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図面 (20)

課題・解決手段

NR4A1リガンド、NR4A1リガンドを含む医薬組成物、及び関連する使用方法を記載する。NR4A1活性の調節によって治療可能な個人における疾患又は状態を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の化合物又は医薬組成物を個人に投与することを含む方法を提供する。

概要

背景

核内受容体サブファミリー4グループAメンバー1(NR4A1)は、結腸膵臓乳房(エストロゲン受容体陽性及び陰性)、及び肺腫瘍において過剰発現し、乳房、結腸、及び肺腫瘍患者において、NR4A1の高発現は、生存率の低下が予測される。癌におけるNR4A1の機能活性は、ノックダウン又は過剰発現のいずれかによって癌細胞株中で幅広く研究され、結果は、メラノーマリンパ腫、膵臓、結腸、乳房、腎臓子宮頚部卵巣、及び胃癌細胞株において、NR4A1が、癌細胞増殖、生存率、細胞周期の進行、移行及び浸潤(図1)のうちの1つ又は複数を調整することを示した。研究は、β1及び他のインテグリンをNR4A1調節遺伝子として特定した。また、研究は、NR4A1が、横紋筋肉腫(RMS)患者の腫瘍において過剰発現し、この受容体が、図1に示すように、RMS細胞中発癌促進経路(pro-oncogenic pathways)を調節することも実証する。NR4A1の発癌促進機能は、インテグリン、スルビビン、EGFR、及び他の受容体チロシンキナーゼを含めた、それら自体が個々の薬物標的である幾つかの遺伝子の調節を含む。

これは、NR4A1アンタゴニストの開発が、固形腫瘍の増殖、生存率、及び移動/浸潤と関連する複数の発癌促進経路を同時に標的とする特有化学療法を表すことを示唆する。研究は、先ず、幾つかの1,1-ビス(3'-インドリル)-1-(p-置換フェニル)メタン(C-DIM)化合物がNR4A1を不活化したことを示し、後続して、研究は、DIM-C-pPhOH及び他のp-置換フェニル類似体をNR4A1リガンドとして特定した。DIM-C-pPhOH及び関連化合物は、細胞培養中10〜20μMの濃度で、図1に略述した発癌促進経路をブロックし、30〜40mg/kg/dの用量で腫瘍増殖を部分的に阻害する。DIM-C-pPhOHは、NR4A1に対して高い結合親和性(K0〜0.100μM)を有するが、短いインビボ半減期を示す。

上記のように、研究は、NR4A1に結合し、アンタゴニスト(逆アゴニスト)として作用するNR4A1リガンドの開発に焦点を当てた。一名又は複数名の本発明者らによる研究は、NR4A1をノックダウンするためにRNA干渉(RNAi)に頼り、細胞機能及び細胞機能に必要な関連経路に与える受容体ノックダウンの効果を決定するために分子/生化学研究に頼った。初期研究は、低下した膵臓癌細胞増殖をもたらすNR4A1のノックダウン及びアポトーシス誘導を示し、これは、横紋筋肉腫、肺癌乳癌腎臓癌及び結腸癌細胞株においても観察された。機構研究は、NR4A1が、補助因子として、生存促進性(スルビビン及びbcl2)及び増殖促進(EGFR及び他の受容体チロシンキナーゼ)遺伝子の近位GC富化領域に結合したSp転写因子相互作用することによって、これらの遺伝子を活性化するように作用することを実証する。他の補助因子(例えば、p300)と結合したNR4A1は、これらの遺伝子の発現を活性化及び制御する。

一連のC-DIM類似体の中でも、p-ヒドロキシフェニル類似体(DIM-C-pPhOH;CDIM8)はNR4A1に結合するだけでなく、アンタゴニストとしても作用することが実証された。したがって、DIM-C-pPhOHは、癌細胞の増殖及び生存を阻害し、スルビビン、EGFR、及び他のNR4A1/Sp調節遺伝子の発現を阻害する。RNAiによるNR4A1のノックダウンも、セストリンのp53-依存性及び非依存性活性化を通してmTORシグナリングを阻害し、同様の結果が、多発性癌細胞株中のDIM-C-pPhOH及び他のNR4A1/C-DIMアンタゴニストでも観察される。NR4A1も、イソクエン酸脱水素酵素1(IDH1)及びチオレドキシンドメイン含有5(TXNDC5)の発現を制御することによって癌細胞株中で低い酸化ストレスを維持する上で重要な役割を果たす。NR4A1のノックダウン又はDIM-C-pPhOH及び他のNR4A1アンタゴニストによる処置は、IDH1及びTXNDC6の発現を低減し、その結果、多くの癌細胞株中で活性酸素種(ROS)、ROS-依存性小胞体ストレス、及び細胞死の誘導をもたらす(図1)。近年の研究は、NR4A1が、癌細胞遊走/浸潤において主要な役割を果たし、これが、浸潤促進遺伝子β1-インテグリンのNR4A1/Sp介在制御に起因することを示した。NR4A1ノックダウン又はDIM-C-pPhOH若しくは他のNR4A1アンタゴニストによる処置は、癌細胞遊走を低減し、β1-インテグリン及び他のインテグリンを下方制御した(図1)。

これらの研究は、NR4A1が、固形腫瘍において発癌促進性があり、DIM-C-pPhOH及び他のC-DIMが、癌細胞株中のNR4A1アンタゴニストとして特徴づけられることを確定した。第一世代C-DIM化合物は全て、p-置換フェニル部分を含み、DIM-C-pPhOH(p-ヒドロキシフェニル)は、癌細胞株中でNR4A1アンタゴニスト活性を主に示すと同時にミトコンドリア毒性等の受容体非依存性活性が最小限の高親和性リガンドとして特徴付けられたが、DIM-C-pPhOH及び関連化合物のインビボでの腫瘍増殖阻害剤としての活性は約30mg/kg/dの範囲であり、インビボ半減期は非常に短い。

本開示は、これらの必要性を満たすことを追求し、関連する更なる利点を提供する。

概要

NR4A1リガンド、NR4A1リガンドを含む医薬組成物、及び関連する使用方法を記載する。NR4A1活性の調節によって治療可能な個人における疾患又は状態を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の化合物又は医薬組成物を個人に投与することを含む方法を提供する。

目的

本開示は、これらの必要性を満たすことを追求し、関連する更なる利点を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

次式:の化合物又はその塩(式中、R1、R2、R1'、及びR2'が、それぞれ独立して、水素、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、及び1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基からなる群から選択され、R3、R4、R5、R6、R3'、R4'、R5'、及びR6'が、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むアルコキシ基、及びニトロ基からなる群から選択され、R7が、水素、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むシクロアルキル基、及びアリール基からなる群から選択され、R8、R9、R10、R11、及びR12が、独立して、H、ハロゲン、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むアルコキシ基、1個から約10個の炭素原子を含むハロアルキル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、及び1個から約10個の炭素原子を含むハロアルコキシ基からなる群から選択され、R8、R9、R10、R11、及びR12のうちの少なくとも1つがOHであり、R10がOHであるとき、R8、R9、R11、及びR12のうちの少なくとも1つが水素でない)。

請求項2

R8がOHである、請求項1に記載の化合物。

請求項3

R9、R10、R11、及びR12がそれぞれHである、請求項2に記載の化合物。

請求項4

R9、R10、R11、及びR12が、独立して、ハロゲン、CH3、OCCl3、CF3、t-ブチル、OCH3、OH、C6H5、及びCNからなる群から選択される、請求項2に記載の化合物。

請求項5

R10がOCH3である、請求項2に記載の化合物。

請求項6

R11が、CH3、OCH3、CF3からなる群から選択される、請求項2に記載の化合物。

請求項7

R9及びR11がBrである、請求項2に記載の化合物。

請求項8

及びこれらの塩からなる群から選択される、請求項2に記載の化合物。

請求項9

R9がOHである、請求項1に記載の化合物。

請求項10

R8、R10、R11、及びR12が、それぞれHである、請求項9に記載の化合物。

請求項11

R8、R10、R11、及びR12が、独立して、ハロゲン、CH3、OCCl3、CF3、t-ブチル、OCH3、OH、C6H5、及びCNからなる群から選択される、請求項9に記載の化合物。

請求項12

R8がハロゲンである、請求項9に記載の化合物。

請求項13

及びこれらの塩からなる群から選択される、請求項9に記載の化合物。

請求項14

R10がOHである、請求項1に記載の化合物。

請求項15

R8、R9、R11、及びR12が、独立して、ハロゲン、CH3、OCCl3、CF3、t-ブチル、OCH3、OH、C6H5、及びCNからなる群から選択される、請求項14に記載の化合物。

請求項16

R9がハロゲンであり、R11がH、ハロゲン、及びOCH3からなる群から選択される、請求項14に記載の化合物。

請求項17

及びこれらの塩からなる群から選択される、請求項14に記載の化合物。

請求項18

治療有効量の請求項1から17のいずれか一項に記載の化合物、又はその塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物

請求項19

核内受容体サブファミリー4グループAメンバー1(NR4A1)活性を調節することによって治療可能な個人における疾患又は状態を治療する方法であって、治療有効量の請求項1から17のいずれか一項に記載の化合物、若しくはその塩、又は請求項18に記載の医薬組成物を個人に投与する工程を含む方法。

請求項20

疾患又は条件が、癌、血栓症大腸炎クローン病炎症性腸疾患多発性硬化症関節リウマチ免疫抑制障害関節炎喘息、卒中、再狭窄鼻炎糖尿病、及び骨粗しょう症からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。

請求項21

癌が、膵臓癌乳癌大腸癌横紋筋肉腫、及び肺癌からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。

請求項22

NR4A1活性の調節が、β1-インテグリン、TXNDC5、スルビビン、EFGR、PAX3-FOX01A、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質下方制御誘導する、請求項19に記載の方法。

請求項23

NR4A1活性の調節が、SERPINB5、GADD45α、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の上方制御を誘導する、請求項19に記載の方法。

請求項24

疾患が糖尿病であり、NR4A1活性の調節が、個人におけるグルコース取り込みを誘導する、請求項20に記載の方法。

請求項25

NR4A1活性の調節が、GLUT-4及びRab4の上方制御並びにAMPKのリン酸化を誘導する、請求項24に記載の方法。

請求項26

投与が、局所投与経口投与静脈注射腹腔内注射筋肉注射、鼻腔内投与経皮投与直腸投与、又はこれらの組み合わせを含む、請求項19に記載の方法。

請求項27

細胞中のNR4A1活性を調節する方法であって、請求項1から17のいずれか一項に記載の化合物、若しくはその塩、又は請求項18に記載の医薬組成物を細胞に投与する工程を含む方法。

請求項28

細胞中のNR4A1活性の調節が、細胞中の機能的NR4A1のレベルを低減する工程を含む、請求項27に記載の方法。

請求項29

細胞が、癌細胞である、請求項27に記載の方法。

請求項30

細胞を、インビトロで化合物又は医薬組成物と接触させる、請求項27に記載の方法。

請求項31

有効量の化合物又は医薬組成物を対象に投与することによって、細胞をインビボで化合物又は医薬組成物と接触させる、請求項27に記載の方法。

請求項32

NR4A1活性の調節が、β1-インテグリン、TXNDC5、スルビビン、EFGR、PAX3-FOX01A、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の下方制御を誘導する、請求項27に記載の方法。

請求項33

NR4A1活性の調節が、SERPINB5、GADD45α、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の上方制御を誘導する、請求項27に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、内容が参照により本明細書に組み込まれている、2017年8月10日に出願した米国出願第62/543761号の利益を主張するものである。

背景技術

0002

核内受容体サブファミリー4グループAメンバー1(NR4A1)は、結腸膵臓乳房(エストロゲン受容体陽性及び陰性)、及び肺腫瘍において過剰発現し、乳房、結腸、及び肺腫瘍患者において、NR4A1の高発現は、生存率の低下が予測される。癌におけるNR4A1の機能活性は、ノックダウン又は過剰発現のいずれかによって癌細胞株中で幅広く研究され、結果は、メラノーマリンパ腫、膵臓、結腸、乳房、腎臓子宮頚部卵巣、及び胃癌細胞株において、NR4A1が、癌細胞増殖、生存率、細胞周期の進行、移行及び浸潤(図1)のうちの1つ又は複数を調整することを示した。研究は、β1及び他のインテグリンをNR4A1調節遺伝子として特定した。また、研究は、NR4A1が、横紋筋肉腫(RMS)患者の腫瘍において過剰発現し、この受容体が、図1に示すように、RMS細胞中発癌促進経路(pro-oncogenic pathways)を調節することも実証する。NR4A1の発癌促進機能は、インテグリン、スルビビン、EGFR、及び他の受容体チロシンキナーゼを含めた、それら自体が個々の薬物標的である幾つかの遺伝子の調節を含む。

0003

これは、NR4A1アンタゴニストの開発が、固形腫瘍の増殖、生存率、及び移動/浸潤と関連する複数の発癌促進経路を同時に標的とする特有化学療法を表すことを示唆する。研究は、先ず、幾つかの1,1-ビス(3'-インドリル)-1-(p-置換フェニル)メタン(C-DIM)化合物がNR4A1を不活化したことを示し、後続して、研究は、DIM-C-pPhOH及び他のp-置換フェニル類似体をNR4A1リガンドとして特定した。DIM-C-pPhOH及び関連化合物は、細胞培養中10〜20μMの濃度で、図1に略述した発癌促進経路をブロックし、30〜40mg/kg/dの用量で腫瘍増殖を部分的に阻害する。DIM-C-pPhOHは、NR4A1に対して高い結合親和性(K0〜0.100μM)を有するが、短いインビボ半減期を示す。

0004

上記のように、研究は、NR4A1に結合し、アンタゴニスト(逆アゴニスト)として作用するNR4A1リガンドの開発に焦点を当てた。一名又は複数名の本発明者らによる研究は、NR4A1をノックダウンするためにRNA干渉(RNAi)に頼り、細胞機能及び細胞機能に必要な関連経路に与える受容体ノックダウンの効果を決定するために分子/生化学研究に頼った。初期研究は、低下した膵臓癌細胞増殖をもたらすNR4A1のノックダウン及びアポトーシス誘導を示し、これは、横紋筋肉腫、肺癌乳癌腎臓癌及び結腸癌細胞株においても観察された。機構研究は、NR4A1が、補助因子として、生存促進性(スルビビン及びbcl2)及び増殖促進(EGFR及び他の受容体チロシンキナーゼ)遺伝子の近位GC富化領域に結合したSp転写因子相互作用することによって、これらの遺伝子を活性化するように作用することを実証する。他の補助因子(例えば、p300)と結合したNR4A1は、これらの遺伝子の発現を活性化及び制御する。

0005

一連のC-DIM類似体の中でも、p-ヒドロキシフェニル類似体(DIM-C-pPhOH;CDIM8)はNR4A1に結合するだけでなく、アンタゴニストとしても作用することが実証された。したがって、DIM-C-pPhOHは、癌細胞の増殖及び生存を阻害し、スルビビン、EGFR、及び他のNR4A1/Sp調節遺伝子の発現を阻害する。RNAiによるNR4A1のノックダウンも、セストリンのp53-依存性及び非依存性活性化を通してmTORシグナリングを阻害し、同様の結果が、多発性癌細胞株中のDIM-C-pPhOH及び他のNR4A1/C-DIMアンタゴニストでも観察される。NR4A1も、イソクエン酸脱水素酵素1(IDH1)及びチオレドキシンドメイン含有5(TXNDC5)の発現を制御することによって癌細胞株中で低い酸化ストレスを維持する上で重要な役割を果たす。NR4A1のノックダウン又はDIM-C-pPhOH及び他のNR4A1アンタゴニストによる処置は、IDH1及びTXNDC6の発現を低減し、その結果、多くの癌細胞株中で活性酸素種(ROS)、ROS-依存性小胞体ストレス、及び細胞死の誘導をもたらす(図1)。近年の研究は、NR4A1が、癌細胞遊走/浸潤において主要な役割を果たし、これが、浸潤促進遺伝子β1-インテグリンのNR4A1/Sp介在制御に起因することを示した。NR4A1ノックダウン又はDIM-C-pPhOH若しくは他のNR4A1アンタゴニストによる処置は、癌細胞遊走を低減し、β1-インテグリン及び他のインテグリンを下方制御した(図1)。

0006

これらの研究は、NR4A1が、固形腫瘍において発癌促進性があり、DIM-C-pPhOH及び他のC-DIMが、癌細胞株中のNR4A1アンタゴニストとして特徴づけられることを確定した。第一世代C-DIM化合物は全て、p-置換フェニル部分を含み、DIM-C-pPhOH(p-ヒドロキシフェニル)は、癌細胞株中でNR4A1アンタゴニスト活性を主に示すと同時にミトコンドリア毒性等の受容体非依存性活性が最小限の高親和性リガンドとして特徴付けられたが、DIM-C-pPhOH及び関連化合物のインビボでの腫瘍増殖阻害剤としての活性は約30mg/kg/dの範囲であり、インビボ半減期は非常に短い。

0007

本開示は、これらの必要性を満たすことを追求し、関連する更なる利点を提供する。

0008

米国特許第7,232,843号

先行技術

0009

Remington's Pharmaceutical Sciences、第18編(Easton, Pa.: Mack Publishing Company、1990)

発明が解決しようとする課題

0010

この概要は、下記の発明を実施するための形態で更に説明する簡易形態の概念の選択を導入するために提供される。この概要は、特許請求の範囲の主題の重要な特色を特定することを意図せず、又は特許請求の範囲の主題の範囲の決定を助けるために使用することも意図しない。

課題を解決するための手段

0011

一態様において、本開示は、核内受容体サブファミリー4グループAメンバー1(NR4A1)リガンドを提供する。一実施形態において、リガンドは、次式の化合物:

0012

0013

又はその塩であり、
式中、
R1、R2、R1'、及びR2'は、それぞれ独立して、水素、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、及び1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基からなる群から選択され、
R3、R4、R5、R6、R3'、R4'、R5'、及びR6'は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むアルコキシ基、及びニトロ基からなる群から選択され、
R7は、水素、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むシクロアルキル基、及びアリール基からなる群から選択され、
R8、R9、R10、R11、及びR12は、独立して、H、ハロゲン、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むアルコキシ基、1個から約10個の炭素原子を含むハロアルキル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、及び1個から約10個の炭素原子を含むハロアルコキシ基からなる群から選択され、
R8、R9、R10、R11、及びR12のうちの少なくとも1つはOHであり、
R10がOHであるとき、R8、R9、R10、R11、及びR12のうちの少なくとも1つは水素でない。

0014

別の態様において、本開示は、治療有効量の本明細書に記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

0015

別の態様において、本開示は、NR4A1活性の調節によって治療可能な個人における疾患又は状態を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の化合物又は医薬組成物を個人に投与することを含む方法を提供する。

0016

別の態様において、本開示は、細胞中のNR4A1活性を調節する方法であって、本明細書に記載の化合物又は医薬組成物を細胞に投与することを含む方法を提供する。

0017

前述の態様及び特許請求された開示の付帯利点の多くは、以下の詳細な説明を添付図と併用して参照することによってより良く理解されるのと同じように、より容易に理解されるであろう。

図面の簡単な説明

0018

1,1-ビス(3'-インドリル)-1-(p-置換フェニル)メタン(CDIM)/NR4A1リガンドが、NR4A1依存性増殖及び生存経路減衰することによる核内受容体サブファミリー4グループAメンバー1(NR4A1)の阻害を概略的に例示する。
本開示の実施形態による4-、3-及び2-ヒドロキシC-DIM類似体で処置したGAL4-NR4A1及びGAL4-NR4A2及びUAS-Luc(GAL4結合ルシフェラーゼ構成体)をトランスフェクトしたPanc1細胞内のルシフェラーゼ活性グラフで示す。
2つのNR4A1依存性因子β1-インテグリン及びTXNDC5の発現の下方制御を示す、本開示の実施形態に従ってモノヒドロキシC-DIM化合物で処置したPanc1(膵臓)及びSKBR3(乳房)癌細胞のウェスタンブロットの画像を含む。
PAX3-FOX01A及びTXNDC5の発現の下方制御を示す、本開示の実施形態に従って4-、3-及び2-ヒドロキシC-DIM化合物で処置したRh30(RMS)細胞のウェスタンブロットの画像を含む。
SERPINB5の発現の上方制御を示す、本開示の実施形態に従って4-、3-及び2-ヒドロキシC-DIM化合物で処置したSKBR3(乳房)癌細胞のウェスタンブロットの画像を含む。
本開示の実施形態に従って2-ヒドロキシC-DIM類似体で処置したGAL4-NR4A1及びUAS-LucをトランスフェクトしたPanc1細胞中のルシフェラーゼ活性をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って3-ヒドロキシC-DIM類似体で処置したGAL4-NR4A1及びUAS-LucをトランスフェクトしたPanc1細胞中のルシフェラーゼ活性をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って4-ヒドロキシC-DIM類似体で処置したGAL4-NR4A1及びUAS-LucをトランスフェクトしたPanc1細胞中のルシフェラーゼ活性をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って4-ヒドロキシC-DIM類似体で処置したGAL4-NR4A1及びUAS-LucをトランスフェクトしたPanc1細胞中のルシフェラーゼ活性をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って4-ヒドロキシC-DIM類似体(5μM)及びSERPINB5の誘導を示す4-OH(DIM-C-pPhOH親化合物)で処置したPanc1細胞のウェスタンブロットの画像を含む。
本開示の実施形態に従って4-ヒドロキシC-DIM類似体(5μM)並びにPAX3-FOX01A及びTXNDC5の誘導の低下を示す4-OH(DIM-C-pPhOH親化合物)で処置したRh30細胞のウェスタンブロットの画像を含む。
Rh30細胞中、本開示の実施形態のDIM-C-pPhOH(4-OH化合物)及び置換C-DIM類似体による、インターロイキン-24(IL-24)、グアニン脱アミノ酵素(GDA)及びダブルコルチンドメイン含有2(DCDC2)それぞれのNR4A1依存性誘導をグラフで示す。
Rh30細胞中、本開示の実施形態のDIM-C-pPhOH(4-OH化合物)及び置換C-DIM類似体による、インターロイキン-24(IL-24)、グアニン脱アミノ酵素(GDA)及びダブルコルチンドメイン含有2(DCDC2)それぞれのNR4A1依存性誘導をグラフで示す。
Rh30細胞中、本開示の実施形態のDIM-C-pPhOH(4-OH化合物)及び置換C-DIM類似体による、インターロイキン-24(IL-24)、グアニン脱アミノ酵素(GDA)及びダブルコルチンドメイン含有2(DCDC2)それぞれのNR4A1依存性誘導をグラフで示す。
図12Aは、本開示の実施形態に従って、対照(灰色)に対する、4-ヒドロキシC-DIM類似体(10mg/kg/day)(黒色)で処置したヒトMDA-MB-231乳癌細胞を使用した無胸腺ヌードマウス異種移植モデルにおける乳腺腫瘍容積をグラフで示す。図12Bは、本開示の実施形態に従って、対照(灰色)に対する、4-ヒドロキシC-DIM類似体(10mg/kg/day)(黒色)で処置したヒトMDA-MB-231乳癌細胞を使用した無胸腺ヌードマウス異種移植モデルにおける乳腺腫瘍容積をグラフで示す。図12Cは、本開示の実施形態に従って、対照(灰色)に対する、4-ヒドロキシC-DIM類似体(10mg/kg/day)(黒色)で処置したヒトMDA-MB-231乳癌細胞を使用した無胸腺ヌードマウス異種移植モデルにおける乳腺腫瘍容積をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、3-ヒドロキシC-DIM類似体で処置したGAL4-NR4A2及びUAS-LucをトランスフェクトしたPanc1細胞中のルシフェラーゼ活性をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、3-ヒドロキシC-DIM類似体で処置したSKBR3細胞のウェスタンブロットの画像を含む。
本開示の実施形態に従って、2-ヒドロキシC-DIM類似体で処置したGAL4-NR4A2及びUAS-LucをトランスフェクトしたPanc1細胞中のルシフェラーゼ活性をグラフで示す。
TXNDC5及びβ1-インテグリンの誘導の低下を示す、本開示の実施形態に従って、2-ヒドロキシC-DIM類似体で処置したPanc1細胞のウェスタンブロットの画像を含む。
SERPINB5及びGADD45αの誘導を示す、本開示の実施形態に従って、2-ヒドロキシC-DIM類似体で処置したPanc1細胞のウェスタンブロットの画像を含む。
mTOR経路の阻害を示す、本開示の実施形態に従って、4-ヒドロキシC-DIM類似体で処置した同所乳癌モデル由来解離腫瘍細胞溶解物のウェスタンブロットの画像を含む。
NR4A1遺伝子産物の下方制御、並びにGADD45α、SERPINB5、及びc-PARPの上方制御を示す。本開示の実施形態に従って、4-ヒドロキシC-DIM類似体で処置した同所乳癌モデル由来の解離腫瘍細胞溶解物のウェスタンブロットの画像を含む。
G6Paseの下方制御を実証する、本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したグルコース欠乏HepG2細胞中のルシフェラーゼ活性をグラフで示す。
PEPCKの下方制御を実証する、本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したグルコース欠乏HepG2細胞中のルシフェラーゼ活性をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したPanc1細胞中のオステオポンチン(OPN)遺伝子発現のNR4A2依存性誘導をグラフで示す。
NR4A1に結合する、本開示の実施形態によるC-DIM類似体の表面プラズモン共鳴(SPR)反応曲線である。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したマウスにおける異種移植乳房腫瘍容積(A〜C)及び質量(D)をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したマウスにおける異種移植乳房腫瘍容積(A〜C)及び質量(D)をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したマウスにおける異種移植乳房腫瘍容積(A〜C)及び質量(D)をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したマウスにおける異種移植乳房腫瘍容積(A〜C)及び質量(D)をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシC-DIM化合物で処置したマウスにおけるRMS異種移植腫瘍の腫瘍容積をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシC-DIM化合物で処置したマウスにおけるRMS異種移植腫瘍の腫瘍容積をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシC-DIM化合物で処置したマウスにおけるRMS異種移植腫瘍の腫瘍容積をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシC-DIM化合物で処置したマウスにおけるRMS異種移植腫瘍の腫瘍容積をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したC2C12細胞の全細胞溶解物のウェスタンブロットの画像である。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したC2C12細胞の全細胞溶解物のウェスタンブロットの画像である。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したC2C12細胞の全細胞溶解物のウェスタンブロットの画像である。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したC2C12細胞の全細胞溶解物のウェスタンブロットの画像である。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したC2C12細胞中の相対NR4A1/グルコーストランスポーター4(GLUT-4)mRNA発現をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したC2C12細胞中の相対NR4A1/グルコーストランスポーター4(GLUT-4)mRNA発現をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したC2C12細胞中の相対NR4A1/グルコーストランスポーター4(GLUT-4)mRNA発現をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したC2C12細胞中の相対NR4A1/グルコーストランスポーター4(GLUT-4)mRNA発現をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、C-DIM類似体で処置したC2C12細胞中のグルコース取り込みをグラフで示す。
DIM-C-pPhOH(A)、DIM-C-pPhOH-3,5-Br2(B)、DIM-C-pPhOH-3-Cl(C)、及びDIM-C-pPhOH-3-Cl-5-OCH3(D)で24時間処置した、又はNR4A1発現プラスミド(E)をトランスフェクトしたC2C12細胞中の解糖系遺伝子の相対mRNA発現をグラフで示す。
DIM-C-pPhOH(A)、DIM-C-pPhOH-3,5-Br2(B)、DIM-C-pPhOH-3-Cl(C)、及びDIM-C-pPhOH-3-Cl-5-OCH3(D)で24時間処置した、又はNR4A1発現プラスミド(E)をトランスフェクトしたC2C12細胞中の解糖系遺伝子の相対mRNA発現をグラフで示す。
DIM-C-pPhOH(A)、DIM-C-pPhOH-3,5-Br2(B)、DIM-C-pPhOH-3-Cl(C)、及びDIM-C-pPhOH-3-Cl-5-OCH3(D)で24時間処置した、又はNR4A1発現プラスミド(E)をトランスフェクトしたC2C12細胞中の解糖系遺伝子の相対mRNA発現をグラフで示す。
DIM-C-pPhOH(A)、DIM-C-pPhOH-3,5-Br2(B)、DIM-C-pPhOH-3-Cl(C)、及びDIM-C-pPhOH-3-Cl-5-OCH3(D)で24時間処置した、又はNR4A1発現プラスミド(E)をトランスフェクトしたC2C12細胞中の解糖系遺伝子の相対mRNA発現をグラフで示す。
DIM-C-pPhOH(A)、DIM-C-pPhOH-3,5-Br2(B)、DIM-C-pPhOH-3-Cl(C)、及びDIM-C-pPhOH-3-Cl-5-OCH3(D)で24時間処置した、又はNR4A1発現プラスミド(E)をトランスフェクトしたC2C12細胞中の解糖系遺伝子の相対mRNA発現をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、ビヒクル対照及びC-DIM8-3-Cl-5-OCH3(10mg/kg/d)で処置したマウスにおける血糖相対的割合をグラフで示す。
本開示の実施形態に従って、ビヒクル対照及びC-DIM8-3-Cl-5-OCH3で処置したHFD給餌C57BL/6マウスにおける耐糖能ベル中の血糖レベルの低下をグラフで示す。

0019

本発明は、核内受容体サブファミリー4グループAメンバー1(NR4Aリガンド)、治療有効量の該NR4A1リガンドを含む医薬組成物、及び関連する使用方法を提供する。

0020

NR4A1リガンド
一態様において、本開示は、NR4A1リガンドである化合物を提供する。本明細書において更に記載するように、特定の実施形態において、4-、3-及び2-ヒドロキシフェニルC-DIM類似体を骨格として使用して、癌及び他の疾患に対して強力な活性を示すNR4A1リガンドの第二世代の合成及び最終的な開発を調べるが、ここで、NR4A1は代謝性及び神経疾患等の潜在的治療標的である。

0021

これに応じて、一実施形態において、リガンドは、次式を有する化合物:

0022

0023

又はその塩であり、
式中、
R1、R2、R1'、及びR2'は、それぞれ独立して、水素、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、及び1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基からなる群から選択され、
R3、R4、R5、R6、R3'、R4'、R5'、及びR6'は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むアルコキシ基、及びニトロ基からなる群から選択され、
R7は、水素、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むシクロアルキル基、及びアリール基からなる群から選択され、
R8、R9、R10、R11、及びR12は、独立して、H、ハロゲン、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むアルコキシ基、1個から約10個の炭素原子を含むハロアルキル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、及び1個から約10個の炭素原子を含むハロアルコキシ基からなる群から選択され、
R8、R9、R10、R11、及びR12のうちの少なくとも1つはOHであり、
R10がOHであるとき、R8、R9、R10、R11、及びR12のうちの少なくとも1つは水素でない。

0024

本明細書において更に考察するように、本開示の化合物はNR4A1リガンドである。その関連で、幾つかの実施形態では、アンタゴニストリガンドは、受容体の構成的機能及びその刺激力をブロックし、同種リガンドをNR4A1タンパク質に結合させ、NR4A1依存性遺伝子を活性化する。

0025

一価化学部分(例えば、アルキルアリール等)と呼ばれる化学部分はまた、当業者に理解される構造的に許容し得る多価部分包含する。例えば、「アルキル」部分は、一般に、一価基(例えば、CH3CH2-)と呼ばれるが、適当な状況において、「アルキル」部分は、二価基(例えば、「アルキレン」基と同等の-CH2CH2-)と呼ぶこともできる。同様に、二価部分が必要とされる状況下、当業者は、用語「アリール」が、対応する二価アリーレン基と呼ばれることを理解するであろう。

0026

本明細書で使用される用語は、前後にハイフン「-」又はイコール「=」に付けて、指名された置換基間の結合の結合次数を示してよく、該用語は親部分であり、ハイフンは単結合を示し、イコールは二重結合を示す。ハイフン又はイコールがない場合、単結合は置換基とその親部分との間に形成され、更に、記号に別段の指定がない限り、置換基は「左から右」に読むことが意図される。例えば、C1〜C6アルコキシカルボニルオキシ及び-OC(O)C1〜C6アルキルは、同じ官能性を示し、同様にアリールアルキル及びアルキルアリールは、同じ官能性を示す。

0027

すべての原子は、結合形成のための原子価正規数を有すると理解されている(例えば、原子の酸化状態に応じて、炭素では4、Nでは3、Oでは2、Sでは2、4又は6)。時には、部分は、例えば(A)aBとして規定することができ、ここでaは0又は1である。このような場合、aが0のとき、部分はBであり、aが1のとき、部分はABである。

0028

置換基が、同じ種類の基又は原子の数が異なり得る場合(例えば、アルキル基は、C1、C2、C3等であり得る)、反復原子又は基の数は、範囲並びに任意の及び全ての部分範囲内の各数及び全数を含む範囲(例えば、C1〜C6アルキル)によって表すことができる。例えば、C1〜C3アルキルは、C1、C2、C3、C1〜2、C1〜3、及びC2〜3アルキルを含む。

0029

用語「アルキル」は、本明細書で用いる場合、別段の指定がない限り、1〜10個の炭素原子を含む直鎖又は分枝鎖炭化水素を意味する。アルキルの代表例としては、これらに限定されないが、メチルエチル、n-プロピルイソプロピルn-ブチル、sec-ブチルイソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチルネオペンチルn-ヘキシル、3-メチルヘキシル、2,2-ジメチルペンチル、2,3-ジメチルペンチル、n-ヘプチルn-オクチル、n-ノニル、及びn-デシルが挙げられる。「アルキル」基が、2つの他の部分の間の連結基であるときも、直鎖又は分枝鎖であってもよく、例としては、これらに限定されないが、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CHC(CH3)-、-CH2CH(CH2CH3) CH2-が挙げられる。

0030

用語「シクロアルキル」は、本明細書で用いる場合、単環式又は二環式シクロアルキル環系を意味する。単環式環系は、3〜8個の炭素原子を含む環状炭化水素基であり、該基は、飽和であっても不飽和であってもよいが、芳香族ではない。特定の実施形態において、シクロアルキル基は、完全に飽和されている。単環式シクロアルキルの例としては、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチルシクロペンテニルシクロヘキシルシクロヘキセニルシクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられる。二環式シクロアルキル環系は、架橋単環又は縮合二環である。架橋単環は、単環式シクロアルキル環を含み、単環の2個の非隣接炭素原子は、1〜3個の追加の炭素原子間アルキレン架橋によって連結される(すなわち、-(CH2)w-型(式中、wは1、2又は3である)の架橋基)。

0031

アルコキシ」は、酸素原子を通して親分子部分に付いた、本明細書で規定されるようなアルキル基を指す。アルコキシの代表例としては、これらに限定されないが、メトキシエトキシプロポキシ、2-プロポキシ、ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、及びヘキシルオキシが挙げられる。

0032

用語「アリール」は、本明細書で用いる場合、フェニル(すなわち、単環式アリール)、又は少なくとも1つのフェニル環を含む二環式環系若しくは芳香族二環式環系中に炭素原子のみ含む芳香族二環を意味する。二環式アリールは、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、又は単環式ヘテロシクリルと融合したアズレニルナフチル、又はフェニルであってもよい。二環式アリールは、二環式系のフェニル部分内に含まれる任意の炭素原子、又はナフチル若しくはアズレニル環の任意の炭素原子を通して親分子部分に結合する。縮合単環式シクロアルキル又は二環式アリールの単環式ヘテロシクリル部分は、任意選択により、1つ又は2つのオキソ及び/又はこの基で置換される。

0033

「ハロゲン」は、クロロ、ブロモフルオロ又はヨード原子基を指す。用語「ハロゲン」はまた、「ハロ」又は「ハロゲン化合物」も企図する。

0034

用語「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」及び「ハロアルコキシ」は、場合によって、1個又は複数個ハロゲン原子で置換された、アルキル基、アルケニル基又はアルコキシ基を指す。

0035

用語「ニトロ」は、本明細書で用いる場合、-NO2基を意味する。

0036

用語「置換」は、本明細書で用いる場合、指定部分水素基が、特定の置換基の基で置き換えられるが、但し、置換が、安定性又は化学的に実現可能な化合物をもたらすことを意味する。用語「置換可能な」は、指定原子に関連して使用される場合、原子に結合しているのは水素基であり、この水素基が、好適な置換基の基で置き換えることが可能であることを意味する。

0037

2-ヒドロキシリガンド
幾つかの実施形態において、R8はOHである。特定の場合には、このようなリガンドは、中心のフェニル基OH基の置換に起因して、本明細書中、「2-ヒドロキシ」及び/又は「2-OH」と称する。特定の該実施形態において、R9、R10、R11、及びR12は、それぞれHである。特定の他の実施形態において、R9、R10、R11、及びR12は、独立して、ハロゲン、CH3、OCCl3、CF3、t-ブチル、OCH3、OH、C6H5、及びCNからなる群から選択される。一実施形態において、R10はOCH3である。一実施形態において、R11は、CH3、OCH3、及びCF3からなる群から選択される。一実施形態において、R9及びR11はBrである。

0038

一実施形態において、本開示の組成物は、以下の構造:

0039

0040

及びこれらの塩の1つを有する。

0041

3-ヒドロキシリガンド
幾つかの実施形態において、R9はOHである。特定の場合には、このようなリガンドは、中心のフェニル基のOH基の置換に起因して、本明細書中、「3-ヒドロキシ」及び/又は「3-OH」と称する。特定の該実施形態において、R8、R10、R11、及びR12は、それぞれHである。特定の他の実施形態において、R8、R10、R11、及びR12は、独立して、ハロゲン、CH3、OCCl3、CF3、t-ブチル、OCH3、OH、C6H5、及びCNからなる群から選択される。特定の実施形態において、R8はハロゲンである。

0042

一実施形態において、本開示の組成物は、以下の構造:

0043

0044

及びこれらの塩の1つを有する。

0045

4-ヒドロキシリガンド
幾つかの実施形態において、R10はOHである。特定の場合には、このようなリガンドは、中心のフェニル基のOH基の置換に起因して、本明細書中、「4-ヒドロキシ」及び/又は「4-OH」と称する。特定の該実施形態において、R8、R9、R11、及びR12は、独立して、ハロゲン、CH3、OCCl3、CF3、t-ブチル、OCH3、OH、C6H5、及びCNからなる群から選択される。特定の他の実施形態において、R9はハロゲンであり、R11はH、ハロゲン、及びOCH3からなる群から選択される。

0046

一実施形態において、本開示の組成物は、以下の構造:

0047

0048

及びこれらの塩の1つを有する。

0049

本開示のC-DIM化合物は、インドール又は置換インドールによる置換ベンズアルデヒドの縮合によって調製することができる。化合物は、2部のインドール又は置換インドールを、希釈酢酸中、1部のベンズアルデヒド又は置換ベンズアルデヒドと共に、80〜90℃で24〜48時間インキュベートすることによって合成することができる。濾過によって固形物回収し、ベンゼン又はベンゼン/ヘキサンから結晶化して、収率70〜90%のC-DIMを得る。単一インドール出発物質の使用は、対称生成物をもたらすが、2種の異なるインドール出発物質の使用は、非対称生成物をもたらす。

0050

代表的なC-DIM化合物の調製及び特性評価は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,232,843号に記載されている。

0051

医薬組成物
特定の態様において、本開示は、治療有効量の本開示の化合物を、薬学的に許容される担体並びに任意選択の他の治療及び/又は予防成分と共に含む医薬組成物を提供する。

0052

用語「治療有効量」は、本明細書で用いる場合、特定の障害、状態又は疾患を治療する、例えばその症状の1つ又は複数を改善、軽減、緩和、及び/又は遅延するのに十分な化合物又は組成物の量を指す。癌又は他の不要な細胞増殖に関して、有効量は、腫瘍の増殖率縮小及び/又は低減する(腫瘍増殖を抑制する)ように腫瘍に働くのに十分な量を含む。幾つかの実施形態において、有効量は、遅延を起こすのに十分な量である。幾つかの実施形態において、有効量は、発症及び/又は再発を防止するのに十分な量である。有効量は、1回又は複数回の投与において投与可能である。

0053

治療上の使用のための「薬学的に許容される担体」は、製薬業界において公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18編(Easton, Pa.: Mack Publishing Company、1990)に記載されている。例えば、生理的pHの無菌生理食塩水及びリン酸緩衝生理食塩水を使用することができる。保存料、安定剤、染料及び更には香味剤を医薬組成物に加えてもよい。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルティ酸(sortie acid)及びp-ヒドロキシ安息香酸エステルを保存料として添加してもよい。加えて、酸化防止剤及び懸濁化剤を使用することもできる。

0054

非流動性配合物の好適な賦形剤も、当業者に公知である。薬学的に許容される賦形剤及び塩の徹底的な議論が、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18編(Easton, Pa.: Mack Publishing Company、1990)で参照できる。

0055

加えて、湿潤剤又は乳化剤生物学的緩衝物質界面活性剤等の補助物質が、このようなビヒクル中に存在していてもよい。生物学的緩衝液は、薬理学的に許容され、所望のpH、すなわち生理的に許容される範囲内のpHを有する配合物をもたらす任意の溶液であってもよい。緩衝液の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水ハンク緩衝生理食塩水等が挙げられる。

0056

意図する投与方法に応じて、医薬組成物は、固体半固体又は液体剤形の形態、例えば、錠剤坐薬丸剤カプセル剤粉末液体、懸濁液、クリーム軟膏ローション等、好ましくは厳密な投与量の単回投与に適した単位剤形とすることができる。組成物は、有効量の選択薬物を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含み、加えて、他の薬剤補助剤希釈剤緩衝剤等を含むことができる。

0057

本開示は、異性体、異性体のラセミ若しくは非ラセミ合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を含む本開示の化合物を、1種又は複数種の薬学的に許容される担体、並びに任意選択の他の治療及び/又は予防成分と共に含む医薬組成物を含む。

0058

一般に、本開示の化合物は、認められた投与方法のいずれかによって治療に有効な量で投与される。好適な投与量の範囲は、治療する疾患の重篤度、対象の年齢及び相対的健康状態、使用する化合物の効能、投与の経路及び形態、投与対象への兆候、並びに関与する医師嗜好及び経験等の多数の要素によって決まる。該疾患の治療の当業者は、過度実験をすることなく、個人的知識及び本出願の開示に頼って、所与の疾患に対する治療に有効な量の本開示の化合物を見定めることができる。

0059

したがって、本開示の化合物は、経口(口腔及び下を含む)、直腸経鼻局所、経肺、内若しくは非経口(筋内、動脈内、鞘内、皮下及び静脈内を含む)投与に適したもの又は吸入若しくは吹送による投与に適した形態のものを含めた医薬配合物として投与することができる。好ましい投与方法は、苦痛度合いに応じて調整ができる便利な1日用法を使用した静脈内又は経口である。

0060

固体組成物では、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬品等級マンニトールラクトースデンプンステアリン酸マグネシウムナトリウムサッカリンタルクセルロース、グルコース、スクロース炭酸マグネシウム等が挙げられる。液体の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、本明細書に記載の活性化合物及び任意選択の補助薬を、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロースグリセロールエタノール等の賦形剤中に溶解、分散等し、それによって溶液又は懸濁液を形成することによって調製することができる。所望に応じて、投与する医薬組成物は、少量の非毒性補助物質(湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムソルビタンモノラウレートトリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレイン酸等)も含有することができる。このような剤形の実際の調製方法は、当業者に公知であり、又は当業者には明らかであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(上記)を参照されたい。

0061

更に別の実施形態において、ポリカチオン(キトサン及びその第4級アンモニウム誘導体ポリ-L-アルギニンアミノ化ゼラチン)、ポリアニオン(N-カルボキシメチルキトサン、ポリアクリル酸)、並びにチオレートポリマー(カルボキシメチルセルロース-システインポリカルボフィル-システイン、キトサン-チオブチルアミジン、キトサン-チオグリコール酸、キトサン-グルタチオン抱合体)等のポリマーを含めた透過促進剤の賦形剤が使用される。

0062

経口投与では、組成物は、一般に、錠剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤の形態をとる、又は水性若しくは非水性溶液、懸濁液若しくはシロップであってもよい。錠剤及びカプセル剤は、好ましい経口投与の形態である。経口使用のための錠剤及びカプセル剤は、1種又は複数種の一般に使用される担体(ラクトース及びコーンスターチ等)を含むことができる。ステアリン酸マグネシウム等の平滑剤も、典型的には添加される。典型的には、本開示の化合物は、経口用の非毒性の薬学的に許容される不活性担体(ラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール等)と組み合わせることができる。その上、所望又は必要の場合、好適なバインダー潤滑剤、崩壊剤、及び着色剤も混合物に取り入れることができる。好適なバインダーとしては、デンプン、ゼラチン、天然糖(グルコース又はβ-ラクトース等)、コーンシロップ、天然及び合成ガム(アカシアトラガカントアルギン酸ナトリウム等)、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールワックス等が挙げられる。これらの剤形に使用される潤滑剤には、オレイン酸ナトリウムステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、これらに限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天ベントナイトキサンタンガム等が挙げられる。

0063

したがって、例えば、カプセル剤は、従来の手順によって調製することができ、用量単位を100mgの本開示の化合物、100mgのセルロース及び10mgのステアリン酸マグネシウムとする。多量の単位のカプセル剤も、標準の2つの固いゼラチンカプセル剤を100mgの粉末活性成分、150mgのラクトース、50mgのセルロース及び10mgのステアリン酸マグネシウムで満たすことによって調整することができる。或いは、錠剤を従来の手順によって調製することができ、用量単位を100mgの本開示の化合物、150mgのラクトース、50mgのセルロース及び10mgのステアリン酸マグネシウムとする。多量の錠剤も、用量単位が100mgの本開示の化合物になるように従来の手順によって調製することができ、他の成分は、0.2mgのコロイド状二酸化ケイ素、5mgのステアリン酸マグネシウム、250mgの微結晶性セルロース、10mgのデンプン及び100mgのラクトースとすることができる。適当なコーティングを施して、美味性を高める又は吸収を遅延することができる。

0064

液体懸濁液を使用する場合、活性剤を任意の経口用の非毒性の薬学的に許容される不活性担体(例えば、エタノール、グリセロール、水等)、並びに乳化剤及び懸濁化剤と組み合わせることができる。所望に応じて、香味剤、着色剤及び/又は甘味剤も添加してよい。本明細書における経口製剤に取り込むための他の任意選択の成分としては、これらに限定されないが、保存料、懸濁化剤、増粘剤等が挙げられる。

0065

非経口製剤は、液体の溶液若しくは懸濁液、注射前に液体中の可溶化若しくは懸濁化のために沈下可能な固体形態、又はエマルションのいずれかの従来の形態で調製することができる。好ましくは、無菌注射懸濁液は、好適な担体、分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、当該技術分野において公知の技術に従って製剤化される。無菌注射製剤はまた、非毒性の非経口で許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射液又は懸濁液であってもよい。許容されるビヒクル及び溶媒の中でも、水、リンゲル液及び等張食塩液を用いることができる。加えて、無菌の固定油、脂肪エステル又はポリオールは、溶媒又は懸濁化媒体として従来から用いられる。加えて、非経口投与は、一定レベルの投与量を維持するように、遅効性又は徐放性系の使用を要し得る。

0066

非経口投与は、関節内、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、及び皮下経路を含み、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び対象の受容者の血液で製剤を等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性無菌等張注射液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存料を含むことができる水性及び非水性無菌懸濁液を含む。特定の非経口経路を介した投与は、本開示の製剤を、無菌注射器又は持続注入システム等の一部の他の機械装置によって推進されるニードル又はカテーテルを通じて患者の体内に導入することを要し得る。本開示が提供する製剤は、非経口投与用の注射器、注入器ポンプ、又は当該技術分野において認められている他の任意の装置を使用して投与することができる。

0067

好ましくは、無菌注射懸濁液は、好適な担体、分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、当該技術分野において公知の技術に従って製剤化される。無菌注射製剤はまた、非毒性の非経口で許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射液又は懸濁液であってもよい。許容されるビヒクル及び溶媒の中でも、水、リンガー液及び等張食塩液を用いることができる。加えて、無菌の固定油、脂肪エステル又はポリオールは、溶媒又は懸濁化媒体として従来から用いられる。加えて、非経口投与は、一定レベルの投与量を維持するように、遅効性又は徐放性系の使用を要し得る。

0068

非経口投与のための本開示による調製は、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、又はエマルションを含む。非水性溶媒又はビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油及びトウモロコシ油等の植物油、ゼラチン、並びにオレイン酸エチル等の有機エステル注射剤がある。このような剤形は、保存料、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤等の補助剤も含有することができる。これらは、例えば、細菌保持フィルター(bacteria retaining filter)に通す濾過によって、滅菌剤を組成物中に取り入れることによって、組成物を照射することによって、又は組成物を加熱することによって、滅菌することができる。これらはまた、使用直前に、滅菌水、又は他の一部の注射可能な無菌媒体を使用して製造することもできる。

0069

製剤は、任意選択により等張剤を含有することができる。製剤は、好ましくは、等張剤を含有し、グリセリンが最も好ましい等張剤である。グリセリン(使用する場合)の濃度は、当該技術分野において公知の範囲内であり、例えば、約1mg/mLから約20mg/mLである。

0070

非経口製剤のpHは、リン酸塩酢酸塩、TRIS又はL-アルギニン等の緩衝剤によって制御することができる。緩衝剤の濃度は、好ましくは、pHを標的のpH±0.2pH単位で維持するように保管中のpHを緩衝させるのに十分な濃度である。好ましいpHは、室温で測定した場合、約7から約8である。

0071

Tween 20(登録商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート)、Tween 40(登録商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート)、Tween 80(登録商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレート)、Pluronic F68(登録商標)(ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー)、及びPEG(ポリエチレングルコール)のような薬学的に許容される可溶化剤等の他の添加剤を任意選択により製剤に添加してもよく、製剤がプラスチック材料と接触する場合に有用であり得る。加えて、非経口製剤は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベンクロロブタノールフェノールソルビン酸チメロサール等を含有することができる。

0072

無菌注射液は、適当な溶媒中に、必要に応じて種々の上記他成分と共に、必要量の本開示の化合物の1つ又は複数を取り入れ、後続して濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散体は、種々の無菌活性成分を、塩基性分散媒体及び必要な他の上記成分を含有する無菌ビヒクル中に取り入れることによって調製される。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、活性成分粉末とその前述の滅菌濾過液由来の追加の所望の任意成分とを生成する。したがって、例えば、注射による投与に適した非経口組成物は、1.5質量%の活性成分を10体積%のプロピレングリコール及び水中で攪拌することによって調製される。溶液を、塩化ナトリウムにより等張性にし、滅菌する。

0073

或いは、本開示の医薬組成物は、直腸投与のために坐薬の形態で投与することができる。これらは、薬剤を、室温で固体であるが、直腸温で液体であり、したがって直腸中で溶解し、薬物を放出する、好適な刺激性のない賦形剤と混合することによって調製することができる。このような材料には、ココアバタービーズワックス及びポリエチレングルコールが挙げられる。

0074

本開示の医薬組成物は、エアロゾル又は吸入によっても投与できる。このような組成物は、医薬製剤の当該技術分野において公知の技術に従って調製され、ベンジルアルコール若しくは他の好適な保存料、バイオアベイラビリティ強化するための吸収促進剤フルオロカーボン若しくは窒素等の噴霧剤、及び/又は他の従来の可溶化剤若しくは分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製することができる。

0075

局所薬送達に好ましい製剤は、軟膏及びクリームである。軟膏は、半固体の調合物であり、典型的には、ペトロラタム又は他の石油誘導体をベースとする。選択活性剤を含むクリームは、当該技術分野において公知であるように、水中油型又は油中水型のいずれかの粘稠液又は半固体エマルションである。クリーム基剤は、水洗性であり、油性相、乳化剤及び水性相を含む。油性相は、場合によっては「内」相とも呼ばれ、一般にペトロラタム及びセチル又はステアリルアルコール等の脂肪アルコールで構成され、水性相は、通常、必ずしもそうとは限らないが、体積が油性相を超え、一般に保湿剤を含む。クリーム製剤中の乳化剤は、一般に、非イオン性アニオン性カチオン性又は両性の界面活性剤である。使用する特定の軟膏又はクリーム基剤IDは、当業者が高く評価するような、最適な薬物送達をもたらすものである。他の担体又はビヒクルと同様に、軟膏基剤は、不活性、安定性、非刺激性及び非感作であるべきである。

0076

口腔投与用の製剤としては、錠剤、トローチ剤ゲル等が挙げられる。或いは、口腔投与は、当業者に公知の経粘膜送達ステムを使用して達成することができる。本開示の化合物はまた、従来の経皮薬物送達システム、すなわち、薬剤が典型的に、体表面に貼られる薬物送達デバイスとして機能する積層構造中に含まれる、経皮パッチ」を使用して皮膚又は粘膜組織を通じて送達することもできる。このような構造中で、薬物組成物は、典型的に、上部のバッキング層の下にある層又は「リザーバー」中に含まれる。積層デバイスは、単一リザーバーを含むことができ、又は複数のリザーバーを含むこともできる。一実施形態において、リザーバーは、薬物送達中にシステムを皮膚に貼る働きをする薬学的に許容されるコンタクト接着材料ポリマーマトリクスを含む。好適な皮膚コンタクト接着材料の例としては、これらに限定されないが、ポリエチレン、ポリシロキサンポリイソブチレンポリアクリレートポリウレタン等が挙げられる。或いは、薬物含有リザーバー及び皮膚コンタクト接着剤は、独立した別個の層として存在し、この場合、上記のポリマーマトリクス又は液体若しくはゲルリザーバーのいずれかであってもよいが、或いは別の形態をとることもできるリザーバーの下に接着剤が存在する。これらの積層物の中のバッキング層は、デバイス上表面として働き、積層構造の一次構造要素として機能し、デバイスにかなりの柔軟性を与える。バッキング層に選ばれた材料は、活性剤及び存在する他の任意材料に対して実質的に不浸透性であるべきである。

0077

本開示の化合物は、特に気道へのエアロゾル投与(鼻腔内投与を含む)用に製剤化することができる。化合物は、一般に、例えば約5ミクロン以下の小粒径を有する。このような粒径は、当該技術分野において公知の手段、例えば微細化によって得ることができる。活性成分を、クロロフルオロカーボン(CFC)、例えばジクロロジフルオロメタントリクロロフルオロメタン、若しくはジクロロテトラフルオロエタン二酸化炭素、又は他の好適なガス等の好適な噴霧剤と共に、加圧パック中に入れる。エアロゾルはまた、都合よく、レシチン等の界面活性剤も含有する。用量は、定量バルブによって制御することができる。或いは、活性成分は、乾燥粉末の形態、例えばラクトース、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のデンプン誘導体、及びポリビニルピロリジン(PVP)等の好適な粉末基剤中の化合物の粉末混合物で供給することができる。粉末担体は、鼻腔内にゲルを形成する。粉末組成物は、単位用量の形態、例えばカプセル若しくは(例えばゼラチンの)カートリッジ又はブリスターパック(このブリスターパックから、吸入器によって粉末を投与することができる)で存在することができる。

0078

薬学的に又は治療的に有効な量の組成物が、対象に送達される。正確な有効量は、対象によって様々であり、種、年齢、対象のサイズ及び健康状態、治療する状態の性質及び度合い、治療を行う医師の助言、並びに投与用に選択される治療又は治療の組み合わせによって決まってくる。したがって、所与の状況に対する有効量は、日常実験によって決定することができる。本開示の目的のため、一般に、治療量は、少なくとも1回の用量中、約0.01mg/kg(体重)から約250mg/kg、より好ましくは約0.1mg/kgから約10mg/kgの範囲である。より大型の哺乳動物では、指示される1日投与量は、1日当たり1回又は複数回で、約1mgから300mg、より好ましくは約10mgから200mgの範囲であってもよい。対象に、問題となっている障害の兆候、症状、若しくは病因を低減及び/若しくは緩和するために、又は他の任意の望ましい改変を生物系にもたらすために必要な用量を可能な限り多く投与することができる。所望に応じて、活性成分の持続又は制御放出投与に適した腸溶コーティングを有する製剤を調製することができる。

0079

医薬品は、好ましくは、単位剤形である。このような剤形で、製剤は、適当な量の活性成分を含む単位用量に細分される。単位剤形は、包装された製剤、離散量の製剤を含むパッケージ(パック入り錠剤、カプセル、及びバイアル又はアンプル中の粉末等)であってもよい。また、単位剤形は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、トローチ剤自体であってもよいが、適当数の包装形態のこれらのいずれかであってもよい。

0080

NR4A1活性を調節する方法
別の態様において、本開示は、細胞中のNR4A1活性を調節する方法であって、本明細書に記載の化合物又は医薬組成物を細胞に投与することを含む方法を提供する。

0081

幾つかの実施形態において、NR4A1活性の調節は、本明細書の別箇所に記載の化合物のNR4A1タンパク質への結合を含む。幾つかの実施形態において、化合物は、拮抗活性を有し、すなわち、化合物は、受容体(例えば、アンタゴニストリガンド)の同種機能刺激する効果を低減又は削除する。幾つかの実施形態において、アンタゴニストリガンドは、受容体の構成機能及びその刺激力、同種リガンドをNR4A1タンパク質に結合する能力、及びNR4A1依存性遺伝子を活性化する能力をブロックする。幾つかの実施形態において、NR4A1リガンドは、組織応答、又は遺伝子特異的なアゴニストであってもよい。

0082

用語「アンタゴニスト」は、NR4A1受容体と結合して、分子及び細胞活動を低減又は阻害することができる化合物を指す。アンタゴニストは、受容体に直接結合するリガンドであってもよい。或いは、アンタゴニストは、例えば、(a)受容体に直接結合する別の分子若しくはタンパク質と複合体を形成することによって受容体と間接的に結合することができるか、又は(b)そうでなければ、別の化合物の修飾をもたらし、そのもう一方の化合物が直接NR4A1受容体に結合するようにする。

0083

用語「アゴニスト」は、NR4A1受容体と結合して、分子及び細胞活動を生成又は増加することができる化合物を指す。アゴニストは、受容体に直接結合するリガンドであってもよい。或いは、アゴニストは、例えば、(a)受容体に直接結合する別の分子若しくはタンパク質と複合体を形成することによって受容体と間接的に結合することができるか、又は(b)そうでなければ、別の化合物の修飾をもたらし、そのもう一方の化合物が直接NR4A1受容体に結合するようにする。

0084

用語「活性化」及びその変態形は、分子及び細胞活動の測定可能な増加を指す。

0085

一実施形態において、細胞は癌細胞である。

0086

一実施形態において、細胞は、インビトロで化合物又は医薬組成物と接触する。一実施形態において、細胞は、有効量の化合物又は医薬組成物を対象に投与することによって、インビボで化合物又は医薬組成物と接触する。

0087

一実施形態において、NR4A1活性の調節は、β1-インテグリン、TXNDC5、スルビビン、EFGR、PAX3-FOX01A、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の下方制御を誘導する。一実施形態において、NR4A1活性の調節は、SERPINB5、GADD45α、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の上方制御を誘導する。

0088

一実施形態において、化合物は、次式:

0089

0090

又はその塩を有し、
式中、
R1、R2、R1'、及びR2'は、それぞれ独立して、水素、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、及び1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基からなる群から選択され、
R3、R4、R5、R6、R3'、R4'、R5'、及びR6'は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むアルコキシ基、及びニトロ基からなる群から選択され、
R7は、水素、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むシクロアルキル基、及びアリール基からなる群から選択され、
R8、R9、R10、R11、及びR12は、独立して、H、ハロゲン、1個から約10個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含む分枝状アルキル基、1個から約10個の炭素原子を含むアルコキシ基、1個から約10個の炭素原子を含むハロアルキル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、及び1個から約10個の炭素原子を含むハロアルコキシ基からなる群から選択され、
R8、R9、R10、R11、及びR12のうちの少なくとも1つはOHであり、
R10がOHであるとき、R8、R9、R11、及びR12のうちの少なくとも1つは水素でない。

0091

4-ヒドロキシリガンド
一実施形態において、R10はOHである。特定の該実施形態において、R8、R9、R11、及びR12は、独立して、ハロゲン、CH3、OCCl3、CF3、t-ブチル、OCH3、OH、C6H5、及びCNからなる群から選択される。特定の他の実施形態において、R9はハロゲンであり、R11はH、ハロゲン、及びOCH3からなる群から選択される。

0092

一実施形態において、本開示の組成物は、以下の構造:

0093

0094

及びこれらの塩のうちの1つを有する。

0095

2-ヒドロキシリガンド
一実施形態において、R9はOHである。特定の該実施形態において、R8、R10、R11、及びR12は、それぞれHである。特定の他の実施形態において、R8、R10、R11、及びR12は、独立して、ハロゲン、CH3、OCCl3、CF3、t-ブチル、OCH3、OH、C6H5、及びCNからなる群から選択される。特定の実施形態において、R8はハロゲンである。

0096

一実施形態において、本開示の組成物は、以下の構造:

0097

0098

及びこれらの塩のうちの1つを有する。

0099

3-ヒドロキシリガンド
一実施形態において、R8はOHである。特定の該実施形態において、R9、R10、R11、及びR12は、それぞれHである。特定の他の実施形態において、R9、R10、R11、及びR12は、独立して、ハロゲン、CH3、OCCl3、CF3、t-ブチル、OCH3、OH、C6H5、及びCNからなる群から選択される。一実施形態において、R10はOCH3である。一実施形態において、R11はCH3、OCH3、及びCF3からなる群から選択される。一実施形態において、R9及びR11はBrである。

0100

一実施形態において、本開示の組成物は、以下の構造:

0101

0102

及びこれらの塩のうちの1つを有する。

0103

疾患又は状態を治療する方法
別の態様において、本開示は、NR4A1活性の調節によって治療可能な個人における疾患又は状態を治療する方法であって、治療に有効な量の本明細書に記載の化合物又は医薬組成物を個人に投与することを含む方法を提供する。

0104

当業者は、送達経路、化合物の代謝、及び他の薬物動態パラメーター(分布容積量、クリアランス、対象の年齢等)を考慮して、組成物を投与するために最も有効な用量及び時間を把握することができる。例えば、NR4A1アンタゴニストは、局所投与、経口投与、静脈注射腹腔内注射筋肉注射、鼻腔内投与、経皮投与、直腸投与による、又は有効な量の活性剤を、治療する組織若しくは部位に送達する任意の手段によるような任意の公知の方法で投与することができる。好適な投与量は、所望の終点を実現するものである。異なる障害の治療には、異なる投与量が必要となり得ることを理解されたい。薬剤の有効量とは、例えば、新生細胞計数、増殖、サイズ、細胞遊走又は細胞浸潤の停止又は有意な減少を引き起こす量である。

0105

組成物は、医薬担体及び/又は希釈剤と共に投与することができる。薬剤はまた、例えば、他の化学療法薬又は免疫促進薬又は癌の治療におけるような治療薬と関連する他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。本発明において有用な医薬担体又は希釈剤の例としては、好適な水溶性有機担体を含む任意の生理的緩衝媒体(すなわちpHが約7.0から7.4)が挙げられる。好適な水溶性有機担体には、これらに限定されないが、トウモロコシ油、ジメチルスルホキシドゼラチンカプセル等が挙げられる。

0106

個人は、哺乳類鳥類爬虫類、又は魚類等の任意の動物であってもよい。例示的な哺乳動物のカテゴリーには、げっ歯類霊長類イヌ科ネコ科有蹄動物ウサギ目の動物等が含まれる。例えば、個人は、ヒト、サル類人猿若しくは他の霊長類、ネズミラット若しくは他のげっ歯類、イヌネコブタウマウシ、又はウサギ等であってもよい。

0107

本明細書で用いる場合、用語「治療」は、障害又は状態へ、改良、治癒、又は予防効果を与えることを意味する。幾つかの実施形態において、治療は、(非治療又は他の治療と比べたときの)状態の漸増若しくは進行の防止、又は漸増若しくは進行の速度の遅延を含む。癌(以下で更に記載する)の趣旨において、治療は、細胞増殖若しくは細胞分裂率の遅延若しくは防止、細胞遊走の遅延若しくは防止、及び/又は細胞浸潤の遅延若しくは防止を含む。

0108

例示的な状態には、癌、糖尿病血栓症大腸炎クローン病炎症性腸疾患多発性硬化症関節リウマチ免疫抑制障害、関節炎喘息、卒中、再狭窄鼻炎、及び骨粗しょう症が挙げられる。例示的な癌には、膵臓環、腎臓癌、大腸癌、横紋筋肉腫、肺癌、及び乳癌が挙げられる。

0109

一実施形態において、疾患は癌である。一実施形態において、癌は、膵臓癌、乳癌、大腸癌、横紋筋肉腫、及び肺癌からなる群から選択される。

0110

一実施形態において、NR4A1活性の調節は、β1-インテグリン、TXNDC5、スルビビン、EFGR、PAX3-FOX01A、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の下方制御を誘導する。一実施形態において、NR4A1活性の調節は、SERPINB5、GADD45α、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の上方制御を誘導する。

0111

一実施形態において、疾患は糖尿病であり、NR4A1活性の調節は、個人におけるグルコース取り込みを誘導する。一実施形態において、NR4A1活性の調節は、GLUT-4及びRab4の上方制御並びにAMPKのリン酸化を誘導する。

0112

4-ヒドロキシ置換NR4A1リガンドと結合するNR4A1
以下は、NR4A1と結合する本開示の実施形態による化合物の説明である。

0113

4-ヒドロキシ化合物(C-DIM8)は、高親和性でNR4A1と結合し、幾つかの発癌促進NR4A1調節遺伝子/経路の発現を阻害する有効なNR4A1アンタゴニストだった。4-ヒドロキシ類似体は、マウス異種移植モデルにおいて比較的強力な腫瘍増殖阻害剤であるが、比較的短い血中半減期を有する。したがって、9つの置換4-ヒドロキシ類似体を合成して、置換基の一部はヒドロキシ基を強化するため、それらのNR4A1リガンドとしての相対的効力及びそれらの半減期を調べた。Panc1細胞中のGAL4-NR4A1及びGAL4-NR4A2の活性化/不活性化に与えるそれらの効果を決定した(図9及び図13を参照)。

0114

4-ヒドロキシ参照化合物によるGAL4-NR4A1トランス活性化の有意な阻害は、22.5μMでのみ観察され、15μMでは観察されなかった(急勾配用量反応曲線)。置換4-ヒドロキシ類似体を7.5μM及び15μMの濃度で試験し、3-フルオロ-4-ヒドロキシ類似体を除き、残りの8つの4-ヒドロキシ置換化合物は、NR4A1依存性トランス活性化の阻害剤として4-ヒドロキシ参照化合物より強力だった。図9を参照されたい。

0115

4-ヒドロキシ参照化合物及び9つの類似体の効果を、Rh30横紋筋肉腫細胞中の2つのNR4A1調節遺伝子産物、すなわちTXNDC5及びPAX3-FOX01Aの下方制御について比較した。図10Bを参照されたい。高用量20μMで、4-ヒドロキシ参照化合物は、両方の遺伝子産物の発現を50〜60%低減し、その一方で、9つ全ての類似体は、5μMの濃度で、両方の遺伝子産物の発現を80から95%超まで低減した。したがって、全ての類似体は、4-ヒドロキシ参照化合物より4倍超強力であり、したがって前途有望な新規の第二世代NR4A1リガンドを表す。また、結果は、NR4A1依存性トランス活性化アッセイが、NR4A1アンタゴニスト効力における違いを決定する上でNR4A1調節遺伝子産物より予測力が低いように見えることも示す。

0116

加えて、同じ化合物によるPanc1及びSKBR3細胞中のNR4A1調節遺伝子産物のC-DIM介在阻害を調べた。図10A及び図14及び図19を参照されたい。これらの結果は、Rh30細胞中で観察された結果と同様である。

0117

核内受容体に対するリガンドは、遺伝子発現の活性化及び抑制のいずれも行い、NR4A1は発癌促進性であるため、本発明者らは、NR4A1調節遺伝子のアンタゴニスト又は阻害剤としてのNR4A1リガンドに焦点を絞った。

0118

4-ブロモ参照化合物[すなわち、1,1-ビス(3'-インドリル)-1-(p-ブロモフェニル)メタン]と比較して、4-ヒドロキシ類似体のGAL4-NR4A2活性化は最小限であり、これらの化合物が、NR4A1特異性であるように見えることを実証した。例えば、図13を参照されたい。

0119

4-ヒドロキシリガンドの構造-活性相
以下は、本開示の実施形態による化合物の構造-活性相関の説明である。

0120

NR4A1は、代謝性疾患において主要プレーヤーであると考えられ、インビボ及びインビトロの両アッセイにおいて効力がある第二世代NR4A1リガンドを表すDIM-C-pPhOH(C-DIM8; NR4A1標準物質)の誘導体が特定された(本明細書において更に記載する)。

0121

図11A〜11Cは、Rh30細胞中のDIM-C-pPhOH及び6つの置換類似体によるインターロイキン-24(IL-24)、グアニン脱アミノ酵素(GDA)及びダブルコルチンドメイン含有2(DCDC2)mRNAの誘導についての完成した構造-活性相関研究をまとめている。誘導のEC50値は、構造依存性効力を明確に示し、これは、それらの有効性(すなわち、最大誘導能)も反映している。

0122

表面プラズモン共鳴によって測定された4-ヒドロキシリガンドと結合するNR4A1及びNR4A2
以下は、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用した、本開示の実施形態による化合物のNR4A1との結合の説明である。

0123

Biacore 3000システム(GE Healthcare社)上にて、25℃でSPR法を用いて結合実験を行った。精製NR4A1及びNR4A2 LBDタンパク質を、アミン結合法を用いて、CM5センサーチップ(GE)上に共有結合固定化した。或いは、より高価なHisタグ結合NTAセンサーチップ(GE)を使用して正確なタンパク質表面配向保証することができる。5又は10μMのDIM-C-pPhX類似体(式中、X=Br(#2)、X=OH(#8)、X=CN(#10)及びX=CO2Me(#14))を使用したリガンド注射後に、SPR応答曲線(センサーグラム)を生成した(図22参照)。両方のタンパク質ともが成功裏チップ上に固定化されたが、NR4A2は、試験緩衝液条件において凝集/オリゴマー形成するように見え、したがって緩衝イオン強度は更なる最適化を必要とする。DIM-C-pPhOH(X-DIM8)は、NR4A1と高親和性で結合し、DIM-C-pPhBr(C-DIM2)は、両方のタンパク質と粘着性の相互作用を示し、これはKd決定にとって問題である。

0124

4-ヒドロキシリガンドで処置した細胞のNR4A2依存性オステオポンチン遺伝子発現
本開示の実施形態による化合物によるオステオポンチン(OPN)の発現の誘導を示す。

0125

Panc1細胞を、2.5〜20μmの濃度(2.5μM刻みで増加していく)の4-F、4-Cl及び4-I置換基を含有するDIM-C-pPhX(ハロゲン置換)類似体で処置し、NR4A2依存性OPN遺伝子発現を、qPCR分析を用いて決定した。化合物の処置は、最初は内部制御として働くことが意図されたGAPDHの発現に影響した。しかしながら、mRNAレベルが決定され、同量のmRNAが各qPCR反応に使用された。OPNの誘導倍率を用いて用量応答曲線及びEC50値を決定することができる(図21)。特定の実施形態において、βアクチン及び18SリボソームRNA等の他のハウスキーピング遺伝子を、内部制御のために現在使用している。

0126

3-ヒドロキシ及び2-ヒドロキシリガンドと結合するNR4A1
以下は、本開示の実施形態による3-ヒドロキシ及び2-ヒドロキシ化合物によって結合するNR4A1の説明である。

0127

4-ヒドロキシ化合物(C-DIM8)は、NR4A1に高親和性で結合し、幾つかの発癌促進NR4A1調節遺伝子/経路の発現を阻害した有効なNR4A1アンタゴニストだった。上記で、4-ヒドロキシ化合物の類似体が、より強力なNR4A1リガンドの新世代を表すことを示す。

0128

本明細書に記載の結果は、特定の実施形態において、3-ヒドロキシ(3-OH)及び2-ヒドロキシ(2-OH)化合物が、NR4A1アンタゴニスト/アゴニストとして4-OH標準物質より強力であることを示す。

0129

トランス活性化の結果は、4-、3-及び2-ヒドロキシ化合物がすべて、GAL4-NR4A1とトランスフェクトしたPanc1細胞中でトランス活性化を低減し、15から22.5μM間で急勾配の用量応答曲線を有することを実証している。図8、図7及び図6を参照されたい。4-ブロモ標準NR4A2リガンドと比較して、3-及び2-ヒドロキシ異性体は、最小限のNR4A2活性を有していた。図13及び図15を参照されたい。

0130

図3は、2-及び3-ヒドロキシ化合物の両方が、Panc1及びSKBR3細胞中のβ1-インテグリン及びTXNDC5の下方制御において4-ヒドロキシ化合物より強力だったことを示す。β1-アクチン負荷対照も、高濃度の3-ヒドロキシ(SKBR細胞)及び2-ヒドロキシ(SKBR3及びPanc1細胞)化合物で低減したことに留意されたい。結果は、トランス活性化のデータと相関する。

0131

ウェスタンブロット分析は、これらの3-及び2-ヒドロキシCDIM化合物の、SERPINB5を誘導する効力(すなわち、2-OH/3-OH>4-OH)が、β1-インテグリン及びTXNDC5の下方制御で観察された結果と同様だったことを示す。例えば、図3及び図5を参照されたい。

0132

Rh30横紋筋肉腫細胞中のTXNDC5及びβ1-インテグリンの下方制御における2-、3-及び4-ヒドロキシ化合物の効力は、Panc1及びSKBR3細胞中で観察されたものと同様だった。図4を参照されたい。

0133

置換2-ヒドロキシ及び3-ヒドロキシリガンドのNR4A1結合及びトランス活性化
2-及び3-ヒドロキシC-DIM類似体で得られた結果は、特定の実施形態において、これらが、親4-ヒドロキシ参照標準物質より強力なNR4A1アンタゴニストだったことを実証した。したがって、幾つかの2-及び3-ヒドロキシDIMの置換類似体を合成し、トランス活性化アッセイにおけるそれらの活性を調べた。その上、2-ヒドロキシ類似体では、本発明者らは、それらの遺伝子誘導(SERPINB5及びGADD45α)(図17参照)及び抑制(β1-インテグリン及びTXNDC5)(図16参照)に与える機能的効果も調べた。

0134

10個の2-ヒドロキシ類似体のトランス活性化アッセイ及びNR4A1に与えるそれらの効果は、4-メトキシ、5-メチル及び5-メトキシ誘導体が、親2-ヒドロキシ化合物で観察されたものと同様の濃度でトランス活性化を低減したことを示した。図6を参照されたい。

0135

この同じ一連の置換2-ヒドロキシ類似体化合物の中で、特定の化合物(例えば、2-ブロモ、5-トリフルオロメチル及び3,5-ジブロモ)がNR4A2を活性化し、最大誘導応答は、4-ブロモDIM参照標準物質で観察されたものの33%超だった。図15を参照されたい。

0136

2-ヒドロキシDIM類似体の、Panc1及びSKBR3細胞中のNR4A1依存性低減(β1-インテグリン及びTXNDC5(図16参照))及びNR4A1依存性増加(SERPINB5及びGADD45α(図17参照))遺伝子産物発現に与える効果を調べ、結果を、2-ヒドロキシDIM化合物(非置換)で観察されたものと比較した。結果は、分析した置換2-ヒドロキシDIM化合物が、親化合物より有意に活性でなかったことと、これが、先の4-ヒドロキシDIM及び置換類似体での試験と対照的だったこととを示唆した。

0137

5つの置換3-ヒドロキシDIM類似体化合物の、NR4A1依存性トランス活性化に与える効果も、Panc1細胞中で調べた。2-クロロ及び2-ブロモ類似体は両方とも、非置換3-及び4-ヒドロキシDIM標準物質より強力だった(注記:5-ヒドロキシ類似体は、3-ヒドロキシ置換と同等である)。図7を参照されたい。

0138

4-ヒドロキシリガンドは、腫瘍抑制SERPINB5を活性化する
核内受容体に対するリガンドは、遺伝子発現の活性化及び抑制の両方を行い、これらの効果は細胞背景に特異的である。本発明者らの初期研究は、β1-インテグリン及びTXNDC5等の発癌促進遺伝子を下方制御するNR4A1アンタゴニストのC-DIMに集中していたが、C-DIMは、癌細胞中の腫瘍抑制遺伝子発現も誘導する。

0139

Panc1細胞中、20μMの4-ヒドロキシ陽性対照化合物(C-DIM8)及び4μMの置換類似体は、細胞浸潤及び転移を抑制する腫瘍抑制遺伝子であるSERPINB5(mapsin)を誘導した(図10A参照)。しかしながら、Panc1細胞中のこの応答では、二置換3,5-Br2及び3-Cl-5-メトキシ及び3-Cl類似体のみ、4-ヒドロキシC-DIM陽性対照より4倍超強力だった。

0140

SKBR3乳癌細胞中、20μMの4-ヒドロキシ陽性対照化合物は、SERPINB5を最小限しか誘導しなかったのに対し、SERPINB5の有意な誘導は、5μMの置換4-ヒドロキシ類似体で処置した細胞中で観察された。図14を参照されたい。この研究では、DMSO(対照)値は比較的高く、結果として4-ヒドロキシ化合物による誘導は少なく、それに対して、他の実験では、低い基礎SERPINB5レベルのために誘導が観察された。SKBR3及びPanc1細胞中での結果は、C-DIM類似体が、効力に多少の違いを有しながらもSERPINB5を誘導していることを実証し、これらの結果は、4-ヒドロキシ置換C-DIM類似体が、強力なNR4A1リガンドの第二世代を表すことを裏付けている。

0141

4-OHリガンドのインビトロ及びインビボアッセイ
以下は、インビボ及びインビトロ両方のアッセイにおける本開示の実施形態によるより活性のDIM-4-OH類似体3種の説明である。

0142

図12A〜12Cは、対照(灰色の線)に対する同所モデル(黒色の線)の三重陰性MDA-MD-231細胞を保有する無胸腺ヌードマウスにおける3つのDIMC-pPh-OHの類似体によるインビボ腫瘍増殖阻害をまとめている。DIM-C-pPh-OHの3-クロロ、3,5-ジブロモ-、及び3-クロロ-5-メトキシ類似体は、10mg/kg/日の用量で腫瘍増殖を阻害し、腫瘍増殖阻害のED50値が、低いmg/kg/日範囲又は高いmg/kg/日範囲になるかは明らかだった。図12A〜図12Cを参照されたい。新規の置換類似体が、40〜50mg/kg/日の用量で腫瘍増殖を部分的にしか阻害しなかったDIM-C-pPh-OHより有意に強力なNR4A1リガンドの第二世代を表すことは明らかである。

0143

対照及び処置したマウス由来の腫瘍溶解物を、インビトロ試験で先に特性評価したNR4A1依存性応答に与えるそれらの効果について分析した。個々の腫瘍由来の溶解物をウェスタンブロットによって分析し、3つの類似体は、(a)リン酸化mTOR、p70S6K、pS6RP、及びp-EBP1を含めたmTOP経路を減少し(図18参照)、(b)スルビビン、EGFR、TXNDC5、及びβ1-インテグリンを含めたNR4A1/Sp調節因子を低減し(図19参照)、(c)NR4A1調節GAD045a及びSERPINB5遺伝子産物の発現を誘導し、また、アポトーシスのマーカーであるPARP切断も誘導した(図19参照)。

0144

インビボ試験で使用したDIM-C-pPhOH(DIM-4-OH)及びより強力な2つのDIM-C-pPhOH類似体(3-クロロ-及び3,5-ビブロモ-)による3つのNR4A1応答遺伝子の構造依存性誘導を、Rh30細胞中で調べた。3つのNR4A1誘導遺伝子、すなわちIL-24、GDA、及びDCDC2は、RNAseqによって特定した。予備試験は、12時間後に、C-DIM NR4A1リガンドによる最大mRNA誘導を示した。結果(図11A〜図11C)は、遺伝子発現の誘導因子としての3つのNR4A1リガンドの構造依存性効力の違いを示す。EC50値に基づき、3-クロロ-又は3,5-ジブロモ類似体は、DIM-C-pPhOHより最大10倍超強力だったが、これらの効力の違いは、複合的であり、遺伝子依存性だった。

0145

インビトロSAR確証として、図23は、3つの第二世代C-DIM/NR4A1リガンドが、30〜40mg/kg/日のDIM-C-pPhOH(C-DIM8)が腫瘍増殖を部分的(40〜50%)しか阻害しなかった先の試験より有意に低い5mg/kg/日の用量で、哺乳動物の腫瘍増殖を完全に阻害することを示す。

0146

図24は、3,5-ジブロモ第二世代C-DIM/NR4A1リガンドを用いたマウス異種移植研究の結果をまとめており、10.0、7.5、5.0及び2.5mg/kg/日の用量で、RMS腫瘍増殖が完全に阻害された。いずれのインビボ試験においても、毒性は観察されず、インビボ試験は、0.25mg/kg/日の用量でのRMS腫瘍増殖の阻害を示した。したがって、インビトロのGAL4-NR4A1スクリーニングアッセイは、インビトロ及びインビボ両方のNR4A1依存性抗癌活性高確率で予測し、マウスの筋細胞(C2C12)での予備段階の結果は、癌についてのSARが、NR4A1介在代謝活性の調節についてのものと同等であることを示す。

0147

置換NR4A1リガンドで処置したC2C12細胞のグルコース取り込み
以下は、本開示の実施形態による化合物で処置した細胞によるグルコース取り込みの説明である。

0148

先の研究は、NR4A1が、C2C12筋細胞中のグルコース代謝に関連する遺伝子を調節し、また、GLUT-4の発現を強化することを示す。その上、筋細胞中でGLUT-4ノックダウンしたマウスは、インスリン抵抗性であり、筋内のGLUT-4発現を増加させる薬物が、潜在的な抗糖尿病薬であることを示す。また、NR4A1が、筋内のグルコース代謝を強化する上で役割を果たすことも明らかであり、これは、マウスモデルにおけるシトスポロン由来NR4A1リガンドについて先に報告されたNR4A1リガンドの潜在的な抗糖尿病活性と一致している。DIM-C-pPhOH及び第二世代置換類似体を用いた初期研究は、これらの化合物の抗糖尿病活性を調べるためのモデルとしてC2C12筋細胞を使用した。図25A〜図25Dは、NR4A1がC2C12細胞中で発現し、C-DIM8(DIM-C-pPhOH)又は第二世代置換C-DIM8類似体の3,5-ブロモ-(C-DIM8-3,5-Br2)、3-クロロ-(C-DIM8-3-Cl)、及び3-クロロ-5-メトキシ-(C-DIM8-3-Cl-5-OCH3)による処置が、C2C12細胞中のNR4A1の発現を増加したことを例示する。加えて、本発明者らは、Rab4の強化された発現及びAMPKの活性化(リン酸化)も観察し、同様の結果が、C2C12細胞中の抗糖尿病薬メトホルミンで観察された。図26A〜図26Dに例示した結果は、DIM-C-pPhOH(C-DIM8)及びメトホルミンの両方が、C2C12細胞中のNR4A1及びGLUT-4遺伝子発現を誘導し、最大誘導が、20μMのDIM-C-pPhOHで処置した後に観察されたことを示す。第二世代置換化合物は、2.5〜5.0μMの濃度で同様の応答を誘導した。

0149

DIM-C-pPhOH及び3つの置換類似体の、C2C12細胞中のグルコース取り込みに与える効果を調べ(図27)、DIM-C-pPhOH(15μM及び20μM)並びに置換類似体(2.5〜5.0μM)が、グルコース取り込みを有意に誘導したことが観察された。C-DIM8-3,5-Br2及びC-DIM8-3-Cl-5-OCH3で観察された応答は、500μMのメトホルミンで観察されたものと同様だった。

0150

C2C12細胞中のNR4A1の過剰発現は、ホスホフルクトキナーゼ(PFKM)、ホスホグリセリン酸ムターゼ2(PGAM2)、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ(BPGM)、及びグリコーゲンホスホリラーゼM(PYGM)を含めた、解糖に関与する幾つかの遺伝子を誘導する。NR4A1リガンド及びメトホルミンによるC2C12細胞の処置は、全遺伝子の発現を有意に誘導し、同様の誘導応答が、C2C12細胞中のNR4A1の過剰発現後に観察された(図28E)。これらの結果(図25〜図28)は、DIM-C-pPhOH及び置換類似体が、C2C12筋細胞中のグルコース取り込み及び解糖を誘導し、NR4A1を通じて作用する新規クラスの抗糖尿病薬を表すことを実証している。

0151

図20は、強化された糖新生を示すグルコース欠乏HepG2細胞中の結果をまとめている。DIM-C-pPhOH(C-DIM8)及び3,5-ジブロモ類似体は、G6Pase及びPEPCKmRNAレベルを阻害し、結果は、機構がmTORのNR4A1/AMPK依存性阻害を要するが、LKB/NR4A1相互作用の役割が、先に発表されたものとは異なり得ることを示唆する。

0152

これらのデータは、C-DIM類似体が、糖尿病モデルにおいてアゴニストの様式で作用し、一方で、腫瘍モデルではアンタゴニスト様式で作用することから、NR4A1の選択的な受容体調節因子であることを実証する。

0153

置換NR4A1リガンドを用いた高脂肪食で維持されたマウスの処置
以下は、本開示の実施形態による化合物で処置した、高脂肪食で維持されたマウスの説明である。

0154

C57BL/6マウスを、数週間の間、高脂肪食で維持し、次いで1日おきに、経口胃管栄養法によってC-DIM8-3-Cl-5-OCH3(トウモロコシ油中、10mg/kg/d)で処置した。処置期間にわたって数回の間隔で血糖を検査し、血糖レベルの有意な低下を観察した(図29A及び図29B)。加えて、C-DIM8-3-Cl-5-OCH3(10mg/kg/d)で処置したマウスが、耐糖能試験において、対照動物と比べて低下した血中グルコースレベルも示したことが観察され、本研究(25mg/kg/d)では、本発明者らは、低下した血中グルコースレベル及び増加した血中インスリンレベルを観察した。また、これらの結果は、典型的には、抗糖尿病薬でも観察され、C-DIM8類似体が抗糖尿病活性を示し、このインビボデータが、インビトロ研究の結果を補完することを裏付け、C-DIM8及び関連する置換類似体が、新規クラスのNR4A1依存性抗糖尿病薬を表すことが確定される。

0155

本開示の任意の態様で提供される任意の実施形態、特徴、要素、定義、又は概要は、別段に明確な規定がない限り、限定されずに本開示の他の任意の態様に適用することができる。したがって、本明細書に記載の実施形態はいずれも、本発明の任意の方法、薬剤、又は組成物を基準にして実施することができ、またその逆も同様である。更に、本発明の薬剤及び組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。

0156

単語「a」又は「an」の使用は、本明細書中の用語「含む(comprising)」と併せて使用する場合、「1(つ)」を意味することができるが、「1(つ)又は複数」、「少なくとも1(つ)」、及び「1(つ)又は2(つ)以上」の意味とも一致する。

0157

用語「又は」の使用は、別段に代替のみを指すか又は代替が相互に排他的であることを明確に示さない限り、「及び/又は」を意味するように用いられるが、本開示は、代替のみ並びに「及び/又は」を指す定義を支持する。

0158

本出願を通して、用語「約」は、値がデバイスの固有誤差変動を含むことを示すために使用され、研究課題の中に存在する値又は変動を決定するために本方法を用いる。

0159

用語「含む(comprise)」、「有する(have)」及び「挙げられる、含む(include)」は、オープンエンド連結動詞である。「comprises」、「comprising」、「has」、「having」、「includes」及び「including」等、これらの動詞1つ又は複数のいずれの形態又は時制もオープンエンドである。例えば、1つ又は複数の工程を「含む(comprises)」、「有する(has)」又は「含む(includes)」任意の方法は、その1つ又は複数の工程のみを持つことに限定されず、他の列挙されていない工程にも及ぶ。「含む(comprising)」の代替として又は「含む(comprising)」に加えて、本明細書中の任意の実施形態は、「からなる(consisting of)」を挙げることができる。移行「からなる(consisting of)」は、特許請求の範囲に指定されない要素、工程、又は成分すべてを除外する。単数又は複数を使用する単語は、それぞれ複数及び単数も含む。加えて、単語「本明細書中」、「上記」、及び「下記」、並びに類義語は、本出願で用いる場合、この出願全体を指すものとし、本出願の特定の任意部分を指すものではないとする。

0160

本明細書中で引用される刊行物及び引用される主題は、参照によりそれらの全内容が本明細書に具体的に組み込まれる。

実施例

0161

本発明の好ましい実施形態を例示して記載するが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく様々な変更を加えることができることを理解されたい。

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