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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、組織および/または生体液試料を含む、生体試料中活性化可能抗体治療薬の活性化および他の特性を定性的におよび/または定量的に分析するための方法およびキットを提供する。本発明はまた、キャピラリーベースイムノアッセイプラットフォームを使用して、組織および/または生体液試料を含む、生体試料中の活性化のレベルを定性的におよび/または定量的に分析する方法に関する。

概要

背景

抗体ベース治療薬は、いくつかの疾患の効果的な治療法であることが証明されているが、場合によっては、幅広い標的発現による毒性により治療効果が制限される。さらに、抗体ベースの治療薬は、投与後の循環からの急速なクリアランスなど、他の制限を呈する。小分子治療の領域では、活性化学成分のプロドラッグを提供するために、戦略が開発されている。こうしたプロドラッグは、比較的不活性な(または著しく活性が低い)形態で投与される。投与されると、プロドラッグは、活性化合物へとin vivoで代謝される。こうしたプロドラッグ戦略は、その意図された標的に対する薬物の選択性を高め、有害作用の低減をもたらし得る。

抗体ベースの治療薬の制限を克服するために、活性化可能抗体ベースの治療法が設計されている。

こうした活性化可能抗体ベースの治療薬の活性化を監視し、定量的に分析できる必要がある。

概要

本発明は、組織および/または生体液試料を含む、生体試料中の活性化可能抗体治療薬の活性化および他の特性を定性的におよび/または定量的に分析するための方法およびキットを提供する。本発明はまた、キャピラリーベースイムノアッセイプラットフォームを使用して、組織および/または生体液試料を含む、生体試料中の活性化のレベルを定性的におよび/または定量的に分析する方法に関する。A

目的

本開示は、キャピラリーベースのイムノアッセイプラットフォームを使用して、組織および/または生体液試料を含む、生体試料における活性化および活性化可能抗体活性化の他の特性を定性的および/または定量的に分析するための方法およびキットを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

活性化可能抗体の活性化レベル定量化する方法であって、i)装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を活性化可能抗体、活性化された活性化可能抗体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の成分を含む生体試料と接触させることであって、前記装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団は積層マトリックスおよび分離マトリックス事前に装填される、接触させることと、ii)各キャピラリー内で前記生体試料の1つ以上の高分子量(MW)成分を前記生体試料の1つ以上の低分子量(MW)成分から分離することと、iii)各キャピラリー内で前記高MW成分および前記低MW成分を固定することと、iv)各キャピラリーを少なくとも1つの活性化可能抗体に特異的である少なくとも第1の試薬で免疫プローブすることと、v)各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における前記第1の試薬のレベルを検出し定量化することとを含む、方法。

請求項2

テップi)の前に、少なくとも1つのキャピラリーまたはキャピラリーの集団に積層マトリックスおよび分離マトリックスを装填して前記少なくとも1つの充填されたキャピラリーまたは充填されたキャピラリーの集団を作製することをさらに含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記生体試料が、活性化可能抗体を含む少なくとも1つの高分子量成分および活性化された活性化可能抗体を含む少なくとも1つの低分子量成分を含む、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

ステップii)が、キャピラリー電気泳動により各キャピラリー内で前記生体試料の高分子量成分を前記生体試料の低分子量成分から分離することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

前記分離ステップが、少なくとも約35分、または少なくとも約36分、または少なくとも約37分、または少なくとも約38分の分離時間にわたって実施される、請求項4に記載の方法。

請求項6

ステップiii)が、UV光を使用して前記生体試料の前記高MW成分および前記低MW成分を固定化することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

前記活性化可能抗体が、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、および結合型多重特異性活性化可能抗体からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

ステップiv)における前記第1の試薬が、前記少なくとも1つの活性化可能抗体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

前記第1の試薬が、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項8に記載の方法。

請求項10

前記抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせの可変軽鎖(VL)CDRに結合し、前記VLCDRが、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。

請求項11

前記第1の試薬が、検出可能な試薬である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

ステップiv)が、各キャピラリーに前記第1の試薬に特異的に結合する第2の試薬を装填することをさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

前記第2の試薬が、二次抗体を含む、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記第2の試薬が、検出可能な標識を含む、請求項12に記載の方法。

請求項15

前記第2の試薬が、検出可能な標識に結合された二次抗体を含む、請求項13に記載の方法。

請求項16

前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項15に記載の方法。

請求項17

前記検出可能な標識が、西ワサビペルオキシダーゼ(HRP)およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるレポーター酵素である、請求項15に記載の方法。

請求項18

前記レポーター酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記二次抗体が、検出可能な標識に結合されない、請求項13に記載の方法。

請求項20

前記二次抗体が、一組の第1の結合タグおよび第2の結合タグの第1の結合タグに結合され、前記第1の結合タグが前記第2の結合タグに結合可能である、請求項19に記載の方法。

請求項21

ステップiv)が、各キャピラリーに前記第2の試薬に特異的に結合する第3の試薬を装填することをさらに含む、請求項19〜20のいずれか一項に記載の方法。

請求項22

前記第3の試薬が、前記第2の結合タグに結合されたレポーター酵素を含む、請求項21に記載の方法。

請求項23

前記レポーター酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項22に記載の方法。

請求項24

前記第1の結合タグおよび第2の結合タグが、それぞれ、ビオチンおよびストレプトアビジン、ストレプトアビジンおよびビオチン、ビオチンおよびアビジン、ならびにアビジンおよびビオチンからなる群から選択される、請求項22または23に記載の方法。

請求項25

前記第2の試薬が、ビオチンに結合された二次抗体であり、かつ前記第3の試薬が、ストレプトアビジンに結合されたレポーター酵素である、請求項24に記載の方法。

請求項26

前記第2の試薬が、ストレプトアビジンに結合された二次抗体であり、かつ前記第3の試薬が、ビオチンに結合されたレポーター酵素である、請求項24に記載の方法。

請求項27

前記レポーター酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項22〜26のいずれか一項に記載の方法。

請求項28

前記第3の試薬が、検出可能な三次抗体を含む、請求項21に記載の方法。

請求項29

ステップiv)が、各キャピラリーに化学発光基質および比色基質からなる群から選択される基質を装填することをさらに含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。

請求項30

前記基質が、化学発光基質であり、かつステップv)が、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における化学発光のレベルを検出することを含む、請求項29に記載の方法。

請求項31

前記化学発光基質が、ルミノールであり、かつステップiv)が、各キャピラリーに過酸化物を装填することをさらに含む、請求項30に記載の方法。

請求項32

ステップi)が、約1〜500ngの生体試料を装填することを含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。

請求項33

ステップi)が、約5〜40ngの生体試料を装填することを含む、請求項32に記載の方法。

請求項34

前記生体試料が、分子量分離をもたらすのに十分な量で1つ以上のSDS含有緩衝液を用いて調製される、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。

請求項35

前記生体試料が、体液である、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。

請求項36

前記体液が、血液、血漿、および血清からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。

請求項37

前記生体試料が、病変組織である、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。

請求項38

前記病変組織が、溶解物である、請求項37記載の方法。

請求項39

前記疾患組織が、腫瘍組織である、請求項38に記載の方法。

請求項40

v)各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における前記第1の試薬のレベルを定量化することが、直接的にまたは間接的にのいずれかで検出される、第1の試薬のレベルを、活性化可能抗体についておよび活性化された活性化可能抗体についての標準曲線と、比較することを含む、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。

請求項41

アミノ酸配列SYGMS(配列番号438)を含む可変重鎖相補性決定領域1(CDRH1);アミノ酸配列TISPSGIYTYYPVTVKG(配列番号439)を含む可変重鎖相補性決定領域2(CDRH2);アミノ酸配列HHPNYGSTYLYYIDY(配列番号440)を含む可変重鎖相補性決定領域3(CDRH3);アミノ酸配列KSSSVFSSSNQKNYLA(配列番号441)を含む可変軽鎖相補性決定領域1(CDRL1);アミノ酸配列WAFTRES(配列番号442)を含む可変軽鎖相補性決定領域2(CDRL2);およびアミノ酸配列YQYLSSLT(配列番号443)を含む可変軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)を含む単離された抗体またはその抗原結合断片。

請求項42

前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項41に記載の抗体またはその抗原結合断片。

請求項43

抗体またはその抗原結合断片が、配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項41または請求項42に記載の抗体またはその抗原結合断片。

請求項44

配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む単離された抗体またはその抗原結合断片。

請求項45

配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む請求項44に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。

請求項46

配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む単離された抗体またはその抗原結合断片。

請求項47

配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む請求項44に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。

請求項48

(i)活性化可能抗体の標準曲線試薬;(ii)活性化された活性化可能抗体の標準曲線試薬;および(iii)前記活性化可能抗体に対する結合特異性を有する抗id一次抗体を含むキット

技術分野

0001

関連出願への相互参照
本出願は、2017年7月20日に出願の米国仮出願第62/534,931号(35 USC§119(e))に基づく利益を主張する。その内容は、その全体が援用によって本明細書に組み込まれる。

0002

技術分野
本発明は一般に、組織および/または生体液試料などの生体試料中活性化可能抗体治療薬の活性化および他の特性を定性的および/または定量的に分析するための方法に関する。本発明はまた、キャピラリーベースイムノアッセイプラットフォームを使用して、組織および/または生体液試料などの生体試料中の活性化レベルを定性的および/または定量的に分析する方法に関する。

背景技術

0003

抗体ベースの治療薬は、いくつかの疾患の効果的な治療法であることが証明されているが、場合によっては、幅広い標的発現による毒性により治療効果が制限される。さらに、抗体ベースの治療薬は、投与後の循環からの急速なクリアランスなど、他の制限を呈する。小分子治療の領域では、活性化学成分のプロドラッグを提供するために、戦略が開発されている。こうしたプロドラッグは、比較的不活性な(または著しく活性が低い)形態で投与される。投与されると、プロドラッグは、活性化合物へとin vivoで代謝される。こうしたプロドラッグ戦略は、その意図された標的に対する薬物の選択性を高め、有害作用の低減をもたらし得る。

0004

抗体ベースの治療薬の制限を克服するために、活性化可能抗体ベースの治療法が設計されている。

0005

こうした活性化可能抗体ベースの治療薬の活性化を監視し、定量的に分析できる必要がある。

0006

本発明は、活性化可能抗体の活性化レベルを定量化する方法に関し、本方法は:
i)装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を、活性化可能抗体、活性化された活性化可能抗体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の成分を含む生体試料と接触させることであって、
装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団は、積層マトリックスおよび分離マトリックス事前に装填される、接触させることと、
ii)各キャピラリー内で生体試料の1つ以上の高分子量(MW)成分を、生体試料の1つ以上の低分子量(MW)成分から分離することと、
iii)各キャピラリー内で高MW成分および低MW成分を固定することと、
iv)少なくとも1つの活性化可能抗体に特異的である少なくとも第1の試薬で各キャピラリーを免疫プローブすることと、
v)各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における第1の試薬のレベルを検出し、定量化することと
を含む。

0007

一実施形態では、ステップii)は、キャピラリー電気泳動により各キャピラリー内の生体試料の高分子量成分を生体試料の低分子量成分から分離することを含む。

0008

さらなる実施形態では、活性化可能抗体は、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、および結合型多重特異性活性化可能抗体からなる群から選択される。

0009

いくつかの実施形態では、第1の試薬は、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む。

0010

別の実施形態では、ステップiv)は、第1の試薬に特異的に結合する第2の試薬を各キャピラリーに装填することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第2の試薬は検出可能に標識される。他の実施形態では、第2の試薬は検出可能に標識されておらず、ステップiv)は、第2の試薬に特異的に結合する第3の試薬を各キャピラリーに装填することをさらに含む。

0011

さらなる実施形態では、本発明は、以下を含むキットを提供する:
(i)活性化可能抗体の標準曲線試薬;
(ii)活性化された活性化可能抗体の標準曲線試薬;
(iii)活性化可能抗体に対する結合特異性を有する抗id一次抗体

図面の簡単な説明

0012

1:100でのヒト血漿中0.11、0.33、1μg/mlで37%の1つのアームの活性化された活性化可能抗体に対するPL07−2001−C5H9v2抗イディオタイプ(抗−id)クローンスクリーニングを示す一連グラフである。図1Aは1アーム活性化PL07−2001−C5H9v2(1μg/ml、0.33μg/ml、および0.11μg/ml、図中ではAAMIXと称する)の濃度が低下している17G1の検出を示すエレクトロフェログラムである。
1:100でのヒト血漿中0.11、0.33、1μg/mlで37%の1つのアームの活性化された活性化可能抗体に対するPL07−2001−C5H9v2抗イディオタイプ(抗−id)クローンのスクリーニングを示す一連のグラフである。図1Bは1アームの活性化された活性化可能抗体の上位6クローンの相対活性化率を示す図である。相対活性化率は、様々な濃度で保持される。21H10および27C1クローンは、低い親和性を有するため、0.11μg/ml濃度に関するデータはない。
本明細書において17G1と称される抗体が活性化可能抗体(AA)PL07−2001−C5H9v2に対して高い特異性を有することを示す一連のグラフである。17G1は、160ng/mlの1アームの活性化されたPL07−2001−C5H9v2(活性化AA)をヒト血漿(図2C)または肺腫瘍溶解物図2D)のいずれかにスパイクすることにより、Wesで特異性を評価された。
本明細書において17G1と称される抗体が活性化可能抗体(AA)PL07−2001−C5H9v2に対して高い特異性を有することを示す一連のグラフである。17G1は、160ng/mlの1アームの活性化されたPL07−2001−C5H9v2(活性化AA)をヒト血漿(図2C)または肺腫瘍溶解物(図2D)のいずれかにスパイクすることにより、Wesで特異性を評価された。
本明細書において17G1と称される抗体が活性化可能抗体(AA)PL07−2001−C5H9v2に対して高い特異性を有することを示す一連のグラフである。17G1は、160ng/mlの1アームの活性化されたPL07−2001−C5H9v2(活性化AA)をヒト血漿(図2C)または肺腫瘍溶解物(図2D)のいずれかにスパイクすることにより、Wesで特異性を評価された。
本明細書において17G1と称される抗体が活性化可能抗体(AA)PL07−2001−C5H9v2に対して高い特異性を有することを示す一連のグラフである。17G1は、160ng/mlの1アームの活性化されたPL07−2001−C5H9v2(活性化AA)をヒト血漿(図2C)または肺腫瘍溶解物(図2D)のいずれかにスパイクすることにより、Wesで特異性を評価された。
選択的抗イディオタイプ抗体による活性化可能抗体(AA)治療薬の特異的検出を示す一連のグラフである。図3Aは、American Qualex(ウェブサイトaqsp.com/より入手可能)の市販のA110UK(非標識サルに対して吸着させたヤギ抗ヒトIgG(H&L))を用いて10mg/kgのPL07−2001−C5H9v2で処置したマウス血漿中での、抗PDL1活性化可能抗体(本明細書においてPL07−2001−C5H9v2と称する)の検出を示している。
選択的抗イディオタイプ抗体による活性化可能抗体(AA)治療薬の特異的検出を示す一連のグラフである。図3Bは、抗イディオタイプ17G1抗体を使用して0.1mg/kgのPL07−2001−C5H9v2で処置したマウスの血漿中での、PL07−2001−C5H9v2の検出を示す図である。
異種移植片腫瘍モデルで検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体(AA)治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。MDA−MB−231異種移植マウスを、1mg/mlの抗PDL1活性化可能抗体(本明細書ではPL07−2001−C5H9v2と称する)で処置した。腫瘍試料および血漿試料を、4日目に採取した。図4Aおよび図4Bは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
異種移植片腫瘍モデルで検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体(AA)治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。MDA−MB−231異種移植マウスを、1mg/mlの抗PDL1活性化可能抗体(本明細書ではPL07−2001−C5H9v2と称する)で処置した。腫瘍試料および血漿試料を、4日目に採取した。図4Aおよび図4Bは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
別の異種移植片腫瘍モデルで検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。SAS異種移植マウスを、0.1mg/kgの抗PDL1活性化可能抗体(本明細書ではPL07−2001−C5H9v2と称する)で処置した。図5Aおよび図5Bは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
別の異種移植片腫瘍モデルで検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。SAS異種移植マウスを、0.1mg/kgの抗PDL1活性化可能抗体(本明細書ではPL07−2001−C5H9v2と称する)で処置した。図5Aおよび図5Bは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
抗CD166活性化可能抗体(本明細書では7614.6−3001−HuCD166と称する)を用いて異種移植片腫瘍モデルにおいて検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。H292異種移植マウスを、5mg/kgの7614.6−3001−HuCD166で処置した。腫瘍試料および血漿試料を、1日目に採取した。図6Aおよび図6Bは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
抗CD166活性化可能抗体(本明細書では7614.6−3001−HuCD166と称する)を用いて異種移植片腫瘍モデルにおいて検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。H292異種移植マウスを、5mg/kgの7614.6−3001−HuCD166で処置した。腫瘍試料および血漿試料を、1日目に採取した。図6Aおよび図6Bは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
異なる基質を含むEGFR活性化可能抗体を用いて異種移植片腫瘍モデルにおいて検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。H292異種移植マウスを25mg/kgのC225−3954−2001またはC225−3954−3001活性化可能抗体治療薬のいずれかにより処置した。腫瘍試料および血漿試料を、4日目に採取した。図7Aおよび図7Bは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
異なる基質を含むEGFR活性化可能抗体を用いて異種移植片腫瘍モデルにおいて検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。H292異種移植マウスを25mg/kgのC225−3954−2001またはC225−3954−3001活性化可能抗体治療薬のいずれかにより処置した。腫瘍試料および血漿試料を、4日目に採取した。図7Aおよび図7Bは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
生体試料中の活性化された抗CD71活性化可能抗体(本明細書ではTF02.13−2011−21.12と称する)と活性化されていない抗CD71活性化可能抗体との比を評価するための本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法から得られた結果のグラフである。この方法を用いて、ヒト血漿の存在下において活性化されていない、すなわち完全な活性化可能抗体と混合された活性化前活性化可能抗体を分離した。
生体試料中の活性化された抗PD1活性化可能抗体(本明細書ではPD34−2011−A1.5 hIgG4 S228Pと称する)と活性化されていない抗PD1活性化可能抗体との比を評価するために、本開示のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法を使用して得られた結果を示すグラフである。この方法を用いて、ヒト血漿の存在下において活性化されていない、すなわち完全な活性化可能抗体、と混合された活性化前活性化可能抗体を分離した。
抗CD166活性化可能抗体(本明細書では7614.6−3001−HuCD166と称する)を用いて活性化された活性化可能抗体(AA)治療薬(AA Tx)および完全な(すなわち、非活性化)活性化可能抗体(AA)治療薬(AA Tx)を評価するために、本開示のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法を使用して得られた結果を示す一連のグラフである。本発明のキャピラリー免疫アッセイ法を使用して、マトリプターゼ図10A)またはMMP−14(図10B)により部分的に活性化されている7614.6−3001−HuCD166活性化可能抗体を、完全な7614.6−3001−HuCD166活性化可能抗体から分離した。
抗CD166活性化可能抗体(本明細書では7614.6−3001−HuCD166と称する)を用いて活性化された活性化可能抗体(AA)治療薬(AA Tx)および完全な(すなわち、非活性化)活性化可能抗体(AA)治療薬(AA Tx)を評価するために、本開示のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法を使用して得られた結果を示す一連のグラフである。本発明のキャピラリー免疫アッセイ法を使用して、マトリプターゼ(図10A)またはMMP−14(図10B)により部分的に活性化されている7614.6−3001−HuCD166活性化可能抗体を、完全な7614.6−3001−HuCD166活性化可能抗体から分離した。
実施例11に記載されているとおり、それぞれ2段階検出プロトコルおよび三次検出プロトコルを用いて、活性化された活性化可能抗体(7614.6−3001−HuCD166の切断産物)および完全な/活性化された活性化可能抗体(完全7614.6−3001−HuCD166)の化学発光シグナルを示す図である。
実施例11に記載されているとおり、それぞれ2段階検出プロトコルおよび三次検出プロトコルを用いて、活性化された活性化可能抗体(7614.6−3001−HuCD166の切断産物)および完全な/活性化された活性化可能抗体(完全7614.6−3001−HuCD166)の化学発光シグナルを示す図である。
抗Jagged(完全な)活性化可能抗体5342−3001−4D11および腫瘍組織中の対応する活性化された活性化可能抗体について検出された化学発光シグナルを示す図である。

実施例

0013

本開示は、キャピラリーベースのイムノアッセイプラットフォームを使用して、組織および/または生体液試料を含む、生体試料における活性化および活性化可能抗体活性化の他の特性を定性的および/または定量的に分析するための方法およびキットを提供する。

0014

活性化可能抗体は典型的には、少なくとも以下の(i)標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB)、(ii)活性化可能抗体が切断されていない状態または完全な状態にあるときに、ABのその標的への結合を阻害するように、ABに連結されているマスキング部分(MM)、および(iii)ABに連結されている切断可能部分(CM)であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるCM、を含む。活性化可能抗体は一般に、CMの基質がそれに対する基質として機能するプロテアーゼの存在下で活性化され、プロテアーゼはCMの基質を切断し、このため「活性化された」(または「切断された」)活性化可能抗体を生じる。活性化可能抗体はまた、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体などの形態であってもよい。活性化可能抗体は、以下により詳細に記載される。

0015

生体試料中の活性化可能抗体の特性、例えば、生体試料中の活性化可能抗体の活性化レベル、生体試料中の活性化された、すなわち切断された活性化可能抗体および/または完全な、すなわち不活性化されている、活性化可能抗体の総量、またはそれらの任意の組み合わせまたは相関を定性的および/または定量的に測定できることは有用である。こうした方法は、開発および/または治療用処置の任意の段階での活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の有効性を監視するのに有用である。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびキットは、それを必要とする対象への投与前におよび/または治療計画中に活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の有効性を試験して全投与期間および/または投与期間後の活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の有効性を監視するために有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびキットは、活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の遡及的分析を提供するのに有用である。

0016

いくつかの実施形態では、本開示は、活性化可能抗体の活性化レベルを定量化する方法を提供し、この方法は、
i)装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を、活性化可能抗体、活性化された活性化可能抗体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の成分を含む生体試料と接触させることであって、
装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団は、積層マトリックスおよび分離マトリックスが事前に装填される、接触させることと、
ii)各キャピラリー内で生体試料の1つ以上の高分子量(MW)成分を、生体試料の1つ以上の低分子量(MW)成分から分離することと、
iii)各キャピラリー内で高MW成分および低MW成分を固定することと、
iv)少なくとも1つの活性化可能抗体に特異的である少なくとも第1の(一次)試薬で各キャピラリーを免疫プローブすることと、
v)各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における第1の(一次)試薬のレベルを検出し定量化することと
を含む。

0017

いくつかの実施形態では、方法は、ステップi)の前に、少なくとも1つのキャピラリーまたはキャピラリーの集団に積層マトリックスおよび分離マトリックスを装填して、少なくとも1つの装填したキャピラリーまたは装填したキャピラリーの集団を生成することをさらに含む。

0018

本明細書で使用される「積層マトリックス」という用語は、生体試料中に存在するタンパク質濃縮し、タンパク質が電気泳動条件下において同じ物理開始点からの移動を開始するように分離マトリックスとの界面にタンパク質を「積層する」ために機能する非常に多孔質である(分離マトリックスに対して)材料を指す。本発明の実施において使用される好適な積層マトリックスは、ウエスタンブロット法のための積層ゲルを調製するために使用されるのと同じ材料および組成物から調製され得る(例えば、アクリルアミド、0.5Mトリス−HCl(pH6.8)、SDS、水、過硫酸アンモニウム、およびN,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミンTEMED)など)。「分離マトリックス」という用語は、本明細書では、電気泳動条件下において、分子量に基づいてタンパク質の分離を促進する材料を指す。本発明の実施に使用される好適な分離マトリックスは、ウエスタンブロット法用の分離ゲルを調製するために使用される同じ材料および組成物から調製され得る(例えば、水、アクリルアミド、トリス−HCl(pH8.8)、SDS、TMED、過硫酸アンモニウムなど)。積層マトリックスおよび分離マトリックスが事前に装填されたキャピラリーは、例えばProteinSimple(Wes(商標)Separation ModuleキャピラリーカートリッジおよびWes(商標)キャピラリー電気泳動イムノアッセイシステムで使用するための関連試薬の供給元)から市販で得ることができる。

0019

次に、装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団は、生体試料と接触されて、装填された各キャピラリー中への生体試料の装填を開始する。生体試料は典型的には、(完全であるか、または切断されていない)活性化可能抗体(例えば、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体を含む)である少なくとも1つの比較的高分子量の成分および(切断された)活性化された活性化可能抗体である少なくとも1つの比較的低分子量の成分を含む。多くの場合、生体試料は、(完全であるか、または切断されていない)活性化可能抗体および(切断された)活性化された活性化可能抗体種の両方を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象からの体液を含む。いくつかの実施形態では、体液は、対象の身体のいずれの場所からでも単離される。いくつかの実施形態では、体液は、血液または血漿もしくは血清などの血液成分である。いくつかの実施形態では、生体試料は、細胞培養上清を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象からの組織試料を含む。組織試料は、対象の身体のいずれの場所からでも単離され得る。いくつかの実施形態では、組織試料は、腫瘍試料である。

0020

いくつかの実施形態では、生体試料は、ヒト、非ヒト霊長類愛玩動物(例えば、ネコイヌウマ)、農場動物、作業動物、または動物園の動物などの哺乳動物由来する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は愛玩動物である。いくつかの実施形態では、対象は獣医の治療を受けている動物である。

0021

いくつかの実施形態では、ステップi)は、約1〜500ngの生体試料または約1〜500ngの生体試料の任意の値および/または範囲を装填することを含む。いくつかの実施形態では、ステップi)は、約5〜40ngの生体試料を装填することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、結果として分子量の分離をもたらすのに十分な量の1つ以上の緩衝液を使用して調製される。いくつかの実施形態では、生体試料は、結果として分子量の分離をもたらすのに十分な量の1つ以上のSDS含有緩衝液を使用して調製される。

0022

各キャピラリー中で生体試料の1つ以上の低分子量成分(複数可)(例えば(切断された)活性化された活性可能化抗体)から1つ以上の高分子量成分(複数可)(例えば(完全な活性化可能抗体))を分離することは、各キャピラリーを電気泳動にかけることにより達成され得る。電気泳動により、生体試料中の化合物は、分子サイズ(分子量など)に応じて異なる速度で分離ゲル中を移動する。いくつかの実施形態では、分離は、約35分未満の期間(すなわち、「分離時間」)にわたって実行される。多くの場合、分離時間は少なくとも約35分、または少なくとも約36分、または少なくとも約37分、または少なくとも約38分である。

0023

任意の好適な固定化方法および試薬を使用して、各キャピラリー内の高分子量成分および低分子量成分を(例えば、各キャピラリーの内部表面に)固定化できる。いくつかの実施形態では、ステップiii)は、生体試料の高MW成分(例えば(完全な)活性化可能抗体)および低MW成分(例えば(切断された)活性化された活性化可能抗体)を固定するためにUV光を使用することを含む。このステップにより、生体試料中に存在する(完全な)活性化可能抗体および(切断された)活性化可能抗体が結果として固定化される。キャピラリー電気泳動および固定化ステップを実行するための好適であるシステムは、Wes(商標)キャピラリー電気泳動イムノアッセイシステム(ProteinSimple)である。

0024

本発明の方法を実施する際、少なくとも1つの活性化可能抗体に対し結合特異性を有する第1の試薬を使用して、各キャピラリーを免疫プローブする。典型的には、第1の試薬は一次抗体である。多くの場合、第1の試薬は、抗イディオタイプ(id)抗体またはその抗原結合断片を含む。活性化可能抗体のMMおよびCMが活性化可能抗体の軽鎖に結合される場合、活性化可能抗体の可変軽鎖(VL)領域に結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が典型的に使用される。多くの場合、これらの実施形態では、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、VLCDR1、VL CDR2、およびVL CDR3からなる群から選択されるVL CDRに対する結合特異性を有する。活性化可能抗体のMMおよびCMが活性化可能抗体の重鎖に結合される場合、活性化可能抗体の可変重鎖(VH)領域に結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が典型的に使用される。これらの実施形態では、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は多くの場合、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3からなる群から選択されるVH CDRに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、2つ以上の抗イディオタイプ抗体種(またはその抗原結合断片)の組み合わせを使用することが望ましい場合がある。例示的な抗id抗体および本発明の方法におけるそれらの使用は、以下の実施例に記載される。

0025

第1の試薬の検出は、様々な方法で達成され得る。例えば、一実施形態では、ステップv)は、各キャピラリーを、第1の試薬に特異的に結合するかまたは第1の試薬を認識するさらなる第2の試薬で免疫プローブすることをさらに含む。この実施形態では、各キャピラリーに第2の試薬が装填される。典型的には、第2の試薬は、第1の試薬に特異的に結合する二次抗体を含む。

0026

いくつかの実施形態では、第1および/または第2の試薬は検出可能に標識される。本明細書で使用される「検出可能な標識」という用語は、例えば、蛍光標識レポーター酵素(例えば、化学発光基質比色分析基質などと組み合わせて使用される)など、直接的または間接的に検出され得る部分を指す。例示的なレポーター酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ(例えば、西ワサビペルオキシダーゼ(HRP)など)、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。本発明の実施における使用に好適である検出可能に標識される例示的な第2の試薬としては、HRP結合抗マウス二次抗体、HRP結合抗ヤギ二次抗体、HRP結合抗ヒト二次抗体などが挙げられる。多くの場合、最終的に検出されるシグナルを提供するために化学発光基質が追加される。好適な化学発光基質系は、当技術分野で公知であり、例えば、ルミノール過酸化物などが挙げられる。

0027

他の実施形態では、第2の試薬は検出可能に標識されていない(例えば、レポーター酵素などの検出可能な標識に結合されない)。この実施形態では、第2の試薬は典型的には、第1および第2の結合タグのセットの第1の結合タグに通常結合される二次抗体であり、第1の結合タグは第2の結合タグに結合できる。第2の試薬に特異的に結合する第3の(三次)試薬を各キャピラリーに装填するステップv)をさらに含む方法が、実行される。第3の試薬は典型的には、第2の結合タグ、および例えばレポーター酵素または蛍光標識などの検出可能な標識を含む。例示的な第1および第2の結合タグとしては、それぞれ、ビオチンおよびストレプトアビジン、ストレプトアビジンおよびビオチン、ビオチンおよびアビジン、ならびにアビジンおよびビオチンなどが挙げられる。この「三次検出法」は、活性化可能抗体および活性化可能抗体種に関連するシグナルを増強すると考えられ、このため、検出および定量化ステップを容易にする。この実施形態で使用される例示的な第2および第3の試薬としては、ストレプトアビジンに結合した二次抗体である第2の試薬、およびビオチンに結合したレポーター酵素である第3の試薬(例えば、HRP結合ビオチン)が挙げられる。化学発光系は通常、最終的に検出されるシグナルを生成するために使用される(例えば、ルミノール+過酸化物)。この方法は、本明細書の実施例11に示されている。

0028

いくつかの実施形態では、ステップv)の少なくとも1つの検出可能な試薬は、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的な少なくとも第1の試薬、および第1の試薬に特異的に結合するか、または第1の試薬を認識する第2の試薬を含み、第2の試薬は検出可能な標識を含む。

0029

いくつかの実施形態では、ステップv)は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における検出可能な標識のレベルを定量化することを含む。

0030

いくつかの実施形態では、ステップiv)の第1の試薬は、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ステップiv)の第2の試薬は、第1の試薬に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体である。いくつかの実施形態では、ステップiv)の第1の試薬は、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体またはその抗原結合断片であり、ステップiv)の第2の試薬は、一次抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体である。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は第2の試薬に結合される。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である。

0031

いくつかの実施形態では、一次試薬二次試薬、および/または三次試薬、または一次試薬、二次試薬、および三次試薬のそれぞれは、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、標的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体ドメイン抗体単鎖抗体Fab断片、F(ab’)2断片、scFv、scAb、dAb、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合するこうした抗体またはその抗原結合断片は、マウス、他のげっ歯類キメラヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。

0032

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、本明細書の例えば実施例1に記載の方法を使用して生成される。

0033

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、アミノ酸配列SYGMS(配列番号438)を含む可変重鎖相補性決定領域1(CDRH1);アミノ酸配列TISPSGIYTYYPVTVKG(配列番号439)を含む可変重鎖相補性決定領域2(CDRH2);アミノ酸配列HHPNYGSTYLYYIDY(配列番号440)を含む可変重鎖相補性決定領域3(CDRH3);アミノ酸配列KSSSVFSSSNQKNYLA(配列番号441)を含む可変軽鎖相補性決定領域1(CDRL1);アミノ酸配列WAFTRES(配列番号442)を含む可変軽鎖相補性決定領域2(CDRL2);およびアミノ酸配列YQYLSSLT(配列番号443)を含む可変軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)を含む。

0034

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。

0035

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

0036

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖、および配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

0037

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。

0038

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。

0039

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列、および配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。

0040

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号444のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

0041

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号445のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

0042

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号444のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号445のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

0043

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号444のアミノ酸配列を含む重鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。

0044

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号445のアミノ酸配列を含む軽鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。

0045

いくつかの実施形態では、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号444のアミノ酸配列を含む重鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列、および配列番号445のアミノ酸配列を含む軽鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。

0046

いくつかの実施形態では、検出可能な標識は第2の試薬に結合される。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、例えばHRPなどの蛍光標識であり、ステップv)は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における化学発光のレベルを検出することを含む。

0047

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中の1つ以上の活性化可能抗体の活性化を定量化するために使用される。例えば、活性化は、検出された活性化可能抗体種および活性化された活性化可能抗体種の総量を基準にしたパーセンテージとして計算され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中の活性化された活性化可能抗体または活性化可能抗体ベースの治療薬、および完全な活性化可能抗体または活性化可能抗体ベースの治療薬の量を比較するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中のin vivoでのプロテアーゼ活性プロファイリング層別化、または分類するために使用される。検出ステップから得られるシグナルピーク属性(すなわち、分子量に対応して検出されたシグナルに対応する)は、第1の試薬のレベルを定量化するための基礎として使用できる(すなわち、直接的に、または検出可能に標識された二次もしくは検出可能に標識された三次試薬を介して間接的に検出される)。例えば、ピーク高さまたは曲線下面積および他の同様の方法を利用してもよい。典型的には、ステップv)は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団中の第1の試薬のレベルを定量化することを含み、直接的または間接的のいずれかで検出された第1の試薬のレベルを、活性化可能抗体および活性化された活性化可能抗体の標準曲線と比較することを含む。標準曲線の作成は、以下の実施例13に示される。

0048

本明細書に記載されるとおり、いくつかの実施形態では、活性化可能抗体ベースの治療薬は、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせである。

0049

いくつかの実施形態では、一次試薬、二次試薬、または一次試薬と二次試薬との両方は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、標的を結合する抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、scFv、scAb、dAb、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合するこうした抗体またはその抗原結合断片は、マウス、他のげっ歯類、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。

0050

本発明の方法を使用して、様々な構造のいずれかを有する活性化可能抗体の活性化を検出し、定量化することができる。完全な活性化可能抗体構造の構造と活性化された/切断された活性化可能抗体構造の構造との一般的な違いは、比較的小さい分子量での違いである。最も複雑な生体試料からであっても検出および定量化を実現できる。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、キャピラリーをベースとした免疫アッセイプラットフォームを使用して、組織試料および/または血漿試料を含む、生体試料における活性化可能抗体治療活性化を定性的および/または定量的に分析するための方法を提供する。本明細書で提供される方法は、例えば、活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む活性化可能抗体ベースの治療薬と共に有用である。特に別に定義されない限り、本明細書で提供される方法での使用のために好適な活性化可能抗体に関するすべての開示は、非限定的な例として、活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、他の活性化可能抗体のベースの治療にも適用可能であり、かつ好適である。

0051

いくつかの実施形態では、本開示は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB)、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、ABの標的への結合を阻害するように、ABの軽鎖に連結されるマスキング部分(MM)、および、ABに連結される切断可能部分(CM)であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるCM、を有する活性化可能抗体治療薬の活性化を定性的および/または定量的に分析するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法を使用して、少なくとも(i)CMが切断されかつMMがABの軽鎖に連結されない活性化された活性化可能抗体のレベル、および(ii)MMおよびCMがABの軽鎖に連結される完全な活性化可能抗体のレベル、を定量化するか、またはさもなければ比較する。

0052

いくつかの実施形態では、標的を特異的に結合する活性化可能抗体および/または結合型活性化可能抗体のABは、抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合する抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、scFv、scAb、dAb、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合するこうした抗体またはその抗原結合断片は、マウス、他のげっ歯類、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。

0053

活性化された状態にある活性化可能抗体は、標的を結合し、かつ、(i)標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB);(ii)活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、ABの標的への結合を阻害するように、ABに連結されるマスキング部分(MM)、および(iii)ABに連結される切断可能部分(CM)であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるCM、を含む。

0054

いくつかの実施形態では、切断されていない状態にある活性化可能抗体は、以下のようにN末端からC末端への構造的配置を有する:MM−CM−ABまたはAB−CM−MM。

0055

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、MMとCMの間に連結ペプチドを含む。

0056

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、CMとABの間に連結ペプチドを含む。

0057

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、第1の連結ペプチド(LP1)および第2の連結ペプチド(LP2)を含み、切断されていない状態にある活性化可能抗体は、以下のようにN末端からC末端への構造的配置を有する:MM−LP1−CM−LP2−ABまたはAB−LP2−CM−LP1−MM。いくつかの実施形態では、2つの連結ペプチドは互いに同一である必要はない。

0058

いくつかの実施形態では、LP1またはLP2の少なくとも一方は、(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n(配列番号339)および(GGGS)n(配列番号340)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、nは少なくとも1つの整数であり、いくつかの実施形態では、20を超えない。

0059

いくつかの実施形態では、LP1またはLP2の少なくとも一方は、GGSG(配列番号341)、GGSGG(配列番号342)、GSGSG(配列番号343)、GSGGG(配列番号344)、GGGSG(配列番号345)、SSSG(配列番号346)およびGGGSSGGS(配列番号449)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0060

いくつかの実施形態では、LP1は、アミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG(配列番号347)、GSSGGSGGSGG(配列番号348)、GSSGGSGGSGGS(配列番号349)、GSSGGSGGSGGSGGGS(配列番号350)、GSSGGSGGSG(配列番号351)、またはGSSGGSGGSGS(配列番号352)を含む。

0061

いくつかの実施形態では、LP2は、アミノ酸配列GSS、GGS、GGGS(配列番号353)、GSSGT(配列番号354)、またはGSSG(配列番号355)を含む。

0062

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB)を含む。いくつかの実施形態では、標的を結合する抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Fab断片、F(ab’)2断片、scFv、scAb、dAb、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合するこうした抗体またはその抗原結合断片は、マウス、他のげっ歯類、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。

0063

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの解離定数よりも大きい、ABへの結合についての解離定数を有する。

0064

いくつかの実施形態では、MMは、標的に対するABの解離定数以下の、ABへの結合についての解離定数を有する。

0065

いくつかの実施形態では、MMは、ABへの結合についての解離定数を有し、これは、標的へのABの解離定数と同等である。

0066

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの解離定数未満である、ABへの結合についての解離定数を有する。

0067

いくつかの実施形態では、ABに対するMMの解離定数(Kd)は、標的へのABの解離定数の2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍以上、または1〜5、5〜10、10〜100、10〜1,000、10〜10,000、10〜100,000、10〜1,000,000、10〜10,000,000、100〜1,000、100〜10,000、100〜100,000、100〜1,000,000、100〜10,000,000、1,000〜10,000、1,000〜100,000、1,000〜1,000,000、1000〜10,000,000、10,000〜100,000、10,000〜1,000,000、10,000〜10,000,000、100,000〜1,000,000、もしくは100,000〜10,000,000倍程度である。

0068

いくつかの実施形態では、MMは、活性化可能抗体が切断された状態にある場合に、標的への結合について、ABと干渉または競合しない。

0069

いくつかの実施形態では、MMは、約2〜40アミノ酸長のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、MMは、最大約40アミノ酸長のポリペプチドである。

0070

いくつかの実施形態では、MMポリペプチド配列は標的の配列とは異なる。いくつかの実施形態では、MMポリペプチド配列は、ABの任意の天然結合パートナーと50%程度の同一性である。いくつかの実施形態では、MMポリペプチド配列は標的の配列とは異なり、ABの天然の結合パートナーとの同一性は、40%、30%、25%、20%、15%、または10%程度である。

0071

いくつかの実施形態では、ABへのMMの連結は、標的を結合するABの能力を低下させ、これにより、標的に向かってMMに連結されるときのABの解離定数(Kd)は、標的に向かってMMに連結されないときのABのKdよりも少なくとも2倍大きい。

0072

いくつかの実施形態では、ABへのMMの連結は、標的を結合するABの能力を低下させ、これにより、標的に向かってMMに連結されるときのABの解離定数(Kd)は、標的に向かってMMに連結されないときのABのKdよりも少なくとも5倍大きい。

0073

いくつかの実施形態では、ABへのMMの連結は、標的を結合するABの能力を低下させ、これにより、標的に向かってMMに連結されるときのABの解離定数(Kd)は、標的に向かってMMに連結されないときのABのKdよりも少なくとも10倍大きい。

0074

いくつかの実施形態では、ABへのMMの連結は、標的を結合するABの能力を低下させ、これにより、標的に向かってMMに連結されるときのABの解離定数(Kd)は、標的に向かってMMに連結されないときのABのKdよりも少なくとも20倍大きい。

0075

いくつかの実施形態では、ABへのMMの連結は、標的を結合するABの能力を低下させ、これにより、標的に向かってMMに連結されるときのABの解離定数(Kd)は、標的に向かってMMに連結されないときのABのKdよりも少なくとも40倍大きい。

0076

いくつかの実施形態では、ABへのMMの連結は、標的を結合するABの能力を低下させ、これにより、標的に向かってMMに連結されるときのABの解離定数(Kd)は、標的に向かってMMに連結されないときのABのKdよりも少なくとも100倍大きい。

0077

いくつかの実施形態では、ABへのMMの連結は、標的を結合するABの能力を低下させ、これにより、標的に向かってMMに連結されるときのABの解離定数(Kd)は、標的に向かってMMに連結されないときのABのKdよりも少なくとも1000倍大きい。

0078

いくつかの実施形態では、ABへのMMの連結は、標的を結合するABの能力を低下させ、これにより、標的に向かってMMに連結されるときのABの解離定数(Kd)は、標的に向かってMMに連結されないときのABのKdよりも少なくとも10,000倍大きい。

0079

いくつかの実施形態では、標的の存在下で、MMは、例えば、PCT国際公開番号第2010/081173号(その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載のアッセイなどの標的置換アッセイを使用してin vitroでアッセイされる場合に、CMが切断される場合と比較して、CMが切断されないときに、標的を結合するABの能力を少なくとも90%低下させる。

0080

いくつかの実施形態では、CMを切断するプロテアーゼは、疾患組織において活性であり、例えば上方制御されているか、そうでなければ制御されておらず、プロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに曝露されるときに活性化可能抗体中のCMを切断する。

0081

いくつかの実施形態では、プロテアーゼは組織中の標的と共局在し、プロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに曝露されるときに、活性化可能抗体中のCMを切断する。

0082

いくつかの実施形態では、CMは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾AB結合の解離定数よりも少なくとも2倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態(すなわち、活性化可能抗体が切断された状態にある場合)では、ABは標的を結合する。

0083

いくつかの実施形態では、CMは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾AB結合の解離定数よりも少なくとも5倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態(すなわち、活性化可能抗体が切断された状態にある場合)では、ABは標的を結合する。

0084

いくつかの実施形態では、CMは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾AB結合の解離定数よりも少なくとも10倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態(すなわち、活性化可能抗体が切断された状態にある場合)では、ABは標的を結合する。

0085

いくつかの実施形態では、CMは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾AB結合の解離定数よりも少なくとも20倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態(すなわち、活性化可能抗体が切断された状態にあるとき)では、ABは標的を結合する。

0086

いくつかの実施形態では、CMは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾AB結合の解離定数よりも少なくとも40倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態では、ABは標的を結合する。

0087

いくつかの実施形態では、CMは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾AB結合の解離定数よりも少なくとも50倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態では、ABは標的を結合する。

0088

いくつかの実施形態では、CMは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾AB結合の解離定数よりも少なくとも100倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態では、ABは標的を結合する。

0089

いくつかの実施形態では、CMは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾AB結合の解離定数よりも少なくとも200倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態では、ABは標的を結合する。

0090

いくつかの実施形態では、CMは、最大15アミノ酸長のポリペプチドである。

0091

いくつかの実施形態では、CMは、少なくとも1つのマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の基質である第1の切断可能部分(CM1)、および少なくとも1つのセリンプロテアーゼ(SP)の基質である第2の切断可能部分(CM2)を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質のCM1基質配列およびCM2基質配列のそれぞれは独立して、最大15アミノ酸長のポリペプチドである。

0092

いくつかの実施形態では、CMは、癌において上方制御されるか、そうでなければ制御されない、またはそのように考えられる少なくとも1つのプロテアーゼの基質である。

0093

いくつかの実施形態では、CMは、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、トロンビン好中球エラスターゼシステインプロテアーゼレグマイン、およびセリンプロテアーゼ、例えばマトリプターゼ(MT−SP1)、およびウロキナーゼ(uPA)からなる群から選択される少なくとも1つのプロテアーゼの基質である。理論に束縛されることなく、これらのプロテアーゼは、癌の少なくとも1つで上方制御されるか、そうでなければ制御されないと考えられている。

0094

例示的な基質としては、表4に列挙される以下の酵素またはプロテアーゼの1つ以上によって切断可能な基質が挙げられるが、これらに限定されない。

0095

いくつかの実施形態では、CMは、特定のプロテアーゼ、例えば、活性化可能抗体の標的と共局在することが知られているプロテアーゼと共に使用するために選択される。

0096

いくつかの実施形態では、CMは少なくとも1つのMMPの基質である。MMPの例としては、表4に列挙されているMMPが挙げられる。いくつかの実施形態では、CMは、MMP9、MMP14、MMP1、MMP3、MMP13、MMP17、MMP11、およびMMP19からなる群から選択されるプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、CMは、MMP9の基質である。いくつかの実施形態では、CMは、MMP14の基質である。

0097

いくつかの実施形態では、CMは、配列TGRGPSWV(配列番号356);SARGPSRW(配列番号357);TARGSFK(配列番号358);LSGRSDNH(配列番号359);GGWHTGRN(配列番号360);HTGRSGAL(配列番号361);PLTGRSGG(配列番号362);AARGPAIH(配列番号363);RGPAFNPM(配列番号364);SSRGPAYL(配列番号365);RGPATPIM(配列番号366);RGPA(配列番号367);GGQPSGMWGW(配列番号368);FPRPLGITGL(配列番号369);VHMPLGFLGP(配列番号370);SPLTGRSG(配列番号371);SAGFSLPA(配列番号372);LAPLGLQRR(配列番号373);SGGPLGVR(配列番号374);PLGL(配列番号375);LSGRSGNH(配列番号789);SGRSANPRG(配列番号790);LSGRSDDH(配列番号791);LSGRSDIH(配列番号792);LSGRSDQH(配列番号793);LSGRSDTH(配列番号794);LSGRSDYH(配列番号795);LSGRSDNP(配列番号796);LSGRSANP(配列番号797);LSGRSANI(配列番号798);LSGRSDNI(配列番号799);MIAPVAYR(配列番号800);RPSPMWAY(配列番号801);WATPRPMR(配列番号802);FRLLDWQW(配列番号803);ISSGL(配列番号804);ISSGLLS(配列番号805);および/またはISSGLL(配列番号806)を含む基質である。

0098

いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSDNH(配列番号359)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列TGRGPSWV(配列番号356)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列PLTGRSGG(配列番号362)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列GGQPSGMWGW(配列番号368)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列FPRPLGITGL(配列番号369)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列VHMPLGFLGP(配列番号370)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列PLGL(配列番号375)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列SARGPSRW(配列番号357)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列TARGPSFK(配列番号358)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列GGWHTGRN(配列番号360)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列HTGRSGAL(配列番号361)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列AARGPAIH(配列番号363)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列RGPAFNPM(配列番号364)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列SSRGPAYL(配列番号365)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列RGPATPIM(配列番号366)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列RGPA(配列番号367)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSGNH(配列番号789)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列SGRSANPRG(配列番号790)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSDDH(配列番号791)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSDIH(配列番号792)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSDQH(配列番号793)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSDTH(配列番号794)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSDYH(配列番号795)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSDNP(配列番号796)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSANP(配列番号797)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSANI(配列番号798)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LSGRSDNI(配列番号799)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列MIAPVAYR(配列番号800)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列RPSPMWAY(配列番号801)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列WATPRPMR(配列番号802)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列FRLLDWQW(配列番号803)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列ISSGL(配列番号804)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列ISSGLLS(配列番号805)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列および/またはISSGLL(配列番号806)を含む。

0099

いくつかの実施形態では、CMはMMPの基質であり、配列ISSGLSS(配列番号376)、QNQALRMA(配列番号377)、AQNLLGMV(配列番号378)、STFPFGMF(配列番号379)、PVGYTSSL(配列番号380)、DWLYWPGI(配列番号381)、ISSGLLSS(配列番号382)、LKAAPRWA(配列番号383)、GPSHLVLT(配列番号384)、LPGGLSPW(配列番号385)、MGLFSEAG(配列番号386)、SPLPRVP(配列番号387)、RMHLRSLG(配列番号388)、LAAPLGLL(配列番号389)、AVGLLAPP(配列番号390)、LLAPSHRA(配列番号391)、および/またはPAGLWDP(配列番号392)を含む。

0100

いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列ISSGLSS(配列番号376)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列QNQALRMA(配列番号377)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列AQNLLGMV(配列番号378)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列STFPFGMF(配列番号379)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列PVGYTSSL(配列番号380)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列DWLYWPGI(配列番号381)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列ISSGLLSS(配列番号382)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LKAAPRWA(配列番号383)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列GPSHLVLT(配列番号384)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LPGGLSPW(配列番号385)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列MGLFSEAG(配列番号386)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列SPLPLRVP(配列番号387)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列RMHLRSLG(配列番号388)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LAAPLGLL(配列番号389)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列AVGLLAPP(配列番号390)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列LLAPSHRA(配列番号391)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列PAGLWLDP(配列番号392)を含む。

0101

いくつかの実施形態では、CMはトロンビンの基質である。いくつかの実施形態では、CMはトロンビンの基質であり、配列GPRSFGL(配列番号393)またはGPRSFG(配列番号394)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列GPRSFGL(配列番号393)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列GPRSFG(配列番号394)を含む。

0102

いくつかの実施形態では、CMは、NTLSGRSENHSG(配列番号395);NTLSGRSGNHGS(配列番号396);TSTSGRSANPRG(配列番号397);TSGRSANP(配列番号398);VAGRSMRP(配列番号399);VVPEGRRS(配列番号400);ILPRSPAF(配列番号401);MVLGRSLL(配列番号402);QGRAITFI(配列番号403);SPRSIMLA(配列番号404);およびSMLRSMPL(配列番号405)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0103

いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列NTLSGRSENHSG(配列番号395)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列NTLSGRSGNHGS(配列番号396)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列TSTSGRSANPRG(配列番号397)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列TSGRSANP(配列番号398)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列VAGRSMRP(配列番号399)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列VVPEGRRS(配列番号400)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列ILPRSPAF(配列番号401)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列MVLGRSLL(配列番号402)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列QGRAITFI(配列番号403)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列SPRSIMLA(配列番号404)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、アミノ酸配列SMLRSMPL(配列番号405)を含む。

0104

いくつかの実施形態では、CMは、好中球エラスターゼの基質である。いくつかの実施形態では、CMは、セリンプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、CMは、uPAの基質である。いくつかの実施形態では、CMは、レグマインの基質である。いくつかの実施形態では、CMは、マトリプターゼの基質である。いくつかの実施形態では、CMは、システインプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、CMは、カテプシンなどのシステインプロテアーゼの基質である。

0105

いくつかの実施形態では、CMは、CM1−CM2基質であり、配列ISSGLLSGRSDNH(配列番号406);ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(配列番号407);AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG(配列番号408);TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP(配列番号409);VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG(配列番号410);TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP(配列番号411);AVGLLAPPGGLSGRSDNH(配列番号412);LSGRSDNHGGAVGLLAPP(配列番号413);VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH(配列番号414);LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(配列番号415);LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(配列番号416);LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS(配列番号417);ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH(配列番号418);LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA(配列番号419);QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH(配列番号420);LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA(配列番号421);QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH(配列番号422);ISSGLLSGRSGNH(配列番号423);ISSGLLSGRSANPRG(配列番号680);AVGLLAPPTSGRSANPRG(配列番号681);AVGLLAPPSGRSANPRG(配列番号682);ISSGLLSGRSDDH(配列番号683);ISSGLLSGRSDIH(配列番号684);ISSGLLSGRSDQH(配列番号685);ISSGLLSGRSDTH(配列番号686);ISSGLLSGRSDYH(配列番号687);ISSGLLSGRSDNP(配列番号688);ISSGLLSGRSANP(配列番号689);ISSGLLSGRSANI(配列番号690);AVGLLAPPGGLSGRSDDH(配列番号691);AVGLLAPPGGLSGRSDIH(配列番号692);AVGLLAPPGGLSGRSDQH(配列番号693);AVGLLAPPGGLSGRSDTH(配列番号694);AVGLLAPPGGLSGRSDYH(配列番号695);AVGLLAPPGGLSGRSDNP(配列番号696);AVGLLAPPGGLSGRSANP(配列番号697);AVGLLAPPGGLSGRSANI(配列番号698);ISSGLLSGRSDNI(配列番号713);AVGLLAPPGGLSGRSDNI(配列番号714);GLSGRSDNHGGAVGLLAPP(配列番号807);および/またはGLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(配列番号808)を含む。

0106

いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSDNH(配列番号406)を含み、これは本明細書では基質2001とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(配列番号407)を含み、これは本明細書では基質1001/LP’/0001とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGSGGS(配列番号1037)である。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG(配列番号408)を含み、これは本明細書では基質2015および/または基質1004/LP’/0003とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGである。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP(配列番号409)を含み、これは本明細書では基質0003/LP’/1004とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGである。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG(配列番号410)を含み、これは本明細書では基質1003/LP’/0003とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGである。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP(配列番号411)を含み、これは本明細書では基質0003/LP’/1003とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGである。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGLSGRSDNH(配列番号412)を含み、これは本明細書では基質3001および/または基質1004/LP’/0001とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGである。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列LSGRSDNHGGAVGLLAPP(配列番号413)を含み、これは本明細書では基質0001/LP’/1004とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGである。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH(配列番号414)を含み、これは本明細書では基質1003/LP’/0001とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGである。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(配列番号415)を含み、これは本明細書では基質001/LP’/1003とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGである。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(配列番号416)を含み、これは本明細書では基質0001/LP’/1001とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGSGGS(配列番号1037)である。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS(配列番号417)を含み、これは本明細書では基質0002/LP’/1001とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGSGGS(配列番号1037)である。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH(配列番号418)を含み、これは本明細書では基質1001/LP’/0002とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGSGGS(配列番号1037)である。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA(配列番号419)を含み、これは本明細書では基質0001/LP’/1002とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGSGGS(配列番号1037)である。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH(配列番号420)を含み、これは本明細書では基質1002/LP’/0001とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGSGGS(配列番号1037)である。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA(配列番号421)を含み、これは本明細書では基質0002/LP’/1002とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGSGGS(配列番号1037)である。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH(配列番号422)を含み、これは本明細書では基質1002/LP’/0002とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGSGGS(配列番号1037)である。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSGNH(配列番号423)を含み、これは本明細書では基質2002とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSANPRG(配列番号680)を含み、これは本明細書では基質2003とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPTSGRSANPRG(配列番号681)を含み、これは本明細書では基質2004とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPSGRSANPRG(配列番号682)を含み、これは本明細書では基質2005とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSDDH(配列番号683)を含み、これは本明細書では基質2006とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSDIH(配列番号684)を含み、これは本明細書では基質2007とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSDQH(配列番号685)を含み、これは本明細書では基質2008とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSDTH(配列番号686)を含み、これは本明細書では基質2009とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSDYH(配列番号687)を含み、これは本明細書では基質2010とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSDNP(配列番号688)を含み、これは本明細書では基質2011とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSANP(配列番号689)を含み、これは本明細書では基質2012とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSANI(配列番号690)を含み、これは本明細書では基質2013とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGLSGRSDDH(配列番号691)を含み、これは本明細書では基質3006とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGLSGRSDIH(配列番号692)を含み、これは本明細書では基質3007とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGLSGRSDQH(配列番号693)を含み、これは本明細書では基質3008とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGLSGRSDTH(配列番号694)を含み、これは本明細書では基質3009とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGLSGRSDYH(配列番号695)を含み、これは本明細書では基質3010とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGLSGRSDNP(配列番号696)を含み、これは本明細書では基質3011とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGLSGRSANP(配列番号697)を含み、これは本明細書では基質3012とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGLSGRSANI(配列番号698)を含み、これは本明細書では基質3013とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列ISSGLLSGRSDNI(配列番号713)を含み、これは本明細書では基質2014とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列AVGLLAPPGGLSGRSDNI(配列番号714)を含み、これは本明細書では基質3014とも称される。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列GLSGRSDNHGGAVGLLAPP(配列番号807)を含み、これは本明細書では基質0001/LP’/1004とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGである。いくつかの実施形態では、CM1−CM2基質は配列GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(配列番号808)を含み、これは本明細書では基質0001/LP’/1003とも称される。このCM1−CM2基質で使用されるLP’は、アミノ酸配列GGである。

0107

いくつかの実施形態では、CMは少なくとも2つのプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、各プロテアーゼは、表4に示すものからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、CMは少なくとも2つのプロテアーゼの基質であり、プロテアーゼの1つはMMP、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、uPA、レグマインおよびマトリプターゼからなる群から選択され、他のプロテアーゼは表4に示すものからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、CMは、MMP、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、uPA、レグマインおよびマトリプターゼからなる群から選択される少なくとも2つのプロテアーゼの基質である。

0108

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、少なくとも第1のCMおよび第2のCMを含む。いくつかの実施形態では、第1のCMおよび第2のCMは、それぞれ15アミノ酸程度の長さのポリペプチドである。いくつかの実施形態では、切断されていない状態である活性化可能抗体中の第1のCMおよび第2のCMは、以下のようにN末端からC末端への構造的配置を有する:MM−CM1−CM2−ABまたはAB−CM2−CM1−MM。いくつかの実施形態では、第1のCMおよび第2のCMの少なくとも一方は、MMP、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、uPA、レグマイン、およびマトリプターゼからなる群から選択されるプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1のCMは、標的組織中のMMP、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、uPA、レグマイン、およびマトリプターゼからなる群から選択される第1の切断剤によって切断され、第2のCMは、標的組織中の2番目の切断剤によって切断される。いくつかの実施形態では、他のプロテアーゼは、表4に示されるものからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第1の切断剤および第2の切断剤は、MMP、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、uPA、レグマイン、およびマトリプターゼからなる群から選択される同じプロテアーゼであり、第1のCMおよび第2のCMはその酵素の異なる基質である。いくつかの実施形態では、第1の切断剤および第2の切断剤は、表4に示されるものからなる群から選択される同じプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、第1の切断剤および第2の切断剤は異なるプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、第1の切断剤および第2の切断剤は、標的組織に共局在する。いくつかの実施形態では、第1のCMおよび第2のCMは、標的組織中の少なくとも1つの切断剤によって切断される。

0109

いくつかの実施形態では、あるプロテアーゼがCMを切断した後に、活性化抗体が、活性化されているかまたは切断されている状態で、LP2および/またはCM配列の少なくとも一部分を含む軽鎖アミノ酸配列を含むように、活性化可能抗体がそのプロテアーゼに曝露され、切断される。

0110

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、1つ以上の剤に結合される。

0111

いくつかの実施形態では、剤は、毒素またはその断片である。いくつかの実施形態では、剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、剤は、核酸損傷剤である。いくつかの実施形態では、剤は、ドラスタチンまたはその誘導体オーリスタチンまたはその誘導体、メイタンシノイドまたはその誘導体、デュオカルマイシンまたはその誘導体、カリケアマイシンまたはその誘導体、およびピロロベンゾジアゼピンまたはその誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンEまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンD(MMAD)である。いくつかの実施形態では、剤は、DM1およびDM4からなる群から選択されるメイタンシノイドである。いくつかの実施形態では、剤は、メイタンシノイドDM4である。いくつかの実施形態では、剤は、デュオカルマイシンである。いくつかの実施形態では、剤は、リンカーを介してABに結合される。いくつかの実施形態では、それにより剤がABに結合されるリンカーは、SPDB部分、vc部分、またはPEG2−vc部分を含む。いくつかの実施形態では、ABに結合されるリンカーおよび毒素は、SPDB−DM4部分、vc−MMAD部分、vc−MMAE部分、vc−デュオカルマイシン、またはPEG2−vc−MMAD部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは切断不能リンカーである。いくつかの実施形態では、剤は、検出可能な部分である。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は診断剤である。

0112

いくつかの実施形態では、ABまたは活性化可能抗体のABに結合される剤は治療剤である。いくつかの実施形態では、剤は、抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態では、剤は、毒素またはその断片である。本明細書で使用される場合、毒素の断片は、毒性活性を保持する断片である。いくつかの実施形態では、剤は、切断可能リンカーを介してABに結合される。いくつかの実施形態では、剤は、少なくとも1つのCM1−CM2基質配列を含むリンカーを介してABに結合される。いくつかの実施形態では、剤は、切断できないリンカーを介してABに結合される。いくつかの実施形態では、剤は、細胞内またリソソーム環境で切断可能であるリンカーを介してABに結合される。いくつかの実施形態では、剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、剤は、DNAアルキル化剤、DNA切断剤、DNA架橋剤、DNAインターカレーター、または他のDNA損傷剤などの核酸損傷剤である。いくつかの実施形態では、剤は、表5に列挙されている群から選択される剤である。いくつかの実施形態では、剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンEまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンD(MMAD)である。いくつかの実施形態では、剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、DM1またはDM4である。いくつかの実施形態では、剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。

0113

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、剤の1つ以上の等価物に結合される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、剤の1当量に結合される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または10を超える当量の剤に結合される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、同種の同等の数の結合された剤を有する活性化可能抗体の混合物の一部分である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、不均一の同等の数の結合された剤を有する活性化可能抗体の混合物の一部分である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の混合物は、各活性化可能抗体に結合された剤の平均数が、0〜1、1〜2、2〜3、3〜4、4〜5、5〜6、6〜7、7〜8、8〜9、9〜10、および10以上であるようなものである。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の混合物は、各活性化可能抗体に結合された剤の平均数が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上であるようなものである。

0114

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、リジンおよび/またはシステイン残基の数が活性化可能抗体の元のアミノ酸配列に対して増加または減少されるように、1つ以上の部位特異的アミノ酸配列修飾を含み、このため、いくつかの実施形態では、活性化可能抗体に結合され得る剤の数を対応して増加もしくは減少させ、またはいくつかの実施形態では、部位特異的様式で活性化可能抗体への剤の結合を制限する。いくつかの実施形態では、改変された活性化可能抗体は、部位特異的な様式で1つ以上の非天然アミノ酸により改変され、このため、いくつかの実施形態では、剤の結合を非天然アミノ酸の部位のみに制限する。

0115

いくつかの実施形態では、剤は、抗炎症剤である。

0116

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、検出可能な部分も含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は診断剤である。

0117

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、それに治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識はABに位置付けられる。いくつかの実施形態では、対象または試料中の活性化可能抗体のレベルを測定することは、活性化抗体に特異的に結合する二次試薬を使用して達成され、この試薬は検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、二次試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。

0118

いくつかの実施形態では、検出可能な標識としては、イメージング剤造影剤、酵素、蛍光標識、発色団色素、1つ以上の金属イオン、またはリガンドベースの標識が挙げられる。いくつかの実施形態では、イメージング剤は、放射性同位元素を含む。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、インジウムまたはテクネチウムである。いくつかの実施形態では、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウムまたは酸化鉄を含む。いくつかの実施形態では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはβ−ガラクトシダーゼを含む。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質(YFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、修飾赤色蛍光タンパク質(mRFP)、赤色蛍光タンパク質tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED、またはユーロピウム誘導体を含む。いくつかの実施形態では、発光標識は、N−メチルアクリジウム誘導体である。これらの方法のいくつかの実施形態では、標識は、AlexaFluor(登録商標)680またはAlexaFluor(登録商標)750などのAlexaFluor(登録商標)標識を含む。いくつかの実施形態では、リガンドをベースにした標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたは1つ以上のハプテンを含む。

0119

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、スペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、シグナルペプチドの非存在下で活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、活性化可能抗体のMMに直接連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、スペーサー−MM−CM−ABのN末端からC末端への構造的配置で、活性化可能抗体のMMに直接連結される。活性化可能抗体のMMのN末端に直接連結されるスペーサーの例は、QGQSGQ(配列番号424)である。活性化可能抗体のMMのN末端に直接連結されるスペーサーの他の例としては、QGQSGQG(配列番号645)、QGQSG(配列番号646)、QGQS(配列番号647)、QGQ(配列番号648)、QG(配列番号649)、およびQが挙げられる。活性化可能抗体のMMのN末端に直接連結されるスペーサーの他の例としては、GQSGQG(配列番号666)、QSGQG(配列番号667)、SGQG(配列番号668)、GQG(配列番号669)、およびGが挙げられる。いくつかの実施形態では、いずれのスペーサーも、MMのN末端に連結されない。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列QGQSGQ(配列番号424)を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーとしては、少なくともアミノ酸配列QGQSGQG(配列番号645)が挙げられる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列QGQSG(配列番号646)を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列QGQS(配列番号647)を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列QGQ(配列番号648)を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列QG(配列番号649)を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸残基Qを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列GQSGQG(配列番号666)を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列QSGQG(配列番号667)を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列SGQG(配列番号668)を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列GQG(配列番号669)を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列Gを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは存在しない。

0120

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および/または結合型活性化可能抗体は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および/または結合型活性化可能抗体は、例えば非限定的な例として、二重特異性または三機能性などの多重特異性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および/または結合型活性化可能抗体は、プロ二重特異性T細胞エンガージャー(BITE)分子の一部として配合される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および/または結合型活性化可能抗体は、プロキメラ抗原受容体(CAR)改変T細胞または他の操作された受容体の一部として配合される。

0121

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体またはその抗原結合断片は、多重特異性活性化可能抗体またはその抗原結合断片に組み込まれ、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも1つのアームが標的を特異的に結合する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性抗体またはその抗原結合断片に組み込まれ、二重特異性活性化可能抗体の少なくとも1つのアームが標的を特異的に結合する。

0122

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、多重特異性活性化可能抗体および/または結合型多重特異性活性化可能抗体である。多重特異性活性化可能抗体および/または結合型多重特異性活性化可能抗体は、少なくとも(i)第1のマスキング部分(MM1)の連結が、第1の標的を結合するAB1の能力を低下させるように、MM1に連結される第1の標的を特異的に結合する第1の抗体またはその抗原結合断片(AB1)、および(ii)第2のマスキング部分(MM2)MM2の連結が、第2の標的を結合するAB2の能力を低下させるように、MM2に連結される第2の標的を特異的に結合する第2の抗体またはその抗原結合断片(AB2)を含む。いくつかの実施形態では、MM1および/またはMM2は、プロテアーゼ、例えば、対象の治療部位で第1の標的、第2の標的、または第1の標的と第2の標的との両方と共局在するプロテアーゼ、の基質を含む配列を介して、それぞれの抗体またはその抗原結合断片(AB1またはAB2)に連結される。いくつかの実施形態では、第1の標的、第2の標的、または第1の標的と第2の標的の両方は、例えば、ヒト標的などの哺乳動物標的である。好適なMM1、MM2、CM1、および/またはCM2としては、本開示の組成物および方法で使用される活性化可能抗体および/または結合型活性化可能抗体に関連して上述したMMおよび/またはCMのいずれかが挙げられる。

0123

非限定的な例として、活性化可能抗体のABは、表1に列挙される任意の標的の結合パートナーである。非限定的な例として、多重特異性活性化可能抗体のAB1、AB2、またはAB1とAB2の両方は、表1に列挙される任意の標的の結合パートナーである。

0124

非限定的な例として、抗体もしくは抗原結合断片、および/もしくは活性化可能抗体のABは、表2に列挙される抗体であるか、またはそれらに由来する。非限定的な例として、活性化可能抗体のAB、多重特異性活性化可能抗体のAB1、および/または多重特異性活性化可能抗体のAB2は、表2に列挙される抗体であるか、またはそれらに由来する。

0125

本開示はまた、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列SYGMS(配列番号438)を含む可変重鎖相補性決定領域1(CDRH1);アミノ酸配列TISPSGIYTYYPVTVKG(配列番号439)を含む可変重鎖相補性決定領域2(CDRH2);アミノ酸配列HHPNYGSTYLYYIDY(配列番号440)を含む可変重鎖相補性決定領域3(CDRH3);アミノ酸配列KSSQSVFSSSNQKNYLA(配列番号441)を含む可変軽鎖相補性決定領域1(CDRL1);アミノ酸配列WAFTRES(配列番号442)を含む可変軽鎖相補性決定領域2(CDRL2);およびアミノ酸配列YQYLSSLT(配列番号443)を含む可変軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)を含む。

0126

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。

0127

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

0128

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖、および配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

0129

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。

0130

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。

0131

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列、および配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。

0132

本開示は、本明細書で提供される方法のいずれかを実施するためのキットも提供する。

0133

本開示は、組織および/または生体液試料を含む、生体試料中での活性化および活性化可能抗体治療活性化の他の特性を定性的および/または定量的に分析するための方法およびキットを提供する。
一実施形態では、本発明は、以下を含むキットを提供する:
(i)活性化可能抗体の標準曲線試薬;
(ii)活性化された活性化可能抗体の標準曲線試薬;
(iii)活性化可能抗体に対する結合特異性を有する抗id一次抗体またはその抗原結合断片。いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ(id)抗体またはその抗原結合断片は、VLCDR1、VL CDR2、およびVL CDR3からなる群から選択されるVL CDRに対する結合特異性を有する。他の実施形態では、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3からなる群から選択されるVH CDRに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、キットは、2つ以上の抗イディオタイプ抗体種(またはその抗原結合断片)の組み合わせを含む。標準曲線試薬は、溶液中において比較的純粋な活性化可能抗体および活性化された活性化可能抗体であり、希釈の準備ができているか、または固体の形態である。

0134

活性化可能抗体は典型的には、少なくとも(i)標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB);(ii)活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、標的へのABの結合を阻害するように、ABに連結されるマスキング部分(MM)、および(iii)ABに連結される切断可能部分(CM)であって、CMはプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、CM、を含む。活性化可能抗体は一般に、CMの基質が、それが基質として機能するプロテアーゼの存在下で活性化され、プロテアーゼが、CMの基質を切断する。生体試料中の活性化可能抗体の特性、例えば、生体試料中の活性化可能抗体の活性化レベル、生体試料中の活性化された、すなわち切断された活性化可能抗体および/または完全な、すなわち不活性化されている、活性化可能抗体の総量、またはそれらの任意の組み合わせまたは相関を、定性的および/または定量的に測定できることは有用である。こうした方法は、開発および/または治療用処置の任意の段階での活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療の有効性を監視するのに有用である。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびキットは、それを必要とする対象への投与前および/または治療計画中に活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の有効性を試験して、投与期間全体および/または投与期間後の活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の有効性を監視するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびキットは、活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の遡及的分析を提供するのに有用である。

0135

いくつかの実施形態では、本開示は、キャピラリーをベースとした免疫アッセイプラットフォームを使用して、組織および/または血漿試料を含む、生体試料における活性化可能抗体治療活性化を定性的および/または定量的に分析するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中の1つ以上の活性化可能抗体の活性化を定量化するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中のin vivoでのプロテアーゼ活性をプロファイリング、層別化、または分類するために使用される。

0136

いくつかの実施形態では、本開示は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB)、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、標的へのABの結合を阻害するように、ABの軽鎖に連結されるマスキング部分(MM)、および、ABに連結される切断可能部分(CM)であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるCM、を有する活性化可能抗体治療薬の活性化を定性的および/または定量的に分析するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法を使用して、少なくとも(i)CMが切断され、かつMMがABの軽鎖に連結されない活性化された活性化可能抗体のレベル、および(ii)MMおよびCMがABの軽鎖に連結される完全な活性化可能抗体のレベルを定量化するか、またはさもなければ比較する。

0137

いくつかの実施形態では、本開示は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB)、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、標的へのABの結合を阻害するように、ABの重鎖に連結されるマスキング部分(MM)、および、ABに連結される切断可能部分(CM)であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるCM、を有する活性化可能抗体治療薬の活性化を定性的および/または定量的に分析するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法を使用して、少なくとも(i)CMが切断され、かつMMがABの重鎖に連結されない活性化された活性化可能抗体のレベル、および(ii)MMおよびCMがABの重鎖に連結される完全な活性化可能抗体のレベルを定量化するか、またはさもなければ比較する。

0138

いくつかの実施形態では、本開示は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB)、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、MM1が標的へのABの結合を阻害するように、ABの軽鎖に連結される第1のマスキング部分(MM1)、軽鎖ABに連結される第1の切断可能部分(CM1)であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるCM1、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、MM2が標的へのABの結合を阻害するように、ABの重鎖に連結される第2のマスキング部分(MM2)、軽鎖ABに連結される第2の切断可能部分(CM2)であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるCM2、を有する活性化可能抗体治療薬の活性化を定性的および/または定量的に分析する方法を提供する。いくつかの実施形態では、これらの方法は、少なくとも(i)MM1および/またはMM2の少なくとも一方がABに連結されないようにCM1および/またはCM2の少なくとも一方が切断されている、活性化された活性化可能抗体のレベル、ならびに(ii)MM1とCM1および/またはMM2とCM2の少なくとも一方がABに連結される完全な活性化可能抗体のレベルを定量化するか、またはそうでなければ比較するために使用される。

0139

いくつかの実施形態では、本開示は、活性化可能抗体ベースの治療薬の活性化レベルを定量化する方法を提供し、この方法は、i)少なくとも1つのキャピラリーまたはキャピラリーの集団に積層マトリックスおよび分離マトリックスを装填することと、ii)装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を生体試料と接触させることと、iii)各キャピラリー内の生体試料において、活性化された活性化可能抗体または活性化された活性化可能抗体ベースの治療薬から完全な活性化可能抗体または完全な活性化可能抗体ベースの治療薬を分離することと、iv)完全な活性化可能抗体または完全な活性化可能抗体ベースの治療薬および活性化された活性化可能抗体または完全な活性化可能抗体ベースの治療薬を各キャピラリー内に固定化することと、v)少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的である少なくとも1つの検出可能な試薬で各キャピラリーを免疫プローブすることと、vi)各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における検出可能な試薬のレベルを定量化すること、を含む。

0140

いくつかの実施形態では、本開示は、活性化可能抗体ベースの治療薬の活性化レベルを定量化する方法を提供し、この方法は、i)少なくとも1つのキャピラリーまたはキャピラリーの集団に積層マトリックスおよび分離マトリックスを装填することと、ii)装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を生体試料と接触させることと、iii)各キャピラリー内で生体試料の高分子量(MW)成分を、生体試料の低分子量(MW)成分から分離することと、iv)各キャピラリー内で高MW成分および低MW成分を固定することと、v)少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的である少なくとも1つの検出可能な試薬で各キャピラリーを免疫プローブすることと、vi)各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における検出可能な試薬のレベルを定量化すること、を含む。

0141

いくつかの実施形態では、ステップv)の少なくとも1つの検出可能な試薬は、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的な少なくとも第1の試薬、および第1の試薬に特異的に結合するか、または第1の試薬を認識する第2の試薬を含み、第2の試薬は検出可能な標識を含む。

0142

いくつかの実施形態では、ステップvi)は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における検出可能な標識のレベルを定量化することを含む。

0143

いくつかの実施形態では、ステップii)は、約1〜500ngの生体試料または約1〜500ngの生体試料の任意の値および/または範囲を装填することを含む。いくつかの実施形態では、ステップii)は、約5〜40ngの生体試料を装填することを含む。当業者であれば、生体試料の装填量は、本方法において使用される検出可能な試薬または第1の試薬の親和性に応じて変化する可能性があり、検出可能な試薬または第1の試薬の親和性が高いほど、生体試料の装填量は少なくなり得ることを理解するであろう。

0144

いくつかの実施形態では、生体試料は、結果として分子量の分離をもたらすのに十分な量の1つ以上の緩衝液を使用して調製される。いくつかの実施形態では、生体試料は、結果として分子量の分離をもたらすのに十分な量の1つ以上のSDS含有緩衝液を使用して調製される。いくつかの実施形態では、生体試料は、生体試料中の活性化可能抗体および/または活性化可能抗体ベースの治療薬を含む、天然タンパク質の分離をもたらすのに十分な量の1つ以上の緩衝液を使用して調製される。いくつかの実施形態では、生体試料は、分離に好適な任意の試薬を使用して低減された試料の分離をもたらすのに十分な量の1つ以上の緩衝液を使用して調製される。

0145

いくつかの実施形態では、ステップiii)は、生体試料の高MW成分および低MW成分を固定化するためにUV光を使用することを含む。いくつかの実施形態では、任意の好適な固定化剤は、本明細書で提供される方法のステップiii)において用いられる。

0146

いくつかの実施形態では、ステップiv)の第1の試薬は、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。

0147

いくつかの実施形態では、ステップiv)の第2の試薬は、第1の試薬に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体である。

0148

いくつかの実施形態では、ステップiv)の第1の試薬は、少なくとも1つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体またはその抗原結合断片であり、ステップv)の第2の試薬は、一次抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体である。

0149

いくつかの実施形態では、検出可能な標識は第2の試薬に結合される。

0150

いくつかの実施形態では、検出可能な標識は蛍光標識であり、ステップvi)は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団において化学発光のレベルを検出することを含む。

0151

いくつかの実施形態では、検出可能な標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である。

0152

いくつかの実施形態では、生体試料は体液である。いくつかの実施形態では、体液は、血液、血漿、または血清である。いくつかの実施形態では、生体試料は病変組織である。いくつかの実施形態では、病変組織は溶解物である。いくつかの実施形態では、疾患組織は腫瘍組織である。

0153

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中の活性化された活性化可能抗体または活性化可能抗体ベースの治療薬、および完全な活性化可能抗体または活性化可能抗体ベースの治療薬の量を比較するために使用される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体ベースの治療薬は、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせである。

0154

本開示はまた、活性化可能抗体および/または活性化可能抗体ベースの治療薬に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、例えば、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせなどである。

0155

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列SYGMS(配列番号438)を含む可変重鎖相補性決定領域1(CDRH1);アミノ酸配列TISPSGIYTYYPVTVKG(配列番号439)を含む可変重鎖相補性決定領域2(CDRH2);アミノ酸配列HHPNYGSTYLYYIDY(配列番号440)を含む可変重鎖相補性決定領域3(CDRH3);アミノ酸配列KSSQSVFSSSNQKNYLA(配列番号441)を含む可変軽鎖相補性決定領域1(CDRL1);アミノ酸配列WAFTRES(配列番号442)を含む可変軽鎖相補性決定領域2(CDRL2);およびアミノ酸配列YQYLSSLT(配列番号443)を含む可変軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)を含む。

0156

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。

0157

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

0158

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号429のアミノ酸配列を含む可変重鎖、および配列番号431のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

0159

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号444のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

0160

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号445のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

0161

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号444のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号445のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

0162

本明細書で提供される方法は、活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、および/または結合型多重特異性活性化可能抗体の定量化に有用である。

0163

活性化可能抗体および/または結合型活性化可能抗体としては、マスキング部分(MM)に連結される標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB)が挙げられ、MMの連結が標的に結合する抗体またはその抗原結合断片の能力を低下させるようにする。いくつかの実施形態では、MMは、プロテアーゼ、例えば、対象の治療部位において標的と共局在するプロテアーゼ、の基質を含む配列を介して連結される。いくつかの実施形態では、標的は、例えばヒト標的などの哺乳動物標的である。

0164

多重特異性活性化可能抗体および/または結合型多重特異性活性化可能抗体は、少なくとも(i)第1のマスキング部分(MM1)の連結が第1の標的を結合する第1の抗体またはその抗原結合断片(AB1)の能力を低下させるように、MM1に連結された第1の標的を特異的に結合するAB1、および(ii)第2のマスキング部分(MM2)の連結が第2の標的を結合する第2の抗体またはその抗原結合断片(AB2)の能力を低下させるように、MM2に連結された第2の標的を特異的に結合するAB2を含む。いくつかの実施形態では、MM1および/またはMM2は、プロテアーゼ、例えば、第1の標的、第2の標的、対象の治療部位での、または第1の標的および第2の標的の両方と共局在するプロテアーゼ、の基質を含む配列を介して、それぞれの抗体またはその抗原結合断片(AB1またはAB2)に連結される。いくつかの実施形態では、第1の標的、第2の標的、または第1の標的および第2の標的の両方は、例えば、ヒト標的などの、哺乳動物標的である。

0165

本明細書で提供される活性化可能抗体は、マスキング部分を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、抗体に結合または付着されるアミノ酸配列であり、かつ活性化可能抗体構築物内に位置付けられ、これにより、マスキング部分が、標的を特異的に結合する抗体の能力を低下させる。好適なマスキング部分は、様々な既知の技術のいずれかを使用して特定される。例えば、ペプチドマスキング部分は、DaughertyらによるPCT公開番号国際公開第2009/025846号に記載されている方法(本内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を使用して特定される。

0166

本明細書で提供される活性化可能抗体は、切断可能部分を含む。いくつかの実施形態では、切断可能部分は、プロテアーゼ、通常は細胞外プロテアーゼ、の基質であるアミノ酸配列を含む。好適な基質は、様々な既知の技術のいずれかを使用して特定される。例えば、ペプチド基質は、Daughertyらによる米国特許第7,666,817号、Staglianoらによる米国特許第8,563,269号、また、La PorteらによるPCT公開番号国際公開第2014/026136号に記載されている方法を使用して特定される。これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる(また、Boulwareら、「Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics」Biotechnol Bioeng.106.3(2010年):339−46も参照されたい)。

0167

例示的な基質としては、表4に列挙される以下の酵素またはプロテアーゼの1つ以上によって切断可能な基質が挙げられるが、これらに限定されない。

0168

本明細書で提供される方法は、プロテアーゼの基質として機能する切断可能部分を含む活性化可能抗体の活性化を定量化するのに有用である。本明細書に記載の活性化可能抗体は、抗体治療、特にin vivoで少なくともある程度毒性であることが知られている抗体治療の限界を克服するように設計されている。標的を介した毒性は、治療用抗体の開発にとって大きな制限となる。本明細書で提供される活性化可能抗体は、従来の治療用抗体による正常組織での標的の阻害に関連する毒性に対処するように設計されている。これらの活性化可能抗体は、疾患部位タンパク質分解的に活性化されるまでマスクされたままである。親治療用抗体としての抗体から始めて、本発明の活性化可能抗体は、プロテアーゼ基質を組み込むリンカーを介して抗体を阻害マスクに連結することにより改変された。

0169

ABがMMで修飾され、標的の存在下にある場合、ABの標的への特異的結合は、MMで修飾されていないABの特異的結合または親ABの標的への特異的結合と比較して、減少または阻害される。

0170

標的に対するMMで修飾されたABのKdは、標的に対するMMで修飾されないABまたは親ABのKdの少なくとも5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍以上、または5〜10、10〜100、10〜1,000、10〜10,000、10〜100,000、10〜1,000,000、10〜10,000,000、100〜1,000、100〜10,000、100〜100,000、100〜1,000,000、100〜10,000,000、1,000〜10,000、1,000〜100,000、1,000〜1,000,000、1000〜10,000,000、10,000〜100,000、10,000〜1,000,000、10,000〜10,000,000、100,000〜1,000,000、もしくは100,000〜10,000,000倍大きい。逆に、MMで修飾されたABの標的に対する結合親和性は、MMで修飾されないABまたは親ABの標的に対する結合親和性よりも少なくとも2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍以上、または5〜10、10〜100、10〜1,000、10〜10,000、10〜100,000、10〜1,000,000、10〜10,000,000、100〜1,000、100〜10,000、100〜100,000、100〜1,000,000、100〜10,000,000、1,000〜10,000、1,000〜100,000、1,000〜1,000,000、1000〜10,000,000、10,000〜100,000、10,000〜1,000,000、10,000〜10,000,000、100,000〜1,000,000、もしくは100,000〜10,000,000倍低い。

0171

ABに対するMMの解離定数(Kd)は一般に、標的に対するABのKdよりも大きい。ABに対するMMのKdは、標的に対するABのKdより少なくとも5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000、またはさらには10,000,000倍大きくてよい。逆に、ABに対するMMの結合親和性は一般に、標的に対するABの結合親和性よりも低い。ABに対するMMの結合親和性は、標的に対するABの結合親和性より少なくとも5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000、またはさらには10,000,000倍低くてよい。

0172

いくつかの実施形態では、ABに対するMMの解離定数(Kd)は、標的に対するABのKdにほぼ等しい。いくつかの実施形態では、ABに対するMMの解離定数(Kd)は、標的に対するABの解離定数程度である。いくつかの実施形態では、ABに対するMMの解離定数(Kd)は、標的に対するABの解離定数に等しい。

0173

いくつかの実施形態では、ABに対するMMの解離定数(Kd)は、標的に対するABの解離定数よりも小さい。

0174

いくつかの実施形態では、ABに対するMMの解離定数(Kd)は、標的に対するABの解離定数よりも大きい。

0175

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合のKd程度である、ABへの結合のKdを有する。

0176

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合のKd以上である、ABへの結合のKdを有する。

0177

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合のKdにほぼ等しい、ABへの結合のKdを有する。

0178

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合のKdよりも小さい、ABへの結合のKdを有する。

0179

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合のKdより大きい、ABへの結合のKdを有する。

0180

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合のKdの2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、または1,000倍程度である、ABへの結合のKdを有する。いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合のKdよりも1〜5、2〜5、2〜10、5〜10、5〜20、5〜50、5〜100、10〜100、10〜1,000、20〜100、20〜1000、または100〜1,000倍大きい、ABへの結合のKdを有する。

0181

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合の親和性よりも低い、ABへの結合の親和性を有する。

0182

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合の親和性程度の、ABへの結合の親和性を有する。

0183

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合の親和性にほぼ等しい、ABへの結合の親和性を有する。

0184

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合の親和性ほどのABへの結合の親和性を有する。

0185

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合の親和性よりも大きいABへの結合の親和性を有する。

0186

いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合の親和性よりも2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、または1,000少ないABへの結合の親和性を有する。いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合の親和性よりも1〜5、2〜5、2〜10、5〜10、5〜20、5〜50、5〜100、10〜100、10〜1,000、20〜100、20〜1000、または100〜1,000倍低いABへの結合の親和性を有する。いくつかの実施形態では、MMは、標的へのABの結合の親和性よりも2〜20倍低いABへの結合の親和性を有する。いくつかの実施形態では、ABに共有結合で連結されずかつABと等モル濃度であるMMは、標的へのABの結合を阻害しない。

0187

ABがMMで修飾され標的の存在下にある場合、その標的へのABの特異的結合は、標的へのMMで修飾されないABの特異的結合または親ABの特異的結合と比較して、減少または阻害される。標的へのMMで修飾されないABの結合または親ABの結合と比較すると、MMで修飾された場合の標的を結合するABの能力は、in vivoまたはin vitroアッセイで測定した場合、少なくとも2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、28時間、24時間、30時間、36時間、48時間、60時間、72時間、84時間、もしくは96時間、または5日、10日、15日、30日、45日、60日、90日、120日、150日、もしくは180日、または1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、または12ヶ月以上の間、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、さらに100%低下され得る。

0188

MMは、標的へのABの結合を阻害する。MMは、ABの抗原結合ドメインを結合し、標的へのABの結合を阻害する。MMは、標的へのABの結合を立体的に阻害できる。MMは、標的へのABの結合をアロステリックに阻害できる。これらの実施形態では、ABが修飾されるか、またはMMに連結され、かつ標的の存在下にある場合、標的へのABの結合はないか実質的になく、またはin vivoまたはin vitroアッセイで測定した場合、少なくとも2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、28時間、24時間、30時間、36時間、48時間、60時間、72時間、84時間、もしくは96時間、または5日、10日、15日、30日、45日、60日、90日、120日、150日、もしくは180日、または1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、もしくは12ヶ月以上の間、標的へのMMにより修飾されないAB、親AB、またはMMに連結されないABの結合と比較して、0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、または50%程度の標的へのABの結合がある。

0189

ABがMMに連結されるか、またはMMにより修飾される場合、MMは標的へのABの特異的結合を「マスク」するか、低減するか、または阻害する。ABがMMに連結されるか、またはMMにより修飾される場合、こうした連結または修飾は、その標的に特異的に結合するABの能力を低下させるか、または阻害する構造変化を引き起こし得る。

0190

MMに連結されるか、またはMMにより修飾されるABは、次式で表すことができる(アミノ(N)末端領域からカルボキシル(C)末端領域の順:
(MM)−(AB)
(AB)−(MM)
(MM)−L−(AB)
(AB)−L−(MM)
式中、MMはマスキング部分であり、ABは抗体またはその抗体断片であり、Lはリンカーである。多くの実施形態では、柔軟性を提供するために、1つ以上のリンカー、例えば柔軟なリンカーを組成物中に挿入することが望ましい場合がある。

0191

特定の実施形態では、MMは、ABの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態では、MMは、ABの任意の天然の結合パートナーと相同性を全く含まないか、または実質的に含まない。いくつかの実施形態では、MMは、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、または80%程度、ABの任意の天然の結合パートナーと類似している。いくつかの実施形態では、MMは、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、または80%程度、ABの任意の天然の結合パートナーと同一である。いくつかの実施形態では、MMは、ABの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、25%程度である。いくつかの実施形態では、MMは、ABの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、50%程度である。いくつかの実施形態では、MMは、ABの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、20%程度である。いくつかの実施形態では、MMは、ABの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、10%程度である。

0192

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、MMにより修飾されたABを含み、1つ以上の切断可能部分(CM)も含む。このような活性化可能抗体は、ABの標的に対して活性化可能な/切り替え可能な結合を呈する。活性化可能抗体は、一般に、マスキング部分(MM)および修飾可能もしくは切断可能部分(CM)によって修飾されるか、またはこれらに連結される抗体もしくは抗体断片(AB)を含む。いくつかの実施形態では、CMは、少なくとも1つのプロテアーゼの基質として機能するアミノ酸配列を含む。

0193

活性化可能抗体のエレメントは、切断された(または比較的活性である)状態でかつ標的の存在下で、ABが標的を結合し、その一方で、活性化可能抗体は、標的の存在下で切断されていない(または比較的不活性な)状態にあるように、MMおよびCMが位置付けられるよう配置され、その標的へのABの特異的結合が減少されるか、または阻害される。標的へのABの特異的結合は、MMによるその標的を特異的に結合するABの能力の阻害またはマスキングにより減少され得る。

0194

標的に対するMMおよびCMにより修飾されたABのKdは、標的に対するMMおよびCMにより修飾されないABまたは親ABのKdの少なくとも5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000以上、または5〜10、10〜100、10〜1,000、10〜10,000、10〜100,000、10〜1,000,000、10〜10,000,000、100〜1,000、100〜10,000、100〜100,000、100〜1,000,000、100〜10,000,000、1,000〜10,000、1,000〜100,000、1,000〜1,000,000、1000〜10,000,000、10,000〜100,000、10,000〜1,000,000、10,000〜10,000,000、100,000〜1,000,000、もしくは100,000〜10,000,000倍大きい。逆に、標的に対するMMおよびCMにより修飾されたABの結合親和性は、標的に対するMMおよびCMにより修飾されないABまたは親ABの結合親和性の少なくとも5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000以上、または5〜10、10〜100、10〜1,000、10〜10,000、10〜100,000、10〜1,000,000、10〜10,000,000、100〜1,000、100〜10,000、100〜100,000、100〜1,000,000、100〜10,000,000、1,000〜10,000、1,000〜100,000、1,000〜1,000,000、1000〜10,000,000、10,000〜100,000、10,000〜1,000,000、10,000〜10,000,000、100,000〜1,000,000、もしくは100,000〜10,000,000倍少ない。

0195

ABがMMおよびCMにより修飾され、標的の存在下にあるが、修飾剤(例えば、少なくとも1つのプロテアーゼ)の存在下にない場合、その標的へのABの特異的結合は、標的へのMMおよびCMにより修飾されないABの、または親ABの特異的結合と比較して、減少されるか、または阻害される。その標的への親ABの結合またはMMおよびCMにより修飾されないABの結合と比較したとき、MMおよびCMにより修飾されたときの標的を結合するABの能力は、in vivoまたはin vitroアッセイで測定した場合少なくとも2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、28時間、24時間、30時間、36時間、48時間、60時間、72時間、84時間、または96時間、または5日、10日、15日、30日、45日、60日、90日、120日、150日、または180日間、または1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、または12ヶ月以上の間、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、およびさらには100%低下され得る。

0196

本明細書で使用する場合、切断された状態という用語は、少なくとも1つのプロテアーゼによるCMの修飾の後の活性化可能抗体の状態を指す。本明細書で使用する切断されていない状態という用語は、プロテアーゼによるCMの切断がない活性化可能抗体の状態を指す。上述のように、「活性化可能抗体」という用語は、本明細書では、その切断されていない(天然の)状態およびその切断された状態の両方の活性化可能抗体を指すために使用される。いくつかの実施形態では、切断された活性化可能抗体がプロテアーゼによるCMの切断によりMMを欠失し、その結果として少なくともMMの放出(例えば、MMが共有結合(例えば、システイン残基間のジスルフィド結合)により活性化可能抗体に結合されない場合)がもたらされることは、当業者にとって明らかであろう。

0197

活性化可能または切り替え可能とは、活性化可能抗体が、阻害され、マスクされ、または切断されていない状態(すなわち、第1の立体構造)にある場合、活性化可能抗体が標的に対する第1のレベルの結合を呈し、阻害されない、マスクされない、かつ/または切断された状態(すなわち、第2の立体構造)では標的に対する第2のレベルの結合を呈することを意味し、このとき標的結合の第2レベルは、第1のレベルの結合より大きい。一般に、活性化可能抗体のABへの標的の接近は、こうした切断剤の非存在下よりも、CMを切断できる切断剤、すなわちプロテアーゼの存在下でより大きい。したがって、活性化可能抗体が切断されていない状態にある場合、ABは標的結合を阻害され、標的結合からマスクされ得る(すなわち、第1の立体構造は、ABが標的を結合できないようなものである)、切断された状態でABは、標的結合が阻害されないか、または標的結合に対してマスクされない。

0198

活性化可能抗体のCMおよびABは、ABが所与の標的の結合部分を表し、CMがプロテアーゼの基質を表すように選択される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、対象の治療部位または診断部位において標的と共局在する。本明細書で使用される共局在化は、同じ場所にあるか、比較的近くにあることを指す。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはCMを切断し、切断部位の近くに位置する標的に結合する活性化抗体を生じる。本明細書に開示される活性化可能抗体は、例えば、CM中の任意の部位を切断できるプロテアーゼ、すなわちプロテアーゼが、処置部位または診断部位の標的含有組織中に、非処置部位の組織(例えば、健康な組織)中よりも比較的高いレベルで存在する、特定の用途を見出す。いくつかの実施形態では、本開示のCMはまた、1つ以上の他のプロテアーゼによって切断される。いくつかの実施形態では、標的と共局在しin vivoでのCMの切断を担うのは1つ以上の他のプロテアーゼである。

0199

いくつかの実施形態では、ABが標的への結合をマスクされないか、または阻害されない場合、活性化可能抗体は非処置部位でのABの結合によって生じ得る毒性および/または有害な副作用の低減をもたらす。

0200

一般に、活性化可能抗体は、コンフォメーション的に制約されている場合、MMがABのマスキングまたは標的へのABの結合の減少をもたらすように、目的のABを選択することおよび活性化可能抗体の残りの部分を構築することにより設計され得る。この機能的特徴をもたらすために、構造設計基準が考慮され得る。

0201

阻害された立体配座および阻害されていない立体配座における標的結合の望ましいダイナミックレンジの切り替え可能な表現型を呈する活性化可能抗体を提供する。ダイナミックレンジとは一般に、(a)第1の条件セットでのパラメーターの最大検出レベル対(b)第2の条件セットでのパラメーターの最小検出値比率、を指す。例えば、活性化可能抗体の文脈において、ダイナミックレンジは、(a)活性化可能抗体のCMを切断できる少なくとも1つのプロテアーゼの存在下での活性化可能抗体に結合する標的タンパク質の最大検出レベル対(b)プロテアーゼ非存在下で活性化可能抗体に結合する標的タンパク質の最小検出レベル、の比率を指す。活性化可能抗体のダイナミックレンジは、活性化可能抗体切断剤処置の解離定数に対する、活性化可能抗体切断剤(例えば、酵素)処置の解離定数の比として算出できる。活性化可能抗体のダイナミックレンジが大きいほど、活性化可能抗体の切り替え可能な表現型がよりよくなる。比較的高いダイナミックレンジ値(例えば、1よりも大きい)を有する活性化可能抗体は、より望ましい切り替え表現型を呈し、これにより、活性化可能抗体による標的タンパク質の結合が、切断剤の非存在下でよりも、活性化可能抗体のCMを切断できる切断剤(例えば、酵素)の存在下において、より広い範囲まで発生する(例えば、主に発生する)ようになる。

0202

活性化可能抗体は、様々な構造構成で提供され得る。活性化可能抗体の例示的な式を以下に提供する。活性化可能抗体内で、N末端からC末端へのAB、MMおよびCMの順序を逆にし得ることが特に想定される。また、例えばCMがMM内に含まれるように、CMおよびMMがアミノ酸配列中で重複し得ることも特に想定される。

0203

例えば、活性化可能抗体は、次式で表すことができる(アミノ(N)末端領域からカルボキシル(C)末端領域の順:
(MM)−(CM)−(AB)
(AB)−(CM)−(MM)
式中、MMはマスキング部分、CMは切断可能部分、ABは抗体またはその断片である。MMおよびCMは、上記の式では別個の成分として示されているが、本明細書に開示されるすべての例示的な実施形態(式を含む)において、MMおよびCMのアミノ酸配列は、例えば、CMが、MM内に完全にまたは部分的に含まれるように、重複し得ることが想定されることに留意されたい。加えて、上記の式は、活性化可能抗体エレメントに対してN末端またはC末端に位置付けられることができる追加のアミノ酸配列をもたらす。

0204

特定の実施形態では、MMは、ABの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態では、MMは、ABの任意の天然の結合パートナーと相同性を全く含まないか、または実質的に含まない。いくつかの実施形態では、MMは、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、または80%程度、ABの任意の天然の結合パートナーと類似している。いくつかの実施形態では、MMは、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、または80%程度、ABの任意の天然の結合パートナーと同一である。いくつかの実施形態では、MMは、ABの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、50%程度である。いくつかの実施形態では、MMは、ABの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、25%程度である。いくつかの実施形態では、MMは、ABの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、20%程度である。いくつかの実施形態では、MMは、ABの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、10%程度である。

0205

いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、MM−CM接合部、CM−AB接合部、またはその両方の1つ以上に柔軟性を付与するために、1つ以上のリンカー、例えば柔軟なリンカーを活性化可能抗体構築物中に含む。例えば、AB、MMおよび/またはCMは、所望の柔軟性をもたらすための十分な数の残基(例えば、Gly、Ser、Asp、Asn、特にGlyおよびSer、特にGly)を含まないかもしれない。そのため、こうした活性化可能抗体構築物の切り替え可能な表現型は、柔軟なリンカーをもたらすために1つ以上のアミノ酸を導入することから利益を得る可能性がある。加えて、以下に記載するように、活性化可能抗体が立体構造的拘束された構築物として提供される場合、柔軟なリンカーを作動可能に挿入して、切断されていない活性化可能抗体における環状構造の形成および維持を容易にし得る。

0206

例えば、ある実施形態では、活性化可能抗体は、次式のうちの1つを含む(以下の式は、N−末端方向からC−末端方向またはC−末端方向からN−末端方向のいずれかのアミノ酸配列を表す):
(MM)−L1−(CM)−(AB)
(MM)−(CM)−L2−(AB)
(MM)−L1−(CM)−L2−(AB)
式中、MM、CM、およびABは、上記で定義したとおりである。式中、L1およびL2は、それぞれ独立してかつ任意に存在するか、または存在せず、少なくとも1つの柔軟なアミノ酸(例えばGly)を含む同じまたは異なる柔軟なリンカーである。加えて、上記の式は、活性化可能抗体エレメントに対してN末端またはC末端に位置付けることができる追加のアミノ酸配列をもたらす。例としては、これらに限定されないが、標的化部分(例えば、標的組織に存在する細胞の受容体に対するリガンド)および血清半減期延長部分(例えば、免疫グロブリン(例えば、IgG)または血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミンHAS)などの血清タンパク質を結合するポリペプチド)が挙げられる。

0207

CMは、約0.001〜1500x104M−1S−1、または少なくとも0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250、または1500x104M−1S−1の速度で少なくとも1つのプロテアーゼにより特異的に切断される。いくつかの実施形態では、CMは約100,000M−1S−1の速度で特異的に切断される。いくつかの実施形態では、CMは、約1x102〜約1x106M−1S−1(すなわち、約1x102〜約1x106M−1S−1)の速度で特異的に切断される。

0208

酵素による特異的切断の場合、酵素とCMの間で接触が生じる。MMおよびCMに連結されるABを含む活性化可能抗体が標的および十分な酵素活性の存在下にある場合、CMは切断され得る。十分な酵素活性は、CMと接触し切断を行う酵素の能力を指す。酵素は、CMの近くにあり得るが、他の細胞因子のためまたは酵素のタンパク質修飾のために切断できないことが容易に想起され得る。

0209

本明細書に記載の組成物中での使用に好適なリンカーは一般に、標的へのABの結合の阻害を容易にするために、修飾ABまたは活性化可能抗体の柔軟性をもたらすものである。こうしたリンカーは一般に、柔軟なリンカーと称される。好適なリンカーは容易に選択でき、1アミノ酸(例えばGly)〜20アミノ酸、2アミノ酸〜15アミノ酸、3アミノ酸〜12アミノ酸、4アミノ酸〜10アミノ酸、5アミノ酸〜9アミノ酸、6アミノ酸〜8アミノ酸、または7アミノ酸から8アミノ酸など、好適な異なる長さのいずれであってもよく、かつ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸の長さであってもよい。

0210

例示的な柔軟なリンカーとしては、グリシンポリマー(G)n、グリシンセリンポリマーが挙げられる(例えば、(GS)n、(GSGGS)n(配列番号339)および(GGGS)n(配列番号340)(nは、少なくとも1つの整数であり、いくつかの実施形態では、20以下である)、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および当技術分野で公知である他の柔軟なリンカーを含む)。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは比較的構造化されていないため、成分間の中性つなぎとして機能し得る。グリシンは、アラニンよりもはるかに多くのphi−psiスペースアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない(Scheraga、Rev.Computational Chem.11173−142(1992年)を参照されたい)。例示的な柔軟なリンカーとしては、これらに限定されないが、Gly−Gly−Ser−Gly(配列番号341)、Gly−Gly−Ser−Gly−Gly(配列番号342)、Gly−Ser−Gly−Ser−Gly(配列番号343)、Gly−Ser−Gly−Gly−Gly(配列番号344)、Gly−Gly−Gly−Ser−Gly(配列番号345)、Gly−Ser−Ser−Ser−Gly(配列番号346)などが挙げられる。当業者であれば、活性化可能抗体の設計は、すべてまたは部分的に柔軟なリンカーを含んでよく、これにより、リンカーは、柔軟性のあるリンカーと、柔軟性の低い構造を付与して所望の活性化可能抗体構造をもたらす1つ以上の部分とを含み得ることを認識するであろう。

0211

本開示はまた、活性化可能抗体の活性(例えば、マスキング、活性化または結合活性)を損なうことなく、AB中の1つ以上のシステイン残基への1つ以上の剤の付着を可能にするように修飾された活性化可能抗体を定量化するための組成物および方法も提供する。いくつかの実施形態では、MM内の1つ以上のジスルフィド結合を還元するか、またはさもなければ妨害することなく、AB内の1つ以上のシステイン残基に1つ以上の剤を付着できるように修飾された活性化可能抗体。本明細書で提供される組成物および方法は、例えばいくつかの実施形態では、活性化可能抗体のMMに結合されるいずれの剤(複数可)もなく、1つ以上の剤、例えば様々な治療剤、診断剤および/または予防剤のいずれかに結合される活性化可能抗体を使用して実施できる。本明細書で提供される組成物および方法は、MMが、切断されていない状態の活性化可能抗体のABを効果的かつ効率的にマスクする能力を保持する、結合型活性化可能抗体と共に使用される。本明細書で提供される組成物および方法は、CMを切断できるプロテアーゼの存在下で、活性化可能抗体が依然として活性化されている、すなわち、切断されている、結合型活性化可能抗体と共に使用される。

0212

活性化可能抗体は、剤に対する少なくとも1つの結合点を有するが、本明細書で提供される方法および組成物では、可能な結合点のすべてが剤への結合に利用可能ではない。いくつかの実施形態では、1つ以上の結合点は、ジスルフィド結合に関与する硫黄原子である。いくつかの実施形態では、1つ以上の結合点は、鎖間ジスルフィド結合に関与する硫黄原子である。いくつかの実施形態では、1つ以上の結合点は、鎖間スルフィド結合に関与する硫黄原子であるが、鎖内ジスルフィド結合に関与する硫黄原子ではない。いくつかの実施形態では、1つ以上の結合点は、システインまたは硫黄原子を含む他のアミノ酸残基の硫黄原子である。こうした残基は、抗体構造中に自然に存在し得るか、部位特異的変異誘発化学変換、または非天然アミノ酸の誤取り込みにより抗体に組み込まれ得る。

0213

本明細書で提供される組成物および方法は、ABに1つ以上の鎖間ジスルフィド結合およびMMに1つ以上の鎖内ジスルフィド結合を有する活性化可能抗体のコンジュゲートも使用でき、この場合、遊離チオールと反応する薬物が提供される。これらの実施形態では、方法は一般に、例えばTCEPなどの還元剤により活性化可能抗体の鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元すること、および遊離チオールと反応する薬物を、部分的に還元された活性化可能抗体に結合させることを含む。本明細書で使用する場合、部分的還元という用語は、活性化可能抗体が還元剤と接触し、すべてよりも少ないジスルフィド結合、例えば、すべてよりも少ない可能な結合部位が還元される状況を指す。いくつかの実施形態では、すべての可能な結合部位の99%未満、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%または5%未満が還元される。

0214

さらに他の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、薬物などの剤を活性化可能抗体に還元し、結合する方法と組み合わせて使用され、その結果、剤の配置の選択性が付与される。これらの実施形態では、方法は一般に、活性化可能抗体のマスキング部分または他のAB以外の部分の任意の結合部位が還元されないように還元剤で活性化可能抗体を部分的に還元すること、およびAB中の鎖間チオールに剤を結合することを含む。結合部位(複数可)は、剤の所望の配置を可能にして、結合が所望の部位で生じ得るように選択される。還元剤は、例えば、TCEPである。例えば、還元剤と活性化可能抗体の比、インキュベーションの長さ、インキュベーション中の温度、還元反応溶液のpHなどの還元反応条件は、MMが切断されていない状態の活性化可能抗体のABを効果的かつ効率的にマスクする能力を保持する結合型活性化可能抗体を産生する条件を特定することによって決定される。還元剤と活性化可能抗体との比は、活性化可能抗体によって異なる。いくつかの実施形態では、還元剤と活性化可能抗体との比は、約20:1〜1:1、約10:1〜1:1、約9:1〜1:1、約8:1〜1:1、約7:1〜1:1、約6:1〜1:1、約5:1〜1:1、約4:1〜1:1、約3:1〜1:1、約2:1〜1:1、約20:1〜1:1.5、約10:1〜1:1.5、約9:1〜1:1.5、約8:1〜1:1.5、約7:1〜1:1.5、約6:1〜1:1.5、約5:1〜1:1.5、約4:1〜1:1.5、約3:1〜1:1.5、約2:1〜1:1.5、約1.5:1〜1:1.5、または約1:1〜1:1.5の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約5:1〜1:1の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約5:1〜1.5:1の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約4:1〜1:1の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約4:1〜1.5:1の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約8:1〜約1:1の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約2.5:1〜1:1の範囲である。

0215

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、活性化可能抗体のAB中の鎖間ジスルフィド結合を還元すること、および剤、例えば薬物などのチオール含有剤を、結果として生じる鎖間チオールに結合して、AB上の剤(複数可)を選択的に配置する方法と組み合わせて使用される。これらの実施形態では、この方法は一般に、ABを還元剤で部分的に還元して、活性化可能抗体においてすべての可能な鎖間チオールを形成することなく、少なくとも2つの鎖間チオールを形成すること、および部分的に還元されたABの鎖間チオールに剤を結合させること、を含む。例えば、活性化可能抗体のABは、還元剤対活性化抗体の望ましい比にて、約37℃で約1時間部分的に還元される。いくつかの実施形態では、還元剤と活性化可能抗体との比は、約20:1〜1:1、約10:1〜1:1、約9:1〜1:1、約8:1〜1:1、約7:1〜1:1、約6:1〜1:1、約5:1〜1:1、約4:1〜1:1、約3:1〜1:1、約2:1〜1:1、約20:1〜1:1.5、約10:1〜1:1.5、約9:1〜1:1.5、約8:1〜1:1.5、約7:1〜1:1.5、約6:1〜1:1.5、約5:1〜1:1.5、約4:1〜1:1.5、約3:1〜1:1.5、約2:1〜1:1.5、約1.5:1〜1:1.5、または約1:1〜1:1.5の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約5:1〜1:1の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約5:1〜1.5:1の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約4:1〜1:1の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約4:1〜1.5:1の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約8:1〜約1:1の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約2.5:1〜1:1の範囲である。

0216

チオール含有試薬は、例えば、システインまたはN−アセチルシステインであり得る。還元剤は、例えば、TCEPであり得る。いくつかの実施形態では、還元された活性化可能抗体は、例えば、カラムクロマトグラフィー透析、またはダイアフィルトレーションを使用して、結合の前に精製され得る。あるいは、還元された抗体は、部分的な還元の後および結合の前に精製されない。

0217

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、活性化可能抗体の鎖内ジスルフィド結合を妨害することなく、活性化可能抗体の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合が還元剤で還元されている、部分的に還元された活性化可能抗体と共に使用され、活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB)、切断されていない状態の活性化可能抗体のABの標的への結合を阻害するマスキング部分(MM)、および、ABに連結される切断可能部分(CM)であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるCM、を含む。いくつかの実施形態では、MMはCMを介してABに連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の1つ以上の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤によって乱されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体内のMMの1つ以上の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤によって乱されない。いくつかの実施形態では、切断されていない状態の活性化可能抗体は、以下のようなN末端からC末端への構造的配置を有する:MM−CM−ABまたはAB−CM−MM。いくつかの実施形態では、還元剤はTCEPである。

0218

さらに他の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、剤、例えば薬物を還元し、活性化可能抗体に結合させ、リジンおよび/またはシステイン残基の定義された数と位置を有する活性化可能抗体を提供することにより剤の配置に選択性をもたらす方法と併せて使用される。いくつかの実施形態では、リジンおよび/またはシステイン残基の定義された数は、親抗体または活性化可能抗体のアミノ酸配列における対応する残基の数より多いかまたは少ない。いくつかの実施形態では、定義された数のリジンおよび/またはシステイン残基は、抗体または活性化可能抗体に結合され得る定義された数の剤同等物をもたらし得る。いくつかの実施形態では、定義された数のリジンおよび/またはシステイン残基は、部位特異的様式で抗体または活性化可能抗体に結合され得る定義された数の剤同等物をもたらし得る。いくつかの実施形態では、修飾された活性化可能抗体は、部位特異的な様式で1つ以上の非天然アミノ酸により修飾され、このため、いくつかの実施形態では、剤の結合を非天然アミノ酸の部位のみに制限する。いくつかの実施形態では、定義された数および位置のリジンおよび/またはシステイン残基を有する抗体または活性化可能抗体は、マスキング部分または活性化可能抗体の他のAB以外の部分でのいかなる結合部位も還元されないように、本明細書で論じられるように還元剤で部分的に還元されてよく、かつ剤をAB中の鎖間チオールに結合する。

0219

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、活性化可能抗体のいかなる鎖内ジスルフィド結合も乱されることなく活性化可能抗体中の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合が還元剤で還元されている、部分的に還元された活性化可能抗体と共に使用され、活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB)、切断されていない状態の活性化可能抗体のABの標的への結合を阻害するマスキング部分(MM)、およびABに連結される切断可能部分(CM)であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるCM、を含む。いくつかの実施形態では、MMはCMを介してABに連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の1つ以上の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤によって乱されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体内のMMの1つ以上の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤によって乱されない。いくつかの実施形態では、切断されていない状態にある活性化可能抗体は、以下のようにN末端からC末端への構造的配置を有する:MM−CM−ABまたはAB−CM−MM。いくつかの実施形態では、還元剤はTCEPである。

0220

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、活性化可能抗体に結合された剤も含む活性化可能抗体と共に使用される。いくつかの実施形態では、結合された剤は、抗炎症剤および/または抗新生物剤などの治療剤である。こうした実施形態では、剤は、活性化可能抗体の炭水化物部分に結合される。例えば、いくつかの実施形態では、炭水化物部分は、活性化可能抗体中の抗体または抗原結合断片の抗原結合領域の外側に配置される。いくつかの実施形態では、剤は、活性化可能抗体中の抗体または抗原結合断片のスルフヒドリル基に結合される。

0221

いくつかの実施形態では、剤は、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片)、または放射性同位体(すなわち、放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤である。

0222

いくつかの実施形態では、剤は、例えば標識または他のマーカーなどの検出可能な部分である。例えば、剤は、放射標識アミノ酸、マークされたアビジンによって検出可能な1つ以上のビオチニル部分(例えば、蛍光マーカーを含むストレプトアビジンまたは光学的方法もしくは熱量測定法によって検出可能な酵素活性)、または1つ以上の放射性同位体もしくは放射性核種、1つ以上の蛍光標識、1つ以上の酵素標識、および/または1つ以上の化学発光剤であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、スペーサー分子によって付着される。

0223

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片)などの細胞傷害剤に結合された抗体を含む免疫複合体、または放射性同位体(すなわち、放射性コンジュゲート)と共に使用される。好適な細胞毒性剤としては、例えば、ドラスタチンおよびその誘導体(例えば、オーリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE、MMAD、DMAF、DMAE)が挙げられる。例えば、剤はモノメチルオーリスタチンE(MMAE)またはモノメチルオーリスタチンD(MMAD)である。いくつかの実施形態では、剤は、表5に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施形態では、剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンEまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンD(MMAD)である。いくつかの実施形態では、剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、DM1またはDM4である。いくつかの実施形態では、剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。

0224

いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドカプロイルバリンシトルリンリンカーまたはマレイミドPEG−バリン−シトルリンリンカーを使用してABに連結される。いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリンリンカーを使用してABに連結される。いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドPEG−バリン−シトルリンリンカーを使用してABに連結される。いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドPEG−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを使用してABに連結されたモノメチルオーリスタチンD(MMAD)であり、このリンカーペイロード構築物は、本明細書では「vc−MMAD」と称される。いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドPEG−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを使用してABに連結されたモノメチルオーリスタチンE(MMAE)であり、このリンカーペイロード構築物は本明細書では「vc−MMAE」と称される。いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドPEG−バリン−シトルリンリンカーを使用してABに連結される。いくつかの実施形態では、剤は、bis−マレイミドPEG−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを使用してABに連結されたモノメチルオーリスタチンD(MMAD)であり、このリンカーペイロード構築物は、本明細書では「PEG2−vc−MMAD」と称される。vc−MMAD、vc−MMAE、およびPEG2−vc−MMADの構造を以下に示す:

0225

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、モノメチルオーリスタチンD(MMAD)ペイロードに連結された活性化可能抗体を含む結合型活性化可能抗体と共に使用され、活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片(AB)、切断されていない状態の活性化可能抗体のABの標的への結合を阻害するマスキング部分(MM)、およびABに結合された切断可能部分(CM)であって、少なくとも1つのMMPプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるCM、を含む。

0226

いくつかの実施形態では、MMAD結合型活性化可能抗体は、剤をABに付着させるためのいくつかの方法のいずれかを用いて結合されてよい:(a)ABの炭水化物部分への付着、または(b)ABのスルフヒドリル基への付着、または(c)ABのアミノ基への付着、または(d)ABのカルボキシレート基への付着。

0227

いくつかの実施形態では、MMADペイロードは、リンカーを介してABに結合される。いくつかの実施形態では、MMADペイロードは、リンカーを介してAB中のシステインに結合される。いくつかの実施形態では、MMADペイロードは、リンカーを介してAB中のリジンに結合される。いくつかの実施形態では、MMADペイロードは、リンカーを介して、本明細書に開示される残基などのABの別の残基に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーはチオール含有リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは切断不能リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、表6および表7に示されるリンカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびMMADペイロードは、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびMMADペイロードは、マレイミドPEG−バリン−シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびMMADペイロードは、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびMMADペイロードは、マレイミドPEG−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、MMADペイロードは、本明細書で開示される部分的還元および結合技術を用いてABに結合される。

0228

いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのポリエチレングリコール(PEG)成分は、2つのエチレングリコールモノマー、3つのエチレングリコールモノマー、4つのエチレングリコールモノマー、5つのエチレングリコールモノマー、6つのエチレングリコールモノマー、7つのエチレングリコールモノマー、8つのエチレングリコールモノマー、9つのエチレングリコールモノマー、または少なくとも10のエチレングリコールモノマーから形成される。本開示のいくつかの実施形態では、PEG成分は分岐ポリマーである。本開示のいくつかの実施形態では、PEG成分は非分岐ポリマーである。いくつかの実施形態では、PEGポリマー成分は、アミノ基またはその誘導体、カルボキシル基またはその誘導体、またはアミノ基またはその誘導体とカルボキシル基またはその誘導体の両方で官能化される。

0229

いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのPEG成分は、アミノテトラエチレングリコールカルボキシル基またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのPEG成分は、アミノトリエチレングリコールカルボキシル基またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのPEG成分は、アミノジエチレングリコールカルボキシル基またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、アミノ誘導体は、アミノ基と、アミノ基が結合されるカルボキシル基との間のアミド結合の形成である。いくつかの実施形態では、カルボキシル誘導体は、カルボキシル基と、カルボキシル基が結合されるアミノ基との間のアミド結合の形成である。いくつかの実施形態では、カルボキシル誘導体は、カルボキシル基と、カルボキシル基が結合されるヒドロキシル基との間のエステル結合の形成である。

0230

使用可能な酵素活性毒素およびその断片としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素非結合活性断片外毒素A鎖(緑膿菌由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファサルシンシナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ダイアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP−S)、ツルレイシ(momordica charantia)阻害剤、クルシン(curcin)、クロチン、サパオリアオフィシナリス阻害剤、ゲロニンミトリンレストクトシンフェノマイシン、エノマイシン、および、トリコテセンが挙げられる。放射性結合抗体の産生には、様々な放射性核種が利用可能である。例としては、212Bi、131I、131In、90Y、および186Reが挙げられる。

0231

抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオールプロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステル二官能性誘導体(アジピン酸ジメチルHCLなど)、活性エステルスベリン酸ジスクシンイミジルなど)、アルデヒドグルタルアルデヒドなど)、ビスアジド化合物ビス(p−アジドベンゾイルヘキサンジアミンなど)、ビス−ジアゾニウム誘導体(ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンなど)、ジイソシアナートトリエン2,6−ジイソシアナートなど)、およびビス活性フッ素化合物(1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼンなど)などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら、Science 238:1098(1987年)に記載のとおり作製され得る。炭素−14標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(MX−DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的なキレート剤である(国際公開第94/11026号を参照されたい)。

0232

表5は、本明細書に記載の開示で使用できる例示的な医薬剤のいくつかを列挙するが、決して網羅的なリストであることを意味するものではない。

0233

当業者であれば、多種多様な可能な部分が、本開示により生じる抗体に結合され得ることを認識するであろう(例えば、「Conjugate Vaccines」、Contributions to Microbiology and Immunology、J.M.Cruse and R.E.Lewis、Jr(編)、Carger Press、New York(1989年)(その全内容は参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。

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