然のリガンドであることがある。上記の追加的な抗原結合ドメインの選択は、治療される具体的ながんのタイプに依存するものとなる。腫瘍抗原は、当技術分野に周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、EGFRvIII、IL−llRa、IL−13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CA LX、CS−1、MUC1、BCMA、bcr−abl、HER2、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトタンパク質(AFP)、ALK、CD19、CD123、サイクリンBl、レクチン反応性AFP、Fos関連抗原1、ADRB3、サイログロブリン、EphA2、RAGE−1、RUl、RU2、SSX2、AKAP−4、LCK、OY−TESl、PAX5、SART3、CLL−1、フコシルGM1、GloboH、MN−CA IX、EPCAM、EVT6−AML、TGS5、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プリシアル酸、PLAC1、RUl、RU2(AS)、腸管カルボキシルエステラーゼルイスY、sLe、LY6K、mut hsp70−2、M−CSF、MYCN、RhoC、TRP−2、CYPIBI、BORIS、プロスターゼ前立腺特異的抗原(PSA)、PAX3、PAP、NY−ESO−1、LAGE−la、LMP2、NCAM、p53、p53変異体、Ras変異体、gplOO、プロステイン、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、HAVCR1、VEGFR2、PDGFRベータ、サバイビンおよびテロメラーゼレグマイン、HPVE6、E7、精子タンパク質17、SSEA−4、チロシナーゼ、TARP、WT1、前立腺癌腫腫瘍抗原1(PCTA−1)、ML−IAP、MAGE、MAGE−A1、MAD−CT−1、MAD−CT−2、Melan A/MART1、XAGE1、ELF2M、ERG(TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、好中球エラスターゼ肉腫転座切断点、NY−BR−1、ephnnB2、CD20、CD22、CD24、CD30、TIM3、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、アンドロゲン受容体、FAP、インスリン成長因子(IGF)I、IGFII、IGF−I受容体、GD2、o−アセチル−GD2、GD3、GM3、GPRC5D、GPR20、CXORF61、葉酸受容体(FRa)、葉酸受容体ベータ、ROR1、Flt3、TAG72、TN Ag、Tie2、TEM1、TEM7R、CLDN6、TSHR、UPK2、およびメソテリンが挙げられる。好適な実施形態では、腫瘍抗原は、葉酸受容体(FRa)、メソテリン、EGFRvIII、IL−13Ra、CD123、CD19、TIM3、BCMA、GD2、CLL−1、CA−IX、MUCl、HER2、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

0102

腫瘍抗原の非限定的な例としては、以下:分化抗原、例えばチロシナーゼ、TRP−1、TRP−2など、および腫瘍特異的多系列抗原、例えばMAGE−1、MAGE−3、BAGE、GAGE−1、GAGE−2、pi 5など;過剰発現された胚性抗原、例えばCEAなど;過剰発現された癌遺伝子および変異型腫瘍抑制遺伝子、例えばp53、Ras、HER−2/neuなど;染色体転座の結果として生じるユニークな腫瘍抗原、例えばBCR−ABL、E2A−PRL、H4−RET、IGH−IGK、MYL−RARなど;ならびにウイルス性抗原、例えばエプスタインバーウイルス抗原EBVAならびにヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7が挙げられる。他の大きなタンパク質ベースの抗原としては、TSP−180、MAGE−4、MAGE−5、MAGE−6、RAGE、NY−ESO、pl85erbB2、pl80erbB−3、c−met、nm−23H1、PSA、CA19−9、CA72−4、CAM17.1、NuMa、K−ras、ベータカテニン、CDK4、Mum−1、p15、p16、43−9F、5T4、791Tgp72、アルファフェトタンパク質、ベータHCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15−3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA−50、CAM43、CD68\P1、CO−029、FGF−5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp−175、M344、MA−50、MG7−Ag、MOV18、NB/70K、NY−CO−1、RCASl、SDCCAG16、TA−90\Mac−2結合タンパク質シクロフィリン会合タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、GPC3、MUC16、LMP1、EBMA−1、BARF−1、CS1、CD319、HER1、B7H6、L1CAM、IL6、およびMETが挙げられる。

0103

核酸およびベクター
また開示されるのは、本開示の免疫エフェクター細胞でCD33特異的なCARの発現を可能にする、本開示のCD33特異的なCARをコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドベクターである。

0104

本開示のCAR、およびその領域をコードする核酸配列は、当技術分野に公知の組換え方法を使用して、例えば、標準的な手法を用いて、遺伝子を発現する細胞由来スクリーニングライブラリーによって、同じものを含むことが公知であるベクターから遺伝子を取り出すことによって、または同じものを含有する細胞および組織から直接的に単離することによって、得ることができる。あるいは、目的の遺伝子は、クローニングよりもむしろ合成によって産生することができる。

0105

CARをコードする核酸の発現は、典型的には、CARポリペプチドをコードする核酸をプロモーターに動作可能に連結し、構築物を発現ベクター内に組み込むことによって達成される。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳終結因子開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現を調節するために有用なプロモーターを含有する。

0106

本開示の核酸は、数多くのタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、以下に限定されないが、プラスミドファージミドファージ誘導体動物ウイルス、およびコスミドを含むベクターにクローニングすることができる。具体的な目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシークエンシングベクターが挙げられる

0107

さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に与えられてもよい。ウイルスベクター技術は、当技術分野に周知であり、例えばSambrook et al.(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)ならびに他のウイルス学および分子生物学手引き書に記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、以下に限定されないが、レトロウイルスアデノウイルスアデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。一般に、適したベクターは、少なくとも1種の生物で機能性のある複製起点プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つまたは複数の選択マーカーを含有する。実施形態によっては、ポリヌクレオチドベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。

0108

数多くのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入に用いるために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームをもたらした。選択された遺伝子は、当技術分野に公知の手法を用いて、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子パッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、in vivoまたはex vivoのどちらかで対象の細胞に送達することができる。

0109

適したプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに動作可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列高レベルの発現を駆動することが可能な、強力な恒常的プロモーター配列である。適したプロモーターの別の例は、伸長成長因子1α(EF−1α)である。しかし、他の恒常的プロモーター配列も使用されることがあり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、シミアンウイルス40SV40初期プロモーター、MND(骨髄増殖性肉腫ウイルス)プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルスHIV長鎖末端反復LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば以下に限定されないが、アクチンプロモーターミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられる。プロモーターは代替的に、誘導性プロモーターとすることができる。誘導性プロモーターの例としては、以下に限定されないが、メタロチオニン(metallothionine)プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。

0110

追加的なプロモーター因子、例えばエンハンサーは、転写開始頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、尤も、数多くのプロモーターが同様に、開始部位の下流に機能因子を含有することが示されている。因子が互いに対し逆転または移動される際にプロモーター機能が保たれるように、プロモーター因子間の間隔は柔軟であることが多い。

0111

CARポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞内に導入される発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子もしくレポーター遺伝子のどちらかまたは両方を含有して、ウイルスベクターによりトランスフェクトまたは感染させようとした細胞の集団からの発現細胞の特定および選択を容易にすることができる。他の態様では、選択マーカーは、別々の一片のDNAに担持されてコトランスフェクションの手順に使用されることがある。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の両方には、その側面に適切な調節配列が位置し、宿主細胞での発現を可能にする。有用な選択マーカーとしては、例えば抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。

0112

レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性がある細胞を特定するために、および調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生体または組織に存在しないかまたは発現されず、いくらか容易に検出可能な性質、例えば酵素活性によってその発現が顕在化するポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後、適した時間にアッセイされる。適したレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼベータガラクトシダーゼクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が挙げられうる。適した発現系は、周知であり、公知の手法を用いて調製されるかまたは商業的に取得されることがある。一般に、最も高いレベルのレポーター遺伝子の発現を示す最小限の5’フランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして特定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動性の転写を調整する能力について薬剤を評価するために用いられることがある。

0113

遺伝子を細胞に導入し発現する方法は、当技術分野に公知である。発現ベクターのコンテクストでは、ベクターは、当技術分野の任意の方法によって、宿主細胞に、例えば哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫の細胞に、容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的な手段によって、宿主細胞内に移入することができる。

0114

ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための物理的な方法としては、リン酸カルシウム沈殿リポフェクション粒子照射マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび/または外来性の核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野に周知である。例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照されたい。

0115

目的のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的な方法としては、DNAベクターおよびRNAベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、そして特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞内に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法となりつつある。

0116

ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセルマイクロスフェア、ビーズ、および脂質ベース系などが挙げられ、脂質ベース系としては、水中油型エマルジョンミセル混合ミセル、およびリポソームが挙げられる。in vitroおよびin vivoでの送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば人工膜小胞)である。

0117

非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。別の態様では、核酸が、脂質に会合されていることがある。脂質に会合された核酸は、リポソームの水性内部に被包されるか、リポソームの脂質二重層内に散在するか、リポソームとオリゴヌクレオチドとの両方に会合している連結分子を介してリポソームに付加するか、リポソーム内に捕らえられるか、リポソームと合わせて複合体となるか、脂質を含有する溶液中に分散するか、脂質と混合されるか、脂質と組み合わされるか、脂質中に懸濁物として含有されるか、ミセルと共に含有されるかもしくは複合体となるか、またはその他脂質と会合されることがある。脂質、脂質/DNA、または脂質/発現ベクターにより会合された組成物は、溶液中の任意の具体的な構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造に、ミセルとして、または「崩壊した」構造で、存在することがある。それらはまた、単に溶液中に散在していることがあり、サイズまたは形状が均一でない凝集塊を形成している可能性がある。脂質は、天然に生じることも合成の脂質であることもある脂肪性物質である。例えば、脂質としては、細胞質に天然に生じる脂肪小滴、ならびに長鎖の脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する化合物のクラス、例えば脂肪酸、アルコール、アミンアミノアルコール、およびアルデヒドなどが挙げられる。使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、シグマセントルイス、ミズーリ州から入手することができ;リン酸ジセチル(「DCP」)は、K&Kラボラトリーズ(プレイビューニューヨーク州)から入手することができ;コレステロール(「Choi」)は、カルビオケム−ベーリングから入手することができ;ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)および他の脂質は、アバンテポーラリピッド社(バーミンガムアラバマ州)から入手されることがある。

0118

免疫エフェクター細胞
また開示されるのは、本開示のCAR(本明細書に「CAR−T細胞」としても称されるを発現するように、工学的に作製された免疫エフェクター細胞である。これらの細胞は、好ましくは治療される対象から取得される(すなわち自家性である)。しかし、実施形態によっては、免疫エフェクター細胞株またはドナーエフェクター細胞(同種異系)が用いられる。免疫エフェクター細胞は、数多くの供給源から取得することができ、そのような供給源としては、末梢血単核細胞骨髄リンパ節組織臍帯血胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水胸水脾臓組織、および腫瘍が挙げられる。免疫エフェクター細胞は、対象から採集された血液から、当業者に公知の任意の数の手法、例えばFicoll(商標)分離などを用いて取得することができる。例えば、個体の循環血液由来の細胞が、アフェレーシスによって取得されることがある。実施形態によっては、免疫エフェクター細胞は、赤血球を溶解することおよび単球を枯渇させることによって、例えば、PERCOLL(商標)勾配を介した遠心分離によって、または対向流遠心溶出法によって、末梢血リンパ球から単離される。免疫エフェクター細胞の特異的な部分集団は、陽性選抜または陰性選抜の手法によってさらに単離することができる。例えば、免疫エフェクター細胞は、陽性選択細胞にユニークな表面マーカーを指向する抗体の組合せを用いて、例えば、所望の免疫エフェクター細胞の陽性選択に十分な時間の間、抗体コンジュゲートビーズと共にインキュベートすることによって、単離することができる。あるいは、免疫エフェクター細胞集団の濃縮は、陰性選択細胞にユニークな表面マーカーを指向する抗体の組合せを用いた陰性選抜によって、達成することができる。

0119

実施形態によっては、免疫エフェクター細胞は、感染症および外来性物質に対する身体の防御に関与する任意の白血球を含む。例えば、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞マスト細胞好中球好塩基球好酸球、またはそれらの任意の組合せを含みうる。例えば、免疫エフェクター細胞は、Tリンパ球を含みうる。

0120

T細胞またはTリンパ球は、細胞表面のT細胞受容体(TCR)の存在によって、他のリンパ球、例えばB細胞およびナチュラルキラー細胞(NK細胞)などから識別することができる。それらは、(扁桃腺中でも成熟するものもあるとはいえ)胸腺で成熟することから、T細胞とよばれる。それぞれが別個の機能を有するいくつかのT細胞のサブセットがある。

0121

ヘルパー細胞(TH細胞)は、形質細胞およびメモリーB細胞へのB細胞の成熟と、細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化とを含む免疫学的過程で、他の白血球を支援する。これらの細胞は、その表面にCD4糖タンパク質を発現することから、CD4+T細胞としても知られる。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞APC)の表面に発現されるMHCクラスII分子によってペプチド抗原を提示されると、活性化されてゆく。それらは活性化されると、速やかに分裂し、小さなタンパク質を分泌するが、このタンパク質はサイトカインとよばれ、能動免疫応答を調節または支援する。これらの細胞は、TH1、TH2、TH3、TH17、TH9、またはTFHを含む複数のサブタイプのうちの1つに分化することができ、そのようなサブタイプは、異なるサイトカインを分泌して、異なるタイプの免疫応答を促進する。

0122

細胞傷害性T細胞(TC細胞またはCTL)は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞は、その表面にCD8糖タンパク質を発現することから、CD8+T細胞としても知られる。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するMHCクラスI分子に会合する、抗原に結合することによって、標的を認識する。調節性T細胞によって分泌されるIL−10、アデノシン、および他の分子を介して、CD8+細胞は、自己免疫疾患を防ぐアネルギー状態不活性化されることがある。

0123

メモリーT細胞は、感染が解消した後に長期間持続する、抗原特異的なT細胞のサブセットである。それらは、同起源の抗原に再度曝露されると多数のエフェクターT細胞に急速に拡大し、それゆえ過去の感染に対する「記憶」を免疫系に付与する。メモリー細胞は、CD4+またはCD8+のどちらかであることがある。メモリーT細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質CD45ROを発現する。

0124

調節性T細胞(Treg細胞)は、かつては抑制性T細胞として知られたものであり、免疫寛容の維持に極めて重要である。これらの主要な役割は、免疫反応の終了に向けてT細胞媒介性免疫を停止させること、および胸腺における陰性選抜の過程を逃れた自己反応性T細胞を抑制することである。2つの主要なクラスのCD4+Treg細胞—天然に生じたTreg細胞および適応性Treg細胞—が記載されている。

0125

ナチュラルキラーT(NKT)細胞[ナチュラルキラー(NK)細胞と混同しないこと]は、適応免疫系を先天免疫系に橋渡しする。主要組織適合抗原複合体(MHC)分子によって提示されたペプチド抗原を認識する従来のT細胞とは異なり、NKT細胞は、CD1dとよばれる分子により提示された糖脂質抗原を認識する。

0126

実施形態によっては、T細胞は、CD4+細胞の混合物を含む。他の実施形態では、T細胞は、細胞表面の発現に基づき、1つまたは複数のサブセットに濃縮される。例えば、場合によっては、Tが含むのは、細胞傷害性のCD8+Tリンパ球である。実施形態によっては、T細胞は、γδT細胞を含むが、このT細胞は、α鎖β鎖の代わりに1つのγ鎖と1つのδ鎖とを有する別個のT細胞受容体(TCR)を有する。

0127

ナチュラルキラー(NK)細胞は、ウイルス感染細胞および形質転換細胞を殺傷することができるCD56+CD3−大型顆粒リンパ球であり、先天免疫系の決定的に重要な細胞サブセットを構成する(Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676)。細胞傷害性のCD8+Tリンパ球とは異なり、NK細胞は、事前感作を必要とすることなく、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を発動し、MHC−I陰性細胞を根絶することもできる(Narni-Mancinelli E, et al. Int Immunol 2011 23:427-431)。NK細胞は、サイトカインストームの潜在的な致死的合併症(Morgan RA, et al. Mol Ther 2010 18:843-851)、腫瘍崩壊性症候群(Porter DL, et al. N Engl J Med 2011 365:725-733)、および標的外、腫瘍外効果を回避することがあるという点で、より安全なエフェクター細胞である。NK細胞ががん細胞のキラーとして周知の役割を有し、かつNK細胞の機能障害がMMの進行に極めて重要であることが広く文書に記載されているとはいえ(Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676; Fauriat C, et al. Leukemia 2006 20:732-733)、NK細胞媒介性の抗MM活性を亢進する可能性をもたらす手段は、本開示のCARに先立ち殆ど探究されていなかった。

0128

治療方法
本開示のCARを発現する免疫エフェクター細胞は、CD33発現がん細胞に対する抗腫瘍免疫応答を惹起することができる。本開示のCAR改変型免疫エフェクター細胞によって惹起された抗腫瘍免疫応答は、能動的な免疫応答でも受動的な免疫応答でもありうる。さらに、CAR媒介性免疫応答は、CAR改変型免疫エフェクター細胞がCD33に特異的な免疫応答を誘導する、養子免疫療法アプローチの一部であることがある。

0129

キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の養子移入は、将来性のある抗がん療法である。患者の免疫エフェクター細胞の採集後、細胞は、本開示のCD33特異的なCARを発現するように遺伝子工学的に作製され、次いで患者に注入されて戻されることがある。

0130

本開示のCAR改変型免疫エフェクター細胞は、単独で、または希釈剤および/もしくは他の構成成分、例えばIL−2、IL−15、もしくは他のサイトカイン、もしくは細胞集団と組み合わされた医薬組成物としてのどちらかで、投与されることがある。端的に述べれば、医薬組成物は、本明細書に記載されるような標的細胞集団を、1つまたは複数の医薬的にまたは生理的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含むことがある。そのような組成物は、緩衝剤、例えば中性緩衝生理食塩水リン酸緩衝生理食塩水など;炭水化物、例えばグルコースマンノーススクロース、またはデキストランマンニトールなど;タンパク質;ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシンなど;抗酸化剤;キレート剤、例えばEDTAまたはグルタチオンなど;アジュバント(例えば水酸化アルミニウム);および保存剤を含むことがある。本開示の方法における使用の際の組成物は、実施形態によっては、静脈内投与のために製剤化される。医薬組成物は、MMを治療するのに適切な任意の方法で投与されてよい。適切な投薬量は臨床試験により決定される可能性があるとはいえ、投与の量および頻度は、患者の状態、および患者の疾患の重症度などの要因によって決定されるものとなる。

0131

「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍性の有効な量」、「腫瘍阻害性の有効な量」または「治療量」が標示される際には、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者(対象)の状態の個体差を考慮して、医師が決定することができる。本明細書に記載されるT細胞を含む医薬組成物は、104から109細胞個/体重kgの、例えば105から106細胞個/体重kgなどの、およびこれらの範囲内にある全ての整数値を含めた投薬量で投与されうることを、一般的に述べることができる。T細胞組成物は、これらの投薬量で複数回投与されることもある。細胞は、免疫療法においてよく知られる注入手法(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照)を用いることによって、投与することができる。具体的な患者に用いる最適の投薬量および治療処方計画は、医療分野の当業者により、疾患の徴候について患者をモニタリングして相応に治療を調整することによって、容易に決定することができる。

0132

ある実施形態では、活性化されたT細胞を対象に投与し、次いで、続いて再度採血し(またはアフェレーシスを実施し)、本開示の方法に従ってそこからT細胞を活性化し、これらの活性化され拡大されたT細胞を患者に再度注入することが望ましい場合がある。この過程は、複数回、数週毎に実施することができる。ある実施形態では、T細胞は、10ccから400ccまでの採取血液から活性化することができる。ある実施形態では、T細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、または100ccの採取血液から活性化される。この複数回血液採取/複数回再注入プロトコールの使用は、ある特定のT細胞集団を選び出すのに役立つことがある。

0133

本開示の組成物の投与は、注射、輸液、または移植によることを含めた任意の簡便な方法で実施されてよい。本明細書に記載される組成物は、皮下で、皮内で、腫瘍内で、結節内で、内で、筋肉内で、静脈内(i.v.)注射によって、または腹腔内で、患者に投与されることがある。実施形態によっては、本開示の組成物は、皮内または皮下の注射によって患者に投与される。実施形態によっては、本開示の組成物は、i.v.注射によって投与される。組成物はまた、腫瘍内、リンパ節内、または感染部位内に直接的に注射されることがある。

0134

ある実施形態では、本開示のCAR改変型免疫エフェクター細胞は、任意の数の関連の治療法と併用して(例えば前に、同時に、もしくは続いて)、患者に投与され、そのような治療法としては、以下に限定されないが、サリドマイドデキサメタゾンボルテゾミブ、およびレナリドミドが挙げられる。さらに別の実施形態では、CAR改変型免疫エフェクター細胞は、化学療法、放射線免疫抑制剤、例えばシクロスポリンアザチオプリンメトトレキサートミコフェノール酸エステル、およびFK506など、抗体または他の免疫アブレーション剤、例えばCAMPATH、抗CD3抗体、もしくは他の抗体療法など、サイトシン(cytoxin)、フルダリビン(fludaribin)、シクロスポリン、FK506、ラパマイシンミコフェノール酸ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに放射線照射と組み合わせて使用されることがある。実施形態によっては、CAR改変型免疫エフェクター細胞は、骨髄移植;フルダラビンなどの化学療法剤体外放射線照射療法(XRT)、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のうちいずれかを用いたT細胞アブレーション療法と併用して(例えば前に、同時に、もしくは続いて)、患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、CD20に反応する薬剤、例えばリツキサンなどのB細胞アブレーション療法に続いて投与される。例えば、実施形態によっては、対象は、高用量の化学療法を用いた標準治療とその後に末梢血幹細胞の移植とを受けることがある。ある実施形態では、移植に続いて、対象は、拡大された本発明の免疫細胞の注入を受ける。追加的な実施形態では、拡大された細胞が、外科手術の前または後に投与される。

0135

本開示の方法のがんは、無制御の成長浸潤、または転移を起こしている対象における任意のCD33発現細胞とすることができる。CD33を発現するがんとしては、前立腺がん卵巣がん腺癌乳がん子宮内膜がん胃がん大腸がん、および膵臓がんが挙げられる。CD33は、Jurkat細胞上にも見出されている。態様によっては、がんは、胆嚢がん外分泌腺癌、またはアポクリン腺癌である。場合によっては、がんは、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、または混合表現型白血病を含む。

0136

態様によっては、がんは、放射線療法が現在用いられている任意の新生物または腫瘍とすることができる。あるいは、がんは、標準的な方法を用いた放射線療法に対して十分な感受性のない新生物または腫瘍とすることができる。そのため、がんは、肉腫、リンパ腫、白血病、癌腫芽腫、または生殖細胞腫瘍とすることができる。本開示の組成物を治療に用いることのできる、代表的ではあるが非限定的ながんの一覧には、リンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫菌状息肉症ホジキン病骨髄性白血病膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮癌腎臓がん、肺がん、例えば小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんなど、神経芽腫神経膠芽腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん肝臓がん黒色腫口腔咽喉咽頭、および肺の扁平上皮癌、子宮内膜がん、子宮頸がん子宮頸癌、乳がん、上皮がん腎がん尿生殖器がん、肺がん、食道癌頭頸部癌、大腸がん、造血器がん精巣がん結腸がんおよび直腸がん、前立腺がん、ならびに膵臓がんが挙げられる。

0137

本開示のCARは、細胞傷害性作用または細胞分裂停止作用を有する任意の化合物、部分、または基と組み合わせて使用することができる。薬剤部分としては、化学療法剤があげられ、これらは、マイクロチューブリン阻害剤、有糸分裂阻害剤トポイソメラーゼ阻害剤、またはDNA挿入剤として機能することがあり、具体的にはがん療法に用いられるものである。

0138

本開示のCARは、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することができる。公知の2つの阻害性チェックポイント経路が、細胞傷害性T−リンパ球抗原4(CTLA−4)受容体およびプログラム死1(PD−1)受容体を介したシグナル伝達に関与する。これらのタンパク質は、T細胞の機能の全ての段階を通じて重要な役割を果たす共シグナル伝達分子であるCD28−B7ファミリーメンバーである。PD−1受容体(CD279としても知られる)は、活性化されたT細胞の表面に発現される。そのリガンドであるPD−L1(B7−H1;CD274)およびPD−L2(B7−DC;CD273)は、樹状細胞やマクロファージなどのAPCの表面に発現される。PD−L1は、最も優勢なリガンドであり、一方、PD−L2は、それよりもはるかに制限された発現パターンを有する。リガンドがPD−1に結合すると、阻害性シグナルがT細胞に伝えられ、それによってサイトカイン産生が低減し、T細胞の増殖が抑制される。チェックポイント阻害剤としては、以下に限定されないが、PD−1[ニボルマブ(BMS−936558またはMDX1106)、CT−011、MK−3475]、PD−L1[MDX−1105(BMS−936559)、MPDL3280A、MSB0010718C]、PD−L2(rHIgM12B7)、CTLA−4[イピリムマブ(MDX−010)、トレリブマブ(CP−675,206)]、IDO、B7−H3(MGA271)、B7−H4、TIM3、LAG−3(BMS−986016)を遮断する抗体が挙げられる。

0139

プログラム死1(PD−1)に対するヒトモノクローナル抗体、および抗PD−1抗体を単独でまたは他の免疫療法薬と組み合わせて用いてがんを治療するための方法は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,008,449号に記載されている。抗PD−L1抗体およびその使用は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,552,154号に記載されている。抗PD−1抗体または抗PD−L1抗体を含む抗がん剤は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,617,546号に記載されている。

0140

実施形態によっては、PDL1阻害剤は、PDL1を特異的に結合する抗体、例えばBMS−936559(ブリストルマイヤーズスクイブ)またはMPDL3280A(ロシュ)などを含む。実施形態によっては、PD1阻害剤は、PD1を特異的に結合する抗体、例えばランブロリズマブ(メルク)、ニボルマブ(ブリストルマイヤーズスクイブ)、またはMEDI4736(アストラゼネカ)などを含む。PD−1に対するヒトモノクローナル抗体、および抗PD−1抗体を単独でまたは他の免疫療法薬と組み合わせて用いてがんを治療するための方法は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,008,449号に記載されている。抗PD−L1抗体およびその使用は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,552,154号に記載されている。抗PD−1抗体または抗PD−L1抗体を含む抗がん剤は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第8,617,546号に記載されている。

0141

本開示のCARは、他のがん免疫療法と組み合わせて使用することができる。2つの異なるタイプの免疫療法がある。受動免疫療法は、必ずしも患者において免疫応答を開始させる必要はなく、免疫系の構成成分を用いて、がん細胞に対し標的化された細胞傷害活性を向けるのに対して、能動免疫療法は、内在性の免疫応答を能動的に誘発する。受動型ストラテジーは、特異的な抗原に応答してB細胞によって産生されるモノクローナル抗体(mAbs)の使用を含む。1970年代にハイブリドーマ技術が発達したこと、および腫瘍特異的な抗原が特定されたことにより、免疫系による破壊のために腫瘍細胞を特異的に標的とすることのできるmAbの医薬開発が可能になった。今までのところ、mAbは、免疫療法の最大の成功事例となっており、2012年の抗がん薬ベストセラートップ3はmAbであった。それらの中には、リツキシマブ(リツキサン、ジェネンテック)があり、これは、非ホジキンリンパ腫(NHL)などのB細胞悪性腫瘍の表面に高発現されているCD20タンパク質に結合する。リツキシマブは、化学療法と組み合わされたNHLおよび慢性リンパ球性白血病(CLL)の治療のために、FDAにより認可されている。別の重要なmAbは、トラスツズマブハーセプチン;ジェネンテック)であり、これは、HER2(ヒト上皮成長因子受容体2)の発現を標的とすることによって、HER2陽性乳がんの治療を一変させた。

0142

最適な「キラー」CD8 T細胞の応答の生成にはまた、T細胞受容体の活性化に加えて共刺激が必要であり、共刺激は、OX40(CD134)および4−1BB(CD137)を含めた腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーの連結を介してもたらされることがある。活性化(アゴニスト)抗OX40 mAbを用いた治療が、T細胞の分化および細胞溶解機能を増大させ、種々の腫瘍に対する抗腫瘍免疫の亢進に繋がるという点で、OX40は特に興味深い。

0143

実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、抗代謝剤、例えばメトトレキサート、6−メルカプトプリン6−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン(decarbazine)、ヒドロキシウレアアスパラギナーゼゲムシタビン、またはクラドリビンなどから選択されることがある。

0144

実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、アルキル化剤、例えばメクロレタミン、チオエパ(thioepa)、クロラムブシルメルファランカルムスチンBSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファンジブロモマンニトール、ストレプトゾトシンダカルバジン(DTIC)、プロカルバジンマイトマイシンCシスプラチン、および他の白金誘導体、例えばカルボプラチンなどから選択されることがある。

0145

実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、標的化剤、例えばイブルチニブまたはイデラリシブなどである。

0146

実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、エピジェネティクス改変剤、例えばアザシチジンまたはビダーザなどである。

0147

実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、抗有糸分裂剤、例えばタキサン類など、例としてドセタキセルおよびパクリタキセル、ならびにビンカアルカロイド類、例としてビンデシンビンクリスチンビンブラスチン、およびビノレルビンから選択されることがある。

0148

実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、トポイソメラーゼ阻害剤、例えばトポテカンもしくはイリノテカンなど、または細胞分裂阻害薬、例えばエトポシドおよびテニポシドなどから選択されることがある。

0149

実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、成長因子阻害剤、例えばErbBl(EGFR)の阻害剤(EGFR抗体、例えばザルツムマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、もしくはニモツズマブなど、または他のEGFR阻害剤、例えばゲフィチニブまたはエルロチニブなど)、別のErbB2(HER2/neu)の阻害剤(HER2抗体、例えばトラスツズマブ、トラスツズマブ−DMl、またはペルツズマブなど)、またはEGFRおよびHER2の両方の阻害剤、例えばラパチニブなど)などから選択されることがある。

0150

実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマニチブグリベックグリーベックSTI571)またはラパチニブなどから選択されることがある。

0151

そのため、実施形態によっては、開示された抗体は、オファツムマブザノリムマブ、ダラツムマブ、ラニビズマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、hu806、ダクリズマブ(ゼナパックス)、バシリキシマブシムレクト)、インフリキシマブレミケード)、アダリムマブヒュミラ)、ナタリズマブ(タイサブリ)、オマリズマブ(ゾレア)、エファリズマブ(ラプティバ)、および/またはリツキシマブと組み合わせて使用される。

0152

実施形態によっては、上記に記載されたような障害を治療するためのCARと組み合わせた使用のための治療剤は、抗がん性のサイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組合せであることがある。適したサイトカインおよび成長因子の例としては、IFNy、IL−2、IL−4、IL−6、IL−7、IL−10、IL−12、IL−13、IL−15、IL−18、IL−23、IL−24、IL−27、IL−28a、IL−28b、IL−29、KGF、IFNa(例えばINFa2b)、IFN、GM−CSF、CD40L、Flt3リガンド、幹細胞因子アンスチム、およびTNFaが挙げられる。適したケモカインとしては、Glu−Leu−Arg(ELR)陰性のケモカイン、例えばヒトCXCおよびC−Cケモカインファミリー由来のIP−10、MCP−3、MIG、およびSDF−laなどが挙げられうる。適したサイトカインとしては、サイトカイン誘導体、サイトカインバリアント、サイトカイン断片、およびサイトカイン融合タンパク質が挙げられる。

0153

実施形態によっては、上記に記載されたような障害を治療するための、CARと組み合わせた使用のための治療剤は、細胞周期制御/アポトーシス調節物質(または「調節剤」)であることがある。細胞周期制御/アポトーシス調節物質としては、細胞周期制御/アポトーシス調節物質を標的とし調節する分子、例えば(i)cdc−25(例えばNSC663284など)、(ii)細胞周期を過剰に刺激するサイクリン依存的キナーゼ[例えばフラボピリドール(L868275、HMR1275)、7−ヒドロキシスタウロスポリン(UCN−01、KW−2401)、およびロスコビチン(R−ロスコビチン、CYC202)など]、ならびに(iii)テロメラーゼ調整物質(例えばBIBR1532、SOT−095、GRN163、および例として米国特許第6,440,735号および米国特許第6,713,055号に記載の組成物)が挙げられうる。アポトーシス経路に干渉する分子の非限定的な例としては、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)/アポトーシス2リガンド(Apo−2L)、TRAIL受容体を活性化する抗体、IFN、およびアンチセンスBcl−2が挙げられる。

0154

実施形態によっては、上記に記載されたような障害を治療するための、CARと組み合わせた使用のための治療剤は、ホルモン性調節剤、例えば、抗アンドロゲンおよび抗エストロゲン療法に有用な薬剤などであることがある。そのようなホルモン性調節剤の例は、タモキシフェンイドキシフェンフルベストラントドロロキシフェントレミフェンラロキシフェンジエチルスチルベストロールエチニルエストラジオールエスニル抗アンドロゲン剤(例えばフルタミンデ(flutaminde)/ユーレキシン)、プロゲスチン(例えば例えばヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステルメドロキシプロゲステロン/プロベラ、酢酸メゲステロール/メゲース)、副腎皮質ステロイド(例えばヒドロコルチゾンプレドニゾン)、黄体形成ホルモン放出ホルモン(およびその類似体ならびに他のLHRHアゴニスト、例えばブセレリンおよびゴセレリンなど)、アロマターゼ阻害剤(例えばアナストラゾール/アリデックス、アミノグルテチミド/シトラデン(cytraden)、エキセメスタン)、またはホルモン阻害剤(例えばオクトレオチドサンドスタチン)である。

0155

実施形態によっては、上記に記載されたような障害を治療するための、CARと組み合わせた使用のための治療剤は、抗がん性の核酸または抗がん性の阻害性RNA分子であることがある。

0156

上記に記載されるような併用投与は、同時であっても、別々であっても、連続的であってもよい。同時投与のために、薬剤は、必要に応じて、1つの組成物としても別々の組成物としても投与されてよい。

0157

実施形態によっては、本開示のCARは、放射線療法と組み合わせて投与される。放射線療法は、患者への放射線または関連する放射性医薬品の投与が行われることを含むことがある。放射線の供給源は、治療されている患者の体外としても体内としてもよい[放射線治療は、例えば、体外放射線照射療法(EBRT)の形態でも近接照射療法(BT)の形態でもよい]。そのような方法を実践する際に使用されることがある放射活性因子としては、例えば、ラジウムセシウム−137、イリジウム−192、アメリシウム−241、金−198、コバルト−57、銅−67、テクネチウム−99、ヨウ素−123、ヨウ素−131、およびインジウム−111が挙げられる。

0158

実施形態によっては、本開示のCARは、外科手術と組み合わせて投与される。

0159

CAR−T細胞は、腫瘍細胞傷害性と特異性とを亢進し、腫瘍の免疫抑制を逃れ、宿主拒絶を回避し、それらの治療半減期を延長する、いくつかの方法で設計されることがある。TRUCK(汎用的なサイトカインによる殺傷を再指向されたT細胞)T細胞は、例えば、CARを有するが、また、腫瘍の殺傷を促進するIL−12などのサイトカインを放出するように工学的に作製される。これらの細胞は、腫瘍環境局在化されると、CARの活性化の際に分子ペイロードを放出するように設計されることから、これらのCAR−T細胞はまた、時には「装甲CAR」とも称される。がん療法としてのいくつかのサイトカインが、前臨床と臨床との両方で検討されており、CAR−T療法のTRUCK形態に同様に組み込まれた際に有用であることが判明することもある。これらの中には、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−10、IL−12、IL−13、IL−15、IL−18、M−CSF、GM−CSF、IFN−α、IFN−γ、TNF−α、TRAIL、FLT3リガンド、リンホタクチン、およびTGF−βが含まれる(Dranoff 2004)。「自己駆動性」または「ホーミング」CAR−T細胞は、それらのCARに加えてケモカイン受容体を発現するように工学的に作製される。ある特定のケモカインを腫瘍内で上方制御できることから、ケモカイン受容体の組み込みは、養子T細胞への腫瘍内輸送および養子T細胞による浸潤を支援し、それによってCAR−Tの特異性と機能性との両方が亢進される(Moon 2011)。汎用性CAR−T細胞もCARを有するが、それらが内在性TCR(T細胞受容体)またはMHC(主要組織適合抗原複合体)タンパク質を発現しないように、工学的に作製される。これらの2つのタンパク質を養子T細胞療法のシグナル伝達レパートリーから除去することにより、移植片対宿主病および拒絶がそれぞれ防止される。装甲CAR−T細胞は、さらに、腫瘍の免疫抑制と腫瘍誘導性のCAR−T機能低下とを逃れる能力でよく知られる。これらの具体的なCAR−Tは、CARを有し、チェックポイント阻害物質を発現しないように工学的に作製されることがある。あるいは、これらのCAR−Tは、チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体(mAb)と共投与することができる。抗PDL1抗体の投与によって、CAR TIL(腫瘍浸潤性リンパ球)の殺傷能は有意に回復した。PD1−PDL1シグナル伝達経路およびCTLA−4−CD80/CD86シグナル伝達経路が検討されているが、その一方で、LAG−3、Tim−3、IDO−1、2B4、およびKIRを含む装甲CAR−Tの設計において他の免疫チェックポイントシグナル伝達分子を標的とすることが可能である。TILの他の細胞内阻害物質としては、ホスファターゼ(SHP1)、ユビキチンリガーゼ(すなわちcbl−b)、およびキナーゼ(すなわちジアシルグリセロールキナーゼ)が挙げられる。装甲CAR−Tはまた、腫瘍分泌性サイトカインの作用に対しそれらを保護するかまたは抵抗性にするタンパク質または受容体を発現するように、工学的に作製されることがある。例えば、TGF−β受容体の二重陰性体を形質導入されたCTL(細胞傷害性Tリンパ球)は、リンパ腫分泌性TGF−βによる免疫抑制に対し抵抗性である。これらの形質導入細胞は、対照カウンターパートに比べて、in vivoで抗腫瘍活性の著しい増加を示した。

0160

タンデムCAR−T細胞および二重CAR−T細胞は、2つの別個の抗原結合ドメインを有するという点でユニークである。タンデムCARは、細胞内共刺激ドメインおよび細胞内刺激ドメインに接続された、細胞外環境に面する2つの連続的な抗原結合ドメインを含有する。二重CARは、一方の細胞外抗原結合ドメインが細胞内共刺激ドメインに接続され、かつ第2の別個の細胞外抗原結合ドメインが細胞内刺激ドメインに接続されるように、工学的に作製される。刺激ドメインおよび共刺激ドメインが、2つの別々の抗原結合ドメインの間を分断することから、二重CARは「分断CAR」とも称される。タンデムCARと二重CARの両方の設計では、双方の抗原結合ドメインの結合が、T細胞におけるCAR回路のシグナル伝達を可能にするのに必要である。これらの2つのCARの設計は、異なる別個の抗原に対する結合親和性を有することから、「二重特異性」CARとも称される。

0161

「生きた治療薬」の形態としてのCAR−T細胞に伴う主要な懸念の1つは、in vivoでの操作性と、それらの免疫刺激性副作用の可能性である。CAR−T療法をより良く制御し、望まない副作用を防止するために、オフスイッチ、安全性機構、および条件的制御機構を含む種々の特徴が工学的に作製されている。例えば、自己破壊性CAR−T細胞と標示/タグ付CAR−T細胞の両方は、CAR発現T細胞のクリアランスを促進する「オフスイッチ」を有するように、工学的に作製される。自己破壊性CAR−Tは、CARを含有するが、また、アポトーシス促進性自殺遺伝子、または外来性分子を投与すると誘発することの可能な「排除遺伝子」を発現するように、工学的に作製される。種々の自殺遺伝子がこの目的のために採用されることがあり、そのようなものとしては、HSV−TK(単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ)、Fas、iCasp9(誘導性カスパーゼ9)、CD20、MYC TAG、および切頭型EGFR(内皮成長因子受容体)が挙げられる。例えば、HSKは、プロドラッグであるガンシクロビル(GCV)を、複製DNA内にそれ自体を取り込むGCV三リン酸に変換して、最終的には細胞死に繋げるものとなる。iCasp9は、FK506結合タンパク質の構成成分を含有するキメラタンパク質であり、FK506結合タンパク質は、小分子AP1903を結合し、カスパーゼ9の二量体化およびアポトーシスに導く。ところが、標示/タグ付CAR−T細胞は、CARを有するもののまた、選択マーカーを発現するように工学的に作製される。この選択マーカーに対するmAbの投与によって、CAR−T細胞のクリアランスが促進されるものとなる。切頭型EGFRは、そのような抗EGFR mAbによる標的化の可能な抗原の1つであり、セツキシマブの投与は、CAR−T細胞の排除を促進するように動作する。これらの特徴を有するように作製されたCARは、「スイッチ可能なCAR」のsCAR、および「調節可能なCAR」のRCARとも称される。「安全性CAR」は、「阻害性CAR”(iCAR)」としても知られ、2つの抗原結合ドメインを発現するように工学的に作製される。これらの細胞外ドメインの1つは、腫瘍関連抗原に対し指向されており、細胞内共刺激および刺激ドメインに結合されている。しかし、第2の細胞外抗原結合ドメインは、正常組織に特異的であり、CTLA4、PD1、またはCD45などの細胞内チェックポイントドメインに結合されている。複数の細胞内阻害性ドメインをiCARに組み込むことも可能である。これらの阻害性ドメインを与えうるいくつかの阻害性分子としては、B7−H1、B7−1、CD160、PIH、2B4、CEACAM(CEACAM−1、CEACAM−3、および/またはCEACAM−5)、LAG−3、TIGIT、BTLA、LAIR1、およびTGFβ−Rが挙げられる。正常組織の存在下では、この第2の抗原結合ドメインの刺激は、CARを阻害するように動作するものとなる。この二重抗原特異性があるために、iCARは二重特異性CAR−T細胞の形態でもあることに留意するべきである。安全性CAR−Tの工学は、腫瘍組織に対するCAR−T細胞の特異性を亢進し、標準的なCARでは標的外作用に繋がりかねない極めて低いレベルの腫瘍関連抗原を特定の正常組織が発現しうる状況では有利である(Morgan 2010)。条件的CAR−T細胞は、細胞内共刺激ドメインと別の細胞内共刺激因子とに接続された細胞外抗原結合ドメインを発現する。共刺激ドメイン配列および刺激ドメイン配列は、外来性分子を投与すると、結果として生じるタンパク質が細胞内で一体となりCAR回路を完成させるように、工学的に作製される。このようにして、CAR−Tの活性化は、調整が可能であり、特定の患者に「微調整」または個人仕様とさえできる可能性がある。二重CARの設計と同様に、刺激ドメインおよび共刺激ドメインは、条件的CARで不活性である際には物理的に隔てられている。この理由から、これらはまた、「分断CAR」とも称される。

0162

実施形態によっては、これらの工学的に作製された特徴のうち2つ以上を組み合わせて、亢進された多機能性CAR−Tを作製することがある。例えば、二重または条件的のどちらかのCARの設計を用いて、TRUCKのようにサイトカインも放出するCAR−T細胞を作製することが可能である。実施形態によっては、二重の条件的CAR−T細胞は、2つのCARを発現するように作ることができ、それらのCARは、2つの別個のがん抗原に対する2つの別々の抗原結合ドメインを有し、各ドメインはそれらのそれぞれの共刺激ドメインに結合する。共刺激ドメインは、活性化分子が投与された後に、刺激ドメインと共に機能的になってゆくのみとなる。このCAR−T細胞を有効にするためには、がんは両方のがん抗原を発現するものでなければならず、活性化分子が患者に投与されなければならない。それによりこの設計は、二重CAR−T細胞と条件的CAR−T細胞との両方の特徴を組み込んでいる。

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