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図面 (18)

課題・解決手段

リサウイルス抗原をコードする核酸ベースワクチン構築物は疾患の予防及び治療に有用である。リサウイルス抗原をコードする自己増幅RNA分子効力が高く長期持続性の免疫をもたらす。

概要

背景

発明の背景
リサウイルス(Lyssavirus)は、ラブドウイルス(Rhabdoviridae)科のエンベロープを有する一本鎖RNAウイルスである。リサウイルス属のメンバー狂犬病を引き起こし、全ての既知のヒトウイル性病原体の中で最も高い致死率を有する。狂犬病は感染した哺乳動物唾液を介して伝染する。向神経性ウイルスとして、それはその宿主の神経系に入り、ほぼ常に致死的である脳脊髄炎を引き起こす。現在、世界中で年間約6万人が狂犬病によって死亡しており、アジア及びアフリカの発展途上国ではイヌ咬傷によって、北米では野生生物及びコウモリによって主に引き起こされる。

狂犬病は狂暴化又は麻痺の形態で現れる。潜伏期間は約5日から数年の間で変わるが、典型的には約20から90日の間である。臨床的症状は、ほとんどの場合、倦怠感食欲不振、疲労、頭痛及び発熱前駆症状訴えから始まり、その後に曝露部位の痛み又異常感覚が続く。不安、興奮又は過敏性がこの期間中に顕著になり得、その後に多動見当識障害痙攣、恐水症唾液分泌過多、並びに最終的には、麻痺、昏睡及び死亡に至る。

実験的に、RNAワクチンウイルス構造タンパク質を欠き、ウイルス構造タンパク質の代わりに異種抗原発現するサブゲノムレプリコン由来する。それらは、ワクチン抗原をコードするRNAを担持する感染性粒子の単一回の発現を可能にするパッケージング細胞株において産生され得る。次いで、細胞質におけるRNA増幅抗原をコードするmRNAの複数のコピーを生成し、そして二本鎖RNA中間体を作製し、これは、先天性免疫の強力な刺激因子であることが知られている。従って、レプリコンRNAワクチンは、生ウイルスを使用することなく、一過性高レベルの抗原産生を達成し得る(Brito et al. (2015) Advances in Genetics 89:179-233)。

単に緩衝液を用いて製剤化されたRNA、すなわちのRNAを細胞に挿入することは遺伝子発現及び免疫応答の両方を誘導し得るが、裸のRNAのin vivo不安定性はワクチンとしてのその効力を制限する。さらに、RNAの親水性及び強い負電荷は、その細胞への取り込みを妨げる。しかしながら、細胞質への移入(transfer)は容易にすることができる。脂質ナノ粒子及びカチオン性ナノエマルジョンなどの合成送達系は、自己増幅RNAなどの核酸を、コードされた抗原を増幅及び発現することができる細胞質に効果的に移入することが実証されている。

概要

リサウイルス抗原をコードする核酸ベースワクチン構築物は疾患の予防及び治療に有用である。リサウイルス抗原をコードする自己増幅RNA分子は効力が高く長期持続性の免疫をもたらす。なし

目的

本発明は、対象においてリサウイルス病に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物の成分として有用な構築物、治療におけるその使用のための方法、並びにその製造のための方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

全長リサウイルス糖タンパク質(G)、RNAポリメラーゼ(L)、マトリックスタンパク質(M)、核タンパク質(N)又はリンタンパク質(P)、その免疫原性誘導体若しくは免疫原性断片の1つ以上から選択される抗原を含むポリペプチドをコードする、核酸ベース構築物

請求項2

前記核酸が、前記抗原のコード領域を含むRNAである、請求項1に記載の構築物。

請求項3

リサウイルス糖タンパク質(G)配列を含む、請求項1又は2に記載の構築物。

請求項4

リサウイルス核タンパク質(N)配列を含む、請求項1又は2に記載の構築物。

請求項5

前記構築物が、(a)配列番号3、配列番号5、配列番号7及び配列番号9のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列;(b)配列番号2、配列番号4、配列番号6及び配列番号8のDNA配列を含む核酸配列;並びに(c)(a)又は(b)の変異体又は断片からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の構築物。

請求項6

前記構築物がコドンを最適化されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の構築物。

請求項7

前記構築物がコドン対最適化されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の構築物。

請求項8

請求項1〜7のいずれかに記載の構築物を含むベクター

請求項9

請求項1〜7のいずれかに記載の構築物を含む自己増幅RNA分子

請求項10

抗原をコードする自己増幅RNA分子であって、配列番号2、配列番号4、配列番号6及び配列番号8からなる群より選択される核酸配列を含む、自己増幅RNA分子。

請求項11

請求項9又は10に記載の自己増幅RNA分子をコードするDNA分子

請求項12

請求項1〜7のいずれか1項に記載の構築物、請求項8に記載のベクター又は請求項9若しくは10に記載の自己増幅RNA分子のうちの1つ以上の免疫学的に有効な量を含む組成物

請求項13

RNAベースワクチンを含む、請求項12に記載の組成物。

請求項14

自己増幅RNA分子を含む、請求項13に記載の組成物。

請求項15

脂質ベースの非ウイルス送達材料を含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組成物。

請求項16

前記脂質ベースの非ウイルス送達材料が脂質ナノ粒子送達系を含む、請求項15に記載の組成物。

請求項17

前記脂質ナノ粒子(LNP)送達系が、RV28、RV31、RV33、RV37、RV39、RV42、RV44、RV73、RV75、RV81、RV84、RV85、RV86、RV88、RV91、RV92、RV93、RV94、RV95、RV96、RV97、RV99、及びRV101からなる群より選択される、請求項16に記載の組成物。

請求項18

前記脂質ベースの非ウイルス送達材料が、脂質カチオン性マイクロエマルジョン送達系を含む、請求項15に記載の組成物。

請求項19

前記脂質カチオン性マイクロエマルジョン送達系がCNE56を含む、請求項18に記載の組成物。

請求項20

前記組成物が追加の抗原をコードする核酸配列をさらに含む、及び/又は前記組成物が追加の抗原をさらに含む、請求項12〜19のいずれか1項に記載の組成物。

請求項21

前記組成物が、追加の抗原をコードする配列を含む核酸を含むさらなる組成物と組み合わせて対象に投与するために薬学的に許容されるものである、及び/又は前記組成物が、追加の抗原を含むさらなる組成物と組み合わせて対象に投与するために薬学的に許容されるものである、請求項12〜20のいずれか1項に記載の組成物。

請求項22

1つ以上のアジュバントを含む、請求項12〜21のいずれか1項に記載の組成物。

請求項23

1.5ug、1.0ug、500ng、250ng、125ng、75ng、50ng又は25ngなどの2ug以下の核酸ベースの構築物を含む、請求項12〜22のいずれか1項に記載の組成物。

請求項24

抗原をコードする自己増幅RNA分子を含む組成物であって、該自己増幅RNA分子が、配列番号2、配列番号4、配列番号6及び配列番号8からなる群より選択される核酸配列を含み、かつ1.5ug、1.0ug、500ng、250ng、125ng、75ng、50ng又は25ngなどの2ug以下の核酸構築物を含む、組成物。

請求項25

それを必要とする対象においてリサウイルスによって引き起こされる疾患に対する免疫応答誘導する方法であって、請求項1〜7のいずれか1項に記載の構築物、請求項8に記載のベクター、請求項9若しくは10に記載の自己増幅RNA分子、又は請求項12〜22のいずれか1項に記載の組成物のうちの1つ以上を含む組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与することを含む方法。

請求項26

前記対象がヒトである、請求項25に記載の方法。

請求項27

請求項8に記載のベクター又は請求項11に記載のDNAを転写して、前記抗原のコード領域を含むRNAを生成する工程を含む、RNAベースのワクチンを生成する方法。

請求項28

前記転写がin vitroである、請求項27に記載の方法。

請求項29

前記転写がin vivoである、請求項27に記載の方法。

請求項30

前記抗原のコード領域を含むRNAを送達系で製剤化する工程をさらに含む、請求項27〜29のいずれか1項に記載の方法。

請求項31

前記送達系が脂質ナノ粒子送達系を含む、請求項30に記載の方法。

請求項32

前記送達系が、カチオン性ナノエマルジョン送達系を含む、請求項30に記載の方法。

請求項33

前記抗原のコード領域を含むRNAと、アジュバントを含む追加の組成物とを合わせる工程をさらに含む、請求項27〜32のいずれか1項に記載の方法。

請求項34

対象におけるリサウイルス疾患に対する免疫応答を誘導するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載の構築物、請求項8に記載のベクター、請求項9若しくは10に記載の自己増幅RNA分子、又は請求項12〜14のいずれか1項に記載の組成物の使用。

請求項35

対象におけるリサウイルス疾患に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における、請求項1〜7のいずれか1項に記載の構築物、請求項8に記載のベクター、請求項9若しくは10に記載の自己増幅RNA分子、又は請求項12〜14のいずれか1項に記載の組成物の使用。

請求項36

本明細書に実質的に記載される組成物、構築物、ベクター、DNA分子、自己増幅RNA分子、方法、プロセス又は使用。

技術分野

0001

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
本発明は、DARPAにより授与された契約番号HR0011-12-3-0001に基づく米国政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

0002

発明の分野
本発明は、ウイルス疾患治療及び予防する分野におけるものである。特に、本発明は、リサウイルス抗原をコードする自己増幅RNA分子に関する。本発明は、狂犬病を治療及び予防するためのリサウイルス抗原の使用を含む。

背景技術

0003

発明の背景
リサウイルス(Lyssavirus)は、ラブドウイルス(Rhabdoviridae)科のエンベロープを有する一本鎖RNAウイルスである。リサウイルス属のメンバーは狂犬病を引き起こし、全ての既知のヒトウイル性病原体の中で最も高い致死率を有する。狂犬病は感染した哺乳動物唾液を介して伝染する。向神経性ウイルスとして、それはその宿主の神経系に入り、ほぼ常に致死的である脳脊髄炎を引き起こす。現在、世界中で年間約6万人が狂犬病によって死亡しており、アジア及びアフリカの発展途上国ではイヌ咬傷によって、北米では野生生物及びコウモリによって主に引き起こされる。

0004

狂犬病は狂暴化又は麻痺の形態で現れる。潜伏期間は約5日から数年の間で変わるが、典型的には約20から90日の間である。臨床的症状は、ほとんどの場合、倦怠感食欲不振、疲労、頭痛及び発熱前駆症状訴えから始まり、その後に曝露部位の痛み又異常感覚が続く。不安、興奮又は過敏性がこの期間中に顕著になり得、その後に多動見当識障害痙攣、恐水症唾液分泌過多、並びに最終的には、麻痺、昏睡及び死亡に至る。

0005

実験的に、RNAワクチンウイルス構造タンパク質を欠き、ウイルス構造タンパク質の代わりに異種抗原発現するサブゲノムレプリコン由来する。それらは、ワクチン抗原をコードするRNAを担持する感染性粒子の単一回の発現を可能にするパッケージング細胞株において産生され得る。次いで、細胞質におけるRNA増幅は抗原をコードするmRNAの複数のコピーを生成し、そして二本鎖RNA中間体を作製し、これは、先天性免疫の強力な刺激因子であることが知られている。従って、レプリコンRNAワクチンは、生ウイルスを使用することなく、一過性高レベルの抗原産生を達成し得る(Brito et al. (2015) Advances in Genetics 89:179-233)。

0006

単に緩衝液を用いて製剤化されたRNA、すなわちのRNAを細胞に挿入することは遺伝子発現及び免疫応答の両方を誘導し得るが、裸のRNAのin vivo不安定性はワクチンとしてのその効力を制限する。さらに、RNAの親水性及び強い負電荷は、その細胞への取り込みを妨げる。しかしながら、細胞質への移入(transfer)は容易にすることができる。脂質ナノ粒子及びカチオン性ナノエマルジョンなどの合成送達系は、自己増幅RNAなどの核酸を、コードされた抗原を増幅及び発現することができる細胞質に効果的に移入することが実証されている。

発明が解決しようとする課題

0007

非常に有効で、安全かつ簡便で、費用効果があり、長時間持続性であり、また広スペクトルの免疫応答を誘導する、リサウイルスにより引き起こされる疾患などの疾患に対する新規免疫方法ニーズが残されている。したがって、ワクチン抗原、特にリサウイルス抗原を効果的に送達することができるベクターに対する需要がある。リサウイルス予防法現在利用可能であるが、曝露の前と後の両方で多数回の投与が必要とされ、接種率は低く、医学的恩恵を減少させる。簡素化された投与スケジュール、向上した安全性、及び増強された製造プロファイルを有する改善されたリサウイルスワクチンが必要とされている。

課題を解決するための手段

0008

発明の概要
本発明は、対象においてリサウイルス病に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物の成分として有用な構築物、治療におけるその使用のための方法、並びにその製造のための方法を提供する。

0009

本発明の第1の態様は、全長リサウイルスタンパク質又はその免疫原性断片を含む又はそれからなる1つ以上のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む又はそれからなる、核酸ベースワクチン構築物を提供する。あるいは又はさらに、リサウイルスタンパク質は、糖タンパク質(G)、RNAポリメラーゼ(L)、マトリックスタンパク質(M)、核タンパク質(N)及びリンタンパク質(P)からなる群より選択される。

0010

あるいは又はさらに、ポリペプチドは、全長リサウイルス糖タンパク質又はその免疫原性断片を含む。あるいは又はさらに、リサウイルス糖タンパク質は、Flury high egg passage(「HEP」)狂犬病Gタンパク質GenBankでAGN9427.1と称する)である。別の好ましい実施形態において、リサウイルス糖タンパク質は、Flury low egg passage(「LEP」)狂犬病Gタンパク質(GenBankでGU565703.1と称する)である。あるいは又はさらに、リサウイルス糖タンパク質はFlury LEP狂犬病Gタンパク質のコドン最適化形態である。あるいは又はさらに、リサウイルス糖タンパク質はFlury LEP狂犬病Gタンパク質のコドン対最適化形態である。

0011

本発明の第2の態様は、核酸ベースのワクチン構築物を含む又はそれからなるベクターを提供する。

0012

本発明の第3の態様は、核酸ベースのワクチン構築物を含む又はそれからなる自己増幅RNA分子を提供する。本発明の自己増幅RNA分子はビリオンに含まれず、本発明の構築物はタンパク質カプシドを含まない。カプシドを作成する必要性を回避することにより、本発明はパッケージング細胞株を必要とせず、したがって商業生産のための容易なアップスケーリングを可能にし、危険な感染性ウイルス不注意生産されるリスクを最小限に抑える。

0013

本発明の第4の態様は、自己増幅RNA分子をコードするDNA分子を提供する。

0014

本発明の第5の態様は、本明細書に記載の構築物、ベクター又は自己増幅RNA分子のうちの1つ以上を含む又はそれからなる組成物を提供する。あるいは又はさらに、組成物は、構築物、ベクター又は自己増幅RNA分子のうちの1つ以上の免疫学的に有効な量を含む又はそれからなる。

0015

あるいは又はさらに、組成物は、RNAベースのワクチンを含む又はそれからなる。

0016

本発明の第6の態様は、それを必要とする対象においてリサウイルス疾患に対する免疫応答を誘導するための方法であって、本明細書に記載の構築物、ベクター又は自己増幅RNA分子のうちの1つ以上を含む組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与することを含む方法を提供する。

0017

本発明の第7の実施形態は、本明細書に記載の自己増幅RNA分子をコードするベクター又はDNA分子を転写して、リサウイルス抗原のコード領域を含むRNAを生成する工程を含む、RNAベースのワクチンを生成する方法を提供する。

0018

本発明の第8の態様は、本明細書に記載の方法によって生成される組成物を提供する。

0019

本発明の第9の態様は、対象におけるリサウイルスにより引き起こされる疾患に対する免疫応答を誘導するための、本明細書に記載の構築物、ベクター、自己増幅RNA分子、又は組成物の使用を提供する。

0020

本発明の第10の態様は、医薬に使用するための、本明細書に記載の構築物、ベクター、自己増幅RNA分子、又は組成物を提供する。

0021

本発明の第11の態様は、(例えば防御的免疫応答を誘導することによる)対象におけるリサウイルスにより引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、本明細書に記載の構築物、ベクター、自己増幅RNA分子、又は組成物を提供する。

0022

本発明の第12の態様は、対象におけるリサウイルス疾患に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における、本明細書に記載の構築物、ベクター、自己増幅RNA分子、又は組成物の使用を提供する。

0023

本発明の第13の態様は、ヒトにおいて免疫原性である2μg以下の量の、本明細書に記載の構築物、ベクター、自己増幅RNA分子、又は組成物のヒト用量を提供する。

図面の簡単な説明

0024

図1A:SAM狂犬病構築物の模式図。「NSP」は、非構造タンパク質をコードするウイルスRNAを指す。狂犬病G抗原はNSPの3'側にコードされている。構築物1:FluryHEP狂犬病G;構築物2:FluryLEP狂犬病G;構築物3:コドン最適化Flury LEP狂犬病G;構築物4:コドン対最適化Flury LEP狂犬病G。
図1B:構築物1〜4のDNA配列アラインメント。この図はもともとカラーであり、その後、白黒改訂された。ここで、明細書はこの図に関連する色を指し、次の手がかりがこの図に適用される:黄=修飾なし;青=イタリック体;緑=下線;白=太字
図1Bの続き1。
図1Bの続き2。
図1Bの続き3。
図2A:BHK細胞における構築物1〜4による狂犬病糖タンパク質(G)抗原のウェスタンブロット発現。
図2B:ペプチドN-グリコシダーゼA(PNGase A)処理前後の構築物1及び3による狂犬病糖タンパク質(G)抗原のウェスタンブロット発現。
図3A:35日目のRABAVERTと比較した、14日目にCNE又はLNPで製剤化したSAM構築物1〜4によりBalb/cマウスにおいて誘導された中和抗体(nAb)力価迅速蛍光フォーカス抑制試験(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test:RFFIT)により測定し、幾何平均力価(GMT)で表した。
図3B:35日目のRABAVERTと比較した、35日目にCNE又はLNPで製剤化したSAM構築物1〜4によりBalb/cマウスにおいて誘導された中和抗体(nAb)力価。迅速蛍光フォーカス抑制試験(RFFIT)により測定し、幾何平均力価(GMT)で表した。
図4:CNE又はLNPで製剤化した構築物4のBalb/cマウスにおける免疫後6ヶ月間のRFFITにより測定した中和抗体(nAb)力価。RABAVERT(丸);CNE中1.5ugの構築物4(四角);LNP中0.15ugの構築物4(三角);LNP中1.5ugの構築物4(逆三角)。
図5A:14日目。CNE又はLNPで製剤化した構築物4のBalb/cマウスにおけるRFFITにより測定した中和抗体(nAb)力価で、免疫原性との用量応答関係を示す。上の破線は100IU/mlのベンチマークを示し、これは高用量でRABAVERTによって誘発されることが観察されるピークnAb力価である。下の破線は免疫原性閾値0.5IU/mlを示す。
図5B:35日目。CNE又はLNPで製剤化した構築物4のBalb/cマウスにおけるRFFITにより測定した中和抗体(nAb)力価で、免疫原性との用量応答関係を示す。上の破線は100IU/mlのベンチマークを示し、これは高用量でRABAVERTによって誘発されることが観察されるピークnAb力価である。下の破線は免疫原性閾値0.5IU/mlを示す。
図6:0、1及び3週での完全ヒト用量のRABAVERT免疫と比較した、0、8及び24週での構築物4の免疫の非ヒト霊長類におけるRFFITにより測定した中和抗体(nAb)力価。上図は、CNEに製剤化された4つの用量の構築物4の中和抗狂犬病抗体力価を示す。150ug(四角);75ug(三角);15ug(逆三角);3ug(黒丸);RABAVERT(白丸)。上側の破線は免疫原性の防御閾値を示し、log0.1の下側の点線定量下限LLOQ)を示す。下図はLNPに製剤化された4つの用量の構築物4の中和抗狂犬病抗体力価を示す。75ug(三角);15ug(逆三角);3ug(黒丸);RABAVERT(白丸)。上側の破線は免疫原性の防御閾値を示し、log0.1の下側の点線は定量下限(LLOQ)を示す。
図7:0、1及び3週での完全ヒト用量のRABAVERT免疫と比較した、0、8及び24週での構築物4の免疫の非ヒト霊長類におけるELISAにより測定したIgG力価。上図は、CNEに製剤化された4つの用量の構築物4の抗狂犬病IgG力価を示す。150ug(四角);75ug(三角);15ug(逆三角);3ug(黒丸);RABAVERT(白丸)。上側の破線は免疫原性の防御閾値を示し、log0.1の下側の点線は定量下限(LLOQ)を示す。下図は、RV39 LNPに製剤化された構築物4の4つの用量の抗狂犬病IgG力価を示す。75ug(三角);15ug(逆三角);3ug(黒丸);RABAVERT(白丸)。上側の破線は免疫原性の防御閾値を示し、log0.1の下側の点線は定量下限(LLOQ)を示す。
図8:15pg〜1.5ugの用量範囲のLNP又はCNE 15ug中の構築物4のマウスにおけるRFFITにより測定した中和抗体力価の用量応答性。上図は、1日目の単回用量後6ヶ月間の中和抗体力価を示している。下図は、1日目と22日目の2回用量後6ヶ月間の中和抗体力価を示している。RABAVERT(白丸);LNP 1.5ug(白四角);LNP 0.15ug(白三角);LNP 0.015ug(白逆三角);LNP 0.0015ug(黒四角);LNP 0.00015ug(黒三角);LNP 0.000015ug(黒逆三角);CNE 15ug(黒丸)。上側の破線は免疫原性の防御閾値を示し、log0.1未満の下側の点線は定量下限(LLOQ)を示す。以下の所見が認められた。以前の狂犬病SAM研究と同様の抗体レベルが、より低いRNA用量で用量応答で誘導された。15ピコグラムという低用量での単回免疫は、マウスで試験した6ヶ月間の期間にわたって維持された、かなりの安定したレベルの狂犬病中和抗体を誘導した。このレベルは2回目の免疫によってブーストされ、3回のRABAVERT免疫よりも有意に高いままであった。
図9:CNE中に製剤化された構築物4の単回15ug用量によるマウスにおける特異的多機能性CD8+T細胞応答。Th1サイトカインであるIL-2、TNFα、インターフェロンγ及びCD107aは、狂犬病抗原ペプチドによって刺激された。CD4+及びCD8+T細胞におけるそれらの発現は、それぞれ上と下のパネルに示されている。ワクチン接種群(8匹)を生理食塩水対照群(5匹)と比較した。各群の細胞を狂犬病抗原ペプチド又は培地対照のいずれかに曝露した。
図10:2回用量(1日及び22日)後6ヶ月間における15pg〜0.15ugの用量範囲の構築物4のマウスにおけるRFFITにより測定した中和抗体力価の用量応答性。構築物4は、LNP RV39又はLNP RV94のいずれかで製剤化された。RABAVERT(白丸);0.15ug RV39(白四角);0.15ug RV94(破線四角);0.0015ug RV39(白三角);0.0015ug RV94(破線三角);0.000015ug RV39(白逆三角);0.000015ug RV94(破線逆三角)。RV39及びRV94 LNP製剤はいずれも同様の狂犬病nAb力価をもたらすが、RV39では寿命が長いことが観察された。
図11:2回用量(1日及び22日)後6ヶ月間における15pg〜0.15ugの用量範囲の構築物4のマウスにおけるELISAにより測定したIgGの用量応答性。構築物4は、LNP RV39又はLNP RV94のいずれかで製剤化された。RABAVERT(白丸);0.15ug RV39(白四角);0.15ug RV94(破線四角);0.0015ug RV39(白三角);0.0015ug RV94(破線三角);0.000015ug RV39(白逆三角);0.000015ug RV94(破線逆三角)。

実施例

0025

配列の説明
列番号1:ベクター骨格−VEE TC83(空ベクター)
配列番号2:構築物1コード配列
配列番号3:構築物1アミノ酸配列
配列番号4:構築物2 コード配列
配列番号5:構築物2 アミノ酸配列
配列番号6:構築物3 コード配列
配列番号7:構築物3 アミノ酸配列
配列番号8:構築物4 コード配列
配列番号9:構築物4 アミノ酸配列

0026

発明の詳細な説明
リサウイルスワクチン
ラブドウイルス(Rhabdoviridae)科の属であるリサウイルスは、一本鎖アンチセンスRNAゲノムを有するエンベロープウイルスである。これは中枢神経系を介して広がる神経向性ウイルスであり、脳と脊髄重度の炎症を引き起こす。このRNAは、糖タンパク質(G)、ウイルスRNAポリメラーゼ(L)、マトリックスタンパク質(M)、核タンパク質(N)、及びリンタンパク質(P)の5つの遺伝子をコードする。Gタンパク質は防御中和抗体の主要な標的である。

0027

リサウイルス属は7つの遺伝子型を含み、そのうち次の6つはヒト狂犬病の症例と関連付けられている:狂犬病ウイルス(RABV、遺伝子型1)、モコラ(Mokola)ウイルス(遺伝子型3)、ドゥベンヘイグ(Duvenhage)ウイルス(遺伝子型4)、ヨーロッパコウモリリサウイルス(遺伝子型5)、ヨーロッパコウモリリサウイルス2(遺伝子型6)、及びオーストラリアコウモリリサウイルス(遺伝子型7)。症状が発症すると、狂犬病はほぼ100パーセント致死的である。

0028

ワクチン接種は、感染性疾患を予防するための最も有効な方法の1つである。しかし、抗原の単回投与は、完全な免疫及び/又は長期持続性の応答を付与するのに十分でないことが多い。現在、狂犬病には複数用量ワクチン接種が必要である。特定の病原体に対する強力かつ持続的な免疫を確立するためのアプローチには、ワクチンへのアジュバントの添加及び/又は反復ワクチン接種、すなわち、抗原の1回以上のさらなる用量の投与による免疫応答のブーストが含まれる。そのようなさらなる投与は、同じワクチンで(同種の追加免疫)又は異なるワクチンで(異種の追加免疫)実行され得る。同種の追加免疫の最も一般的なアプローチは、同じワクチンを投与するだけでなく、以前の投与と同じ用量で投与することでもある。

0029

狂犬病ワクチンは現在主に曝露後予防に使用されており、狂犬病ワクチン用量の低いパーセンテージのみが曝露前予防に使用されている。介入スケジュールは、ウイルスが侵入する創傷重症度及び種類に基づいて世界保健機関によって規定されており、抗狂犬病免疫グロブリンによる追加の治療を含み得る。曝露前予防は、典型的には、曝露リスクに応じてタイミングを調整した追加免疫を用いた2〜3回の筋肉内用量のための2〜3回の訪問を含む。曝露後予防は、典型的には、4〜5回の筋肉内用量のための3〜5回の訪問、又は4回の皮内用量のための4回の訪問を含む。一部の発展途上国では、感染した動物の脳内で狂犬病ウイルスを増殖させ、ウイルスを不活化し、腹壁内に皮下で14〜21回、毎日注射することによって未だ免疫が行われている。

0030

現在、いくつかの狂犬病ワクチンが曝露前及び曝露後予防の両方でヒトでの使用に利用可能であり、特定の投与レジメンで投与される場合には規制当局によって承認されている。IMOVAX(Sanofi Pasteur)は、Wistar Instituteから得られた株PM-1503-3Mから調製された凍結乾燥狂犬病ウイルスとして提供されている。それは感染したヒト二倍体細胞から採取され、次いで不活化される。曝露前及び曝露後予防は両方とも、0、7及び21又は28日目に筋肉内投与される3回用量からなる。VERORAB(Sanofi Pasteur)は、Wistar Instituteから得られた株PM/WI 38 1503-3Mから調製される凍結乾燥狂犬病ウイルスとして提供される。それはVero細胞から回収され、次いで不活化される。曝露前予防は、0、7及び21又は28日目に筋肉内投与される3回用量からなる。曝露後予防は、0、3、7、14及び28日目に筋肉内投与される5回用量からなる。VAXIRAB/LYSSAVAC(Zydus Cadila/Novavax)は、狂犬病ウイルスのPitman Moore株から調製された凍結乾燥狂犬病ウイルスとして提供される。それはアヒル胚細胞において産生され、次いで不活化される。曝露前予防は、0、7及び21又は28日目に筋肉内投与される3回用量からなる。曝露後予防は、0、3、7、14及び28日目に筋肉内投与される5回用量からなる。曝露後予防も皮内投与することができ、0、3、7及び28日目に2つの部位の各々に注射することができる。RABAVERT(GSK)は、FluryLEP(low egg passage:低継代)株から調製される凍結乾燥狂犬病ウイルスとして提供される。それはニワトリ線維芽細胞初代培養物中で増殖され、次いで不活化される。曝露前予防は、0、7及び21又は28日目に筋肉内投与される3回用量からなる。曝露後予防は、0、3、7、14及び28日目に筋肉内投与される5回用量からなる。

0031

RABAVERT中に存在する狂犬病ウイルス株FluryLEPは、59代目の卵継代としてアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。ウイルスの増殖のための増殖培地は、ヒトアルブミン、加工ウシゼラチンポリリン)及び抗生物質を添加した合成細胞培養培地である。ウイルスをβ-プロピオラクトンで不活化し、ショ糖密度勾配でのゾーン遠心分離によってさらに処理する。このワクチンを、緩衝化ポリゲリン及びグルタミン酸カリウムの安定剤溶液の添加後に凍結乾燥する。1用量(1.0ml)のRABAVERTの効力は、約2.5IU狂犬病抗原である。

0032

核酸ベースの狂犬病ワクチンは過去に試みられてきたが、RABAVERTよりも劣っていることが証明されている。糖タンパク質遺伝子をコードする狂犬病DNAワクチン及び糖タンパク質遺伝子をコードする狂犬病自己増幅RNAワクチンを、RABAVERTと直接比較した。RABAVERTをワクチン接種したマウスは、狂犬病Gタンパク質を発現するシンドビス(Sindbis)ウイルスRNAレプリコン又は狂犬病Gタンパク質を発現するDNAワクチンのいずれかをワクチン接種したマウスよりも、より強力なT細胞増殖反応、サイトカイン産生の増加、及びより高い抗体力価を示した。シンドビスウイルスレプリコンワクチンはまた、狂犬病チャレンジに対する防御においてRABAVERTよりも劣っていた(Saxena et al. (2009) Veterinary Microbiol. 136:36)。

0033

抗原、変異体、断片及び構築物
本発明は、対象におけるリサウイルスによって引き起こされる疾患に対する免疫応答の誘導のための免疫原性組成物の成分として有用な構築物を提供する。これらの構築物は、抗原の発現、処置におけるそれらの使用のための方法、及びそれらの製造のための方法に有用である。「構築物」は遺伝子操作された分子である。「核酸構築物」は遺伝子操作された核酸を指し、DNA、RNA、又は非天然核酸モノマーを含み得る。

0034

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、リサウイルスの野生型ポリペプチド配列、その変異体又は断片をコードする。構築物は、リサウイルスのポリペプチド配列に対して異種のポリペプチド配列をさらにコードし得る。いくつかの実施形態において、構築物は、CVS11、CVS-N2C、Evelyn Rokitniki Abelset(ERA)、Flury、Pitman Moore又はWistar株のリサウイルスタンパク質のポリペプチド配列の野生型、変異体及び/又は断片をコードする。このような抗原は、狂犬病ウイルス糖タンパク質(G)、RNAポリメラーゼ(L)、マトリックスタンパク質(M)、核タンパク質(N)及びリンタンパク質(P)に由来し得る。

0035

ポリぺプチド配列の「変異体(バリアント)」は、基準配列と比較した場合、1つ以上のアミノ酸の付加、置換及び/又は欠失を有するアミノ酸配列を含む。変異体は、全長野生型ポリペプチド、例えば、配列番号3、配列番号5、配列番号7又は配列番号9によるポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含み得る。あるいは又はそれに加えて、ポリペプチドの断片は、全長ポリペプチドの連続アミノ酸配列と同一である少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも20、又はそれ以上のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る、全長ポリペプチドの免疫原性断片(すなわち、エピトープ含有断片)を含み得る。

0036

リサウイルスG抗原が野生型リサウイルス糖タンパク質の変異体である場合、変異体は、全長野生型ポリペプチド、例えば、配列番号3、配列番号5、配列番号7又は配列番号9によるポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなってもよい。あるいは又はさらに、ポリペプチドの断片は、全長ポリペプチドの連続アミノ酸配列と同一である少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも20、又はそれ以上のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る、全長ポリペプチドの免疫原性断片(すなわち、エピトープ含有断片)を含み得る。

0037

明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して、体液性及び/又は細胞性抗原特異的免疫応答(すなわち、天然ポリペプチドを特異的に認識する免疫応答)を生じる1つ以上のエピトープ(例えば、直鎖状コンホメーション状、又はその両方)を含む分子をいう。「エピトープ」は、その免疫特異性を決定する抗原の部分である。

0038

T細胞及びB細胞エピトープは経験的に(例えば、PEPSCAN又は類似の方法を使用して)同定し得る。それらはまた、公知の方法(例えば、Jameson- Wolf抗原性インデックスマトリックスベースのアプローチ、TEPITOPE、ニューラルネットワーク、OptiMer&EpiMer、ADEPT、Tsites、親水性又は抗原性インデックスを使用する)によって予測し得る。

0039

あるいは又はさらに、本明細書中の構築物は、リサウイルスG抗原をコードする。「リサウイルスG抗原」とは、野生型リサウイルス糖タンパク質、その変異体、又は断片のアミノ酸配列、又はアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意図する。図1は、いくつかの全長リサウイルスGタンパク質変異体の核酸コード配列を同定する。

0040

あるいは又はさらに、ワクチン構築物の交差防御範囲は、抗原のメドイド(medoid)配列を含めることによって増大させることができる。「メドイド(medoid)」とは、他の配列に対して最小限の非類似性を有する配列を意味する。あるいは又はさらに、本発明のベクターは、狂犬病G糖タンパク質又はその免疫原性断片のメドイド配列を含む。あるいは又はさらに、本発明の自己増幅RNA構築物は、狂犬病G糖タンパク質のメドイド配列を含む。あるいは又はさらに、メドイド配列は、NCBIデータベースにおいて注釈された全ての狂犬病Gタンパク質配列の中でアミノ酸同一性の平均のパーセントが最も高い天然ウイルス株に由来する。あるいは又はさらに、狂犬病G糖タンパク質のメドイド配列はNCBI株AGN94271である。

0041

遺伝暗号縮重性の結果として、ポリペプチドは、種々の異なる核酸配列によってコードされ得る。コード化は、いくつかの同義コドン、すなわち同じアミノ酸をコードするコドンを、他のものよりも使用するように偏っている。「コドン最適化」とは、組換え核酸のコドン構成における修飾がアミノ酸配列を変化させることなく行われることを意図する。コドン最適化は、生物特異的コドン使用頻度を使用することによって、異なる生物におけるmRNA発現を改善するために使用されてきた。

0042

コドン偏りに加えて及びそれとは独立して、いくつかの同義コドン対が、他のものよりも高頻度で使用される。このコドン対の偏りは、いくつかのコドン対が過剰提示され、他のコドン対が過小提示されることを意味する。コドン対脱最適化は、ウイルス毒性を減少させるために使用されてきた。例えば、過小提示されるコドン対を含むように改変されたポリオウイルスは野生型ポリオウイルスと比較して、減少した翻訳効率を実証し、そして弱毒化されたことが報告されている(WO 2008/121992;Coleman et al. (2008) Science 320:1784)。Coleman et al.は、コドン対の脱最適化によって合成弱毒化ウイルスを操作することによって、野生型と同じアミノ酸配列をコードしながらも、同義コドンの異なるペアワイズ配置を使用するウイルスを作り出すことができることを示した。コドン対脱最適化によって弱毒化されたウイルスは野生型と比較して1000倍まで少ないプラークを生成し、より少ないウイルス粒子を生成し、そしてプラークを形成するために約100倍多くのウイルス粒子を必要とした。

0043

対照的に、ヒトゲノムにおいて過剰提示されるコドン対を含むように改変されたポリオウイルスは野生型RNAと同様の様式で作用し、そして野生型RNAとサイズが同一のプラークを生成した(Coleman et al. (2008) Science 320:1784)。これは、過剰提示されたコドン対を有するウイルスが過少提示されたコドン対を有するウイルスと同様の数の突然変異を含み、野生型と比較して翻訳の増強を示したという事実にもかかわらず起こった。この観察は、コドン対最適化構築物がそれらの非コドン対最適化対応物と同様の様式で作用することが予想され、そして機能的利点を提供することが予想されないことを示唆する。

0044

あるいは又はさらに、本発明の構築物はコドン最適化核酸配列を含む。あるいは又はさらに、本発明の自己増幅RNA構築物は、狂犬病糖タンパク質又はその免疫原性誘導体若しくは断片のコドン最適化配列を含む。あるいは又はさらに、本発明の自己増幅RNA構築物は、FluryLEP野生型狂犬病糖タンパク質又はその免疫原性誘導体若しくは断片のコドン最適化配列を含む。

0045

あるいは又はさらに、本発明の構築物は、コドン対最適化核酸配列を含む。あるいは又はさらに、本発明の自己増幅RNA構築物は、狂犬病糖タンパク質又はその免疫原性誘導体若しくは断片のコドン対最適化配列を含む又はそれからなる。あるいは又はさらに、本発明の自己増幅RNA構築物は、FluryLEP野生型狂犬病糖タンパク質又はその免疫原性誘導体若しくは断片のコドン対最適化配列を含む又はそれからなる。

0046

あるいは又はさらに、本明細書中の構築物は、リサウイルスL抗原をコードする。「リサウイルスL抗原」とは、既知の野生型リサウイルスRNAポリメラーゼ、その変異体又は断片のアミノ酸配列、又はアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意図する。したがって、リサウイルスL抗原が野生型リサウイルスRNAポリメラーゼの変異体である場合、変異体は、全長野生型ポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含み得る。あるいは又はさらに、ポリペプチドの断片は、全長ポリペプチドの連続アミノ酸配列と同一である少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも20、又はそれ以上のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含み得る全長ポリペプチドの免疫原性断片(すなわち、エピトープ含有断片)を含み得る。

0047

あるいは又はさらに、本明細書中の構築物は、リサウイルスM抗原をコードする。「リサウイルスM抗原」とは、既知の野生型リサウイルスマトリックスタンパク質、その変異体又は断片のアミノ酸配列、又はアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意図する。したがって、リサウイルスM抗原が野生型リサウイルスマトリックスタンパク質の変異体である場合、変異体は、全長野生型ポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含み得る。あるいは又はさらに、ポリペプチドの断片は、全長ポリペプチドの連続アミノ酸配列と同一である少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも20、又はそれ以上のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含み得る全長ポリペプチドの免疫原性断片(すなわち、エピトープ含有断片)を含み得る。

0048

あるいは又はさらに、本明細書中の構築物は、リサウイルスN抗原をコードする。「リサウイルスN抗原」とは、野生型リサウイルス核タンパク質、その変異体又は断片のアミノ酸配列、又はアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意図する。したがって、リサウイルスN抗原が野生型リサウイルス核タンパク質の変異体である場合、変異体は、全長野生型ポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含み得る。あるいは又はさらに、ポリペプチドの断片は、全長ポリペプチドの連続アミノ酸配列と同一である少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも20、又はそれ以上のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含み得る全長ポリペプチドの免疫原性断片(すなわち、エピトープ含有断片)を含み得る。

0049

あるいは又はさらに、本明細書中の構築物は、リサウイルスP抗原をコードする。「リサウイルスP抗原」とは、既知の野生型リサウイルスリンタンパク質、その変異体又は断片のアミノ酸配列、又はアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意図する。したがって、リサウイルスP抗原が野生型リサウイルスリンタンパク質の変異体である場合、変異体は、全長野生型ポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含み得る。あるいは又はさらに、ポリペプチドの断片は、全長ポリペプチドの連続アミノ酸配列と同一である少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも20、又はそれ以上のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含み得る全長ポリペプチドの免疫原性断片(すなわち、エピトープ含有断片)を含み得る。

0050

あるいは又はさらに、構築物はポリペプチドの複数の要素をコードする。要素は隣接する要素のすぐ隣に、すなわちいかなる介在アミノ酸もなしに並置される。あるいは又はさらに、1、2、3、4又は5アミノ酸のリンカー基が、1つ以上のポリぺプチド要素の間に存在する。

0051

あるいは又はさらに、構築物は、1つ以上の抗原を含むRNA核酸配列を含む。複数の抗原を、本発明の構築物によって同時送達することができる。本発明の構築物は、第1のリサウイルス抗原をコードする第1の配列、及び任意に、リサウイルス抗原であってもなくてもよい第2の抗原を含有する組換えポリシストロン核酸分子を含む又はそれからなる。所望であれば、追加の抗原(例えば、第3の抗原、第4の抗原、第5の抗原など)をコードする1つ以上の追加の配列が、組換えRNA中に存在し得る。あるいは又はさらに、本発明の構築物は、ポリシストロン性であり得る。

0052

ポリペプチド
「ポリペプチド」とは、配列を規定し、アミド結合によって連結された複数の共有結合したアミノ酸残基を意味する。この用語は、ペプチドと交換可能に使用される。ペプチドという用語は、当技術分野で知られているように、化学反応又は酵素触媒反応によって導入される翻訳後修飾包含する。この用語は、ポリペプチドの変異体又は断片を指すこともある。

0053

あるいは又はさらに、本明細書中のポリペプチドは非天然形態(例えば、組換え形態又は修飾形態)である。本発明のポリペプチドは、C末端及び/又はN末端共有結合修飾を有し得る。それらはまた、種々の形態(例えば、天然、融合、グリコシル化非グリコシル化、脂質化、非脂質化、リン酸化非リン酸化ミリストイル化、非ミリストイル化、単量体多量体、粒状、変性など)をとり得る。ポリペプチドは天然又は非天然にグリコシル化され得る(すなわち、ポリペプチドは、対応する天然ポリペプチドにおいて見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有し得る)。

0054

本明細書中のポリペプチドの非天然形態は、リサウイルス抗原配列に加えて、1つ以上の異種アミノ酸配列(例えば、別の抗原配列、別のシグナル配列、検出可能なタグなど)を含み得る。例えば、本明細書中のポリペプチドは、融合タンパク質であり得る。あるいは又はさらに、ポリペプチドのアミノ酸配列又は化学構造は、天然ポリペプチド配列と比較して、(例えば、1つ以上の非天然アミノ酸を用いて、共有結合修飾によって、及び/又は例えば、1つ以上のグリコシル基の除去若しくは付加によって異なるグリコシル化パターンを有することによって)修飾されてもよい。

0055

あるいは又はさらに、構築物は、配列番号3、配列番号5、配列番号7及び配列番号9からなる群より選択される配列を有するポリペプチドをコードする。あるいは又はさらに、構築物は、配列番号3、配列番号5、配列番号7及び配列番号9からなる群から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるポリペプチドをコードする。あるいは又はさらに、構築物は、配列番号3、配列番号5、配列番号7及び配列番号9からなる群より選択される全長配列の断片を含むポリペプチドをコードし、ここで、断片は、全長配列よりも最大1、10、25、50、100、200、300、400、450又は475アミノ酸短い、全長配列のアミノ酸配列の連続したストレッチを含む。

0056

核酸
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドリボヌクレオチド、及び/又はそれらの類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドポリマー形態を意味する。これには、DNA、RNA及びDNA/RNAハイブリッドが含まれる。それにはまた、修飾された骨格(例えば、ペプチド核酸(PNA)若しくはホスホロチオエート)又は修飾された塩基を含むものなどのDNA又はRNA類似体が含まれる。したがって、本開示の核酸は、mRNA、DNA、cDNA、組換え核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクターなどを含む。核酸がRNAの形態をとる場合、核酸は5'キャップを有していても有していなくてもよい。

0057

本発明者は、本明細書において、リサウイルス抗原をコードする1つ以上の核酸配列を含む核酸を開示する。本明細書中に開示される核酸は種々の形態(例えば、一本鎖、二本鎖、ベクターなど)をとり得る。核酸は環状であっても分枝状であってもよいが、典型的には直鎖状である。

0058

本明細書中で使用される核酸は、好ましくは精製された形態又は実質的に精製された形態、すなわち、他の核酸を実質的に含まない(例えば、天然に存在する核酸を含まない)、特に他のリサウイルス又は宿主細胞核酸(典型的には、少なくとも約50%の純度(重量による)、及び通常は少なくとも約90%の純度である)を実質的に含まない形態で提供される。

0059

核酸は、多くの方法で、例えば、全部又は一部の化学合成(例えば、DNAのホスホルアミダイト合成)によって、ヌクレアーゼ(例えば、制限酵素)を使用してより長い核酸を消化することによって、より短い核酸又はヌクレオチドを連結することによって(例えば、リガーゼ又はポリメラーゼを使用して)、ゲノム又はcDNAライブラリーから、調製され得る。

0060

本明細書中の核酸は、少なくとも1つのリサウイルス抗原をコードする配列を含む。典型的には、本発明の核酸は、組換え形態、すなわち、天然に存在しない形態である。例えば、核酸は、リサウイルス抗原をコードする配列に加えて、1つ以上の異種核酸配列(例えば、別の抗原をコードする配列、及び/又はプロモーター若しくは内部リボソーム侵入部位のような制御配列)を含み得る。核酸は、ベクターの一部、すなわち、1つ以上の細胞型形質導入/トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部であり得る。ベクターは、例えば、宿主細胞においてヌクレオチド配列を発現するように設計された発現ベクター、又は組換えウイルス若しくはウイルス様粒子の産生をもたらすように設計されたウイルスベクターであり得る。

0061

あるいは又はさらに、核酸の配列又は化学構造は、リサウイルス抗原をコードする天然配列と比較して修飾し得る。核酸分子の配列は、例えば、核酸の発現若しくは複製の効率を増加させるために、又は分解に対するさらなる安定性若しくは耐性を提供するために、修飾し得る。あるいは又はさらに、本発明のワクチン構築物は、in vitroアッセイにおいてRNAse消化に対して耐性である。

0062

上記のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳効率及び/又は半減期を増加させるために修飾し得る。例えば、核酸は、コドン最適化又はコドン対最適化し得る。ポリAテール(例えば、約30、約40又は約50以上のアデノシン残基)を、その半減期を増加させるためにRNAの3'末端に結合し得る。RNAの5'末端は構造m7G (5')ppp(5')N(キャップ0構造)又はその誘導体を有する修飾リボヌクレオチドでキャップされてもよく、これはRNA合成の間に組み込まれてもよく、又はRNA転写後に酵素的に操作されてもよい(例えば、N7-モノメチル化キャップ0構造の構築触媒する、mRNAトリホスファターゼグアニリルトランスフェラーゼ及びグアニン-7-メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャップ酵素VCE)を使用することによって)。キャップ0構造は、RNA分子の安定性及び翻訳効率を維持する際に重要な役割を果たす。RNA分子の5'キャップは2'-O-メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾されてもよく、これはキャップ1構造(m7Gppp [m2 '-Ο] N)の生成をもたらし、これは翻訳効率をさらに増大させ得る。

0063

核酸は、1つ以上のヌクレオチド類似体又は修飾ヌクレオチドを含み得る。本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド類似体」又は「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド窒素塩基(例えば、シトシン(C)、チミン(T)、ウラシル(U)、アデニン(A)又はグアニン(G))中又は上に1つ以上の化学修飾(例えば、置換)を含むヌクレオチドをいう。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオシドの糖部分(例えば、リボースデオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、6員糖類似体、又は開鎖糖類似体)の中又は上、あるいはリン酸部分の中又は上にさらなる化学修飾を含むことができる。多くの修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドが市販されている。

0064

修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドに組み込むことができ、mRNA分子中に存在する修飾核酸塩基としては、以下が挙げられる:m5C(5-メチルシチジン);m5U(5-メチルウリジン);m6A(N6-メチルアデノシン);s2U(2-チオウリジン);Um(2'-O-メチルウリジン);mlA(l-メチルアデノシン);m2A(2-メチルアデノシン);Am(2-1-O-メチルアデノシン);ms2m6A(2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン);i6A(N6-イソペンテニルアデノシン);ms2i6A(2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン);io6A(N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン);ms2io6A(2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン);g6A(N6-グリニルカルバモイルアデノシン);t6A(N6-トレオニルカルバモイルアデノシン);ms2t6A(2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン);m6t6A(N6-メチル-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン);hn6A(N6-30ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン);ms2hn6A(2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン);Ar(p)(2'-O-リボシルアデノシン(リン酸));I(イノシン);mil(1-メチルイノシン);m'Im(1, 2'-O-ジメチルイノシン);m3C(3-メチルシチジン);Cm(2T-O-メチルシチジン);s2C(2-チオシチジン);ac4C(N4-アセチルシチジン);f5C(5-ホルミルシチジン);m5Cm(5,2-O-ジメチルシチジン);ac4Cm(N4アセチル2TOメチルシチジン);k2C(リシジン);mIG(1-メチルグアノシン);m2G(N2-メチルグアノシン);m7G(7-メチルグアノシン);Gm(2'-O-メチルグアノシン);m22G(N2, N2-ジメチルグアノシン);m2Gm(N2,2'-O-ジメチルグアノシン);m22Gm(N2,N2,2'-O-トリメチルグアノシン);Gr(p)(2'-O-リボシルグアノシン(リン酸));yW(ワイブトシン);o2yW(ペルオキシワイブトシン);OHyW(ヒドロキシワイブトシン);OHyW*(過少修飾ヒドロキシワイブトシン);imG(ワイオシン);mimG(メチルグアノシン);Q(キューオシン);oQ(エポキシキューオシン);galQ(ガルタクトシルキューオシン);manQ(マンノシル-キューオシン);preQo(7-シアノ-7-デアザグアノシン);preQi(7-アミノメチル-7-デアザグアノシン);G*(アルエオシン);D(ジヒドロウリジン);m5Um(5,2'-O-ジメチルウリジン);s4U(4-チオウリジン);m5s2U(5-メチル-2-チオウリジン);s2Um(2-チオ-2'-O-メチルウリジン);acp3U(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン);ho5U(5-ヒドロキシウリジン);mo5U(5-メトキシウリジン);cmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸);mcmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル);chm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン));mchm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル);mcm5U(5-メトキシカルボニルメチルウリジン);mcm5Um(S-メトキシカルボニルメチル-2-O-メチルウリジン);mcm5s2U(5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン);nm5s2U(5-アミノメチル-2-チオウリジン);mnm5U(5-メチルアミノメチルウリジン);mnm5s2U(5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン);mnm5se2U(5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン);ncm5U(5-カルバモイルメチルウリジン);ncm5Um(5-カルバモイルメチル-2'-O-メチルウリジン);cmnm5U(5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン);cnmm5Um(5-カルボキシメチル1アミノメチル-2-L-Oメチルウリジン);cmnm5s2U(5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン);m62A(N6,N6-ジメチルアデノシン);Tm(2'-O-メチルイノシン);m4C(N4-メチルシチジン);m4Cm(N4, 2-O-ジメチルシチジン);hm5C(5-ヒドロキシメチルシチジン);m3U(3-メチルウリジン);cm5U(5-カルボキシメチルウリジン);m6Am(N6,T-O-ジメチルアデノシン);rn62Am(N6,N6,O-2-トリメチルアデノシン);m2'7G(N2,7-ジメチルグアノシン);m2'2'7G(N2,N2,7-トリメチルグアノシン);m3Um(3,2T-O-ジメチルウリジン);m5D(5-メチルジヒドロウリジン);£5Cm(5-ホルミル-2'-O-メチルシチジン);mlGm(1,2'-0-ジメチルグアノシン);m'Am(1,2-O-ジメチルアデノシン)イリノメチルウリジン);tm5s2U(S-タウリノメチル-2-チオウリジン);iniG-14(4-デメチルグアノシン);imG2(イソグアノシン);ac6A(N6-アセチルアデノシン);ヒポキサンチン;イノシン;8-オキソ-アデニン、その7-置換誘導体ジヒドロウラシルシュードウラシル;2-チオウラシル4-チオウラシル;5-アミノウラシル;5-(C1〜C6)-アルキルウラシル;5-メチルウラシル;5-(C2〜C6)-アルケニルウラシル;5-(C2〜C6)-アルキニルウラシル;5-(ヒドロキシメチル)ウラシル;5-クロロウラシル;5-フルオロウラシル5-ブロモウラシル;5-ヒドロキシシトシン;5-(C1〜C6)-アルキルシトシン;5-メチルシトシン;5-(C2〜C6)-アルケニルシトシン;5-(C2〜C6)-アルキニルシトシン;5-クロロシトシン;5-フルオロシトシン;5-ブロモシトシン;N2-ジメチルグアニン;7-デアザグアニン;8-アザグアニン;7-デアザ-7-置換グアニン;7-デアザ-7(C2〜C6)アルキニルグアニン;7-デアザ-8-置換グアニン;8-ヒドロキシグアニン6-チオグアニン;8-オキソグアニン;2-アミノプリン;2-アミノ-6-クロロプリン;2,4-ジアミノプリン;2,6-ジアミノプリン;8-アザプリン;置換7-デアザプリン;7-デアザ-7-置換プリン;7-デアザ-8-置換プリン;水素脱塩基残基(abasicresidue));m5C;m5U;m6A;s2U;W;又は2'-0-メチル-U。これらの修飾核酸塩基及びそれらの対応するリボヌクレオシドの多くは商業的供給源から入手可能である。

0065

あるいは又はさらに、構築物は、配列番号2、配列番号4、配列番号6及び配列番号8からなる群より選択されるDNA核酸配列を含む。あるいは又はさらに、構築物は、配列番号2、配列番号4、配列番号6及び配列番号8からなる群から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一である核酸配列を含む。あるいは又はさらに、構築物は、配列番号2、配列番号4、配列番号6及び配列番号8からなる群より選択される全長配列の断片を含む核酸配列を含み、ここで、断片は、全長配列よりも最大1、10、25、50、100、200、300、400、450又は475核酸短い、全長配列の核酸配列の連続したストレッチを含む。

0066

核酸ベースのワクチン
本発明は、リサウイルス抗原、その変異体又は断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物を開示する。このような組成物は、核酸ベースのワクチンであり得る。1つ以上の追加のリサウイルス抗原をコードする核酸配列を含むさらなる組成物はまた、核酸ベースのワクチンとして提供され得る。あるいは又はさらに、組成物は、第1のリサウイルス株由来のリサウイルス抗原をコードする核酸配列と、リサウイルスの1つ以上の他の株由来の追加のリサウイルス抗原をコードする追加の核酸配列とを含む。あるいは又はさらに、組成物は、リサウイルス抗原及び追加のリサウイルス抗原をコードする核酸配列を含む。あるいは、追加の非リサウイルス抗原がコードされてもよい。

0067

核酸は、例えばRNA(すなわち、RNAベースのワクチン)又はDNA(すなわち、プラスミドDNAワクチンなどのDNAベースのワクチン)であり得る。あるいは又はさらに、核酸ベースのワクチンは、RNAベースのワクチンである。あるいは又はさらに、RNAベースのワクチンは、自己増幅RNA分子を含む。自己増幅RNA分子は、アルファウイルス由来RNAレプリコンであってもよい。

0068

本明細書中で使用される場合、用語「アルファウイルス」は、当該技術分野で慣用的な意味を有し、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE、例えば、トリニダードドンキー、TC83CRなど)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス(Ross river virus)、西部ウマ脳炎ウイルス(Western equine encephalitis virus)、東部ウマ脳炎ウイルス(Eastern equine encephalitis virus)、チクングンヤウイルス(Chikungunya)、S.A. AR86ウイルス、エバグレーズウイルス(Everglades virus)、ムカンボウイルス(Mucambo)、バルマーフォレストウイルス(Barmah forest virus)、ミデルブルグウイルス(Middelburg virus)、ピクスナウイルス(Pixuna virus)、オニョンニョンウイルス(O'nyong-nyong virus)、ゲタウイルス(Getah virus)、サギヤマウイルス(Sagiyama virus)、ベバルウイルス(Bebaru virus)、マヤロウイルス(Mayaro virus)、ウナウイルス(Una virus)、アウラウイルス(Aura virus)、ワタロアウイルス(Whataroa virus)、バンバキウイルス(Banbanki virus)、キジラガッチウイルス(Kyzylagach virus)、ハイランズジェイウイルス(HighlandsJ virus)、フォートモルガンウイルス(Fort Morgan virus)、ヌドゥムウイルス(Ndumu virus)、及びバギークリークウイルス(Buggy creek virus)などの種々の種がある。アルファウイルスという用語はまた、2つ以上のアルファウイルス由来のゲノム配列を含むキメラアルファウイルスを含み得る。

0070

「アルファウイルスレプリコン」(又は「レプリコン」)は、標的細胞においてin vivoでそれ自体の増幅を指令することができるRNA分子である。レプリコンはRNA増幅を触媒するポリメラーゼをコードし、コードされたポリメラーゼによって認識され利用される、複製に必要なシスRNA配列を含む。アルファウイルスレプリコンは、典型的には以下の順序付けられた要素:複製のためにシスで必要とされる5'ウイルス配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)をコードする配列、複製のためにシスえ必要とされる3'ウイルス配列、及びポリアデニレートトラクトを含む。アルファウイルスレプリコンはまた、異種ヌクレオチド配列の発現を指示する1つ以上のウイルスサブゲノム「接合領域」プロモーターを含み得、これは、発現対象のサブゲノム断片及び異種配列のウイルス転写を増加又は減少させるために改変され得る。

0071

「自己増幅RNA」及び「RNAレプリコン」は、それ自体を複製する能力を有するRNAを意味するために互換的に使用される。本発明の自己増幅RNA分子は、1つ以上の抗原をコードするmRNAを含む。このmRNAは、感染性ウイルスの産生に必要な構造タンパク質をコードする核酸配列と置き換えることができる。RNAは、酵素転写によってin vitroで産生され得、それによって、ワクチンの細胞培養製造に関連する製造上の問題を回避する。本発明の自己増幅RNA分子で免疫した後、RNA分子の複製及び増幅はトランスフェクトされた細胞の細胞質において起こり、核酸はゲノムに組み込まれない。RNAはゲノムに組み込まれず、標的細胞を形質転換しないので、自己増幅RNAワクチンは、組換えDNAワクチンが直面する安全性の障害をもたらさない。

0072

自己増幅RNA分子は当該分野で公知であり、そして例えば、アルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、そして構造ウイルスタンパク質を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で置換することによって作製され得る。自己増幅RNA分子は、典型的には細胞への送達後に直接翻訳され得るプラス鎖分子である。この翻訳はRNA依存性RNAポリメラーゼを提供し、次いで、これは、送達されたRNAからアンチセンス転写物及びセンス転写物の両方を産生する。従って、送達されたRNAは、複数のRNAの産生を導く。これらの娘RNA、並びに同一線上(collinear)のサブゲノム転写物は、コードされる抗原(例えば、リサウイルス抗原)のin situ発現を提供するためにそれ自体翻訳され得るか、あるいは送達されたRNAと同じ意味(センス)を有するさらなる転写物を提供するために転写され得、次いで、これは、抗原のin situ発現を提供するために翻訳される。転写のこの配列の全体的な結果は導入されたレプリコンRNAの数の膨大な増幅であり、従って、コードされる抗原は、細胞の主要なポリペプチド産物になる。

0073

このように自己増幅を達成するための1つの適切な系は、アルファウイルスに基づくレプリコンを使用することである。これらのレプリコンは、細胞に送達後にレプリカーゼ(又はレプリカーゼ転写酵素)の翻訳を導くプラス鎖RNAである。レプリカーゼは、ポリタンパク質として翻訳され、これは自己切断して複製複合体を提供し、これがプラス鎖の送達されたRNAのゲノム鎖コピーを生成する。これらのマイナス鎖転写産物は、それ自体が転写されてプラス鎖の親RNAのさらなるコピーを与え、また抗原をコードするサブゲノム転写産物を与えることができる。サブゲノム転写産物の翻訳は、感染した細胞による抗原のin situ発現へと導く。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどからのレプリカーゼを使用することができる。突然変異又は野生型のウイルス配列を使用することができ、例えば、VEEVの弱毒化TC83変異体がレプリコンで使用されている。

0074

自己増幅RNAは、mRNAの基本要素、すなわちキャップ、5'UTR、3'UTR、及びポリ(A)テールを含む。それらはさらに、非構造ウイルス遺伝子及び1つ以上のサブゲノムプロモーターをコードする大きなオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。ポリメラーゼを含む非構造遺伝子は、細胞内RNA複製工場を形成し、サブゲノムRNAを高レベルで転写する。ワクチン抗原をコードするこのmRNAは細胞内で増幅され、高レベルのmRNAと抗原発現をもたらす。

0075

あるいは又はさらに、本明細書に記載の自己増幅RNA分子は、(i)自己増幅RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼ、及び(ii)リサウイルス抗原をコードする。このポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼであり得、例えば、アルファウイルスタンパク質nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4の1つ以上を含む。

0076

天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて構造ビリオンタンパク質をコードするが、あるいは又はさらに、自己増幅RNA分子はアルファウイルス構造タンパク質をコードしない。したがって、自己増幅RNAは、細胞内でそれ自体のゲノムRNAコピーの生成へと導くことができるが、RNAを含むビリオンの生成には導くことができない。これらのビリオンを生成することができないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、自己増幅RNA分子がそれ自体、感染性形態で永続化することができないことを意味する。野生型ウイルスの永続化に必要とされるアルファウイルス構造タンパク質は、本開示の自己増幅RNAには存在せず、それらの場所は、目的の免疫原をコードする遺伝子(複数可)によって占有され、そのため、サブゲノム転写産物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく免疫原をコードする。

0077

したがって、本発明で有用な自己増幅RNA分子は、2つのオープンリーディングフレームを有し得る。第1のオープンリーディングフレームはレプリカーゼをコードする。第2のオープンリーディングフレームは抗原をコードする。あるいは又はさらに、RNAは、例えば、追加の抗原をコードするため、又はアクセサリーポリペプチドをコードするために、1つ以上の追加の(例えば、下流の)オープンリーディングフレームを有することができる。

0078

あるいは又はさらに、本明細書に開示の自己増幅RNA分子は、5'キャップ(例えば、7-メチルグアノシン)を有する。このキャップは、RNAのin vivo翻訳を増強することができる。あるいは又はさらに、自己増幅RNA分子の5’配列は、コードされるレプリカーゼとの適合性保証するように選択すべきである。

0079

自己増幅RNA分子は、3'ポリAテールを有することができる。これはまた、その3'末端近辺ポリAポリメラーゼ認識配列(例えば、AAUAAA)を含むことができる。

0080

自己増幅RNA分子は、様々な長さを持つことができるが、それらは、典型的には、5000〜25000ヌクレオチドの長さである。自己増幅RNA分子は、典型的には一本鎖である。一本鎖RNAは、一般的に、TLR7、TLR8、RNAヘリカーゼ及び/又はPKRに結合することにより、アジュバント効果を開始することができる。二本鎖形態で送達されるRNA(dsRNA)は、TLR3に結合することができ、この受容体はまた、一本鎖RNAの複製の間、又は一本鎖RNAの二次構造内、のいずれかに形成されたdsRNAにより誘発することができる。

0081

自己増幅RNAは、好都合には、in vitro転写(IVT)により調製することができる。IVTは、細菌中でプラスミドの形で作製及び増幅されるか、又は合成的に(例えば、遺伝子合成及び/又はポリメラーゼ連鎖反応PCR工学的方法により)作製されるcDNA鋳型を使用することができる。例えば、DNA鋳型から自己増幅RNAを転写するために、DNA依存性RNAポリメラーゼ(例えば、バクテリオファージT7、T3、又はSP6RNAポリメラーゼ)を使用することができる。適切なキャッピング及びポリA付加反応を、必要に応じて使用することができる(通常、レプリコンのポリAはDNA鋳型内にコードされているが)。これらのRNAポリメラーゼは、転写された5'ヌクレオチド(複数可)についてのストリンジェント要件を有することがあり、一部の実施形態では、これらの要件を、コードされるレプリカーゼの要件と一致させて、IVT転写されたRNAが、自己によりコードされるそのレプリカーゼのための基質として効率的に機能できることを確実にする必要がある。

0082

自己増幅RNAは、任意の5’キャップ構造に加えて、修飾核酸塩基を有する1つ以上のヌクレオチドを含むことができる。本発明で使用されるRNAは、理想的にはヌクレオシド間のホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態では、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、及び/又はメチルホスホネート結合を含むことができる。

0083

自己増幅RNA分子は、単一の異種ポリペプチド抗原(すなわち、リサウイルス抗原)をコードしてもよいし、又は任意で、アミノ酸配列として発現される場合に、各配列がその同一性を保持するように一緒に連結された(例えば、直列に連結された)2つ以上の異種ポリペプチド抗原をコードしてもよい。次いで、自己増幅RNAから生成された異種ポリペプチドは、融合ポリペプチドとして産生されるか、又は別個のポリペプチド若しくはペプチド配列をもたらすように操作され得る。

0084

本明細書に記載の自己増幅RNA分子は、2つ以上のオープンリーディングフレームから複数のヌクレオチド配列を発現するように操作され、それによりサイトカイン又は他の免疫調節物質(免疫応答の生成を増強することができる)と一緒に1つ、2つ又はそれ以上のリサウイルス抗原(例えば、1つ、2つ又はリサウイルス抗原)などのタンパク質の共発現が可能になる。そのような自己増幅RNA分子は、例えば、二価又は多価ワクチンとして、例えば、同時に様々な遺伝子産物(例えば、タンパク質)の生産において、特に有用かもしれない。

0085

必要に応じて、自己増幅RNA分子をスクリーニング又は分析して、当業者に公知のさまざまなin vitro又はin vivo試験方法を使用して、それらの治療及び予防特性を確認することができる。たとえば、迅速蛍光フォーカス抑制試験(RFFIT)は、狂犬病ウイルス中和活性のレベルを測定できる。自己増幅RNA分子を含むワクチンは、増殖の誘導に対する効果、又は特定の目的のリンパ球タイプ、例えばB細胞、T細胞、T細胞株若しくはT細胞クローンエフェクター機能に対する効果について試験することができる。例えば、免疫したマウスの脾臓細胞を単離し、細胞傷害性Tリンパ球がリサウイルス抗原をコードする自己増幅RNA分子を含む自己標的細胞を溶解する能力を得ることができる。さらに、TH1(IL-2及びIFN-γ)及び/又はTH2(IL-4及びIL-5)サイトカインの増殖又は産生をELISAで測定することにより、あるいは細胞質サイトカイン染色及びフローサイトメトリによりCD4+ T細胞で直接測定することにより、Tヘルパー細胞分化を分析し得る。

0086

リサウイルス抗原をコードする自己増幅RNA分子はまた、例えば対象のリサウイルス抗原に特異的な抗体のB細胞産生の誘導により実証されるように、液性免疫応答を誘導する能力について試験することができる。これらのアッセイは、例えば、免疫された個体の末梢Bリンパ球を使用して実施することができる。そのようなアッセイ方法は、当業者に公知である。自己増幅RNA分子を特性決定するために使用し得る他のアッセイは、標的細胞によるコードされたリサウイルス抗原の発現の検出を含み得る。例えば、蛍光活性細胞選別FACS)を使用して、細胞表面又は細胞内での抗原発現を検出できる。FACS選択のもう1つの利点は、発現のレベルが異なる場合にソートできることであり、これは、より低い発現が望まれる場合があるためである。特定の抗原を発現する細胞を同定する他の適切な方法は、プレート上のモノクローナル抗体を使用したパニング、又はモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用した捕獲を含む。

0087

あるいは又はさらに、自己増幅RNA分子をコードするDNA配列が提供され、配列番号2、配列番号4、配列番号6及び配列番号8からなる群より選択され得る。あるいは又はさらに、自己増幅RNA分子をコードするDNA配列は、配列番号2、配列番号4、配列番号6及び配列番号8からなる群から選択される配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一である配列を含む。あるいは又はさらに、自己増幅RNA分子をコードするDNA配列は、配列番号2、配列番号4、配列番号6及び配列番号8からなる群より選択される全長配列の断片を含む又はそれからなり、ここで、断片は、全長配列よりも最大1、10、25、50、100、200、300、400、450又は475核酸短い、全長配列の核酸配列の連続したストレッチを含む又はそれからなる。

0088

脂質ベースの送達系
本発明の核酸ベースのワクチンは、非ウイルス送達系、例えば、脂質ベースの送達系を含み得る。これらの系は自己増幅RNAワクチンを細胞の内部に効率的に送達することができ、次いで、そこでコードされる抗原(複数可)を複製し、発現することができる。

0089

送達系は、コードされるリサウイルス抗原の免疫原性を増強するアジュバント効果を有し得る。例えば、核酸分子は、リポソーム又は非毒性の生分解性ポリマー微粒子中に封入され得る。あるいは又はさらに、核酸ベースのワクチンは、脂質ナノ粒子(LNP)送達系を含む。あるいは又はさらに、核酸分子は、カチオン性ナノエマルジョン(CNE)として送達され得る。あるいは又はさらに、核酸ベースのワクチンは、裸のRNA(例えば、mRNA)のような裸の核酸を含み得るが、脂質ベースの送達系が好ましい。

0090

「脂質ナノ粒子(LNP)」は、核酸分子(例えば、RNA)を封入することができる非ビリオンリポソーム粒子である。LNP送達系及び非毒性生分解性ポリマー微粒子、並びにそれらの調製方法は、当技術分野で公知である。粒子いくらかの外部RNA(例えば、粒子の表面上に)を含み得るが、RNAの少なくとも半分(好ましくはその全て)が封入される。リポソーム粒子は例えば、飽和又は不飽和であり得る双性イオン性、カチオン性及びアニオン性脂質、例えば、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)(双性イオン性、飽和)、1,2-ジリノレイルオキシ(dilinoleyoxy)-3-ジメチルアミノプロパン(DlinDMA)(カチオン性、不飽和)、及び/又は1,2-ジミリストイル-rac-グリセロールDMG)(アニオン性、飽和)の混合物から形成され得る。本発明で使用するのに好ましいLNPは、リポソームを形成することができる双性イオン性脂質を含み、任意選択で、少なくとも1つのカチオン性脂質(N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル-硫酸DOTAPビス(2-メタクリロイル)オキシエチルジスルフィド(DSDMA)、2,3-ジオレイルオキシ-1-(ジメチルアミノ)プロパン(DODMA)、1,2-ジリノレイオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、N,N-ジメチル-3-アミノプロパン(DLenDMA)など)と組み合わせることができる。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG及びコレステロールの混合物は特に有効である。あるいは又はさらに、LNPはRV01リポソームである。

0091

あるいは又はさらに、LNPは、中性脂質、カチオン性脂質、コレステロール及びポリエチレングリコール(PEG)を含み、自己増幅RNAを含むナノ粒子を形成する。一部の実施形態では、本明細書におけるカチオン性脂質は、式I:

0092

0093

の構造を含み、式中、
nは、1から3の整数であり、
(i)R1はCH3であり、R2とR3はともにHであり、及びYはCであり;又は
(ii)R1及びR2は集合的にCH2-CH2であり、窒素と一緒になって、5員、6員、又は7員のヘテロシクロアルキルを形成し、R3はCH3であり、及びYはCであり;又は
(iii)R1はCH3であり、R2とR3はともに存在せず、及びYはOであり;
oは、0又は1であり;
Xは、
(i)

0094

0095

{式中、
R4及びR5は、独立して、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有するC10〜20炭化水素鎖である};又は
(ii)-CH(-R6)-R7
{式中、
(1)R6は、-(CH2)p-O-C(O)-R8若しくは-Cp-R8であり;
(2)R7は、-(CH2)p'-O-C(O)-R8'若しくは-Cp'-R8'であり;
(3)p及びp'は、独立して、0、1、2、3若しくは4であり;及び
(4)R8及びR8'は、独立して、
(A)オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有するC8〜20炭化水素鎖;
(B)-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖
(C)-C6〜16飽和炭化水素鎖
(D)-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖;
(E)-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖;及び
(F)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖
である}
である。

0096

一実施形態では、R1はCH3であり、R2とR3はともにHであり、YはCである。一部の実施形態では、R1及びR2は集合的にCH2-CH2であり、窒素と一緒になって、5員、6員、又は7員のヘテロシクロアルキルを形成し、R3はCH3であり、及びYはCである。一部の実施形態では、R1はCH3であり、R2とR3はともに存在せず、YはOである。

0097

一実施形態では、Xは、

0098

0099

であり、式中、R4及びR5は、独立して、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有するC10〜20炭化水素鎖である。

0100

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0101

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0102

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0103

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0104

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0105

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0106

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、R8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0107

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0108

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0109

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0110

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0111

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0112

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0113

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0114

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0115

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0116

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0117

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0118

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0119

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0120

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0121

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0122

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0123

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0124

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0125

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0126

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0127

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0128

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0129

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0130

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0131

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0132

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0133

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0134

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0135

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0136

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、R8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0137

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0138

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0139

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0140

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0141

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0142

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0143

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0144

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0145

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0146

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0147

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0148

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0149

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0150

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0151

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0152

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0153

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0154

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、R8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0155

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0156

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0157

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0158

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0159

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0160

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0161

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0162

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、及びR8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0163

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0164

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0165

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0166

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0167

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7はCp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0168

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0169

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0170

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0171

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-(CH2)p-O-C(O)-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0172

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0173

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0174

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0175

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0176

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0177

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0178

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0179

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0180

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0181

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0182

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0183

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0184

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0185

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0186

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0187

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0188

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0189

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0190

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0191

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0192

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0193

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、R8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0194

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0195

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0196

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0197

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0198

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0199

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0200

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0201

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0202

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0203

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0204

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0205

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0206

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0207

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-(CH2)p'-O-C(O)-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0208

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0209

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0210

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0211

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0212

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0213

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0214

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0215

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0216

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0217

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0218

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0219

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0220

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0221

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0222

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0223

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0224

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0225

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0226

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0227

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0228

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0229

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0230

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0231

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0232

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0233

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0234

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0235

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0236

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0237

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0238

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は、オメガ6と9の位置のいずれか又は両方に1つ又は2つのシスアルケン基を有する-C8〜20炭化水素鎖である。

0239

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C1〜3-C(-O-C6〜12)-O-C6〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0240

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和炭化水素鎖である。

0241

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C(-C6〜16)-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0242

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8''であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C[-C-O-C(O)-C4〜12]-C-O-C(O)-C4〜12飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0243

一実施形態では、Xは-CH(-R6)-R7であり、R6は-Cp-R8であり、R7は-Cp'-R8'であり、p及びp'は独立して0、1、2、3又は4であり、R8は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖であり、及びR8'は-C6〜16飽和又は不飽和炭化水素鎖である。

0244

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV28である。

0245

0246

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV31である。

0247

0248

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV33である。

0249

0250

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV37である。

0251

0252

一実施形態では、LNPは、カチオン性脂質RV39、すなわち2,5-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)ベンジル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート)を含む。

0253

0254

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV42である。

0255

0256

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV44である。

0257

0258

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV73である。

0259

0260

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV75である。

0261

0262

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV81である。

0263

0264

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV84である。

0265

0266

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV85である。

0267

0268

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV86である。

0269

0270

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV88である。

0271

0272

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV91である。

0273

0274

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV92である。

0275

0276

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV93である。

0277

0278

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有する2-(5-((4-((1,4-ジメチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ヘキサデシル)オキシ)-5-オキソペンチル)プロパン-1,3-ジイルジオクタノエート(RV94)である。

0279

0280

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV95である。

0281

0282

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV96である。

0283

0284

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV97である。

0285

0286

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV99である。

0287

0288

一実施形態では、例示的なカチオン性脂質は、以下の構造を有するRV101である。

0289

0290

一実施形態では、カチオン性脂質は、RV39、RV88、及びRV94からなる群から選択される。

0291

式Iを有する化合物、並びにRV28、RV31、RV33、RV37、RV39、RV42、RV44、RV73、RV75、RV81、RV84、RV85、RV86、RV88、RV91、RV92、RV93、RV94、RV95、RV96、RV97、RV99、及びRV101を合成するための組成物及び方法は、2014年12月17日に出願されたPCT/US2014/070882(国際公開番号第2015/095340号)及びPCT/US2014/070891(国際公開番号第2015/095346号において、並びに2015年9月4日に出願されたPCT/US2015/048535(国際公開番号第2016/037053号)に見出すことができる。

0292

RNAと脂質の比率は様々であり得る。ヌクレオチド(N)のリン脂質(P)に対する比率は、例えば、1N:1P、2N:1P、3N:1P、4N:1P、5N:1P、6N:1P、7N:1P、8N:1P、9N:1P、又は10N:1Pの範囲であり得る。ヌクレオチド(N)のリン脂質(P)に対する比率は、例えば、1N:1Pから10N:1P、2N:1Pから8N:1P、2N:1Pから6N:1P、又は3N:1Pから5N:1Pの範囲であり得る。あるいは又はさらに、ヌクレオチド(N)とリン脂質(P)の比率は4N:1Pである。

0293

あるいは又はさらに、核酸ベースのワクチンは、カチオン性ナノエマルジョン(CNE)送達系を含む。カチオン性水中油型エマルジョンを使用して、RNA分子などの負に帯電した分子を細胞内部に送達し得る。エマルジョン粒子は、疎水性オイルコアとカチオン性脂質を含み、後者はRNAと相互作用することができ、それによりそれをエマルジョン粒子に固定する。CNE送達系では、抗原をコードする核酸分子(例えば、RNA)は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合化される。

0294

したがって、本発明の核酸ベースのワクチンにおいて、リサウイルス抗原をコードするRNA分子は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合化され得る。粒子は通常、25℃で液相にあるオイルコア(例えば植物油又はスクアレン)、カチオン性脂質(例えばリン脂質)、及び必要に応じて界面活性剤(例えばトリオレインソルビタンポリソルベート80)を含み、ポリエチレングリコールも含めることができる。あるいは又はさらに、CNEは、スクアレン、及び1,2-ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)などのカチオン性脂質を含む。一実施形態では、CNEは、ポリソルベートで安定化されたDOTAP及びスクアレンの水中油型エマルジョンである。

0295

本発明のLNP及びCNE送達系は、液性及び細胞性免疫応答の両方を誘発するのに特に有効であり得る。これらの送達系の利点には、制限的な抗ベクター免疫応答がないことも含まれる。

0296

医薬組成物、免疫原性組成物
本開示は、リサウイルスポリペプチド、例えばリサウイルス抗原をコードする配列を含む核酸を含む組成物を提供する。組成物は、医薬組成物、例えば免疫原性組成物又はワクチン組成物であり得る。したがって、組成物は、薬学的に許容される担体も含み得る。一部の実施形態において、リサウイルスは狂犬病ウイルスである。

0297

「薬学的に許容される担体」には、組成物を受容する個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しない任意の担体が含まれる。本発明の組成物は、水、発熱物質を含まない滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グリセロールなどの薬学的に許容される希釈剤も含み得る。さらに、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質などが存在してもよい。

0298

医薬組成物は、淡水(例えば、注射用水「w.f.i.」)又は緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液コハク酸緩衝液ヒスチジン緩衝液、若しくはクエン酸緩衝液中に、本明細書のいずれかに記載の構築物、核酸配列、及び/又はポリペプチド配列を含み得る。緩衝液塩は、通常は5〜20mMの範囲で含まれる。医薬組成物は、5.0〜9.5、例えば、6.0〜8.0のpHを有し得る。組成物は、張度を与えるためにナトリウム塩(例えば、塩化ナトリウム)を含み得る。10±2mg/ml NaClの濃度が典型的であり、例えば、約9mg/mLである。組成物は、金属イオンキレート剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解加速し得るイオンを除去することにより、RNAの安定性を延長させることができる。したがって、組成物は、EDTA、EGTA、BAPTA、ペンテト酸などのうちの1つ以上を含み得る。このようなキレート剤は、典型的には、10〜500μM、例えば0.1mMで存在する。クエン酸塩、例えばクエン酸ナトリウムはまた、キレート剤として作用することができ、一方で、緩衝活性も有利に提供する。

0299

医薬組成物は、200mOsm/kg〜400mOsm/kg、例えば、240〜360mOsm/kg、又は290〜310mOsm/kgの浸透圧を有し得る。医薬組成物は、1つ以上の防腐剤、例えば、チオメルサール又は2-フェノキシエタノールを含み得る。水銀を含まない組成物が好ましく、防腐剤を含まないワクチンを調製することができる。医薬組成物は、無菌又は滅菌であり得る。医薬組成物は、非発熱性であり、例えば、1用量あたり<1ED(内毒素単位、標準尺度)、好ましくは1用量あたり<0.1EUを含み得る。医薬組成物は、グルテンを含まない。医薬組成物は、単位用量剤形で調製することができる。あるいは又はさらに、単位用量は、0.1〜2.0ml、例えば、約1.0又は0.5mlの体積を有し得る。

0300

本発明の組成物は、アジュバントと共に又はアジュバントなしで投与され得る。あるいは又はさらに、組成物は、特に組成物が免疫学的に有効な量のリサウイルス抗原をコードする核酸を含む場合、1つ以上のアジュバント(例えば、ワクチンアジュバント)を含むか、又は一緒に投与することができる。

0301

「アジュバント」とは、組成物の有効成分に対する免疫応答を増大、刺激、活性化、増強又は調節する剤を意味する。アジュバント効果は、細胞レベル若しくは液性レベル又はその両方で生じ得る。アジュバントは、実際の抗原に対する免疫系の反応を刺激するが、それ自体免疫学的作用はない。あるいは又はさらに、本発明のアジュバント添加組成物は、1つ以上の免疫刺激剤を含んでもよい。「免疫刺激剤」とは、抗原とともに投与するか別個に投与するかにかかわらず、対象の免疫応答の一般的な一時的増加を誘発する剤を意味する。

0302

使用方法/使用
本明細書に開示される構築物又は組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含む、それを必要とする対象においてリサウイルスによって引き起こされる疾患に対する免疫応答を誘導する方法が提供される。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象においてリサウイルス抗原に対する免疫応答を誘導するための、本明細書に開示される構築物又は組成物の使用が提供される。いくつかの実施形態では、対象においてリサウイルスに対する免疫応答を誘導する医薬の製造における、本明細書に開示される構築物又は組成物の使用が提供される。

0303

「対象」とは、脊椎動物、例えば哺乳動物など、例としてヒト又は獣医哺乳動物を意図している。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

0304

投与経路
本明細書に開示される組成物は一般に、対象に直接投与される。直接送達は、非経口注射、例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、又は組織間質腔への注射により達成され得る。リサウイルス抗原をコードする自己増幅RNAは、あらゆる年齢の個体に予防的又は治療的に投与することができる。予防的に、例えば狂犬病に固有の地域の居住者又は旅行者に予防的に投与する場合、投与スケジュールは3回用量、2回用量又は単回用量で構成され得る。あるいは又はさらに、単回用量を予防的に投与する。治療的に、例えば狂犬病曝露後に治療的に投与する場合、投与スケジュールは5回用量、4回用量、3回用量、2回用量又は単回用量で構成され得る。好ましい実施形態では、単回又は2回用量が治療的に投与される。

0305

本明細書で使用する場合、組成物の投与「後の」組成物の投与は、第1及び第2の組成物が同じか異なるかに関係なく、第1の組成物の投与と第2の組成物の投与との間に時間間隔が経過したことを示す。

0306

製造方法及び製剤
あるいは又はさらに、自己増幅RNAの製造方法は、in vitro転写(IVT)のステップを含む。いくつかの実施形態では、自己増幅RNAを製造する方法は、IVTでRNAを生成するステップを含み、その後にキャッピング5’ジヌクレオチドm7G(5’)ppp(5’)G反応が続き、さらにRNAと非ウイルス送達系を合わせるステップを含む。あるいは又はさらに、自己増幅RNAを製造する方法は、RNAを生成するIVTのステップを含み、さらにRNAを脂質ベースの送達系と合わせるステップを含む。

0307

配列同一性
配列に関する同一性は、最大パーセント配列同一性を達成するように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないで、参照アミノ酸配列と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして、本明細書において定義される。

0308

配列同一性は、2つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために一般的に使用されている標準的な方法によって決定することができる。BLAST又はFASTAのようなコンピュータープログラムを使用して、2つのポリペプチドをそれらの各々のアミノ酸の一致が最適化するように(一方又は両方の配列の全長にわたって、或いは一方又は両方の配列の所定部分にわたって)整列させる。これらのプログラムは、初期設定オープニングペナルティ及び初期設定のギャップペナルティを提供し、PAM250又はswgapdnantなどのスコアリングマトリックスをそのコンピュータープログラムと組み合わせて使用することができる。一実施形態では、ギャップオープニングペナルティ15、ギャップ伸長ペナルティ6.66、ギャップ分離ペナルティ範囲8、アライメントディレイのためのパーセント同一性40である。例えば、一致の合計数を100倍し、次いで一致した領域内のより長い配列の長さと、2つの配列を整列させるためにより短い配列に導入されたギャップの数との合計で除算したものとして、パーセント同一性を計算することができる。

0309

本開示がUniProt又はGenbankアクセッションコードへの参照によって配列を参照する場合、参照される配列は本出願の出願日現在のバージョンである。

0310

単一のアミノ酸又は低いパーセンテージのアミノ酸を改変、付加又は欠失させるタンパク質への個々の置換、欠失又は付加は、当該改変がアミノ酸の機能的に類似したアミノ酸との置換、又は免疫原性機能に実質的に影響を及ぼさない残基の置換/欠失/付加である場合に「免疫原性誘導体」であることを当業者は認識するものである。

0311

機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は当技術分野において周知である。一般に、そのような保存的置換は、以下に特定されるアミノ酸グループの1つとなるが、ある状況では、抗原の免疫原性に実質的に影響を及ぼすことなく他の置換が可能であり得る。以下の8つのグループは、各々、通常互いが保存的置換となるアミノ酸を含む:
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);及び
8)システイン(C)、メチオニン(M)。

0312

適切には、そのような置換はエピトープの領域の中で起こらず、したがって、抗原の免疫原性特性に著しい影響を与えない。

0313

免疫原性誘導体は、参照配列と比較して追加のアミノ酸が挿入されているものも含み得る。適切には、そのような挿入はエピトープの領域の中では起こらず、それ故抗原の免疫原性特性に著しい影響を与えない。挿入の一例は、対象の抗原の発現及び/又は精製を補助するためのヒスチジン残基の短い領域(例えば2〜6残基)を含む。

0314

免疫原性誘導体は、参照配列と比較してアミノ酸が欠失しているものを含む。適切には、そのような欠失はエピトープの領域に起こらず、したがって抗原の免疫原性特性に著しい影響を与えない。

0315

特定の免疫原性誘導体は、置換、欠失及び付加(又はその任意の組合せ)を含み得ることを、当業者は認識する。

0316

他に説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」には、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、複数の指示対象が含まれる。同様に、「又は(or)」という言葉は、文脈から明確に他に示されない限り、「及び」を含むことが意図される。「複数」という用語は、2つ以上を指す。さらに、物質の濃度又はレベルに関して与えられる数値限定、例えば、溶液成分濃度又はその比率、及び反応条件、例えば、温度、圧力及びサイクル時間は、近似値であることが意図される。本明細書で使用される「約」という用語は、量±10%を意味することが意図される。

0317

以下の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。以下の実施例に示される結果は、リサウイルス抗原をコードする自己増幅RNAが、様々な脂質組成物中に製剤化された場合、強力で長期持続性の免疫を伝達することを実証する。それらの製造の容易性、低用量での有効性、及び既存のワクチンに対する優位性は、狂犬病の予防及び曝露後の処置に著しいブレークスルーを提供する。

0318

[実施例]
実施例1:リサウイルス抗原を用いたSAMの構築物設計
本発明者は、アルファウイルスレプリコンに由来する合成自己増幅mRNA(「SAM」)を用いて、リサウイルスワクチンの研究を開始した。VEE TC-83(配列番号1)由来のSAMベクターを、クローニングのためのバックボーンとして選択した。対象のリサウイルス抗原をこのベクターで発現させ、堅牢な抗原産生、免疫原性、in vitro及びin vivoモデルを用いた有効性について評価した。

0319

0320

本発明のSAM狂犬病構築物は、表1及び図1Aに記載される構築物によって例示される。これらの構築物は全て狂犬病全長糖タンパク質(「G」)を発現する。構築物1は、メドイド(medoid)Gタンパク質配列をコードするものであり、狂犬病ウイルスのFlury-HEP及びERA株と密接に関連している。構築物2は、認可されたRABAVERTワクチンの株であるFlury-LEP株の野生型配列(GenBankGU565703.1)をコードしている。構築物3及び4は、Flury-LEP株の野生型配列に由来する。構築物3は、GENEWIZが提供する独自のバイオインフォマティクスプラットフォームを用いてコドン最適化した。構築物4は、Coleman et al. (2008) Science 320:1784により記載されたコドン対脱最適化に使用される表に基づいて、コドン対最適化した。Colemanらにより同定された高スコアを用いて、バイオインフォマティクスツール又は計算アルゴリズムを使用せずに、手動でコドン対最適化を実施した。構築物1〜4のDNA配列のアラインメント比較を図1Bに示す。

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