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技術 生物学的標的に関する定量化における標的関連分子のシーケンシング出力決定及び解析

出願人 ビリオントゥーワン,インコーポレイテッド
発明者 ツァオ,デイヴィッドアタイ,オグザーン
出願日 2018年8月6日 (2年6ヶ月経過) 出願番号 2020-504691
公開日 2020年10月8日 (4ヶ月経過) 公開番号 2020-529202
状態 未査定
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード ピーク測定値 トリガー事象 測定値対 計算解析 ターゲットマーカー 同一区画 関連出力 時間的差分
関連する未来課題
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図面 (20)

課題・解決手段

方法及び/又はシステムの実施形態は、1以上の生物学的標的に関連する標的関連分子(例えば、スパイクイン分子)の組を作製すること;該組の標的関連分子を1以上の生物学的標的を含む1以上のサンプルと一緒に処理することに基づき、1以上のスパイクイン混合物を作製すること;1以上のスパイクイン混合物に1以上のサンガーシーケンシング操作を実施することと;1以上の存在量測定値を、1以上のサンガーシーケンシング操作からのクロマトグラム関連出力に基づき決定すること;及び/又は1以上の医学的状態特徴付けを、1以上の存在量測定値に基づき支援すること;を含むことができる。

概要

背景

概要

方法及び/又はシステムの実施形態は、1以上の生物学的標的に関連する標的関連分子(例えば、スパイクイン分子)の組を作製すること;該組の標的関連分子を1以上の生物学的標的を含む1以上のサンプルと一緒に処理することに基づき、1以上のスパイクイン混合物を作製すること;1以上のスパイクイン混合物に1以上のサンガーシーケンシング操作を実施することと;1以上の存在量測定値を、1以上のサンガーシーケンシング操作からのクロマトグラム関連出力に基づき決定すること;及び/又は1以上の医学的状態特徴付けを、1以上の存在量測定値に基づき支援すること;を含むことができる。A

目的

方法100及び/又はシステム200の実施形態は、これに加えて、又はこれに替えて、1以上の状態の特徴付け(例えば、診断)及び/又は治療(例えば、治療決定、治療評価、及びある期間に亘る調節(modification)を介して、等)を目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

妊婦に関連する母親のサンプルからの遺伝子疾患出生前診断支援するための方法であって、前記方法は:・第1標的関連配列であって、・生物学的標的の第1標的配列の第1標的配列領域と配列相同性を有する第1標的関連領域であって、前記生物学的標的は前記遺伝子疾患に関連する、前記第1標的関連領域と;・前記標的配列の配列領域と配列差異を有する標的変異領域と;を含む、前記第1標的関連配列を含む、標的関連分子の第1組を作製することと;・前記第1組の標的関連分子及び前記母親のサンプルからの第1核酸分子を共増幅させることに基づき、共増幅されたスパイクイン合物を作製することであって、前記第1核酸分子は前記標的配列領域を含む、ことと;・前記共増幅されたスパイクイン混合物をサンガーシーケンシングすることにより、前記第1標的関連領域、前記生物学的標的の前記標的配列領域、前記標的変異領域、及び前記生物学的標的の前記配列領域に関連する第1ピークを含む少なくとも1のクロマトグラム関連出力を決定することと;・標的関連存在量測定値の第1組を決定することであって、前記第1組の標的関連存在量測定値のそれぞれの標的関連存在量測定値は、前記第1標的関連配列の塩基及び前記第1標的配列の塩基の異なる対に対応し、前記第1組の標的関連存在量測定値の決定は、前記異なる対のそれぞれについて:・前記対の前記第1標的関連配列の前記塩基のピーク強度測定値を、前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定することと;・前記対の前記第1標的配列の前記塩基のピーク強度測定値を、前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定することと;・前記第1組の標的関連存在量測定値の標的関連存在量測定値を、前記第1標的関連配列の前記塩基の前記ピーク強度測定値及び前記第1標的配列の前記塩基の前記ピーク強度測定値に基づき決定することと;を含む、ことと;・全標的関連存在量測定値を、前記第1組の標的関連存在量測定値に基づき決定することと;・前記遺伝子疾患の前記出生前診断を、前記全標的関連存在量測定値と、リファレンス関連分子に対する生物学的リファレンスの存在量を表すリファレンス関連全存在量測定値との比較に基づき支援することと;を含む、方法。

請求項2

・前記遺伝子疾患は、染色体異常及び単一遺伝子疾患の少なくとも1を含み、・前記第1標的配列領域は、第1染色体及び突然変異の少なくとも1に関連し、・前記生物学的リファレンスのリファレンス配列領域は、第2染色体及び前記突然変異の欠如の少なくとも1に関連し、・前記遺伝子疾患の前記出生前診断の支援は、前記染色体異常及び前記単一遺伝子疾患のうちの前記少なくとも1の前記出生前診断を、前記全標的関連存在量測定値と前記リファレンス関連全存在量測定値との比較に基づき支援することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記遺伝子疾患は前記染色体異常を含み、前記第1標的配列は前記第1染色体の第1遺伝子座に対応し、前記方法は:・第2標的関連配列標的を含む標的関連分子の第2組を作製することであって、前記第2標的関連配列は:・第2標的配列の第2標的配列領域と配列相同性を有する第2標的関連領域を含み、・前記第2標的配列は、前記第1染色体の第2遺伝子座に対応する;ことと;・前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき、標的関連存在量測定値の第2組を決定することであって、前記第2組の標的関連存在量測定値の各標的関連存在量測定値は、前記第2標的関連配列の塩基と前記第2標的配列の塩基との異なる対に対応する、ことと;を更に含み、・前記全標的関連存在量測定値の決定は、前記第1組の標的関連存在量測定値及び前記第2組の標的関連存在量測定値に基づき、前記全標的関連存在量測定値を決定することを含み;・前記生物学的リファレンスの前記リファレンス配列領域は、前記第2染色体に関連する;請求項2に記載の方法。

請求項4

前記出生前診断の支援は、前記遺伝子疾患の前記出生前診断を、胎児分画測定、前記全標的関連存在量測定値、及び前記リファレンス関連全存在量測定値に基づき支援することを含む、請求項1に記載の方法。

請求項5

前記標的変異領域は、前記標的配列と比較して挿入及び欠失の少なくとも1を含み、前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力は、前記第1ピークに対応するアラインメント位置を含み、前記異なる対のそれぞれに関し、前記第1標的関連配列の前記塩基は、前記第1標的配列の前記塩基に対応する第2アラインメント位置とは異なる第1アラインメント位置に対応し、前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力の前記アラインメント位置は、前記第1及び前記第2アラインメント位置を含む、請求項1に記載の方法。

請求項6

標的分子を含むサンプルからの医学的状態特徴付けを支援するための方法であって、前記方法は:・標的関連配列であって、・生物学的標的の標的配列の第1標的配列領域と配列相同性を有する第1標的関連領域であって、前記生物学的標的は前記遺伝子疾患に関連する、前記第1標的関連領域と;・前記標的配列の配列領域と配列差異を有する標的変異領域と;を含む、前記標的関連配列を含む、標的関連分子の組を作製することと:・前記組の標的関連分子及び前記標的配列を含む前記標的分子に基づくサンガーシーケンシングを実施することにより、前記第1標的関連領域、前記生物学的標的の前記第1標的配列領域、前記標的変異領域、及び前記生物学的標的の前記配列領域に関連するピークの第1組を含む少なくとも1のクロマトグラム関連出力を決定することと;・前記第1組の前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力のピークに基づき、塩基の異なる対の組に関し、標的関連存在量測定値の組を決定することであって、前記組の塩基の異なる対からの塩基の異なる対はそれぞれ、前記標的関連配列の塩基と前記標的配列の塩基との対に対応する、ことと;・前記組の標的関連存在量測定値及びリファレンス関連分子に対する生物学的リファレンスの存在量を表すリファレンス関連存在量測定値の組に基づき、前記医学的状態の前記特徴付けを支援することと、を含む、方法。

請求項7

前記標的変異領域は、前記標的配列の前記配列領域に対し、置換、挿入、及び欠失の少なとも1を含み、前記組の標的関連存在量測定値の決定は、前記組の標的関連存在量測定値を、前記第1組のピーク並びに前記置換、前記挿入、及び前記欠失の前記少なくとも1に基づき決定することを含む、請求項6に記載の方法。

請求項8

前記標的変異領域は、前記挿入及び前記欠失の少なくとも1を含み、前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力は、前記第1組のピークに対応するアラインメント位置を含み、前記組の標的関連存在量測定値の決定は、前記異なる対のそれぞれについて:・前記アラインメント位置の第1アラインメント位置において、前記対の前記第1標的関連配列の前記塩基に関するピーク強度測定値を、前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定することと;・前記アラインメント位置の第2アラインメント位置において、前記対の前記第1標的配列の前記塩基に関するピーク強度測定値を、前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定することであって、前記第1アラインメント位置は前記第2アラインメント位置とは異なり、前記アラインメント位置は前記第1及び前記第2アラインメント位置を含む、ことと;・前記組の標的関連存在量測定値の標的関連存在量測定値を、前記標的関連配列の前記塩基の前記ピーク強度測定値及び前記第1標的配列の前記塩基の前記ピーク強度測定値に基づき決定することと;を含む、請求項7に記載の方法。

請求項9

・前記第1アラインメント位置は第1組のピークの第1ピーク及び第2ピークに対応し、・前記第1ピークは前記標的関連配列の重なっている塩基に対応し、・前記第1ピークは前記組の標的関連存在量測定値の第1標的関連存在量測定値に対応し、・前記第2ピークは前記標的配列の重なっている塩基に対応し、・前記第2ピークは前記組の標的関連存在量測定値の第2標的関連存在量測定値に対応する、請求項8に記載の方法。

請求項10

・前記医学的状態は、染色体異常、単一遺伝子疾患、及びがん状態の少なくとも1を含み、・前記第1標的配列領域は、第1染色体及び突然変異の少なくとも1に関連し、・前記生物学的リファレンスのリファレンス配列領域は、第2染色体及び前記突然変異の欠如の少なくとも1に関連し、・前記医学的状態の前記特徴付けの支援は、前記染色体異常、前記単一遺伝子疾患、及び前記がん状態の前記少なくとも1の前記特徴付けを、前記組の標的関連存在量測定値及び前記組のリファレンス関連存在量測定値に基づき支援することを含む、請求項6に記載の方法。

請求項11

少なくとも1の配列領域を、前記組の標的関連分子及び前記標的分子の少なくとも1に追加することを更に含み、前記少なくとも1の配列領域は、(a)第2標的配列領域と配列相同性を有する第2標的関連領域、及び(b)前記標的関連配列の領域及び前記標的配列の領域のうちの少なくとも1の、少なくとも1の反復配列、のうちの少なくとも1である、請求項6に記載の方法。

請求項12

・前記少なくとも1の配列領域の追加は、前記標的関連配列の前記領域及び前記標的配列の前記領域のうちの前記少なくとも1の、前記少なくとも1の反復配列を追加することを含み、・前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力の前記第1組のピークは、前記第1標的関連領域、前記生物学的標的の前記第1標的配列領域、前記標的変異領域、及び前記生物学的標的の前記配列領域に関する第1シーケンシングに対応し、・前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力は、前記第1標的関連領域、前記生物学的標的の前記第1標的配列領域、前記標的変異領域、及び前記生物学的標的の前記配列領域に関する第2シーケンシングに対応する第2組のピークを含み、・前記組の標的関連存在量測定値の決定は、前記組の標的関連存在量測定値を、前記第1組のピーク及び前記第2組のピークに基づき決定することを含む、請求項11に記載の方法。

請求項13

少なくとも1の反復配列を、前記組の標的関連分子及び前記標的分子の少なくとも1に追加することを更に含み、前記少なくとも1の反復配列の追加は、前記組の標的関連分子及び前記標的分子を、ヘアピン配列を含むプライマーの組と一緒に共増幅させることを更に含む、請求項6に記載の方法。

請求項14

標的分子を含むサンプルからの生物学的標的を定量化するための方法であって、前記方法は:・標的関連分子の第1組及び標的分子の組に関連する少なくとも1のクロマトグラム関連出力を、前記第1組の標的関連分子及び前記組の標的分子に関連するサンガーシーケンシングに基づき決定することであって、前記第1組の標的関連分子は:・生物学的標的の第1標的配列の第1標的配列領域と配列相同性を有する第1標的関連領域であって、前記組の標的分子は前記第1標的配列領域を含む、前記第1標的関連領域と;・第1標的配列の配列領域と配列差異を有する標的変異領域と;を含む、第1標的関連配列を含む、ことと、・塩基の異なる組の標的関連存在量測定値の第1組を、前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定することであって、前記塩基の異なる組の、塩基の異なる組はそれぞれ、前記第1標的関連配列の少なくとも1の塩基及び前記第1標的配列の少なくとも1の塩基を含む、ことと;・前記サンプルの前記生物学的標的の第1存在量を表す第1全存在量測定値を、前記第1組の標的関連存在量測定値に基づき決定することと、を含む、方法。

請求項15

・前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力の決定は、前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力を、第1組の標的関連分子、前記組の標的分子、及び第2組の標的関連分子に関連する前記サンガーシーケンシングに基づき決定することを含み、・前記第2組の標的関連分子は、第2標的配列の第2標的配列領域と配列相同性を有する第2標的関連領域を含む第2標的関連配列を含み、・前記方法は、前記第2標的関連配列及び前記第2標的配列の塩基の異なる組の標的関連存在量測定値の第2組を、前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定することを更に含む、請求項14に記載の方法。

請求項16

前記第1標的配列は、染色体の第1遺伝子座に対応し、前記第2標的配列は、前記染色体の第2遺伝子座に対応し、前記方法は、前記第1全存在量測定値に基づき染色体異常の特徴付けを支援することを更に含む、請求項15に記載の方法。

請求項17

前記生物学的標的は医学的状態に関連し、前記方法は、前記医学的状態の特徴付けを、前記第1全存在量測定値と、生物学的リファレンスの存在量を表す全リファレンス関連存在量測定値との第1比較に基づき支援することを更に含む、請求項14に記載の方法。

請求項18

・前記医学的状態は、単一遺伝子疾患及びがん状態の少なくとも1を含み、・前記第1全存在量測定値は第1期間に関連し、・前記方法は、前記生物学的標的の第2存在量を表す第2全存在量測定値を決定することを更に含み、前記第2全存在量測定値は第2期間に関連し、・前記医学的状態の前記特徴付けの支援は、前記医学的状態の前記特徴付けを、前記第1比較及び前記第2全存在量測定値に基づき支援することを含む、請求項17に記載の方法。

請求項19

・前記サンガーシーケンシングは:・第1組の標的関連分子を含む第1サンプルのサンガーシーケンシング;及び・前記組の標的分子を含む第2サンプルのサンガーシーケンシング;を含み、・前記少なくとも1種のクロマトグラム関連出力の決定は:・第1組の標的関連分子に関連する第1クロマトグラム関連出力を、前記第1サンプルの前記サンガーシーケンシングに基づき決定することと;・前記組の標的分子に関連する第2クロマトグラム関連出力を、前記第2サンプルの前記サンガーシーケンシングに基づき決定することと;を含み、・前記第1組の標的関連存在量測定値の決定は、前記第1組の標的関連存在量測定値を、前記第1クロマトグラム関連出力及び前記第2クロマトグラム関連出力に基づき決定することを含む、請求項14に記載の方法。

請求項20

前記少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づく第1組の標的関連存在量測定値の決定は、前記塩基の異なる組の前記第1組の標的関連存在量測定値を、ピーク強度、ピーク面積塩基型が共通する塩基のピーク測定値、及び塩基型が異なる塩基のピーク測定値の少なくとも1に基づき決定することを含む、請求項14に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2017年8月4日に出願された米国仮特許出願第62/541,565号明細書の優先権を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に組み込む。

0002

本開示は全体としてゲノミクス分野に関する。

図面の簡単な説明

0003

図1Aは、一方法の実施形態の変形形態フローチャートを図示したものを含む。
図1Bは、一方法の実施形態の変形形態のフローチャートを図示したものを含む。
図1Cは、一方法の実施形態の変形形態のフローチャートを図示したものを含む。
図2は、方法の実施形態の変形形態の略図を含む。
図3は、標的配列、標的関連配列、及び関連プライマーの具体例を含む。
図4は、ヘアピン配列を含むPCRプライマーの具体例を含む。
図5Aは、本方法の実施形態の一変形形態における、ヘアピン配列を含むPCRプライマーを用いた増幅産物の具体例を含む。
図5Bは、本方法の実施形態の変形形態における、ヘアピン配列を含むPCRプライマーを用いた増幅産物の具体例を含む。
図5Cは、本方法の実施形態の変形形態における、ヘアピン配列を含むPCRプライマーを用いた増幅産物の具体例を含む。
図5Dは、本方法の実施形態の変形形態における、ヘアピン配列を含むPCRプライマーを用いた増幅産物の具体例を含む。
図5Eは、本方法の実施形態の変形形態における、ヘアピン配列を含むPCRプライマーを用いた増幅産物の具体例を含む。
図6Aは、クロマトグラム関連出力及び存在量測定値(metric)の具体例を含む。
図6Bは、クロマトグラム関連出力及び存在量測定値の具体例を含む。
図7Aは、クロマトグラム関連出力及び存在量測定値の具体例を含む。
図7Bは、クロマトグラム関連出力及び存在量測定値の具体例を含む。
図8は、一方法の実施形態の一変形形態の略図を含む。
図9は、一方法の実施形態の一変形形態の略図を含む。
図10は、一方法の実施形態の一変形形態の一部分を図示したものを含む。
図11は、標的配列及び標的関連配列の具体例を含む。
図12Aは、一方法の実施形態の一変形形態の検証部分の結果を図示したものを含む。
図12Bは、一方法の実施形態の一変形形態の検証部分の結果を図示したものを含む。
図13Aは、一方法の実施形態の一変形形態の一部の略図を含む。
図13Bは、一方法の実施形態の一変形形態の一部の略図を含む。
図13Cは、一方法の実施形態の一変形形態の一部の略図を含む。

実施例

0004

以下の実施形態の説明(例えば、実施形態の変形形態、実施形態の実施例、実施形態の具体例、他の好適な変形等)は、これらの実施形態を限定することを意図しておらず、当業者によって作製及び利用することができる。

0005

1.概要
図1A〜1C及び2に示すように、方法100の実施形態(例えば、生物学的標的の存在量を決定するためのもの;1以上の状態の特徴付け支援するためのもの、等)は、次に示すことを含むことができる:1以上の生物学的標的に関連する標的関連分子(例えば、スパイクイン分子等)の組の作製S110;1以上のスパイクイン混合物の作製S120(例えば、該組の標的関連分子を、1以上のサンプル、例えば、1以上の生物学的標的を含む生物学的サンプル及び/若しくは合成サンプル一緒に処理することに基づく、等)(例えば、ここで、1以上のスパイクイン混合物は、正確度の向上(例えば、標的関連分子を1以上の生物学的標的と共増幅することに基づく等により、増幅バイアスを最小限に抑えることを介して;等)及び/若しくは展開性の向上(例えば、サンガーシーケンシング等のシーケンシング技術との適合性を介して、等)を支援(facilitate)するように構成することができる);例えば、1以上のスパイクイン混合物に基づく、1以上のシーケンシング操作の実施S130(例えば、サンガーシーケンシング、等);並びに/又は、例えば、1以上のスパイクイン混合物に関する1以上のシーケンシング操作に基づく(例えば、内在塩基及びスパイクイン塩基間の相対的なクロマトグラムピーク強度に基づく、等)、1以上の存在量測定値の決定S140(例えば、標的関連分子に対する標的分子の存在量比;等);を含むことができる。

0006

これに加えて、又はこれに替えて、方法100の実施形態は、次に示す1以上を含むことができる:リファレンス関連分子の組の処理S115(例えば、サンプル中のリファレンス分子に関連するものであり、ここで、1以上の状態の特徴付け及び/若しくは治療を支援することを目的として、該組のリファレンス関連分子に対し決定される存在量測定値を、標的関連存在量測定値と比較することができる;等);例えば、1以上の存在量測定値に基づく、1以上の状態の特徴付けの支援S150;治療の支援S160(例えば、1以上の存在量測定値に基づく、1以上の状態の治療、等);並びに/又は方法100の実施形態の1以上の部分の検証等の検証S105;及び/又は他の任意の好適なプロセス。

0007

特定の実施例において、方法100(例えば、妊婦に関連する母親のサンプルからの遺伝子疾患、例えば、1以上の染色体障害及び/又は単一遺伝子疾患の出生前診断を支援するためのもの、等)は、次を含むことができる:生物学的標的の標的配列の標的配列領域と配列相同性を有する標的関連領域(ここで、該生物学的標的は、遺伝子疾患に関連する)と、標的配列の配列領域と配列差異を有する標的変異領域と、を含む標的関連配列を含む、標的関連分子の組を作製することと;該組の標的関連分子及び母親のサンプルからの核酸分子(ここで、該核酸分子は標的配列領域を含む)の共増幅に基づき、共増幅されたスパイクイン混合物を作製することと;標的関連領域、生物学的標的の標的配列領域、標的変異領域、及び生物学的標的の配列領域に関連するピークを含む、少なくとも1のクロマトグラム関連出力(例えば、クロマトグラム、塩基に対応するピーク、ピーク強度等)を決定するために、共増幅されたスパイクイン混合物をサンガーシーケンシングすることと;標的関連存在量比(及び/又は他の好適な存在量測定値;等)の組を決定することと(ここで、該組の標的関連存在量比のそれぞれの標的関連存在量比は、標的関連配列の塩基と標的配列の塩基との異なる対に対応し(例えば、この対の塩基が同一の塩基型共有する場合;この対の塩基が異なる塩基型を共有する場合;等)、ここで、該組の標的関連存在量比の決定は、異なる対のそれぞれについて、次を行うことを含む:該対の標的関連配列の塩基のピーク強度測定値(例えば、ピークの最大強度;全体のピーク強度;等)を、少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき(例えば、サンガーシーケンシングに基づき決定されたピーク強度値に基づき;等)決定すること;該対の標的配列の塩基のピーク強度測定値を、少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定すること;及び標的関連配列の塩基のピーク強度測定値及び標的配列の塩基のピーク強度測定値に基づき、該組の標的関連存在量比の標的関連存在量比(例えば、標的関連分子の配列の塩基のピーク強度測定値に対する、標的配列の塩基のピーク強度測定値の比;等)を決定すること;該組の標的関連存在量比に基づき、全標的関連存在量比を決定すること);並びに/又は全体の標的関連存在量比と、リファレンス関連分子に対する生物学的リファレンスの存在量を表すリファレンス関連全存在量比(及び/又は他の好適なリファレンス関連存在量測定値;等)との比較に基づき、遺伝子疾患の出生前診断を支援すること。

0008

特定の実施例において、方法100(例えば、標的分子を含むサンプルから、医学的状態、例えば、遺伝子疾患及び/又はがん状態の1以上の特徴付けを支援するためのもの、等)は、次を含むことができる:生物学的標的(ここで、該生物学的標的は遺伝子疾患に関連する)の標的配列の標的配列領域と配列相同性を有する標的関連領域と、標的配列の配列領域と配列差異を有する標的変異領域と、を含む標的関連配列を含む標的関連分子の組を作製すること;標的関連領域、生物学的標的の標的配列領域、標的変異領域、及び生物学的標的の配列領域に関連するピークの組を含む少なくとも1のクロマトグラム関連出力を決定することを目的として、標的関連分子及び標的配列を含む標的分子の組に基づきサンガーシーケンシングを実施すること;少なくとも1のクロマトグラム関連出力の該組のピークに基づき、異なる塩基対の組に関し、標的関連存在量比(及び/又は他の好適な存在量測定値;等)の組を決定すること(ここで、該組の異なる塩基対のそれぞれの異なる塩基対は、標的関連配列の塩基と標的配列の塩基との対に対応する);並びに/又は該組の標的関連存在量比と、リファレンス関連分子に対する生物学的リファレンスの存在量を表す、リファレンス関連存在量比(及び/又は他の好適なリファレンス関連存在量測定値;等)の組とに基づき、医学的状態の特徴付け(例えば、検出、診断等)を支援すること(例えば、全標的関連存在量比と全リファレンス関連存在量比との比較に基づく特徴付けの支援;ここで、該全標的関連存在量比は、該組の標的関連存在量比の組合せに基づき決定することができ;ここで、該全リファレンス関連存在量比は、該組のリファレンス関連存在量比の組合せに基づき決定することができる;等)。

0009

特定の実施例において、方法100(例えば、標的分子を含むサンプルから生物学的標的を定量化するためのもの、等)は、次を含むことができる:標的関連分子の組及び標的分子の組に関連する少なくとも1のクロマトグラム関連出力を、該組の標的関連分子及び該組の標的分子に関連するサンガーシーケンシング(例えば、第三者によるもの、任意の好適な者によるもの;等)に基づき決定すること(ここで、該組の標的関連分子は:生物学的標的の標的配列の標的配列領域と配列相同性を有する標的関連領域と、標的配列の配列領域と配列差異を有する標的変異領域と、を含む、標的関連配列を含み、ここで、該組の標的分子は、標的配列領域を含む);異なる塩基の組に関する標的関連存在量比(及び/又は他の好適な存在量測定値;等)の組を、少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定すること(ここで、異なる塩基の組の、それぞれの異なる塩基の組は、標的関連配列の少なくとも1の塩基及び標的配列の少なくとも1の塩基を含む);並びに/又は該組の標的関連存在量比に基づき、サンプルの生物学的標的の存在量を表す全存在量測定値を決定すること。

0010

特定の実施例において、方法100は、次を含むことができる:標的関連核酸(例えば、スパイクイン核酸;等)の組を作製すること(ここで該核酸は、1以上の標的関連領域(例えば、標的関連領域を含む標的関連核酸配列を含む標的関連核酸の該組;サンプル中の標的分子(ここで、標的分子は生物学的標的に対応する)の標的配列の標的配列領域に一致するヌクレオチド配列を含む配列領域;等)を含み、該標的関連領域は、標的染色体(例えば、21番染色体;その場合、標的関連核酸の異なる組を作製することができ、異なる組は、21番染色体の異なる遺伝子座に対応させることができると共に、標的配列の異なる標的配列領域と配列相同性を有する異なる標的関連領域を含むことができ、異なる標的配列領域又は標的配列は異なる遺伝子座に対応させることができる;等)に関連し、1以上の変異領域(例えば、21番染色体を識別する標的配列等の標的配列に対し、配列挿入;配列欠失;複数のシャッフルされた塩基(shuffled bases)を有する変異配列等)を含む);該組の標的関連核酸を、サンプル(例えば、妊婦由来の母親の血液サンプル;等)からの標的核酸の組(例えば、21番染色体を識別する内在DNA分子)と混合すること;標的関連プライマーの組(例えば、標的関連核酸及び標的核酸に共通する配列をターゲットとするもの)に基づき、該組の標的関連核酸と該組の標的核酸とを共増幅し(例えば、異なる遺伝子座に対応する標的関連核酸の異なる組のそれぞれについて、該組の標的関連核酸を、該遺伝子座に対応する該組の標的核酸と一緒に共増幅する;等)、それによって、1以上のスパイクイン混合物を作製すること;1以上のクロマトグラム関連出力を決定することを目的として、1以上のスパイクイン混合物について(及び/又は標的関連核酸の該組について別々に、標的核酸について別々に、及び/又は他の好適な分子について)サンガーシーケンシングを実施すること;標的配列塩基と標的関連配列塩基との対について(例えば、標的配列の本来の配列の位置と標的関連配列のシフトした配列位置とに対応する同一塩基型の対について(例えば、標的関連配列の変異領域が、1以上の挿入及び/又は欠失を含む場合);変異領域に対応する位置で(例えば、変異領域が、標的配列に対しシャッフルされた塩基型の組を含む場合);等.)、1以上のクロマトグラム関連出力(例えば、サンガーシーケンシングからのクロマトグラム;ピークデータ、例えば、サンガーシーケンシングからのピーク強度測定値等のピーク強度データ;等)の統計学推定解析(例えば、一般線回帰、非負拘束最小二乗法圧縮センシングランダムサンプルコンセンサス;等.)を実施することと;各対について、標的配列塩基のピーク強度測定値(例えば、ピークの最大強度;全体のピーク強度;等)(及び/又は他の好適なシーケンシング出力)を、標的関連配列塩基のピーク強度測定値(及び/又は他の好適なシーケンシング出力)に対して比較することに基づき、内在対スパイクインの個々の存在量比を抽出することと;個々の存在量比に基づき、全存在量比を得ること(例えば、標的配列塩基と、21番染色体の複数の標的遺伝子座に関連する標的関連配列塩基との異なる対の個々の存在量比を平均する;遺伝子座全体の存在量比を平均する;等.);並びに存在量比に基づき(例えば、方法100の一実施形態の一部分に従い、リファレンス関連分子をサンプル由来のリファレンス分子と一緒に処理することに基づき18番染色体等のリファレンス染色体に関し算出されたリファレンス全存在量比に対し、21番染色体の全存在量比を比較することに基づく;ここで、この比較は、ダウン症候群及びエドワーズ症候群の特徴付けを支援することができる;等)、1以上の状態の1以上の特徴付け(例えば、ダウン症候群診断、他の状態の特徴付け、シーケンシング出力の解析等)を支援すること。

0011

方法100及び/又はシステム200の実施形態は、1以上の生物学的標的の存在量測定値(例えば、分子の計数値)の決定に関し、費用効果を改善(例えば、サンガーシーケンシング技術を活用することを介して、等)、展開性を改善(例えば、ゲノムシーケンシングシステムの利用が限られている国において、等)、及び正確度を向上(例えば、1%未満の変動係数で、及び/又は任意の好適な正確性で、等)する役割を果たすことができる。方法100及び/又はシステム200の実施形態は、これに加えて、又はこれに替えて、1以上の状態の特徴付け(例えば、診断)及び/又は治療(例えば、治療決定、治療評価、及びある期間に亘る調節(modification)を介して、等)を目的とする、存在量測定値の活用に役立つことができる。方法100及び/又はシステム200の実施形態は、これに加えて、又はこれに替えて、例えば、用途(例えば、デジタルPCR)の多重化能力の増大、用途(例えば、qPCR)の正確度の向上、及び/又は任意の他の好適な改善により、従来の手法の問題を克服するのに役立つことができる。しかしながら、実施形態は任意の好適な機能性を含むことができる。

0012

方法100及び/又はシステム200の実施形態は、1以上の状態に関連して使用することができ(例えば、特徴付け、診断、治療、及び/又は1以上の状態に関連するプロセスの実施に関連するもの;等)、ここで、該状態は、次に示す1以上を含み得る、及び/又はそれ以外の形で関連し得る:無侵襲的出生前遺伝学的検査(NIPT)(例えば、次に示すものの有無の遺伝学スクリーニングに関して:異数性(例えば、21トリソミー、即ちダウン症候群、18トリソミー、即ちエドワーズ症候群、13トリソミー、即ちパトー症候群性染色体異数性、例えば、ターナー症候群、他の好適な異数性)を含む染色体異常ディジョージ症候群を含む染色体異常;単一遺伝子疾患に関する遺伝学的スクリーニングに関連するもの;希少変異が関連する状態;等);他の出生前検診;異数性解析及び/又は出生前に関連するもの以外の他の好適な解析;遺伝子疾患(例えば、鎌状赤血球病及び/又は希少変異が関与する状態を含む単一遺伝子疾患;染色体異常;遺伝子増幅に関連する疾患;遺伝子欠失;部分的染色体異常;22q11.2欠失症候群、即ちディジョージ症候群;シャルコー・マリー・トゥース病、嚢胞性線維症ハンチントン病デュシェンヌ型筋ジストロフィー血友病サラセミア;希少変異が関与する状態等)、染色体異常が関連する他の状態(例えば、染色体DNAの追加、欠失、乱れ(irregular)等)、希少変異が関連する状態、がん(例えば、腫瘍生検中の腫瘍遺伝子の遺伝子増幅解析を介して;HER2、MET、MYC−N、MYC−C、EGFR、FGFR1、ER/PR、KRAS、UGT1A1、c−KIT、CD20、CD30、FIP1L1−PDGFRalpha、PDGFR、VCR/ABL、PML/RAR−alpha、TPMT、UGT1A1、EML4/ALK、BRAF、及び/又は任意の他の好適な腫瘍遺伝子、がんバイオマーカー、及び/又は他のがん関連標的の1以上が関連する解析を介して;ハーセプチン等の治療の決定及び/又は評価において、ある期間に亘る血中循環腫瘍DNAの拡散(prevalence)を評価するための生検サンプルの解析;等)、及び/又は任意の他の好適な状態。状態は、これに加えて、又はこれに替えて、次を含むことができる:精神及び行動状態(例えば、精神疾患鬱病精神病;等);意思疎通に関係する状態(例えば、表出言語障害吃音音韻障害;自閉性障害;発声状態聴覚状態;眼の状態;等);睡眠に関係する状態(例えば、不眠睡眠時無呼吸;等);心血管に関係する状態(例えば、冠動脈疾患高血圧症;等);代謝に関係する状態(例えば、糖尿病等)、リューマチに関係する状態(例えば、関節炎等);体重に関係する状態(例えば、肥満等);疼痛に関係する状態;内分泌に関係する状態;遺伝に関係する状態;慢性疾患;及び/又は任意の他の好適な種類の状態。

0013

方法100及び/又はシステム200の実施形態は、これに加えて、又はこれに替えて、ある物(entity)(例えば、サンプル、標的、リファレンス、合成分子、使用者、サンプル取扱いシステム、シーケンシングシステム、計算システム、等)を異なる状態又は事物に変換することができる。例えば、方法100は、生物学的標的に対し共通領域(例えば、共通ヌクレオチド配列)及び変異領域(例えば、シャッフルされたヌクレオチド配列)を含むスパイクイン分子(例えば、標的関連分子等)を合成することを含むことができ、ここで、この種のスパイクイン分子は、増幅バイアスを最小限に抑えながら(例えば、標的関連分子及び標的分子が両方共等しい効率で共増幅される場合;等)、正確な存在量決定を行うのに適した形態に変換するために、標的分子と一緒に処理する(例えば、同一プライマーを用いて標的分子と共に共増幅する等)ことができ、これは、例えば、スパイクイン混合物のサンガーシーケンシング、及びそれに伴うサンガーシーケンシング結果に基づく計算解析を実施することによる。この種のプロセスにより、以前は実施できなかった、存在量の定量化(例えば、標的分子の、リファレンス分子の、等)、状態の特徴付け(例えば、1以上の状態の診断の向上等)、及び/又は治療(例えば、スパイクイン分子及び標的分子(例えば、異なる遺伝子座に関連する標的分子)の、意味のある定量化及び比較の正確度向上の支援を介して;ある期間に亘り治療を提供及び評価することを目的とする、ある期間に亘る存在量の決定を支援することを介して;等)が可能になる。しかしながら、方法100及び/又はシステム200の実施形態は、任意の他の好適な利益(例えば、方法100の実施形態の非従来的な部分を実施するためのシステム200の実施形態の一部分の一般化していない構成要素を用いることに関するもの)を提供することができる。

0014

これに加えて、又はこれに替えて、本明細書に記載するデータ(例えば、存在量測定値;特徴付け;シーケンシング出力;比;識別子;分子設計、例えば、標的関連分子設計、リファレンス関連分子設計、プライマー設計実験設計;配列設計;配列領域設計;実験結果;検証結果;状態に関係するデータ;治療に関係するデータ;等)は、次に示す1以上:いつデータを収集、決定、送信、受信、及び/若しくはそれ以外の形で処理したかを示す時間的指標;そのデータにより表される内容に状況を付与する時間的指標、例えば、スパイクイン混合物作製及び/若しくは好適なシーケンシングライブラリー作製及び/若しくはシーケンシングの異なる段階を示す時間的指標;時間的指標の変化(例えば、1以上の状態の特徴付けの支援及び/又はがん状態の監視に関連するもの等の治療の支援に使用することができる、ある期間に亘る存在量測定値等の、ある期間に亘るデータ;データの変化;データのパターン;データの傾向;データの外挿及び/又は他の予測;等);並びに/又は時間が関与する任意の他の好適な指標;を含む、任意の好適な時間的指標(例えば、秒、分、時間、日、週、期間、時点、時刻印、等)を伴うことができる。

0015

これに加えて、又はこれに替えて、条件、測定値、入力値出力値、及び/又は本明細書に記載する他の好適なデータは、次に示す任意の1以上を含む種類の値を伴うことができる:評点バイナリ値クラス分類信頼性レベル、識別子(例えば、サンプル識別子、本明細書に記載する任意の好適な分子の分子識別子、等)、スペクトルに沿った値、及び/又は任意の他の好適な種類の値。本明細書に記載する任意の好適な種類のデータは、方法100及び/又はシステム200の実施形態に関連する任意の好適な構成要素を得るために、入力値として使用すること、出力値として生成すること、及び/又は任意の好適な様式で操作することができる。

0016

方法100及び/又は本明細書に記載するプロセスの実施形態の1以上の段階及び/又は一部分は、非同時に(例えば、順次)、同時に(例えば、並行して;サンプルの多重的な自動化方式による同時処理;サンガーシーケンシングにより生成したピークデータ及び/又はクロマトグラム等の出力の、システムの処理能力を向上するための同時計算処理;任意の好適な数のサンプル、混合物、シーケンシング出力、及び/又は他の構成要素の、任意の好適な同時計算処理;多重サンプル調製及び/又はシーケンシング操作;等)、トリガー事象に時間的に関連させて、及び/又は任意の他の好適な順序で、任意の好適な時点及び頻度で、本明細書に記載するシステム200の段階、構成要素、及び/又は物の1以上により、及び/又はこれらを用いて、実施することができる。

0017

システム200の実施形態は、分子を作製し(例えば、標的関連分子;リファレンス関連分子;等)、サンプルを処理し(例えば、生物学的サンプル;合成サンプル;利用者由来のサンプル;等)、及び/若しくは他の好適なプロセスを実施するように構成された1以上のサンプル取扱いネットワーク;スパイクイン混合物、他の混合物、及び好適なサンプル、並びに/若しくは任意の好適な構成要素に由来する遺伝物質配列決定処理するように構成された1以上のシーケンシングシステム(例えば、サンガーシーケンシングシステム;等);1以上のシーケンシングシステムのシーケンシング出力を解析する(例えば、1以上の存在量測定値の決定において;1以上の状態の特徴付けの支援において;治療の支援において;等)ように構成された、1以上の計算システム(例えば、遠隔計算システム局所計算システム、等);並びに/又は任意の他の好適な構成要素;を含むことができる。方法100及び/又はシステム200の実施形態の一部分は、好ましくは、第一者により実施されるが、これに加えて、又はこれに替えて、第三者、利用者、及び/又は任意の好適な者(例えば、看護者実験技術者、等)の1以上により実施することができる。

0018

しかしながら、方法100及びシステム200は、任意の好適な様式で構成することができる。

0019

2.1 標的関連分子の作製
方法100の実施形態は、1以上の標的関連分子の作製S110(例えば、1以上の生物学的標的に関連するもの等)を含むことができ、これは、1以上の標的(例えば、生物学的標的等)と、1以上の特徴(例えば、配列的特徴機能的特徴構造的特徴進化的特徴等)が共通している1以上の分子を合成する役割を果たすことができ、これは、バイアス(例えば、増幅バイアス等)を低減すること、及び/又は下流の処理(例えば、線形回帰等の統計学的推定;ピーク解析;存在量比の決定を支援するための、異なる配列の塩基の対及び/又は組の関連付け(association)及び/又は識別;デコンボリューション;ある期間に亘る、方法100の実施形態の複数の段階の実施;等)における正確度を向上することを目的として、類似の条件でサンプル処理する(例えば、標的関連分子及び標的分子を含むスパイクイン混合物をシーケンシングするため、標的関連分子を個々に、又は標的分子を個々にシーケンシングするための、サンガーシーケンシング条件;標的関連分子及び標的分子の共増幅、リファレンス関連分子及びリファレンス分子の共増幅等の、PCRをベースとする増幅における類似の増幅パラメータ;等)ことに役立つことができる。

0020

標的関連分子は、好ましくは、1以上の標的関連配列(例えば、ヌクレオチド配列;標的関連分子の組のそれぞれの標的関連分子は、同一又は類似の標的関連分子の配列に対応する;等)を含み、標的関連配列は、1以上の標的関連領域を含むことができる。例えば、標的関連配列は、1以上の生物学的標的の1以上の標的配列の1以上の標的配列領域(例えば、生物学的標的に対応する標的配列;等)と配列相同性(例えば、完全配列相同性;百分率及び/又は量の閾値を超える配列相同性;等)を有する標的関連領域を含むことができ、1以上の生物学的標的は、1以上の医学的状態に関連し得る。

0021

標的関連領域(及び/又は標的関連分子及び/又は標的関連配列)は、好ましくは、1以上の生物学的標的及び/又は標的分子(例えば、生物学的標的に対応する標的分子;生物学的標的の標的配列領域を含む標的分子;等)に関連している(例えば、一緒にヌクレオチド配列が共通している;標的配列と対応する位置の塩基の組が共通している;一緒に処理することができる;一緒にサンガーシーケンシングすることができる;共増幅等により一緒に増幅させることができる;同一プライマーのターゲットとすることができる;相補的である;ターゲットとしている;計算システムにおいて数字上関連している;等)。生物学的標的(例えば、ターゲットマーカー;1以上の医学的状態に、対応する、引き起こす、寄与する、治療的に関連する、相関関係にある、及び/又はそれ以外の形で関連するもの;対象とする標的;既知又は同定されている標的;未知又は過去に確認されていない標的;等)は、次に示す任意の1以上を含むことができる:標的配列領域(例えば、染色体を識別する配列;状態を示唆する配列;被検者集団及び/又は任意の好適な組に亘り不変の配列;保存配列突然変異多型を含む配列;ヌクレオチド配列;アミノ酸配列;等)、遺伝子(例えば、1以上の単一遺伝子疾患に関連するもの等)、遺伝子座、染色体(例えば、1以上の染色体異常に関連するもの;等)タンパク質(例えば、血清タンパク質、抗体、等)、ペプチド炭水化物、脂質、核酸(例えば、細胞外RNA、microRNA、メッセンジャーRNA(ここで、RNA標的の存在量決定は、好適な逆転写酵素による操作を含むことができる)等)、細胞(例えば、全細胞等)、代謝産物天然産物、がんバイオマーカー(例えば、腫瘍が分泌する分子;がんの存在に反応して分泌される分子;等)、遺伝的素因バイオマーカー、診断用バイオマーカー、予後バイオマーカー、予測バイオマーカー、他の分子バイオマーカー遺伝子発現マーカーイメージングバイオマーカー、及び/又は他の好適な標的。標的は、好ましくは、本明細書に記載する状態に関連するものであり、これに加えて、又はこれに替えて:徴候、原因、疾患、障害、及び/又は状態に関連する任意の他の好適な様相を含む、1以上の状態に関連し得る。一実施例において、標的関連分子は、標的分子の標的配列の1以上の領域(例えば、21番染色体を識別するもの)と同一のヌクレオチド配列を含むことができ、ここでプライマーは、同一領域をターゲットとすることにより、標的関連分子及び標的分子の両方を同時にターゲットとすることができる(例えば、共増幅を、例えば増幅バイアスの低減を目的として支援するため、等)。一実施例において、図3に示すように、標的関連配列(例えば、“spk”配列)は、標的配列の標的配列領域(例えば、“hg19”配列)と配列相同性を有する標的関連領域を含むことができ、例えば、プライマーの組(例えば、1回目のPCRプロセス用、2回目のPCRプロセス用;“chr21:14439004_PCR2_FP”、“chr21:14439076_PCR2_RP_hp”、“chr21:14439004_PCR1_FP”、“chr21:14439076_PCR1_RP”;1以上のヘアピン配列を含むPCRプライマー;等)は、標的関連配列及び標的配列の両方をターゲットとすることができる(例えば、共増幅及び対応する増幅バイアスの低減の支援するために;等)。一実施例において、標的関連分子は、標的配列と同一の任意の好適な配列を有する配列を含むことができ、標的関連分子及び標的分子を並行して又は別々にターゲットとするために、任意の数及び/又は種類のプライマーを使用することができる。特定の実施例において、生物学的標的は、異数性が関連する状態(例えば、21番、18番、13番染色体の異数性に関するNIPTに関連するもの等)に対応する染色体を識別する標的配列を含むことができる。特定の実施例において、生物学的標的は、腫瘍遺伝子(例えば、がん状態の測定値の決定、がん治療の評価に関連するもの等)を識別する標的配列を含むことができる。しかしながら、標的(例えば、生物学的標的等)は、任意の好適な様式で構成することができる。これに加えて、又はこれに替えて、例えば、後段で標的関連分子及び標的分子の存在量測定値間で意味のある比較を行うことができるような、類似の条件によるサンプル処理を支援するために、標的関連分子(例えば、標的関連分子の標的関連領域等)は、任意の好適な特徴(例えば、構成要素等)を、生物学的標的と(例えば、生物学的標的に対応する標的分子と;等)共通させることができる。しかしながら、標的関連分子は任意の好適な様式で構成することができる。

0022

図11に示すように、標的関連分子は、好ましくは、標的変異領域(例えば、標的関連分子の標的関連配列の変異領域;標的関連分子はそれぞれ、1以上の変異領域を含む;等)を含み、変異領域は、標的分子の特徴とは異なる特徴を含むことができる。変異領域は、好ましくは、1以上の変異(例えば、挿入、欠失、置換、等)を含み、この変異は、例えば、対応する標的関連分子(例えば、変異領域を含む標的関連配列を含む標的関連分子;等)を、対応する標的分子(例えば、生物学的標的の標的配列領域を含む核酸;等)と類似の様式でサンプル処理操作に付すことを可能にすると同時に、標的分子からの標的関連分子の差異化を支援するものである(例えば、シーケンシング出力の決定において;存在量測定値の決定、例えば、統計学的推定解析の実施において;1以上の医学的状態の特徴付け及び/又は治療の支援のため;スパイクイン混合物及び/又は好適なサンプルのサンガーシーケンシングからのクロマトグラム関連出力の後処理において;例えば、標的関連塩基及び標的塩基の対、例えば、変異領域及び/又は他の好適な領域の位置に対応する対の、ピークの重なりのデコンボリューションにおいて;標的関連配列及び標的配列の存在量に当てはめるための統計学的推定解析において;等)。この種の差異化は、意味のある比較(例えば、塩基の対及び/又は組のピーク強度間の定量的比較;個々の存在量測定値の比較及び/又は組合せ(例えば、全存在量測定値を決定するため);例えば、特徴付け及び/又は治療を支援するため;等)が行えるよう、異なる対応する存在量測定値の決定を支援することを可能にするものである。一実施例において、変異領域は、標的分子の標的配列の配列領域とは異なるヌクレオチド配列を含む、配列変異領域を含むことができる。特定の実施例において、図3に示すように、標的関連配列(例えば、“spk”配列;等)は、標的配列の配列領域に対し(例えば、“hg19”標的配列の“att”配列領域に対し;等)、欠失(例えば、3ヌクレオチド欠失;等)を含み得る。これに加えて、又はこれに替えて、変異領域は、任意の好適な塩基及び/又は塩基型に関し、任意の好適な数の置換、挿入、欠失、及び/又は任意の好適なサイズの他の改変(modification)(例えば、任意の好適な数のヌクレオチドの挿入及び/又は欠失;任意の好適な数の点変異、例えば、10個の点変異;等)を含み得る。

0023

特定の実施例において、変異領域は、任意の標的関連塩基(例えば、標的関連配列のもの;等)及び/又は標的塩基(例えば、標的配列のもの;等)のシーケンシング出力(例えば、ピーク強度、ピーク面積、ピークデータ、クロマトグラム、等)の決定を支援するこができ、例えば、1以上の領域(例えば、標的関連領域、変異領域、等)における標的関連塩基に関するシーケンシング出力(例えば、ピーク強度測定値)と、異なる位置(例えば、対応する塩基の位置が、変異領域の1以上の挿入及び/又は欠失のためにシフトしている可能性がある場合;等)又は同じ位置(例えば、変異領域が点置換されている場合;等)にある対応する標的塩基のシーケンシング出力(例えば、ピーク強度測定値、等)とを、例えば、1以上の存在量測定値を決定することを目的として、比較することができる。特定の実施例において、図11に示すように、標的関連分子は、対応する標的ヌクレオチド配列と10塩基が異なるヌクレオチド配列変異領域を含むことができ(例えば、標的配列が”TCTTGGATAG”を含み、変異領域が、対応する位置に”CTGGTTTAGA”領域を含む場合、等)、異なる10塩基のそれぞれから、内在対スパイクインの異なる個々の存在量比を得ることができ、これを、正確度が向上した全存在量比を得るために使用することができる。これに加えて、又はこれに替えて、変異領域は任意の好適な数の塩基の違い(例えば、標的配列に対し、等)を含むことができる。

0024

変異領域は、それぞれ適切な配列差異及び配列相同性が容易に得られるように、標的関連領域と連関させて設計することができる(例えば、サンガーシーケンシング等のシーケンシング技術に関連する所与のシーケンシング条件でのシーケンシング出力の改善を支援することを目的として、変異領域及び/又は標的関連領域の特徴を決定する;等)。

0025

配列変異領域は、任意の好適な染色体及び/又は他の標的の任意の好適な遺伝子座の任意の好適な位置(例えば、連続した位置、不連続;等)において、標的配列とは、任意の好適な数及び種類の塩基が異なり得、及び/又は標的配列が任意の好適な様式で異なり得る。配列変異領域は、任意の1以上の置換、挿入、欠失、任意の好適な種類の突然変異、及び/又は任意の好適な改変(例えば、標的配列及び/又は生物学的標的の1以上の配列領域に対し;等)を含み得る。

0026

一変形形態において、配列変異領域は、ランダムにシャッフルされた塩基を含むことができる(例えば、塩基型の比率を等しくして、予め定められた塩基型の割合で、等)。一変形形態において、方法100は、改変する標的配列の塩基を選択することを含むことができる(例えば、サンガーシーケンシング出力結果の最適化に基づき、例えば、配列中の塩基の順序及び塩基型に依存するサンガー出力の品質を左右する特定の塩基型の配列を選択することを介して;後計算処理における統計学的推定、アンミキシング、デコンボリューションの支援に基づき;増幅バイアスを最小限に抑えながら正確な存在量測定値の閾値を得るために必要な相違塩基数に基づき;等)。

0027

これに加えて、又はこれに替えて、変異領域は1以上の標的分子の特徴(例えば、任意の好適な種類のもの、等)とは異なる、機能的、構造的、進化的、及び/又は他の好適な特徴を有する不連続な変異領域を含むことができる。しかしながら、変異領域は、任意の好適な様式で構成することができ、標的関連分子は、任意の好適なヌクレオチド配列領域を含むことができる。

0028

変形形態において、標的関連分子は、シーケンシング操作(例えば、シーケンシングシステムの操作;例えば、正確度が向上した、並びに/又は定量的比較及び/若しくは定量化を可能にする形態のシーケンシング出力の決定;等)S130、存在量測定値の決定S140、及び/又は方法100の任意の好適な部分(例えば、特徴付けの支援S150及び/又は治療の支援S16;等)を補助するように構成された1以上のシーケンシング領域(例えば、シーケンシング分子のもの;等)を含むことができる。一変形形態において、標的関連分子(例えば、標的関連分子の標的関連配列;等)は、(例えば、追加等を介して)1以上のサンガー関連配列領域(例えば、サンガーシーケンシング出力を向上するように構成されたもの、等)及び/又は任意の好適なシーケンシング領域を含むことができ、これは、任意の1以上の追加される標的関連領域(例えば、1以上の生物学的標的(例えば、同一又は異なる生物学的標的)の、1以上の標的配列(例えば、同一又は異なる標的配列)の追加の標的配列領域と配列相同性を有するもの;等);反復配列(例えば、標的関連分子、標的分子、リファレンス関連分子、リファレンス分子、本明細書に記載する任意の好適な配列、領域、及び/又は分子の、任意の好適な領域のもの;等);及び/又は任意の好適な配列領域(例えば、1以上の分子への追加に関連し、本明細書に記載するシーケンシング領域;等)を含むことができる。

0029

一変形形態において、サンガー関連配列領域は、標的関連分子の配列変異領域及び/又は他の好適な領域の前に(及び/又は任意の好適な位置関係で)、特定のヌクレオチド配列(例えば、予め定められた長さを有し、特定の選択されたヌクレオチドを含むもの;等)を含むことができ、これは、配列変異領域を、サンガーシーケンシングクロマトグラム関連出力を向上することに対応する位置に(例えば、サンガーシーケンシングにおいて100〜500番目の塩基に、200〜500番目の塩基に、及び/又は任意の好適な位置に)再配置することを支援することができる。特定の実施例において、配列の開始領域に関する正確度を向上するためにSanger BigDye 1.1 chemistryを適用することができる(例えば、ここでは、図13A〜13Bに示すLCR及び/又はRCAが省略できる;等)。特定の実施例において、より長いシーケンシング読み取り長が可能になるようにSanger BigDye 3.1 chemistryを適用することができ、正確度を向上するために(例えば、図13A〜13Bに示すように、多重化が可能なLCR及び/又はRCAを介すること等により)、開始配列領域(例えば、約200bp及び/又は他の好適なサイズ)を使用することができる(例えば、標的配列領域及び/又は標的関連配列領域の前に挿入する)。しかしながら、サンガー関連配列領域は任意の好適な様式で構成することができる。

0030

これに加えて、又はこれに替えて、シーケンシングされる分子は、シーケンシングシステムによるプロセスを支援するように構成されたシーケンシングプライマー、アダプター配列、及び/又は任意の好適なシーケンシングシステムに関連する他の好適な構成要素を含むことができる。しかしながら、シーケンシング分子は任意の好適な様式で構成することができる。

0031

標的関連分子(及び/又は本明細書に記載する他の好適な構成要素、例えば、リファレンス関連分子、スパイクイン混合物の構成要素等)は、任意の好適なサイズを有するものとすることができ(例えば、100〜500塩基対、200〜500塩基対の長さを有し、標的関連領域及び/又は変異領域等の配列領域の繰り返しを含むもの;標的分子と類似又は異なる長さを有するもの;80〜150塩基対の長さを有し、シャッフルされた形態の塩基の10塩基対の変異領域を含むもの;等)。標的関連分子の組は、任意の好適な数の標的(例えば、任意の数の遺伝子座、染色体、がんバイオマーカー、標的バイオマーカーに関連する任意の数の標的配列、等)、サンプル(例えば、サンプル取扱いシステムの効率を改善することを目的として、複数の利用者のサンプルを使用するため、単一の利用者の複数のサンプルを有する使用者のために、分子のバッチを並行して合成する;等)、状態(例えば、異なる状態に関連する生物学的標的に関連する標的関連分子の組;等)、及び/又は他の好適な様相に関連する任意の数の標的関連分子を含むことができる。

0032

変形形態において、標的関連分子の作製は、異なる種類の標的関連分子(例えば、異なる標的関連領域、異なる変異領域、異なる配列分子を含む、等)、例えば、標的関連分子の組(例えば、異なる種類の標的関連分子に対応するそれぞれの組;等)の作製を含むことができる。標的関連分子は、標的関連分子の組(例えば、複数の異なる組等)を含むことができ、各組は、異なる標的配列領域(例えば、同一の標的配列及び/又は染色体等の生物学的標的の異なる標的配列領域;異なる標的配列及び/又は異なる遺伝子等の生物学的標的の異なる標的配列領域;等)に関連する(例えば、配列相同性を有する;等)、異なる標的関連領域を含み、これは、標的関連領域型(例えば、特定の標的関連領域配列に対応するもの;等)及び標的配列領域型(例えば、生物学的標的の特定の標的配列に対応する;等)の異なる対及び/若しくは組、並びに/又は、塩基の異なる対及び/若しくは組(例えば、対及び/又は組の塩基が、標的関連配列及び標的配列に由来し得る場合;等)に関する、個々の存在量比等の対応する存在量測定値(例えば、異なる対に対応するもの;例えば、異なる塩基の組に対応する個々の存在量比(ここで、異なる塩基の組は、染色体生物学的標的の異なる遺伝子座に対応させることができる);等)の決定等を支援することができ、これは、例えば、個々の存在量測定値を用いた平均化及び/又は任意の好適な組合せ操作の実施を介することによる、正確度が向上した全存在量測定値の決定に使用することができる。

0033

特定の実施例において、標的関連分子の異なる組は、異なる遺伝子座の異なる標的配列(及び/又は標的配列領域等)に関連するものとすることができる。特定の実施例において、各組は、同一染色体の異なる遺伝子座に関連するものとすることができ(例えば、図9に示すように、染色体の第1、第2、第3、及び第4遺伝子座;等)、ここで、所与の組の標的関連分子の配列は、該組に対応する遺伝子座に共通する配列領域を含むことができ、また、該遺伝子座の配列とは異なる(例えば、挿入、欠失、塩基置換等)配列変異領域を含むことができる。

0034

任意の数の組の標的関連分子及び/又は任意の数の形態の標的関連分子を、作製すること及び/又は任意の好適な数の生物学的標的と関連させることができる。一実施例において、異なる標的関連分子の組の選択は、シーケンシング条件、所与の状態及び/又は用途に求められる正確度に基づくことができ(例えば、ダウン症候群を診断するための目標の正確度を達成するために使用するための、対応する好適な数の個々の存在量測定値が得られる数の組を選択する)、及び/又は任意の好適な基準(例えば、最適化すべき条件)に基づき選択することができる。しかしながら、標的関連分子の異なる組の作製は、任意の好適な様式で実施するこができる。

0035

標的関連分子の作製は、標的配列(例えば、標的配列の標的配列領域;標的配列の任意の好適な領域;等)の決定を含むことができ、これは、標的関連分子を作製する基準とすることができる標的配列の選択に役立つことができる。標的配列の決定は、次に示す任意の1以上に基づくことができる:状態(例えば、ダウン症候群の診断を支援するための21番染色体を識別する標的配列の選択;腫瘍遺伝子を識別する標的配列の選択;等)、シーケンシング条件(例えば、サンガーシーケンシングのクロマトグラム関連出力の品質を最適化するため;統計学的推定解析に適したクロマトグラム関連出力を生成するため、及び/又は他の好適な;コスト低減、正確度向上、再現性向上のため;並びに/又はシーケンシングシステム及び/又は操作に関する他の好適な最適化のための、特定の長さの標的配列、ヌクレオチド配列、及び/又は他の条件の選択、等);増幅条件(例えば、特定の長さの標的配列、ヌクレオチド配列、及び/又は増幅特異性を最適化するための他の条件の選択、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅に関する標的配列に対するプライマー特異性に関するもの;等)、他のサンプル処理条件;並びに/又は他の好適な基準。一実施例において、標的配列の決定は、標的配列候補リストを作成するためにデータベース(例えば、DNAデータベース、ゲノムデータベース遺伝子発現データベース、表現型データベース、RNAデータベース、タンパク質データベース等)をコンピュータ検索することと;標的配列候補リストを、本明細書に記載する基準、及び/又は任意の好適な基準に基づき選別することと;を含むことができる。特定の実施例において、配列のターゲティングの決定は、標的配列候補リストを抽出すること(例えば、エキソームのプルダウン;好適な数の塩基対のチャンクへの融合;等);規定の形態の突然変異及び/又は多型を含む候補を除外すること(例えば、集団の被験者全体に亘り相対的に不変な候補を得るために、一般的な単一種のヌクレオチド多型を伴う候補を除外する、等);残りの候補のプライマーを同定すること(例えば、80〜150bpのアンプリコンにはPrimer−BLASTを用いる);及び標的関連分子の変異領域の作製において、変異させるのに適した候補領域を決定すること(例えば、フォワードプライマー及び/又は配列の他の領域に対する塩基の位置を混ぜる(scrambling)ことによる、等)を含むことができる。しかしながら、標的配列の決定は、任意の好適な様式で実施することができる。

0036

標的関連分子の作製は、次に示す1以上を実施することによる分子の合成を含むことができる:増幅(例えば、PCR増幅、例えば、1以上のヘアピン配列を含むPCRプライマーを用いるもの;等)、プラスミドを用いる核酸合成(例えば、標的染色体及びリファレンス染色体の異なる遺伝子座にそれぞれ対応する標的関連分子及びリファレンス関連分子の両方を含むもの;任意の好適な切断部位複製部位の起点、複数のクローニング部位選択マーカーレポーターマーカー、骨格、及び/又は他の構成要素を含むプラスミドを使用するもの;等)、他の人工遺伝子合成法、増幅法(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅、等)、ライゲーション法(例えば、Ligase Cycling Reaction、等)、ホスホラミダイト手法、後合成処理、精製(例えば、高速液体クロマトグラフィー又は他のクロマトグラフィー手法、脱塩洗浄遠心分離を用いるもの、等)、タグ付け法(例えば、分子タグ付け法、蛍光タグ付け法、粒子標識法、等)、分子クローニング法、及び/又は任意の好適なサンプル処理技法

0037

一変形形態において、標的関連分子の合成は、異なる標的(例えば、同一染色体の異なる遺伝子座、異なる染色体の異なる遺伝子座、異なる腫瘍遺伝子、等)に関連する複数の配列領域を含む標的関連配列の作製を含むことができる。特定の実施例において、標的関連分子の形態は、所要のシーケンシング操作の回数を減らすように構成することができる(例えば、複数の標的の情報を与える、単回のサンガーシーケンシングの実施で生成するクロマトグラム関連出力の生成を支援する形態の標的関連分子;等)が、標的関連分子の形態は、任意の好適な条件を最適化するように合成することができる。これに加えて、又はこれに替えて、任意の数の標的に関連する任意の好適な数の分子及び/又は種類の分子を任意の好適な時間及び頻度で作製することができる。

0038

しかしながら、標的関連分子の作製S110は任意の好適な様式で実施することができる。

0039

2.2スパイクイン混合物の作製
方法100の実施形態は、1以上のスパイクイン混合物の作製S120(例えば、利用者からの1以上のサンプルに由来する標的分子を含む標的関連分子の組を処理することに基づくもの、等)を含む(例えば、作製を支援する、等)ことができ、これは、増幅(例えば、類似の増幅条件での)、前処理の実施(例えば、サンプル調製、溶解、ビーズを用いるプロセス、他の精製、及び/又は核酸抽出法、等)、改変(例えば、反復配列の作製、異なる標的に関連する配列の結合、等)、並びに/又はそれ以外の形で、標的関連分子、標的分子及び/若しくは他の好適な分子(例えば、リファレンス関連分子、リファレンス分子、等)を処理して、後段の解析(例えば、サンガーシーケンシング、等)及び存在量測定値の決定(例えば、サンガーシーケンシングの出力に基づく、等)に適した形態にすることに役立つことができる。回収したサンプル(例えば、生物学的サンプル;利用者に提供されたサンプル容器を用いてサンプル回収キットに回収したもの)は、次に示す任意の1以上を含むことができる:血液、血漿血清組織生検(例えば、組織生検等)、、尿、便、精液排出物涙液間質液、他の体液、及び/又は任意の他の好適なサンプル(例えば、ヒトの利用者、動物食品等の物品微生物に関連するもの、等)。NIPT等の実施例において、生物学的サンプルは1以上の母親のサンプルを含むことができる。サンプルは、好ましくは、標的分子(例えば、1以上の標的配列及び/又は標的配列領域を含む核酸分子;等)及び/又はリファレンス分子(例えば、1以上のリファレンス配列及び/又はリファレンス配列領域を含む核酸分子;等)を含み、例えば、標的分子は、標的関連分子と一緒に、類似のパラメータで増幅することができ;リファレンス分子は、リファレンス関連分子と一緒に類似のパラメータで増幅することができる;等)。これに加えて、又はこれに替えて、サンプルは、スパイクイン混合物の作製が任意の好適な数及び種類の物体に関し実施することができるように、複数の利用者由来の構成要素(例えば、標的分子)(例えば、母親由来の核酸及びその母親の胎児由来の核酸を含む血液サンプルであり、この核酸混合物は、21番染色体の異常な存在量を示す可能性がある、等)、複数の期間に亘り収集した構成要素、及び/又は任意の好適な状態間で変化する構成要素を含むことができる。

0040

1以上のスパイクイン混合物の作製は、好ましくは、標的関連分子をサンプル由来の標的分子(例えば、標的配列領域及び/又は標的配列を含む核酸等)を混合すること;及び/又はリファレンス関連分子をリファレンス分子と混合すること;及び/又は任意の好適な分子を混合することを含む。混合は、次に示す1以上を含むことができる:それぞれの分子を単一の混合物(例えば、異なる標的関連分子の一部分及び標的分子の対応する一部分を含む;等)に混合すること;サンプル(例えば、事前処理されたサンプル)を複数の混合物にサブサンプリングする(それぞれ、標的関連分子の異なる部分集合(subset)(例えば、標的染色体の異なる標的遺伝子座に対応するもの、等)用に指定されている)こと;サンプルを標的関連分子及びリファレンス関連分子用の異なる混合物にサブサンプリングすること;並びに/又は分子を混合する任意の他の好適な手法。一実施例において、標的分子及び標的関連分子(例えば、標的分子及び標的関連分子の形態の異なる対;標的関連領域及び標的配列領域の異なる対に対応するもの;複数の異なる標的に関連するもの;等)を、同一区画(例えば、試験管;等)(及び/又は任意の好適な数の区画)内で多重PCR及び/又は好適な増幅プロセスにより増幅することができ、こうすることにより、貴重なサンプルの保存を支援することができ;結果として得られた増幅産物を、後段のサンガーシーケンシングで異なる標的形態を個々にターゲティングするために(例えば、標的関連領域及び標的配列領域に共通する配列相同性を有する領域等の不変領域に関連するサンガーシーケンシングプライマーを使用して;等)、別々の混合物にサブサンプリングすることができる。実施例において、サブサンプリング及び/又は他のサンプル改変操作は任意の好適な順序で実施することができる。

0041

これに加えて、又はこれに替えて、異なる種類の分子用に別々のサンプル(例えば、混合物、溶液等)を作製することができる(例えば、異なる種類の分子を混合せずに)。例えば、標的関連分子(例えば、標的分子を含まない)を含む第1サンプルを作製することができ、標的分子を含む(例えば、標的関連分子を含まない)サンプル混合物を作製することができ、第1及び第2混合物は下流の処理で別々に使用することができる(例えば、別々のクロマトグラム関連出力、例えば、統計学的推定、デコンボリューション、及び/又は他の計算処理操作、例えば、存在量測定値の決定において使用することができる別々のクロマトグラムを作成するために、別々にサンガーシーケンシング運転を行う、等)。しかしながら、任意の好適な別々の分子又は複数の種類を分子の混合物を含む任意の好適な数のサンプルを作製及び/又は処理することができる。

0042

分子の混合は、好ましくは、既知の存在量の標的関連分子を用いることを含むが、未知の存在量の標的分子を代替として使用することができる(例えば、その未知の存在量で先に行ったシーケンシング運転の結果を、後段のシーケンシング運転で得られた結果を報告する際に利用できる、等)。更に、分子の混合は、好ましくは、標的関連分子の異なる部分集合(例えば、異なる遺伝子座に関連するもの)を同一若しくは実質的に類似の存在量で、及び/又はリファレンス関連分子に対し同一若しくは類似の存在量で使用することを含む。これに加えて、又はこれに替えて、任意の好適な存在量の異なる種類の分子を用いることができる。

0043

一変形形態において、分子の混合は、標的関連分子、リファレンス関連分子、及び/又は他の好適な構成要素の存在量を修正(例えば、前処理中に)することを含むことができる。例えば、分子の存在量の修正は、分子の初期存在量(例えば、標的関連分子の存在量)の測定;標的分子の期待される存在量(例えば、サンプル中の内在標的分子に期待される個数、等)に基づく存在量の修正(例えば、希釈、増幅を介して、等)を含むことができる。一変形形態において、スパイクイン混合物の作製は、存在量の修正(例えば、前処理中に)を省略することができる(例えば、方法100の実施形態の第1段階の存在量の結果を、方法100の実施形態の後の段階に使用するための補正係数の決定に用いることができる;等)。しかしながら、分子の混合は任意の好適な様式で実施することができる。

0044

スパイクイン混合物の作製は、好ましくは、標的関連分子を標的分子と一緒に増幅させることを含む。増幅は、次に示す任意の1以上を実施することを含むことができる:ポリメラーゼ連鎖反応を用いる技法(例えば、固相PCR,RT−PCR、qPCR、多重PCR、タッチダウンPCR、ナノPCR、ネステッドPCR、ホットスタートPCR等)、ヘリカーゼ依存増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、自家持続配列複製(3SR)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、鎖置換(strand displacement)増幅(SDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、リガーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応(LCR)、並びに/又は任意の他の好適な増幅技法及び/若しくは関連するプロトコル(例えば、増幅のボトルネックを最小限に抑えるプロトコル)。一実施例において、図3に示すように、スパイクイン混合物の作製は、標的関連分子を標的分子と一緒に共増幅させるために(例えば、標的関連分子及び標的分子の両方に共通する配列をターゲティングするプライマーの組を使用する;図3に示すように、異なる種類及び配列のプライマーに対応するプライマーの異なる組を使用する(ここで、1以上のプライマーの組は、例えば、反復配列の追加を支援するために1以上のヘアピン配列を含む);等)、複数の反復回数(例えば、任意の数のPCR反復回数)でPCRを実施することを含むことができる。

0045

一変形形態において、スパイクイン混合物及び/又は方法100の実施形態の好適な部分(例えば、標的関連分子を含むサンプルが標的分子を含むサンプルから独立に調製及び配列決定される変形形態において;リファレンス関連分子を含むサンプルがリファレンス分子を含むサンプルから独立に調製及び配列決定される変形形態において;等)の作製は、1以上の配列領域を1以上の分子に(例えば、1以上の分子の1以上の領域及び/又は配列を;標的関連分子に、標的分子に、リファレンス関連分子に、リファレンス分子に、等)追加することを含むことができる。

0046

配列領域の追加は、次に示す1以上を含むことができる:反復配列の作製(例えば、標的関連配列及び/又は標的配列の繰り返しを含む改変された配列の作製;等);異なる標的を識別する配列領域の追加(例えば、元の標的により識別される染色体の異なる遺伝子座;染色体の異なる遺伝子座;異なる状態に関連する配列領域;等);及び/又は任意の好適なヌクレオチド配列の追加。例えば、方法100は、少なくとも1の配列領域を、標的関連分子の組及び標的分子の組の少なくとも1つに追加することを含むことができ、ここで少なくとも1の配列領域は、次に示す少なくとも1つを含む(a)第2標的配列領域と配列相同性を有する第2標的関連領域(例えば、標的分子の組が、生物学的標的の標的配列の第1標的配列領域と配列相同性を有する第1標的関連領域を含む場合;等)、及び(b)標的関連配列の領域及び標的配列の領域のうちの少なくとも1の、少なくとも1の反復配列。

0047

配列領域の追加は、次に示すことに役立ち得る:シーケンシングシステムの出力品質(例えば、クロマトグラム結果の品質)の向上の、例えば、配列領域を、存在量測定値を抽出する基準となる変異領域よりも前の位置に追加することによる(例えば、追加された配列領域によって、変異領域をシーケンシング出力を向上させる位置へと再配置することができる場合;等)、支援、;正確度が向上した全存在量測定値の算出に使用することができる、追加配列領域に関する追加された個々の存在量測定値の決定の支援(例えば、変異領域の反復配列を、対応する標的塩基に関連させて解析することによる;等);例えば、異なる標的に関連する異なる配列を連結することによる、複数の標的(例えば、異なる遺伝子座、染色体、等)を解析するために必要なシーケンシング操作の回数及び/又は費用の低減(例えば、サンガーシーケンシング運転回数の低減;等)の支援。

0048

一実施例において、方法100は、1以上の標的関連分子(例えば、標的関連分子の標的関連配列の1以上の領域;等)及び/又は1以上の標的分子(例えば、標的分子の標的配列の1以上の領域;等)に、少なくとも1の反復配列を追加することを含むことができ(例えば、同一又は異なるシーケンシング運転において、例えばノイズを低減することを目的として、例えばシーケンシング出力データを増やして、シーケンシング出力データ及び/又はそれに伴う存在量測定値を平均化及び/又はそれ以外の形で結合できるように、例えば、配列の複数回のシーケンシングを行うための、多重(multiple−pass)シーケンシングを支援するため;等)、例えば、少なくとも1のクロマトグラム関連出力のピークの第1組(例えば、クロマトグラム、ピーク強度、他のピークデータ、等)は、標的関連領域、生物学的標的の標的配列領域、標的変異領域、及び生物学的標的の配列領域に関する第1シーケンシング(例えば、サンガーシーケンシング操作;等)に対応し、少なくとも1のクロマトグラム関連出力は、標的関連領域、生物学的標的の標的配列領域、標的変異領域、及び生物学的標的の配列領域に関する第2シーケンシングに対応するピークの第2組(例えば、同一のサンガーシーケンシング操作に由来するもの等)を含み、標的に関連する存在量比の組の決定は、ピークの第1組及びピークの第2組に基づき(例えば、標的配列及び標的関連配列の塩基の対に関するピークの第1及び第2組に由来するピーク強度の個々の存在量に基づき;等)行うことができる。

0049

一変形形態において、1以上の配列領域(例えば、反復配列;等)の追加は、1以上のヘアピン配列(例えば、プライマーのもの、例えば、PCR増幅に使用されるもの;等)に基づくことができ、例えば、1以上のヘアピン配列を含むPCRプライマーを用いる増幅により、サンガー配列決定することが可能な反復配列を追加するために、複数のヌクレオチド伸長段階(例えば、自己プライミングを介して)を行うことが可能になる。一実施例において、図3に示すように、1以上の反復配列の追加(例えば、任意の好適な分子に;等)は、1以上のヘアピン配列(例えば、図3及び4に示す“chr21:14439076_PCR2_RP_hp”)を含むプライマーの組、サンプル(例えば、母親のサンプル;生物学的サンプル;等)由来の標的関連分子及び核酸分子(この核酸分子は標的配列領域を含む)の組のうちの1以上と一緒に共増幅(及び/又は別々に増幅)することを含むことができる。一実施例において、ヘアピン配列を含むプライマー(例えば、PCRプライマー)は、図3及び4に示す配列(“chr21:14439076_PCR2_RP_hp”)の1以上の部分(例えば、配列部分構造部分;等)を含むことができる。一実施例において、1以上のヘアピン配列に基づき1以上の配列領域(例えば、反復配列;等)を追加した結果として得られる産物(例えば、結果として得られる分子、等)は、図5A〜5Eに示す配列(例えば、図5A〜5Eは完全配列を例示し、図5Aの配列が、図5Bの配列に連結し、図5Cの配列に連結し、図5Dの配列に連結し、及び図5Eの配列に連結している、等)の1以上の部分(例えば、配列部分、構造部分;等)を含むことができる。

0050

実施例において、ヘアピンを配列の(例えば、PCRプライマー配列の)一端のみに使用する場合、双方向(two−pass)サンガー配列が得られる(例えば、クロマトグラム関連出力は、配列を2回通過したピーク結果を含む)。一実施例において、双方向サンガー配列の重大な寄与は、第2配列(例えば、配列のピークデータ及び/又は好適なクロマトグラム関連出力の第2の組)は、1回目に通過した配列(例えば、配列のピークデータ及び/又は好適なクロマトグラム関連出力の第1組)よりもクロマトグラムの内容に関するより多くの情報を提供し、より明確になることにある。その理由は、このように長さが長くなるとプライマーダイマーの作用が低下すると共に、Big Dye3.1 chemistryを用いた場合、長さが長い方が品質が向上するためである。実施例において、2ではなく(例えば、2を超える複数)複数の(例えば、多数の、多重の;等)ヘアピンが両端に使用される場合、同一配列のサンガークロマトグラムが得られることになる一方で、これは存在量測定に伴う任意のノイズを、平均化によって大幅に低減することができるが、プライマー−ダイマーの作用を同様に低下することができない場合がある。

0051

一変形形態において、ヘアピン配列(例えば、プライマーの、等)は、標的関連分子及びリファレンス関連分子のために構成されている、作製される、使用される、及び/又はそれ以外の形で、それなしで処理することができる。例えば、1以上の反復配列(例えば、1以上のヘアピン配列を含むPCRプライマーを用いて増幅することにより作製されたもの)を、複数の段階に用いるための特定の配列(例えば、単回のシーケンシング運転で同一配列に関する複数組のデータを生成することが可能な多重シーケンシングを行うために;等)のサンガーシーケンシング(及び/又は好適なシーケンシング技法)が可能になるように、標的分子、リファレンス分子、及び/又は好適な分子に追加することができる。一実施例において、主要な対立遺伝子のピーク(例えば、ピーク強度測定値)(及び/又は好適なクロマトグラム関連出力;等)対少数の対立遺伝子のピーク(例えば、ピーク強度測定値)(及び/又は好適なクロマトグラム関連出力;等)の比は、全存在量比を決定するために、反復配列(例えば、ヘアピン配列を使用することにより作製されたもの;等)をサンガーシーケンシングした出力に基づき複数回で判定することができる。これに加えて、又はこれに替えて、1以上の配列領域の追加は、例えば、1以上の配列領域の追加が、独立に、クロマトグラム関連出力、存在量測定値、特徴付け、及び/又は治療を向上(例えば、正確度;それに関するバイアスの低減;それに関するノイズの低減;等)することができる場合、標的関連分子及び/又はリファレンス関連分子を処理することなく実施することができる。

0052

しかしながら、ヘアピン配列は、任意の好適な様式で構成することができ、ヘアピン配列に基づく1以上の配列領域の追加は、任意の好適な様式で実施することができる。

0053

特定の実施例において、図13A〜13Bに示すように(例えば、約150塩基対の長さのアンプリコンの縦列反復を作製し、スパイクイン塩基を予め定められたサンガー品質窓(quality window)、例えば、シーケンシング出力の向上を支援する窓に配置することを例示しており;ここで、内在及びスパイクイン対立遺伝子のアンプリコン混合物をLCRにより環状にすることができ、次いで縦列反復を環状になったアンプリコンのRCAにより作製することができ、ここで、スパイクイン塩基の位置は影付きの範囲で示すことができ、ここで、クロマトグラムは複数のスパイクイン遺伝子座のマルチプレックスサンガーシーケンシングにて得ることができ、ここで、4つの遺伝子座に由来するアンプリコンを、LCRにより環状DNA集合させ、その産物をRCAで増幅し、サンガー配列決定した;等)、配列領域の追加は:標的関連核酸及び標的核酸の共増幅により生成したアンプリコン混合物にライゲーション操作を実施(例えば、Taq ligase及び/又は他の好適なリガーゼを用いたリガーゼサイクリング反応(Ligase Cycling Reaction);等)し、それによって環状のアンプリコンを作製し;環状アンプリコンに増幅操作(例えば、ローリングサークル増幅)を実施し、それによって、反復配列(例えば、縦列反復)及び/又は異なる標的を識別する追加配列領域を含む、1以上の改変された配列を作製することを含むことができ、ここで、結果として得られたスパイクイン混合物(例えば、改変された配列を含む直鎖状核酸)を、後のシーケンシング操作(例えば、サンガーシーケンシング、等)に使用することができる。配列領域の追加は、好ましくは、配列領域を、標的分子をベースとするアンプリコン(例えば、内在標的分子から作製したアンプリコン)及び標的関連分子をベースとするアンプリコン(例えば、スパイクイン標的関連分子から作製したアンプリコン)を含むアンプリコンの混合物に追加することを含む。或いは、配列領域の追加を、標的分子とは別に、標的関連分子について実施することができる。これに加えて、又はこれに替えて、例えば、初期の標的関連配列及び/又はリファレンス関連配列の一部とすることなどを目的として、配列領域を最初に作製することができる(例えば、標的関連分子、リファレンス関連分子の作製の最中、等)。配列領域の追加及び/又は方法100の実施形態の任意の好適な部分は、本明細書に記載する任意のサンプル処理操作及び/又は他の好適な操作の実施を含むことができる。しかしながら、配列領域は任意の好適な様式で構成することができ、配列領域の追加は任意の好適な様式で実施することができる。

0054

しかしながら、標的関連配列、標的配列、及び/又は他の好適な配列は、任意の好適なサンプル処理操作を用いて、任意の好適な様式(例えば、領域の欠失、特定の位置のヌクレオチドの改変、等)で改変することができる。しかしながら、スパイクイン混合物の作製S120は任意の好適な様式で実施することができる。

0055

2.3シーケンシング操作の実施
方法100の実施形態は、1以上のシーケンシング操作の実施S130(例えば、1以上のスパイクイン混合物について、等)を含むことができ、これは、1以上の構成要素(例えば、1以上のスパイクイン混合物s;等)を配列決定し、及び/又は1以上のシーケンシング出力を生成する役割を果たすことができる。シーケンシング操作の実施は、好ましくは、サンガーシーケンシングを実施すること(例えば、スパイクイン混合物、標的分子に別々に、標的関連分子に別々に、等)を含むことができる。サンガーシーケンシングは、好ましくは、チェーンターミネーション手法及び/又はサンガーシーケンシングに関連する任意の好適な操作(例えば、標識されたジドデキシヌクレオチド及びDNAポリメラーゼの使用(例えば、in vitroDNA複製中に);標的関連配列、標的配列、リファレンス関連分子配列、リファレンス配列、任意の好適な配列の塩基の塩基位置を含む核酸断片の作製;例えばキャピラリーゲル電気泳動標識塩基レーザーによる検出による核酸断片の解析の実施;任意の好適なサンガーシーケンシング関連操作の実施、例えば、dye−terminatorシーケンシング、サンガーシーケンシングに関連する自動化及び/又はサンプル調製、微小流路サンガーシーケンシング、シーケンシング出力を決定する計算処理;等)。しかしながら、サンガーシーケンシングは任意の好適な様式で実施することができる。

0056

シーケンシング操作の実施は、好ましくは、1以上の共増幅されたスパイクイン混合物(例えば、共増幅された標的関連分子及び関連する標的配列領域を含む核酸を含むスパイクイン混合物;等)のシーケンシングを含むが、これに加えて、又はこれに替えて、任意の好適な構成要素(例えば、第1サンプルからの標的関連分子及び第2サンプルからの標的分子の別々のシーケンシング;スパイクイン混合物;利用者からのサンプル;リファレンス関連分子及び/又はリファレンス分子を含むサンプル;等)を任意の回数のシーケンシング操作(例えば、任意の回数のサンガーシーケンシング運転、等)に付すことができる。

0057

シーケンシング操作は、好ましくは、1以上のシーケンシング出力(例えば、それにより存在量測定値を決定することができる定量シーケンシング出力;等)の決定を行うことができる。シーケンシング出力は、次に示す任意の1以上を含むことができる:クロマトグラム関連出力、読み取り配列、ハイスループットシーケンシング出力、テキストデータ、アラインメント、及び/又は任意の好適なシーケンシング技術からの任意の他の好適な出力。クロマトグラム関連出力は、任意の1以上のクロマトグラムを含むことができる(例えば、標的関連分子配列、標的配列、リファレンス関連分子配列、リファレンス配列の配列決定された塩基、任意の好適な分子の配列決定された塩基、本明細書に記載する任意の好適な関連する領域の配列決定された塩基のピークを含むもの;等)、アラインメント位置(例えば、ピーク及び/又はサンガーシーケンシングにより配列決定された塩基に対応するもの;各アラインメント位置は1以上のピーク及び/又は1以上の塩基に対応する;複数のアラインメントされた配列の塩基、例えば、標的関連配列及び標的配列の塩基に対応するもの;図6A及び7Aに示すもの;等)、任意の好適なシーケンシング関連位置、ピーク強度、ピーク面積、ピーク類似性、ピーク相違性、同一又は異なる塩基型のピークに対するピーク測定値平均強度;強度中央値;高さ;幅;重なり、並びに/又は他の同一位置若しくは異なる位置にある標的関連塩基及び標的塩基のピーク間比較、テキストデータ(例えば、サンガーシーケンシングのテキスト結果、等)、並びに/又は任意の他の好適な出力(例えば、サンガーシーケンシングに関連するもの、等)。例えば、図8に示すように、クロマトグラム関連出力は、異なる混合物のクロマトグラムを含むことができ(例えば、スパイクイン混合物の第1クロマトグラム、標的関連分子単独の第2クロマトグラム、標的分子単独の第3クロマトグラム等)、例えば、異なる塩基のクロマトグラムピークはシーケンシング出力を抽出するために計算処理することができる。

0058

1以上の特定の塩基のシーケンシング出力(例えば、サンガーシーケンシングのピークに関連するもの)は、この特定の塩基に先行する(及び/又はそれ以外の形で関係する)塩基の数及び/又は種類に対する依存性を示す可能性があり、スパイクイン混合物を作製する際の配列領域(例えば、反復配列)の追加により、このような依存性が考慮される。これに加えて、又はこれに替えて、標的関連配列及び/又はリファレンス関連分子配列の変異領域配列の決定は、この依存性(例えば、該配列に先行する塩基の数及び/又は種類に、等)及び/又は他の好適なシーケンシング条件(例えば、シーケンシング技術の特徴、例えば、サンガーシーケンシングの特徴、等)に基づくことができ、例えば、変異領域の予め定められた挿入及び/又は欠失により、存在量測定値の決定の支援においてピーク強度及び/又は他の好適なクロマトグラム関連出力を正確に比較することを可能にする較正(例えば、自動較正)が可能になる。例えば、標的変異領域は、1以上の挿入及び1以上の欠失のうちの少なくとも1つを含み、少なくとも1のクロマトグラム関連出力は、ピークに対応するアラインメント位置を含み(例えば、第1標的関連領域の塩基、生物学的標的の標的配列領域の塩基、標的変異領域、及び生物学的標的の配列領域の塩基に関連するもの、等)、異なる対のそれぞれにおいて(例えば、標的関連配列の塩基及び標的配列の塩基、等)、第1標的関連配列の塩基は第1アラインメント位置に対応し、これは第1標的配列の塩基に対応する第2アラインメント位置とは異なっており(例えば、図6A及び7Aに示すように)、少なくとも1のクロマトグラム関連出力は、第1及び第2アラインメント位置を含む。

0059

一実施例において、変異領域は、存在量測定値決定の正確度を向上するための、較正及び/又は好適な処理操作(例えば、デコンボリューション、補正係数の決定、及び適用等)を可能にする予め定められたシャッフルされた塩基(例えば、塩基置換、等)を含むことができる。しかしながら、任意の好適な領域及び/又は配列の決定は、任意の好適な様式で任意の好適なシーケンシング条件に基づくことができる。これに加えて、又はこれに替えて、特定の塩基及び/若しくは他の配列領域のシーケンシング出力、並びに/又は任意の好適な領域及び/若しくは配列の決定は、他の配列領域及び/又は好適なシーケンシング条件とは独立に行うことができる。

0060

変形形態において、1以上のシーケンシング操作の実施は、追加された配列領域(例えば、反復配列;等)を含む産物(例えば、スパイクイン混合物の構成要素;標的関連分子、標的分子、及び/又は他の好適な分子;等)、例えば、ヘアピン配列に基づき作製された1以上の産物(例えば、1以上のヘアピン配列を有するPCRプライマーを用いた増幅に基づく;等)について行うことができる。反復配列を含む産物のシーケンシング操作を実施することは、存在量測定値の決定(例えば、正確度が向上した全存在量測定値の決定;等)及び/又は任意の好適な目的(例えば、特徴付け及び/又は治療を支援するため;等)に使用されるシーケンシング出力を追加することを目的として、1以上の配列及び/又は配列領域の配列決定を複数回行うことに役立ち得、こうすることにより、ノイズを低減することができる。

0061

これに加えて、又はこれに替えて、シーケンシング操作の実施(及び/又は方法100及び/又はシステム200の実施形態の任意の好適な部分)は:NGS、NGS関連技術、massively parallel signatureシーケンシング、Polonyシーケンシング、454パイロシーケンシング、Illuminaシーケンシング、SOLiDシーケンシング、Ion Torrent半導体シーケンシング、DNAナノボールシーケンシング、Heliscope1分子シーケンシング、1分子リアルタイムSMRT)シーケンシング、ナノポアDNAシーケンシング、任意の世代のシーケンシング技術(例えば、第2世代シーケンシング技術、第3世代シーケンシング技術、第4世代シーケンシング技術等)、アンプリコン関連シーケンシング(例えば、ターゲットアンプリコンシーケンシング)、メタゲノム関連シーケンシング、合成時解読トンネル電流に基づくシーケンシング、ハイブリダイゼーションを利用するシーケンシング、質量分析を利用するシーケンシング、顕微鏡を用いる技法、及び/又はハイスループットシーケンシングに関する任意の好適な技術のうちの任意の1以上を含み得る及び/又はそれに関連し得る、ハイスループットシーケンシング等の、決定、適用、実施、及び/又は任意の好適なシーケンシング及び/又はシーケンシング関連技術のそれ以外の形での使用を含むことができる。これに加えて、又はこれに替えて、シーケンシング及び/又はシーケンシング関連技術は、任意の好適な技術(例えば、キャピラリーシーケンシング、等)を含むことができる。

0062

しかしながら、シーケンシング操作の実施S130は任意の好適な様式で実施することができる。

0063

2.4 存在量測定値の決定
方法100の実施形態は、1以上の存在量測定値(例えば、1以上のサンプルに関し;1種以上のスパイクイン混合物の1以上のシーケンシング操作による出力に基づくもの、等)の決定S140を含むことができ、これは存在量測定値、例えば、意味のある解析及び比較を行うことができる存在量測定値(例えば、存在量比を得るために標的分子及び標的関連分子の個々の存在量を比較し、標的対リファレンスの存在量比を比較する;等)、例えば、特徴付け及び/又は治療の支援に用いることができる存在量測定値を正確に決定するのに役立ち得る。存在量測定値は、次に示す任意の1以上を含むことができる:存在量比(例えば、第1ピークの第1ピーク強度測定値対第2ピークの第2ピーク強度測定値の比(例えば、第1及び第2ピークは同一又は異なるアラインメント位置に対応する);任意の好適なシーケンシング出力の比;内在標的分子の計数値対標的関連分子の計数値の計数値比;内在対スパイクインのシーケンシング出力比、例えば標的配列塩基及び対応する標的関連配列塩基のピーク強度測定値比;任意の好適な分子及び分母の比;個々の存在量比、例えば、全存在量比及び/又は存在量測定値の決定に使用可能なもの;等);が、これに加えて、又はこれに替えて、個々の存在量(例えば、個々のピーク強度;計数値;等)、相対的存在量、絶対的存在量、及び/又は他の好適な存在量測定値を含むことができる。特定の実施例において、内在分子対スパイクイン分子の比(例えば、内在DNA及びスパイクインDNAの比、等)を、シーケンシング出力比(例えば、内在関連ピーク対スパイクイン関連ピークのピーク強度比)及びスパイクイン分子の既知の存在量(例えば、スパイクイン混合物の作製に使用することができる)に基づき算出することができる。

0064

存在量測定値の決定は、好ましくは、1以上のシーケンシング出力に基づくが、これに加えて、又はこれに替えて、任意の好適なデータ(例えば、既知の存在量、生物測定データ病歴データ人口統計学データ、遺伝、調査データ食事データ行動データ環境データ、サンプル形態、及び/又は他の好適な状況データ(contextual data)を含む補足データ)に基づくこともできる。例えば、存在量比(例えば、標的に関連する存在量比;等)(及び/又は任意の好適な存在量測定値)の決定は、ピーク強度、ピーク面積、塩基型が共通している塩基のピーク測定値、塩基型が異なる塩基のピーク測定値、及び/又は任意の他の好適なクロマトグラム関連出力、及び/又はシーケンシング出力を含む1以上のクロマトグラム関連出力、のうちの1以上に基づくことができる。存在量測定値の決定は、計算処理(例えば、クラウドコンピューティングシステム等の遠隔計算システムを用いて、局所計算システムを用いて、等)、例えば、1以上のシーケンシング出力(例えば、クロマトグラム、ピークデータ、等)及び/又は他の好適なデータを計算処理することを含むことができるが、これに加えて、又はこれに替えて、任意の好適な処理(例えば、手作業による処理;等)を含むことができる。処理(例えば、存在量測定値の決定のための)及び/又は方法100の実施形態の好適な部分(例えば、特徴付け及び/又は治療の支援、等)は、次に示す任意の1以上を含むことができる:データの統計学的推定の実施(例えば、最小二乗回帰、非負最小二乗回帰、主成分分析リッジ回帰、等)、デコンボリューション(例えば、クロマトグラムの重なっているピークの、分解が不十分なピークの、任意の好適なピークの;フーリエデコンボリューション;ガウス関数に基づくデコンボリューション;ルーシー・リチャードソン・デコンボリューション等)、特徴の抽出(例えば、クロマトグラムの任意の好適な数のピーク等)、データのパターン認識の実施、複数のソースからのデータの融合、値の結合(例えば、値の平均化、等)、圧縮、変換(例えば、デジタル/アナログ変換アナログデジタル変換)、波変調正規化更新等級付け、検証、フィルタリング(例えば、ベースライン補正のため、データ間引きのため、等)、ノイズ低減平滑化充填(例えば、ギャップ充填)、整列モデルフィットウィンドウ処理切り出し、変形、数学的操作(例えば、導関数移動平均加算、減算、積算、除算、等)、多重化、多重分離内挿、外挿、クラスタリング、他の信号処理操作、他の画像処理操作可視化、及び/又は任意の他の好適な処理操作。

0065

変形形態において、存在量測定値の決定は、1以上の挿入(例えば、ヌクレオチド挿入;等)及び/若しくは1以上の欠失(例えば、ヌクレオチド欠失;等)及び/若しくは任意の好適な改変を有する変異領域を含む標的関連配列(及び/又はリファレンス関連配列)に関連する1以上のシーケンシング出力に基づき、並びに/又はそれ以外の形で関連させて、行うことができる。例えば、標的に関連する存在量の比の組の決定は、ピークの組(例えば、配列決定された標的配列及び標的関連配列の塩基に対応するピークのピーク強度データ;等)並びに置換、挿入、及び欠失の少なくとも1つ(例えば、置換、挿入、及び/又は欠失の1以上の特徴;例えば、ヌクレオチド数に関する改変のサイズ;塩基型の変化に関するものなどの改変の種類;改変が適用される位置;等)に基づくことができる。図6A及び7Aに示すように、挿入及び/又は欠失の1以上を含む変異領域は、アラインメント位置をシフトさせることができる(例えば、標的関連配列の塩基を標的配列の塩基に対して;例えば、標的関連領域及び標的配列領域の塩基間の配列相同性を、挿入及び/又は欠失の1以上に起因する位置に対しシフトさせることができる場合;等)。一実施例において、標的変異領域(例えば、標的関連配列のもの;等)は、挿入及び欠失の少なくとも1を含むことができ、ここで、1以上のクロマトグラム関連出力は、ピークの組に対応するアラインメント位置を含むことができ(例えば、標的関連分子の標的関連領域、生物学的標的の標的配列領域、標的関連分子の標的変異領域、及び生物学的標的の配列領域のピークデータ及び/又はそれに関連するピークデータ、等)、ここで、標的に関連する存在量の比の組の決定(及び/又は好適な存在量測定値)は、異なる対(例えば、標的関連配列の塩基及び標的配列の塩基の対;等)のそれぞれに関し、次に示すことを含む:該対の標的関連配列の塩基の、アラインメント位置の第1アラインメント位置における、少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づく(例えば、配列決定された塩基のピーク強度データに基づく;クロマトグラムに基づく;等)、ピーク強度測定値(例えば、ピークの最大強度;全ピーク強度;等)の決定;該対の標的配列の塩基の、アラインメント位置の第2アラインメント位置における、少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づく(例えば、配列決定された塩基のピーク強度データに基づく;クロマトグラムに基づく;等)、ピーク強度測定値の決定(ここで、第1アラインメント位置は第2アラインメント位置とは異なり、アラインメント位置は、第1及び第2アラインメント位置を含む);及び/又は標的関連配列の塩基のピーク強度測定値及び第1標的配列の塩基のピーク強度測定値に基づく、標的関連存在量比の組(及び/又は好適な存在量測定値の組;等)の標的関連存在量比(及び/又は好適な存在量測定値;等)の決定。一実施例において、図6A及び7Aに示すように、第1アラインメント位置は、ピークの第1組の第1ピーク及び第2ピークに対応させることができ(例えば、同一アラインメント位置に対応する重なっているピーク;同一又は異なる塩基型に対応するもの;等)、ここで第1ピークは、標的関連配列の重なっている塩基に対応し(例えば、図6A及び7Aに示すように、標的関連配列塩基に“*”印を付す)、ここで第1ピークは、標的関連存在量比の組の、第1標的関連存在量比に対応し(例えば、標的関連配列と重なっている塩基と、アラインメント位置をシフトさせた、標的配列の対応する塩基との対に関するものであり、アラインメント位置のシフト量は、例えば、1以上の挿入及び/又は欠失のサイズ等の、挿入及び/又は欠失の1以上の特徴に基づく;等)、ここで第2ピークは、標的配列の重なっている塩基に対応し(例えば、標的配列塩基は、図6A及び7Aに示すように、“O”印を付す)、及び/又は、ここで第2ピークは、標的関連存在量比の組の第2標的関連存在量比に対応する(例えば、第1標的関連存在量比とは異なる;標的配列の重なっている塩基と、アラインメント位置をシフトさせた、標的関連配列の対応する塩基との対に関するもの、等)。

0066

特定の実施例において、図6A〜6Bに示すように、サンプルDNAの領域chr21:15811326−15811417の初期存在量は、hg19“リファレンス”DNA強度対スパイクイン“Spk”強度の比を推定することにより決定することができ(例えば、標的関連分子及び標的配列を含む標的分子を共増幅させることにより作製したスパイクイン混合物のサンガーシーケンシング後;等);ここで標的関連配列(例えば、スパイクイン配列;標的関連分子のもの;等)は、3ヌクレオチド欠失を含み、その結果として、標的関連配列及び標的配列を形成している塩基の対に対応する(例えば、配列が類似している;等)アラインメント位置において3個分の位置シフトが生じ;個々の標的関連存在量比は、対応する対のピーク強度(例えば、クロマトグラムのピークの“*”及び“O”で示す位置)に基づき決定することができ(例えば、“*”で示す標的関連配列の“C”塩基に対応するアラインメント位置161の個々の存在量比は、標的関連配列の“C”塩基のピーク強度測定値(例えば、ピークの最大強度)と、“O”で示す標的配列の“C”塩基及び標的関連配列の変異領域における3個のヌクレオチド欠失によりアラインメント位置がシフトした位置164の“C”塩基のピーク強度測定値(例えば、ピークの最大強度)との比に基づき決定することができる;等)、例えば、標的関連比をプロットすることができ(例えば、図6Bに示すように;例えば、位置161及び164のそれぞれの“C”塩基の対の個々の存在量比は、グラフのアラインメント位置番号“161”に示す;等)、及び/又は、例えば、データ点の傾き(例えば、0.185;グラフの標的関連存在量比のデータ点の線形回帰による;等)は、標的関連分子の存在量に対するサンプル中の標的分子の存在量を表す存在量測定値とすることができる(例えば、内在DNA対スパイクインDNAの存在量(サンプルDNAの存在量はスパイクインDNAの量の0.185であった);等)。

0067

特定の実施例において、図7A〜7Bに示すように、サンプルDNAの領域chr21:22231528+22231612の初期存在量は、hg19“リファレンス”DNA強度対スパイクイン“Spk”強度の比を推定することにより決定することができ(例えば、標的関連分子及び標的配列を含む標的分子を共増幅させることにより作製されるスパイクイン混合物のサンガーシーケンシング後;等);ここで標的関連配列(例えば、スパイクイン配列;標的関連分子のもの;等)は、3ヌクレオチド欠失を含み、その結果として、標的関連配列及び標的配列を形成している塩基の対に対応する(例えば、配列が類似している;等)アラインメント位置において3個分の位置シフトが生じ;個々の標的関連存在量比は、対応する対のピーク強度(例えば、クロマトグラムのピークの“*”及び“O”で示す位置)に基づき決定することができ(例えば、“*”で示す標的関連配列の“G”塩基に対応するアラインメント位置15の個々の存在量比は、標的関連配列の“G”塩基のピーク強度測定値(例えば、ピークの最大強度)と、“O”で示す標的配列の“G”塩基及び標的関連配列の変異領域における3個のヌクレオチド欠失によりアラインメント位置がシフトした位置18の“G”塩基のピーク強度測定値(例えば、ピークの最大強度)との比に基づき決定することができる;等)、例えば、標的関連比をプロットすることができ(例えば、図7Bに示すように;例えば、位置15及び18のそれぞれの“G”塩基の対の個々の存在量比は、グラフのアラインメント位置番号“15”に示す;等)、及び/又は、例えば、データ点の傾き(例えば、0.34;グラフの標的関連存在量比のデータ点の線形回帰による;等)は、標的関連分子の存在量に対するサンプル中の標的分子の存在量を表す存在量測定値とすることができる(例えば、内在DNA対スパイクインDNAの存在量(サンプルDNAの存在量はスパイクインDNAの量の0.34であった);等)。

0068

しかしながら、1以上の挿入、欠失、及び/又は好適な改変を含む変異領域に関連するシーケンシング出力に基づく、及び/又はそれ以外の形で関連させる存在量測定値の決定は、任意の好適な様式で実施することができる。

0069

一変形形態において、存在量測定値の抽出は、変異領域の位置における標的関連配列塩基(例えば、”A”塩基)に対応する第1ピーク及び同位置における標的配列塩基(例えば、”T”塩基)に対応する第2ピークを含む、重なっているピーク(例えば、クロマトグラムピーク等)をデコンボリューションすることと;デコンボリューションされたピークに関するシーケンシング出力及び/又は存在量測定値(例えば、”T”塩基対”A”塩基のピーク強度比)を算出することと;を含むことができる。一変形形態において、デコンボリューションは、第1遺伝子座(例えば、18番染色体)の塩基と第2遺伝子座(例えば、同一染色体のもの、21番染色体等の異なる染色体のもの、等)の塩基との間の重なっているピークに対し実施することができる。

0070

一変形形態において、図8に示すように、スパイクイン混合物のクロマトグラムからの標的及び標的関連配列の相対的存在量の統計学的推定は、標的分子単独の第1クロマトグラム(及び/又は任意の好適なシーケンシング出力、例えば、ピークデータ;等)及び/又は標的関連分子単独の第2クロマトグラム(及び/又は任意の好適なシーケンシング出力;等)に基づくことができる(例えば、クロマトグラム中の特定の塩基のピーク及び/又はシーケンシング出力の組を、多重線形回帰で処理することができる;等)。一変形形態において、デコンボリューション(例えば、ルーシー・リチャードソン・デコンボリューション)をクロマトグラムのピークを分解(例えば、同一色のピークの分離を向上する)及び/又は他の好適な出力を分解するために適用することができる。特定の実施例において、方法100は:クロマトグラムの組(及び/又はクロマトグラム関連データ;等)の作成(例えば、スパイクイン混合物のもの、標的関連分子単独のもの、標的分子単独のもの、等);該組のクロマトグラムのピークのデコンボリューションによる分解(例えば、この操作及び/又は他の好適な操作は省略することができる;等);及び処理されたクロマトグラムに関する回帰分析の実施を含むことができる。これに加えて、又はこれに替えて、デコンボリューション、回帰分析、又は他の計算操作を、任意の好適な数及び組合せのクロマトグラムピーク及び/又はシーケンシングシステム出力の他の構成要素に関し実施することができる。

0071

一変形形態において、存在量測定値の決定は、複数の個々の存在量測定値から全存在量測定値を決定することを含むことができ、こうすることにより、存在量測定値の正確度を向上させることができる。一実施例において、方法100は、標的関連分子(例えば、第1標的配列の第1標的配列領域との配列相同性を有する第1標的関連領域を含む第1標的関連配列を含む;等)の第1組、標的分子の組、及び標的関連分子の第2組(ここで、標的関連分子の第2組は、第2標的配列の第2標的配列領域と配列相同性を有する第2標的関連領域を含む第2標的関連配列を含む)に関連するサンガーシーケンシングに基づき、少なくとも1のクロマトグラム関連出力を決定すること;第1標的関連配列及び第1標的配列の塩基の異なる組(例えば、異なる塩基の組からのそれぞれの異なる塩基の組は、第1標的関連配列の少なくとも1の塩基及び第1標的配列の少なくとも1の塩基を含む;等)の、標的関連存在量比の第1組を、少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定すること;第2標的関連配列及び第2標的配列の塩基の異なる組(例えば、異なる塩基の組からのそれぞれの異なる塩基の組は、第2標的関連配列の少なくとも1の塩基及び第2標的配列の少なくとも1の塩基を含む、等)の、標的関連存在量比の第2組を、少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定すること;並びに/又は標的関連存在量比の第1組及び第2組に基づき、1以上の全存在量測定値(例えば、サンプルの生物学的標的の存在量を表す、等)を決定すること;を含むことができる。一実施例において、第1標的配列は染色体の第1遺伝子座に対応させることができ、第2標的配列は染色体の第2遺伝子座に対応させることができ、1以上の状態の特徴付けの支援は、1以上の全存在量測定値に基づく染色体異常の特徴付けの支援を含むことができる。

0072

例えば、図9に示すように、全存在量比測定値の決定は:変異領域の各位置の個々のシーケンシング出力の比を、該位置の塩基の内在関連ピーク及び対応するスパイクイン関連ピークの対に関するシーケンシング出力(例えば、ピーク強度、等)に基づき決定することと(ここで個々のシーケンシング出力比は、任意の数の遺伝子座(例えば、異なる遺伝子座の個々のシーケンシング出力比は、異なる遺伝子座の異なるクロマトグラムから抽出され;該比は、複数の遺伝子座のデータを含む同一クロマトグラムから抽出される;等)、染色体、標的、及び/又は他の好適な様相の、任意の数の塩基位置の範囲のものとすることができる);個々のシーケンシング出力比を結合(例えば、平均化)することと;に基づき行うことができる。これに加えて、又はこれに替えて、個々の存在量測定値からの全存在量測定値の決定は、任意の好適な統計学的手法(例えば、平均化、中央値、等)を活用することができ、及び/又は任意の好適な様式で実施することができる。一変形形態において、存在量測定値の異なる組は、別々に調製され、及び/又は配列決定されたサンプル(例えば、標的関連分子を含む第1サンプル、及び標的分子を含む第2サンプル(ここで、第1及び第2サンプルは、別々に調製及び/又はサンガー配列決定等で配列決定することができる);等)に関し決定することができる。例えば、方法100は:標的関連分子の組を含む第1サンプルのサンガーシーケンシング;及び標的分子の組を含む第2サンプルのサンガーシーケンシング;を含む、サンガーシーケンシング(例えば、第一者、第三者、利用者、及び/又は任意の好適な者により実施される;等)を含むことができ、少なくとも1のクロマトグラム関連出力(例えば、ピーク強度の組;クロマトグラム;等)の決定は:第1サンプルのサンガーシーケンシングに基づき、標的関連分子の組に関連する、第1クロマトグラム関連出力(例えば、クロマトグラム、ピーク強度の組;等)(例えば、標的関連分子の組の標的関連配列の塩基のピーク強度データ;等)を決定することと;第2サンプルのサンガーシーケンシングに基づき、標的分子の組に関連する、第2クロマトグラム関連出力(例えば、クロマトグラム、ピーク強度の組;等)(例えば、標的関連分子の組の標的関連配列の塩基に関するピーク強度データ;等)を決定することと;を含むことができ、標的関連存在量比(及び/又は任意の好適な存在量測定値)の組の決定は、第1クロマトグラム関連出力及び第2クロマトグラム関連出力に基づく、標的関連存在量比の組の決定を含むことができる(例えば、第1組の第1クロマトグラム関連出力に基づく、標的関連分子の組に関する個々の存在量比の決定;第2組の第2クロマトグラム関連出力に基づく、標的分子の組に関する個々の存在量比の決定;ここで全存在量比は個々の存在量比に基づき決定することができる;等)。

0073

一変形形態において、存在量測定値はある期間に亘り決定することができ(例えば、ある期間に亘り採取された異なるサンプルについて;ある期間に亘り方法100の実施形態の段階を複数回実施することによる;等)、一連の存在量測定値は、1以上の状態の、1以上の特徴付け(例えば、がん関連分子の計数値をある期間に亘り監視する;等)、治療(例えば、がん治療の有効性をある期間に亘り評価する等)、及び/又は他の好適な情報の支援において解析を行うことができる。例えば、方法100は、1以上の状態(例えば、医学的状態、等)が、単一遺伝子疾患及びがん状態(及び/又は任意の好適な状態;等)の少なくとも1つを含む場合;第1期間(例えば、方法100の実施形態の1以上の部分を実施する第1段階に関連するもの;等)に関連する第1の全存在量測定値(及び/又は任意の好適な第1存在量測定値;等)(例えば、生物学的標的の第1存在量を表す;等)を決定すること;第2期間に関連する(例えば、方法100の実施形態の1以上の部分を実施する第2段階に関連するもの;等)第2の全存在量測定値(例えば、生物学的標的の第2存在量を表す;等)を決定すること;及び/又は第1の全存在量測定値(例えば、第1の全存在量測定値及び第1のリファレンス関連存在量測定値、例えば、第1の全リファレンス関連存在量測定値の第1比較に基づく;等)及び第2の全存在量測定値に基づき(例えば、第2の全存在量測定値と、同一の生物学的リファレンス又は異なる生物学的リファレンスの第2存在量を表す第2全リファレンス関連存在量測定値との第2比較(ここで、第2の全リファレンス関連存在量測定値は、第2期間及び/又は任意の好適な期間に関連するものであり得る);第2全存在量測定値と第1全リファレンス関連存在量測定値との第2比較、等)、1以上の状態の特徴付けを支援すること;を含むことができる。

0074

一変形形態において、存在量測定値の決定は:確率論的特性(probabilistic properties)、発見的特性(heuristic properties)、決定論的特性(deterministic properties)、及び/又は任意の他の好適な特性の任意の1以上を含む存在量決定モデルの適用を含むことができる。

0075

しかしながら、存在量測定値の決定S140は、任意の好適な様式で実施することができる。

0076

2.5リファレンス関連分子の処理
これに加えて、又はこれに替えて、方法100の実施形態は、リファレンス関連分子の組(例えば、リファレンス関連領域及びリファレンス変異領域を含むリファレンス配列を含み、例えば、該配列及び/又は領域は、標的関連分子の配列及び/又は領域に類似しており、例えば、この種の分子、配列、及び/又は領域は、類似の様式、例えば、S110、S120、及び/又はここに関連して記載するものに類似する様式等で、構成、作製、適用、処理、及び/又は使用することができる;等)の処理S115を含むことができ、これは、サンプル(例えば、標的分子を抽出する生物学的サンプル;等)中に存在するリファレンス分子等の、リファレンス分子に関連する分子(例えば、21番染色体等のリファレンス染色体を識別するリファレンス配列を含むリファレンス核酸;単一遺伝子疾患の野生型変異に関連するリファレンス配列を含むリファレンス核酸;等)を、例えば、標的の存在量測定値と比較する(例えば、相対的存在量の決定において;標的関連存在量測定値と比較する;等)ことができる、及び/又はそれ以外の形で処理することができる(例えば、特徴付け及び/又は治療を支援するために;等)リファレンス存在量測定値(例えば、リファレンス関連存在量測定値等)を決定することを目的として、作製及び/又は処理(例えば、方法100の実施形態の1以上の好適な部分を適用することによる、等)役割を果たすことができ、これは、例えば、21トリソミー及び/又は18トリソミーをスクリーニングするために、標的の21番染色体の存在量比をリファレンスの18番染色体の存在量比と比較することにより行われる。リファレンス関連分子及び/又はリファレンス分子の処理(例えば、分子の作製;リファレンススパイクイン混合物を作製するための分子の処理;シーケンシング;計算処理等)は、標的関連分子、標的分子、及び/又は他の好適な構成要素の処理に類似の任意の様式で実施することができる。しかしながら、リファレンス関連分子の処理S115は任意の好適な様式で実施することができる。

0077

2.6 状態の特徴付けの支援
これに加えて、又はこれに替えて、方法100の実施形態は、1以上の状態(例えば、遺伝子疾患等の医学的状態;1以上の存在量測定値に基づく;等)の特徴付けの支援S150を含むことができ、これは、1以上の状態を、検出、診断、解析、その特徴付けの判定、それに関係する1以上の看護者の補助、それに関するデータ(例えば、条件;等)の提供;及び/又はそれ以外の形の特徴付けの支援に役立つことができる。

0078

特徴付けは、次に示す任意の1以上を含むことができる:診断、リスクアセスメント、原因(例えば、利用者の行動確認、人口統計学、病歴、遺伝、及び/又はその状態に寄与する他の好適な様相)、及び/又は1以上の状態の情報を提供する他の好適な情報。変形形態において、1以上の特徴付けは、次に示す任意の1以上に用いることができる:治療の決定、利用者への通知、看護者への通知(例えば、診断に看護者を案内;等)、及び/又は任意の好適な操作の実施。1以上の特徴付けの支援は、好ましくは、存在量比の比較に基づき(例えば、全標的関連存在量比対全リファレンス関連存在量比の比較)、しかしながら、これに加えて、又はこれに替えて、任意の数及び/又は種類の存在量測定値に基づくことができ(例えば、任意の好適な解析技法、例えば、存在量測定値の生成に適用及び/又は使用される統計学的推定解析;等)、しかしながら、これに加えて、又はこれに替えて、任意の好適な存在量測定値に基づくことができる。一実施例において、生物学的標的は、1以上の医学的状態に関連するものとすることができ、1以上の医学的状態の特徴付けの支援は、第1の全存在量測定値(例えば、全標的関連存在量測定値;等)及び第2の全存在量測定値(例えば、生物学的リファレンスの存在量を表す全リファレンス関連存在量測定値;等)の比較に基づくことができる。

0079

一実施例において、状態(例えば、医学的状態等)は、染色体異常及び単一遺伝子疾患の少なくとも1つを含む遺伝子疾患を含むことができ;ここで、第1標的配列領域(例えば、標的関連分子の第1組の第1標的配列;等)は、第1染色体及び突然変異の少なくとも1つに関連するものとすることができ;生物学的リファレンスのリファレンス配列領域は、該突然変異の欠如及び第2染色体の少なくとも1つに関連するものとすることができ;及び/又は遺伝子疾患の出生前診断(及び/又は好適な特徴付け;等)の支援は、全標的関連存在量比(例えば、第1標的関連配列の塩基及び第1標的配列の塩基の異なる対のピーク強度に対応する標的関連存在量比の第1組に基づき決定される;等)と、全リファレンス関連存在量比(例えば、リファレンス関連配列の塩基及びリファレンス配列の塩基の異なる対のピーク強度に対応するリファレンス関連存在量比の組に基づき決定される;等)との比較に基づく、染色体異常及び単一遺伝子疾患の少なくとも1の出生前診断を支援することを含む。一実施例において、状態は、染色体異常を含む遺伝子疾患を含むことができ、第1標的配列は、第1染色体の第1遺伝子座に対応し、方法100は、第1染色体の第2遺伝子座に対応する第2標的配列の第2標的配列領域と配列相同性を有する第2標的関連領域を含む第2標的関連配列を含む標的関連分子の第2組を作製することと;標的関連存在量比の第2組を、少なくとも1のクロマトグラム関連出力に基づき決定することと;を含むことができ、ここで、標的関連存在量比の第2組の標的関連存在量比のそれぞれは、第2標的関連配列の塩基及び第2標的配列の塩基の異なる対に対応し、ここで、全標的関連存在量比の決定は、全標的関連存在量比を、標的関連存在量比の第1組及び標的に関連する存在量比の第2組に基づき決定することを含み、ここで、生物学的リファレンスのリファレンス配列領域は第2染色体に関連するものである。

0080

一実施例において、状態(例えば、医学的状態;等)は、1以上の染色体異常、1以上の単一遺伝子疾患、及び/又は1以上のがん状態の少なくとも1つを含むことができ、ここで、標的配列領域は、第1染色体(例えば、染色体異常に関連するもの;がん状態に関連するもの;等)及び突然変異(例えば、染色体異常に関連するもの;がん状態に関連するもの;等)の少なくとも1つに関連し、生物学的リファレンスのリファレンス配列領域は、第2染色体及び該突然変異の欠如の少なくとも1つに関連し、並びに/又は、医学的状態の特徴付けの支援は、1以上の存在量測定値(例えば、標的関連存在量比の組及びリファレンス関連存在量比の組、例えば、標的関連存在量比の組から決定される全標的関連存在量比、及びリファレンス関連存在量の組から決定される全リファレンス関連存在量比;等)に基づき、1以上の染色体異常、1以上の単一遺伝子疾患、及び/又は1以上のがん状態の少なくとも1つの特徴付けを支援することを含む。

0081

変形形態において、1以上の特徴付けの支援は1種以上の胎児分画測定(及び/又は任意の他の好適なデータ、例えば、1以上の存在量測定値等)に基づくことができる。例えば、出生前診断の支援は、胎児分画測定及び/又は1以上の存在量測定値に基づく1以上の遺伝子疾患の出生前診断の支援を含むことができる(例えば、全標的関連存在量比、全リファレンス関連存在量比、この比の比較、等)。しかしながら、胎児分画測定に基づく特徴付けの支援は任意の好適な様式で実施することができる。

0082

1以上の状態の特徴付けの支援及び/又は方法100の実施形態の任意の他の好適な部分(例えば、存在量測定値の決定;治療の支援;等)は、次に示す1以上を含む、1以上の人工知能的手法(例えば、機械学習的手法、等)を適用することを含むことができる:教師あり学習(例えば、ロジスティック回帰使用、バックプロパゲーションニューラルネットワーク使用、ランダムフォレスト使用、決定木、等)、教師なし学習(例えば、Aprioriアルゴリズム使用、K平均法)、半教師あり学習、ディープラーニングアルゴリズム(例えば、ニューラルネットワーク、制限付きボルツマンマシン、deep belief network法、畳み込みニューラルネットワーク法、回帰型ニューラルネットワーク法、積層オートエンコーダ法、等)、強化学習(例えば、Q学習アルゴリズム使用、時間的差分学習使用)、回帰アルゴリズム(例えば、最小2乗法、ロジスティック回帰、ステップワイズ回帰、多変量適応型回帰スプライン、局所的に推定された散布図の平滑化(locally estimated scatterplot smoothing)、等)、事例に基づく方法(例えば、k近傍法学習ベクトル量子化自己組織化マップ、等)、正則化方法(例えば、リッジ回帰、lasso(least absolute shrinkage and selection operator)、elastic net、等)、決定木学習方法(例えば、分類木及び回帰木、ID3(iterative dichotomiser 3)、C4.5、CHAID(chi−squared automatic interaction detection)、決定株、ランダムフォレスト、多変量適応型回帰スプライン、勾配ブースティングマシン、等)、ベイズ的方法(例えば、ナイーブベイズ、AODE(averaged one−dependence estimators)、ベイジアンネットワーク、等)、カーネル法(例えば、サポートベクターマシン動径基底関数線形判別分析、等)、クラスタリング法(例えば、k平均法、EMアルゴリズム、等)、相関ルール学習アルゴリズム(例えば、Aprioriアルゴリズム、Eclatアルゴリズム、等)、人工ニューラルネットワークモデル(例えば、パーセプトロン法、バックプロパゲーション法、ホップフィールド・ネットワーク法、自己組織化マップ法、学習ベクトル量子化法、等)、次元削減法(例えば、主成分分析、部分的最小二乗回帰partiallestsquaresregression、サモンマップ化多次元尺度射影追跡、等)、アンサンブル法(例えば、ブースティング、ブートストラップ・アグリゲーティング(bootstrapped aggregation)、AdaBoost、スタック汎化、勾配ブースティングマシン法、ランダムフォレスト法、等)、及び/又は任意の好適な人工知能手法。

0083

しかしながら、1以上の状態の特徴付けの支援S150は任意の好適な様式で実施することができる。

0084

2.7治療支援
これに加えて、又はこれに替えて、方法100の実施形態は、治療の支援S160(例えば、1以上の存在量測定値に基づくもの;1以上の状態の1以上の特徴付けに基づくもの;等)を含むことができ、これは、存在量データを活用して、1以上の状態の治療の提供(例えば、個別化治療の提供、等)を決定、提供、管理、促進、推奨、及び/又はそれ以外の形で支援することに役立つことができる。治療の支援は、存在量測定値の解析に関する任意の好適な技法の適用を含むことができる(例えば、1以上の特徴付けを支援するために;類似の又は異なる統計学的操作又はアルゴリズムを使用して;同一又は異なる存在量測定値、補足データ、他の好適なデータを使用して;等)。治療は、次に示す任意の1以上を含むことができる:治療組成物(例えば、妊娠関連組成物薬物治療に基づく治療、プロバイオティックスに基づく治療、局所治療に基づく(topical−based)治療、等)、外科的治療医療機器を用いる治療、存在量測定値に基づき導かれた状態関連及び/又は治療関連情報を含む健康に関する通知(例えば、被験者、看護者に伝達されるもの、等);食事関連治療;認知/行動治療;理学療法臨床関連治療(例えば、遠隔医療、看護者の予約日程計画、等);代替的な内科的治療;環境に基づく治療;及び/又は任意の他の好適な種類の治療。しかしながら、治療の支援S160は、任意の好適な様式で実施することができる。

0085

2.8 検証
これに加えて、又はこれに替えて、方法100の実施形態は、方法100及び/又はシステム200の実施形態に関連する任意の好適な条件(例えば、精度、コスト、有効性、展開性、等)を評価するのに役立つことができる検証S105(例えば、方法100及び/又はシステム200の実施形態の1以上の部分の検証、等)を含むことができる。特定の実施例において、図10は、スパイクインDNAを未知の量のサンプルに追加するウエトラボプロトコルを図示したものを含むことができ;ここで、スパイクインDNA配列は、10bpの可変領域を除いて内在DNAと同一であり;次いで、スパイクイン及び内在DNAはPCR増幅され、結果として得られるアンプリコンは精製及びBig Dyev3.3 chemistry等を用いてサンガー配列決定され;図10は、スパイクイン及び内在DNA、即ち個々に配列決定された純粋な内在及びスパイクインDNAの調製物のクロマトグラムを含み;内在/スパイクイン混合物のクロマトグラムは、純粋なスパイクインクロマトグラム及び内在クロマトグラムの線形結合であり;図10は、内在DNAの量を算出するためのクロマトグラムデータの計算解析結果を含み;スパイクインDNA及び内在DNAの比率は線形回帰解析により決定され;蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドに対応するサンガークロマトグラムの各チャネルが個々に解析され;“A”チャネルの解析が図示されており;内在又はスパイクインのいずれかにおいて“A”ピークを示すと予想される塩基位置のピーク強度がクロマトグラムで測定される。特定の実施例において、図10に示すように、検証は、スパイクイン混合物及び/又は他の好適な構成要素の存在量測定値の決定において、方法100の実施形態の正確度を評価するために、サンプル処理及び計算処理(例えば、本明細書に記載する任意の好適な技法を用いて、等)を実施することを含むことができ;ここで、検証の測定値(例えば、既知の存在量の構成要素を含むスパイクイン混合物に関する内在対スパイクインの比率、等)は、未知の標的分子存在量を含むサンプルについて算出される存在量比測定値を調整するための較正係数として用いることができ、及び/又は任意の好適な目的に用いることができる様式で算出することができる。

0086

一変形形態において、図12A〜12Bに示すように、標的関連分子(例えば、スパイクイン分子)の任意の好適な存在量(例えば、段階希釈から得られるもの、等)は、方法100の実施形態の一部分に関連する正確度、精密度、及び/又は他の好適なパラメータを評価するために用いることができる。特定の実施例において、図12A〜12Bに示すように(例えば、方法100の実施形態の一部分を適用する正確度及び/又は精密度を示す)、42ngのNA12878ヒトゲノムDNAを様々な量のスパイクインDNAと混合し、PCRを30ラウンド行うことにより増幅し、各サンプル中のスパイクインDNAの比率を、方法100の実施形態の一部分を適用することにより決定し;ここで、スパイクインの比率が>0となる4種のサンプルに回帰直線フィッティングし、この回帰フィッティングに基づけば、0.0226amol、即ち44.9ngはスパイクイン比率が1/2となると予測され;ここで、リファレンスDNAを1fmolをスパイクインDNAと指定の比率で混合し;混合物を20×PCRで増幅し、精製し、方法100の実施形態の部分を実施することができる。

0087

しかしながら、検証S105は任意の好適な様式で実施することができる。

0088

しかしながら、方法100の実施形態は任意の好適な様式で実施することができる。

0089

方法100及び/又はシステム200の実施形態は、任意の変形(例えば、実施形態、変形形態、実施例、具体例、図面、等)を含む、様々なシステムの構成要素及び様々なプロセスのあらゆる組合せ及び並べ替えを包含し、ここで、方法100及び/又はプロセスの実施形態の一部分は、非同時に(例えば、順次)、同時に(例えば、並行して)、又は任意の他の好適な順序で、システム200及び/又は本明細書に記載する他の要素(entity)の1以上の段階、要素、構成要素、及び/又は他の様相により、又はこれらを用いて実施することができる。

0090

本明細書に記載する任意の変形(例えば、実施形態、変形形態、実施例、具体例、図面、等)及び/又は本明細書に記載する変形の任意の部分を、これに加えて、又はこれに替えて、結合、集合、排除、使用、順次実施、並行実施、及び/又はそれ以外の形で適用することができる。

0091

方法100及び/又はシステム200の実施形態の一部分は、コンピュータ可読命令を保存するコンピュータ可読媒体を受けるように構成された装置の少なくとも一部で具体化及び/又は実行することができる。命令は、システム200の実施形態に統合することができるコンピュータ実行可能な構成要素で実行することができる。コンピュータ可読媒体は、RAM、ROM、フラッシュメモリ、EEPROM光学素子(CD又はDVD)、ハードドライブフロッピードライブ、又は任意の好適なデバイス等の任意の好適なコンピュータ可読媒体に保存することができる。コンピュータ実行可能な構成要素は、汎用又は特定用途向け処理装置とすることができるが、任意の好適な専用のハードウェア又は、ハードウェア/ファームウェアを組み合わせたデバイスで代替的に又は追加的に命令を実施することができる。

0092

当業者は、上の詳細な説明並びに図面及び特許請求の範囲から、方法100、システム200、及び/又は変形の実施形態を、特許請求の範囲に定義した範囲から逸脱することなく修正及び変化させることが可能であることを認識するであろう。

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