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図面 (19)

課題・解決手段

本発明は、一部は、PD−1またはPD−L1を結合する物質ならびに診断薬および治療薬としてのそれらの使用に関する。本発明は、PD−1またはPD−L1結合物質を含む医薬組成物および種々の疾患の治療でのそれらの使用にさらに関する。

概要

背景

身体の免疫系を癌の方向に向け直すための免疫療法が開発されている。免疫療法は、化学療法および放射線療法などの他の治療方式欠く細胞特異性の利点をもたらす。従って、免疫に基づく療法の効力を高めるための方法は、臨床的に有益であり得る。例えば、共刺激または共抑制シグナルをもたらす免疫チェックポイント分子は、腫瘍細胞に対するT細胞免疫応答の調節において中心的な役割を果たす。

しかし、例えば、ヤーボイ、キイトルーダ、およびオプジーボの承認に至った臨床試験を含む、チェックポイント分子を標的とする物質に対する患者の著しい応答にもかかわらず、チェックポイント阻害療法などの免疫療法は、圧倒的多数の患者ではまだ成功していない。さらに未だに、多くの免疫療法では、治療のための患者の治療濃度域を大きく狭めかつ患者を他の疾患によりかかりやすくする、副作用併発する。

したがって、最小限の副作用にしながら癌に対する標的療法を提供できる、改善された免疫療法薬の必要性が残されている。

概要

本発明は、一部は、PD−1またはPD−L1を結合する物質ならびに診断薬および治療薬としてのそれらの使用に関する。本発明は、PD−1またはPD−L1結合物質を含む医薬組成物および種々の疾患の治療でのそれらの使用にさらに関する。

目的

本発明は、結合物質を含む医薬組成物および、癌、自己免疫疾患、および/または神経変性疾患を含む、種々の疾患の治療におけるそれらの使用をさらに提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

列番号301、287、290、300、305、306、および309のうちの1つと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むPD−L1結合物質

請求項2

3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2、およびCDR3)を含む少なくとも1つの標的化部分を含むPD−L1結合物質であって、(a)CDR1が、配列番号199、181、178、183、189、196、201、および206のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含み;(b)CDR2が、配列番号259、260、241、242、245、246、263、および264のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含み;ならびに(c)CDR3が、配列番号268、272、および277のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、PD−L1結合物質。

請求項3

前記標的化部分が、単一ドメイン抗体である、請求項1または2に記載のPD−L1結合物質。

請求項4

前記標的化部分が、VHH、ヒト化VHH、またはラクダ化VHHを含む、請求項3に記載のPD−L1結合物質。

請求項5

1種類または複数種類シグナル伝達物質を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のPD−L1結合物質。

請求項6

前記シグナル伝達物質が、インターフェロンインターロイキン、および腫瘍壊死因子のうちの1つまたは複数から選択され、これらはいずれも任意に改変されていてもよい、請求項5に記載のPD−L1結合物質。

請求項7

1種類または複数種類の追加のシグナル伝達物質を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のPD−L1結合物質。

請求項8

前記1つまたは複数の追加の標的化部分が腫瘍抗原を認識し、任意に腫瘍抗原を機能的に調節してもよい、請求項7に記載のPD−L1結合物質。

請求項9

前記1つまたは複数の追加の標的化部分が免疫細胞上の抗原を認識し、任意に免疫細胞上の抗原を機能的に調節してもよい、請求項8に記載のPD−L1結合物質。

請求項10

前記免疫細胞が、T細胞B細胞樹状細胞マクロファージ好中球、およびNK細胞から選択される、請求項9に記載のPD−L1結合物質。

請求項11

細胞傷害性T細胞腫瘍細胞にまたは腫瘍環境動員する、請求項1〜10のいずれか1項に記載のPD−L1結合物質。

請求項12

PD−L1を認識してPD−L1に結合し、その活性を実質的に機能的に調節するかあるいはその活性を実質的に機能的に調節しない、請求項1〜11のいずれか1項に記載のPD−L1結合物質。

請求項13

請求項1〜12のいずれか1項に記載のPD−L1結合物質をコードする組換え核酸組成物

請求項14

請求項13に記載の核酸を含む宿主細胞

請求項15

3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2、およびCDR3)を含む少なくとも1つの標的化部分を含むPD−1結合物質であって、(a)CDR1が、配列番号2〜23のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含み;(b)CDR2が、配列番号24〜54のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含み;および(c)CDR3が、配列番号55〜69のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、PD−1結合物質。

請求項16

3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2、およびCDR3)を含む少なくとも1つの標的化部分を含むPD−L1結合物質であって、(a)CDR1が、配列番号177〜207のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含み;(b)CDR2が、配列番号208〜266のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含み;および(c)CDR3が、配列番号267〜285のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、PD−L1結合物質。

請求項17

前記標的化部分が、単一ドメイン抗体である、請求項15または16に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項18

前記標的化部分が、VHH、ヒト化VHH、またはラクダ化VHHを含む、請求項17に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項19

配列番号70〜83、1246、または1247のうちの1つと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項18に記載のPD−1結合物質。

請求項20

配列番号286〜316のうちの1つと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項18に記載のPD−L1結合物質。

請求項21

1種類または複数種類のシグナル伝達物質を含む、請求項15〜20のいずれか1項に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項22

前記シグナル伝達物質が、インターフェロン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子のうちの1つまたは複数から選択され、これらはいずれも任意に改変されていてもよい、請求項21に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項23

1つまたは複数の追加の標的化部分を含む、請求項15〜22のいずれか1項に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項24

前記1つまたは複数の追加の標的化部分が腫瘍抗原を認識し、任意に腫瘍抗原を機能的に調節してもよい、請求項23に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項25

前記1つまたは複数の追加の標的化部分が免疫細胞上の抗原を認識し、任意に免疫細胞上の抗原を機能的に調節してもよい、請求項24に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項26

前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージ、好中球、およびNK細胞から選択される、請求項25に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項27

細胞傷害性T細胞を腫瘍細胞にまたは腫瘍環境に動員する、請求項15〜26のいずれか1項に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項28

PD−1またはPD−L1を認識して結合し、その活性を実質的に機能的に調節するかあるいはその活性を実質的に機能的に調節しない、請求項15〜27のいずれか1項に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項29

請求項15〜28のいずれか1項に記載のPD−1またはPD−L1結合物質をコードする組換え核酸組成物。

請求項30

請求項29に記載の核酸を含む宿主細胞。

請求項31

癌、感染症、免疫異常、および/または自己免疫疾患のうちの1つまたは複数を有する患者における使用に適している、請求項15〜28のいずれか1項に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項32

PD−1またはPD−L1を標的とする抗原または受容体認識ドメインを含む標的化部分ならびにインターフェロン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子のうちの1つまたは複数から選択されるシグナル伝達物質を含むキメラの有効量を、投与を必要とする患者に投与することを含む、癌を治療または予防するための方法。

請求項33

前記シグナル伝達物質が、改変されている、請求項32に記載の方法。

請求項34

前記PD−1またはPD−L1結合物質が、請求項1〜12または請求項15〜28のいずれか1項に記載のPD−1またはPD−L1結合物質である、請求項32または請求項33に記載の方法。

請求項35

前記PD−1結合物質が、3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2、およびCDR3)を含む少なくとも1つの標的化部分を含み、(a)CDR1が、配列番号2〜23のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含み;(b)CDR2が、配列番号24〜54のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含み;および(c)CDR3が、配列番号55〜69のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項32〜34のいずれか1項に記載の方法。

請求項36

前記PD−L1結合物質が、3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2、およびCDR3)を含む少なくとも1つの標的化部分を含み、(a)CDR1が、配列番号177〜207のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含み;(b)CDR2が、配列番号208〜266のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含み;および(c)CDR3が、配列番号267〜285のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項32〜34のいずれか1項に記載の方法。

請求項37

前記癌が、基底細胞癌胆道癌膀胱癌骨癌、脳および中枢神経系癌、乳癌腹膜の癌、子宮頸癌絨毛癌結腸および直腸癌結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌食道癌、眼癌、頭頸部の癌、胃癌胃腸癌を含む)、神経膠芽腫肝癌ヘパトーマ、上皮内腫瘍腎臓癌または腎性癌(kidneyorrenalcancer)、喉頭癌、白血病肝臓癌肺癌(例えば、小細胞肺癌非小細胞肺癌肺腺癌、および扁平上皮癌)、黒色腫骨髄腫神経芽腫口腔癌舌状、口内、および咽頭)、卵巣癌膵臓癌前立腺癌網膜芽細胞腫横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌腫肉腫皮膚癌扁平上皮細胞癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌子宮または子宮内膜癌、泌尿器系の癌、外陰癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、ならびにB細胞リンパ腫を含むリンパ腫(低悪性度濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)を含む)、小リンパ球性(SL)NHL、中悪性度/濾胞性NHL、中悪性度びまん性NHL、高悪性度免疫芽細胞NHL、高悪性度リンパ芽球性NHL、高悪性度小型非切れ込み核細胞性NHL、巨大腫瘤病変NHL、マントル細胞リンパ腫エイズ関連リンパ腫、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症慢性リンパ性白血病(CLL)、急性リンパ性白血病(ALL)、毛様細胞性白血病慢性骨髄芽球性白血病、ならびに他の癌腫および肉腫、および移植リンパ増殖性疾患(PTLD)、ならびに母斑症浮腫(例えば脳腫瘍に関連するもの)、およびメグズ症候群に関連する異常血管増殖のうちの1つまたは複数から選択される、請求項32〜36のいずれか1項に記載の方法。

請求項38

癌、感染症、免疫異常、および/または自己免疫疾患のうちの1つまたは複数の治療における使用のための請求項1〜37のいずれか1項に記載のPD−1またはPD−L1結合物質。

請求項39

癌、感染症、免疫異常、および/または自己免疫疾患のうちの1つまたは複数を治療するための薬物の製造のための請求項1〜38のいずれか1項に記載のPD−1またはPD−L1結合物質の使用。

請求項40

(a)請求項1〜12または16〜28のいずれか1項に記載のPD−L1結合物質;および(b)野生型FNα2に比べて改善された安全性を付与する1つまたは複数の変異を有する改変ヒトIFNα2を含むキメラタンパク質であって、前記標的化部分および前記改変シグナル伝達物質が、任意に1つまたは複数のリンカーにより連結されていてもよい、キメラタンパク質。

請求項41

前記改変ヒトIFNα2が、位置R120、M148、R149、およびL153に1つまたは複数の変異を含む、請求項40に記載のキメラタンパク質。

請求項42

前記改変ヒトIFNα2が、R120E、R149A、およびL153Aから選択される1つまたは複数の変異を含む、請求項40に記載のキメラタンパク質。

請求項43

前記改変ヒトIFNα2が、R120E変異と、R149AまたはL153A変異のいずれかとを含む、請求項40に記載のキメラタンパク質。

請求項44

(a)請求項1〜12または請求項16〜28のいずれか1項に記載のPD−L1結合物質;および(b)野生型IFNβに比べて改善された安全性を付与する1つまたは複数の変異を有する改変ヒトIFNβを含むキメラタンパク質であって、前記標的化部分および前記改変シグナル伝達物質が、任意に1つまたは複数のリンカーにより連結されていてもよい、キメラタンパク質。

請求項45

前記改変ヒトIFNβが、位置W22、R27、L32、R35、V148、L151、R152、およびY155に1つまたは複数の変異を含む、請求項44に記載のキメラタンパク質。

請求項46

前記改変ヒトIFNβが、W22G、R27G、L32A、L32G、R35A、R35G、V148G、L151G、R152A、R152Gから選択される1つまたは複数の変異を含む、請求項45に記載のキメラタンパク質。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2017年8月9日出願の米国特許仮出願第62/542,921号の利益および優先権を主張する。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0002

発明の分野
本発明は、一部は、PD−1またはPD−L1を結合する結合物質および治療薬および診断薬としてのそれらの使用に関する。

0003

電子申請したテキストファイルの説明
本明細書と共に電子申請された次記のテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる:配列リストコンピュータ可読形式コピーファイル名:ORN−034PC_ST25、作成日付:2018年8月8日、ファイルサイズ:827KB)。

背景技術

0004

身体の免疫系を癌の方向に向け直すための免疫療法が開発されている。免疫療法は、化学療法および放射線療法などの他の治療方式欠く細胞特異性の利点をもたらす。従って、免疫に基づく療法の効力を高めるための方法は、臨床的に有益であり得る。例えば、共刺激または共抑制シグナルをもたらす免疫チェックポイント分子は、腫瘍細胞に対するT細胞免疫応答の調節において中心的な役割を果たす。

0005

しかし、例えば、ヤーボイ、キイトルーダ、およびオプジーボの承認に至った臨床試験を含む、チェックポイント分子を標的とする物質に対する患者の著しい応答にもかかわらず、チェックポイント阻害療法などの免疫療法は、圧倒的多数の患者ではまだ成功していない。さらに未だに、多くの免疫療法では、治療のための患者の治療濃度域を大きく狭めかつ患者を他の疾患によりかかりやすくする、副作用併発する。

0006

したがって、最小限の副作用にしながら癌に対する標的療法を提供できる、改善された免疫療法薬の必要性が残されている。

課題を解決するための手段

0007

種々の態様では、本発明は、PD−1またはPD−L1に特異的に結合する少なくとも1つの標的化部分を有する結合物質に関する。種々の実施形態では、これらの結合物質は、PD−1またはPD−L1に結合し、これを機能的に調節する(例えば、部分的にまたは完全に中和する)。種々の実施形態では、これらの結合物質は、PD−1またはPD−L1に結合するが、これを機能的に調節しない(例えば、部分的にまたは完全に中和しない)。したがって、種々の実施形態では、本発明の結合物質は、例えば、PD−1発現細胞またはPD−L1発現細胞にPD−1またはPD−L1を介してシグナル伝達させつつそのPD−1発現細胞またはPD−L1発現細胞を目的の部位に直接または間接的に動員するのに使用される(すなわち、PD−1またはPD−L1結合物質の結合は、目的の部位でのPD−1またはPD−L1シグナル伝達を低減せず排除しない)。ある実施形態では、標的化部分は単一ドメイン抗体(VHH)である。

0008

種々の実施形態では、本発明の結合物質は、シグナル伝達物質、例えば、限定されないが、活性を弱めるように改変され得るインターフェロンインターロイキン、および腫瘍壊死因子をさらに含む。種々の実施形態では、結合物質は、目的とする他の標的(例えば、抗原受容体)に結合する追加の標的化部分を含む。ある実施形態では、目的とする他の標的(例えば、抗原、受容体)は、腫瘍細胞上に存在する。別の実施形態では、目的とする他の標的(例えば、抗原、受容体)は、免疫細胞上に存在する。いくつかの実施形態では、本発明の結合物質は、免疫細胞、(例えば、樹状細胞)を、作用の部位(例えば、非限定的例であるが、腫瘍微小環境など)に直接的にまたは間接的に動員し得る。いくつかの実施形態では、本発明の結合物質は、樹状細胞による抗原(例えば、腫瘍抗原)の提示を促進する。

0009

種々の実施形態では、本発明の結合物質は、癌、感染症、免疫異常、ならびに他の疾患および障害などの種々の疾患または障害の治療で使用され、さらに本発明は、治療の様々な方法を包含する。

図面の簡単な説明

0010

図1は、実施例1に記載のPD−1またはPD−L1 AcTaferonのクローニング方法の概略図を示す。
図2は、PD−L1(上段パネル)またはPD−1(下段パネル)AcTaferonの遺伝子導入Hek293T細胞への結合を示す。
図3は、末梢血単核球(PBMC)中のpSTAT1の状態により評価したPD−1標的化を示す。データは、非刺激pSTAT1平均蛍光強度MFI)のパーセンテージとしてプロットされる。
図4は、遺伝子導入Hek293T細胞中のpSTAT1の状態により評価したPD−1標的化を示す。pSTAT1細胞パーセンテージがプロットされている。
図5は、MDA−MB−231細胞中のpSTAT1の状態により評価したPD−L1標的化を示す。データは、平均蛍光強度(MFI)のプロットである。
図6は、遺伝子導入Hek293T細胞へのPD−L1 VHHの結合を示す。データは、平均蛍光強度(MFI)のプロットである。
図7Aは、PD−L1 VHH AcTaferon(AFN)の生物活性を示すグラフである。生物活性は、親HL116細胞(p6−16ルシフェラーゼレポーターを安定に遺伝子導入したIFN応答性細胞株)で測定した。ルシフェラーゼ活性は、過剰(20μg/ml)の対応するPD−L1 VHHの存在下または非存在下で、段階希釈のPD−L1 VHH AFNにより誘導された。試験したPD−L1 VHHは、2LIG3であった。
図Bは、PD−L1 VHH AcTaferon(AFN)の生物活性を示すグラフである。生物活性は、親HL116細胞(p6−16ルシフェラーゼレポーターを安定に遺伝子導入したIFN応答性細胞株)で測定した。ルシフェラーゼ活性は、過剰(20μg/ml)の対応するPD−L1 VHHの存在下または非存在下で、段階希釈のPD−L1 VHH AFNにより誘導された。試験したPD−L1 VHHは、2LIG27(図7B)であった。
図7Cは、PD−L1 VHH AcTaferon(AFN)の生物活性を示すグラフである。生物活性は、親HL116細胞(p6−16ルシフェラーゼレポーターを安定に遺伝子導入したIFN応答性細胞株)で測定した。ルシフェラーゼ活性は、過剰(20μg/ml)の対応するPD−L1 VHHの存在下または非存在下で、段階希釈のPD−L1 VHH AFNにより誘導された。試験したPD−L1 VHHは、2LIG97であった。
図7Dは、PD−L1 VHH AcTaferon(AFN)の生物活性を示すグラフである。生物活性は、親HL116細胞(p6−16ルシフェラーゼレポーターを安定に遺伝子導入したIFN応答性細胞株)で測定した。ルシフェラーゼ活性は、過剰(20μg/ml)の対応するPD−L1 VHHの存在下または非存在下で、段階希釈のPD−L1 VHH AFNにより誘導された。試験したPD−L1 VHHは、2LIG99であった。
図7Eは、PD−L1 VHH AcTaferon(AFN)の生物活性を示すグラフである。生物活性は、親HL116細胞(p6−16ルシフェラーゼレポーターを安定に遺伝子導入したIFN応答性細胞株)で測定した。ルシフェラーゼ活性は、過剰(20μg/ml)の対応するPD−L1 VHHの存在下または非存在下で、段階希釈のPD−L1 VHH AFNにより誘導された。試験したPD−L1 VHHは、2LIG176であった。
図7Fは、PD−L1 VHH AcTaferon(AFN)の生物活性を示すグラフである。生物活性は、親HL116細胞(p6−16ルシフェラーゼレポーターを安定に遺伝子導入したIFN応答性細胞株)で測定した。ルシフェラーゼ活性は、過剰(20μg/ml)の対応するPD−L1 VHHの存在下または非存在下で、段階希釈のPD−L1 VHH AFNにより誘導された。試験したPD−L1 VHHは、2LIG189であった。
図7Gは、PD−L1 VHH AcTaferon(AFN)の生物活性を示すグラフである。生物活性は、親HL116細胞(p6−16ルシフェラーゼレポーターを安定に遺伝子導入したIFN応答性細胞株)で測定した。ルシフェラーゼ活性は、過剰(20μg/ml)の対応するPD−L1 VHHの存在下または非存在下で、段階希釈のPD−L1 VHH AFNにより誘導された。試験したPD−L1 VHHは、3LIG8であった。
図8は、親HL116細胞(p6−16ルシフェラーゼレポーターを安定に遺伝子導入したIFN応答性細胞株)でのアテゾリズマブ−AcTaferon(ate−AFN;すなわち、Ate−IFNa2mut)の生物活性を示すグラフである。生物活性は、過剰(50μg/ml)のアテゾリズマブ(ate)の存在下または非存在下で、段階希釈のate−AFNにより誘導したルシフェラーゼ活性により測定された。
図9は、ヒト化免疫系を有するマウスでのRL腫瘍モデルにおける2LIG99ベースAFNのインビボ抗腫瘍活性を示すグラフである。
図10Aは、ヒトPD−1または空のベクターを遺伝子導入し、段階希釈の102C3 AFN(図10A)で刺激したHek293T細胞中のpSTAT1を示すグラフである。pSTAT1陽性細胞のパーセンテージがグラフでプロットされている。
図10Bは、ヒトPD−1または空のベクターを遺伝子導入し、段階希釈の102C12 AFN(図10B)で刺激したHek293T細胞中のpSTAT1を示すグラフである。pSTAT1陽性細胞のパーセンテージがグラフでプロットされている。
図10Cは、ヒトPD−1または空のベクターを遺伝子導入し、段階希釈の野生型IFNa2で刺激したHek293T細胞中のpSTAT1を示すグラフである。pSTAT1陽性細胞のパーセンテージがグラフでプロットされている。

0011

本発明は、一部は、PD−1またはPD−L1を認識し、それに結合する結合物質(例えば、非限定的例であるが、VHHなどの抗体)の発見に基づいている。いくつかの実施形態では、本発明の結合物質は、1つまたは複数の標的化部分および/または1種類または複数種類のシグナル伝達物質とのキメラまたは融合タンパク質の一部である。種々の実施形態では、これらの結合物質は、PD−1またはPD−L1に結合し、これを機能的に調節する(例えば、部分的にまたは完全に中和する)。いくつかの実施形態では、これらの結合物質は、PD−1またはPD−L1に結合するが、これを機能的に調節しない。

0012

本発明は、結合物質を含む医薬組成物および、癌、自己免疫疾患、および/または神経変性疾患を含む、種々の疾患の治療におけるそれらの使用をさらに提供する。

0013

PD−1またはPD−L1結合物質
種々の実施形態では、本発明のPD−1またはPD−L1結合物質は、PD−1またはPD−L1に特異的に結合できるタンパク質ベースの物質である。種々の実施形態では、本発明のPD−1またはPD−L1結合物質は、PD−1またはPD−L1を機能的に調節することなくPD−1またはPD−L1に特異的に結合できるタンパク質ベースの物質である。

0014

PD−1および表面抗原分類279(CD279)としても知られるプログラム細胞死タンパク質1は、活性化T細胞B細胞、およびマクロファージ上で主に発現される細胞表面受容体である。PD−1は、そのリガンド(PD−L1および/またはPD−L2)の結合時に、抗原受容体シグナル伝達を負に制御することが示されている。PD−1は、免疫系の下方制御およびT細胞炎症活性の抑制による自己寛容の促進において重要な役割を果たす。PD−1は、リガンド結合に関与するIg可変型(V型ドメインおよびシグナル伝達分子の結合に関与する細胞質側末端を含むI型膜貫通型糖タンパク質である。PD−1の細胞質側末端は、2つのチロシンベースシグナル伝達モチーフである、ITIM(免疫受容抑制性チロシンモチーフ)およびITSM免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ)を含む。

0015

種々の実施形態では、本発明のPD−1結合物質は、PD−1上に存在するエピトープを認識する抗原認識ドメインを有する標的化部分を含む。ある実施形態では、抗原認識ドメインは、PD−1上に存在する1つまたは複数の線形エピトープを認識する。本明細書で使用される場合、線形エピトープは、PD−1上に存在するアミノ酸の任意の連続配列を指す。別の実施形態では、抗原認識ドメインは、PD−1上に存在する1つまたは複数の立体構造エピトープを認識する。本明細書で使用される場合、立体構造エピトープは、抗原認識ドメインにより認識され得る特徴および/または形状および/または三次構造を備えた3次元表面を形成する1つまたは複数のアミノ酸の部分(これは不連続であってよい)を指す。

0016

種々の実施形態では、本発明のPD−1結合物質は、ヒトPD−1の完全長型および/または成熟型および/またはアイソフォームおよび/またはスプライスバリアントおよび/またはフラグメントおよび/または任意の他の天然のまたは合成の類似体バリアント、または変異体に結合し得る。種々の実施形態では、本発明のPD−1結合物質は、任意の形態のヒトPD−1に結合し得る。ある実施形態では、PD−1結合物質は、リン酸化型のPD−1に結合する。

0017

ある実施形態では、本発明のPD−1結合物質は、ヒトPD−1上に存在する1つまたは複数のエピトープを認識する抗原認識ドメインを有する標的化部分を含む。ある実施形態では、ヒトPD−1は、配列番号1のアミノ酸配列を含む。

0018

別の実施形態では、ヒトPD−1は、アミノ末端シグナルペプチドを含まない配列番号1のアミノ酸配列を含む。

0019

種々の実施形態では、本発明のPD−1結合物質は、特異的に結合できる標的化部分を含む。種々の実施形態では、PD−1結合物質は、抗体またはその誘導体などの抗原認識ドメインを有する標的化部分を含む。ある実施形態では、PD−1結合物質は、抗体である標的化部分を含む。種々の実施形態では、抗体は、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む完全長マルチマータンパク質である。それぞれの重鎖は、1つの可変領域(例えば、VH)および少なくとも3つの定常領域(例えば、CH1、CH2およびCH3)を含み、それぞれの軽鎖は、1つの可変領域(VL)および1つの定常領域(CL)を含む。可変領域は抗体の特異性を決定する。それぞれの可変領域は、4つの比較的保存されたフレームワーク領域(FR)により挟まれた、相補性決定領域(CDR)としても知られる、3つの高頻度可変領域を含む。3つのCDRは、CDR1、CDR2、およびCDR3と呼ばれ、抗体の結合特異性に寄与する。いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。

0020

いくつかの実施形態では、PD−1結合物質は、特定の抗体誘導体または抗体フォーマットである標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、本発明のPD−1結合物質は、次の標的化部分を含む:単一ドメイン抗体、組み換え型重鎖抗体(重鎖抗体)(VHH)、単鎖抗体(scFv)、サメの重鎖抗体(VNAR)、マイクロタンパク質システインノットタンパク質、ノッチン)、DARPin;テトラネクチンアフィボディトランスディアンチカリンアドネクチン;アフィリン;アフィマー;ミクロボディアプタマー;alterase;プラスチック抗体;フィロマー;ストラドボディマキシボディ;エビボディ;フィノマー;アルマジロリピートタンパク質(armadillo repeat protein);クニッツドメインアビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオマブ、トロイボディ、ペプボディ、ワクシボディ、ユニボディデュオボディ、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、ペプチド模倣分子、または合成分子。これらは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,417,130号、米国特許出願公開第2004/132094号、米国特許第5,831,012号、米国特許出願公開第2004/023334号、米国特許第7,250,297号、米国特許第6,818,418号、米国特許出願公開第2004/209243号、米国特許第7,838,629号、米国特許第7,186,524号、米国特許第6,004,746号、米国特許第5,475,096号、米国特許出願公開第2004/146938号、米国特許出願公開第2004/157209号、米国特許第6,994,982号、米国特許第6,794,144号、米国特許出願公開第2010/239633号、米国特許第7,803,907号、米国特許出願公開第2010/119446号、および/または米国特許第7,166,697号に記載されている。Storz MAbs.2011 May−Jun;3(3):310−317、も参照されたい。

0021

いくつかの実施形態では、PD−1結合物質は、VHHなどの単一ドメイン抗体である標的化部分を含む。VHHは、例えば、ラクダ類、サメなどのVHH抗体を産生する生物からから誘導されるか、またはVHHは設計されたVHHであってもよい。VHHは、天然起源の重鎖抗体の特有の構造および機能特性を含む、抗体由来治療用タンパク質である。VHH技術は、軽鎖を欠くラクダ類由来の完全に機能的な抗体に基づいている。これらの重鎖抗体は、単一可変ドメイン(VHH)および2つの定常ドメイン(CH2およびCH3)を含む。

0022

ある実施形態では、PD−1結合物質はVHHを含む。いくつかの実施形態では、VHHは、ヒト化VHHまたはラクダ化VHHである。

0023

いくつかの実施形態では、VHHは、完全ヒトVHドメイン、例えば、HUMABODY(Crescendo Biologics,Cambridge,UK)を含む。いくつかの実施形態では、完全ヒトVHドメイン、例えば、HUMABODYは、一価二価、または三価である。いくつかの実施形態では、完全ヒトVHドメイン、例えば、HUMABODYは、単一特異性、二重特異性、または三重特異性などの単一特異性または多重特異性である。例示の完全ヒトVHドメイン、例えば、HUMABODIESは、例えば、国際公開第2016/113555号および国際公開第2016/113557号に記載されている。これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

0024

いくつかの実施形態では、PD−1結合物質は、4つの「フレームワーク領域」またはFRおよび3つの「相補性決定領域」またはCDRを有する単一アミノ酸鎖を含むVHHである標的化部分を含む。本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」または「FR」は、CDR間に位置する可変ドメイン中の領域を意味する。本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」または「CDR」は、抗原性標的に特異的に結合できるアミノ酸配列を含むVHH中の可変領域を指す。

0025

種々の実施形態では、PD−1結合物質は、少なくとも1つのCDR1、CDR2、および/またはCDR3配列を含む可変ドメインを有するVHHを含む。種々の実施形態では、PD−1結合物質は、少なくとも1つのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4配列を含む可変領域を有するVHHを含む。

0026

いくつかの実施形態では、PD−1CDR1配列は、下記から選択される:GFSMDYYAIA(配列番号2);GFSVDYYAIA(配列番号3);GGFNRVSYMG(配列番号4);GIIKSINFMG(配列番号5);GFILDYYGIG(配列番号6);GLSLDYDGVG(配列番号7);GRTFSSGMG(配列番号8);GFAFGSYDMG(配列番号9);GFSFGNNDMS(配列番号10);IHAMG(配列番号11);INAMA(配列番号12);SGTMG(配列番号13);GSIASIHAM(配列番号14);GSIASIHAMG(配列番号15);FYGMG(配列番号16);GGTFSFYGMG(配列番号17);YYAIA(配列番号18);VSYMG(配列番号19);INFMG(配列番号20);SLGMG(配列番号21);SYDMG(配列番号22);およびNNDMS(配列番号23)。

0027

いくつかの実施形態では、PD−1CDR2配列は、下記から選択される:CITGSDFVDT(配列番号24);SVTSGGEI(配列番号25);STTSDGRT(配列番号26);CISSSDGST(配列番号27);AIAWNGAST(配列番号28);GINSGGRIT(配列番号29);AINSGGGST(配列番号30);AITWSGGITYYEDSVKG(配列番号31);VITWSGGITYYADSVKG(配列番号32);VITVSGGITYYADSVKG(配列番号33);AITWSGGITYYADSLKG(配列番号34);LISWSGGSTYYEDSVKG(配列番号35);SIPWSGGRIYYADSVKG(配列番号36);VITWSGGITY(配列番号37);VITVSGGITY(配列番号38);DIRTSAGRTYYADSVKG(配列番号39);DIRTSAGRTY(配列番号40);CITGSDFMVDTY(配列番号41);CITGSDFMVDTYYVASVKG(配列番号42);SVTSGGEIT(配列番号43);SVTSGGEITIADSVKG(配列番号44);SVTSGGEITVADSVKG(配列番号45);STTSDGRTT(配列番号46);STTSDGRTTVADSVKG(配列番号47);CISSSDGSTY(配列番号48);AIAWNGASTY(配列番号49);AIAWNGASTYYTESVKG(配列番号50);GINSGGRITD(配列番号51);GINSGGRITDYADSVTG(配列番号52);AINSGGGSTY(配列番号53);およびAINSGGGSTYYADSVKG(配列番号54)。

0028

いくつかの実施形態では、PD−1CDR3配列は、下記から選択される:AVRSTANTCPSHYSVMDY(配列番号55);AVRSTANTLCPSHYSIMDY(配列番号56);NADIWVSDARMYNY(配列番号57);NADIWLPSDRMYNY(配列番号58);ATATLCDGGIWGY(配列番号59);AASGLGSVVVTANEYDY(配列番号60);AQGDRSSWHYYGMDY(配列番号61);ATKSDPMTNEYDL(配列番号62);DRAESSWYDY(配列番号63);DKHQSSWYDY(配列番号64);DKHQSSFYDY(配列番号65);DRAQSSWYDY(配列番号66);DRVDSNWYDY(配列番号67);KERSTGWDFAS(配列番号68);およびEMSGISGWDY(配列番号69)。

0029

種々の代表的実施形態では、PD−1結合物質は、下記の配列から選択されるアミノ酸配列を含む:
2PD23
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSMDYYAIAWFRQAPGKEREEISCITGSDFMVDTYYVASVKGRFTISRDNAENTAYLQMNNLKPEDTGVYFCAVRSTANTLCPSHYSVMDYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号70);
2PD26
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFSMDYYAIAWFRQAPGKEREEISCITGSDFMVDTYYVASVKGRFTISRDNAENTAYLQMNNLKPEDTGVYFCAVRSTANTLCPSHYSVMDYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号71);
2PD90
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSVDYYAIAWFRQAPGKEREEISCITGSDFMVDTYYVASVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTGVYFCAVRSTANTLCPSHYSIMDYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号72);
2PD−106
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSMDYYAIAWFRQAPGKEREEISCITGSDFMVDTYYVASVKGRFTISRDNAKNTAHLQMNSLKPEDTGVYFCAVRSTANTLCPSHYSVMDYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号73);
2PD−16
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGFNRVSYMGWYRQAPGTKRELVASVTSGGEITIADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNGLKPEDGATYWCNADIWVSDARMYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号74);
2PD71
QVQLQESGGGLVQTGESLRLSCAASGGFNRVSYMGWYRQAPGSKRELVASVTSGGEITVADSVKGRFTVSRDNNKNTLYLQMNGLKPEDGATYWCNADIWVSDARMYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号75);
2PD−152
QVQLQESGGGLVQTGESLRLSCAASGIIKSINFMGWYRQPPGTKRELVASTTSDGRTTVADSVKGRFTISRDNAKNTIYLEMSSLKPEDTATYWCNADIWLPSDRMYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号76);
2PD−12
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGFILDYYGIGWFRQAPGKEREAVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNALNTLYLQMNSLKPEDTAVYHCATTLCDGGIWGYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号77);
3PD55
QVQLQESGGGLAQAGGSLRLSCEGSGLSLDYDGVGWFRQAPGKEREAVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRGNALNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCATATLCDGGIWGYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号78);
3PD82
QVQLQESGGGSVQPGGSLRLSCAVSGFILDYYGIGWFRQAPGKEREAVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNALNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCATATLCDGGIWGYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号:79);
2PD8
QVQLQESGGGSVQAGDSLRLSCTASGRTFSSLGMGWFRQAPGKEREFVSAIAWNGASTYYTESVKGRFTISRDDAKNTVYLQMNSLKPTDTAVYFCAASGLGSVVVTANEYDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号80);
2PD27
QVQLQESGGGSVQPGKSLRLSCAASGRTFSSLGMGWFRQAPGKEREFVSAIAWNGASTYYTESVKGRFTISRDDAKNTVYLQMNSLKPTDTAVYFCAASGLGSVVVTANEYDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号81);
2PD82
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGFAFGSYDMGWVRQAPGKGPEWVSGINSGGRITDYADSVTGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAQGDRSSWHYYGMDYWGKGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号82);または
3PD36
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFGNNDMSWVRQAPGKGPEWVSAINSGGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCATKSDPMTNEYDLWGXGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号83)。

0030

種々の代表的実施形態では、PD−1結合物質は、末端ヒスチジンタグ配列(すなわち、HHHHHH;配列番号84)を含まない配列番号70〜配列番号83から選択されるアミノ酸配列を含む。

0031

いくつかの実施形態では、PD−1結合物質は、HAタグ(すなわち、YPYDVPDYGS;配列番号85)を含まない配列番号70〜83(上記で提供)から選択されるアミノ酸配列を含む。

0032

いくつかの実施形態では、PD−1結合物質は、AAAリンカーを含まない配列番号70〜83(上記で提供)から選択されるアミノ酸配列を含む。

0033

いくつかの実施形態では、PD−1結合物質は、AAAリンカー、HAタグ、および末端ヒスチジンタグ配列(すなわち、AAAYPYDVPDYGSHHHHHH;配列番号86)を含まない配列番号70〜83(上記で提供)から選択されるアミノ酸配列を含む。

0034

種々の代表的実施形態では、PD−1結合物質は、下記の配列から選択されるアミノ酸配列を含む:
102C3:
QVQLQESGGGLVQAGKSLRLSCAASGSIFSIHAMGWFRQAPGKEREFVAAITWSGGITYYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAADRAESSWYDYWGQGTQVTVSS(配列番号1246);または
102C12:
QVQLQESGGGLVQAGKSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTQVTVSS(配列番号1247)。

0035

種々の実施形態では、PD−1結合物質は、米国特許出願公開第2017/0137517号に記載のアミノ酸配列を含む。この特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。一例として、いくつかの実施形態では、PD−1結合物質は、米国特許出願公開第2017/0137517号中の次の配列のうちの1つを含む:
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号87);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTATYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号88);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTATYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVKVSS(配列番号89);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEMSGISGWDYWGQGTQVQVSS(配列番号90);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVKS(配列番号91);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVQS(配列番号92);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVKVSS(配列番号93);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVQVSS(配列番号94);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVKS(配列番号95);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVQS(配列番号96);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVSS(配列番号97);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVKVSS(配列番号98);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVQVSS(配列番号99);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVKS(配列番号100);
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVQS(配列番号101);
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVSS(配列番号102);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVSS(配列番号103);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTSSA(配列番号104);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTATYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVKVSSA(配列番号105);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVQVSSA(配列番号106);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVKSA(配列番号107);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVQSA(配列番号108);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVKVSSA(配列番号109);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVQVSSA(配列番号110);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVKSA(配列番号111);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVQSA(配列番号112);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVSSA(配列番号113);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVKVSSA(配列番号114);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVQVSSA(配列番号115);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVKSA(配列番号116);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVQSA(配列番号117);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVSSA(配列番号118);
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEMSGISGWDYWGQGTLVTVSSA(配列番号119);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号120);
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWERQAPGKEREEVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号121);
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWERQAPGKEREEVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号122);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWERQAPGKEREEVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA(配列番号123);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWERQAPGKEREEVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA(配列番号124);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWERQAPGKEREEVAVITVSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSFYDYWGQGTLVTVSS(配列番号125);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITVSGGITYYADSVKGRFTISRDQSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSFYDYWGQGTLVTVSS(配列番号126);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITVSGGITYYADSVKGRFTISRDPSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSFYDYWGQGTLVTVSS(配列番号127);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITVSGGITYYADSVKGRFTISRDPSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSFYDYWGQGTLVTVSS(配列番号128);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITVSGGITYYADSVKGRFTISRDQSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSFYDYWGQGTLVTVSS(配列番号129);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITVSGGITYYADSVKGRFTISRDSSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSFYDYWGQGTLVTVSS(配列番号130);
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWERQAPGKEREEVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWERQAPGKEREEVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS(配列番号131);および
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAPSPPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(配列番号132)。

0036

いくつかの実施形態では、PD−1結合物質は、位置1、11、14,52a、73、74、83、89、100a、110、および112(Kabatナンバリングによる)に1つまたは複数の置換を有する配列番号87〜132から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、位置1のアミノ酸はEまたはDである。いくつかの実施形態では、位置11のアミノ酸はLまたはVである。いくつかの実施形態では、位置14のアミノ酸はAまたはPである。いくつかの実施形態では、位置52aのアミノ酸はWまたはVである。いくつかの実施形態では、位置73のアミノ酸はN、S、PまたはQである。いくつかの実施形態では、位置74のアミノ酸はAまたはSである。いくつかの実施形態では、位置83のアミノ酸はKまたはRである。いくつかの実施形態では、位置89のアミノ酸はT、V、IまたはLである。いくつかの実施形態では、位置100aのアミノ酸はWまたはFである。いくつかの実施形態では、位置110のアミノ酸はT、K、またはQである。いくつかの実施形態では、位置112のアミノ酸はS、K、またはQである。

0037

種々の実施形態では、PD−1結合物質は、国際公開第2017/087587号に記載のアミノ酸配列を含む。この特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。一例として、いくつかの実施形態では、PD−1結合物質は、国際公開第2017/087587号中の次の配列のうちの1つを含む:
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEQEFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEMSGISGWDYWGQGTQVTVSS(配列番号133);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTATYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号134);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVKVSS(配列番号135);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVQVSS(配列番号136);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVKS(配列番号137);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVQS(配列番号138);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVKVSS(配列番号139);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVQVSS(配列番号140);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVKS(配列番号141);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVQS(配列番号142);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号143);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVKVSS(配列番号144);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVQVSS(配列番号145);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVKS(配列番号146);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVQS(配列番号147);
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号148);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号149);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTATYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSA(配列番号150);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVKVSSA(配列番号151);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVQVSSA(配列番号152);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVKSA(配列番号153);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMCWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVQSA(配列番号154);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMCWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVKVSSA(配列番号155);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVQVSSA(配列番号156);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVKSA(配列番号157);
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVQSA(配列番号158);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSA(配列番号159);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVKVSSA(配列番号160);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVQVSSA(配列番号161);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVKSA(配列番号162);
EVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVQSA(配列番号163);
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSA(配列番号164);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSA(配列番号165);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAIITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号166);
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAIYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号167);
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSS(配列番号168);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA(配列番号169);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSWYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA(配列番号170);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITVSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSFYDYWGQGTLVTVSS(配列番号171);
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITVSGGITYYADSVKGRFTISRDQSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSFYDYWGQGTLVTVSS(配列番号172);および
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIASIHAMGWFRQAPGKEREFVAVITVSGGITYYADSVKGRFTISRDPSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAGDKHQSSFYDYWGQGTLVTVSS(配列番号173)。

0038

いくつかの実施形態では、PD−1結合物質は、位置1、11、14,52a、73、74、83、89、100a、110、および112(Kabatナンバリングによる)に1つまたは複数の置換を有する配列番号133〜173から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、位置1のアミノ酸はEまたはDである。いくつかの実施形態では、位置11のアミノ酸はLまたはVである。いくつかの実施形態では、位置14のアミノ酸はAまたはPである。いくつかの実施形態では、位置52aのアミノ酸はWまたはVである。いくつかの実施形態では、位置73のアミノ酸はN、S、PまたはQである。いくつかの実施形態では、位置74のアミノ酸はAまたはSである。いくつかの実施形態では、位置83のアミノ酸はKまたはRである。いくつかの実施形態では、位置89のアミノ酸はT、V、IまたはLである。いくつかの実施形態では、位置100aのアミノ酸はWまたはFである。いくつかの実施形態では、位置110のアミノ酸はT、K、またはQである。いくつかの実施形態では、位置112のアミノ酸はS、K、またはQである。

0039

種々の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の本発明のPD−1結合物質の任意の天然のまたは合成の類似体、変異体、バリアント、アレル同族体およびオーソログ(本明細書では、ひとまとめにして「類似体」と呼ぶ)の使用を意図している。種々の実施形態では、PD−1結合物質のアミノ酸配列は、アミノ酸類似体アミノ酸誘導体、またはその他の非古典的アミノ酸をさらに含む。

0040

種々の実施形態では、本発明は、PD−L1結合物質をさらに提供する。プログラム死リガンド1(PD−L1)は、表面抗原分類274(CD274)またはB7ホモログ1(B7−H1)としても知られ、免疫系の抑制に大きな役割を果たすと推測されている1型膜貫通タンパク質である。PD−LIは、LPSおよびGM−CSF処理に応答してマクロファージおよび樹状細胞(DC)上で、ならびにTCRおよびB細胞受容体シグナル伝達時にT細胞およびB細胞上で発現上昇される。

0041

種々の実施形態では、本発明のPD−L1結合物質は、PD−L1上に存在するエピトープを認識する抗原認識ドメインを有する標的化部分を含む。ある実施形態では、抗原認識ドメインは、PD−L1上に存在する1つまたは複数の線形エピトープを認識する。本明細書で使用される場合、線形エピトープは、PD−L1上に存在するアミノ酸の任意の連続配列を指す。別の実施形態では、抗原認識ドメインは、PD−L1上に存在する1つまたは複数の立体構造エピトープを認識する。本明細書で使用される場合、立体構造エピトープは、抗原認識ドメインにより認識され得る特徴および/または形状および/または三次構造を備えた3次元表面を形成する1つまたは複数のアミノ酸の部分(これは不連続であってよい)を指す。

0042

種々の実施形態では、本発明のPD−L1結合物質は、ヒトPD−L1の完全長型および/または成熟型および/またはアイソフォームおよび/またはスプライスバリアントおよび/またはフラグメントおよび/または任意の他の天然のまたは合成の類似体、バリアント、または変異体に結合し得る。種々の実施形態では、本発明のPD−L1結合物質は、任意の形態のヒトPD−L1に結合し得る。ある実施形態では、PD−L1結合物質は、リン酸化型のPD−L1に結合する。ある実施形態では、PD−L1結合物質は、アセチル化型のPD−L1に結合する。

0043

ある実施形態では、本発明のPD−L1結合物質は、ヒトPD−L1上に存在する1つまたは複数のエピトープを認識する抗原認識ドメインを有する標的化部分を含む。ある実施形態では、ヒトPD−L1は、下記のアミノ酸配列(下線はシグナルペプチド)を含む:

0044

種々の実施形態では、本発明のPD−L1結合物質は、特異的結合ができる標的化部分を含む。種々の実施形態では、PD−L1結合物質は、抗体またはその誘導体などの抗原認識ドメインを有する標的化部分を含む。ある実施形態では、PD−L1結合物質は、抗体である標的化部分を含む。種々の実施形態では、抗体は、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む完全長マルチマータンパク質である。それぞれの重鎖は、1つの可変領域(例えば、VH)および少なくとも3つの定常領域(例えば、CH1、CH2およびCH3)を含み、それぞれの軽鎖は、1つの可変領域(VL)および1つの定常領域(CL)を含む。可変領域は抗体の特異性を決定する。それぞれの可変領域は、4つの比較的保存されたフレームワーク領域(FR)により挟まれた、相補性決定領域(CDR)としても知られる、3つの高頻度可変領域を含む。3つのCDRは、CDR1、CDR2、およびCDR3と呼ばれ、抗体の結合特異性に寄与する。いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。

0045

いくつかの実施形態では、PD−L1結合物質は、特定の抗体誘導体または抗体フォーマットである標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、本発明のPD−L1結合物質は、次の標的化部分を含む:単一ドメイン抗体、組み換え型の重鎖抗体(重鎖抗体)(VHH)、単鎖抗体(scFv)、サメの重鎖抗体(VNAR)、マイクロタンパク質(システインノットタンパク質、ノッチン)、DARPin;テトラネクチン;アフィボディ;トランスボディ;アンチカリン;アドネクチン;アフィリン;アフィマー;ミクロボディ;アプタマー;alterase;プラスチック抗体;フィロマー;ストラドボディ;マキシボディ;エビボディ;フィノマー;アルマジロリピートタンパク質(armadillo repeat protein);クニッツドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオマブ、トロイボディ、ペプボディ、ワクシボディ、ユニボディ;デュオボディ、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、ペプチド模倣分子、または合成分子。これらは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,417,130号、米国特許出願公開第2004/132094号、米国特許第5,831,012号、米国特許出願公開第2004/023334号、米国特許第7,250,297号、米国特許第6,818,418号、米国特許出願公開第2004/209243号、米国特許第7,838,629号、米国特許第7,186,524号、米国特許第6,004,746号、米国特許第5,475,096号、米国特許出願公開第2004/146938号、米国特許出願公開第2004/157209号、米国特許第6,994,982号、米国特許第6,794,144号、米国特許出願公開第2010/239633号、米国特許第7,803,907号、米国特許出願公開第2010/119446号、および/または米国特許第7,166,697号に記載されている。Storz MAbs.2011 May−Jun;3(3):310−317、も参照されたい。

0046

いくつかの実施形態では、PD−L1結合物質は、VHHなどの単一ドメイン抗体である標的化部分を含む。VHHは、例えば、ラクダ類、サメなどのVHH抗体を産生する生物からから誘導するか、またはVHHは設計によるVHHであってもよい。VHHは、天然起源の重鎖抗体の特有の構造および機能特性を含む、抗体由来の治療用タンパク質である。VHH技術は、軽鎖を欠くラクダ類由来の完全に機能的な抗体に基づいている。これらの重鎖抗体は、単一可変ドメイン(VHH)および2つの定常ドメイン(CH2およびCH3)を含む。

0047

ある実施形態では、PD−L1結合物質はVHHを含む。いくつかの実施形態では、VHHは、ヒト化VHHまたはラクダ化VHHである。

0048

いくつかの実施形態では、VHHは、完全ヒトVHドメイン、例えば、HUMABODY(Crescendo Biologics,Cambridge,UK)を含む。いくつかの実施形態では、完全ヒトVHドメイン、例えば、HUMABODYは、一価、二価、または三価である。いくつかの実施形態では、完全ヒトVHドメイン、例えば、HUMABODYは、単一特異性、二重特異性、または三重特異性などの単一特異性または多重特異性である。例示的な完全ヒトVHドメイン、例えば、HUMABODIESは、例えば、国際公開第2016/113555号および国際公開第2016/113557号に記載されている。これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

0049

いくつかの実施形態では、PD−L1結合物質は、4つの「フレームワーク領域」またはFRおよび3つの「相補性決定領域」またはCDRを有する単一アミノ酸鎖を含むVHHである標的化部分を含む。本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」または「FR」は、CDRの間に位置する可変ドメイン中の領域を意味する。本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」または「CDR」は、抗原性標的に特異的に結合できるアミノ酸配列を含むVHH中の可変領域を指す。

0050

種々の実施形態では、PD−L1結合物質は、少なくとも1つのCDR1、CDR2、および/またはCDR3配列を含む可変ドメインを有するVHHを含む。種々の実施形態では、PD−L1結合物質は、少なくとも1つのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4配列を含む可変領域を有するVHHを含む。

0051

いくつかの実施形態では、PD−L1CDR1配列は、下記から選択される:GFTLDYYAIG(配列番号177);GTIFSINHMD(配列番号178);GFTFDDYGMS(配列番号179);GFTLDYYAIN(配列番号180);GTIFSINRMD(配列番号181);GFTFSSYGMS(配列番号182);GKIFSGNDMG(配列番号183);GFTFNDYAMS(配列番号184);GFNLDPYAIA(配列番号185);GFTFTAYAMS(配列番号186);GFTFDYYAIG(配列番号187);GFNLDPYAIG(配列番号188);ESIFSIEAMG(配列番号189);GRTFSISAMG(配列番号190);YYAIG(配列番号191);YYAKC(配列番号192);QYDVG(配列番号193);NSAMG(配列番号194);DSIVS(配列番号195);INHMD(配列番号196);DYGMS(配列番号197);YYAIN(配列番号198);INRMD(配列番号199);SYGMS(配列番号200);GNDMG(配列番号201);DYAMS(配列番号202);PYAIA(配列番号203);AYAMS(配列番号204);PYAIG(配列番号205);IEAMG(配列番号206);およびISAMG(配列番号207)。

0052

いくつかの実施形態では、PD−L1CDR2配列は、下記から選択される:ISSSDGSTY(配列番号208);ITSDGFPT(配列番号209);IRWNGGSTN(配列番号210);ITSDGTPT(配列番号211);IDSGGGSTS(配列番号212);ITSGGITD(配列番号213);ITSDGTPT(配列番号214);IDSGGGSTS(配列番号215);IRSNGGYTN(配列番号216);ISSSDVGTY(配列番号217);INSSDGSTY(配列番号218);ISGSDSSTY(配列番号219);ISSSDVGTY(配列番号220);ITSDGTPT(配列番号221);ITSDGTPA(配列番号222);IDSGGGSTS(配列番号223);ISSGDGSKY(配列番号224);ISSSDVGTY(配列番号225);IFGGGFTN(配列番号226);ITSGGITD(配列番号227);IDSGGGSTS(配列番号228);ITSDGTPT(配列番号229);IDSGGGSTS(配列番号230);ISSSDVGTY(配列番号231);ITWSGGSTS(配列番号232);IDSGGGSTS(配列番号233);IRSNGGYTN(配列番号234);SISSSDGSTYYADSVKG(配列番号235);CISSSDGSTYYADSVKG(配列番号236);CISGGDNSTYYADSVKG(配列番号237);FSSSGGRTIYPDSVKG(配列番号238);RITGGGLIAYTDSVKG(配列番号239);GISNGGTIKYAESVLG(配列番号240);LITSDGFPT(配列番号241);LITSDGFPTYADSAKG(配列番号242);AIRWNGGSTN(配列番号243);AIRWNGGSTNYADSVKG(配列番号244);LITSDGTPT(配列番号245);LITSDGTPTYADSAKG(配列番号246);AIDSGGGSTS(配列番号247);AIDSGGGSTSYADSVKG(配列番号248);IITSGGITD(配列番号249);IITSGGITDYADAVKG(配列番号250);GIRSNGGYTN(配列番号251);GIRSNGGYTNYADSVKG(配列番号252);CISSSDVGTY(配列番号253);CISSSDVGTYYADSVKG(配列番号254);CINSSDGSTY(配列番号255);CINSSDGSTYYADSVKG(配列番号256);CISGSDSSTY(配列番号257);CISGSDSSTYYADSVKG(配列番号258);LITSDGTPA(配列番号259);LITSDGTPAYADSAKG(配列番号260);CISSGDGSKY(配列番号261);CISSGDGSKYYADSVKG(配列番号262);AIFGGGFTN(配列番号263);AIFGGGFTNYADSVKG(配列番号264);AITWSGGSTS(配列番号265);およびAITWSGGSTSYTDSVKG(配列番号266)。

0053

いくつかの実施形態では、CDR3配列は、下記から選択される:DGWSSCRHGINEYLYW(配列番号267);SSGVYNYW(配列番号268);QGYYCSGGCPR(配列番号269);SGWRLCRPTDEYDYSYW(配列番号270);QGYYCSGYGCSDYW(配列番号271);RDRTIWW(配列番号272);QGYYCSGYGCYP(配列番号273);DGYYYCSDYPHPLYW(配列番号274);DGWRDCTWSNEYAYW(配列番号275);TGWRTCRGLNEYDYW(配列番号276);DLVSGSSRLYDYW(配列番号277);MGRTNYGVIYDPNMYNYW(配列番号278);SGWRLCRPTDEYDYLYW(配列番号279);SQAPITIATMMKPFYDY(配列番号280);RHGGPLTVEYFFDY(配列番号281);GGWKYCSGYDPEYIY(配列番号282);DWYLNSY(配列番号283);INSRDG(配列番号284);およびRQY(配列番号285)。

0054

種々の代表的実施形態では、PD−L1結合物質は、下記の配列から選択されるアミノ酸配列を含む:
2LIG2
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREEVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYYCATDGWSSCRHGIN−EYLYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号286);
または
2LIG3
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCTASGTIFSINHMDWFRQAPGKQRELVALITSDGFPTYADSAKGRFTISRDNTKKTVSLQMNSLKPEDTAVYYCHVSSGVYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号287);
または
2LIG16
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSAIRWNGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCA−QGYY−CSGYGCPRGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号288);
または
2LIG22
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAINWFRQAPGKEREEVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATSGWRLCRPTDEYDYSYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号289);
または
2LIG27
QVQLQESGGGVVQAGGSLRLSCTASGTIFSINRMDWFRQAPGKQRELVALITSDGTPTYADSAKGRFTISRDNTKKTVSLQMNSLKPEDTAVYYCHVSSGVYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号290);
または
2LIG29
QVQLQESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPGKGPEWVSAIDSGGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCA−QGYY−CSGYGCSDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号291);
または
2LIG30
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKIFSGNDMGWYRQAPGKQRELVGIITSGGITDYADAVKGRFTISRDNAKNMMYLQMNSLKPEDTAVYYCNMRDRTIWWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号292);
または
2LIG34
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASGTIFSINRMDWFRQAPGKQRELVALITSDGTPTYADSAKGRFTISRDNTKKTVSLQMNSLKPEDTAVYYCHVSSGVYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号293);
または
2LIG35
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPGKGPEWVSAIDSGGGSTSYADSVKGRFTTSRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCA−QGYY−CSGYGCSDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号294);
または
2LIG48
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIRSNGGYTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCA−QGYY−CSGYGCYPGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号295);
または
2LIG65
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFNLDPYAIAWFRQAPGKEREEVSCISSSDVGTYYADSVKGRFTISRDNAKKTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDGYYYCSDYPHPLYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号296);
または
2LIG85
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTAYAMSWFRQAPGKEREEVSCINSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYHCATDGWRDCTWSNEYAYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号297);
または
2LIG86
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDYYAIGWFRQAPGKEREEVSCISGSDSSTYYADSVKGRFTIVRDNAQNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAVTGWRTCRGLNEYDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号298);
または
2LIG89
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLDPYAIAWFRQAPGKEREEVSCISSSDVGTYYADSVKGRFTISRDNTKKTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDGYYYCSDYPHPLYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号299);
または
2LIG97
QVQLQESGGGLVQAGESLRLSCTASGTIFSINRMDWFRQAPGKQRELVALITSDGTPTYADSAKGRFTISRDNTKKTVSLQMNSLKPEDTAVYYCHVSSGVYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号300);
または
2LIG99
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCTASGTIFSINRMDWFRQAPGKQRELVALITSDGTPAYADSAKGRFTISRDNTKKTVSLQMNSLKPEDTAVYYCHVSSGVYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号301);
または
2LIG109
QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCKTSGFTFSSYGMSWVRQTPGKGPEWVSAIDSGGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAQGYY−CSGYGCSDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号302);
または
2LIG127
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLDPYAIGWFRQAPGKEREEVSCISSGDGSKYYADSVKGRFTMSRDNAKKTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDGYYYCSDYPHPLYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号303);
または
2LIG139
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFNLDPYAIAWFRQAPGKEREEVSCISSSDVGTYYADSVKGRFTISRDNAKKTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDGYYYCSDYPHPLYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号304);
または
2LIG176
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASESIFSIEAMGWYRQAPGKQRELVAAIFGGGFTNYADSVKGRFTISRDNANRTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNADLVSGSSRLYDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号305);
または
2LIG189
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGKIFSGNDMGWYRQAPGKQRELVGIITSGGITDYADAVKGRFTISRDNAKNMMYLQMNSLKPEDTAVYYCNMRDRTIWWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号306);
または
3LIG3
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREEVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYYCATDGWSSCRHGINEYLYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号307);
または
3LIG7
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPGKGPEWVSAIDSGGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAQGYY−CSGYGCSDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号308);
または
3LIG8
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGTIFSINRMDWFRQAPGKQRELVALITSDGTPTYADSAKGRFTISRDNTKKTVSLQMNSLKPEDTAVYYCHVSSGVYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号309);
または
3LIG9
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPGKGPEWVSAIDSGGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAQGYYCSGYGCSDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号310);
または
3LIG18
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLDPYAIAWFRQAPGKEREEVSCISSSDVGTYYADSVKGRFTISRDNAKKTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDGYYYCSDYPHPLYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号311);
または
3LIG20
QVQLQESGGGLVXAGGSLRLSCAASGRTFSISAMGWFRQAPGKEREFVAAITWSGGSTSYTDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAIYYCAAMGRTNYGVIYDPNMYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号312);
または
3LIG28
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAINWFRQAPGKEREEVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATSGWRLCRPTDEYDYLYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号313);
または
3LIG29
QVQLQESGGGLVQAGGSMRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPGKGPEWVSAIDSGGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAQGYYCSGYGCSDYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号314);
または
3LIG30
QVQLQESGGGTVQAGGSLRLSCAASGFTFNDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIRSNGGYTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAQGYYCSGYGCYPGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号315);
または
3LIG33
QVQLQESGGGLVQPGTSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREEVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYYCATDGWSSCRHGINEYLYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH(配列番号316)。

0055

種々の例示的実施形態では、PD−L1結合物質は、末端ヒスチジンタグ配列(すなわち、HHHHHH:配列番号84)を含まない上記配列のうちのいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む。

0056

いくつかの実施形態では、PD−L1結合物質は、HAタグ(すなわち、YPYDVPDYGS;配列番号85)を含まない配列番号286〜316(上記で提供)から選択されるアミノ酸配列を含む。

0057

いくつかの実施形態では、PD−L1結合物質は、AAAリンカーを含まない配列番号286〜316(上記で提供)から選択されるアミノ酸配列を含む。

0058

いくつかの実施形態では、PD−L1結合物質は、AAAリンカー、HAタグ、および末端ヒスチジンタグ配列(すなわち、AAAYPYDVPDYGSHHHHHH;配列番号86)を含まない配列番号286〜316(上記で提供)から選択されるアミノ酸配列を含む。

0059

種々の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の本発明のPD−L1結合物質の任意の天然または合成類似体、変異体、バリアント、アレル、同族体およびオーソログ(本明細書では、ひとまとめにして「類似体」と呼ぶ)の使用を意図している。種々の実施形態では、PD−L1結合物質のアミノ酸配列は、アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体、またはその他の非古典的アミノ酸をさらに含む。

0060

種々の実施形態では、PD−1またはPD−L1結合物質は、本明細書で開示の配列のうちのいずれか1つに少なくとも60%同一である配列を含む標的化部分を含む。例えば、PD−1またはPD−L1結合物質は、本明細書で開示の配列のうちのいずれかに、少なくとも約60%、少なくとも約61%、少なくとも約62%、少なくとも約63%、少なくとも約64%、少なくとも約65%、少なくとも約66%、少なくとも約67%、少なくとも約68%、少なくとも約69%、少なくとも約70%、少なくとも約71%、少なくとも約72%、少なくとも約73%、少なくとも約74%、少なくとも約75%、少なくとも約76%、少なくとも約77%、少なくとも約78%、少なくとも約79%、少なくとも約80%、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%同一(例えば、本明細書で開示の配列のうちのいずれか1つに約60%、または約61%、または約62%、または約63%、または約64%、または約65%、または約66%、または約67%、または約68%、または約69%、または約70%、または約71%、または約72%、または約73%、または約74%、または約75%、または約76%、または約77%、または約78%、または約79%、または約80%、または約81%、または約82%、または約83%、または約84%、または約85%、または約86%、または約87%、または約88%、または約89%、または約90%、または約91%、または約92%、または約93%、または約94%、または約95%、または約96%、または約97%、または約98%、約99%または約100%の配列同一性)である配列を含む標的化部分を含み得る。

0061

種々の実施形態では、PD−1またはPD−L1結合物質は、本明細書で開示の配列のうちのいずれか1つに関して1つまたは複数のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む標的化部分を含む。種々の実施形態では、PD−1またはPD−L1結合物質は、本明細書で開示の配列のうちのいずれか1つに関して1個、または2個、または3個、または4個、または5個、または6個、または7個、または8個、または9個、または10個、または15個、または20個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸変異は、置換、挿入、欠失、および短縮化から独立に選択され得る。

0062

いくつかの実施形態では、アミノ酸変異は、アミノ酸置換であり、保存的および/または非保存的置換を含み得る。

0063

「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基極性電荷、サイズ、溶解度、疎水性親水性、および/または両親媒特性における類似性に基づいて行われ得る。20種類の天然アミノ酸は、次の6つの標準アミノ酸グループに分類できる:(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr;Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)塩基性:His、Lys、Arg;(5)鎖配向に影響を与える残基:Gly、Pro;および(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。

0064

本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、あるアミノ酸の、上記6つの標準的アミノ酸グループの同じグループ内に記載の別のアミノ酸による交換として定義される。例えば、AspのGluによる交換は、そのように改変されたポリペプチド中で1つの負電荷を保持する。さらに、グリシンおよびプロリンは、それらのαヘリックス破壊する能力に基づいて相互に置換され得る。

0065

本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、あるアミノ酸の、上記6つの標準的アミノ酸グループ(1)〜(6)の異なるグループに記載の別のアミノ酸による交換として定義される。

0066

種々の実施形態では、置換は非古典的アミノ酸も含んでよい。代表的非古典的アミノ酸としては、限定されないが、セレノシステインピロールリジンN−ホルミルメチオニンβ−アラニンGABAおよびδ−アミノレブリン酸、4−アミノ安息香酸(PABA)、共通アミノ酸のD−異性体、2,4−ジアミノ酪酸α−アミノイソ酪酸、4−アミノ酪酸、Abu、2−アミノ酪酸、γ−Abu、ε−Ahx、6−アミノヘキサン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−アミノプロピオン酸オルニチンノルロイシンノルバリンヒドロキシプロリンサルコシンシトルリンホモシトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニンフェニルグリシンシクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、C α−メチルアミノ酸、N α−メチルアミノ酸、およびアミノ酸類似体一般が挙げられる。

0067

種々の実施形態では、アミノ酸変異は、標的化部分のCDR(例えば、CDR1、CDR2またはCDR3領域)中にあってもよい。別の実施形態では、アミノ酸変化は、標的化部分のフレームワーク領域(FR)(例えば、FR1、FR2、FR3、またはFR4領域)中にあってもよい。

0068

アミノ酸配列の改変は、任意の当該技術分野において、周知の技術、例えば、部位特異的変異誘発またはPCRベース変異誘発を用いて実現され得る。このような技術は、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.,1989 and Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.,1989に記載されている。

0069

種々の実施形態では、変異は、PD−1またはPD−L1に特異的に結合する本発明のPD−1またはPD−L1結合物質の能力を実質的に低下させない。種々の実施形態では、変異は、PD−1またはPD−L1に特異的に結合する本発明のPD−1またはPD−L1結合物質の能力を実質的に低下させず、さらにPD−1またはPD−L1を機能的に調節する(例えば、部分的にまたは完全に中和する)こともない。

0070

種々の実施形態では、ヒトPD−1またはPD−L1の完全長および/または成熟型および/またはアイソフォームおよび/またはスプライスバリアントおよび/またはフラグメントおよび/またはモノマーおよび/またはダイマー型および/または任意のその他の天然のまたは合成類似体、バリアント、または変異体(モノマー、ダイマー型を含む)に対する本発明のPD−1またはPD−L1結合物質の結合親和性は、平衡解離定数(KD)により特徴付けられる。種々の実施形態では、PD−1またはPD−L1結合物質は、ヒトPD−1またはPD−L1の完全長および/または成熟型および/またはアイソフォームおよび/またはスプライスバリアントおよび/またはフラグメントおよび/または任意のその他の天然のまたは合成類似体、バリアント、または変異体(モノマーおよび/またはダイマー型を含む)に、約1uM、約900nM、約800nM、約700nM、約600nM、約500nM、約400nM、約300nM、約200nM、約100nM、約90nM、約80nM、約70nM、約60nM、約50nM、約40nM、約30nM、約20nM、約10nM、または約5nM、または約1nM未満のKDで結合する標的化部分を含む。

0071

種々の実施形態では、PD−1またはPD−L1結合物質は、目的の抗原、すなわち、PD−1またはPD−L1を結合するが機能的に調節(例えば、部分的にまたは完全に中和)しない標的化部分を含む。例えば、種々の実施形態では、PD−1またはPD−L1結合物質の標的化部分は、単に抗原を標的とするが、抗原が有する生物学的作用を実質的に機能的に調節(例えば、部分的にまたは完全に阻害するかあるいは中和する)しない。種々の実施形態では、PD−1またはPD−L1結合物質の標的化部分は、生物活性にとって重要な抗原部位(例えば、抗原の活性部位)から物理的に離れたエピトープを結合する。

0072

種々の実施形態では、これらの結合物質は、PD−1またはPD−L1に結合し、かつこれを機能的に調節する(例えば、部分的にまたは完全に中和する)。

0073

PD−1またはPD−L1結合物質を含む治療薬
シグナル伝達物質とのキメラおよび融合体
種々の実施形態では、本発明のPD−1またはPD−L1結合物質は、1種類または複数種類のシグナル伝達物質とのキメラまたは融合体の一部である。したがって、本発明は、例えば、PD−1またはPD−L1に対する標的化部分および1種類または複数種類のシグナル伝達物質を含むキメラまたは融合タンパク質を提供する。

0074

種々の実施形態では、シグナル伝達物質は、1つまたは複数のその受容体に対する低減された親和性または活性を有するように改変され、それによりキメラまたは融合タンパク質の活性の減弱化アゴニズムまたはアンタゴニズムを含む)を可能にし、および/または非特異的シグナル伝達または望ましくない隔離を防止する。種々の実施形態では、シグナル伝達物質は野生型の形態で拮抗性であり、そのアンタゴニスト活性を弱める1つまたは複数の変異を有する。種々の実施形態では、シグナル伝達物質は、1つまたは複数の変異に起因して拮抗性であり、例えば、アゴニストシグナル伝達物質はアンタゴニストシグナル伝達物質に変換され、このような変換されたシグナル伝達物質は、場合により、そのアンタゴニスト活性を弱める1つまたは複数の変異も有する(例えば、国際公開第2015/007520号に記載のように、この特許の全内容は参照により本明細書に組み込まれる)。

0075

したがって、種々の実施形態では、シグナル伝達物質は、1つまたは複数の改変(例えば、変異)を有する改変された(変異した)型のシグナル伝達物質である。種々の実施形態では、変異は改変シグナル伝達物質が、非変異型、すなわち、野生型形態のシグナル伝達物質に比べて(例えば、野生型形態と改変(例えば、変異)形態での同じシグナル伝達物質を比較して)、低減された結合親和性、低減された内在性活性、および低減された特定の生物活性のうちの1つまたは複数などの1つまたは複数の弱められた活性を有することを可能にする。いくつかの実施形態では、結合または親和性を弱めるまたは低減する変異は、結合または活性を実質的に低減または除去する変異を含む。いくつかの実施形態では、結合または親和性を弱めるまたは低減する変異は、結合または活性を実質的に低減または除去する変異とは異なる。結果として、種々の実施形態では、変異は、シグナル伝達物質が、非変異型、すなわち、野生型シグナル伝達物質に比べて(例えば、野生型形態と改変(例えば、変異)形態での同じシグナル伝達物質を比較して)、向上した安全性、例えば、低減された全身毒性、低減された副作用、および低減されたオフターゲット効果を有することを可能にする。

0076

本明細書に記載のように、物質は、1つまたは複数の改変、例えば、変異により、向上した安全性を有し得る。種々の実施形態では、向上した安全性は、本キメラタンパク質がより低い毒性(例えば、全身性毒性および/または組織器官関連毒性);および/または低減されたまたは実質的に除去された副作用;および/または高められた耐容性、低減されたまたは実質的に除去された有害事象;および/または低減されたまたは実質的に除去された;および/または拡大された治療濃度域をもたらすことを意味する。

0077

種々の実施形態では、シグナル伝達物質は、1つまたは複数のその受容体に対する結合親和性または活性を低減する1つまたは複数の変異を有するように改変されている。いくつかの実施形態では、シグナル伝達物質は、受容体に対する結合親和性または活性を実質的に低減または除去する1つまたは複数の変異を有するように改変されている。いくつかの実施形態では、野生型シグナル伝達物質により与えられる活性は、受容体に対するアゴニズム(例えば、治療の部位での細胞効果の活性化)である。例えば、野生型シグナル伝達物質は、その受容体を活性化し得る。このような実施形態では、変異は、受容体に対する活性化作用を低減または除去するように改変されたシグナル伝達物質をもたらす。例えば、変異は、標的細胞に低減された活性化シグナルを送るように改変されたシグナル伝達物質をもたらし得る、または活性化シグナルが除去され得る。いくつかの実施形態では、野生型シグナル伝達物質により与えられる作用は、受容体に対するアンタゴニズム(例えば、治療の部位での細胞効果の遮断または抑制)である。例えば、野生型シグナル伝達物質は、受容体をアンタゴナイズするかあるいは阻害し得る。これらの実施形態では、変異は、受容体に対するアンタゴナイズ活性を低減または除去するように改変されたシグナル伝達物質をもたらす。例えば、変異は、標的細胞に低減された阻害シグナルを送るように改変されたシグナル伝達物質をもたらし得る、または阻害シグナルが除去され得る。種々の実施形態では、シグナル伝達物質は、1つまたは複数の変異に起因して拮抗性であり、例えば、アゴニストシグナル伝達物質はアンタゴニストシグナル伝達物質に変換され(例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第2015/007520号に記載のように)、また、このような変換されたシグナル伝達物質は、場合により、1つまたは複数のその受容体に対するその結合親和性または活性を低減する、または1つまたは複数のその受容体に対する結合親和性または活性を実質的に低減または除去する1つまたは複数の変異も有する。

0078

いくつかの実施形態では、受容体に対し低減された親和性または活性は、本明細書に記載の1つまたは複数の標的化部分(例えば、PD−1またはPD−L1に対する標的化部分)の結合により回復可能である。他の実施形態では、受容体に対し低減された親和性または活性は、1つまたは複数の標的化部分の活性により実質的に回復可能でない。

0079

種々の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、それらのシグナル伝達物質が受容体に対する結合親和性または活性を弱めるまたは除去する変異を有するという理由で、オフターゲット効果を低減させる。種々の実施形態では、例えば、野生型シグナル伝達物質と比べて、副作用におけるこの低減が観察される。種々の実施形態では、シグナル伝達物質は、標的細胞に対し活性である。理由は、標的化部分(単数または複数)が、実質的な活性化に必要とされる欠損した/不十分な結合(例えば、限定されないが、および/または結合力)を補償するためである。種々の実施形態では、改変シグナル伝達物質は、治療作用部位へ向かう途上では実質的に不活性であり、特異的に標的とされる細胞型に対してその効果を実質的に有し、これにより望ましくない副作用を大きく低減する。

0080

いくつかの実施形態では、シグナル伝達物質は、1つの受容体(すなわち、治療受容体)に対する結合または親和性を弱めるまたは低減させる1つまたは複数の変異および第2の受容体に対する結合または活性を実質的に低減または除去する1つまたは複数の変異を含み得る。このような実施形態では、これらの変異は、同じまたは異なる位置にあってよい(すなわち、同じ変異または複数の変異)。いくつかの実施形態では、1つの受容体に対し結合および/または活性を低減する変異(単数または複数)は、別の受容体に対し実質的に低減または除去する変異(単数または複数)とは異なる。いくつかの実施形態では、1つの受容体に対し結合および/または活性を低減する変異(単数または複数)は、別の受容体に対し実質的に低減または除去する変異(単数または複数)と同じである。いくつかの実施形態では、本キメラタンパク質は、治療受容体に対し結合および/または活性を弱めしたがってより制御されたオンターゲット治療効果(例えば、野生型シグナル伝達物質に比較して)を可能にする変異および、別の受容体に対する結合および/または活性を実質的に低減または除去ししたがって副作用を低減する(例えば、野生型シグナル伝達物質に比べて)変異の両方を有する改変シグナル伝達物質を有する。

0081

いくつかの実施形態では、結合または活性の実質的な低減または除去は、標的化部分(PD−1またはPD−L1に対する標的化部分または本明細書に記載の任意のその他の標的化部分)を用いて実質的に回復可能ではない。いくつかの実施形態では、結合または活性の実質的な低減または除去は、標的化部分を用いて回復可能である。種々の実施形態では、第2の受容体に対する結合または活性の実質的な低減または除去は、他の受容体により媒介される有害作用も防止し得る。あるいは、または加えて、他の受容体に対する結合または活性の実質的な低減または除去は、治療作用部位から離れて治療キメラタンパク質を隔離するのを低減するかあるいは無くするので、治療効果を改善させる。例えば、いくつかの実施形態では、これは、他の受容体での損失を補償するための高用量の本発明のキメラタンパク質の必要性を無くする。このような投与量を低減する能力は、さらに副作用の可能性を低くする。

0082

種々の実施形態では、改変シグナル伝達物質は、1つまたは複数のその受容体に対し、シグナル伝達物質に、親和性、例えば、結合(例えば、KD)および/または活性化(例えば、改変シグナル伝達物質がその受容体のアゴニストである場合、例えば、KAおよび/またはEC50として測定可能である)および/または阻害(例えば、改変シグナル伝達物質がその受容体のアンタゴニストである場合、例えば、KIおよび/またはIC50として測定可能である)を低減、実質的に低減、または除去する1つまたは複数の変異を含む。種々の実施形態では、免疫調節薬の受容体に対する低減された親和性は、活性の減弱化(アゴニズムまたはアンタゴニズムを含む)を可能にする。このような実施形態では、改変シグナル伝達物質は、野生型シグナル伝達物質に比較して、受容体に対する約1%、または約3%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約10%〜20%、約20%〜40%、約50%、約40%〜60%、約60%〜80%、約80%〜100%の親和性を有する。いくつかの実施形態では、結合親和性は、野生型シグナル伝達物質に比べて、少なくとも約2倍低い、約3倍低い、約4倍低い、約5倍低い、約6倍低い、約7倍低い、約8倍低い、約9倍低い、少なくとも約10倍低い、少なくとも約15倍低い、少なくとも約20倍低い、少なくとも約25倍低い、少なくとも約30倍低い、少なくとも約35倍低い、少なくとも約40倍低い、少なくとも約45倍低い、少なくとも約50倍低い、少なくとも約100倍低い、少なくとも約150倍低い、または約10〜50倍低い、約50〜100倍低い、約100〜150倍低い、約150〜200倍低い、または200倍超低い。

0083

改変シグナル伝達物質が1つの受容体に対し結合を低減しかつ第2の受容体に対し結合を実質的に低減または除去する変異を有するいくつかの実施形態では、1つの受容体に対する改変シグナル伝達物質の結合親和性の減弱または低減は、他の受容体に対する親和性の実質的な低減または除去より小さい。いくつかの実施形態では、1つの受容体に対する改変シグナル伝達物質の結合親和性の減弱または低減は、他の受容体に対する親和性の実質的低減または除去よりも、約1%、または約3%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、または約95%だけ小さい。種々の実施形態では、実質的な低減または除去は、減弱または低減よりも大きい結合親和性および/または活性の低減を指す。

0084

種々の実施形態では、改変シグナル伝達物質は、例えば、野生型シグナル伝達物質に比べて、シグナル伝達物質の内在性活性を、約75%、または約70%、または約60%、または約50%、または約40%、または約30%、または約25%、または約20%、または約10%、または約5%、または約3%、または約1%に低減する1つまたは複数の変異を含む。

0085

いくつかの実施形態では、改変シグナル伝達物質は、シグナル伝達物質が、その受容体に対する標的化部分の結合親和性より低い、その受容体に対する低減された親和性を有するようにさせる1つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態では、この結合親和性の差異は、同じ細胞上のシグナル伝達物質/受容体と標的化部分/受容体との間に存在する。いくつかの実施形態では、この結合親和性の差異は、シグナル伝達物質、例えば、変異シグナル伝達物質が、局在化されたオンターゲット効果を有し、かつ野生型シグナル伝達物質で観察される副作用の根底にあるオフターゲット効果を最小化するのを可能にする。いくつかの実施形態では、この結合親和性は、少なくとも約2倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約15倍低い、または少なくとも約25倍、または少なくとも約50倍低い、または少なくとも約100倍、または少なくとも約150倍低い。

0086

受容体結合活性は、当該技術分野において既知の方法を使用して測定され得る。例えば、親和性および/または結合活性は、スキャッチャードプロット分析および結合データコンピューターフィッティング(例えば、Scatchard,1949)またはBrechtら(1993)により記載のように、フロースルー条件下で反射型干渉分光法により評価し得る。これらの文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

0087

種々の実施形態では、シグナル伝達物質は、免疫調節薬、例えば、インターロイキン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子のうちの1つまたは複数である。

0088

いくつかの実施形態では、シグナル伝達物質は、インターロイキンまたは改変インターロイキンであり、例えば、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36またはそのフラグメント、バリアント、類似体、またはファミリーメンバーを含む。インターロイキンは、リンパ球単球、およびマクロファージにより合成される多機能サイトカイン群である。既知の機能は、免疫細胞(例えば、ヘルパーT細胞、B細胞、好酸球、およびリンパ球)の増殖の刺激、好中球およびTリンパ球遊走作用、および/またはインターフェロンの阻害を含む。インターロイキン活性は、当該技術分野において既知のアッセイを使用して測定できる(Matthews et al.,in Lymphokines and Interferons:A Practical Approach,Clemens et al.,eds,IRL Press,Washington,D.C.1987,pp.221−225;and Orencole & Dinarello(1989)Cytokine 1,14−20)。

0089

いくつかの実施形態では、シグナル伝達物質は、インターフェロンまたはインターフェロンI、II、およびIII型などの改変型のインターフェロンである。インターフェロンの例としては、例えば、インターフェロンα−1、2、4、5、6、7、8、10、13、14、16、17、および21、インターフェロンβおよびインターフェロンγ、インターフェロンκ、インターフェロンε、インターフェロンτ、およびインターフェロンωが挙げられる。

0090

いくつかの実施形態では、シグナル伝達物質は、腫瘍壊死因子(TNF)または腫瘍壊死因子(TNF)の改変型またはTNFファミリーのタンパク質であり、限定されないが、TNFα、TNFβ、LTβ、CD40L、CD27L、CD30L、FASL、4−1BBL、OX40L、およびTRAILを含む。

0091

本明細書に記載の野生型シグナル伝達物質のアミノ酸配列は、当該技術分野において、周知である。したがって、種々の実施形態では、改変シグナル伝達物質は、本明細書に記載のシグナル伝達物質の既知の野生型アミノ酸配列との少なくとも約60%、または少なくとも約61%、または少なくとも約62%、または少なくとも約63%、または少なくとも約64%、または少なくとも約65%、または少なくとも約66%、または少なくとも約67%、または少なくとも約68%、または少なくとも約69%、または少なくとも約70%、または少なくとも約71%、または少なくとも約72%、または少なくとも約73%、または少なくとも約74%、または少なくとも約75%、または少なくとも約76%、または少なくとも約77%、または少なくとも約78%、または少なくとも約79%、または少なくとも約80%、または少なくとも約81%、または少なくとも約82%、または少なくとも約83%、または少なくとも約84%、または少なくとも約85%、または少なくとも約86%、または少なくとも約87%、または少なくとも約88%、または少なくとも約89%、または少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性(例えば、約60%、または約61%、または約62%、または約63%、または約64%、または約65%、または約66%、または約67%、または約68%、または約69%、または約70%、または約71%、または約72%、または約73%、または約74%、または約75%、または約76%、または約77%、または約78%、または約79%、または約80%、または約81%、または約82%、または約83%、または約84%、または約85%、または約86%、または約87%、または約88%、または約89%、または約90%、または約91%、または約92%、または約93%、または約94%、または約95%、または約96%、または約97%、または約98%、または約99%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含む。

0092

種々の実施形態では、改変シグナル伝達物質は、本明細書に記載のシグナル伝達物質のうちのいずれかのアミノ酸配列との少なくとも約60%、または少なくとも約61%、または少なくとも約62%、または少なくとも約63%、または少なくとも約64%、または少なくとも約65%、または少なくとも約66%、または少なくとも約67%、または少なくとも約68%、または少なくとも約69%、または少なくとも約70%、または少なくとも約71%、または少なくとも約72%、または少なくとも約73%、または少なくとも約74%、または少なくとも約75%、または少なくとも約76%、または少なくとも約77%、または少なくとも約78%、または少なくとも約79%、または少なくとも約80%、または少なくとも約81%、または少なくとも約82%、または少なくとも約83%、または少なくとも約84%、または少なくとも約85%、または少なくとも約86%、または少なくとも約87%、または少なくとも約88%、または少なくとも約89%、または少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性(例えば、約60%、または約61%、または約62%、または約63%、または約64%、または約65%、または約66%、または約67%、または約68%、または約69%、または約70%、または約71%、または約72%、または約73%、または約74%、または約75%、または約76%、または約77%、または約78%、または約79%、または約80%、または約81%、または約82%、または約83%、または約84%、または約85%、または約86%、または約87%、または約88%、または約89%、または約90%、または約91%、または約92%、または約93%、または約94%、または約95%、または約96%、または約97%、または約98%、または約99%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含む。

0093

種々の実施形態では、改変シグナル伝達物質は、1つまたは複数のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸変異は、置換、挿入、欠失、および短縮化から独立に選択され得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸変異はアミノ酸置換であり、本明細書の他の場所で記載のように、保存的置換および/または非保存的置換を含み得る。種々の実施形態では、本明細書の他の場所で記載のように、置換は非古典的アミノ酸も含んでよい。

0094

本明細書に記載のように、改変シグナル伝達物質は、1つまたは複数の受容体に対し親和性および/または活性に影響を与える変異を有する。種々の実施形態では、治療受容体、例えば、それにより目的の治療効果が媒介される(例えば、アゴニズムまたはアンタゴニズム)受容体に対する低減された親和性および/または活性が存在する。種々の実施形態では、改変シグナル伝達物質は、受容体、例えば、それにより目的の治療効果が媒介されない(例えば、結合の混乱状態の結果として)受容体に対する親和性および/または活性が実質的に低減または除去される変異を有する。改変シグナル伝達物質の受容体、例えば、本明細書に記載のサイトカイン、成長因子、およびホルモンのうちの1つの受容体は当技術分野において既知である。

0095

受容体に対し低減された親和性および/または活性(例えば、アゴニスト活性)をもたらす変異の例は、国際公開第2013/107791号および国際出願第PCT/EP2017/061544号(例えば、インターフェロンに関して)、国際公開第2015/007542号(例えば、インターロイキンに関して)、および国際公開第2015/007903号(例えば、TNFに関して)で見出され、これらのそれぞれの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。治療受容体に対する親和性および/または活性(例えば、アンタゴニスト活性)を低減する変異の例は、国際公開第2015/007520号で見出され、この全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

0096

いくつかの実施形態では、改変シグナル伝達物質は、シグナル伝達物質のI型サイトカイン受容体II型サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーの受容体、TGFベータ受容体、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーの受容体、および/またはチロシンキナーゼスーパーファミリーの受容体に対する親和性および/または活性を低減させる1つまたは複数の変異を含む。

0097

種々の実施形態では、シグナル伝達物質に対する受容体は、I型サイトカイン受容体である。I型サイトカイン受容体は当技術分野において既知であり、限定されないが、IL2(ベータサブユニット)、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL9、IL11、IL12、GM−CSF、G−CSF、LIF、CNTFに対する受容体、および同様に、トロンボポエチン(TPO)、プロラクチン、および成長ホルモンに対する受容体が挙げられる。例示I型サイトカイン受容体としては、限定されないが、GM−CSF受容体、G−CSF受容体、LIF受容体、CNTF受容体、TPO受容体、およびI型IL受容体が挙げられる。

0098

種々の実施形態では、シグナル伝達物質に対する受容体は、II型サイトカイン受容体である。II型サイトカイン受容体は、異種のサブユニットからなる多量体受容体であり、主にインターフェロンに対する受容体である。この受容体ファミリーは、限定されないが、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγ、IL10、IL22、および組織因子に対する受容体を含む。例示II型サイトカイン受容体としては、限定されないが、IFNα受容体(例えば、IFNAR1およびIFNAR2)、IFNβ受容体、IFNγ受容体(例えば、IFNGR1およびIFNGR2)、およびII型IL受容体が挙げられる。

0099

種々の実施形態では、シグナル伝達物質に対する受容体は、Gタンパク質共役受容体である。ケモカイン受容体は、7回膜貫通型構造を有し、シグナル伝達のためにGタンパク質に結合されるGタンパク質共役受容体である。ケモカイン受容体としては、限定されないが、CCケモカイン受容体、CXCケモカイン受容体、CX3Cケモカイン受容体、およびXCケモカイン受容体(XCR1)が挙げられる。代表的ケモカイン受容体には、限定されないが、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR3B、CXCR4、CXCR5、CSCR6、CXCR7、XCR1、およびCX3CR1が挙げられる。

0100

種々の実施形態では、シグナル伝達物質に対する受容体は、TNFRファミリーメンバーである。腫瘍壊死因子受容体(TNFR)ファミリーメンバーは、細長い分子を作成するCXXCXXCのコアモチーフを取り囲む3つのジスルフィド結合から形成されるシステインリッチドメインCRD)を共有する。代表的腫瘍壊死因子受容体ファミリーとしては、下記が挙げられる:CD120a(TNFRSF1A)、CD120b(TNFRSF1B)、リンホトキシンベータ受容体(LTBR、TNFRSF3)、CD134(TNFRSF4)、CD40(CD40、TNFRSF5)、FAS(FAS、TNFRSF6)、TNFRSF6B(TNFRSF6B)、CD27(CD27、TNFRSF7)、CD30(TNFRSF8)、CD137(TNFRSF9)、TNFRSF10A(TNFRSF10A)、TNFRSF10B(TNFRSF10B)、TNFRSF10C(TNFRSF10C)、TNFRSF10D(TNFRSF10D)、RANK(TNFRSF11A)、破骨細胞分化抑制因子(TNFRSF11B)、TNFRSF12A(TNFRSF12A)、TNFRSF13B(TNFRSF13B)、TNFRSF13C(TNFRSF13C)、TNFRSF14(TNFRSF14)、神経成長因子受容体(NGFR、TNFRSF16)、TNFRSF17(TNFRSF17)、TNFRSF18(TNFRSF18)、TNFRSF19(TNFRSF19)、TNFRSF21(TNFRSF21)、およびTNFRSF25(TNFRSF25)。ある実施形態では、TNFRファミリーメンバーは、CD120a(TNFRSF1A)またはTNF−R1である。別の実施形態では、TNFRファミリーメンバーは、CD120b(TNFRSF1B)またはTNF−R2である。

0101

種々の実施形態では、シグナル伝達物質に対する受容体は、TGFベータ受容体である。TGFベータ受容体は、1回膜貫通型セリントレオニンキナーゼ受容体である。TGFベータ受容体としては、限定されないが、TGFBR1、TGFBR2、およびTGFBR3が挙げられる。

0102

種々の実施形態では、シグナル伝達物質に対する受容体は、Igスーパーファミリー受容体である。免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーの受容体は、免疫グロブリンとの構造的相同性を共有する。Igスーパーファミリーの受容体としては、限定されないが、インターロイキン−1受容体、CSF−1R、PDGFR(例えば、PDGFRAおよびPDGFRB)、およびSCFRが挙げられる。

0103

種々の実施形態では、シグナル伝達物質に対する受容体は、チロシンキナーゼスーパーファミリー受容体である。チロシンキナーゼチロシンキナーゼスーパーファミリーの受容体は、当該技術分野において周知である。20のサブファミリーに分類される約58個の受容体チロシンキナーゼ(RTK)が存在する。チロシンキナーゼスーパーファミリーの受容体としては、限定されないが、FGF受容体およびそれらの種々のアイソフォーム、例えば、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、およびFGFR5が挙げられる。

0104

ある実施形態では、改変シグナル伝達物質はインターフェロンαである。このような実施形態では、改変IFNα物質は、IFNα/β受容体(IFNAR)、すなわち、IFNAR1および/またはIFNAR2鎖に対する低減された親和性および/または活性を有する。いくつかの実施形態では、改変IFNα物質は、IFNα/β受容体(IFNAR)、すなわち、IFNAR1および/またはIFNAR2鎖に対し、実質的に低減または除去された親和性および/または活性を有する。

0105

変異型のインターフェロンαは、当業者に既知である。ある例示的実施形態では、改変シグナル伝達物質は、配列番号317のアミノ酸配列を有するアレル型IFNα2aである。

0106

ある例示的実施形態では、改変シグナル伝達物質は、配列番号318(アミノ酸位置23でIFNα2aと異なる)のアミノ酸配列を有するアレル型のIFNα2bである。

0107

いくつかの実施形態では、上記IFNα2変異体(IFNα2aまたはIFNα2b)は、位置144〜154、例えば、アミノ酸位置148、149および/または153に、1つまたは複数のアミノ酸の変異が導入されている。いくつかの実施形態では、IFNα2変異体は、L153A、R149A、およびM148Aから選択される1つまたは複数の変異を含む。このような変異体は、例えば、国際公開第2013/107791号およびPiehlerら、(2000)J.Biol.Chem,275:40425−33に記載されている。これらの文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

0108

いくつかの実施形態では、IFNα2変異体は、IFNAR1に対する低減された親和性および/または活性を有する。いくつかの実施形態では、国際公開第2010/030671号に記載のように、IFNα2変異体は、F64A、N65A、T69A、L80A、Y85A、およびY89Aから選択される1つまたは複数の変異を含む。この特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

0109

いくつかの実施形態では、国際公開第2008/124086号に記載のように、IFNα2変異体は、K133A、R144A、R149A、およびL153Aから選択される1つまたは複数の変異を含む。この特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

0110

いくつかの実施形態では、国際公開第2015/007520号および国際公開第2010/030671号に記載のように、IFNα2変異体は、R120EおよびR120E/K121Eから選択される1つまたは複数の変異を含む。これらの特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。このような実施形態では、上記IFNα2変異体は、野生型IFNα2活性をアンタゴナイズする。このような実施形態では、上記変異体IFNα2は、IFNAR1に対する低減された親和性および/または活性を有するが、IFNAR2に対する活性は保持される。

0111

いくつかの実施形態では、ヒトIFNα2変異体は、(1)R120EおよびR120E/K121Eから選択される1つまたは複数の変異(理論に束縛されることを望むものではないが、これらはアンタゴニスト効果を作り出す)、および(2)K133A、R144A、R149A、およびL153Aから選択される1つまたは複数の変異(理論に束縛されることを望むものではないが、これらは、例えば、IFNAR2に対する減弱化効果を可能とする)を含む。ある実施形態では、ヒトIFNα2変異体は、R120EおよびL153Aを含む。

0112

いくつかの実施形態では、ヒトIFNα2変異体は、国際公開第2013/059885号に開示のように、L15A、A19W、R22A、R23A、L26A、F27A、L30A、L30V、K31A、D32A、R33K、R33A、R33Q、H34A、D35A、Q40A、D114R、L117A、R120A、R125A、K134A、R144A、A145G、A145M、M148A、R149A、S152A、L153A、およびN156Aから選択される1つまたは複数の変異を含み、この特許の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、国際公開第2013/059885号で開示のように、ヒトIFNα2変異体は、変異H57Y、E58N、Q61S、および/またはL30Aを含む。いくつかの実施形態では、国際公開第2013/059885号で開示のように、ヒトIFNα2変異体は、変異H57Y、E58N、Q61S、および/またはR33Aを含む。いくつかの実施形態では、国際公開第2013/059885号で開示のように、ヒトIFNα2変異体は、変異H57Y、E58N、Q61S、および/またはM148Aを含む。いくつかの実施形態では、国際公開第2013/059885号で開示のように、ヒトIFNα2変異体は、変異H57Y、E58N、Q61S、および/またはL153Aを含む。いくつかの実施形態では、国際公開第2013/059885号で開示のように、ヒトIFNα2変異体は、変異N65A、L80A、Y85A、および/またはY89Aを含む。いくつかの実施形態では、国際公開第2013/059885号で開示のように、ヒトIFNα2変異体は、変異N65A、L80A、Y85A、Y89Aおよび/またはD114Aを含む。

0113

ある実施形態では、改変シグナル伝達物質はインターフェロンβである。このような実施形態では、改変インターフェロンβ物質は、IFNα/β受容体(IFNAR)、すなわち、IFNAR1および/またはIFNAR2鎖に対する低減された親和性および/または活性を有する。いくつかの実施形態では、改変IFNβ物質は、IFNα/β受容体(IFNAR)、すなわち、IFNAR1および/またはIFNAR2鎖に対する実質的に低減または除去された親和性および/または活性を有する。

0114

ある実施形態では、改変シグナル伝達物質はIFNβである。種々の実施形態では、IFNβは、官能性誘導体、類似体、前駆物質、アイソフォーム、スプライスバリアント、またはIFNβのフラグメントを包含する。種々の実施形態では、IFNβは、任意の種由来のIFNβを包含する。ある実施形態では、キメラタンパク質は、改変型のマウスIFNβを含む。ある実施形態では、キメラタンパク質は、改変型のヒトIFNβを含む。ヒトIFNβは、166個のアミノ酸残基を含む約22kDaの分子量を有するポリペプチドである。ヒトIFNβのアミノ酸配列は、配列番号319である。

0115

いくつかの実施形態では、ヒトIFNβは、ヒトIFNβのグリコシル化型であるIFNβ1aである。いくつかの実施形態では、IFNβは、Met−1欠失およびCys−17のSerへの変異を有する非グリコシル化型のヒトIFNβであるIFNβ1bである。

0116

種々の実施形態では、改変IFNβは、IFNARのIFNAR1サブユニットに対するその結合または親和性を低減する1つまたは複数の変異を有する。一実施形態では、改変IFNβは、IFNAR1に対する低減された親和性および/または活性を有する。種々の実施形態では、改変IFNβは、ヒトIFNβであり、位置F67、R71、L88、Y92、I95、N96、K123、およびR124に1つまたは複数の変異を有する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の変異は、F67G、F67S、R71A、L88G、L88S、Y92G、Y92S、I95A、N96G、K123G、およびR124Gから選択される置換である。ある実施形態では、改変IFNβは、F67G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、K123G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、F67GおよびR71A変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、L88GおよびY92G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、Y92G、I95A、およびN96G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、K123GおよびR124G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、F67G、L88G、およびY92G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、F67S、L88S、およびY92S変異を含む。

0117

いくつかの実施形態では、改変IFNβは、IFNARのIFNAR2サブユニットに対するその結合または親和性を低減する1つまたは複数の変異を有する。一実施形態では、改変IFNβは、IFNAR2に対する低減された親和性および/または活性を有する。種々の実施形態では、改変IFNβは、ヒトIFNβであり、位置W22、R27、L32、R35、V148、L151、R152、およびY155に1つまたは複数の変異を有する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の変異は、W22G、R27G、L32A、L32G、R35A、R35G、V148G、L151G、R152A、R152G、およびY155Gから選択される置換である。ある実施形態では、改変IFNβは、W22G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、L32A変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、L32G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、R35A変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、R35G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、V148G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、R152A変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、R152G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、Y155G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、W22GおよびR27G変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、L32AおよびR35A変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、L151GおよびR152A変異を含む。ある実施形態では、改変IFNβは、V148GおよびR152A変異を含む。

0118

いくつかの実施形態では、改変IFNβは、1つまたは複数の次の変異を有する:R35A、R35T、E42K、M62I、G78S、A141Y、A142T、E149K、およびR152H。いくつかの実施形態では、改変IFNβは、1つまたは複数の次の変異を有する:C17SまたはC17Aと組み合わせた、R35A、R35T、E42K、M62I、G78S、A141Y、A142T、E149K、およびR152H。

0119

いくつかの実施形態では、改変IFNβは、1つまたは複数の次の変異を有する:本明細書で記載の他のIFNβ変異と組み合わせた、R35A、R35T、E42K、M62I、G78S、A141Y、A142T、E149K、およびR152H。

0120

ヒトIFNβの結晶構造は既知であり、Karpusas et al.,(1998)PNAS,94(22):11813−11818に記載されている。特に、ヒトIFNβの構造は、5つのαヘリックス(すなわち、A、B、C、D、およびE)およびこれらのヘリックスを連結する4つのループ領域(すなわち、AB、BC、CD、およびDEループ)を含むことが示された。種々の実施形態では、改変IFNβは、A、B、C、D、Eヘリックスおよび/またはAB、BC、CD、およびDEループ中に、IFNARなどの治療受容体に対するその結合親和性または活性を低減させる1つまたは複数の変異を有する。代表的変異は、国際公開第2000/023114号および米国特許出願公開第20150011732号に記載されている。これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。代表的実施形態では、改変IFNβは、アミノ酸位置15、16、18、19、22、および/または23にアラニン置換を含むヒトIFNβである。代表的実施形態では、改変IFNβは、アミノ酸位置28〜30、32、および33にアラニン置換を含むヒトIFNβである。代表的実施形態では、改変IFNβは、アミノ酸位置36、37、39、および42にアラニン置換を含むヒトIFNβである。代表的実施形態では、改変IFNβは、アミノ酸位置64および67にアラニン置換を含み、位置68にセリン置換を含むヒトIFNβである。代表的実施形態では、改変IFNβは、アミノ酸位置71〜73にアラニン置換を含むヒトIFNβである。代表的実施形態では、改変IFNβは、アミノ酸位置92、96、99、および100にアラニン置換を含むヒトIFNβである。代表的実施形態では、改変IFNβは、アミノ酸位置128、130、131、および134にアラニン置換を含むヒトIFNβである。代表的実施形態では、改変IFNβは、アミノ酸位置149、153、156、および159にアラニン置換を含むヒトIFNβである。いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびW22での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0121

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびR27での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0122

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびW22での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、さらにR27での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0123

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびL32での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0124

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびR35での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0125

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびL32での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、さらにR35での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0126

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびF67での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0127

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびR71での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0128

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびF67での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、さらにR71での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0129

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびL88での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0130

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびY92での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0131

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびF67での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、およびL88での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、およびY92での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0132

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびL88での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、さらにY92での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0133

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびI95での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、さらにY92での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0134

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびN96での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、さらにY92での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0135

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびY92での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、およびI95での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、およびN96での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0136

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびK123での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0137

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびR124での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0138

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号188およびK123での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、さらにR124での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0139

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびL151での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0140

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびR152での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0141

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびL151での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、さらにR152での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0142

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびV148での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、およびメチオニン(M)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0143

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびV148での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基であり、さらにR152での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0144

いくつかの実施形態では、変異体IFNβは、配列番号319およびY155での変異を含み、変異は、グリシン(G)、アラニン(A)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、およびバリン(V)から選択される脂肪族疎水性残基である。

0145

いくつかの実施形態では、本発明は、(1)配列番号319のアミノ酸配列および位置W22に変異を有し、変異は脂肪族疎水性残基である改変IFNβ;および(b)1つまたは複数の標的化部分を含むキメラタンパク質に関し、上記標的化部分は、目的の抗原または受容体(例えば、PD−1またはPD−L1)に特異的に結合する認識ドメインを含み、改変IFNβおよび標的化部分は、任意に1つまたは複数のリンカーにより連結されていてもよい。種々の実施形態では、位置W22の変異は、G、A、L、I、M、およびVから選択される脂肪族疎水性残基である。種々の実施形態では、位置W22の変異はGである。

0146

追加の代表的IFNβ変異体は、国際出願第PCT/EP2017/061544号で提供される。この全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

0147

ある実施形態では、改変シグナル伝達物質はインターフェロンγである。このような実施形態では、改変インターフェロンγ物質は、インターフェロンガンマ受容体(IFNGR)、すなわち、IFNGR1および/またはIFNGR2鎖に対し、低減された親和性および/または活性を有する。いくつかの実施形態では、改変インターフェロンγ物質は、インターフェロンガンマ受容体(IFNGR)、すなわち、IFNGR1および/またはIFNGR2鎖に対し、実質的に低減または除去された親和性および/または活性を有する。

0148

IFNγは、II型クラスのインターフェロンの唯一メンバーである。IFNγは、主にナチュラルキラー(NK)細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞により自然免疫応答の一部として産生される。IFNγは、CD4 Th1およびCD8細胞傷害性Tリンパ球(CTL)エフェクターT細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびB細胞によっても産生される。活性化されたIFNγは、二量体を形成し、IFNγ受容体1およびIFNγ受容体2サブユニットからなるヘテロダイマー受容体(すなわち、IFNγまたはIFNγR)を介して作用する。IFNγ受容体1は、主要なリガンド結合サブユニットであり、一方、IFNγ受容体2は、シグナル伝達に必要であり、また、IFNγ受容体1のそのリガンドに対する親和性を高める。IFNγ二量体の受容体に対する結合は、JAK−STATシグナル伝達経路活性化し、種々の生物学的作用を誘発する。

0149

種々の実施形態では、改変シグナル伝達物質は、改変型のIFNγをシグナル伝達物質として含む。種々の実施形態では、IFNγは、官能性誘導体、類似体、前駆物質、アイソフォーム、スプライスバリアント、またはIFNγのフラグメントを包含する。種々の実施形態では、IFNγは、任意の種由来のIFNγを包含する。ある実施形態では、改変シグナル伝達物質は、改変型のマウスIFNγを含む。別の実施形態では、改変シグナル伝達物質は、改変型のヒトIFNγを含む。

0150

ヒトIFNγは、166個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。ある実施形態では、ヒトIFNγは、配列番号320のアミノ酸配列を有する。

0151

本明細書で使用される場合、ヒトIFNγはまた、N末端シグナルペプチドのない成熟ヒトIFNγを指す。この実施形態では、成熟ヒトIFNγは、143個のアミノ酸を含み、配列番号321のアミノ酸配列を有する。

0152

いくつかの実施形態では、ヒトIFNγは、グリコシル化型のヒトIFNγである。いくつかの実施形態では、ヒトIFNγは、非グリコシル化型のヒトIFNγである。

0153

IFNγの配列は、当技術分野において既知である種々の実施形態では、改変IFNγは、IFNγの既知の野生型アミノ酸配列と少なくとも約60%、または少なくとも約61%、または少なくとも約62%、または少なくとも約63%、または少なくとも約64%、または少なくとも約65%、または少なくとも約66%、または少なくとも約67%、または少なくとも約68%、または少なくとも約69%、または少なくとも約70%、または少なくとも約71%、または少なくとも約72%、または少なくとも約73%、または少なくとも約74%、または少なくとも約75%、または少なくとも約76%、または少なくとも約77%、または少なくとも約78%、または少なくとも約79%、または少なくとも約80%、または少なくとも約81%、または少なくとも約82%、または少なくとも約83%、または少なくとも約84%、または少なくとも約85%、または少なくとも約86%、または少なくとも約87%、または少なくとも約88%、または少なくとも約89%、または少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性(例えば、約60%、または約61%、または約62%、または約63%、または約64%、または約65%、または約66%、または約67%、または約68%、または約69%、または約70%、または約71%、または約72%、または約73%、または約74%、または約75%、または約76%、または約77%、または約78%、または約79%、または約80%、または約81%、または約82%、または約83%、または約84%、または約85%、または約86%、または約87%、または約88%、または約89%、または約90%、または約91%、または約92%、または約93%、または約94%、または約95%、または約96%、または約97%、または約98%、または約99%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含む。

0154

いくつかの実施形態では、改変IFNγは、配列番号320のアミノ酸配列を有するヒトIFNγと少なくとも約60%、または少なくとも約61%、または少なくとも約62%、または少なくとも約63%、または少なくとも約64%、または少なくとも約65%、または少なくとも約66%、または少なくとも約67%、または少なくとも約68%、または少なくとも約69%、または少なくとも約70%、または少なくとも約71%、または少なくとも約72%、または少なくとも約73%、または少なくとも約74%、または少なくとも約75%、または少なくとも約76%、または少なくとも約77%、または少なくとも約78%、または少なくとも約79%、または少なくとも約80%、または少なくとも約81%、または少なくとも約82%、または少なくとも約83%、または少なくとも約84%、または少なくとも約85%、または少なくとも約86%、または少なくとも約87%、または少なくとも約88%、または少なくとも約89%、または少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性(例えば、約60%、または約61%、または約62%、または約63%、または約64%、または約65%、または約66%、または約67%、または約68%、または約69%、または約70%、または約71%、または約72%、または約73%、または約74%、または約75%、または約76%、または約77%、または約78%、または約79%、または約80%、または約81%、または約82%、または約83%、または約84%、または約85%、または約86%、または約87%、または約88%、または約89%、または約90%、または約91%、または約92%、または約93%、または約94%、または約95%、または約96%、または約97%、または約98%、または約99%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含む。

0155

いくつかの実施形態では、改変IFNγは、配列番号321のアミノ酸配列を有するヒトIFNγと少なくとも約60%、または少なくとも約61%、または少なくとも約62%、または少なくとも約63%、または少なくとも約64%、または少なくとも約65%、または少なくとも約66%、または少なくとも約67%、または少なくとも約68%、または少なくとも約69%、または少なくとも約70%、または少なくとも約71%、または少なくとも約72%、または少なくとも約73%、または少なくとも約74%、または少なくとも約75%、または少なくとも約76%、または少なくとも約77%、または少なくとも約78%、または少なくとも約79%、または少なくとも約80%、または少なくとも約81%、または少なくとも約82%、または少なくとも約83%、または少なくとも約84%、または少なくとも約85%、または少なくとも約86%、または少なくとも約87%、または少なくとも約88%、または少なくとも約89%、または少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性(例えば、約60%、または約61%、または約62%、または約63%、または約64%、または約65%、または約66%、または約67%、または約68%、または約69%、または約70%、または約71%、または約72%、または約73%、または約74%、または約75%、または約76%、または約77%、または約78%、または約79%、または約80%、または約81%、または約82%、または約83%、または約84%、または約85%、または約86%、または約87%、または約88%、または約89%、または約90%、または約91%、または約92%、または約93%、または約94%、または約95%、または約96%、または約97%、または約98%、または約99%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含む。

0156

種々の実施形態では、改変IFNγは、1つまたは複数のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸変異は、置換、挿入、欠失、および短縮化から独立に選択され得る。

0157

いくつかの実施形態では、アミノ酸変異は、アミノ酸置換であり、保存的および/または非保存的置換を含み得る。

0158

「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒特性における類似性に基づいて行われ得る。20種類の天然アミノ酸は、次の6つの標準的アミノ酸グループに分類できる:(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr;Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)塩基性:His、Lys、Arg;(5)鎖配向に影響を与える残基:Gly、Pro;および(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。

0159

本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、あるアミノ酸の、上記6つの標準的アミノ酸グループの同じグループ内に記載の別のアミノ酸による交換として定義される。例えば、AspのGluによる交換は、そのように改変されたポリペプチド中で1つの負電荷を保持する。さらに、グリシンおよびプロリンは、それらのαヘリックスを破壊する能力に基づいて相互に置換され得る。

0160

本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、あるアミノ酸の、上記6つの標準的アミノ酸グループ(1)〜(6)の異なるグループに記載の別のアミノ酸による交換として定義される。

0161

種々の実施形態では、置換はまた、非古典的アミノ酸(例えば、セレノシステイン、ピロールリジン、N−ホルミルメチオニンβ−アラニン、GABAおよびδ−アミノレブリン酸、4−アミノ安息香酸(PABA)、共通アミノ酸のD−異性体、2,4−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、4−アミノ酪酸、Abu、2−アミノ酪酸、γ−Abu、ε−Ahx、6−アミノヘキサン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、C α−メチルアミノ酸、N α−メチルアミノ酸、および一般的にアミノ酸類似体)も含む。

0162

種々の実施形態では、IFNγは、1つまたは複数の変異を有するように改変されている。いくつかの実施形態では、変異は改変IFNγが、非変異型、例えば、野生型形態のIFNγに比べて、低減された結合親和性、低減された内在性活性、および低減された特定の生物活性のうちの1つまたは複数などの1つまたは複数の弱められた活性を有することを可能にする。例えば、非変異型、例えば、野生型のIFNγに比べて、低減された結合親和性、低減された内在性活性、および低減した特定の生物活性などの1つまたは複数の弱められた活性は、IFNγ受容体などの治療受容体に対するものであり得る。結果として、種々の実施形態では、変異は、改変可溶性物質が、非変異型、例えば、野生型IFNγに比べて、低減された全身毒性、低減された副作用、および低減されたオフターゲット効果を有することを可能にする。

0163

種々の実施形態では、IFNγは、IFNγ受容体1およびIFNγ受容体2サブユニットを含むIFNγ受容体などの治療受容体に対するその結合親和性および/または活性を低減する変異を有するように改変されている。いくつかの実施形態では、野生型IFNγにより与えられる活性は、治療受容体に対するアゴニズム(例えば、治療の部位での細胞効果の活性化)である。例えば、野生型IFNγは、治療受容体を活性化し得る。このような実施形態では、変異は、治療受容体に対する活性化作用を低減するように改変されたIFNγをもたらす。

0164

いくつかの実施形態では、治療受容体(例えば、IFNγ受容体)に対する低減された親和性および/または活性は、標的化部分の結合により回復可能である。他の実施形態では、治療受容体に対する低減された親和性および/または活性は、標的化部分への結合により実質的に回復され得ない。種々の実施形態では、本発明の治療キメラタンパク質は、IFNγが治療受容体に対する結合親和性および/または活性を弱める変異を有するという理由で、オフターゲット効果を低減する。種々の実施形態では、これは、例えば、野生型IFNγで観察される副作用を低減する。種々の実施形態では、改変IFNγは、治療作用部位へ向かう途上では実質的に不活性であり、特異的に標的とされる細胞型に対してその効果を実質的に有し、これにより望ましくない副作用を大きく低減する。

0165

種々の実施形態では、改変IFNγは、IFNγに、1つまたは複数の治療受容体(例えば、IFNγ受容体)に対して、弱められたまたは低減された親和性および/または活性、例えば、結合(例えば、KD)および/または活性化(例えば、KAおよび/またはEC50として測定可能な)を持たせる1つまたは複数の変異を有する。種々の実施形態では、治療受容体に対する低減された親和性および/または活性は、治療受容体からの活性および/またはシグナル伝達の減弱化を可能にする。

0166

種々の実施形態では、改変IFNγは、IFNγ受容体1サブユニットに対するその結合または親和性および/または生物活性を低減する1つまたは複数の変異を有する。一実施形態では、改変IFNγは、IFNγ受容体1サブユニットに対する低減された親和性および/または活性を有する。種々の実施形態では、改変IFNγは、IFNγ受容体1サブユニットに対する結合に関与するアミノ酸残基で1つまたは複数の変異を有するヒトIFNγである。いくつかの実施形態では、改変IFNγは、IFNγ受容体1サブユニットとの境界に位置するアミノ酸で1つまたは複数の変異を有するヒトIFNγである。種々の実施形態では、1つまたは複数の変異は、限定されないが、Q1、V5、E9、K12、H19、S20、V22、A23、D24、N25、G26、T27、L30、K108、H111、E112、I114、Q115、A118、E119、およびK125から選択されるアミノ酸の位置に存在する(それぞれ、N末端シグナル配列を欠いている野生型ヒトIFNγである配列番号321を基準にして)。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の変異は、V5E、S20E、V22A、A23G、A23F、D24G、G26Q、H111A、H111D、I114A、Q115A、およびA118Gから選択される置換である(それぞれ、配列番号321を基準にして)。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の変異は、V22A、A23G、D24G、H111A、H111D、I114A、Q115A、およびA118Gから選択される置換である。

0167

ある実施形態では、改変IFNγは、変異A23GおよびD24Gを含む。別の実施形態では、改変IFNγは、変異I114AおよびA118Gを含む。さらなる実施形態では、改変IFNγは、変異V5E、S20E、A23F、およびG26Qを含む。

0168

種々の実施形態では、改変IFNγは、1つまたは複数の次記変異を有する:残基A23の欠失、残基D24の欠失、S20I置換、A23V弛緩、D21K置換およびD24A置換。

0169

いくつかの実施形態では、改変IFNγは、IFNγ受容体2サブユニットに対するその結合または親和性および/または生物活性を低減する1つまたは複数の変異を有する。

0170

いくつかの実施形態では、改変IFNγは、IFNγ受容体1およびIFNγ受容体2サブユニットの両方に対するその結合または親和性および/または生物活性を低減する1つまたは複数の変異を有する。

0171

いくつかの実施形態では、改変IFNγは、IFNγ受容体1に対するその結合または親和性および/または生物活性を低減する1つまたは複数の変異、およびIFNγ受容体2に対する結合またはその親和性および/または生物活性を実質的に低減または除去する1つまたは複数の変異を有する。いくつかの実施形態では、このような改変IFNγを有するキメラタンパク質は、標的選択的IFNγ受容体1活性を提供できる(例えば、IFNγ受容体1活性は、標的化部分を介する標的化により回復可能である)。

0172

いくつかの実施形態では、改変IFNγは、IFNγ受容体1に対するその結合または親和性および/または生物活性を低減する1つまたは複数の変異、およびIFNγ受容体1に対する結合またはその親和性および/または生物活性を低減する1つまたは複数の変異を有する。いくつかの実施形態では、このような改変IFNγを有するキメラタンパク質は、標的選択的IFNγ受容体1および/またはIFNγ受容体1活性を提供できる(例えば、IFNγ受容体1およびIFNγ受容体2活性は、標的化部分を介する標的化により回復可能である)。

0173

種々の実施形態では、改変IFNγは、C末端で短縮化されている。いくつかの実施形態では、改変IFNγは、C末端の欠失を有する配列番号321のアミノ酸配列を含む成熟IFNγである。このような実施形態では、成熟IFNγは、少なくとも約1個、約2個、約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、または約25個のアミノ酸残基のC末端短縮化を含み得る。ある実施形態では、改変IFNγは、5個のアミノ酸のC末端の欠失を有する配列番号321のアミノ酸配列を含む成熟IFNγである。ある実施形態では、改変IFNγは、7個のアミノ酸のC末端の欠失を有する配列番号321のアミノ酸配列を含む成熟IFNγである。ある実施形態では、改変IFNγは、14個のアミノ酸のC末端の欠失を有する配列番号321のアミノ酸配列を含む成熟IFNγである。ある実施形態では、改変IFNγは、15個のアミノ酸のC末端の欠失を有する配列番号321のアミノ酸配列を含む成熟IFNγである。ある実施形態では、改変IFNγは、16個のアミノ酸のC末端の欠失を有する配列番号321のアミノ酸配列を含む成熟IFNγである。本発明で利用し得るC末端短縮化を有するさらなる改変IFNγは、Haelewyn et al.,Biochem.J.(1997),324:591−595およびLundell et al.,Protein Eng.(1991)4:335−341に記載されている。これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

0174

種々の実施形態では、改変IFNγは、例えば、Randal et al.(2001)Structure 9:155−163およびRandal et al.(1998)Protein Sci.7:1057−1060に記載されているように、単鎖IFNγである。これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、単鎖IFNγは、C末端で第2のIFNγ鎖のN−末端に連結された第1のIFNγ鎖を含む。種々の実施形態では、第1と第2のIFNγ鎖は、本明細書で他の場所で記載のように、リンカーにより連結される。

0175

いくつかの実施形態では、第1のIFNγ鎖は、少なくとも約1個、約2個、約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、または約25個のアミノ酸残基のC末端短縮化を含む。ある実施形態では、第1のIFNγ鎖は、約24個のアミノ酸残基のC末端短縮化を含む。いくつかの実施形態では、第2のIFNγは、少なくとも約1個、約2個、約3個、約4個、または約5個のアミノ酸残基のN末端短縮化を含む。ある実施形態では、第2のIFNγ鎖は、約3個のアミノ酸残基のN末端短縮化を含む。いくつかの実施形態では、第2のIFNγ鎖は、少なくとも約1個、約2個、約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、または約25個のアミノ酸残基のC末端短縮化を含む。種々の実施形態では、第1および/または第2のIFNγ鎖は、本明細書の別の場所で記載のように、Q1、V5、E9、K12、H19、S20、V22、A23、D24、N25、G26、T27、L30、K108、H111、E112、I114、Q115、A118、E119、およびK125の位置に1つまたは複数のアミノ酸変異を有する。種々の実施形態では、第1および/または第2のIFNγ鎖は、V5E、S20E、V22A、A23G、A23F、D24G、G26Q、H111A、H111D、I114A、Q115A、およびA118Gから選択される1つまたは複数の置換を含む。種々の実施形態では、第1および/または第2のIFNγ鎖は、V22A、A23G、D24G、H111A、H111D、I114A、Q115A、およびA118Gから選択される1つまたは複数の置換を含む。種々の実施形態では、第1および/または第2のIFNγ鎖は、A23GおよびD24G置換を含む。種々の実施形態では、第1および/または第2のIFNγ鎖は、I114AおよびA118G置換を含む。別の実施形態では、変異は、V5E、S20E、A23F、およびG26Qである。

0176

種々の実施形態では、第1および/または第2のIFNγ鎖は、本明細書で開示の1つまたは複数の置換を含み、さらに第1および/または第2のIFNγ鎖は、本明細書で開示のC末端短縮化を含む。

0177

種々の実施形態では、第1および/または第2のIFNγ鎖は、1つまたは複数の本明細書で開示の置換および本明細書で開示のC末端短縮化を含む。

0178

ヒトIFNγの結晶構造は既知であり、例えば、Ealick et al.,(1991)Science,252:698−702に記載されている。特に、ヒトIFNγの構造は、6個のαヘリックスのコアおよびC末端領域における延長されたアンフォールド配列を含むことが示された。種々の実施形態では、改変IFNγは、治療受容体(例えば、IFNγ受容体)に対するその結合親和性および/または生物活性を低減する1つまたは複数のヘリックス中の1つまたは複数の変異を有する。

0179

種々の実施形態では、改変IFNγは、野生型IFNγに比較して、約1%、または約3%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約10%〜20%、約20%〜40%、約50%、約40%〜60%、約60%〜80%、約80%〜100%の治療受容体(例えば、IFNγ受容体またはそのIFNγ受容体1およびIFNγ受容体2サブユニットのうちのいずれか1つ)に対する親和性および/または生物活性を有する。いくつかの実施形態では、結合親和性および/または生物活性は、野生型IFNγに比べて、少なくとも約2倍低い、約3倍低い、約4倍低い、約5倍低い、約6倍低い、約7倍低い、約8倍低い、約9倍低い、少なくとも約10倍低い、少なくとも約15倍低い、少なくとも約20倍低い、少なくとも約25倍低い、少なくとも約30倍低い、少なくとも約35倍低い、少なくとも約40倍低い、少なくとも約45倍低い、少なくとも約50倍低い、少なくとも約100倍低い、少なくとも約150倍低い、または約10〜50倍低い、約50〜100倍低い、約100〜150倍低い、約150〜200倍低い、または200倍超低い。

0180

種々の実施形態では、改変IFNγは、例えば、野生型IFNγに比べて、IFNγの内在性活性を、約75%、または約70%、または約60%、または約50%、または約40%、または約30%、または約25%、または約20%、または約10%、または約5%、または約3%、または約1%に低減する1つまたは複数の変異を含む。

0181

いくつかの実施形態では、改変IFNγは、IFNγに受容体に対する親和性および/または生物活性を低減させる1つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態では、改変IFNγの受容体に対する結合親和性および/または生物活性は、標的化部分のその受容体に対する結合親和性および/または生物活性より低い。いくつかの実施形態では、この結合親和性および/または生物活性の差異は、同じ細胞上の改変IFNγ/受容体と標的化部分/受容体との間に存在する。いくつかの実施形態では、この結合親和性および/または生物活性の差異は、改変IFNγが、局在化されたオンターゲット効果を有し、さらに野生型IFNγで観察される副作用の根底にあるオフターゲット効果を最小化するのを可能にする。いくつかの実施形態では、この結合親和性および/または生物活性は、少なくとも約2倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約15倍低い、または少なくとも約25倍、または少なくとも約50倍低い、または少なくとも約100倍、または少なくとも約150倍低い。

0182

受容体結合活性は、当該技術分野において既知の方法を使用して測定され得る。例えば、親和性および/または結合活性は、スキャッチャードプロット分析および結合データのコンピューターフィッティング(例えば、Scatchard,1949)またはBrechtら(1993)により記載のように、フロースルー条件下で反射型干渉分光法により評価し得る。これらの文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

0183

いくつかの実施形態では、改変シグナル伝達物質はコンセンサスインターフェロンである。コンセンサスインターフェロンは、いくつかのヒト非アレルIFNαサブタイプの配列を走査し、それぞれ対応する位置で最も高頻度に観察されるアミノ酸を割り当てることにより、生成される。コンセンサスインターフェロンは、166個のアミノ酸のうちの20個でIFNα2bとは異なり(88%相同性)、IFNβとの比較は、30%を超えるアミノ酸位置で同一性を示す。種々の実施形態では、コンセンサスインターフェロンは、配列番号322のアミノ酸配列を含む。

0184

いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンは、配列番号323のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号322のアミノ酸配列とは、1つのアミノ酸だけ異なり、すなわち、配列番号323は、配列番号322の最初のメチオニン残基を欠いている。

0185

種々の実施形態では、コンセンサスインターフェロンは、改変型のコンセンサスインターフェロン、すなわち、コンセンサスインターフェロンバリアントをシグナル伝達物質として含む。種々の実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、機能性誘導体、類似体、前駆物質、アイソフォーム、スプライスバリアント、またはコンセンサスインターフェロンのフラグメントを包含する。

0186

ある実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、米国特許第4,695,623号、同第4,897,471号、同第5,541,293号、および同第8,496,921号で開示されるコンセンサスインターフェロンバリアントから選択される。これらの文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。例えば、コンセンサスインターフェロンバリアントは、米国特許第4,695,623号、同第4,897,471号、および同第5,541,293号で開示のような、IFN−CON2またはIFNCON3のアミノ酸配列を含み得る。ある実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、IFN−CON2のアミノ酸配列、配列番号324を含む。

0187

ある実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、IFN−CON3のアミノ酸配列、配列番号325を含む。

0188

ある実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、米国特許第8,496,921号で開示のバリアントのうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む。例えば、コンセンサスバリアントは、配列番号326のアミノ酸配列を含み得る。

0189

別の実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、配列番号327のアミノ酸配列を含み得る。

0190

いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、ペグ化され得、すなわち、PEG部分を含む。ある実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、配列番号327のS156Cの位置で結合されたPEG部分を含み得る。

0191

いくつかの実施形態では、遺伝子改変インターフェロンは、ヒトIFNα2aのバリアントであり、配列番号328の配列の位置41の近傍へのAspの挿入により配列番号329が得られ(これはIFNα2a配列に対する配列の再番号割当をもたらす)、次の変異Arg23Lys、Leu26Pro、Glu53Gln、Thr54Ala、Pro56Ser、Asp86Glu、Ile104Thr、Gly106Glu、Thr110Glu、Lys117Asn、Arg125Lys、およびLys136Thrを有する。コンセンサスインターフェロンについて記載する本明細書の全ての実施形態は、同様に、この遺伝子改変インターフェロンに該当する。

0192

種々の実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、1つまたは複数のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸変異は、置換、挿入、欠失、および短縮化から独立に選択され得る。

0193

いくつかの実施形態では、アミノ酸変異は、アミノ酸置換であり、保存的および/または非保存的置換を含み得る。

0194

種々の実施形態では、置換はまた、非古典的アミノ酸(例えば、セレノシステイン、ピロールリジン、N−ホルミルメチオニンβ−アラニン、GABAおよびδ−アミノレブリン酸、4−アミノ安息香酸(PABA)、共通アミノ酸のD−異性体、2,4−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、4−アミノ酪酸、Abu、2−アミノ酪酸、γ−Abu、ε−Ahx、6−アミノヘキサン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、C α−メチルアミノ酸、N α−メチルアミノ酸、および一般的にアミノ酸類似体)も含む。

0195

種々の実施形態では、コンセンサスインターフェロンは、1つまたは複数の変異を有するように改変されている。いくつかの実施形態では、変異はコンセンサスインターフェロンバリアントが、非変異型、例えば、野生型のコンセンサスインターフェロン(例えば、配列番号325または326のアミノ酸配列を有するコンセンサスインターフェロン)に比べて、低減された結合親和性、低減された内在性活性、および低減された特定の生物活性のうちの1つまたは複数などの1つまたは複数の弱められた活性を有することを可能にする。例えば、非変異型、例えば、野生型のコンセンサスインターフェロンに比べて、低減された結合親和性、低減された内在性活性、および低減した特定の生物活性などの1つまたは複数の弱められた活性は、IFNARなどの治療受容体に対するものであり得る。結果として、種々の実施形態では、変異は、コンセンサスインターフェロンバリアントが、非変異型、例えば、野生型のコンセンサスインターフェロンに比べて、低減された全身毒性、低減された副作用、および低減されたオフターゲット効果を有することを可能にする。

0196

種々の実施形態では、コンセンサスインターフェロンは、IFNARなどの治療受容体に対するその結合親和性または活性を低減する変異を有するように改変されている。いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンにより与えられる活性は、治療受容体に対するアゴニズム(例えば、治療の部位での細胞効果の活性化)である。例えば、コンセンサスインターフェロンは、治療受容体を活性化し得る。このような実施形態では、変異は、治療受容体に対し低減された活性化作用を有するコンセンサスインターフェロンバリアントをもたらす。

0197

いくつかの実施形態では、治療受容体に対する低減された親和性または活性は、標的化部分の結合により回復可能である。他の実施形態では、治療受容体に対する低減された親和性または活性は、標的化部分への結合により実質的に回復され得ない。種々の実施形態では、本発明の治療Fcベースキメラタンパク質は、コンセンサスインターフェロンバリアントが、治療受容体に対する結合親和性または活性を弱める変異を有するという理由で、オフターゲット効果を低減させる。種々の実施形態では、これは、例えば、野生型コンセンサスインターフェロンで観察される副作用を低減する。種々の実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、治療作用部位へ向かう途上では実質的に不活性であり、特異的に標的とされる細胞型に対してその効果を実質的に有し、これにより望ましくない副作用を大きく低減する。

0198

種々の実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、コンセンサスインターフェロンバリアントが、1つまたは複数の治療受容体に対する弱められたまたは低減された親和性、例えば、結合(例えば、KD)および/または活性化(例えば、KAおよび/またはEC50として測定可能な)を有するようにさせる1つまたは複数の変異を有する。種々の実施形態では、治療受容体に対する低減された親和性は、治療受容体からの活性および/またはシグナル伝達の減弱化を可能にする。

0199

種々の実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、IFNARのIFNAR1サブユニットに対するその結合または親和性を低減する1つまたは複数の変異を有する。一実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、IFNAR1に対する低減された親和性および/または活性を有する。いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、IFNARのIFNAR2サブユニットに対するその結合または親和性を低減する1つまたは複数の変異を有する。いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、IFNAR1およびIFNAR2サブユニットに対するその結合または親和性を低減する1つまたは複数の変異を有する。

0200

いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、IFNAR1に対するその結合または親和性を低減する1つまたは複数の変異、およびIFNAR2に対する結合またはその親和性を実質的に低減または除去する1つまたは複数の変異を有する。いくつかの実施形態では、このようなコンセンサスインターフェロンバリアントを有するFcベースキメラタンパク質は、標的選択的IFNAR1活性を提供できる(例えば、IFNAR1活性は、標的化部分、例えば、SIRPαを介する標的化により回復可能である)。

0201

いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、IFNAR2に対するその結合または親和性を低減する1つまたは複数の変異、およびIFNAR1に対する結合またはその親和性を実質的に低減または除去する1つまたは複数の変異を有する。いくつかの実施形態では、このようなコンセンサスインターフェロンバリアントを有するFcベースキメラタンパク質は、標的選択的IFNAR2活性を提供できる(例えば、IFNAR2活性は、標的化部分、例えば、SIRPαを介する標的化により回復可能である)。

0202

いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンバリアントは、IFNAR1に対するその結合または親和性を低減する1つまたは複数の変異、およびIFNAR2に対するその結合または親和性を低減する1つまたは複数の変異を有する。いくつかの実施形態では、このようなコンセンサスインターフェロンバリアントを有するFcベースキメラタンパク質は、標的選択的IFNAR1および/またはIFNAR2活性を提供できる(例えば、IFNAR1およびIFNAR2活性は、標的化部分、例えば、SIRPαを介する標的化により回復可能である)。

0203

いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンは、配列番号326を基準にして、位置145〜155、例えば、アミノ酸位置149、150および/または154に、1つまたは複数のアミノ酸の変異を有するように改変されている。いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンは、配列番号326を基準にして、位置145〜155、例えば、アミノ酸位置149、150および/または154に、1つまたは複数のアミノ酸の変異を有するように改変され、場合により、置換は疎水性であり、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択される。いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロン変異体は、配列番号323を基準にして、M149A、R150A、およびL154Aから選択される1つまたは複数の変異を含む。

0204

いくつかの実施形態では、コンセンサスインターフェロンは、配列番号323を基準にして、アミノ酸位置121(すなわち、K121)に変異を有するように改変されている。ある実施形態では、コンセンサスインターフェロンは、配列番号323を基準にして、K121E変異を含む。

0205

いくつかの実施形態では、改変シグナル伝達物質は、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)である。VEGFは、生理学的であるが病的でもある血管新生において重要な役割を果たし、血管透過性を調節し、VEGF受容体を発現する細胞に対して成長因子として作用できる、強力な成長因子である。さらなる機能は、特に、マクロファージ系統および内皮細胞細胞遊走の刺激を含む。少なくとも3個の受容体(VEGFR1、VEGFR2およびVEGFR3)に加えて、VEGF成長因子ファミリーのいくつかのメンバーが存在する。VEGFファミリーのメンバーは、2種以上のVEGFRタイプを結合し活性化できる。例えば、VEGF−Aは、VEGFR1およびVEGFR2を結合し、一方、VEGF−Cは、VEGFR2およびVEGFR3を結合できる。VEGFR1およびVEGFR2活性化は、血管新生を調節し、VEGFR3活性化は、リンパ脈管新生に関与する。大部分の血管新生促進シグナルは、VEGFR2の活性化から生成される。VEGFR1活性化は、血管新生の負の役割と関連する可能性があることが報告された。VEGFR1シグナル伝達は、腫瘍骨髄由来VEGFR1陽性細胞を介したインビボ進行にも重要である(骨中の転移微小環境の形成の一因となる)ことも報告された。治療抗体指向する/治療抗体を中和するVEGF−Aをベースにしたいくつかの治療法が、主に、血管新生に依存する種々のヒト腫瘍の治療での使用のために開発されてきた。しかし、これらは、副作用がないわけではない。これは、これらが一般的な非細胞/組織特異的VEGF/VEGFR相互作用阻害剤として作用することを考慮すると驚くべきことではない。従って、特定の標的細胞(例えば、腫瘍血管系内皮細胞)に対するVEGF(例えば、VEGF−A)/VEGFR2阻害を制限することが望ましいであろう。

0206

いくつかの実施形態では、VEGFは、VEGF−A、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−D、またはVEGF−EおよびVEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、およびVEGF206などの種々のVEGF−Aのアイソフォームを含むこれらのアイソフォームである。いくつかの実施形態では、改変シグナル伝達物質は、VEGFR−1(Flt−1)および/またはVEGFR−2(KDR/Flk−1)に対する低減された親和性および/または活性を有する。いくつかの実施形態では、改変シグナル伝達物質は、VEGFR−1(Flt−1)および/またはVEGFR−2(KDR/Flk−1)に対する低減または除去された親和性および/または活性を有する。ある実施形態では、改変シグナル伝達物質は、VEGFR−2(KDR/Flk−1)に対する低減された親和性および/または活性を有し、および/またはVEGFR−1(Flt−1)に対する低減または除去された親和性および/または活性を有する。このような実施形態は、例えば、創傷治癒方法または虚血関連疾患の治療で使用される(理論に束縛されることを意図するものではないが、内皮細胞機能および血管新生に対するVEGFR2の効果により媒介されて)。種々の実施形態では、癌および炎症促進性活性と関連するVEGFR−1(Flt−1)への結合が回避される。種々の実施形態では、VEGFR−1(Flt−1)は、デコイ受容体として機能し、そのため、この受容体に対する親和性を実質的に低減または除去し、治療薬の隔離を回避する。ある実施形態では、改変シグナル伝達物質は、VEGFR−1(Flt−1)に対する低減または除去された親和性および/または活性を有し、および/またはVEGFR−2(KDR/Flk−1)に対する低減または除去された親和性および/または活性を有する。このような実施形態では、改変シグナル伝達物質は、VEGFR3に対する低減された親和性および/または活性を有する。あるいは、改変シグナル伝達物質は、VEGFR3に対する実質的に低減または除去された親和性および/または活性を有する。

0207

血管新生促進治療法はまた、種々の疾患(例えば、虚血性心疾患出血など)において重要であり、VEGFベース治療薬を含む。VEGFR2の活性化は血管新生促進性である(内皮細胞上で作用する)。VEGFR1は、炎症細胞(例えば、マクロファージを含む)の遊走の刺激を生じ、血管過多透過性に関連する炎症をもたらし得る。VEGFR1の活性化はまた、腫瘍微小環境形成に関連する骨髄を活性化できる。従って、VEGFR2活性化に対し選択性があるVEGFベース治療薬は、この場合には望ましいであろう。さらに、例えば、内皮細胞を特異的に標的とする細胞が望ましいであろう。

0208

いくつかの実施形態では、改変シグナル伝達物質は、VEGFR−2に対する低減された親和性および/または活性(例えば、拮抗的な)を有し、および/またはVEGFR−1に対する実質的に低減または除去された親和性および/または活性を有する。腫瘍内皮細胞マーカー(例えば、PSMAなど)に結合する標的化部分を介して腫瘍血管系内皮細胞を標的にする場合、このような構築物は、このようなマーカー陽性細胞上で特異的にVEGFR2活性化を阻害するが、標的細胞へ向かう途上および標的細胞上では(活性が除去された場合)VEGFR1を活性化せず、従って、例えば、炎症反応の誘導を無くする。これは、VEGF−A中和療法に比べて、多くの腫瘍型に対するより選択的で安全な抗血管新生薬療法を提供することになろう。

0209

いくつかの実施形態では、改変シグナル伝達物質は、VEGFR−2に対する低減された親和性および/または活性(例えば、アゴニスト活性)を有し、および/またはVEGFR−1に対する実質的に低減または除去された親和性および/または活性を有する。血管内皮細胞への標的化により、いくつかの実施形態では、このような構築物は、VEGFR1が関連する炎症反応誘導を生じることなく、血管新生を促進する。従って、このような構築物は、VEGFR2ならびにVEGFR1の全身性活性化に起因する副作用の実質的に低減されたリスクを有する、標的化血管新生促進効果を有するであろう。

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