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課題

解決手段

本発明は、標的結合分子および局在化ドメインを含むタンパク質発現ブロッカーまたはPEBLを含む組成物、ならびに癌治療においてそのような組成物を使用する方法を提供する。PEBLは、免疫細胞における標的表面受容体(ペプチドまたは抗原)の発現遮断に有用である。本明細書では、そのようなPEBLを発現するCD3/TCRαβ欠損T細胞およびCD3/TCRαβ欠損キメラ抗原受容体T細胞も提供される。

概要

背景

遺伝子組み換え免疫細胞は、癌の強力な新しい治療法である。キメラ抗原受容体(CAR)を発現するTリンパ球を用いた最近の臨床試験の結果は、このアプローチの力の説得力のある実証を提供している。キメラ抗原受容体(CAR)は、免疫細胞をリダイレクトして、腫瘍細胞を特異的に認識して死滅させることができる。CARは、膜貫通ドメインを介してシグナル伝達分子に連結された抗体の単鎖可変領域(scFv)で構成される人工的な多分子タンパク質である。scFvがその同族抗原ライゲーションすると、シグナル伝達トリガーされ、CAR発現細胞傷害性Tリンパ球による腫瘍細胞の死滅を引き起こす(Eshhar Z,Waks T,et al.PNAS USA。90(2):720−724,1993、GeigerTL,et al.J Immunol.162(10):5931−5939,1999、Brentjens RJ,et al.Nat Med.9(3):279−286,2003、Cooper LJ,et al.Blood 101(4):1637−1644,2003,Imai C,et al.Leukemia.18:676−684,2004)。CAR発現自己Tリンパ球を用いた臨床試験では、B細胞難治性白血病およびリンパ腫患者陽性反応が示されている(例:Till BG,et al.Blood 119(17):3940−3950,2012、Maude SL,et al.N Engl J Med.371(16):1507−1517,2014)。

表面分子CD19に特異的なCAR−T細胞は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病非ホジキンリンパ腫などの治療抵抗性のCD19陽性悪性腫瘍の患者で形態学的および分子寛解を誘発することが示されている。他の悪性腫瘍は、異なる抗原に対してリダイレクトされたT細胞によって攻撃され得る。したがって、腫瘍学における遺伝子工学的細胞療法の可能な応用は広範囲である。

CAR−T細胞注入初期の臨床経験も潜在的な限界を特定しており、これは治療効果を著しく低下させ、開発を妨げる可能性がある。主要な問題は、がん患者から収集された免疫細胞の適応度が変化し、インビボで拡大し、抗腫瘍効果を発揮する予測不可能能力をもたらすことである。この変動により、最も効果的な細胞用量の特定が複雑になり、短命で効果のない細胞産物の注入につながり、最終的には一貫した「生体薬(living drug)」の開発が妨げられる可能性がある。健康なドナーからのTリンパ球の使用は、有効性一貫性を改善するはずであるが、ドナーリンパ球注入の重大な、そして潜在的に致命的な結果である移植片対宿主病(GvHD)のリスクを伴う。そのような同種異系環境では、不可欠な細胞によって発現される組織抗原を認識する能力を抑制するために、注入されたT細胞に対する追加の修飾が必要である。13

遺伝子編集のための実用的な方法論出現は、癌の細胞療法に適用可能な治療細胞工学の新しい機会を開いた。ジンクフィンガーメガヌクレアーゼ、TALEN、およびCRISPR−Cas9を使用して、TCRαβ鎖をコードする遺伝子を削除し、アロ反応性欠くT細胞を誘導でき、同時に他の遺伝子を標的して、拒絶反応を遅らせることができる。TCRαおよびCD52遺伝子座のTALEN欠失と抗CD19CAR発現を使用した報告は、CAR発現と遺伝子編集を組み合わせることは、技術的には難しいものの、臨床現場で実現可能であることを示している。

要するに、B細胞悪性腫瘍の患者に対する新しい治療法の選択肢に対する未だ対処されていない重要なニーズがある。

概要

T細胞受容体欠損キメラ抗原受容体T細胞およびその使用方法に関する。本発明は、標的結合分子および局在化ドメインを含むタンパク質発現ブロッカーまたはPEBLを含む組成物、ならびに癌治療においてそのような組成物を使用する方法を提供する。PEBLは、免疫細胞における標的表面受容体(ペプチドまたは抗原)の発現の遮断に有用である。本明細書では、そのようなPEBLを発現するCD3/TCRαβ欠損T細胞およびCD3/TCRαβ欠損キメラ抗原受容体T細胞も提供される。

目的

本発明は、CAR−T細胞を含むT細胞の表面分子の迅速かつ効率的なダウンレギュレーションを可能にする方法を提供する

効果

実績

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請求項1

局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドを含む操作されたCD3/TCRαβ陰性細胞であって、前記標的結合分子は、CD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、前記局在化ドメインは、小胞体ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、前記局在化ドメインに連結された前記標的結合分子は、前記操作された細胞によって分泌されず、前記操作された細胞の細胞表面に発現されない、操作されたCD3/TCRαβ陰性T細胞。

請求項2

前記CD3/TCRαβ複合体タンパク質が、TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、およびCD3ζからなる群から選択される、請求項1に記載の操作されたT細胞。

請求項3

前記抗体が、単鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項1または2に記載の操作された免疫細胞

請求項4

前記scFvが、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列とを含む、請求項3に記載の操作されたT細胞。

請求項5

前記操作されたT細胞が、同種異系T細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。

請求項6

前記操作されたT細胞が、自己T細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。

請求項7

前記局在化ドメインが、CD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。

請求項8

前記ER保持配列が、KDEL(配列番号32)、KKMP(配列番号33)、KKTN(配列番号43)、またはKKXX(前記Xは任意のアミノ酸である)(配列番号35)から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。

請求項9

CD3/TCRαβの発現が、前記操作されたT細胞において遮断される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。

請求項10

自己免疫疾患またはウイルス疾患治療を必要とする患者において自己免疫疾患またはウイルス疾患を治療する方法であって、請求項1〜9のいずれか一項に記載の操作されたT細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を前記自己免疫疾患またはウイルス性疾患患者に投与することを含む、方法。

請求項11

患者における移植片対宿主病の可能性を低減または排除する方法であって、請求項1〜9のいずれか一項に記載の操作されたT細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を前記患者に投与することを含む、方法。

請求項12

前記操作されたT細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。

請求項13

前記CARが、抗CD19scFvドメイン、4−1BB刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項12に記載の操作されたT細胞。

請求項14

前記操作されたT細胞が、CD19+癌細胞細胞傷害性誘導する、請求項13に記載の操作されたT細胞。

請求項15

前記CARが、抗CD3scFvドメイン、4−1BB刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項12に記載の操作されたT細胞。

請求項16

前記操作されたT細胞がCD3+癌細胞の細胞傷害性を誘導する、請求項15に記載の操作されたT細胞。

請求項17

癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法であって、請求項12〜16のいずれか一項に記載の操作されたT細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を前記癌患者に投与し、それにより前記患者の癌を治療することを含む、方法。

請求項18

前記癌が、CD3+癌、CD19+癌、またはB細胞悪性腫瘍である、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記B細胞悪性腫瘍が、再発性または難治性急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞非ホジキンリンパ腫(B−NHL)、および大細胞B細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。

請求項20

投与が、静脈内注入動脈注入腹腔内注入、腫瘍への直接注射および/または手術後の腫瘍床の灌流人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与を含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2017年8月10日に出願された米国仮出願第62/543,735号の利益を主張し、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。

0002

配列表の参照
本出願は、ASCIIフォーマット電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。2018年8月9日に作成された前記ASCIIコピー名前は「119419−5003−WO−SequenceListing_ST25.txt」で、サイズは24.0キロバイトである。

背景技術

0003

遺伝子組み換え免疫細胞は、癌の強力な新しい治療法である。キメラ抗原受容体(CAR)を発現するTリンパ球を用いた最近の臨床試験の結果は、このアプローチの力の説得力のある実証を提供している。キメラ抗原受容体(CAR)は、免疫細胞をリダイレクトして、腫瘍細胞を特異的に認識して死滅させることができる。CARは、膜貫通ドメインを介してシグナル伝達分子に連結された抗体の単鎖可変領域(scFv)で構成される人工的な多分子タンパク質である。scFvがその同族抗原ライゲーションすると、シグナル伝達トリガーされ、CAR発現細胞傷害性Tリンパ球による腫瘍細胞の死滅を引き起こす(Eshhar Z,Waks T,et al.PNAS USA。90(2):720−724,1993、GeigerTL,et al.J Immunol.162(10):5931−5939,1999、Brentjens RJ,et al.Nat Med.9(3):279−286,2003、Cooper LJ,et al.Blood 101(4):1637−1644,2003,Imai C,et al.Leukemia.18:676−684,2004)。CAR発現自己Tリンパ球を用いた臨床試験では、B細胞難治性白血病およびリンパ腫患者陽性反応が示されている(例:Till BG,et al.Blood 119(17):3940−3950,2012、Maude SL,et al.N Engl J Med.371(16):1507−1517,2014)。

0004

表面分子CD19に特異的なCAR−T細胞は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病非ホジキンリンパ腫などの治療抵抗性のCD19陽性悪性腫瘍の患者で形態学的および分子寛解を誘発することが示されている。他の悪性腫瘍は、異なる抗原に対してリダイレクトされたT細胞によって攻撃され得る。したがって、腫瘍学における遺伝子工学的細胞療法の可能な応用は広範囲である。

0005

CAR−T細胞注入初期の臨床経験も潜在的な限界を特定しており、これは治療効果を著しく低下させ、開発を妨げる可能性がある。主要な問題は、がん患者から収集された免疫細胞の適応度が変化し、インビボで拡大し、抗腫瘍効果を発揮する予測不可能能力をもたらすことである。この変動により、最も効果的な細胞用量の特定が複雑になり、短命で効果のない細胞産物の注入につながり、最終的には一貫した「生体薬(living drug)」の開発が妨げられる可能性がある。健康なドナーからのTリンパ球の使用は、有効性一貫性を改善するはずであるが、ドナーリンパ球注入の重大な、そして潜在的に致命的な結果である移植片対宿主病(GvHD)のリスクを伴う。そのような同種異系環境では、不可欠な細胞によって発現される組織抗原を認識する能力を抑制するために、注入されたT細胞に対する追加の修飾が必要である。13

0006

遺伝子編集のための実用的な方法論出現は、癌の細胞療法に適用可能な治療細胞工学の新しい機会を開いた。ジンクフィンガーメガヌクレアーゼ、TALEN、およびCRISPR−Cas9を使用して、TCRαβ鎖をコードする遺伝子を削除し、アロ反応性欠くT細胞を誘導でき、同時に他の遺伝子を標的して、拒絶反応を遅らせることができる。TCRαおよびCD52遺伝子座のTALEN欠失と抗CD19CAR発現を使用した報告は、CAR発現と遺伝子編集を組み合わせることは、技術的には難しいものの、臨床現場で実現可能であることを示している。

0007

要するに、B細胞悪性腫瘍の患者に対する新しい治療法の選択肢に対する未だ対処されていない重要なニーズがある。

0008

本明細書で提供されるのは、免疫細胞における表面受容体発現の遮断のための単純で効果的な方法である。タンパク質発現ブロッカー(PEBL)という名称の特定の構築物は、標的タンパク質細胞膜への輸送を防ぐ。PEBL構築物は、他の遺伝子修飾と容易に組み合わせることができ、既存の大規模cGMPグレードプロトコルに組み込まれてエクスビボで細胞を処理して免疫細胞の機能を最適化できる。

0009

一態様では、本発明は、CAR−T細胞を含むT細胞の表面分子の迅速かつ効率的なダウンレギュレーションを可能にする方法を提供する。本発明の一実施形態では、抗CD3εPEBLの形質導入がCD3の細胞内保持を引き起こし、その結果、Tリンパ球の表面上のTCRαβの発現が妨げられた抗CD3εPEBLが提供される。本明細書で概説されるPEBL構築物は、細胞外漏出が最小限であるか、または全くない可能性があり、CD3/TCRαβの発現およびシグナル伝達のブロッキングに非常に効果的である。このようなPEBL構築物は、抗ウイルスTCRで形質導入されたT細胞を同種のウイルスペプチド応答できなくし、移植片対宿主病(GvHD)を引き起こすヒトT細胞の能力を著しく低下させることができる。PEBLの発現とCD3/TCRαβの妨害は永続的であり、他の表面分子の発現には影響しない。PEBLを発現するT細胞は、匹敵するT細胞と同様に生存および増殖できる。重要なことに、PEBL発現T細胞はCARシグナル伝達に正常に反応し、インビトロでCAR標的白血病細胞を効果的に死滅させることができる。CD3/TCRαβの発現とシグナル伝達のPEBL遮断は、CAR−T細胞などの同種異系T細胞の注入をサポートするためのシンプルで効果的なツールである。

0010

一態様では、本発明は、局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドを含む操作されたCD3/TCRαβ欠損T細胞を提供し、標的結合分子はCD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、および局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作されたCD3/TCRαβ欠損T細胞によって分泌されない。

0011

いくつかの態様において、抗体は、TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、およびCD3ζからなる群から選択されるCD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する単鎖可変フラグメント(scFv)である。特定の実施形態では、scFvは、配列番号1と少なくとも95%の配列同一性を有する可変重鎖(VH)配列と、配列番号2と少なくとも95%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列とを含む。

0012

いくつかの態様において、局在化ドメインは、CD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ER保持配列は、KDEL(配列番号32)、KKMP(配列番号33)、KKTN(配列番号43)、またはKKXX(前記Xは任意のアミノ酸である)(配列番号35)から選択されるアミノ酸配列を含む。

0013

他の態様において、本明細書に記載の操作されたT細胞の任意の1つおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、患者における移植片対宿主病の可能性を低減または排除する方法も本明細書で提供され、そのような薬学的組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。

0014

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたT細胞は、CD3またはCD19に結合するCARなどであるがこれらに限定されないキメラ抗原受容体(CAR)をさらに含む。本明細書に開示されるのは、そのような操作されたT細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。いくつかの態様では、本発明は、そのような薬学的組成物の治療的有効量を投与することを含む、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法に関する。場合によっては、癌は造血器癌(hematopoietic cancer)である。他の例では、癌はCD3発現癌である(例えば、癌細胞はCD3を発現する)。特定の例において、癌はCD19発現癌である(例えば、癌細胞はCD19を発現する)。

0015

様々な態様において、本発明は、操作されたCD3/TCRαβ欠損キメラ抗原受容体T細胞(CAR−T細胞)であって:(i)局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドであって、標的結合分子は、CD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、および局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作された細胞によって分泌されない、ペプチドと、(ii)キメラ抗原受容体(CAR)と、を含むものを提供する。

0016

いくつかの態様において、抗体は、TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、およびCD3ζからなる群から選択されるCD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する単鎖可変フラグメント(scFv)である。特定の実施形態では、scFvは、配列番号1と少なくとも95%の配列同一性を有する可変重鎖(VH)配列と、配列番号2と少なくとも95%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列とを含む。局在化ドメインには、CD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ER保持配列は、KDEL(配列番号32)、KKMP(配列番号33)、KKTN(配列番号43)、またはKKXX(前記Xは任意のアミノ酸である)(配列番号35)から選択されるアミノ酸配列を含む。

0017

いくつかの実施形態では、操作されたCD3/TCRαβ欠損CAR−T細胞のCARはCD3またはCD19に結合する。場合によっては、CARは、抗CD19scFvドメイン、4−1BB刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。他の例では、CARは抗CD3scFvドメイン、4−1BB刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。

0018

特定の態様において、本明細書では、操作されたCD3/TCRαβ欠損キメラ抗原受容体T細胞(CAR−T細胞)であって、(i)局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドであって、標的結合分子はCD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作された細胞によって分泌されない、ポリペプチドと、(ii)キメラ抗原受容体(CAR)と、を含む、操作されたCD3/TCRαβ欠損キメラ抗原受容体T細胞を含む、薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法が提供される。抗体は、TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、およびCD3ζからなる群から選択されるCD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する単鎖可変フラグメント(scFv)であり得る。いくつかの実施形態では、CD3εに結合するscFvは、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、CD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ER保持配列は、KDEL(配列番号32)、KKMP(配列番号33)、KKTN(配列番号43)、またはKKXX(前記Xは、任意のアミノ酸である)(配列番号35)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、局在化ドメインは、配列番号11〜31の任意の1つから選択されるアミノ酸配列を含む。場合によっては、操作されたCAR−T細胞のCARはCD3に結合する。他の例では、操作されたCAR−T細胞のCARがCD3に結合する。CARには、抗CD19scFvドメイン、4−1BB刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含めることができる。または、CARには、抗CD3scFvドメイン、4−1BB刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含めることができる。

0019

いくつかの実施形態では、操作されたCAR−T細胞は同種異系T細胞(例えば、同種異系の操作されたCAR−T細胞)である。他の実施形態では、操作されたCAR−T細胞は自己T細胞(例えば、自己の操作されたCAR−T細胞)である。そのような操作されたCAR−T細胞は、細胞の投与時に患者の移植片対宿主反応の低下を誘発すことができる。

0020

いくつかの態様において、患者はCD3陽性癌などの癌を患っている。他の実施形態では、患者はCD19陽性癌などの癌を患っている。

0021

他の態様において、本明細書で提供されるのは、同種の操作されたCD3/TCRαβ欠損キメラ抗原受容体T細胞(CAR−T細胞)であって、i)局在化ドメインに結合した標的結合分子を含むポリペプチドであって、標的結合分子はCDεに結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作された細胞によって分泌されないポリペプチドと、(ii)キメラ抗原受容体(CAR)と、を含む、同種の操作されたCD3/TCRαβ欠損キメラ抗原受容体T細胞を含む、薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法である。

0022

いくつかの実施形態では、抗体は、CD3εに結合する単鎖可変フラグメント(scFv)である。CD3εに結合するscFvは、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列とを含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、CD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ER保持配列は、KDEL(配列番号32)、KKMP(配列番号33)、KKTN(配列番号43)、またはKKXX(前記Xは任意のアミノ酸である)(配列番号35)から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、配列番号11〜31の任意の1つから選択されるアミノ酸配列を含む。場合によっては、CARはCD3またはCD19を結合する。CARは、抗CD3scFvドメイン、4−1BB刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメイン、または抗CD19scFvドメイン、4−1BB刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むことができる。

0023

本明細書で提供されるのは、局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドを含む操作されたCD3/TCRαβ陰性T細胞であって、標的結合分子はCD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、および局在化ドメインに連結された標的結合分子は操作された細胞によっては分泌されないものである。

0024

また、本明細書で提供されるのは、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドであって、標的結合分子はCD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含むものである。

0025

本明細書で提供されるのは、操作されたCD3/TCRαβ陰性キメラ抗原受容体T細胞(CAR−T細胞)であって、(i)キメラ抗原受容体(CAR)と、(ii)局在化ドメインに連結された標的結合分子とを含み、標的結合分子は、CD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、および局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作されたCAR−T細胞によって分泌されない、ものである。

0026

本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の操作された免疫細胞の任意の1つを含む薬学的組成物の治療有効量を癌患者に投与し、それにより癌の治療を必要とする対象における癌を治療することを含む、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法である。

0027

他の態様では、患者におけるCD3またはCD19を発現する前悪性状態または癌を治療する方法であって、本明細書で提供される操作された免疫細胞の任意の1つを含む薬学的組成物の治療有効量を患者に投与することと、それにより癌の治療を必要とする対象における癌を治療することと、を含む、方法が本明細書で提供される。

0028

別の態様において、血液癌細胞を、本明細書に記載の操作された免疫細胞の任意の1つと接触させることを含む、CD3またはCD19を発現する血液癌を弱める方法が本明細書に提供される。

0029

いくつかの実施形態では、本発明は、哺乳動物、例えばヒト患者標的細胞集団または組織に対してT細胞を刺激する方法であって、哺乳動物に、本明細書に記載された操作された免疫細胞の任意の1つを含む薬学的組成物の治療有効量を投与することを含む方法に関する。

図面の簡単な説明

0030

図1A図1D:抗CD3εPEBLは表面CD3発現をブロックする。(図1Aフローサイトメトリードットプロットは、GFPのみで(「対照」)またはSEKDEL(配列番号50)で形質導入された細胞と比較した、抗CD3εPEBLによるジャーカット(Jurkat)の表面CD3ダウンレギュレーションを示している。(図1B)示された構築物で形質導入されたジャーカットにおける表面CD3発現。バーは、KEDL、SEKDEL、およびPEBL2,4,5,8,9,11に対する2〜3回の実験の平均、または残りの個々の結果を示している。(図1C)ジャーカットにおけるPEBLで誘導された抗CD3εscFvの細胞内また表面発現。バーは、PEBL2,4,8,9,11に対する2〜3回の実験の平均、または残りの個々の結果を示す。(図1D)フローサイトメトリーのヒストグラムは、GFPのみで形質導入されたリンパ球のものと比較する、形質導入後8〜13日間の抗CD3εSEKDELまたはPEBLで形質導入された末梢血T細胞におけるCD3発現を示している。
図2A図2D:抗CD3εPEBLはTCRαβをダウンレギュレートする。(図2A)PEBL形質導入の5〜9日後のGFP陽性Tリンパ球におけるTCRαβ発現。平均(±標準偏差¥[SD])は、GFPのみで(「対照」、n=25)、PEBL2(n=4)で、およびPEBL5(n=18)で形質導入された細胞について示されており、他のデータは、1回の実験の結果または2回の実験の平均を表す。(図2B)フローサイトメトリーのドットプロットは、GFPのみで形質導入された細胞と比較したTリンパ球におけるTCRαβのダウンレギュレーションを示している。(図2C長期培養後にPEBLを形質導入したジャーカット細胞でのCD3/TCRαβ発現;対照、GFPのみで形質導入された細胞。(図2D)Tリンパ球(200IU/mLIL−2である)またはジャーカット細胞の長期培養におけるCD3/TCRαβ発現の集合的結果。記号は、GFP+形質導入細胞における表面CD3/TCRαβの90%以上の減少の持続性を示している。
図3A図3F:PEBLによるCD3/TCRαβのダウンレギュレーションは細胞増殖に影響を与えないが、CD3/TCRαβシグナル伝達を抑制する。(図3A)抗CD3PEBLまたはGFPのみ(「対照」)で形質導入されたジャーカットの増殖率。記号は、3回測定の平均(±SD)を示す。(図3B)IL−2(200IU/mL)で培養した5人のドナー(7回の実験)からのPEBL形質導入または対照Tリンパ球の生存。記号は、3回測定の平均を示す。(図3C)OKT3または非反応性マウスIgG2aを使用した24時間後のジャーカットのCD25およびCD69平均蛍光強度MFI)。バーは、3回の測定の平均(±SD)を示す。(図3D)IL−2(200IU/mL)をすべて含むが、OKT3を含まない培養と比較する、OKT3を含む培養から回収された生存可能なPEBLまたは対照Tリンパ球。記号は、3人のドナーからの細胞による9回の測定の平均(±SD)を表す。スチューデントt検定によるP値が、有意差について示される(****P<0.0001)。(図3EHBVs183に特異的なTCRまたはネオマイシン耐性遺伝子のみを含むベクター(「NeoR」)で形質導入されたジャーカット細胞は、ネオマイシン選択後、抗CD3PEBLでまたはmCherryのみ(「対照」)で形質導入された。CD3、TCRαβ、およびTCRVβ3鎖(HBVs183TCRの一部)の発現が示されており、TCRVβ3の発現は、細胞表面で、および細胞透過処理後に細胞内で、試験された。(図3FパネルEに示す形質導入されたジャーカット細胞を、HBVs183ペプチドをロードしたT2細胞と24時間共培養した。示されているのは、CD25およびCD69MFIから、ペプチドを含まないがT2細胞での培養後に測定されたものを差し引いたものである。記号は、3回測定の平均を表す。
図4A図4D:CD3/TCRαβ発現遮断を伴うT細胞におけるCAR発現およびシグナル伝達。(図4A)フローサイトメトリーのドットプロットは、CD3のダウンレギュレーションと抗CD19−41BB−CD3ζCARの発現を示している。細胞にCAR構築物、続いて抗CD3εPEBLを導入し、またはGFPのみ、続いてmCherryのみを形質導入した(「対照」)。(図4B)CARmRNAエレクトロポレーションの24時間後(n=5)、またはCARウイルス形質導入の5〜6日後(n=4)、抗CD19−41BB−CD3ζCARを発現するPEBLまたはGFPのみ(「対照」)で形質導入されたTリンパ球の割合、P=0.207。(図4C)CAR mRNAでまたはmRNAなしでのエレクトロポレーションをし、CD19+RS4;11でE:T 1:2にて8時間培養したPEBLまたは対照T細胞によるIFNγ産生バーは、3人のドナーの細胞での9回の測定の平均(±SD)を表す、****P<0.0001。(図4D)Tリンパ球に最初にCARを形質導入し、次にmCherryのみまたは抗CD3PEBLのいずれかで形質導入した。次いで、細胞を照射CD19+OP−1とともに3週間培養した。結果をGFPのみで形質導入した細胞と比較し、次にmCherryのみ(「対照」)で形質導入した細胞と比較した。記号は、3連の培養における投入細胞の数に対する平均(±SD)細胞回収率を示している。
図5A図5D:CAR+PEBLTリンパ球の細胞傷害性。(図5A)抗CD19−41BB−CD3ζCARmRNAまたはmRNAなしのいずれかでエレクトロポレーションした、3人のドナーからのT細胞のPEBLまたは対照(mCherry形質導入)の、2:1 E:TでのCD19+ALL細胞株に対して4時間細胞傷害性アッセイ補足図4も参照)。記号は、各ドナーについて3回の測定の平均を示す。(図5B)mCherryのみまたは抗CD3PEBLのいずれかを含有するレトロウイルスベクターで逐次的に形質導入された2人のドナーからのCAR形質導入Tリンパ球の細胞傷害性をCD19+細胞株に対して試験した。対照、GFPのみで形質導入された細胞、続いてmCherryのみで形質導入された細胞。示されているのは、1:1 E:TでのCD19+ALL細胞株に対する4時間アッセイのデータである(図12Aおよび図12Bデータ一式)。各記号は、各ドナーに対して3回の実験の平均を示している。(図5C図5D)パネルBのように形質導入されたTリンパ球を、mCherryで形質導入されたNalm6に対する長期細胞傷害性について試験した。白血病細胞の増殖は、IncuCyte Zoom System(Essen BioScience)で測定された。80時間、E:T1:8での3連の培養のホールウェルイメージング図5Cに示す。図5Dに示されたE:T比での白血病細胞増殖測定。***P<.001、****P<.0001。
図6A図6E:PEBLによるCD3/TCRαβノックダウンはGVHDを防ぐ。(図6A)NSGマウスに2.5Gyを照射し、1日後に抗CD3PEBLまたはGFPのみ(「対照」、群あたりn=8)で形質導入した1×107Tリンパ球を静脈内注射した。体重は、照射後3日目の体重に対する変化として表される。(図6Bヘモグロビンレベルおよび(C)末梢血血小板数。(図6Dカプラン・マイヤーの全生存曲線ログランク検定。2回の連続測定体重減少が20%を超えたときにマウスを安楽死させた(図14の追加データ)。(図6E)T細胞注射の18日後の血液中のヒトCD45+細胞数。*P=0.0148、***P<0.001。
図7A図7F:PEBLおよびCAR発現によるCD3/TCRαβノックダウンを持つT細胞は、マウスの白血病細胞を死滅させる。(図7A)NSGマウスに5×105個のNalm6−ルシフェラーゼ細胞を静脈内注射した。3日後、マウスに抗CD19−41BB−CD3ζCARに加えてPEBLまたはmCherryのみのいずれかを形質導入した2×107個のTリンパ球を投与した。他のマウスには代わりに組織培養培地を投与した(「T細胞なし」)。Nalm6の生着を説明するために、3日目の生物発光画像が感度を高めて表示されている。(図7B)記号は、腹部および背部のイメージングにおける平均生物発光シグナルに対応する。(図7C全生存率のカプラン・マイヤー曲線とログランク検定。腹部および背部の生物発光の平均シグナルが1秒あたり1x010光子に達したときにマウスを安楽死させた。****P<0.0001。(図7D)NSGマウスに、パネルAに記載されているように、3日目に5x05Nalm6−ルシフェラーゼ細胞と2×107Tリンパ球を静脈内注射した。Tリンパ球注射の前に、マウスは2.5Gyの全身照射を受けた。Nalm6の生着を説明するために、3日目の生物発光画像が感度を高めて表示されている。(図7Eシンボルは、腹側および背側のイメージングによる生物発光の平均に対応している。(図7F)カプラン・マイヤー曲線と全生存率のログランク検定。マウスは、腹部および背部の生物発光の平均シグナルが1秒あたり1×1010光子に達したとき、またはGVHDの兆候(2回の連続測定で20%を超える体重減少、可動性の低下および/または毛皮損失)が明らかとなったときに安楽死させた。GVHDは、CAR+mCherryマウス5匹中3匹、CAR+PEBLマウス6匹中0匹で発生した。再発(「相対」)率は、それぞれ5匹中0匹対6匹中2匹であった。**P=0.0014、***P=0.0006。
本明細書に記載のタンパク質発現ブロッカー(PEBL)構築物。
PEBLまたはGFPのみ(「対照」)で形質導入されたTリンパ球の免疫表現型。4人のドナーからの形質導入リンパ球における3〜5回の測定の平均値(±SD)が示されている。細胞マーカーは、形質導入の6〜8日後に分析された。モックのGFP+細胞およびPEBLのCD3陰性細胞をゲーティングした後、パーセンテージを計算した。すべての比較に対しP>0.05。抗体はBD Biosciences(CD4 PE−Cy7、CD8 PE、CD7 PE、CD25 PE−Cy7、CD62LAPC、CD69 PE、Biolegend(CD2 APC、CD137 APC、CD279 PE、CD366 PE)、およびThermoFisher Scientific(CD223 APC)から得た。
抗CD3PEBLまたはGFPのみ(「対照」)を形質導入したT細胞を注射した免疫不全マウス病理学的特徴
PEBLのscFvの導き出しに使用した抗CD3抗体特異性。K562細胞に、各CD3サブユニットcDNA(δ、ε、γ、ζ)、2つのサブユニットの組み合わせ、またはGFPのみを含むベクター(「対照」)を形質導入した。形質導入された細胞を透過処理し、PLUハイブリドーマ細胞から分泌された上清とともにインキュベートした後、Alexa Fluor 647コンジュゲート(conjugated)ヤギ抗マウスIgG抗体(SouthernBiotech、アラバマ州、バーミンガム)で染色した。分析は、Fortessaフローサイトメーター(BD Bioscience)およびFlowJoソフトウェアを使用して行った。
図10A図10C:抗CD3εPEBLの細胞内局在。(図10A)フローサイトメトリーのヒストグラムは、抗CD3PEBL5またはGFPのみ(「モック」)で形質導入されたジャーカット細胞におけるCD3の表面および細胞内発現を示している。(図10B)抗CD3PEBL5形質導入ジャーカット細胞の共焦点顕微鏡イメージング。細胞透過処理後、PEBLscFvはビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスF(ab´)2抗体、続いてストレプトアビジンPEで検出され、CD3は抗CD3APCで検出された。(図10C)PEBLは形質導入細胞から分泌されない。PEBLは、細胞内の細胞内区画に局在化できる。たとえば、PEBLはERまたはゴルジ体に保持できる。抗CD3PEBL、抗CD3scFvのみ、またはGFPのみ(「モック」)を48時間かけて形質導入したジャーカット細胞の上清を、CD3+Loucy細胞とともに4℃で45分間インキュベートした。Loucyの表面に結合した分泌scFvは、ビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスF(ab´)2抗体とそれに続くストレプトアビジンAPCで可視化された。
長期培養後のTリンパ球におけるCD3/TCRαβのダウンレギュレーション。フローサイトメトリーのドットプロットは、200IU/mL IL−2で55日間培養した後、PEBL5とGFP、またはGFPのみ(「対照」)で形質導入されたTリンパ球におけるCD3およびTCRαβの発現を示している。残留CD3+細胞の枯渇の前後の結果が示される。
図12A図12B:PEBL−CAR Tリンパ球の細胞傷害性。図11A:抗CD19−41BB−CD3ζCARmRNAまたはmRNAなしでエレクトロポレーションしたPEBLまたはモック形質導入T細胞の細胞傷害性。示されているのは、CD19+ALL細胞株に対する4時間アッセイのデータである。各記号は、示されたE:T比での3回の実験の平均(±SD)を示している。図11B:mCherryのみまたは抗CD3PEBLのいずれかで連続的に形質導入されたCARでまたはGFPのみで形質導入されたTリンパ球の細胞傷害性をCD19+細胞株に対して試験した。示されているのは、CD19+ALL細胞株に対する4時間アッセイのデータである。各記号は、示されたE:T比での3回の実験の平均(±SD)を示している。各パネルは、1人のドナーからの細胞を使用した実験に対応している。
図13A図13C:CARおよびPEBL構築物を送達するバイシストロン性ベクターの開発。(図13Aバイシストロン性構築物の概略図。ATNFSLLKQAGDVEENPGPの例示的な2A配列(配列番号42)は、図13Aに提供されている。(図13B)フローサイトメトリーのドットプロットは、末梢血Tリンパ球におけるCD3ダウンレギュレーションおよび抗CD19−41BB−CD3ζCAR発現を示している。細胞に、GFPのみ(「対照」)またはバイシストロン性構築物(CAR−2A−PEBL)を形質導入した。後者については、残留CD3+細胞の枯渇前後の結果が示されている。(図13C)対照Tリンパ球の細胞傷害性と比較した、CARまたはCAR−2A−PEBLのいずれかで形質導入されたTリンパ球の細胞傷害性。CD19+ALL細胞株OP−1、Nalm6およびRS4;11に対する4時間アッセイのデータが示されている。各記号は、示されているE:T比での3回の実験の平均(±SD)を示している。
図14A図14C:CD3/TCRαβ発現のPEBLダウンレギュレーションなしでヒトTリンパ球を投与されたマウスにおけるGvHDの兆候。NOD−SCID−IL2RGnullマウスに2.5Gyを照射し、1日後に抗CD3PEBLまたはGFPのみ(「Mock」;各グループでn=8)のいずれかで形質導入した1×107Tリンパ球を静脈内注射した。すべてのマウスにIL−2(20000IU)を週に3回腹腔内投与した。(図14A)ヘモグロビンレベルおよび(図14B穿刺により採取された血液中の血小板数。(図14Cヘマトキシリン−エオシン染色、およびモック群のマウスの1匹からの組織の抗ヒトCD4およびCD8抗体による免疫組織化学脾臓および骨髄造血細胞の減少とともに、CD4+またはCD8+リンパ球の浸潤ならびに線維症がすべての組織で見られた。
抗CD3εPEBLを発現する非アロ反応性T細胞と、抗CD3εPEBLを発現する非アロ反応性CAR−T細胞およびバイシストロン性構築物由来のCARの模式図。

0031

本発明の例示的な実施形態の説明は以下の通りである。

0032

1.タンパク質発現ブロッカー(PEBL)を発現する操作された細胞
本明細書に記載の方法は、免疫細胞におけるTCRα、TCRβ、CD3(例えばCD3δ、CD3ε、CD3γ、およびCD3ζ)などの特定の標的TCR複合体タンパク質の迅速な除去または不活性化を可能にする。この方法は、一部は、除去または中和される標的(例えば、タンパク質)に結合する標的結合分子を含むポリペプチド構築物に依存している。標的結合分子は、用途に応じて、ゴルジ体、小胞体(ER)、プロテアソーム、または細胞膜などの特定の細胞区画にポリペプチドを導くドメイン(たとえば、局在化ドメイン)に連結されている。簡単にするために、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、本明細書では「タンパク質発現ブロッカー」または「PEBL」と呼ぶことができる。

0033

活性化された免疫細胞によるサイトカインの分泌は、サイトカイン放出症候群およびマクロファージ活性化症候群を引き起こし、免疫細胞療法の深刻な悪影響をもたらすことが示されている(LeeDW,et al,Blood.2014;124(2):188−195)。したがって、本明細書で概説したPEBLを使用して、IL−6、IL−2、IL−4、IL−7、IL−10、IL−12、IL−15、IL−18、IL−21、IL−27、IL−35、インターフェロン(IFN)−γ、IFN−β、IFN−α、腫瘍壊死因子(TNF)−α、およびそのような炎症カスケードに寄与する可能性のある形質転換成長因子(TGF)−βなどのサイトカインをブロックすることができる。したがって、標的結合分子は、IL−6、IL−2、IL−4、IL−7、IL−10、IL−12、IL−15、IL−18、IL−21、IL−27、IL−35、IFN−γ、IFN−β、IFN−α、TNF−α、またはTGF−βに特異的に結合する分子であり得る。いくつかの実施形態では、標的結合分子は、TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、およびCD3ζなどのTCR複合体タンパク質に特異的に結合する分子である。

0034

T細胞上で発現されるリガンド(例えば、ペプチドまたは抗原)への結合時に免疫応答を活性化または不活性化することができるそのような適切な結合分子はすべて、「標的結合分子」と総称される。当業者であれば、標的結合分子は、抗体または抗原結合フラグメント(例えば、scFv)のみを含む必要はなく、むしろ、標的分子に結合する標的結合分子の部分は、例えば、受容体−リガンド対の受容体、または受容体−リガンド対のリガンドに由来し得る。

0035

いくつかの実施形態では、局在化ドメインは保持シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、局在化ドメインは、保持シグナル伝達ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。場合によっては、保持シグナル伝達ドメインは、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、またはプロテアソーム局在化配列を含む。保持シグナル伝達ドメインには、タンパク質が細胞によって分泌されるのを防ぐまたは妨げるアミノ酸配列を含めることができる。保持シグナル伝達ドメインは、細胞内区画にタンパク質を保持するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの場合、保持シグナル伝達ドメインは、ERまたはゴルジ体の膜などの細胞膜内にタンパク質のアンカーを保持するアミノ酸配列を含むことができる。例えば、保持シグナル伝達ドメインは、KDEL配列(配列番号32)、KKDまたはKKE配列KKMP配列(配列番号33)、YQRL配列(配列番号34)、またはKKXX配列(前記Xは任意のアミノ酸配列である)(配列番号35)を含むことができる。

0036

いくつかの実施形態では、タンパク質発現ブロッキング(PEBL)ポリペプチドは細胞によって分泌されない。いくつかの実施形態では、PEBLポリペプチドは細胞の細胞表面に発現されない。いくつかの実施形態では、PEBLポリペプチドは、T細胞の細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体(CAR)として機能しない。

0037

膜貫通ドメインは、CD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメインを含むことができる。特定の実施形態では、局在化ドメインの膜貫通ドメインはCD8αに由来する。膜貫通ドメインは保持シグナル伝達ドメインに連結することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、リンカーを介して保持シグナル伝達ドメインに連結されている。

0038

リンカーの非限定的な例には、(GS)n、(GGS)n、(Gly3Ser)n、(Gly2SerGly)n、(Gly2SerGly2)n、または(Gly4Ser)nが含まれ、前記nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。いくつかの実施形態では、リンカーは(Gly4Ser)3または(Gly4Ser)4である。リンカーの長さの変動は、活性を保持するかまたは強化でき、活性研究において優れた有効性を生じる。

0039

いくつかの実施形態では、本発明の局在化ドメインは、表1および図8Aに提供されるアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号11のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号12のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号13のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号14のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号15のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号16のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号17のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号18のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号19のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号20のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号21のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号22のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号23のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号24のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号25のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号26のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号27のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号28のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号29のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号30のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号31のアミノ酸配列を含む。

0040

したがって、PEBLのC末端領域に位置する局在化ドメインは、N末端領域にある。いくつかの実施形態では、N末端からC末端までのPEBLは、標的結合ドメイン、リンカー、および局在化ドメインを含む。他の実施形態では、N末端からC末端までのPEBLは、シグナルペプチド、標的結合ドメイン、リンカー、および局在化ドメインを含む。特定の実施形態では、N末端からC末端までのPEBLは、シグナルペプチド、標的結合ドメイン、および局在化ドメインを含む。他の実施形態において、N末端からC末端までのPEBLは、標的結合ドメインおよび局在化ドメインを含む。

0041

本発明の操作された細胞は、機能的T細胞受容体を産生しない。いくつかの実施形態では、CD3/TCRαβ複合体構成要素またはサブユニットの1つ以上は細胞表面に発現されない。言い換えれば、そのような細胞はCD3/TCRαβ陰性またはCD3/TCRαβ欠損である。

0042

2.タンパク質発現ブロッカー(PEBL)およびキメラ抗原受容体(CAR)を発現する操作された細胞
したがって、一実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体(例えば、CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、および局在化ドメイン(例えば、PEBL)に連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む、操作された免疫細胞(例えば、操作されたT細胞)に関する。

0043

本明細書で使用される「操作された」免疫細胞は、天然に存在する免疫細胞と比較して遺伝的に改変された免疫細胞を含む。例えば、本方法に従って産生された操作されたT細胞は、それが由来するT細胞に天然には存在しないヌクレオチド配列を含む核酸を保有する。いくつかの実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、PEBLおよびキメラ抗原受容体(CAR)を含む。例示的なCARの非限定的な例には、CD3、CD19、CD22、CD30、CD123、B細胞成熟抗原(BCMA)、GD2、メソセリン、EGVRvIII、HER2、c−Met、PD−L1、その他の腫瘍関連抗原に結合するCARが含まれる。

0044

例示的な腫瘍関連抗原には、メソセリン、EGFRvIII、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS−1、CLL−1、CD33、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL−13Ra2、インターロイキン−11受容体a(IL−11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板由来増殖因子受容体ベータ(PDGFR−ベータ)、SSEA−4、CD20、葉酸受容体アルファ(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、MUCl、表皮増殖因子受容体(EGFR)、NCAM、Prostase、PAPELF2M、エフリンB2、IGF−I受容体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr−abl、チロシナーゼ、EphA2、フコシルGM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o−アセチル−GD2、葉酸受容体ベータ、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、ポリシアル酸PLAC1、GloboH、NY−BR−1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY−ESO−1、LAGE−la、MAGE−A1、レグマイン、HPVE6、E7、MAGE Al、ETV6−AML、精子タンパク質17、XAGE1、Tie 2、MAD−CT−1、MAD−CT−2、Fos関連抗原1、p53、p53変異体、プロスタイン(prostein)、サバイビンおよびテロメラーゼ、PCTA−1/ガレクチン8、MelanA/MART1、Ras変異体、hTERT、肉腫転座切断点、ML−IAPERG(TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、アンドロゲン受容体サイクリンB l、MYCN、RhoC、TRP−2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY−TES1、LCK、AKAP−4、SSX2、RAGE−1、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2、腸管カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70−2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、およびIGLL1が含まれるが、これらに限定されない

0045

いくつかの実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、局在化ドメインに連結された抗CD3 scFvおよびCD19に結合するCARを含む。特定の実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、局在化ドメインおよび抗CD19−4−1BB−CD3ζCARに連結された抗CD3 scFvを含む。

0046

他の実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、局在化ドメインに連結された抗CD3scFvおよびCD3に結合するCARを含む。特定の実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、局在化ドメインおよび抗CD3−4−1BB−CD3ζCARに連結された抗CD3scFvを含む。

0047

特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたT細胞である。場合によっては、T細胞は細胞傷害性T細胞ヘルパーT細胞制御性T細胞エフェクターT細胞、記憶T細胞、ナチュラルキラーT細胞ガンマデルタT細胞などである。

0048

本明細書で概説するPEBLは、標的タンパク質の細胞膜への輸送を妨げる。例えば、本明細書に記載のCD3/TCR複合体のタンパク質を対象とするPEBLは、ERに保持されている。CD3εを対象とするPEBLは、内因性CD3と細胞内で共局在(co−localize)できる。したがって、細胞表面での内因性CD3発現は抑制される。いくつかの実施形態では、そのようなPEBLはCD3を抑制する。他の実施形態では、PEBLはTCRαβ発現を抑制する。CD3を対象とするPEBLは、CD3/TCRαβ発現を抑制することができる。場合によっては、PEBLは、操作された免疫細胞に免疫表現型の変化を引き起こさない。また、PEBLは操作された免疫細胞の増殖に影響を与えない。いくつかの実施形態では、PEBLは、抗CD19−4−1BB−CD3ζCARなどのCARと同時発現される。

0049

特定の態様では、CARは、CD20、CD22、CD33、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD45、CD52、CD38、CS−1、TIM3、CD123、メソセリン、葉酸受容体、HER2−neu、上皮増殖因子受容体、および上皮増殖因子受容体を含むがこれらに限定されない、腫瘍細胞の表面に発現する分子に結合する。いくつかの実施形態では、免疫活性化受容体はCAR(例えば、抗CD19−4−1BB−CD3ζCAR)である。特定の実施形態では、免疫活性化受容体は、CD20、CD22、CD33、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD45、CD52、CD38、CS−1、TIM3、CD123、メソセリン、葉酸受容体、HER2−neu、表皮増殖因子受容体、および表皮増殖因子受容体を含むがこれらに限定されない、腫瘍細胞の表面上に発現する分子に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント(例えばscFv)を含む。

0050

本発明によるキメラ抗原受容体(例えば、CAR)の膜貫通ドメインは、CD8α、CD8p、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcsRIγ、CD16(例えば、CD16AまたはCD16B)OX40、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD35、TCRα、CD32(例えば、CD32AまたはCD32B)、CD64(例えば、CD64A、CD64B、またはCD64C)、VEGFR2、FAS、およびFGFR2Bを含むがこれらに限定されないシングルパス膜タンパク質に由来し得る。いくつかの例では、膜タンパク質はCD8αではない。膜貫通ドメインは、天然に存在しない疎水性タンパク質セグメントであってもよい。

0051

キメラ抗原受容体(例えば、CAR)のヒンジドメインは、CD8αまたはIgGなどのタンパク質に由来し得る。ヒンジドメインは、CD8αの膜貫通またはヒンジドメインのフラグメント、または様々な長さの親水性残基からなるポリペプチドなどの非天然ペプチド、または(GGGGS)n(配列番号36)ポリペプチド(前記nは、例えば2〜12の整数である)であってよい。

0052

キメラ抗原受容体(例えば、CAR)のシグナル伝達ドメインは、CD3ζ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、または免疫細胞に活性化シグナルを送達することが知られている他の分子に由来し得る。受容体の少なくとも1つの同時刺激シグナル伝達ドメインは、4−1BB(CD137としても知られる)、CD28変異体、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM−1、TIM−3、LFA−1、またはCD2などの同時刺激分子であり得る。そのような分子は容易に入手可能であり、当技術分野で知られている。

0053

当業者によって理解されるように、免疫活性化受容体の構成要素は、本明細書に記載されるような多くの機能的組み合わせを含むように操作して、所望の結果を生み出すことができる。特定の抗CD19−4−1BB−CD3ζCARを例として使用すると、分子を結合する抗体(またはscFvなどのその抗原結合フラグメント)は、本明細書に記載されているように、異なる分子を結合する抗体と置き換えることができる(例えば、抗CD19の代わりに、抗CD20、抗CD33、抗CD123など)。他の実施形態では、同時刺激分子(この特定の例では4−1BB)は、異なる同時刺激分子、例えばCD28で変化させることもできる。いくつかの実施形態では、刺激分子(この特定の例ではCD3)は、別の既知の刺激分子で置き換えることができる。様々な実施形態では、受容体の膜貫通ドメインはまた、必要に応じて変化させることができる。そのような免疫活性化受容体の機能性に関する設計、産生、および試験は、当業者によって容易に決定され得る。同様に、このような免疫活性化受容体をコードする核酸の設計、細胞への送達、および発現は、容易に知られており、当技術分野で利用可能である。

0054

本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、複数のヌクレオチドモノマー(例えば、リボヌクレオチドモノマーまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー)を含むポリマーを指す。「核酸」には、例えば、ゲノムDNA、cDNA、RNA、およびDNA−RNAハイブリッド分子が含まれる。核酸分子は、天然に存在する、組換え、または合成のものであり得る。さらに、核酸分子は、一本鎖二本鎖または三本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子を修飾することができる。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は分子の片方または両方の鎖を指す。

0055

核酸に関する「ヌクレオチド配列」という用語は、リン結合(例えば、ホスホジエステルアルキルおよびアリールホスホネートホスホロチオエートホスホトリエステル結合)および/または非リン結合(例えば、ペプチドおよび/またはスルファメート結合)などの共有結合により接合された連続した一連ヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、例えば、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列は、異種配列(例えば、異なる種または細胞型起源の遺伝子)である。

0056

用語「ヌクレオチド」および「ヌクレオチドモノマー」は、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー、ならびにその天然に存在しない誘導体および類似体を指す。したがって、ヌクレオチドには、例えば、天然に存在する塩基(例えば、アデノシンチミジングアノシンシチジンウリジンイノシンデオキシアデノシンデオキシチミジンデオキシグアノシン、またはデオキシシチジン)を含むヌクレオチド、および当技術分野で既知の修飾塩基を含むヌクレオチドが含まれ得る。

0057

当業者によって理解されるように、いくつかの態様では、核酸はプラスミド配列をさらに含む。プラスミド配列は、例えば、プロモーター配列選択マーカー配列、および遺伝子座標的配列からなる群から選択される1つ以上の配列を含むことができる。

0058

本明細書で使用される場合、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードする遺伝子は、「PEBLをコードする遺伝子」と呼ばれることがある。

0059

特定の実施形態では、標的結合分子は抗体またはその抗原結合フラグメントである。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の抗体または抗体の抗原結合フラグメントを意味し、無傷の抗体または修飾されたまたは操作された、またはヒト抗体である抗原結合フラグメントを含む。修飾されたまたは操作された抗体の例は、キメラ抗体ヒト化抗体マルチパラトピック抗体(たとえば、バイパラトピック抗体(biparatopic antibody))、および多特異性抗体(たとえば、二重特異性抗体(bispecific antibody))である。抗原結合フラグメントの例には、Fab、Fab´、F(ab´)2、Fv、単鎖抗体(例えばscFv)、ミニ抗体(minibody)および二重特異性抗体(diabody)が含まれる。

0060

Fabフラグメント」は、1つの軽鎖と1つの重鎖のCH1および可変領域を含む。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。

0061

「Fc」領域は、抗体のCH2およびCH3ドメインを含む2つの重鎖フラグメントを含む。2つの重鎖フラグメントは、2つ以上のジスルフィド結合と、CH3ドメインの疎水性相互作用によって結合している。

0062

「Fab´フラグメント」には、1つの軽鎖と、VHドメインとCHIドメイン、およびCHIドメインとCH2ドメイン間の領域を含む1つの重鎖の一部が含まれ、2つのFab´フラグメントの2つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されF(ab´)2分子を形成する。

0063

「F(ab´)2フラグメント」は、2つの軽鎖とCH1ドメインとCH2ドメイン間の定常領域の一部を含む2つの重鎖を含み、2つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、F(ab´)2フラグメントは、2つの重鎖間のジスルフィド結合によって結合された2つのFab´フラグメントで構成されている。

0064

「Fv領域」は、重鎖と軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。

0065

特定の実施形態では、標的結合分子は単鎖Fv抗体(「scFv抗体」)である。scFvは、抗体のVHおよびVLドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、scFvが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにするVHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。scFvの総説については、Pluckthun(1994)The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113,Rosenburg and Moore eds.Springer−Verlag,New York,pp.269−315を参照されたい。PCT公開第WO88/01649および米国特許第4,946,778号および第5,260,203号も参照されたい。例として、本明細書に開示されるscFvのVHドメインとVLドメインとの間のリンカーは、例えば、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号37)またはGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号38)を含む。当業者によって理解されるように、様々な適切なリンカーは、当該技術分野において提供され、本明細書に開示されるように、最適な機能のために設計および試験され得る。

0066

PEBL分子の一部であるscFvは、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)または同様の抗体結合シグナル伝達受容体との関連で生じるscFvと必ずしも同じではない。いくつかの実施形態では、PEBL分子の一部であるscFvは、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)または同様の抗体結合シグナル伝達受容体との関連で生じるscFvと同じである。

0067

いくつかの実施形態では、標的結合分子(例えば、PEBL分子と関連するscFv)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号1および2のいずれか1つ以上と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する1つ以上のアミノ酸配列を含む。

0068

「配列同一性」という用語は、デフォルトギャップ重みを使用するプログラムGAPまたはBESTFITなどによって最適に整列させた場合、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、少なくとも、例えば70%の配列同一性、または少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも85%の配列同一性、または少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%以上の配列同一性を共有する意味する。配列比較では、通常、1つの配列が参照配列親配列など)として機能し、試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

0069

比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同アライメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman,Proc.Nat´l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)の類似法の検索により、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装(Wisconsin Genetics Software PackageのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、ウィスコンシン州マディソン)により、または目視検査により(一般的にAusubel et ah,Current Protocols in Molecular Biologyを参照)。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、BLASTアルゴリズムであり、これはAltschul et al,J.Mol.Biol.215:403(1990)に記載されている。BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから公開されている(National Institutes of HealthNCBIインターネットサーバーから公開されている)。通常、デフォルトのプログラムパラメータを使用して配列比較を実行できるが、カスタマイズされたパラメータも使用できる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワード長(W)3、期待値(E)10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989)を参照)。

0070

特定の実施形態において、抗体(例えば、scFv)は、それぞれ配列番号1および配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するVHおよびVLを含む。いくつかの実施形態では、抗体(例えばscFv)は、それぞれ配列番号1および配列番号2に示されるVHおよびVL配列に対して、それぞれ少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有する配列を有するVHおよびVLを含む。

0071

「二重特異性抗体(diabody)」は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントである。フラグメントは、同じポリペプチド鎖(VH−VLまたはVL−VH)中に軽鎖可変領域(VL)に接続された重鎖可変領域(VH)を含む。同じ鎖上の2つのドメインをペアリングするには短すぎるリンカーを使用すると、ドメインは別のチェーンの相補ドメインとペアリングさせられ、2つの抗原結合部位が作成される。二重特異性抗体は、例えば、特許文献EP404,097、WO93/11161、およびHolliger et al,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444−6448に記載されている。

0072

特定の実施形態では、抗体は三重特異性抗体(triabody)または四重特異性抗体(tetrabody)である。三重特異性抗体および四重特異性抗体を設計および生産する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Todorovska et al,J.Immunol.Methods248(l−2):47−66,2001を参照されたい。

0073

ドメイン抗体フラグメント」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。場合によっては、2つ以上のVH領域がペプチドリンカーと共有結合して、二価ドメイン抗体フラグメントを作成する。二価ドメイン抗体フラグメントの2つのVH領域は、同じ抗原または異なる抗原を標的とし得る。

0074

いくつかの実施形態では、抗体は修飾または操作されている。修飾または操作された抗体の例には、キメラ抗体、マルチパラトピック抗体(例えば、バイパラトピック抗体)、および多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体(bispecific antibody))が含まれる。

0075

本明細書で使用する場合、「マルチパラトピック抗体」とは、少なくとも2つの単一ドメイン抗体を含む抗体を意味し、少なくとも1つの単一ドメイン抗体は抗原上の第1の抗原決定基に対するものであり、少なくとも1つの他の単一ドメイン抗体は同じ抗原上の第2の抗原決定基に対するものである。したがって、例えば、「バイパラトピック」抗体は、抗原上の第1の抗原決定基に対する少なくとも1つの単一ドメイン抗体と、同じ抗原上の第2の抗原決定基に対する少なくとも1つのさらなる単一ドメイン抗体を含む。

0076

本明細書で使用する場合、「多特異性抗体」とは、少なくとも2つの単一ドメイン抗体を含む抗体を意味し、少なくとも1つの単一ドメイン抗体は第1の抗原に対するものであり、少なくとも1つの他の単一ドメイン抗体は第2の抗原に対するものである(第1の抗原とは異なる)。したがって、例えば、「二重特異性」抗体は、第1の抗原に対する少なくとも1つの単一ドメイン抗体と、例えば第1の抗原とは異なる、第2の抗原に対する少なくとも1つのさらなる単一ドメイン抗体を含む抗体である。

0077

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体、例えばマウスモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を産生する方法は、当該分野で公知である。例えば、Pluckthun(1994)The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer−Verlag,New York,pp.269−315を参照されたい。

0078

様々な実施形態において、PEBL分子に関連する標的結合分子は、標的分子に結合する受容体またはリガンドである。例えば、その標的結合分子は、PD−1(例えば、PD−L1またはPD−L2)に結合するリガンドであり得る。したがって、当業者によって理解されるように、標的結合分子は、抗体、または標的分子に結合するリガンド/受容体であり得る。

0079

本明細書で使用する場合、PEBL遺伝子に関連する「作動可能に連結された」とは、1つ以上の局在化ドメインをコードする1つ以上の遺伝子に隣接するフレームに(例えば、リンカーなしで)標的結合分子を直接コードする遺伝子を指す。あるいは、標的結合分子をコードする遺伝子は、本明細書に記載されるように、リンカー配列を介して1つ以上の局在化ドメインをコードする1つ以上の遺伝子に接続されてもよい。

0080

本明細書で使用する場合、PEBLタンパク質に関連する「連結された」とは、第1のドメイン、例えば標的結合分子の、第2のドメイン、例えば局在化ドメインへの接合を指す。リンカーはアミノ酸配列であり得る。当技術分野で公知の様々な適切なリンカーを使用して、標的結合分子を局在化ドメインにつなぐことができる。例えば、様々な長さの親水性残基からなるポリペプチド、または(GGGGS)n(配列番号40)ポリペプチド(前記nは例えば2〜12の整数である)などの天然に存在しないペプチドを、包括的に、本発明に従って使用することができる。特定の実施形態では、リンカーは、例えばGGGGSGGGGS(配列番号39)を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号37)を含む。様々な実施形態では、約5〜約100アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを、包括的に、本発明で使用することができる。特定の実施形態では、約20〜約40アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを本発明で使用することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも5アミノ酸、少なくとも10アミノ酸、少なくとも15アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも35アミノ酸、または少なくとも40アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを本発明で使用することができる。当業者によって理解されるように、そのようなリンカー配列およびそのようなリンカー配列の変異体は、当技術分野で知られている。リンカー配列を組み込む構築物を設計する方法、および機能性を評価する方法は、当業者に容易に利用可能である。

0081

特定の実施形態では、PEBL分子は、免疫細胞の表面上に発現される標的に結合する。いくつかの態様では、PEBL分子は標的分子の活性または機能を阻害する。例として、本明細書に開示されるように、PEBL分子は、例えば、TCRα、TCRβ、CD3(例えば、CD3ε、CD3γ、CD3δ、またはCD3ζ)、CD7、CD45、hB2MG、KIR2DL1、KIR2DL2/DL3、NKG2AまたはNKG2Dと結合するように設計され、これにより、そのような分子の細胞表面発現をダウンレギュレートする。このような分子のダウンレギュレーションは、例えば、分解および/または内部移行のために分子を局在化/標的化することにより達成できる。他の実施形態では、PEBL分子は標的を不活性にする(例えば、標的はその同族リガンドまたは受容体と相互作用および/または結合することができなくなる)。

0082

いくつかの実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は治療効果が増強される。本明細書で使用する「治療効果の増強」とは、ホストまたはレシピエントにおける移植片対宿主病(GVHD)の減少、ホストによる拒絶の減少または排除、ホストにおける生存期間延長、ホストにおける腫瘍、ホストにおける自己殺傷(self−killing)の減少、ホストにおける炎症カスケードの減少、またはホストにおけるCAR媒介シグナル伝達持続のうちの1つ以上を指す。

0083

本発明の特定の実施形態では、PEBL分子に関連する標的結合分子は、CD3/T細胞受容体(TCR)複合体の分子、サイトカイン、ヒトMHCクラスI分子、ヒトMHCクレームII分子、または免疫応答をダウンレギュレートする受容体に結合する。

0084

特定の実施形態では、CD3/TCR複合体の分子は、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、またはCD3ζであり得る。特定の実施形態では、分子はCD3δである。特定の実施形態では、分子はCD3γである。いくつかの実施形態では、分子はCD3εである。特定の実施形態では、分子はCD3ζである。

0085

別の実施形態では、MHCクラスI分子は、β−2ミクログロブリン、α1−ミクログロブリン、α2−ミクログロブリン、またはα3−ミクログロブリンであり得る。

0086

他の実施形態では、免疫応答をダウンレギュレートする受容体は、例えば、PD−1、CTLA−4、TIM−1、TIM−3、キラー免疫グロブリン様受容体(KIR、例えばKIR2DL1(CD158aとしても知られる)、KIR2DL2/DL3(CD158bとしても知られる))、CD94またはNKG2A(CD159aとしても知られる)、Src相同性領域2ドメイン含有ホスファターゼ(SHP)−1およびSHP−2などのタンパク質チロシンホスファターゼから選択される。したがって、このような受容体は、本明細書に記載されるように、PEBL分子の標的結合分子により標的化され得る。

0087

様々な実施形態では、PEBL分子の標的結合分子で標的化され得るサイトカインの例には、例えば、インターロイキン(IL)−6、IL−2、IL−4、IL−7、IL−10、IL−12、IL−15、IL−18、IL−21、IL−27、IL−35、インターフェロン(IFN)−γ、IFN−β、IFN−α、TNF−α、またはTGF−βが含まれる。さらなる態様において、PEBL分子は、例えばCD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD30、CD38、CD45、CD52、またはCD127から選択される分子に結合する。本発明の特定の態様では、PEBLは、糖タンパク質のCD1ファミリーメンバー、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD25、CD28、CD30、CD38、CD45、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD57、CD99、CD127、およびCD137を含むがこれらに限定されない細胞の表面で発現される分子に結合することができる。いくつかの態様において、PEBL分子はCD3ε、CD3γ、CD3δ、またはCD3ζに特異的に結合する。

0088

任意の標的タンパク質に対する抗体およびその抗体フラグメントを産生する方法は、当技術分野で周知であり、通例のものである。さらに、本明細書に例示されるように、様々な標的、例えばCD3およびCD7に対する市販の抗体を使用して、本明細書に例示されるPEBL分子を生成することができる。本明細書に例示されるように、当技術分野で公知の抗体、ならびにそれから誘導される抗体のフラグメント(例えばscFv)を本発明で使用することができる。

0089

他の態様では、PEBL分子の局在化ドメインは、小胞体(ER)保持配列KDEL(配列番号32)、またはKKXX(配列番号35)、KXDまたはKXE(Xは任意のアミノ酸であってよく、例えば、Gao C, et al,Trendsin Plant Science 19:508−515,2014を参照)およびYQRL(配列番号34)(例えば、Zhan J, et al,Cancer Immunol Immunother46:55−60,1998)などの他のERまたはゴルジ体保持配列、例えば「PEST」モチーフSHGFPPEVEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV(配列番号41)を含むプロテオソーム標的配列、および/またはCD8a膜貫通ドメイン、または本明細書に記載の別のシングルパス膜タンパク質の膜貫通(例えば、CD8a、CD8p、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcsRIy、CD16(CD16AまたはCD16Bなど)、OX40、CD3ζ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD35、TCRa、CD32(CD32AまたはCD32Bなど)、CD64(CD64A、CD64B、またはCD64Cなど)、VEGFR2、FAS、またはFGFR2B)などの、標的結合分子を細胞膜に標的化する配列を含む。本明細書に例示される特定の局在化ドメイン(配列)の例を図8aに示す。他の様々な局在化配列が知られており、当技術分野、例えばWO2016/126213で利用可能である。

0090

いくつかの実施形態では、本発明のPEBL分子は、1つ以上の局在化ドメインを含むことができる。例えば、PEBL分子は、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個の一緒に連結された局在化ドメインを有することができる。特定のPEBL分子で2つ以上の局在化ドメインを使用する場合、各局在化ドメインは、リンカーを介して、または介在せずに連結できる。場合によっては、CD8α膜貫通ドメイン、KDELモチーフ、リンカーなどの局在化ドメインを単一のPEBL分子で使用できる。この特定の構築物は介在性リンカーのない局在化ドメインを示しているが、局在化ドメインの一部またはすべての間に様々な介在性リンカーを組み込むことができる。他の例を図8Aに示す。

0091

当業者によって理解されるように、キメラ抗原受容体および/またはPEBL分子は、本明細書に開示される標的ならびに本明細書に開示される標的の変異体に結合するように設計され得る。例として、キメラ抗原受容体および/またはPEBL分子は、CD3/TCR複合体の分子、またはその天然に存在する変異体分子に結合するように設計することができる。そのような天然に存在する変異体は、分子の野生型と同じ機能を持つことができる。他の実施形態では、変異体は、分子の野生型と比較して変化する機能を有することができる(例えば、病的状態を与える)。

0092

当業者によって理解されるように、組み合わせが機能的なPEBLを産生する限り、PEBL分子構築物の様々な構成要素は、異なる組み合わせで(例えば、異なるリンカー、異なる局在化配列、異なるscFvなどを含むように)置換することができる。特定の構築物の機能性を評価する方法は、本明細書に開示されているように、当業者の範囲内である。

0093

さらなる態様では、本発明は、癌を治療するための、PEBL分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む操作された免疫細胞の使用であって、操作された免疫細胞の治療的有効量を、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。

0094

別の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸と、癌を治療するための局在化ドメインに連結された単鎖可変フラグメント(scFv)をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸と、を含む操作された免疫細胞の使用であって、操作された免疫細胞の治療的有効量を、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。いくつかの態様において、第1の核酸配列および第2の核酸配列はバイシストロン性である。

0095

他の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、自己免疫障害を治療するための局在化ドメインに連結された標的結合分子(例えば、scFv)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む操作された免疫細胞の使用であって、操作された免疫細胞の治療的有効量を、自己免疫障害の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。

0096

他の態様では、本発明はまた、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、および感染性疾患を治療するための局在化ドメインに連結された標的結合分子(例えば、scFv)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む操作された免疫細胞の使用であって、操作された免疫細胞の治療的有効量を、感染性疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。

0097

様々な実施形態において、キメラ抗原受容体はCAR(例えば、抗CD19−4−l−BB−CD3ζCAR)である。いくつかの実施形態では、局在化ドメインに連結されたPEBL分子または単鎖可変フラグメント(scFv)は、図8Aに示される任意の1つ以上の構築物から選択される。

0098

3.操作された免疫細胞の投与
本明細書では、PEBLおよび/またはCARを発現する操作された免疫細胞の治療的有効量を投与することにより、疾患または障害を軽減または改善することを目的とする方法が提供される。一実施形態では、操作されたCD3/TCRαβ陰性T細胞は、癌の症状を軽減、治療、または予防するために投与される。いくつかの実施形態では、操作されたCD3/TCRαβ陰性T細胞は、自己免疫疾患の症状を軽減、治療、または予防するために投与される。他の実施形態において、操作されたCD3/TCRαβ陰性T細胞は、移植手術を受けた際の移植片対宿主病または移植片拒絶を治療または予防するために投与される。

0099

「治療有効量」という用語は、患者に投与されたときに疾患(例えば、癌、感染症またはGVHD)の徴候およびまたは症状を緩和する、本発明の操作された免疫細胞(例えば、操作されたCD3/TCRαβ陰性T細胞)の量を指す。投与される実際の量は、機能的CD3/TCRαβ陰性T細胞が疾患に対して薬理活性を示すインビトロまたはインビボで行われた研究に基づいて決定することができる。例えば、標的細胞増殖の阻害についてCD3/TCRαβ陰性T細胞の量をアッセイすることができ、阻害を示すCD3/TCRαβ陰性T細胞の量は治療有効量を表すことができる。

0100

「薬学的組成物」とは、対象、例えばヒト対象への投与に適した組成物を指す。そのような組成物は、口腔(buccal)、動脈内、心臓内脳室内、皮内、筋肉内、眼内、腹腔内、脊髄内くも膜下静脈内、経口、非経口浣腸または坐剤を介して直腸、皮下(subcutaneous)、皮下(subdermal)、下、経皮、および経粘膜を含むがこれらに限定されない多数の経路の1つ以上を介した投与のために特に製剤化することができる。加えて、投与は、注射、液体ゲル、液滴、または他の投与手段によって起こり得る。

0101

本発明による操作されたT細胞は、適切な担体または希釈剤とともに、インビボでの投与に適切な薬学的組成物またはインプラントにされ得、これらはさらに薬学的に許容され得る。そのような組成物またはインプラントを作製する手段は、当技術分野において記載されている(例えば、Remington´s Pharmaceutical Sciences,16th Ed.,Mack,ed(1980)を参照されたい)。適切な場合、操作されたT細胞は、それぞれの投与経路の通常の方法で、カプセル溶液、注射、吸入剤、またはエアロゾルなどの半固体または液体形態の製剤に製剤化することができる。ほとんどの場合、薬学的に許容される形態は、PEBLおよび/またはCARを発現する細胞を無効にしない(not ineffectuate)ものである。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、平衡塩類溶液、好ましくはハンクス平衡塩類溶液、または生理食塩水を含む薬学的組成物にすることができる。

0102

いくつかの態様では、操作された免疫細胞は、対象への注入によって投与される。免疫細胞(例えば、同種異系または自己免疫細胞)を注入する方法は、当技術分野で知られている。病気の症状を改善するために、十分な数の細胞がレシピエントに投与される。典型的には、107〜1010個の細胞の投与量が、例えば、109個の細胞の投与量の1回の設定で注入される。注入は、1回の109個の細胞用量として、または数回に分けた109個の細胞用量として投与される。注入の頻度は、3〜30日ごと、または必要に応じて、または必要ならばより長い間隔にすることができる。注入の量は、一般に、対象ごとに少なくとも1回の注入であり、好ましくは、許容されるように、または疾患の症状が改善されるまで、少なくとも3回の注入である。細胞は、50〜250ml/時間の速度で静脈内に注入することができる。他の適切な投与様式には、動脈内注入、腫瘍への直接注射および/または手術後の腫瘍床の灌流人工足場の腫瘍部位への移植髄腔内投与、および眼内投与が含まれる。本発明をそのような送達様式に適合させる方法は、当業者に容易に利用可能である。

0103

特定の態様において、治療される癌は固形腫瘍または血液悪性腫瘍である。血液悪性腫瘍の例には、急性骨髄性白血病慢性骨髄性白血病骨髄異形成、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病多発性骨髄腫ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫が含まれる。固形腫瘍の例には、肺癌黒色腫乳癌前立腺癌結腸癌腎細胞癌卵巣癌膵臓癌肝細胞癌神経芽細胞腫横紋筋肉腫、および脳腫瘍が含まれる。

0104

4.操作された免疫細胞の生産
別の実施形態では、本発明は、本発明の操作された免疫細胞を産生する方法であって、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメイン(例えば、PEBL分子)に連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを免疫細胞に導入することと、それにより操作された免疫細胞を産生することと、を含む、方法に関する。

0105

特定の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸は、エクスビボまたはインビトロで免疫細胞に導入される。他の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸は、インビボで免疫細胞に導入される。

0106

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに「作動可能に連結され」ている。例えば、シグナル配列のDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのDNAに作動可能に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。標的結合分子をコードする核酸は、局在化ドメインをコードする核酸に作動可能に連結され得る。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されたDNA配列が連続的であること、および分泌リーダーの場合、連続的かつリーディングフレームであることを意味する。ただし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより、あるいは当業者によく知られているPCR/組換え法により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。

0107

いくつかの実施形態では、「免疫細胞」には、例えば、細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞、制御性T細胞、エフェクターT細胞、記憶T細胞、ナチュラルキラーT細胞、ガンマデルタT細胞などのT細胞が含まれるが、これらに限定されない。

0108

導入されるヌクレオチド配列を含む核酸は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体および局在化ドメインに連結された標的結合分子(例えばscFv)を含む単一のバイシストロン性構築物であり得る。本明細書に記載されるように、本明細書に記載のキメラ抗原受容体(例えばCAR)と標的結合分子(例えばscFv)をコードする2つのcDNAの間に内部リボソーム進入部位(IRES)または2Aペプチドコード領域部位を挿入することにより、単一のバイシストロン性構築物を調製することができる。いくつかの実施形態では、バイシストロン性構築物は、それらの間にIRESまたは2Aペプチドコード領域を有するPEBLの上流にCARを含む。いくつかの場合では、例示的なバイシストロン性構築物が図13Aに表されている。他の実施形態では、バイシストロン性構築物は、それらの間にIRESまたは2Aペプチドコード領域を伴うCAR上流のPEBLを含む。2つ以上の標的を削除するためのトリシストロン性送達システムの設計も実行可能でなければならない。あるいは、個々の構築物(例えば、CARおよびPEBL)の別々の形質導入(同時または連続)を実施することができる。外因性核酸を導入する方法は本明細書に例示されており、当技術分野で周知である。

0109

本明細書に記載の核酸は、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を使用して細胞に導入(直接形質導入)することができる。「レンチウイルスベクター」という用語は、特に、Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453−1464(2009)で提供される、自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。診療所で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、Oxford BioMedicaからのLENTIVECTOR(登録商標遺伝子送達技術、LentigenからのLENTIMAX(商標)ベクターシステムなどが含まれるが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られている。他の実施形態では、核酸を細胞に直接トランスフェクトすることができる。さらに他の実施形態では、核酸を細胞にエレクトロポレーションすることができる。エレクトロポレーションの詳細な方法は、Roth et al.,Nature,2018,559:405−409およびVan Tendello et al.,Gene Therapy,2000,7,1431−1437に記載されている。

0110

本明細書で使用されるように、不定詞「a」および「an」は、明らかに反対の指示がない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。

0111

本明細書に記載の操作された免疫細胞は、WO2016/126213に記載されているように、CD3に結合する局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むことができる。WO2016/126213の図2および表1および2ならびに以下の表1に記載される抗CD3PEBLの構成要素の配列。

0112

0113

5.CD3/TCRαβ陰性免疫細胞を産生するゲノム編集
上記のように、エフェクターT細胞上の免疫分子の発現のダウンレギュレーションは、たとえばメガヌクレアーゼ、TALEN、CRISPR/Cas9、およびジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した遺伝子編集法など、様々な他の既知の方法に従って達成できる。したがって、特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、修飾により標的遺伝子またはタンパク質を非機能的にする修飾遺伝子をさらに含む。例として、本発明の操作された免疫細胞は、CDタンパク質の発現を防止または低減する、および/またはその他の方法でCDタンパク質がCARによって認識または干渉されるのを(たとえば、構造的に)阻害する、修飾された(例えば、非機能性)TCRα遺伝子、TCRβ遺伝子、またはCD3遺伝子(例えば、メガヌクレアーゼ、TALEN、CRISPR/Cas9、またはジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して修飾された)をさらに含む。そのような方法を使用して遺伝子発現を改変する方法は、容易に入手可能であり、当技術分野で周知である。

0114

CRISPR/Cas6技術を使用して免疫細胞内の標的遺伝子を不活性化する方法は、例えば、米国特許公開番号US2016/0272999、US2017/0204372、およびUS2017/0119820に記載されている。

0115

CRISPR/Casシステムは、標的遺伝子の変化(ゲノム修飾)を誘発するシステムである。Cas9タンパク質による標的認識には、ガイドRNA(gRNA)内の「シード」配列と、gRNA結合領域の上流にあるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を含む保存されたマルチヌクレオチドが必要である。CRISPR/Casシステムは、細胞株、初代細胞、および操作された細胞のgRNAを再設計することにより、実質的に任意のDNA配列を切断するように操作できる。CRISPR/Casシステムは、単一のCas9タンパク質を2つ以上のgRNAと同時発現させることにより、複数のゲノム遺伝子座を同時に標的とすることができ、このシステムを、複数の遺伝子編集または標的遺伝子の相乗的活性化に独自に適合させている。遺伝子発現の阻害に使用されるCRISPR/Casシステムの例は、米国公開番号2014/0068797および米国特許番号8,697,359および8,771,945に記載されている。このシステムは、RNA誘導Cas9エンドヌクレアーゼを利用してエラーを起こしやすい修復経路をトリガーしてフレームシフト変異を引き起こすDNA二本鎖切断を導入する永続的な遺伝子破壊を誘導する。いくつかの場合、限定するものではないが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1およびCsx12しても知られる)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、T7、Fok1、当技術分野で知られている他のヌクレアーゼ、その相同体、またはその修飾型を含む他のエンドヌクレアーゼも使用することができる。

0116

CRISPR/Cas遺伝子破壊は、標的遺伝子に特異的なgRNA配列とCasエンドヌクレアーゼが細胞に導入され、Casエンドヌクレアーゼが標的遺伝子に二本鎖切断を導入できる複合体を形成するときに発生する。場合によっては、CRISPRシステムは、Casエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列および標的遺伝子に特異的なガイド核酸配列を含む1つ以上の発現ベクターを含む。ガイド核酸配列は遺伝子に特異的であり、Casエンドヌクレアーゼによって誘導される二本鎖切断の遺伝子を標的とする。ガイド核酸配列の配列は、遺伝子の遺伝子座内にあってもよい。一部の実施形態では、ガイド核酸配列は、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、またはそれ以上のヌクレオチド長である。ガイド核酸配列には、RNA配列、DNA配列、それらの組み合わせ(RNA−DNA組み合わせ配列)、またはペプチド核酸(PNA)やロックド核酸(LNA)などの合成ヌクレオチドを含む配列が含まれる。ガイド核酸配列は、単一分子または二重分子であり得る。一実施形態では、ガイド核酸配列は単一のガイドRNAを含む。

0117

いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、CRISPR/Casシステムを介して修飾されて、ヒトCD3遺伝子を不活性化することができる。ヒトCD3遺伝子のゲノム構造と配列の詳細は、例えば、NCBI GeneデータベースのGeneID番号6955(TCRα)、6957(TCRβ)、915(CD3δ)、916(CD3ε)、917(CD3γ)、および919(CD3ζ)に見出すことができる。

0118

特定の標的遺伝子をノックアウトするための市販のキット、gRNAベクターおよびドナーベクターは、例えばOrigene(メリーランド州ロックビル)、GenScript(ジョージア州アトランタ)、Applied Biological Materials(ABM;ブリティッシュコロンビアリッチモンド)、BioCat(ドイツ、ハイデルベルク)またはその他から入手できる。例えば、CRISPRを介したCD3δのノックアウト用の市販のキットまたはキット構成要素には、例えば、カタログ番号KN210010、KN210010G1、KN210010G2、およびKN210010Dとして入手可能なものが含まれ、CRISPRを介したCD3εδのノックアウト用のものには例えばカタログ番号KN208276、KN208276G1、KN208276G2、およびKN208276Dとして入手可能なものが含まれ、CRISPRを介したCD3γのノックアウト用のものには例えばカタログ番号KN220512、KN220512G1、KN220512G2、およびKN220512Dとして入手可能なものが含まれ、それぞれOriGeneから入手できる。また、CRISPRを介したCD3ζのノックアウト用のSanta Cruz Biotechnologyから入手可能な市販のキットまたはキット構成要素には、たとえば、カタログ番号sc−419554、sc−419554−HDR、sc−419554−NIC、およびsc−419554−NIC2として入手可能なものが含まれる。

0119

いくつかの実施形態では、CRISPR/Casシステムを使用して、本明細書で概説される核酸のいずれかを免疫細胞、例えばT細胞のゲノムに導入することができる。

0120

6.例示的な実施形態の詳細な説明
特定の実施形態では、操作された免疫細胞であって、(i)局在化ドメイン(例えば、PEBL)に連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、標的結合分子は、CD3結合する抗体であり、および局在化ドメインは、小胞体(ER)配列、ゴルジ体保持配列、プロテオソーム局在化配列、およびCD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナルドメインを含む、免疫細胞が提供される。場合によっては、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む別の核酸。特定の場合において、CARは4−1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメイン、およびCD分類19(CD19)に結合する抗体を含む。特定の実施形態では、標的結合分子に関連するCD3に結合する抗体は、配列番号1に記載のVH配列および配列番号2に記載のVL配列を含む。本明細書に記載されるように、特定の実施形態において、抗体は、配列番号1および配列番号2にそれぞれ示されるVHおよびVL配列に対して、それぞれ少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性を有する配列、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有するVHおよびVLを含む。いくつかの場合、抗体は単鎖可変フラグメント(scFv)である。いくつかの実施形態では、PEBLの局在化ドメインは、図8Aまたは表1に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、CARは、ヒンジおよび膜貫通配列をさらに含む。

0121

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたT細胞(例えば、操作された細胞傷害性T細胞、操作されたヘルパーT細胞、操作された制御性T細胞、操作されたエフェクターT細胞、操作された記憶T細胞、操作されたナチュラルキラーT細胞、および操作されたガンマデルタT細胞)、操作されたナチュラルキラー(NK)細胞、操作されたNK/T細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である。いくつかの場合、操作された免疫細胞は同種異系細胞である。他の場合、操作された免疫細胞は自己細胞である。

0122

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも6ヶ月、例えば6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16か月、17か月、またはそれ以上の間CD3/TCRαβ発現を欠く。他の実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも12ヶ月、例えば12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、22ヶ月、23か月、24か月、またはそれ以上の間CD3/TCRαβ発現を欠く。特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも20ヶ月、例えば20ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、24ヶ月、25ヶ月、26ヶ月、27ヶ月、28ヶ月、29ヶ月、30ヶ月、31か月、32か月、またはそれ以上の間CD3/TCRαβ発現を欠く。

0123

特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、相当する免疫細胞と比較して実質的に等しい速度で増殖する。

0124

本発明の操作された細胞は、特定の条件下、培地で増殖させることができる。いくつかの実施形態では、操作された細胞はIL−2の存在下で培養される。操作された細胞は、当業者に認識されている任意の方法に従って凍結保存することができる。患者に投与する前に、操作されたコール解凍して培養することができる。他の場合では、操作されたコールを投与前に増殖させることもできる。

0125

いくつかの実施形態において、対象は、操作された免疫細胞であって、その対象に対して同種異系である操作された免疫細胞が対象に投与されたとき、移植片対宿主病を発症する可能性が低減される。操作された免疫細胞は、CD19+白血病細胞の細胞傷害性を誘導できる。

0126

いくつかの態様では、本明細書に記載の操作された免疫細胞のいずれか1つを含む操作された免疫細胞の実質的に純粋な集団も提供され、操作された免疫細胞の少なくとも90%、例えば少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上、CD3/TCRαβ発現を欠いている。いくつかの場合、実質的に純粋な母集団は、少なくとも80%、例えば少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上、CD3/TCRαβ発現を欠く操作された免疫細胞を含む。

0127

いくつかの態様では、局在化ドメイン(例えば、PEBL)に連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供され、標的結合分子はCD3に結合する抗体であり、局在化ドメインは、小胞体(ER)配列、ゴルジ体保持配列、プロテオソーム局在化配列、およびCD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列である、保持シグナルドメインを含む。いくつかの場合、本明細書に記載の核酸を含む発現ベクターが提供される。場合によっては、発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。

0128

他の態様において、癌の治療を必要とする対象の癌を治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞の治療的有効量を対象に投与することと、それにより癌の治療を必要とする対象の癌を治療することと、を含む、方法も提供する。いくつかの態様では、癌の治療を必要とする対象の癌を治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞の実質的に純粋な集団の治療有効量を対象に投与することと、それにより癌の治療を必要とする対象の癌を治療することと、を含む、方法を提供する。

0129

いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の治療を必要とする対象の自己免疫疾患を治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞の治療有効量を対象に投与することと、それにより自己免疫疾患の治療を必要とする対象の自己免疫疾患を治療することと、を含む、方法も提供する。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の治療を必要とする対象の自己免疫疾患を治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞の実質的に純粋な集団の治療有効量を対象に投与することと、それにより自己免疫疾患の治療を必要とする対象の自己免疫疾患を治療することと、を含む、方法を提供する。

0130

特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるように、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む操作された免疫細胞の治療有効量を投与することを含む。場合によっては、第2の核酸はCARをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、CARは、4−1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにCD19またはCD3などのサイトカインに結合する抗体を含む。

0131

特定の実施形態では、癌には、CD3陽性癌、CD19陽性癌、固形腫瘍癌、血液癌、B細胞悪性腫瘍、例えばB細胞急性リンパ性白血病リンパ芽球性白血病B細胞慢性リンパ性白血病、B細胞非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。

0132

本明細書で使用される「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」または「治療(treatment)」という用語は、臨床的に許容される基準に従って、病状が改善される程度まで、医学的状態(例えば、悪性腫瘍、自己免疫疾患、移植片対宿主病、移植拒絶ウイルス感染、感染症など)に対抗することを指す。

0133

交換可能に使用される用語「対象」または「患者」は、哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類ウシヒツジ、ヤギ、ウマイヌネコウサギモルモットラット、マウス)を指す。特定の実施形態では、対象はヒトである。「治療を必要とする対象」とは、T細胞を誘導して標的細胞に対して特異的な細胞傷害性を発揮することにより治療(例えば、改善(improved)、改善(ameliorated)、予防)することができる疾患または状態を有する、または発症するリスクがある対象(例えば、患者)を指す。

0134

本明細書で定義されるように、「治療有効量」とは、対象に投与されたときに、投与条件下で対象において所望の治療効果を達成する(T細胞悪性腫瘍に関連する状態を治療する)のに十分な量を指す。投与される薬剤の有効量は、本明細書で提供されるガイダンスおよび当技術分野で知られている他の方法を使用して、および例えば、選択された特定の薬剤、対象の年齢感受性、薬物に対する耐性および全体的な健康状態を含むいくつかの要因に依存して、通常の技能臨床医が決定できる。

0135

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、治療、例えば、癌治療、自己免疫疾患治療、感染症治療、GVHD治療、および移植拒絶治療を必要とする対象に対して自己由来である。他の実施形態では、操作された免疫細胞は、治療を必要とする対象に対して同種異系である。本発明の単離された操作された免疫細胞は、複数の対象に投与することができ、GVHDのリスクを低減する「既製」免疫細胞になり得る。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、複数の対象(例えば、少なくとも2人以上の対象)への投与時にGVHD応答を誘発しない。

0136

特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、静脈内注射、静脈内注入、動脈内注入、皮下注射筋肉内注射胸骨内注射、腫瘍内注射、腫瘍への直接注射、および/または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、髄腔内投与、および眼内投与によって対象に投与される

0137

特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、対象への注入によって投与される。免疫細胞(例えば、同種異系または自己免疫細胞)を注入する方法は、当技術分野で知られている。病気の症状を改善するために、十分な数の細胞がレシピエントに投与される。典型的には、107〜1010個の細胞の投与量、例えば、109個の細胞の投与量が、で1回の設定で注入される。注入は、1回の109個細胞用量として、または数回に分けた109個の細胞用量として投与される。注入の頻度は、毎日、2〜30日ごと、または必要に応じて、または必要ならばより長い間隔にすることができる。注入の量は、一般に、対象ごとに少なくとも1回の注入であり、好ましくは、許容されるように、または疾患の症状が改善されるまで、少なくとも3回の注入である。細胞は、50〜250ml/時間の速度で静脈内に注入することができる。他の適切な投与様式には、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および/または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、髄腔内投与が含まれる。本発明をそのような送達様式に適合させる方法は、当業者に容易に利用可能である。

0138

特定の実施形態では、本発明による癌の治療方法は、少なくとも1つの他の既知の癌療法、例えば化学療法と組み合わされる。

0139

他の態様において、癌を治療するための本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞の使用であって、操作された免疫細胞の治療有効量を、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用も提供される。特定の実施形態では、癌はB細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態では、B細胞悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病、または非ホジキンリンパ腫である。

0140

特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射、および/または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与により投与される。

0141

いくつかの実施形態では、CARをコードするヌクレオチド配列およびPEBLをコードするヌクレオチド配列は連続的に導入される。他の実施形態では、CARをコードするヌクレオチド配列およびPEBLをコードするヌクレオチド配列は同時に導入される。特定の場合、CARをコードするヌクレオチド配列とPEBLをコードするヌクレオチド配列は機能的に連結されており、したがって単一の発現ベクターまたはプラスミドに導入することができる。

0142

特定の態様では、本明細書において提供されるのは、局在化ドメイン(例えば、PEBL)に連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、標的結合分子はCD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体であり、局在化ドメインは、ER配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含む。CD3/TCRαβ複合体タンパク質は、TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、およびCD3ζから選択できる。CD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体は、scFvであり得る。いくつかの例では、scFvは、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列とを含む。特定の例において、scFvは、配列番号1に示される可変重鎖(VH)配列および配列番号2に示される可変軽鎖(VL)配列を含む。上記のように、操作された免疫細胞は同種異系免疫細胞であり得る。たとえば、操作された免疫細胞は、「既製の」免疫細胞として使用できる。他の実施形態では、操作された免疫細胞は自己免疫細胞である。膜貫通ドメインは、CD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメインを含むことができる。例えば、膜貫通ドメインはCD8αからの膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、保持シグナル伝達ドメインは、KDEL、KKMP、KKTN、またはKKXX(Xは任意のアミノ酸であり得る)から選択されるアミノ酸配列を含む。局在化ドメインは、図8Aまたは表1に示されるアミノ酸配列を含むことができる。他の態様では、本明細書で概説される核酸を含む発現ベクターが提供される。特定の態様では、本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。

0143

別の態様では、操作された免疫細胞を産生する方法が提供される。この方法は、本明細書に概説した核酸を免疫細胞に導入することを含む。免疫細胞はT細胞であり得る。いくつかの場合、免疫細胞は同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を免疫細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、PEBLの核酸は、CARをコードする核酸に作動可能に連結されている。他の実施形態では、PEBLの核酸およびCARをコードする核酸は、バイシストロン発現のために配置される(例えば、両方の核酸配列は同じRNA転写物から発現される)。

0144

さらに別の態様では、局在化ドメインに連結した標的結合分子を含むポリペプチドが提供され、局在化ドメインは、小胞体(ER)配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列、およびCD8αに由来する膜貫通ドメインからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、およびこのポリペプチドは細胞によって分泌されず、細胞の細胞表面に発現されない。そのようなものとして、このポリペプチドは細胞内にとどまり、隣接細胞(例えば、癌細胞)と相互作用または結合しない。いくつかの場合、標的結合分子のC末端は、局在化ドメインのN末端に接続される。標的結合分子は、チェックポイント阻害剤、CDタンパク質、またはT細胞抗原に特異的に結合できる。標的結合分子は、単鎖可変フラグメントまたはscFvなどの抗体であり得る。場合によっては、scFvは、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列とを含む。特定の例において、scFvは、配列番号1に示される可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に示される可変軽鎖(VL)配列を含む。一部の実施形態では、保持シグナル伝達ドメインは、KDEL、KKMP、KKTN、またはKKXX(Xは任意のアミノ酸であり得る)から選択されるアミノ酸配列を含む。局在化ドメインは、図8Aまたは表1に示されるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本明細書で概説されるそのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。特定の実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。

0145

様々な態様において、本明細書に記載の操作された免疫細胞を産生するためのキットも提供される。本キットは、例えば、同種異系または自己エフェクターT細胞、同種異系または自己細胞傷害性T細胞、同種異系または自己ヘルパーT細胞、同種異系または自己制御性T細胞などを産生するために使用することができる。

0146

したがって、本明細書では、抗CD3εPEBLなどのPEBLをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むキットが提供される。いくつかの態様において、キットは、抗CD3εPEBLなどのPEBLをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。キットは、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従って設計することができる。

0147

特定の実施形態では、CARをコードするヌクレオチド配列および/またはPEBLをコードするヌクレオチド配列は、例えば、クローニングおよび/または発現を可能にする配列(例えば、プラスミドまたはベクター配列)をさらに含む。例えば、ヌクレオチド配列は、例えば細胞(例えば免疫細胞)へのトランスフェクションのために他のプラスミドおよび/またはベクターへのクローニングを容易にするためにプラスミドの一部として提供され得る。特定の実施形態では、CARをコードするヌクレオチド配列およびPEBLをコードするヌクレオチド配列は、単一のプラスミドまたはベクターで提供される。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、別個のプラスミドまたはベクターで提供される。

0148

いくつかの実施形態では、キットは、CD3/TCRαβ陰性免疫細胞を単離するための構成要素または試薬をさらに含む。特定の実施形態では、キットは抗CD3抗体または抗TCRαβ抗体を含む。CD3/TCRαβ陽性細胞を除去することにより、CD3/TCRαβ陰性免疫細胞を細胞集団から分離できる。キットには、CD3/TCRαβ陽性細胞に結合する抗CD3抗体に付着した固体支持体も含まれる。様々な実施形態では、キットは、CD3/TCRαβ陽性細胞に結合する抗TCRαβ抗体に付着した固体支持体を含むことができる。

0149

通常、キットは使いやすさのために区画化されており、試薬が入った1つ以上の容器を含むことができる。特定の実施形態では、キットの構成要素はすべて一緒に包装される。あるいは、キットの1つ以上の個別の構成要素を、他のキットの構成要素とは別のパッケージで提供できる。キットには、キットの構成要素を使用するための指示も含まれ得る。

0150

WO2016/126213およびKamiya et al.,Blood Advances,2018,2(8):517−528の開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

0151

本明細書では、以下に示す例示的な実施形態が提供される。

0152

実施形態1局在化ドメインに連結した標的結合分子を含むポリペプチドを含む操作されたCD3/TCRαβ陰性T細胞であって、標的結合分子はCD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作された細胞によって分泌されない、操作されたCD3/TCRαβ陰性T細胞。

0153

実施形態2。CD3/TCRαβ複合体タンパク質が、TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、およびCD3ζからなる群から選択される、実施形態1に記載の操作されたT細胞。

0154

実施形態3抗体が、単鎖可変フラグメント(scFv)である、実施形態1または2に記載の操作された免疫細胞。

0155

実施形態4scFvが、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列とを含む、実施形態3に記載の操作されたT細胞。

0156

実施形態5scFvが、配列番号1に記載の可変重鎖(VH)配列と配列番号2に記載の可変軽鎖(VL)配列とを含む、実施形態3に記載の操作されたT細胞。

0157

実施形態6操作されたT細胞が、操作されたCD4+T細胞または操作されたCD8+T細胞である、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0158

実施形態7操作されたT細胞が、操作されたヘルパーT細胞または操作された制御性T細胞である、実施形態1〜5のいずれか1つの操作されたT細胞。

0159

実施形態8操作されたT細胞が、操作されたエフェクターT細胞または操作された記憶T細胞である、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0160

実施形態9操作されたT細胞が、同種異系T細胞である、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0161

実施形態10操作されたT細胞が、自己T細胞である、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0162

実施形態11局在化ドメインが、CD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0163

実施形態12膜貫通ドメインが、CD8αに由来する膜貫通ドメインである、実施形態11に記載の操作されたT細胞。

0164

実施形態13ER保持配列が、KDEL(配列番号32)、KKMP(配列番号33)、KKTN(配列番号43)、またはKKXX(前記Xは任意のアミノ酸である)(配列番号35)から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態1〜12のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0165

実施形態14局在化ドメインが、図8Aのいずれか1つまたは配列番号11〜31のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0166

実施形態15CD3/TCRαβ発現が、操作されたT細胞においてブロックされる、実施形態1〜14のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0167

実施形態16CD3/TCRαβ発現の妨害が、少なくとも6ヶ月間または少なくとも12ヶ月間持続する、実施形態15に記載の操作されたT細胞。

0168

実施形態17操作されたT細胞が、相当するT細胞と実質的に同等の速度で増殖する、実施形態1〜16のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0169

実施形態18操作されたT細胞が、細胞の投与時に対象において移植片対宿主応答の低下を誘発する、実施形態1〜17のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0170

実施形態19操作されたT細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)をさらに含む、実施形態1〜18のいずれか1つに記載の操作されたT細胞。

0171

実施形態20CARが、抗CD19 scFvドメイン、4−1BB刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態19に記載の操作されたT細胞。

0172

実施形態21操作されたT細胞が、CD19+癌細胞の細胞傷害性を誘導する、実施形態20に記載の操作されたT細胞。

0173

実施形態22CARが、抗CD3 scFvドメイン、4−1BB刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態19に記載の操作されたT細胞。

0174

実施形態23操作されたT細胞が、CD3+癌細胞の細胞傷害性を誘導する、実施形態22に記載の操作されたT細胞。

0175

実施形態24操作されたT細胞の少なくとも90%がCD3/TCRαβ発現の妨害を示す、実施形態1〜23に記載の操作されたT細胞のいずれか1つを含む操作されたT細胞の実質的に純粋な集団。

0176

実施形態25操作されたT細胞の少なくとも95%がCD3/TCRαβ発現の妨害を示す、請求項24に記載の操作されたT細胞の実質的に純粋な集団。

0177

実施形態26自己免疫疾患またはウイルス疾患の治療を必要とする患者において自己免疫疾患またはウイルス疾患を治療する方法であって、実施形態1〜18のいずれか1つに記載の操作されたT細胞を含む薬学的組成物の治療的有効量を自己免疫疾患またはウイルス疾患を有する患者に投与することを含む、方法。

0178

実施形態27患者における移植片対宿主病の可能性を低減または排除する方法であって、実施形態1〜18のいずれか1つに記載の操作されたT細胞を含む薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、方法。

0179

実施形態28投与が静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、腹腔内、またはくも膜下腔内投与を含む、実施形態26または27に記載の方法。

0180

実施形態29癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法であって、実施形態19〜23に記載のいずれか1つの操作されたT細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を癌患者に投与し、それにより患者の癌を治療することを含む、方法。

0181

実施形態30癌がB細胞悪性腫瘍である、実施形態29に記載の方法。

0182

実施形態31B細胞悪性腫瘍が、再発性または難治性の急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞非ホジキンリンパ腫(B−NHL)、および大細胞B細胞リンパ腫からなる群から選択される、実施形態30に記載の方法。

0183

実施形態32投与が、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および/または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与を含む、実施形態29〜31のいずれか一項に記載の方法。

0184

実施形態33局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドであって、標的結合分子はCD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含む、ポリヌクレオチド。

0185

実施形態34CD3/TCRαβ複合体タンパク質が、TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、およびCD3ζからなる群から選択される、実施形態33に記載のポリヌクレオチド。

0186

実施形態35抗体が、scFvである、実施形態33または34に記載のポリヌクレオチド。

0187

実施形態36前記scFvが、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列とを含む、実施形態35に記載のポリヌクレオチド。

0188

実施形態37前記scFvが、配列番号1に示される可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に示される可変軽鎖(VL)配列とを含む、実施形態35に記載のポリヌクレオチド。

0189

実施形態38局在化ドメインが、CD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む、実施形態33〜37のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。

0190

実施形態39膜貫通ドメインがCD8αに由来する膜貫通である、実施形態38に記載のポリヌクレオチド。

0191

実施形態40保持シグナル伝達ドメインが、KDEL(配列番号32)、KKMP(配列番号33)、KKTN(配列番号43)、またはKKXX(前記Xは任意のアミノ酸である)(配列番号35)から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態33〜39のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。

0192

実施形態41局在化ドメインが、図8Aのいずれか1つまたは配列番号11〜31のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態33〜40のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。

0193

実施形態42実施形態33〜41のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

0194

実施形態43キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態42に記載の発現ベクター。

0195

実施形態44局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドと、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、バイシストロン性である、実施形態43に記載の発現ベクター。

0196

実施形態45実施形態42〜44のいずれか1つに記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

0197

実施形態46癌を治療するための、実施形態25または26における操作されたT細胞の実質的に純粋な集団の使用であって、実質的に純粋な集団の操作されたT細胞の治療有効量を、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用。

0198

実施形態47癌がB細胞悪性腫瘍である、実施形態46に記載の使用。

0199

実施形態48B細胞悪性腫瘍が、再発性または難治性の急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞非ホジキンリンパ腫(B−NHL)、および大細胞B細胞リンパ腫からなる群から選択される、実施形態47に記載の使用。

0200

実施形態49操作された免疫細胞の実質的に純粋な集団が、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および/または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与によって対象に投与される、実施形態46〜48のいずれか1つに記載の使用。

0201

実施形態50(i)請求項33〜41のいずれか一項に記載の局在化ドメインに連結された標的結合ドメインをコードするポリヌクレオチドをT細胞に導入することと、(ii)得られたCD3/TCRαβ陰性T細胞を単離することと、を含む、操作されたCD3/TCRαβ陰性T細胞を産生する方法。

0202

実施形態51T細胞が、同種異系T細胞である、実施形態50に記載の方法。

0203

実施形態52T細胞が、操作されたCD4+T細胞または操作されたCD8+T細胞である、実施形態50または51に記載の方法。

0204

実施形態53操作されたT細胞が、操作されたヘルパーT細胞または操作された制御性T細胞である、実施形態50または51に記載の方法。

0205

実施形態54操作されたT細胞が、操作されたエフェクターT細胞または操作された記憶T細胞である、実施形態50または51に記載の方法。

0206

実施形態55キメラ抗原受容体(CAR)をコードするポリヌクレオチドをT細胞に導入することをさらに含む、実施形態50〜54のいずれか1つに記載の方法。

0207

実施形態56局在化ドメインに連結された標的結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、CARをコードする核酸に機能的に連結されている、バイシストロン性である、実施形態55に記載の方法。

0208

実施形態57(i)キメラ抗原受容体(CAR)と、(ii)局在化ドメインに結合した標的結合分子を含む、操作されたCD3/TCRαβ陰性キメラ抗原受容体T(CAR−T)細胞であって、標的結合分子は、CD3/TCRαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソームからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作されたCAR−T細胞によって分泌されない、操作されたCD3/TCRαβ陰性キメラ抗原受容体T細胞。

0209

実施形態58CD3/TCRαβ複合体タンパク質が、TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、およびCD3ζからなる群から選択される、実施形態57に記載の操作されたCAR−T細胞。

0210

実施形態59抗体が、単鎖可変フラグメント(scFv)である、実施形態57または58に記載の操作されたCAR−T細胞。

0211

実施形態60scFvが、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する可変軽鎖(VL)配列を含む、実施形態59に記載の操作されたCAR−T細胞。

0212

実施形態61scFvが、配列番号1に示される可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に示される可変軽鎖(VL)配列とを含む、実施形態59に記載の操作されたCAR−T細胞。

0213

実施形態62操作されたCAR−T細胞が、操作されたCD4+T細胞または操作されたCD8+T細胞である、実施形態57〜61のいずれか1つに記載の操作されたCAR−T細胞。

0214

実施形態63操作されたCAR−TT細胞が、操作されたヘルパーT細胞または操作された制御性T細胞である、実施形態57〜61のいずれか1つに記載の操作されたCAR−T細胞。

0215

実施形態64操作されたCAR−T細胞が、操作されたエフェクターT細胞または操作された記憶T細胞である、実施形態57〜61のいずれか1つに記載の操作されたCAR−T細胞。

0216

実施形態65操作されたCAR−T細胞が、自己T細胞である、実施形態57〜64のいずれか1つに記載の操作されたCAR−T細胞。

0217

実施形態66操作されたCAR−T細胞が、同種異系T細胞である、実施形態57〜64のいずれか1つに記載の操作されたCAR−T細胞。

0218

実施形態67局在化ドメインが、CD8α、CD8β、4−1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む、実施形態57〜66のいずれか1つに記載の操作されたCAR−T細胞。

0219

実施形態68膜貫通ドメインがCD8αに由来する膜貫通ドメインである、実施形態67に記載の操作されたCAR−T細胞。

0220

実施形態69ER保持配列が、KDEL(配列番号32)、KKMP(配列番号33)、KKTN(配列番号43)、またはKKXX(前記Xは任意のアミノ酸である)(配列番号35)から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態57〜68のいずれか1つに記載の操作されたCAR−T細胞。

0221

実施形態70局在化ドメインが、図8Aのいずれか1つまたは配列番号11〜31のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態57〜69のいずれか1つに記載の操作されたCAR−T細胞。

0222

実施形態71CARが、CD3またはCD19に結合する、実施形態57〜70のいずれか1つに記載の操作されたCAR−T細胞。

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