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図面 (13)

課題・解決手段

本明細書において、オトペトリポリペプチドを含む組成物及び装置、並びに、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を通るプロトン転移活性調節物質を同定するためのその使用が提示される。

概要

背景

[0004]脂質二重層プロトンにとって透過不可能であり、細胞内への及び細胞からのプロトンの移動は、イオンチャネルを含む膜タンパク質によって厳しく調節される。本明細書において提示されるように、膜貫通タンパク質であるオトペトリン1(Otop1)及びある特定の関連する膜貫通タンパク質が、プロトン選択性のイオンチャネルとして同定されている。

[0005]図面は、本技術の実施形態を説明するものであり、限定するものではない。説明を明瞭且つ平易にするために、図面は同じ縮尺では作成されておらず、一部の場合では、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が誇張又は拡大されて示される場合がある。

概要

本明細書において、オトペトリンポリペプチドを含む組成物及び装置、並びに、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を通るプロトン転移活性調節物質を同定するためのその使用が提示される。

目的

[0029]ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドは、任意の量の検出可能なプロトン転移活性を提供する

効果

実績

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請求項1

オトペトリ介在性プロトン転移活性調節物質を同定する方法であって、(a)オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を、試験化合物と接触させるステップ、及び(b)オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を判定するステップを含み、試験化合物の非存在下で判定されたプロトン転移活性の量と比較した前記プロトン転移活性の少なくとも1%の増大又は低減が、前記試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性の調節物質として同定する、方法。

請求項2

(b)で判定された前記プロトン転移活性と、前記試験化合物の非存在下でオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分について判定されたプロトン転移活性とを比較するステップを含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

プロトン転移活性の少なくとも1%の増大が、前記試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアゴニストであると同定する、請求項1又は2に記載の方法。

請求項4

プロトン転移活性の少なくとも1%の減少が、前記試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアンタゴニストであると同定する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

前記オトペトリンポリペプチドが、哺乳動物のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

前記哺乳動物のオトペトリンポリペプチドが、Otop1、Otop2、Otop3、及びその機能的部分から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項5に記載の方法。

請求項7

前記オトペトリンポリペプチドが、昆虫のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

前記オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が、内在性膜タンパク質である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

前記オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が、細胞膜又は合成膜と共役している、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

前記プロトン転移活性を判定するステップが、伝導性電流細胞内pH、細胞内カルシウム、又はオトペトリンポリペプチド若しくはその機能的部分を含む膜にわたる電圧電位若しくは抵抗を測定することを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

前記伝導性、前記電流、前記細胞内pH、前記細胞内カルシウム、前記電圧電位、又は前記抵抗が、pHの変化に応答して測定される、請求項10に記載の方法。

請求項12

前記プロトン転移活性を判定するステップが、パッチクランプ技術、電圧クランプ技術、ホールセル電流の測定、放射性標識されたイオン流束アッセイ、又はpH感受性指標の使用を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

前記pH感受性の指標が、pHluorin又はpHrodoレッドを含む、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記プロトン転移活性を判定するステップが、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を細胞で発現させることを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

前記細胞が、トランスフェクトされた哺乳動物細胞である、請求項14に記載の方法。

請求項16

前記細胞が卵母細胞である、請求項14又は15に記載の方法。

請求項17

前記試験化合物が、有機低分子無機分子求電子剤多糖ペプチドタンパク質、抗体、核酸、及び抽出物からなる群から選択され、前記抽出物が、細菌、植物、真菌動物細胞、及び動物組織から選択される生物学的材料由来する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。

請求項18

前記試験化合物が50〜500000ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記試験化合物が、約0.1uM〜約1000mMの範囲の濃度である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。

請求項20

オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法であって、(a)(i)試験化合物の存在下で、及び(ii)試験化合物の非存在下で、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を測定するステップ、及び(b)(a)の(i)で測定されたプロトン転移活性と、(a)の(ii)で測定されたプロトン転移活性とを比較した差を判定し、この判定によって、試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性の調節物質として同定するステップを含む、方法。

請求項21

前記差が少なくとも1%の差である、請求項20に記載の方法。

請求項22

(a)の(i)で測定された前記プロトン転移活性が、(a)の(ii)で測定されたプロトン転移活性よりも少なくとも1%大きく、前記試験化合物が(b)において、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアゴニストとして同定される、請求項20又は21に記載の方法。

請求項23

(a)の(i)で測定された前記プロトン転移活性が、(a)の(ii)で測定されたプロトン転移活性よりも少なくとも1%小さく、前記試験化合物が(b)において、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアンタゴニストとして同定される、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。

請求項24

前記オトペトリンポリペプチドが、哺乳動物のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む、請求項20〜23のいずれか一項に記載の方法。

請求項25

前記哺乳動物のオトペトリンポリペプチドが、マウス又はヒトのOtop1、Otop2、Otop3、及びその機能的部分から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項24に記載の方法。

請求項26

前記オトペトリンポリペプチドが、昆虫のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む、請求項20〜23のいずれか一項に記載の方法。

請求項27

前記オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が内在性膜タンパク質である、請求項20〜26のいずれか一項に記載の方法。

請求項28

前記オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が、細胞膜若しくは合成膜と共役しているか又は細胞膜若しくは合成膜に組み込まれる、請求項20〜27のいずれか一項に記載の方法。

請求項29

前記プロトン転移活性を測定するステップが、伝導性、電流、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む膜にわたる電圧電位又は抵抗を測定することを含む、請求項20〜28のいずれか一項に記載の方法。

請求項30

前記プロトン転移活性を測定するステップが、pHの変化に応答した、伝導性、電流、細胞内pH、細胞内カルシウム、又はオトペトリンポリペプチド若しくはその機能的部分を含む膜にわたる電圧電位若しくは抵抗を測定することを含む、請求項20〜29のいずれか一項に記載の方法。

請求項31

pHの変化をオトペトリンポリペプチドの一方の側で誘発するステップを含む、請求項20〜30のいずれか一項に記載の方法。

請求項32

前記pHの変化が細胞外pHの変化である、請求項30又は31に記載の方法。

請求項33

前記pHの変化がpHの増大である、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。

請求項34

前記pHの変化がpHの減少である、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。

請求項35

前記pHの変化が少なくとも0.1pH単位である、請求項30〜34のいずれか一項に記載の方法。

請求項36

前記プロトン転移活性を測定するステップが、パッチクランプ技術、ホールセル電流の測定、2電極の電圧クランプ、放射性標識されたイオン流束アッセイ、又は電圧感受性の染料を使用する蛍光アッセイを含む、請求項20〜35のいずれか一項に記載の方法。

請求項37

前記プロトン転移活性を測定するステップが、異種又は同種の細胞においてオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を発現させることを含む、請求項20〜36のいずれか一項に記載の方法。

請求項38

前記異種又は同種の細胞が哺乳動物細胞である、請求項37に記載の方法。

請求項39

前記異種又は同種の細胞が卵母細胞である、請求項37に記載の方法。

請求項40

前記異種又は同種の細胞が味覚受容体細胞である、請求項37に記載の方法。

請求項41

前記試験化合物が、有機低分子、無機低分子、多糖、ペプチド、タンパク質、抗体、核酸、及び抽出物からなる群から選択され、前記抽出物が、細菌、植物、真菌、動物細胞、及び動物組織から選択される生物学的材料に由来する、請求項20〜40のいずれか一項に記載の方法。

請求項42

前記試験化合物が50〜500000ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項20〜41のいずれか一項に記載の方法。

請求項43

前記試験化合物が、約0.1uM〜約1000mMの範囲の濃度である、請求項20〜42のいずれか一項に記載の方法。

請求項44

細胞外膜と、細胞外膜に組み込まれたオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分とを含む細胞。

請求項45

クセノプス属卵母細胞である、請求項44に記載の細胞。

請求項46

哺乳動物細胞である、請求項44に記載の細胞。

請求項47

前記オトペトリンポリペプチドが細胞に対して異種である、請求項44に記載の細胞。

請求項48

前記オトペトリンポリペプチドが、修飾された非天然のオトペトリンポリペプチドである、請求項44に記載の細胞。

請求項49

オトペトリンポリペプチドを含む合成膜又は合成脂質二重層

請求項50

チャネルを通るプロトン転移活性を感知するためのシステムであって、細胞の膜に組み込まれた1つ又は複数の異種オトペトリンポリペプチドを含み、前記細胞が、1つ又は複数の異種オトペトリンポリペプチドの発現を指示する1つ又は複数の核酸を含み、前記細胞が蛍光pHの指標又は蛍光カルシウムの指標を含む、システム。

請求項51

前記細胞が不死化細胞である、請求項50に記載のシステム。

請求項52

前記細胞がHEK−293又はCos−7である、請求項50又は51に記載のシステム。

請求項53

1つ又は複数の前記異種オトペトリンポリペプチドが、Otop1、Otop2、及びOtop3から選択される、請求項50〜52のいずれか一項に記載のシステム。

請求項54

前記細胞が蛍光レポーターでトランスフェクトされている、請求項50〜53のいずれか一項に記載のシステム。

請求項55

前記蛍光レポーターがpHluorinである、請求項50〜54のいずれか一項に記載のシステム。

請求項56

前記蛍光pHの指標が、pHrodoレッド、DFFDA、及びBCECFから選択されるか、又は蛍光カルシウムの指標がFura2AMである、請求項50〜55のいずれか一項に記載のシステム。

請求項57

蛍光イメージングプレートリーダーFLIPR)をさらに含む、請求項50〜56のいずれか一項に記載のシステム。

請求項58

試験化合物をさらに含む、請求項50〜57のいずれか一項に記載のシステムであって、前記試験化合物が1つ又は複数のオトペトリンポリペプチドと接触している、システム。

請求項59

異種オトペトリンポリペプチドを含む細胞。

請求項60

前記オトペトリンポリペプチドが、Otop1、Otop2、及びOtop3から選択される、請求項59に記載の細胞。

請求項61

前記細胞が、異種オトペトリンポリペプチドの発現を指示する核酸でトランスフェクトされている、請求項59又は60に記載の細胞。

請求項62

前記細胞が昆虫細胞又は爬虫類細胞であり、前記異種オトペトリンポリペプチドが哺乳動物のオトペトリンポリペプチドである、請求項59〜61のいずれか一項に記載の細胞。

請求項63

前記細胞が非ヒト細胞であり、前記異種オトペトリンポリペプチドがヒトオトペトリンポリペプチドである、請求項59〜62のいずれか一項に記載の細胞。

関連する特許出願

0001

[0001]この特許出願は、発明者名がEmily Limanであり、代理人案件番号第043871−0452046号によって指定される「医薬品開発のための標的としてのオトペトリプロトンチャネル」という名称の2017年7月27日に出願された特許仮出願第62/537,900号の利益を主張する。全てのテキスト、表、及び図面を含む、先の特許出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

0002

政府支援
[0002]本発明は、一部は、米国国立衛生研究所の認可番号R01DC013741及びR21DC012747の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。

技術分野

0003

[0003]本発明の実施形態は、オトペトリン介在性プロトン転移調節因子を同定するための組成物及び方法に関する。

背景技術

0004

[0004]脂質二重層プロトンにとって透過不可能であり、細胞内への及び細胞からのプロトンの移動は、イオンチャネルを含む膜タンパク質によって厳しく調節される。本明細書において提示されるように、膜貫通タンパク質であるオトペトリン1(Otop1)及びある特定の関連する膜貫通タンパク質が、プロトン選択性のイオンチャネルとして同定されている。

0005

[0005]図面は、本技術の実施形態を説明するものであり、限定するものではない。説明を明瞭且つ平易にするために、図面は同じ縮尺では作成されておらず、一部の場合では、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が誇張又は拡大されて示される場合がある。

図面の簡単な説明

0006

Otop1がクセノプス属(Xenopus)卵母細胞及びHEK−293細胞において、酸誘発された電流を生じさせることを示す図である。図1aは、減少するpHの、Na+を含有しない細胞外溶液応答した、Otop1を発現するクセノプス属卵母細胞における、TEVCによって測定された電流を示す(Vm=−80mV)。図1bは、図1aにおける電流のI−Vの関係を示す。電圧は、1V/sで−80mV〜80mVまで傾斜させた。図1cは、Otop1mRNAを注射されたクセノプス属卵母細胞(n=4)及び注射されていない卵母細胞(灰色の丸、n=4)における、pHに対する、誘起された電流の規模アベレージ(平均±SEM)(ΔI)の関数を示す。図1dは、Na+を含有しない溶液中でOtop1でトランスフェクトされたHEK−293細胞における、ホールセルパッチクランプ記録法によって測定された電流を示す(Vm=−80mV)。図1eは、電圧を傾斜させた(1V/s)実験から示されるような、pH0での、Otop1でトランスフェクトされたHEK−293細胞において誘起された電流のI−Vの関係を示す。図1fは、Otop1でトランスフェクトされたHEK−293細胞(四角、n=5)及びトランスフェクトされていない細胞(灰色の四角、n=3)における、pHに対する、誘起された電流の規模のアベレージ(平均±SEM)(ΔI)の関数を示す。図1gは、細胞質タンパク質タグ−RFPでコトランスフェクトされ、共焦点顕微鏡法で画像化された、Otop1とYFPとの融合タンパク質(YFP−Otop1)を示す。ラインスキャン図1g、下のパネル)は、YFP−Otop1が細胞表面に多くあることを示す。図1hは、pHrodoレッドで測定したところ、Otop1でトランスフェクトされた細胞は細胞外pHの変化に応答して細胞内pHを大きく変化させたが、トランスフェクトされた細胞はそうではなかったことを示す(平均±SEM、n=9〜11)。類似の結果が、3回の反復で得られた。データのアベレージ(平均±SEM、n=28〜29細胞)を両側t検定によって分析した。****:p<0.0001。HOAcを陽性対照として用いた。
Otop1のイオン選択性及び生物物理学的特性を示す図である。図2aは、Otop1の電流が、示した時点で、細胞外溶液中のNMDG+をNa+、Li+、若しくはCs+(それぞれ160mM)、又はCa2+(40mM)で置き換えた低pH溶液に応答して誘起されたことを示す(Vm=−80mV)。電流の変化のパーセンテージのアベレージが示される。図2bは、Otop1の電流が、イオン蓄積を最小にし、Otop1の電流の単離を可能にする条件下の、変化する細胞外pHで、電圧ランプ(1V/s)に応答して誘起されたことを示す(pHi=6.0、Zn2+感受性の成分が示される)。図2cは、図2bの実験から得られたΔpH(pHi−pHo)に対する、Erevの関数を示す。赤のラインは、純粋にH+選択性コンダクタンスについての予測を示す。データを、53mV/ΔpHの傾斜及び3.6mVのY切片を有する線形回帰フィッティングした(R2=0.99)。図2d及び図2eは、140mMのNMDG+、4mMのCl−(Erev=34.4±1.0、n=5);140mMのNa+、4mMのCl−(Erev=34.4±1.0、n=5);140mMのNa+、20mMのCl−(Erev=33.8±1.0、n=5);又は(d)140mMのNMDG+、4mMのCl−(35.2±1.2、n=5);NMDG+、20mMのCl−(35.5±0.5、n=4)の存在下で測定されたOtop1の電流(Zn2+感受性の成分)を示す。いずれの条件の間にも有意差はなく、ANOVAによってp>0.05であった。図2fは、HEK−293細胞におけるOtop1の電流がZn2+によって用量依存性の様式で遮断されることを示す(ピンク色のバー、示される濃度はmM単位である)。図2gは、データのアベレージ(平均±SEM、n=6〜14)が、0.19mMのIC50及び0.89のHill係数でHill方程式にフィッティングしたことを示す。
オトペトリンが多様な種においてプロトンチャネルをコードすることを示す図である。図3aは、13のオトペトリンファミリータンパク質マルチシーケンスアラインメントから作成された最大尤度系統樹を示す。スケールバーは、0.1置換/部位である。図3bは、3つのマウスホモログ(Otop1、Otop2、及びOtop3、左側)の間の、及び、mOtop1とdmOTOPLcとの間(右側)の、膜貫通ドメイン細胞質ドメイン、及び細胞外ドメインにおける配列同一性を示す。TMドメイン11は、哺乳動物タンパク質の間で高度に保存されるが、TMドメイン5は、脊椎動物タンパク質無脊椎動物タンパク質との間で最も高度に保存される。TMドメイン12は全ての間で高度に保存される。図3c及び図3eは、電流が、変化するpHOに応答して、Otop2、Otop3(c)、又はdmOTOPLc(e)を発現するクセノプス属卵母細胞において誘起されたことを示す。代表的なトレース(Vm=−80mV)及びI−Vの関係(1V/sでの電圧ランプからの)が示される。プロトン選択性イオンチャネルで予想されたように、Erevは、Otop3及びdmOTOPLcでは、pHoが低減するにつれ右にシフトした。Otop2は、変則的な挙動を示した。図3d及び図3fは、チャネルの各々でのpHに対する、誘起された電流のアベレージ(ΔI)の関数を示す(黒い丸、平均±SEM、n=3−7)。灰色の三角は、注射されていない卵母細胞からの応答を示す(n=3、平均±SEM)。ΔIとpHとの間の関係がチャネル間で変化し、mOtop3が最も急勾配の関係を示したことに留意されたい。
Otop1の電流を安定化させる条件下でのErevの測定を示す図である。図4aは、Otop1の電流を安定化させ、[H+]iの変化を低減させるように設計された、電圧及び溶液交換プロトコルを示す。細胞内溶液をpHi=6.0に調節し、VmをEHの近くで維持し(pHo=7.0では−60mV、pHo=5.5では+30mV)、1V/sで−80mV〜+80mVまで電圧を傾斜させた。pH5.5の溶液(NMDGベースの)に対する、Otop1でトランスフェクトされたHEK−293細胞及びトランスフェクトされていない細胞の応答が示される(キャパシタンスアーティファクトは除去した)。Otop1を発現する細胞においてpH5.5に応答して誘起された電流は記録の期間を通して安定なままであったことに留意されたい。図4bは、aの実験で得られたI−V曲線を示す。Zn2+への曝露の後にpH5.5に応答して引き起こされた電流を、Zn2+への曝露の前の電流から差し引いて、純粋なOtop1依存性の電流を得(3−4)、そこからErevを測定した。
Otop1の電流が穏やかな電圧依存性のみを示すことを示す図である。図5は、pH5.5の溶液への曝露の前及び最中の、一群電圧ステップ(示される)に応答した、クセノプス属卵母細胞におけるOtop1の電流を示す。右側は、示された時間で測定されたデータのアベレージ(n=4)である。−80mVまでの最も過分極する電圧ステップでのみ、電流振幅に何らかの時間依存性の変化があった。
Otop2及びOtop3が、内向き伝導するプロトンチャネルを形成することを示す図である。図6a及び図6bは、クセノプス属卵母細胞で発現するOtop1及びOtop2のpHに対するErevの関数を示す。赤のラインは、傾きがOtop2及びOtop3でそれぞれ20.7及び46.3mV/log[H+]の、pH5と6との間のデータの線形フィッティングを示す。点線はEHを示し、仮定のpHiは7.2である。図6bは、クセノプス属卵母細胞において、中性及び酸性pHでの過分極電圧ステップに対するOtop2及びOtop3の応答が、穏やかな電圧依存性のゲーティングに対して最小であることを示す。データは、n>3の実験の代表である。本発明者らが、pH7.4の溶液中で、0mVで、Otop2を発現する卵母細胞において外向き電流一貫して観察したことに留意されたい。このことは、チャネルを通るプロトンの外向きの動きに起因し得る。図6cは、pHの指標であるpHrodoレッドでモニタリングした、酢酸を添加されていない及び添加されたpH5の溶液に応答した、Otop2若しくはOtop3でトランスフェクトされた、又は偽トランスフェクトされたHEK−293細胞の細胞内pHの変化を示す(平均±SEM)。図6dは、応答のピークで測定された、cの実験で得られたデータのアベレージ(平均±SEM)を示す。有意性を両側t検定によって判定した。***:P<0.001。類似の結果が、3回の反復実験で得られた。
HEK−293細胞におけるOtop2の生物物理学的特性を示す図である。図7aは、トランスフェクトされたHEK−293細胞のホールセルパッチクランプ記録法で測定されたOtop2の電流を示す。溶液を交換し、示されるように、−80mV〜+160mVまで膜電圧を傾斜させた(1V/s)。図7bは、(a)で示された実験で得られたI−Vの関係を示す。図7cは、図7a及び7bの実験で得られたErevのアベレージ(平均±SEM)を示す。傾きが25.3mV/log[H+]の、pH5と6との間のデータの線形フィッティングが示される。クセノプス属卵母細胞におけるOtop2についての対応する関係も示される。
ヒトOtop1がプロトンチャネルを形成することを示す図である。図8は、Otop1がプロトンチャネルを形成することを示すさらなる証拠を示す。図8aは、変化する外部pHに応答して、hOtop1でトランスフェクトされたHEK293細胞において引き起こされた電流を示す。図8bは、トランスフェクトされた細胞及びトランスフェクトされていない細胞における、pH5.0での、図8aの実験で得られた電流の規模のアベレージを示す。図8c及び図8dは、pHの指標であるpHrodoレッドで測定された、酢酸を添加した及び添加していないpH5の溶液に応答した、hOtop2でトランスフェクトされた、又は偽トランスフェクトされたHEK293細胞の細胞内pHの変化を示す(平均+/−SEM)。誤差のバーは、SEMを表す。有意性をANOVAによって計算する。****:P<0.0001。類似の結果が、少なくとも3回の反復実験で得られた。
細胞外pHの変化に応答した、Otop1でトランスフェクトされたHEK−293細胞における細胞内カルシウムの上昇を示す図である。図9は、mOtop1でトランスフェクトされた、又は偽トランスフェクトされたHEK−293細胞における細胞内カルシウムの変化を示す。トランスフェクトされた細胞に、カルシウムの指標であるFura 2 AMをロードし、7.4〜5.0までの細胞外pHの変化に曝露させた。図9(左側のパネル)は、Otop1でトランスフェクトされた細胞のみが応答した(n=8細胞)ことを示す。両方の細胞型が、細胞膜侵入し細胞内の酸性化を生じさせ、それによって、細胞内の緩衝液からカルシウムを遊離させることで細胞内カルシウムを上昇させる、pH5のHOAcに応答した。応答の規模のピークは、右側のパネルで示される。Otop1でトランスフェクトされた細胞と偽トランスフェクトされた細胞との間の差は有意である(ステューデントt検定。***p<0.001)。
様々なpHに応答した、異なるオトペトリンのpHluorinイメージングを示す図である。HEK−293細胞に、pHluorin及び示されるオトペトリンポリペプチドの1つでコトランスフェクトしたか、又は対照でコトランスフェクトした(図10D、pHluorinのみでトランスフェクトされた)。図10は、Otop1(図10A)、Otop2(図10B)、及びOtop3(図10C)でトランスフェクトされたHEK−293細胞が、細胞への酸性pH溶液のアプライ(HClによって調節された)に応答して、細胞内のpHluorin蛍光の減少を示す(このことは、細胞内pHが低減したことを示した)ことを示す。細胞内pHの低減は、pHluorinのみでトランスフェクトされた対照では見られなかった(図10D)。しかし、塩基性溶液(pH8.5)をアプライすると、Otop1及びOtop2を有する細胞のみがpHluorin蛍光の増大を示し(細胞内のアルカリ化)、それはOtop3を有する細胞では示されなかった。pH5.0の酢酸溶液弱酸)をアプライすると細胞内の酸性化が誘発され、これは、細胞内pHが低減した後にpHluorin蛍光が全ての細胞において減少したことを示すための対照として機能する。黒のライン:pHluorin蛍光強度のアベレージ。薄い灰色のライン:pHluorin蛍光強度のs.e.m.。濃い灰色のバー:アプライされた異なるpH溶液(ブランク:pH7.4)。HOAc:酢酸。

課題を解決するための手段

0007

[0016]一部の態様では、本明細書において、オトペトリン介在性のプロトン転移活性調節物質を同定するための方法であって、(a)オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を、試験化合物と接触させるステップ、及び(b)オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を判定するステップを含み、試験化合物の非存在下で判定されたプロトン転移活性と比較したプロトン転移活性の少なくとも1%の増大又は減少が、その試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性の調節物質として同定する、方法が提示される。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドが介在するプロトン転移活性は、pHの変化に応答して判定される。pHの変化は、pHの増大又は減少であり得る。一部の実施形態では、pHの変化は、少なくとも0.1pH単位の変化である。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドが介在するプロトン転移活性は、細胞外pHの変化に応答して判定される。一部の実施形態では、本方法は、pH(例えば、細胞外pH)の変化を誘発するステップを含む。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは脂質二重層に組み込まれており、本方法は、(a)の前又は(b)の前に酸又は塩基をオトペトリンポリペプチドの一方の側(例えば、細胞外の側)に添加することによってpHの変化を誘発するステップを含む。

0008

[0017]一部の態様では、本明細書において、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法であって、(a)(i)試験化合物の存在下で、及び(ii)試験化合物の非存在下で、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を測定するステップ、及び(b)(a)の(i)で測定されたプロトン転移活性と、(a)の(ii)で測定されたプロトン転移活性とを比較した差を判定し、この判定によって、試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性の調節物質として同定するステップを含む、方法が提示される。

0009

[0018]一部の態様では、本明細書において、細胞外膜と、細胞の細胞外膜に組み込まれたオトペトリンポリペプチド(例えば、異種オトペトリンポリペプチド)とを含む細胞が提示される。一部の実施形態では、細胞は、クセノプス属卵母細胞である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、味覚受容体細胞である。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、異種オトペトリンポリペプチド(例えば、オトペトリンポリペプチドを含む細胞に対して異種の)である。例えば、一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、異種の昆虫細胞爬虫類細胞、又は非ヒト哺乳動物細胞において発現されるヒトオトペトリンポリペプチドである。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、オトペトリンポリペプチドを天然には発現しない不死化細胞又は不活化細胞型において発現されるヒトオトペトリンポリペプチドである。

0010

[0019]一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、オトペトリンポリペプチドの発現を指示する核酸を哺乳動物細胞又は卵母細胞に導入するステップを含む。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドの発現を指示する核酸は、オトペトリンポリペプチドをコードするcDNAである。例えば、ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞又は卵母細胞は、オトペトリンポリペプチドをコードするcDNAでトランスフェクトされる。オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分をコードする任意の適切な核酸又はcDNAを、本明細書において記載される方法に使用することができる。

0011

[0020]一部の実施形態では、プロトン転移活性は、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞に対して2電極電圧クランプを行うこと、トランスフェクトされたHEK−293細胞をパッチクランプすること、又は細胞内pHの指標をイメージングすることを含む方法によって、判定、測定、検出、又はアッセイされる。例えば、ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドタンパク質、その機能的部分、又はそのホモログをコードする核酸が、クセノプス属卵母細胞に注入されて、卵母細胞膜でのオトペトリンポリペプチドの発現及び組み込みに介在するようになる。プロトン転移活性を次いで、膜の極性化の変化(例えば、膜電位の変化)を測定することによって評価することができる。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、pH及び/又はpHの変化(例えば、細胞内pHの変化)を適切なpH感受性の指標で測定することによって判定される。pH感受性の指標は、pH感受性の染料(例えば、pHrodoレッド)又はpH感受性のタンパク質(例えば、pH感受性の緑色蛍光タンパク質(GFP)又はpHluorin)であり得る。一部の実施形態では、pH及び/又はpHの変化は、pHrodoレッドで測定することができる。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞内のCa2+又は亜鉛のレベルの変化を測定することによって判定される。例えば、カルシウムレベルは、Fura−2などの蛍光カルシウム指標染料を使用することによって測定することができる。典型的な顕微蛍光測定アッセイでは、単一のCa2+イオンを結合すると蛍光が変化するFura−2などの染料が、Otop発現細胞細胞質基質にロードされる。試験化合物に曝露された際の細胞質性のカルシウムの増大は、カルシウムが結合すると生じるFura−2の蛍光の変化に反映される。

0012

[0021]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性は、機能的、化学的、及び物理的影響を判定するための様々なインビトロアッセイ及びインビボアッセイを使用して、例えば、他の分子(例えば、ペプチドや、ペプチド、有機低分子、及び脂質を含むシグナル伝達分子)へのオトペリンの結合を測定すること、並びに/又は、オトペトリン依存性のプロトン転移の結果生じる細胞内pHの変化に応答したタンパク質発現(例えば、転写レベルタンパク質レベルなど)の増大若しくは減少を測定することで、間接的に評価される。一部の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞の成長又は生存能力の各々でオトペトリン依存性のプロトン転移が介在する場合には、細胞の成長又は生存能力の変化を評価することによって判定される。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞内の第2のメッセンジャー(例えば、IP3、cGMP、又はcAMP)の量又は修飾(例えばリン酸化)がオトペトリン依存性のプロトン転移によって調節又は誘発される場合には、このような量の変化を検出すること、又は修飾を検出することによって、間接的に判定又は測定される。

0013

[0022]ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、膜にオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が組み込まれた細胞又は卵母細胞でパッチクランプ技術を使用して判定される。一部の実施形態では、オトペトリン依存性のプロトン転移活性の存在は、少なくとも0.1pH単位のpHの変化に応答した、少なくとも0.1pA、少なくとも1pA、少なくとも5pA、少なくとも10pA、少なくとも50pA、少なくとも100pA、少なくとも500pA、少なくとも1000pA、少なくとも50nA、少なくとも100nA、少なくとも500nA、少なくとも0.1μA、少なくとも0.2μA、少なくとも0.5μA、少なくとも1.0μA、又は少なくとも2μAの電流の純変化として判定される。一部の実施形態では、電流の変化は、適切な数学アルゴリズムを使用して容易に変換されるパラメータである抵抗又は電圧電位の対応する変化を測定又は検出することによって、判定、測定、又は検出される。一部の実施形態では、オトペトリン依存性のプロトン転移活性の調節は、オトペトリン依存性のプロトン転移活性における少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、又は少なくとも10倍の純変化(例えば、プロトン転移活性の増大又は減少)である。純変化は、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリン介在性のプロトン転移活性を、試験化合物の存在下で判定されたオトペトリン介在性のプロトン転移活性と比較することによって判定することができる。一部の実施形態では、試験化合物の非存在下で判定されるオトペトリン介在性のプロトン転移活性の量は、参照レベル又は対照と呼ばれる。例えば、プロトン転移活性の減少は、一部の実施形態では、試験化合物の存在下でのオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の量を、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性(例えば、参照レベル)と比較することによって判定される。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性の増大は、試験化合物の存在下でのオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の量を、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性(例えば、参照レベル)と比較することによって判定される。

0014

[0023]プロトンを真核細胞輸送することができるプロトンチャネルは、分子的に同定されていない。味細胞トランスクリプトームプロファイリングに基づく不偏のスクリーニングを使用して、膜貫通タンパク質オトペトリン1(Otop1)を、新規な生物物理学的特性を有するプロトン選択性イオンチャネルをコードすると同定した。関連するマウス遺伝子であるOtop2及びOtop3、並びにショウジョウバエ属(Drosophila)遺伝子のdmOTOPLcもまた、プロトンチャネルをコードする。Otop1がZn2+感受性のプロトン伝導性に必要であることも、本明細書において判定された。

0015

[0024]一部の実施形態では、本明細書において、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法が提示される。一部の実施形態では、本方法は、試験化合物をオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分と接触させるステップ、及びオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を判定するステップを含む。用語「判定する」は、「プロトン転移活性を判定する」文脈で本明細書において使用する場合、これらに限定されないが、「測定する」、「検出する」、及び/又は「得る」ことを意味し、含む。

0016

オトペトリンポリペプチド
[0025]オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分は、脂質二重層内のチャネルを形成する複数回貫通型内在性膜タンパク質である。したがって、本明細書において言及されるオトペトリンポリペプチド又はその機能的変異体は、脂質二重層(例えば、細胞膜又は合成脂質二重層)に組み込まれるオトペトリンポリペプチドである。細胞膜に組み込まれる場合、オトペトリンポリペプチドは、第1の側(例えば、細胞外の側)及び第2の側(例えば、細胞内の側)を含む。本明細書において示されるように、オトペトリンポリペプチドは、膜の一方の側でのpHの変化(例えば、プロトンの増大又は減少)に多くは応答して、オトペトリンポリペプチドの一方の側(例えば、膜の一方の側)からオトペトリンポリペプチドの他方の側(例えば、膜の他方の側)へのプロトンの転移をもたらす。一部の実施形態では、pHの変化がオトペトリンポリペプチドの一方の側で誘発され(例えば、塩基又は酸の添加によって)、その後、オトペトリンポリペプチドを通るプロトン転移が検出される。

0017

[0026]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、任意の適切な生物学的生物から得られる、発現される、又は由来するオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなり、任意の適切な生物学的生物の非限定的な例としては、動物、植物、原生生物刺胞動物淡水水生動物又は海洋動物)、節足動物真菌、細菌、環形動物棘皮動物脊索動物、及び軟体動物、及びそれに類するものが含まれる。オトペトリンポリペプチドは、任意の適切な種から得られ得るか、発現され得るか、又は由来し得る。オトペトリンポリペプチドは、一部の実施形態では、昆虫由来のオトペトリンポリペプチド(例えば、ショウジョウバエ属に由来するオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分)を含むか又はそれからなる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、適切な哺乳動物から得られる、発現される、又は由来するオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなる。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは哺乳動物オトペトリンポリペプチドを含み、哺乳動物オトペトリンポリペプチドの非限定的な例としては、オトペトリン−1(Otop1)、オトペトリン−2(Otop2)、及びオトペトリン−3(Otop3)が含まれる。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、齧歯動物から得られる、発現される、又は由来するオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなり、齧歯動物の非限定的な例としては、マウス及びラットが含まれる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、適切な霊長類から得られる、発現される、又は由来するオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなる。霊長類は、非ヒト霊長類であり得るか、又はヒトを含み得る。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、ヒトオトペトリンポリペプチドを含むか、それからなるか、それから得られるか、又はそれに由来し、ヒトオトペトリンポリペプチドの非限定的な例としては、オトペトリン−1(Otop1、UniProtKB−Q7RTM1、配列番号1)、オトペトリン−2(Otop2、UniProtKB−Q7RTS6、配列番号2)、及びオトペトリン−3(Otop3、UniProtKB−Q7RTS5、配列番号3)が含まれる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドはマウスオトペトリンポリペプチドを含み、マウスオトペトリンポリペプチドの非限定的な例としては、オトペトリン−1(Otop1、UniProtKB−Q80VM9、配列番号4)、オトペトリン−2(Otop2、UniProtKB−Q80SX5、配列番号5)、オトペトリン−3(Otop3、UniProtKB−Q80UF9、配列番号6)、又はその機能的部分が含まれる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、ショウジョウバエ属のOtopポリペプチドを含むか若しくはそれからなるオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなり、ショウジョウバエ属のOtopポリペプチドの非限定的な例としては、ショウジョウバエ属OTOP変異体D(NM_001272325.1(CG42492))(配列番号7)、ショウジョウバエ属OTOP変異体A(NM_134914.3(CG332)(配列番号8)、及びショウジョウバエ属OTOP変異体D(NM_001144688.3(CG42265))(配列番号9)が含まれる。オトペトリンポリペプチドは、オトペトリンポリペプチドをコードする適切な核酸(例えば、cDNA)を使用して、細胞の細胞膜において発現させることができる。一部の実施形態では、適切な細胞は、オトペトリンポリペプチドをコードするcDNAでトランスフェクトされる。ショウジョウバエ属のオトペトリンポリペプチドをコードするcDNAの非限定的な例は、NCBI参照番号NM_001272325.1(CG42492)、NM_134914.3(CG332)、及びNM_001144688.3(CG42265)で提供される。

0018

[0027]ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、1つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含む。オトペトリンポリペプチドは、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドに少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であり得る。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、配列番号1、2、3、4、5、又は6のうちのいずれか1つのオトペトリンポリペプチド配列に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一なオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなる。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、1つ若しくは複数のアミノ酸類似体又は1つ若しくは複数の修飾されたアミノ酸を含む。アミノ酸の置換、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又はアミノ酸の類似体を含む修飾されたオトペトリンポリペプチドは、ペプチド配列改変するための適切な方法によって調製することができ、ペプチド配列を改変するための適切な方法の非限定的な例は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、J.Sambrookら編、第2版、Cold Spring Harbor、又はCurrent Protocols in Molecular Biology、F.M.Ausubelら編、John Wiley & Sons,Inc.New Yorkにおいて記載される。オトペトリンポリペプチドはまた、適切な組換え核酸技術を使用して修飾及び作製することができる。

0019

[0028]用語「同一なパーセント」又は「パーセント同一性」は、2つのアミノ酸配列の間の配列同一性を指す。同一性は、比較を目的としてアラインされ得る各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列内の同等な位置に同じアミノ酸がある場合、分子は、その位置で同一である。同等な部位に同じ又は類似のアミノ酸残基(例えば、立体的性質及び/又は電子的性質が類似の)がある場合、分子は、その位置で相同(類似)であると言うことができる。相同性類似性、又は同一性のパーセンテージとしての表現は、比較される配列が共有する位置での同一又は類似のアミノ酸の数の関数を指す。相同性、類似性、又は同一性のパーセンテージという表現は、比較される配列が共有する位置での同一又は類似のアミノ酸の数の関数を指す。FASTA、BLAST、又はENTREZを含む様々なアラインメントアルゴリズム及び/又はプログラムを使用することができる。FASTA及びBLASTは、GC配列分析パッケージウィスコシン大学、マディソン、ウィスコンシン州)の一部として利用可能であり、例えばデフォルトの設定で使用することができる。ENTREZは、米国立生物工学情報センター、米国国立医薬図書館、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州を介して利用可能である。一実施形態では、2つの配列の同一性パーセントは、例えば、各アミノ酸ギャップがこのギャップが2つの配列の間の単一のアミノ酸又はヌクレオチドミスマッチであるかのように重み付けされるものであるギャップウェイト1を用いて、GCGプログラムによって決定することができる。

0020

[0029]ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドは、任意の量の検出可能なプロトン転移活性を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書において記載される方法において使用するためのオトペトリンポリペプチドは、天然であるか、トランケートされるか、突然変異しているか、又は遺伝子改変されるが、任意の量の検出可能なプロトン転移活性を保持する。一部の実施形態では、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドは、野生型オトペトリンポリペプチドのペプチド配列のプロトン転移活性の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又はそれ以上を保持する。一部の実施形態では、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドは、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、又は9のうちのいずれか1つのオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又はそれ以上を保持する。

0021

[0030]ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドの機能的部分を含む。オトペトリンポリペプチドの機能的部分は、膜に組み込まれた場合に、本明細書において記載される方法によって測定するとプロトン転移活性を示す、オトペトリンポリペプチドの任意の部分である。オトペトリンポリペプチドの機能的部分は、当技術分野において公知の適切な組換え方法を使用して作製する及び/又は発現させることができ、本明細書において記載される方法によってプロトン転移活性を試験することができる。したがって、当業者であれば、本明細書において記載される方法を使用して、オトペトリンポリペプチドの機能的部分を容易に同定することができる。オトペトリンポリペプチドの機能的部分は、ある特定の実施形態では、野生型オトペトリンポリペプチド(例えば、配列番号1〜9のうちのいずれか1つのオトペトリンポリペプチド)のプロトン転移活性の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は100%を保持する。

0022

[0031]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分は、共有結合によって又は他の様式で、別のポリペプチド、核酸、糖質脂肪酸、又は検出可能な試薬に連結している。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分は、別のポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分は、プロトン転移活性を保持したまま、別のポリペプチド又はその部分に共有結合し得る。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、別の膜貫通タンパク質又はその部分に連結している。

0023

[0032]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、区別可能識別子に連結している(共有結合によって又は非共有結合によって)。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、1つ又は複数の区別可能な識別子を含む。任意の適切な区別可能な識別子は、オトペトリンポリペプチドに連結又は共役していてもよい。一部の実施形態では、区別可能な識別子は、検出可能な標識である。区別可能な識別子の非限定的な例としては、金属標識、蛍光標識蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP))、pH感受性のタンパク質若しくはpH感受性のGFP(例えば、pHluorin若しくはそれに類するもの)、任意の適切なフルオロフォア(例えば、mCherry)、発色団化学発光標識電気化学発光標識(例えば、オリゲン(Origen)(商標))、燐光標識クエンチャー(例えば、フルオロフォアクエンチャー)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の対(例えば、ドナー及びアクセプター)、タンパク質(例えば酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼβ−ガラクトシダーゼルシフェラーゼアルカリホスファターゼ、若しくはそれに類するもの))、抗原若しくはその部分、リンカー結合対メンバー)、酵素基質、低分子(例えば、ビオチンアビジン)、質量タグ量子ドットナノ粒子、それに類するもの、又はその組み合わせが含まれる。任意の適切なフルオロフォア又は光放出材料を、区別可能な識別子として使用することができる。光放出する区別可能な識別子は、例えば、フローサイトメトリーゲル電気泳動、タンパク質−チップ分析(例えば、任意のチップ方法論)、マイクロアレイ質量分析細胞蛍光分析、蛍光顕微鏡法共焦点レーザー走査型顕微鏡レーザースキャンサイトメトリー、それに類するもの、及びその組み合わせなどの様々な適切な技術によって、検出及び/又は定量することができる。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、GFPに融合している。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、pHluorinに融合している。

0024

[0033]ある特定の実施形態では、区別可能な識別子は、オトペトリンポリペプチドと間接的に会合している(例えば結合している)。一部の実施形態では、区別可能な識別子は、オトペトリンポリペプチドと可逆的に会合している。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドと可逆的に会合している区別可能な識別子は、適切な方法を使用して(例えば、塩濃度の増大、変性洗浄、適切な溶媒及び/若しくは塩の添加、適切な競合物質の添加、並びに/又は加熱によって)、オトペトリンポリペプチドから除去することができる。

0025

プロトン転移活性
[0034]本明細書において記載するように(例えば、実施例を参照されたい)、オトペトリンポリペプチドは、脂質二重層に組み込まれた場合に脂質二重層の一方の側から他方の側へのプロトンの転移を選択的に可能にするイオンチャネル又は孔を形成する、複数回貫通型の膜貫通タンパク質である。したがって、表現「プロトン転移活性」は、プロトンが、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分によって形成されたイオンチャネル又は孔を通って、脂質二重層の一方の側から脂質二重層の他方の側に転移することを指す。プロトン転移活性は、能動的又は受動的なプロセスであり得る。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドによるプロトン転移活性は、受動的プロセスである。膜に組み込まれたオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性は、適切なインビトロ又はインビボ方法を使用してアッセイ又は測定することができる。オトペトリンポリペプチドによって形成されたチャネル又は孔にわたる又は通るプロトンの転移は、直接的に(例えば、細胞内pH、電流、抵抗、若しくは電圧電位の変化(例えば、増大若しくは減少)を直接的に測定若しくは検出することによって)、又は間接的に(例えば、細胞内カルシウム若しくは亜鉛の変化(例えば、増大若しくは減少)を測定若しくは検出することによって(例えばイメージング、例えばカルシウムイメージングによって))、オトペトリン介在性の細胞シグナル伝達若しくは他のオトペトリン介在性の事象を検出することによって、又はpH感受性の指標から放出された光を測定若しくは検出することによって(例えば、イメージングによって)、判定、測定、検出、又はアッセイすることができる。pH感受性の指標の非限定的な例としては、pH感受性のフルオロフォア、pH感受性の染料、pH感受性のタンパク質、それに類するもの、及びその組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、pH感受性の指標は、pHluorinを含む。一部の実施形態では、pH感受性の指標は、pHrodoレッドを含む。pH感受性の指標であるpHrodoレッドは、中性pHで弱く蛍光性であるが、pHが減少するにつれて蛍光性を増していく。この試薬は、細胞の細胞質性のpHを定量するために使用することができる。任意の適切なpH指標を、pHの変化(細胞内又は細胞外の)を検出するために、本明細書において記載される方法に使用することができ、任意の適切なpH指標の非限定的な例は、Invitrogen’s Molecular Probes Handbook、A Guide to fluorescent probes and labeling technologies(2010)第11版、第20章に列挙される。

0026

[0035]一部の実施形態では、プロトン転移活性は、電圧クランプ(例えば、アフリカツメガエル卵母細胞に対する2電極の電圧クランプ、若しくはトランスフェクトされたHEK−293細胞に対するパッチクランプ)を行うこと、又は細胞内pHの指標をイメージングすることを含む方法によって、判定、測定、検出、又はアッセイされる。例えば、ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドタンパク質、その機能的部分、又はそのホモログをコードする核酸が、クセノプス属卵母細胞に注入されて、卵母細胞膜でのオトペトリンポリペプチドの発現及び組み込みに介在するようになる。プロトン転移活性を次いで、電流を測定することによって、又は膜の極性化の変化(例えば、膜電位の変化)を測定することによって、評価することができる。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、pHluorinなどのpH指標の使用によって細胞内pHの変化を測定することによって判定される。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞内Ca2+レベルの変化を測定することによって判定される。例えば、カルシウム流量は、Ca2+の取り込みを評価することによって、又はFura−2などの蛍光色素を使用することによって、測定することができる。典型的な顕微蛍光測定アッセイでは、単一のCa2+イオンを結合すると蛍光が変化するFura−2などの染料が、Otop発現細胞の細胞質基質にロードされる。試験化合物に曝露された際の細胞質性のカルシウムの増大は、カルシウムが結合すると生じるFura−2の蛍光の変化に反映される。他の適切な蛍光カルシウム指標もまた、本明細書において開示される方法に使用することができる。

0027

[0036]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性は、機能的、化学的、及び物理的影響を判定するための様々なインビトロアッセイ及びインビボアッセイを使用して、例えば、他の分子(例えば、ペプチドや、ペプチド、有機低分子、及び脂質を含むシグナル伝達分子)へのオトペトリンの結合を測定すること、並びに/又は、オトペトリン依存性のプロトン転移の結果生じる細胞内pHの変化に応答したタンパク質発現(例えば、転写レベル、タンパク質レベルなど)の増大若しくは減少を測定することで、間接的に評価される。一部の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞の成長又は生存能力の各々でオトペトリン依存性のプロトン転移が介在する場合には、細胞の成長又は生存能力の変化を評価することによって判定される。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞内の第2のメッセンジャー(例えば、IP3、cGMP、又はcAMP)の量又は修飾(例えばリン酸化)がオトペトリン依存性のプロトン転移によって調節又は誘発される場合には、このような量の変化を検出すること、又は修飾を検出することによって、間接的に判定又は測定される。

0028

[0037]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分のプロトン転移活性は、電流、抵抗、又は脂質二重層にわたる電圧電位の変化を測定又は検出することによって判定される。脂質二重層は、細胞の脂質二重層であっても、合成であってもよい。一部の実施形態では、プロトン転移活性は、脂質二重層の一方の側でのpH(すなわち、プロトン濃度)の変化に応答して判定される。一部の実施形態では、プロトン転移活性は、脂質二重層の一方の側でのpH(すなわち、プロトン濃度)の変化によって誘発される。pHの変化は、膜の一方の側の流体にプロトン(例えば酸)を添加することによって生じさせることができる。pHの変化は、pHの増大又は減少であり得る。一部の実施形態では、pHの変化は、少なくとも0.01、少なくとも0.05、少なくとも0.1、少なくとも0.5、又は少なくとも1.0pH単位の変化である。一部の実施形態では、pHの変化は、少なくとも0.5pH単位の変化である。pHの変化は、膜のいずれかの側で生じさせることができる。ある特定の実施形態では、プロトンは、膜の細胞外の側に添加され、それによって、細胞外のpHの変化が生じる。プロトン転移活性を判定する、アッセイする、又は測定するために使用され得る方法の非限定的な例としては、任意の適切なバージョンのパッチクランプ技術(例えば、セルアタッチパッチインサイドアウトパッチ、ホールセル記録、アウトサイド−アウトパッチ、穿孔パッチ、ルーズパッチ、2電極の電圧クランプ、及び哺乳動物細胞のパッチクランプ(例えば、トランスフェクトされたHEK−293細胞を使用する))、染料(例えば、DFFDACECF、pHrodoレッド、若しくはFura 2−AM(Sigma Aldrich、カタログ番号108964−32−5))での又は例えばpHluorinとのコトランスフェクションによる哺乳動物細胞のpHイメージング、並びにイメージング(例えば、カルシウムイメージング)、それに類するもの、並びにその組み合わせが含まれる。プロトン転移活性を判定する、アッセイする、又は測定するために使用され得る方法のさらなる非限定的な例は、Tsien RY、Biochemistry(1980)19(11):2396〜404;Rink TJ、Tsien RY、Pozzan T.、(1982)J.Cell Biol.95(1):189〜96;Grynkiewicz G、Poenie M、Tsien RY.(1985)J Biol Chem.260(6):3440〜5;Tsien RY、(1989)MethodsCell Biol.30:127〜56;Cohen−Armon M、Sokolovsky M、Dascal N.、(1989)Brain Res.496(1〜2):197〜203;LimanER、Tytgat J、Hess P.、(1992)Neuron.9(5):861〜71;Shimbo K、Brassard DL、Lamb RA、PintoLH.、(1996)Biophys J.70(3):1335〜46;及びChang RB、Waters H、Liman ER.、(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)107(51):22320〜5で見ることができる。先の参考文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

0029

[0038]ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、膜に組み込まれたオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む細胞又は卵母細胞で電圧クランプ技術を使用して判定される。一部の実施形態では、オトペトリン依存性のプロトン転移活性の存在は、少なくとも1pH単位のpHの変化に応答した、少なくとも50pA、少なくとも100pA、少なくとも500pA、少なくとも1000pA、少なくとも50nA、少なくとも100nA、少なくとも500nA、少なくとも0.1μA、少なくとも0.2μA、少なくとも0.5μA、少なくとも1.0μA、又は少なくとも2μAの電流の純変化として判定される。

0030

[0039]一部の実施形態では、プロトン転移活性は、蛍光−イメージングプレートリーダーFLIPR)を使用して判定される。FLIPRは、蛍光の読み出し捕捉するためにプレート全体の電荷結合素子イメージングを利用する、ファーストインクラスの機器であった(Schroeder及びNeagle(1996)J.Biomol.Screen.1:75〜80頁;また、Chemistry & Biology(2014)21(9):1162〜1170も参照されたい)。ある特定の実施形態では、システムは、FLIPRを含む。一部の実施形態では、システムは、FLIPRを含むハイスループットシステムである。

0031

[0040]一部の実施形態では、電流の変化は、直接的に決定、測定、又は検出される。一部の実施形態では、電流の変化は、適切な数学アルゴリズムを使用して容易に変換されるパラメータである抵抗又は電圧電位の対応する変化を測定又は検出することによって、判定、測定、又は検出される。一部の実施形態では、オトペトリン依存性のプロトン転移活性の調節は、オトペトリン依存性のプロトン転移活性における少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、又は少なくとも10倍の純変化(例えば、プロトン転移活性の増大又は減少)である。純変化は、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリン介在性のプロトン転移活性を、試験化合物の存在下で判定されたオトペトリン介在性のプロトン転移活性と比較することによって判定することができる。一部の実施形態では、試験化合物の非存在下で判定されるオトペトリン介在性のプロトン転移活性の量は、参照レベル又は対照と呼ばれる。例えば、プロトン転移活性の減少は、一部の実施形態では、試験化合物の存在下でのオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の量を、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性(例えば、参照レベル)と比較することによって判定される。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性の増大は、試験化合物の存在下でのオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の量を、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性(例えば、参照レベル)と比較することによって判定される。

0032

[0041]用語「減少する」又は「低減した」、及びその文法上の変型は、本明細書において使用する場合、参照レベル又は対照と比較して少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、又は少なくとも10倍の減少を意味する。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の減少を誘発する試験化合物は、本明細書において記載される方法によって、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質であると同定される。オトペトリンポリペプチドのオトペトリン介在性のプロトン転移活性を減少又は低減させる試験化合物又は調節物質は、本明細書において、アンタゴニスト(例えば、オトペトリンポリペプチドのアンタゴニスト、オトペトリン介在性のプロトン転移活性のアンタゴニスト)と呼ばれる。

0033

[0042]用語「増大する」又は「増強させる」、及びその文法上の変型は、本明細書において使用する場合、参照レベル又は対照と比較して少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、又は少なくとも10倍の増大を意味する。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の増大を誘発する試験化合物は、本明細書において記載される方法によって、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質であると同定される。オトペトリンポリペプチドのオトペトリン介在性のプロトン転移活性を増大又は増強させる試験化合物又は調節物質は、本明細書において、アゴニスト(例えば、オトペトリンポリペプチドのアゴニスト、オトペトリン介在性のプロトン転移活性のアゴニスト)と呼ばれる。

0034

[0043]一部の実施形態では、オトペトリンを結合した化合物は、オトペトリンの機能に関連する生物学的活性、例えば、オトペトリンを発現する宿主細胞内の細胞内プロトンレベル(例えば、プロトン、カルシウム、亜鉛)に対する影響、pHによって活性化される伝導性細胞死(すなわち、例えば形態学的アッセイ、化学的アッセイ、若しくは免疫学的アッセイを使用してモニタリングされ得る、受容体介在性の細胞死)、オトペトリン発現細胞の脱分極(例えば、蛍光電圧感受性の染料の使用)、ラジオイムノアッセイ若しくはELISAによって検出され得る第2のメッセンジャーの生産、カルシウムによって誘発されるレポーター遺伝子の発現、又はオトペトリン活性若しくはオトペトリン活性の阻害に関連する他の容易にアッセイ可能な生物学的活性をモニタリングする機能的アッセイにおいて、アゴニスト作用又はアンタゴニスト作用についてスクリーニングされる。ある特定の実施形態では、機能的アッセイは、複数の試料ハイスループットスクリーニングを同時に使用してアッセイされ得るオトペトリンの生物学的活性の検出に基づき、例えば、機能的アッセイは、オトペトリン活性の変化に関連する蛍光の変化の検出に基づく。このような機能的アッセイは、候補作用物質をオトペトリンのアゴニスト又はアンタゴニストのいずれかとしての活性についてスクリーニングするために使用することができる。

0035

[0044]一部の実施形態では、オトペトリン発現細胞(例えば、組換えオトペトリン発現細胞)は、蛍光標識されたpH指標(例えば、pHrodレッド)を事前にロードされる。オトペトリン発現細胞は次いで、オトペトリンを結合した候補化合物に曝露され、化合物への曝露の影響がモニタリングされる。オトペトリンアゴニスト活性を有する候補化合物は、オトペトリン発現細胞と接触した場合に、対照細胞(例えば、候補化合物の非存在下でのオトペトリン発現細胞、オトペトリンをコードする核酸を有さない宿主細胞)よりも、細胞内pH又は細胞内カルシウムのオトペトリン介在性の変化を引き起こすものであることが多い。同様に、機能的オトペトリンアッセイを使用して、オトペトリンの活性を遮断する(例えば、細胞外pHの変化によって誘発される細胞内pHの変化を遮断する)候補化合物を同定することができる。

0036

[0045]一部の実施形態では、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法は、ハイスループットスクリーニングプロセスを含む。ハイスループットスクリーニング(HTS)は、数千から数百万の試験化合物を比較的短い時間でスクリーニングするために、ロボット工学、データの処理及び制御ソフトウェアリキッドハンドリング装置、及び受動型検出機を使用する、科学的発見のための方法である。任意の適切なハイスループットスクリーニングプロセスを、本明細書において記載される方法に使用することができ、任意の適切なハイスループットスクリーニングプロセスの非限定的な例は、米国特許第5,976,813号、米国特許第6,472,144号、米国特許第6,692,856号、米国特許第6,824,982号、及び米国特許第7,091,048号において記載されており、これらの特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

0037

[0046]一部の実施形態では、プロトン転移活性の差が判定される。プロトン転移活性の差は、試験化合物の非存在下で判定された第1のプロトン転移活性と、試験化合物の存在下で判定された第2のプロトン転移活性とを比較することによって判定することができる。ある特定の実施形態では、試験化合物をオトペトリンプロトン転移活性の調節物質として同定することは、少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、又は少なくとも10倍のプロトン転移活性の差を判定することを含む。

0038

試験化合物
[0047]任意の適切な試験化合物を、本明細書において記載される方法によって試験することができる。一部の実施形態では、試験化合物は、試験される濃度で、水性培地(例えば細胞培養培地)に溶解可能である。一部の実施形態では、試験化合物は、試験される濃度で、水性培地に完全に溶解可能である。一部の実施形態では、試験化合物は、試験される濃度で、水性培地に部分的に溶解可能である。ある特定の実施形態では、試験化合物は、試験される濃度で、哺乳動物細胞に対して無毒である。例えば、ある特定の実施形態では、試験化合物は、試験される濃度で、(i)成長を阻害しない、(ii)生存能力を低減させない、(iii)ネクローシス若しくはアポトーシスを誘発しない、(iv)DNA若しくはRNAの損傷を誘発しない、(V)細胞膜を損傷しない、又は(vi)細胞タンパク質のタンパク質分解性の切断を誘発しない。一部の実施形態では、試験化合物は、発がん性物質でも補発がん性物質でもない。一部の実施形態では、試験化合物は、催奇性物質ではない。

0039

[0048]本明細書において使用する場合、表現「試験化合物」は、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性を特異的に調節する能力についてスクリーニングされ得る、任意の適切な化合物を指す。試験化合物の非限定的な例としては、低分子化合物(例えば、低分子の有機分子又は無機分子)、高分子化合物(例えば、5000Daを超える)、多糖、糖質、糖類、脂肪酸、脂質、生物学的高分子(例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びペプチド誘導体ペプチド模倣体、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体)、天然化合物又は合成化合物結合剤(例えば、非天然結合剤及び合成結合剤(例えば、TandAb、ナノボディアプタマー、BiTE、SMIP、DARPin、DNLアフィボディデュカリンアドネクチンフィノマー(fynomer)、KunitzドメインAlbu−dab、DART、DVD−IG、Covx−ボディ、ペプチボディ、scFv−IgSVD−Ig、dAb−Ig、ノブ・イン・ホール、triomAb、及びそれに類するものを含む、抗体又はその結合断片)、その誘導体、そのポリマー、その塩、その異性体、その多形、並びにその組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、試験化合物は、細菌の、植物の、真菌の、動物細胞の、又は動物組織抽出物などの生物学的材料から作られた抽出物に含有される。一部の実施形態では、試験化合物は、生体液に含有される。したがって、一部の実施形態では、試験化合物は、抽出物又は生体液を含む。低分子化合物としては、約40ダルトン(Da)よりも大きいが5000Daよりも小さい、3000Daよりも小さい、又は1000Daよりも小さい分子量を有する分子が含まれ得る。低分子化合物は、任意の適切な化学的部分又は基を含み得、任意の適切な化学的部分又は基の非限定的な例としては、アルカンアルケンアルキンアルコールハロゲンケトンアルデヒドカルボン酸エーテルエステルアミンアミド飽和した、部分的に飽和した、又は不飽和の環状構造、ヌクレオチド、ヌクレオシド多原子非金属(例えば、P、S、Se)、遷移金属ポスト遷移金属半金属、それに類するもの、その塩、及びその組み合わせが含まれる。

0040

[0049]ある特定の実施形態では、試験化合物としては、適切なライブラリーの合成の又は天然の化合物が含まれる。多数の低分子ライブラリーが当技術分野において知られており、その一部は市販されている。市販されている化合物ライブラリーは、例えば、ArQule、Pharmacopia、graffinity、Panvera、Vitas−M Lab、Biomol International、及びOxfordから入手することができる。低分子の、ポリマー性の、及びゲノムに基づくライブラリーを開発するための方法は、例えば、Dingら、J Am.Chem.Soc.124:1594〜1596(2002)、及びLynnら、J.Am.Chem.Soc.123:8155〜8156(2001)において記載される。例えばNIH Roadmap、Molecular Libraries Screening Centers Network(MLSCN)の化学化合物ライブラリーもまた使用することができる。あらゆる適切な方法を、低分子化合物ライブラリーを作製するために使用することができる。化合物ライブラリーを、適切なHTSスクリーニング方法及び/又は本明細書において記載される方法を使用してスクリーニングして、オトペトリン介在性のプロトン転移活性を調節する試験化合物をライブラリー内で同定することができる。

0041

[0050]ある特定の実施形態では、試験化合物は、40〜500,000Da、40〜200,000Da、40〜100,000Da、40〜50,000Da、40〜25,000Da、40〜10,000Da、40〜5000Da、又は40〜1000Daの分子量を含む。ある特定の実施形態では、試験化合物は、5000〜500,000Da、10,000〜500,000Da、25FF0C000〜500,000Da、又は5000〜100,000Daの分子量を含む。

0042

[0051]試験化合物は、任意の適切な濃度で試験することができる。一部の実施形態では、試験化合物は、少なくとも1pM、少なくとも10pM、少なくとも100pM、少なくとも1nM、少なくとも10nM、少なくとも100nM、少なくとも1μM、少なくとも10μM、少なくとも100μM、又は少なくとも1mMの濃度で試験される。一部の実施形態では、試験化合物は、1pM〜100mM、1pM〜10mM、1pM〜1mM、10pM〜100mM、10pM〜10mM、10pM〜1mM、100pM〜100mM、100pM〜10mM、又は100pM〜1mMの範囲の濃度で試験される。一部の実施形態では、試験化合物は、100mMより小さい、10mMより小さい、1mMより小さい、又は100nMより小さい濃度で試験される。一部の実施形態では、試験化合物は、1つ又は複数の異なる濃度で試験又はアッセイされる。

0043

[0052]ある特定の実施形態では、試験化合物は、求電子剤を含むか又はそれからなる。求電子剤は、オトペトリンポリペプチドと共有結合を形成し得る化合物である。ある特定の実施形態では、試験化合物は、酵素(例えばプロテアーゼ)を含む。

0044

細胞及び膜
[0053]ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分は、細胞膜又は合成膜と共役している。表現「細胞膜又は合成膜と共役している」は、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が膜に組み込まれ、それによって、プロトン転移活性を含む機能的なプロトンチャネルを形成することを意味する。

0045

[0054]オトペトリンポリペプチドは、適切な方法を使用して脂質二重層に組み込むことができる。オトペトリンポリペプチドは、適切な細胞の脂質二重層に組み込むことができ、適切な細胞の非限定的な例としては、動物細胞、植物細胞、原生生物細胞、淡水水生動物又は海洋動物の細胞、節足動物細胞、真菌細胞細菌細胞、環形動物細胞、棘皮動物細胞、脊索動物細胞、軟体動物細胞、及びそれに類するものが含まれる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、又はヒト細胞の脂質二重層に組み込まれる。ある特定の実施形態では、細胞は、一次細胞又は不死化細胞(例えば、組織培養細胞株)であり、一次細胞又は不死化細胞の非限定的な例としては、HeLa、HEK293、DU145、H295R、HT29、KBM−7、MCF−7、MDA−MB−468、PC3、THP−1、PC12、A549、CHO、COS、Caco−2、EL4、HEP G2、HL−60、それに類するもの、及びその誘導体が含まれる。一部の実施形態では、細胞は、味覚受容体細胞(例えば、酸味細胞)である。ある特定の実施形態では、細胞は、卵細胞(例えば卵母細胞、例えばクセノプス属卵母細胞)である。ある特定の実施形態では、細胞は、赤血球又はその誘導体である。ある特定の実施形態では、細胞は、ゴースト細胞又は無核細胞である。オトペトリンポリペプチドは、あらゆる適切な方法を使用して、細胞の脂質二重層に組み込むことができる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、オトペトリンポリペプチドの発現を指示する細胞に核酸を導入することによって、細胞の脂質二重層に組み込まれる。したがって、一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を細胞で発現させることを含む。したがって、一部の実施形態では、細胞は、トランスフェクトされた細胞、例えば、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分の発現を指示する核酸でトランスフェクトされた細胞である。一部の実施形態では、細胞は、形質導入された細胞、例えば、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分の発現を指示する核酸を含む組換えウイルスを形質導入された細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞の細胞膜に組み込まれたオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、異種オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む。表現「異種オトペトリンポリペプチド」は、オトペトリンポリペプチドが、オトペリンペプチドが発現する細胞とは異なる種に由来することを示す。ある特定の実施形態では、細胞は、異種オトペトリンポリペプチドを含むクセノプス属卵母細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、異種オトペトリンポリペプチドを含む味覚受容体細胞である。

0046

[0055]ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、本明細書において記載される方法において使用するための、適切なリポソームミセルナノディスク二重層シート、又はバイセルに組み込まれる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、本明細書において記載される方法において使用するための、適切な合成膜に組み込まれる。一部の実施形態では、オトペトリンは、本明細書において記載される方法において使用するための、適切なナノポア装置の開口部内に形成された適切な合成膜に組み込まれる。

0047

[0056]ある特定の実施形態では、ナノポア装置は、合成膜を含む開口部によって分離した、流体で満たされた第1のチャンバー及び流体で満たされた第2のチャンバーを含み、ここで、膜は、1つ又は複数のオトペトリンポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、流体で満たされた第1のチャンバーは第1の電極を含み、流体で満たされた第2のチャンバーは第2の電極を含み、ここで、第1の電極及び第2の電極は、少なくとも電圧電位、電流、及び/又は抵抗を測定又は検出するための手段に機能可能に連結される。ある特定の実施形態では、電圧電位、電流、及び/又は抵抗を測定又は検出するための手段は、電流計電圧計電気抵抗器オシロスコープ、それに類するもの、又はその組み合わせを含む装置である。ある特定の実施形態では、第1及び又は第2のチャンバーは、光放出分子プローブを検出するための1つ又は複数のフォトセルを含む。

0048

[0057]ある特定の実施形態では、本明細書において、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性を判定するためのシステムが提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の調節物質(すなわち、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質)を同定するためのシステムが提供される。ある特定の実施形態では、システムは、膜に組み込まれた1つ又は複数のオトペトリンポリペプチド、流体で満たされた第1のチャンバー、及び流体で満たされた第2のチャンバーを含み、ここで、流体で満たされた第1のチャンバー及び流体で満たされた第2のチャンバーは、膜の反対側に位置する。ある特定の実施形態では、開口部は膜を含む。例えば、一部の実施形態では、システムは開口部を含み、膜は開口部内に収納される。一部の実施形態では、膜は合成膜である。一部の実施形態では、システムはナノポア装置を含む。

0049

実施例1−Otop1は固有の生物物理学的特性を有するプロトン選択性イオンチャネルを形成する
[0058]Otop1の機能的特性特徴付けするために、本発明者らはpHoを変化させ、Otop1を発現するクセノプス属卵母細胞で誘起された電流を測定した。別段の記載がない限り、これらの及び全ての他の実験は、細胞外溶液中のNa+に代えて、イオンチャネルを一般に透過しない大きな陽イオンであるNMDG+で行った。クセノプス属卵母細胞におけるOtop1の電流は、pHoがpH6〜4の範囲で低減するにつれて、規模が単調増加し(図1a〜c)、電流の逆転電位(Erev)は、よりプラスの電圧の方にシフトした。これらの実験において、内因性電流及びリーク電流は差し引かれなかったため、Otop1の電流がネルンストの挙動からはずれることに留意されたい3、5。

0050

[0059]Otop1が細胞の状況に関係なくイオンチャネルの孔形成サブユニットを生成し得るかどうかを判定するために、本発明者らは、Otop1をHEK−293細胞で発現させた(図1d〜f)。N末端でYFPをタグ付けされたチャネルは、細胞表面での発現を裏付けた(図1g)。Otop1でトランスフェクトされた細胞では、pHoの低減に応答して大きな内向き電流が引き起こされ(トランスフェクトしていない細胞で14±4pAであるのに対し、pHo=5.0でI=1130±192pA)、電流の規模は、卵母細胞においてそうであったように、pHoで単調増加した(図1f)。HEK−293細胞におけるOtop1の電流は数秒以内に減衰し、より酸性の刺激に応答して、より速い動態が観察された(図1c)。電流の減衰は、プロトンの移動又はチャネルのゲーティングのための推進力に影響し得る、チャネルのそばでのプロトンの蓄積(又は枯渇)に起因し得る3、5。例えば、最大20mM3ごとのH+の総(結合型+遊離)細胞内濃度を増大させるために、例えば本発明者らが観察するところでは、10μmの直径(524fLの容積)の細胞において1秒間で1000pAのH+電流が流れるように計算することができる。さらに、過剰なH+の除去は、かさの大きいpH緩衝液に結合しているH+の拡散が遅いため、60〜90秒を要し得る3。実際、本発明者らが、膜透過性染料であるpHrodoレッドを使用して細胞内pHをイメージングしたところ、本発明者らは、Otop1でトランスフェクトされた細胞において、pHoが7.4〜5.0まで低減するとpHiが大きく変化することを観察し、この応答は、偽トランスフェクトされた細胞では観察されなかった(図1h)。

0051

[0060]本発明者らは、Otop1の詳細な生物物理学的特徴付けを行って、Otop1がプロトン選択性であるかどうかを判定した。まず、本発明者らは、イオン条件を変えながら、低減するpHに対する応答を測定することによって、Otop1が他の陽イオンに対して透過性であるかどうかを判定した。細胞外溶液中のNMDG+をNa+で置き換えると(図2a)、pH5.5に応答して引き起こされる電流の振幅は変化せず(両側t検定によってp>0.05)、このことは、チャネルがNa+に対して測定可能な程度に透過性ではないことを示す。同様に、NMDG+をCs+、Li+、又はCa2+で置換すると、電流規模の3%未満の増大が生じ、このことは、Otop1がまた、これらの一価及び二価の陽イオンに対して認められる程度に透過性ではないことを示す(図2a)。

0052

[0061]Na+及びCl−に対するH+の相対的透過性を判定するために、本発明者らは、140のNa+で140のNMDGを置き換えた条件下、及びNa+の存在下又は非存在下のいずれかで[Cl−]が増大した条件下で、Erevを測定した。どのケースにおいても、本発明者らは、Erevの変化を全く観察しなかった(図2d、e)。ゴールドマンホジキン・カッツ(GHK)の方程式を使用して30、本発明者らは、5mVの変化が、これは容易に検出可能であったであろうが、Na+の>2×105倍の、H+に対する選択性、及びCl−の>1×105倍の、H+に対する選択性に繋がることを計算する。本発明者らはErevの変化を観察しなかったため、Hv1のように、チャネルがCl−及びNa+よりもH+に対して完全に選択性である可能性がある3。

0053

[0062]遷移金属であるZn2+は、ゲーティングを調節する2つの外部ヒスチジン残基に結合する、Hv1の強力な阻害剤である7、31、32。Zn2+はまた、味細胞におけるプロトンチャネルを含む20、プロトン輸送に関与する他の分子を阻害する3。Otop1によるイオン透過に関与する構造要素への見通しを得るために、本発明者らは、Zn2+による阻害に対するOtop1の感度を測定した。pH5.5に応答して誘起された、HEK−293細胞におけるOtop1の電流は、用量依存性の様式でZn2+によって阻害され、IC50は0.19mM±0.01であった(図2f、g)。1に近いHill係数(0.89±0.06)は、単一のZn2+イオンがチャネルに結合して阻害することを示す。

0054

[0063]Otop1を試験して、Otop1が電圧依存性であり得るかどうかを判定した。−80〜+40mVの間の電圧ステップ(0mVの保持電位から)に対する、pH5.5の溶液によって誘起されたOtop1の電流の応答を測定した。電流は、振幅の時間依存性の変化についてほとんど証拠を示さず、このことは、Otop1のゲーティングが、生理学的に関連する電圧の範囲にわたり、認められる程度に電圧依存性ではないことを示す(図5)。

0055

[0064]これらのデータを総合すると、Otop1が、固有の構造的及び生物物理学的特性を有するプロトン選択性のイオンチャネルをコードすることが立証される。
実施例2−オトペトリンは、進化的に保存されたプロトンチャネルファミリーを構成する
[0065]オトペトリンは、線虫からヒトまで、進化的に保存されている28、33(図3a)。このファミリーが一般にプロトンチャネルとして機能するかどうかを判定するために、本発明者らは、関連が最も遠いメンバーの一部を試験した。

0056

[0066]Otop1は、2つのマウスホモログであるmOtop2及びmOtop3を有し28(図3a)、これらは、Otop1と30%〜34%のアミノ酸同一性を有する(図3b)。クセノプス属卵母細胞で発現すると、Otop2及びOtop3の両方が、NMDGベースの溶液中で、pHoが低減すると、大きな電流を生じさせた(図3c)。Otop3は、H+についての高い選択性の証拠を示し、Otop3の電流の規模は、試験したpH範囲の全体にわたってpHoの関数として線形的に増大し(pH4〜6、図3c、d)、Erevは、46.3mV/log[H+]にシフトした(図6a)。逆に、Otop2の電流は変則的な挙動を示した。Otop2の電流は約pH5で飽和し(図3c、d)、Erevは、pH4〜6の範囲にわたりほとんどシフトしなかった(図6a)。Otop2のこれらの予想外の特徴は、HEK−293細胞において測定されたOtop2の電流が非常に類似の特性を示したことから、チャネルタンパク質に固有である(図7)。Otop2の電流及びOtop3の電流の両方は、Otop1のように、電圧依存性の証拠をほとんど示さなかった(図6b)。HEK−293細胞で発現し、顕微蛍光測定法で測定されると、Otop2及びOtop3の両方は、低減するpHoに応答して、プロトンを細胞の細胞質基質内に伝導する(図6c、d)。興味深いことに、Otop3でトランスフェクトされた細胞におけるpHiは、中性pHoに戻った後に回復することができず、その一方で、Otop2は、Otop1と比較して速い回復を示し、このことは、チャネルによるH+の伝導の差を指摘している。したがって、Otop2及びOtop3は異なる特性を有するが、両者ともプロトンを透過させる。

0057

[0067]ショウジョウバエ属ゲノムにはmOtop1に関連する3つの遺伝子が存在する。これらの遺伝子は、予測されるタンパク質であるdmOTOPLa、dmOTOPLb、及びdmOTOPLcをコードし(図3a)、これらのタンパク質のいずれもこれまでに特徴付けされていない。1576アミノ酸からなるタンパク質であるdmOtopLcは、相同性領域にわたってOtop1と14.1%のアミノ酸同一性を、及びその膜貫通ドメインのいくつかにおいて>30%のアミノ酸同一性を示す(図3b)。クセノプス属卵母細胞で発現すると、dmOTOPLcは、低減する細胞外pHに応答して大きな電流を生じさせた(図3e)。Otop1及びOtop3と同様に、dmOTOPLcの電流はpHoが低減すると増大し、Erevはよりプラスの電圧の方にシフトし、これは、プロトン選択性の指標である(図3e、f)。興味深いことに、dmOTOPLcは、Otop1又はOtop3よりも、pH6で比較的大きな電流を伝導し、電流振幅とpHとの間の関連(図3f)は、より浅かった。このことは、チャネルに、より広いダイナミックレンジをもたらし得る。

0058

[0068]これらのデータを総合すると、オトペトリンファミリーの大きく分岐して進化的に遠位のメンバーが、機能的特性は異なるがプロトンを透過させる能力は共通なチャネルを形成することが示される。

0059

実施例3−オトペトリンチャネルを通る電流は、顕微蛍光測定法で測定され得る細胞内のpH及びカルシウムの変化を生じさせる。

0060

[0069]オトペトリンチャネルmOtop1、mOtop2、mOtop3、及びhOtop1を通るプロトンの流入が、細胞内pH感受性の指標染料で検出され得る細胞内pHの変化をもたらし得るかどうかを判定するために、本発明者らは、各チャネルをHEK−293細胞において一時的に発現させた。実際、本発明者らが、膜透過性のpH感受性染料であるpHrodoレッドを使用して、mOtop1でトランスフェクトされた細胞から細胞内pHをイメージングし、細胞外pHを7.4〜5.0に低減させると、本発明者らは、細胞内pHの大きな変化の指標である蛍光の大きな変化を観察した(図1h)。pHの指標であるpHrodoレッドを使用して、hOtop1でトランスフェクトされたHEK293細胞の細胞内pHの変化をモニタリングすると、pH5の溶液に応答して、類似の結果が観察された(図8c及び図8d)(平均+/−SEM)。両方のケースで、偽トランスフェクトされた細胞では類似の応答は観察されず(図1h)、このことは、細胞内pHの変化が、Otop1チャネルを通るプロトン移入の結果であることを示す。図7は、Otop2又はOtop3でトランスフェクトされ、pHrodoレッドをロードされたHEK293細胞が、細胞外pHの低減で蛍光の大きな変化を示したことを示し、このことは、両チャネルが、低減する細胞外pHに応答してプロトンを細胞の細胞質基質内に伝導することを示す(図6c、d)。興味深いことに、Otop3でトランスフェクトされた細胞の細胞内pHは、中性pHoに戻した後も回復することができず、その一方で、Otop2は、Otop1と比較して速い回復を示し、このことは、チャネルによるH+伝導の差を指摘している。

0061

[0070]本発明者らはまた、Otop1(図10A)、Otop2(図10B)、及びOtop3(図10C)を通るプロトン輸送を、遺伝的にコードされたpH指標でモニタリングし得るかどうかを試験した。このために、本発明者らは、チャネルの各々でコトランスフェクトされたか又は単独でトランスフェクトされた(対照として)、pHluorinを使用した。OtopチャネルでトランスフェクトされたHEK293細胞では、外部pHが低減した場合(Otop1、Otop2、及びOtop3)又は外部pHが増大した場合(Otop1及びOtop2)に、蛍光発光の大きな変化がpHluorinから検出された。これらの応答は、3つのOtopのうちの1つでトランスフェクトされた細胞でのみ観察され、トランスフェクトされていない細胞では観察されなかった。
実施例4−細胞外pHの変化に応答した、Otop1でトランスフェクトされたHEK−293細胞における細胞内カルシウムの上昇。

0062

本発明者らはまた、Otopチャネルを通るプロトンの移入が、顕微蛍光測定法によって検出され得る細胞内カルシウムの変化を生じさせ得るかどうかを試験した。トランスフェクトされた細胞に、カルシウムの指標であるFura 2 AMをロードし、7.4〜5.0までの細胞外pHの変化に曝露させた。図9(左側のパネル)は、Otop1でトランスフェクトされた細胞のみが細胞内カルシウムの上昇に応答した(n=8細胞)ことを示す。Otop1でトランスフェクトされた細胞と偽トランスフェクトされた細胞との間の差は、有意である(ステューデントt検定。***p<0.001)。対照として、本発明者らは、トランスフェクトされた細胞及びトランスフェクトされていない細胞の両方が、細胞膜に侵入し細胞内の酸性化を生じさせ、それによって、細胞内の緩衝液からカルシウムを遊離させることで細胞内カルシウムを上昇させる、pH5のHOAcに応答することを示した。

0063

実施例5−材料及び方法
動物
[0071]全ての実験手順は、カリフォルニア大学のIACUCによって承認された。eGFPの発現がTRPM5プロモーターによって駆動されたマウス22、23と、YFPがPkd2l1プロモーターによって駆動されたマウス(Pkd2l1−YFP)20とを交配して、GFP及びYFPの両方が陽性のマウスを生成した(Trpm5−GFP/Pkd2l1−YFP)。

0064

[0072]HEK−293細胞での発現のために、cDNAをイン−フュージョン(In−Fusion)(登録商標)HDクローニングキット(Clontech)でpcDNA3ベクター内にクローニングした。N末端でYFPをタグ付けされたmOtop1を、開始コドンを除去し、Otop1をpcDNA3の5’YFPにインフレームサブクローニングすることによって生成した。全ての配列をサンガーシーケンシング(Genewiz)によって検証した。インビトロでの転写を、T7 mMESSAGEmMACHINEキット(Thermo Fisher Scientific)で行った。mRNAをTURBO DNaseで処理し(37℃で15分間)、RNA Clean & Concentratorキット(Zymo)で精製し、ゲル電気泳動及びNanodrop(Thermo Scientific)で完全性及び濃度について確認した。

0065

クセノプス属卵母細胞の電気生理学
[0073]アフリカツメガエル卵母細胞は、Ecocyte Bioscienceによって提供された。mRNA(0.2〜20ng、50nL)を、Nanoject II Auto−Nanoliter Injector(Drummond)で卵母細胞に注入し、標準Barth溶液(SBS、Ecocyte Bioscience)中で、18℃で1〜3日間インキュベートし、その後、記録した。

0066

[0074]2電極の電圧クランプ(TEVC)を、以前に記載されるようにして行った42。ホウケイ酸ガラスピペットをP−97 Flaming/Brownタイプのマイクロピペットプラーで引き伸ばし、その抵抗は、0.5〜5MΩの範囲内であった。電流を、GeneClamp 500増幅器(Axon)で測定した。溶液の交換は、重力駆動型かん流によって行った。ほとんどの実験で、膜電位は−80mVで保持され、電圧ランプを1秒毎に−80mV〜+80mVまで(1V/s)適用した。卵母細胞を、Na+を含有しない細胞外溶液中で、100μMのDIDSと2〜3分間インキュベートして、Ca2+によって活性化されるCl−チャネルを阻害し43、44、その後、酸をアプライした。有意性をANOVAによって決定した。

0067

卵母細胞の電気生理学的溶液
[0075]クセノプス属卵母細胞を、HClで7.4にpH調整された、100のNaCl、2のKCl、1.8のCaCl2、2のMgCl2、10のHEPES(mM単位で)を含有するND96溶液中でインキュベートした。pHoの変化に応答した電流の変化を測定するために、10mMのHEPESでpH6.5〜7.4に、又は2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES、10mM)でpH4〜6に緩衝された、100のN−メチル−D−グルカミン(NMDG)、2のKCl、1.8のCaCl2、2のMgCl2を含有する、ナトリウムを有さない溶液を使用した。pHをHClで調整した。以下の化学物質を、図に示すように、ナトリウムを有さない溶液に添加した:100μMの4,4’−ジイソチオシアノ−2,2’−スチルベンジスルホン酸(DIDS)、0.03〜10のZnCl2、100μMのアマンタジン

0068

HEK−293細胞のトランスフェクション
[0076]Otop及びGFP(5:1)を、TransIT−LTトランスフェクション試薬(Mirus Bio Corporation、Madison、WI)を使用して、HEK−293細胞(CRL−1573、ATCC)にコトランスフェクトした。GFP陽性細胞でのパッチクランプの記録及びイメージング実験を、トランスフェクションの約24〜48時間後に室温で行った。

0069

パッチクランプの電気生理学
[0077]ホールセルパッチクランプ記録法を、以前に記載されるようにして行った49。簡潔に述べると、記録をAxopatch 200A増幅器又はAxopatch 200B増幅器で行い、pClamp 8.2を備えたDigidata 1322a 16ビットデータ収集システムデジタル化し、そしてClampfit 8.2(Molecular Devices、Palo Alto、CA)で分析した。記録を5kHzでサンプリングし、1kHzでフィルタリングした。2〜4MΩの抵抗を有するパッチピペットをホウケイ酸ガラスから作製し、ギガオームシールが達成された記録のみを分析で使用した。ほとんどの実験で、ホールセルの立体構造が達成された後、膜電位は−80mVで保持されたか、又は1秒当たり−80mV〜+80mVまで傾斜させた(1V/s)。Otop1のプロトン選択性を判定するための実験では、膜電位は、細胞を細胞外溶液に漬けるためにEHで保持され、1秒当たり−80mV〜+80mVまで傾斜させた(1V/s)。溶液は、微小潅流パイプ(Warner Instruments、Hamden、CT)の線形配列を使用して変化させた。

0070

パッチクランプの電気生理学溶液
[0078]タイロード溶液は、145mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl2、2mMのCaCl2、20mMのデキストロース、10mMのHEPES(NaOHでpH7.4)を含有していた。ピペット溶液は、120mMのCs−アスパルテート、15mMのCsCl、2mMのMg−ATP、5mMのEGTA、2.4mMのCaCl2(100nMの遊離Ca2+)、及び10mMのHEPES(CsOHでpH7.3)を含有していた。pHoが変化した実験では(図1d〜f)、細胞外溶液は、160mMのNMDGと、2mMのCaCl2と、HClでpH調整された10mMのHEPES(pH7.4に)、10mMのMES(pH6〜5.5に)、又は10mMのHomoPIPES(pH5〜4に)のいずれかとを含有していた。イオン置換実験では(図2a)、溶液が含有していた160mMのNMDG−Clが等モル濃度のNaCl、LiCl、又はCsClで置き換えられ、200μMのアミロライドが、内因性のENaCチャネルを遮断するために添加された。高カルシウム溶液では、一貫した重量モル浸透圧濃度を維持するために、60mMのNMDGを40mMのCaCl2で置き換えた。図1d〜f、3f〜g、及び図7で示す実験では、内因性のCl−電流を遮断するために、100μMのDIDSを添加した45。DIDSは、全ての他の実験では省略した。

0071

[0079]プロトン選択性の測定では(図2b〜e)、ピペット溶液は、約15mMのTMA−OHで(6.0)に滴定され、dH2Oで305mOsmに調整された、130mMのTMA−メタンスルホネート、5mMのTEA−Cl、2mMのMgATP、5mMのEGTA、2.4mMのCaCl2、及び80mMのMESを含有していた。NMDGベースの(Naを有さない)外部溶液は、約10〜15mMのNMDG−OHでpH調整され、dH2Oで305mOsmに調整された、130mMのNMDG−メタンスルホネート、2mMのCaCl2、100mMのHEPES(pH7.0〜7.4)、又は100mMのMES(pH5.5〜6.5)、又は100mMのHomoPIPES(pH4.5〜5.25)を含有していた。Na含有溶液は、NaOHでpH調整された、130mMのNa−メタンスルホネート、2mMのCaCl2、100mMのHEPES(pH7.0)、又は100mMのMES(pH5.5)を含有していた。示される場合、ZnCl2(10mM、最終濃度)、NMDG−Cl(20mM)、NaCl(20mM)、又はMgCl2(10mM)を、Naを有さない溶液又はNa含有溶液に添加し、モル浸透圧濃度を、dH2Oで調整した。各溶液のpHを使用の前に測定し、必要に応じて調整した。測定は、+/−0.01pH単位程度のpHのわずかな変化、又はpH5.5での[H+]の約+/−3%の変化の分、正確度が限定されていたことに留意されたい。これにより、図2aで見られるように、示されるものなどの異なるイオンの存在下での応答を測定する場合に、電流規模にわずかな変化が生じ得る。5mVの液間電位差をピペット溶液とバス溶液(Tyrodeの)との間で測定し、事後的に補正した。下水管によって送達される溶液とバス溶液との間の液間電位差を最小にするために、1MのKCl寒天橋を利用し、バス溶液を調整して、使用した下水管と類似のイオン組成を含むようにした46。<2mVの液間電位は補正されなかった。

0072

pHのイメージング
[0080]Otop及びGFPでコトランスフェクトされたHEK−293細胞を、CFPでトランスフェクトされたHEK−293細胞と混合し、37℃で、プロタミン被覆したカバースリップ上で平板培養した。少なくとも1時間後、製造者の指示に従ってPowerLoa濃縮物を使用して(Molecular Probes)、細胞に、細胞内pHの指標であるpHrodoレッドAMをロードした。Otop及びGFPでコトランスフェクトされた細胞を、U−MNIBA2 GFPフィルタキューブ(Olympus)を使用して同定し、その一方で、CFPを発現する「偽」トランスフェクト細胞を、U−N31044v2 CFPフィルターキューブ(Olympus)を使用して、又は蛍光の非存在によって、同定した。pHのイメージングオプティクス及び画像の取得は、以前に記載されるものと同一であった23、21。MES(150mMのNaCl、10mMのMES、2mMのCaCl2)で又は酢酸(150mMのNaCl、10mMの酢酸、2mMのCaCl2)で緩衝したpH5.0の溶液に応答した、各細胞のpHrodoレッドの蛍光強度を測定した。フルオロフォアを560nmの光で励起させ、630nmでの発光を、U−N31004 Texas Red/Cy3.5フィルターキューブ(Chroma Technologies)を使用して、Olympus IX71顕微鏡に取り付けられたHamamatsuデジタルCCDカメラによって検出した。各細胞のpHrodoレッドの蛍光強度を、pH7.4の溶液(150mMのNaCl、10mMのHEPES、2mMのCaCl2)中でのそのベースライン蛍光に対して正規化し、その後、最初の酸のアプライを行った。

0073

データ分析及び統計
[0081]全てのデータは、別段の記載がない限り、平均±SEMで表される。統計分析(ANOVA又はステューデントt検定)は、Graphpad Prism(Graphpad Softoware Inc)を使用して行った。本研究における試料のサイズは、類似の研究についての文献で報告されたものに類似している。図で示される代表的なデータは、一部のケースでは、グラフィクスプログラムであるOrigin(Microcal)及びCoreldraw(Corel)にエクスポートする前に、10倍デシメートされた。

0074

[0082]図3では、最大尤度系統樹を、Align−X(Invitrogen)及びNJplotを使用して48、13のオトペトリンファミリータンパク質のマルチシーケンスアラインメントから作成した。受託番号は以下の通りである:ヒト、NP_819056;ウシ、NP_001193713;マウス、NP_766297;イヌ、XP_545943;ニワトリ、XP_015141351;カエル、XP_012811170;ゼブラフィッシュ、NP_942098;m_OTOP2、NP_766389;m_OTOP3、NP_081408;dm_OTOPLa、AAF46050;dm_OTOPLb、AAN10385;dm_OTOPLc、ACL82893;ce_OTOPL1、CCD61337。Hughesらを参照されたい28。膜貫通トポロジーを、TMHMMサーバ2.0(2017年4月24日にアクセスしたインターネット<URL:http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/>上)を使用して予測した。

0075

実施例6−細胞外pHの変化に応答した、Otop1でトランスフェクトされたHEK−293細胞における細胞内カルシウムの上昇。

0076

[0083]カルシウムイメージングを使用して、37℃で、プロタミンで被覆したカバースリップ上で培養した、Otop及びGFPでコトランスフェクトされたHEK−293細胞、並びにCFPでトランスフェクトされたHEK−293細胞における細胞内カルシウムの変化についてアッセイした(図9)。少なくとも1時間後、製造者の指示に従ってPowerLoad濃縮物を使用して(Molecular Probes)、細胞に、細胞内カルシウムの指標であるfura−2 AMをロードした。Otop及びGFPでコトランスフェクトされた細胞を、U−MNIBA2 GFPフィルターキューブ(Olympus)を使用して同定し、その一方で、「偽」トランスフェクトされた細胞は、U−N31044v2 CFPフィルターキューブ(Olympus)を使用してCFPを発現することが同定されたか、又は蛍光を示さなかった。カルシウムのイメージングオプティクス及び画像の取得は、記載されるものと同一であった(Changら、2010)。MES(150mMのNaCl、10mMのMES、2mMのCaCl2)で又は酢酸(150mMのNaCl、10mMの酢酸、2mMのCaCl2)で緩衝したpH5.0の溶液に応答した、各細胞のFura−2励起の比を測定した。

0077

実施例7−参考文献
以下の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。

0078

実施例8−オトペトリンの配列
[0084]ヒトOTOP1(配列番号1):
LEGLGSPASPRAAASASVAGSSGPAACSPPSSSAPRSPESPAPRRGGVRASVPQKLAEMLSSQYGLIVFVAGLLLLLAWAVHAAGVSKSDLLCFLTALMLLQLLWMLWYVGRSSAHRRLFRLKDTHAGAGWLRGSITLFAVITVILGCLKIGYFIGFSECLSATEGVFPVTHSVHTLLQVYFLWGHAKDIIQSFKTLERFGVIHSVFTNLLLWANGVLNESKHQLNEHKERLITLGFGNITTVLDDHTPQCNCTPTLCAISHGIYYLYPFNIEYQILASTMLYVLWKNIGRKVDSHQHQKMQFKSDGVMVGAVLGLTVLAATIAVVVVYLIHIGRSKTKSESALIMFYLYAITLLMLMGAAGLAGIRIYRIDEKSLDESKNPARKLDSDLLVGTASGSWLISWGSILAILCAEGHPRYTWYNLPYSILAIVEKYIQNLFIFESIHREPEKLSEDIQTLRVVTVCNGNTMPLASSCPKSGGVARDVAPQGKDMPPAANGNVCMRESHDKEEEKQEESSWGGSPSPVLPRFLQGNAKRKVLRNIAAFLFLCNISLWIPPAFGCRPEYDNGLEEIVFGFEPWIIVVNLAMPFSIFYRMHAAASLFEVYCK

0079

[0085]ヒトOTOP2(配列番号2):
MSEELAQGPKESPPAPRAGPREVWKKGGRLLSVLLAVNVLLLACTLISGGAFNKVAVYDTDVFALLTAMMLLATLWILFYLLRTVRCPCAVPYRDAHAGPIWLRGGLVLFGICTLIMDVFKTGYYSSFFECQSAIKILHPLIQAVFVIIQTYFLWVSAKDCVHVHLDLTWCGLMFTLTTNLAIWMAAVVDESVHQSHSYSSSHSNASHARLISDQHADNPVGGDSCLCSTAVCQIFQQGYFYLYPFNIEYSLFASTMLYVMWKNVGRFLASTPGHSHTPTPVSLFRETFFAGPVLGLLLFVVGLAVFIIYEVQVSGDGSRRQALVIYYSFNIVCLGLTTLVSLSGSIIYRFDRRAMDHHKNPTRTLDVALLMGAALGQYAISYYSIVAVVAGTPQDLLAGLNLTHALLMIAQHTFQNMFIIESLHRGPPGAEPHSTHPKEPCQDLTFTNLDALHTLSACPPNPGLVSPSPSDQREAVAIVSTPRSQWRRQCLKDISLFLLLCNVILWIMPAFGARPHFSNTVEVDFYGYSLWAVIVNICLPFGIFYRMHAVSSLLEVYVLS

0080

[0086]ヒトOTOP3(配列番号3):
MGRGARAAAAQSRWGRASRASVSPGRTIRSAPAVGEAQETEAAPEKENRVDVGAEERAAATRPRQKSWLVRHFSLLLRRDRQAQKAGQLFSGLLALNVVFLGGAFICSMIFNKVAVTLGDVWILLATLKVLSLLWLLYYVASTTRRPHAVLYQDPHAGPLWVRGSLVLFGSCTFCLNIFRVGYDVSHIRCKSQLDLVFSVIEMVFIGVQTWVLWKHCKDCVRVQTNFTRCGLMLTLATNLLLWVLAVTNDSMHREIEAELGILMEKSTGNETNTCLCLNATACEAFRRGFLMLYPFSTEYCLICCAVLFVMWKNVGRHVAPHMGAHPATAPFHLHGAIFGPLLGLLVLLAGVCVFVLFQIEASGPAIACQYFTLYYAFYVAVLPTMSLACLAGTAIHGLEERELDTVKNPTRSLDVVLLMGAALGQMGIAYFSIVAIVAKRPHELLNRLILAYSLLLILQHIAQNLFIIEGLHRRPLWETVPEGLAGKQEAEPPRRGSLLELGQGLQRASLAYIHSYSHLNWKRRALKEISLFLILCNITLWMMPAFGIHPEFENGLEKDFYGYQIWFAIVNFGLPLGVFYRMHSVGGLVEVYLGA

0081

[0087]マウスOTOP1(配列番号4):
MPGGPGAPSSPAASSGSSRAAPSGIAACPLSPPPLARGSPQASGPRRGASVPQKLAETLSSQYGLNVFVAGLLFLLAWAVHATGVGKSDLLCVLTALMLLQLLWMLWYVGRSYMQRRLIRPKDTHAGARWLRGSITLFAFITVVLGCLKVAYFIGFSECLSATEGVFPVTHAVHTLLQVYFLWGHAKDIIMSFKTLERFGVIHSVFTNLLLWANSVLNESKHQLNEHKERLITLGFGNITIVLDDHTPQCNCTPPALCALSHGIYYLYPFNIEYQILASTMLYVLWKNIGRRVDSSQHQKMQCRFDGVLVGSVLGLTVLAATIAVVVVYMIHIGRSKSKSESALIMFYLYAITVLLLMGAAGLVGSWIYRVDEKSLDESKNPARKLDVDLLVATASGSWLLSWGSILAIACAETRPPYTWYNLPYSVLVIVEKYVQNIFIIESVHLEPEGVPEDVRTLRVVTVCSSEAAALAASTLGSQGMAQDGSPAVNGNLCLQQRCGKEDQESGWEGATGTTRCLDFLQGGMKRRLLRNITAFLFLCNISLWIPPAFGCRPEYDNGLEEIVFGFEPWIIVVNLAMPFSIFYRMHAAAALFEVYCKI

0082

[0088]マウスOTOP2(配列番号5):
MSEELVPHPNESLPGPRASPREVWKKGGRLLSVLLAVNVLLLACTLISGGAFNKVAVYDTDVFALLTTMMLLAALWIVFYLLRTARCPDAVPYRDAHAGPIWLRGGLVLFGICTLVMDVFKTGYYSSFFECQSAIKILHPIIQAVFVIVQTYFLWISAKDCIHTHLDLTRCGLMFTLATNLAIWMAAVVDESVHQAHSYSGSHGNTSHTRLNPDSKRAGGAAEEDPCLCSTAICQIFQQGYFYLYPFNIEYSLFASTMLYVMWKNVGRLLASTHGHGHTPSRVSLFRETFFAGPVLGLLLFVVGLAVFILYEVQVSGERGHTRQALVIYYSFNIVCLGLMTLVSLSGSVIYRFDRRAMDHHKNPTRTLDVALLMGAALGQYAISYYSIVAVVVGSPRDLQGALNLSHALLMIAQHTFQNVFIIESLHRGPPGAEPREMPPKEPCQGITFANLDAIRTLPSCPPTPRLVIPNLESPQEAVAIISAPRCHWRRRCLKDISLFLLLCNVILWIMPAFGARPHFSNTVEVDFYGYSLWAAIVNICLPFGIFYRMHAVSSLLEVYVLS

0083

[0089]マウスOTOP3(配列番号6):
MASQTSAPAEPAPMPSPEAKTTEGASSYDQADMETKHAGSPCPPKQKSWLARHFSLLLRRDRQAQKAGQLFSGLLALNVVFLGGAFICSMIFNKVSVTLGDVWILLAALKVLSLLWLLYYTVGTTRKPHAVLYRDPHAGPIWVRGSLVLFGSCTVCLNIFRMGYDVSHIHCKSEVELIFPAIEIVFMIIQTWVLWRHCKDCVQVQTNFTRCGLMLTLATNLLMWVLAVTNDSMHREIEAELDALMEKFSGNGTNTCMCLNTTVCEVFRKGYLMLYPFSTEYCLICCAVLFVMWKNVSRSLAAHTGAHPNRSPFRLHGTIFGPLLGLLALVAGVCVFVLFQIEASGPDIARQYFTLYYAFYVAVLPTMSLACLAGTAIHGLEERELDTLKNPTRSLDVVLLMGAALGQMGIAYFSIVAIVATQPHELLNQLILAYSLLLILQHITQNLFIIEGLHRRPLWEPAVSGVMEKQDVELPRRGSLRELGQDLRRASRAYIHSFSHLNWKRRMLKEISLFLILCNITLWMMPAFGIHPEFENGLEKDFYGYRTWFTIVNFGLPLGVFYRMHSVGGLVEVYLGA

0084

[0090]ショウジョウバエ属OTOP変異体D(CG42492),(配列番号7):
MQRCPYIHEMRERLLDQPRETLQLENMERANLLDNRQSASESNQLQGDGYHTSPAHQRTPLVPHDLGEDFNLDFDDDFPIDARRPKNANDIHPAVLTRPQQRTSLFIVTSLVYAILLIVVCIAYVISDVTTHRLPVLYYETFFTYLYGVSILFLLYVFCFLLQESSCCNGGNGGSKPKPQPKEKKSKKAKNADPADSKDAKGSKDSGKAAKGAAYQHTLAKFLEAPVDAEVAVTPKNVRKRKTTHSDLTHGSFFLRVGAIAFGLGAMIYIGLEFGSFFEIPFDSPCHHILIGVNPLLQMIFTFMQMYFIFMNARTRPPFQLNIHRFKVIARFGLMHVVATNICVWIRTLVKESLLEITIYHQKNEPEAGASSIAHSIRQHALRHAGTVLRTHAGPNSEFEVLDGEDILPKDVYKSDNVLSKLVRNTVDGISKSLGMGGDQALDSSTTSSTTTTTRAPFTTPNYQWHSTTMARKLKKFITSATTAATTAAGSSSTASSTTTISPTISSTTIPSTTISSTTISSSTTFSPFSPSTTTTTTTTAAALNLETSGSESPFGGLQRILSSAAPPSLAPVDGFGSASAATPTSGSGAGSFVDSFLASTLSPASSTEGSASIMNNLFGQGPMENSFQTYTDLGHEEATGLVSFENLESLDNIYPAALSSNIGTLNSTACGRIDIMGTIVYDSAPYLYPFIIEYSLIGAVVLYVMWKHIGRYPGRMNDEDLEHRLEVMLSRRAVAMAQQARSGRVDCVGSSKGLFFGLLLLVGALICLILFFVLVRHQQFSLLAIYLADASHCILMAFAILAIIVGFIRVKNLKFRCEQSNLNDILLRISAFGLFTYSVFSIIAGSLKVLESEPSLLVTTTGGVAVFQVILQLLFIADVSRRRVHLPEHDRSKPGRQIVTFLLICNVAMFAIYTFEAQKVFANPVSRYVQLEFYGFVPWSIIQRITLPLCIFHRFHSAVTLAEIWKTTYKARL

0085

[0091]ショウジョウバエ属OTOP変異体A(配列番号8):
MSLINLKSKDMYDEPINLWRTKQRVHYHHDVISKGNDSHRSSDACEYITISAPKKSGSFSRSPPSSLPTSVPGTPRHSVAATSNQVIRYARTSCDHCGHHSIPVMSPHPISPLAKSQTNLDLVEHGSQRQALLPLPTVGMHHEDSACTLQVSRRPSLLLQEILTQRPPLFGRRDGNGFLSPRTAKNGNLQGTASGSTATINFQSGATSARNGSTAFFDNGAKSFQAKQQKDKNRRTGNDAISSALSATYCKLLVLLGVCLPITEVISDQIPTYVYQGFYVYLYVGSILFVIFLYISAFRNRSLFNALKDYHEKNSNVHLKHKVTHFGSFYLRVGAIAFAIGTMVYSGLEFGQFFELNGHPGCRDVFVAITPICRMVLCIAQVQFIFLNTTYMDMARHKVTSRFGLMHMVATNLCEWLYVLVEETKHEIFHISQHEVDPAHDLVIHNSSMSRTDWAAVNESLHQHHHHHALNNTLVANVSSVIVNMTITPSPTPAAFSGCSRTTIMGALVQQLSPFLFPCTIEYSLICAVILFEMWKTVKSIPDIDKTRKNSVKPAAAKPAHHFSVDCSQSHKGLFFGILIIVMTIISMIMYFVLYTQPGYELVATQEVTLWETFMYFMCAAAVITGMILMRDLRYIKNTSDEHHSMDLDNLLLIVAQTGVYLYGMFSILGSYFAKWDTVPDRVEGIIAEVFGVVQTSLQTMFILHSSHRRCRGTNQVRRKPGREIITFLLVANIAIWFVNTLIKGRAVFRESHLEFFGVWGWTIITHISMPLAIFYRFHSTICLFEVWKITYKAKAH

0086

[0092]ショウジョウバエ属OTOP変異体D(CG42265)(配列番号9):
MDSSPDLSLKLRRGSSDSRDNFYMDFAQGIDSDIEEVDNTANNQEAGEVPPPPLPTVSLAEEVLLLVAPPPPPPSLLGQPLPTLTETDDIPPTPTPPPQQKDDEGDDEDEREEPVPEQDQGAPAAPSPPGSPINSVLELELIPPPPLSPMDDAGLRTDDDGEGEETDDAEEVAAIPPPHEMLDIESNPDEEEEEEEQEQASQEDTPKEEDEEEDDDKSTPPPPLPPLPSNFSYVQGHNLGQVTPPLTKSPSNSPSPPVTPPPCPELNISRMVSPPAQHISQIPPLTPSDESEGEAESQPNSPPLRLDAEQPPPDMDQPEPEDQPPEPENEPEPEPEPEPEPEPVSGAREDYSRSLDNEDESTTITTPPSNGYSASSIIAPPPEHFAELDEDRGFIPPPPLEQEPEEEVEEEEEEEEEELTKETDEISVDRESLQDQGGDSISSPRPASILTGSSTSVGGGAGGSPKPESRGPSRSGSQRSQLRSGSQQGSIAESRGGSRIGSRTGSVASAQAAGVLSPQASLKSQTSIRSQGQAGVRSPAGSIKSGSQRMQSPQAGEGAPAMPSPPLMRSPPPELARQMHSPPRITTPPRVCSPPLVSSPPKLAESAAAAVGVAATVKEQIGSSSSTAEPLEPSKPEPLKPPIATVSYQDEQKPSPPPTAAAAPAVTTTAATTAVTSQPRSHFTSSHHHYHLPHQFQHPHHQNHHTHSVRVPTPTVPSSYAPPPPPDSGSSSSPVDRRRLFMAGVAPPIAAGAGSLMAMPAEPAVAISPGRVSARSGSQHHVTIDESSLPSHKGNIQETPGPSGLIIGGGDGDGDRDIGGGGGPDSSDPPSSPGGSSSQPALSGSQADGQLALMYHSHQLTNYPVLPAIKRTHRPSFVYPPMPRVKAGDALATLFSALYGKLLVVMGIAFPMAEVISTYIPPSFYEVYYLYLYIGSMIFLLFMYATLIWGRPKLPVPIASPSKSATKASGTDSMDESDTDSNSVHHRLPPPIPVRRPSLLSPLGRRDAHYGSFYLRMGAVAFGIGSMIYSGLEFGQYFELNPDTKCHNVLLALTPATRMAFIFIQMYFIFLNNEQIKVYRYKIIARFGLMHMIGTNLAVWLNVLIQETKHEILTFYNPENRTLRISHRIPGHSRGHAIIQHDPTAHLRVPRGLKGPYQIFECRRTNIIGTLVQDASPFLFPCTIEYSLICAAILYVMWRSISRPQTPTPQRPDMISSPMKRSPHHYSVDCARAHKGLFVGILILVLTIISLIIFFVLISRPEFVAMAVTEVTICELLIYGTATIATLVGMIQIRHLQYDAYRSFSLDDILLVGAQTGSFLYNIFTVIAGHFTLRSDDMLVPINALASIVQTACQTMFILDASRRQAVSPEHLRKKPGREIVTFMLVVNLAMWAISTLEKSRAESHPIQLNFYGLWAWTIITHVSMPLAIFYRFHSTVCLCEIWKRAYKLKPTYMXEFARSRIQSIAQQQQFCEDLKTNLSYCYCSTTLAGGELETVEEVDSGESNSAEDAGAGAGSGGSRGSGGGAGAAEAGEAGEEGQQGGDSSCGLKAPIRALSPQSLNTEKAFCPVYVINGE

0087

[0100]詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定を意図しない。本明細書において提示される発明の主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用してもよいし、他の変更がなされてもよい。本明細書の全体で記載され図面で例示された本開示の態様は、アレンジされ得、置換され得、組み合わされ得、及び広範な異なる立体配置で設計され得、その全てが明確に検討され、本開示の一部を成すことは容易に理解されよう。

0088

[0101]本明細書における実質的に全ての複数形の及び/又は単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び/又は適用に適切なように、複数形から単数形に、及び/又は単数形から複数形に変換することができる。様々な単数形/複数形の入れ替えは、明確にするために、本明細書において明示的に示され得る。

0089

[0102]当業者には、通常、本明細書において、特に添付の特許請求の範囲(例えば、請求項のボディ)において使用される用語は、一般に、「非排他的な」用語を意図する(例えば、用語「含む(including)」は「これらに限定されないが、〜が挙げられる」として解釈されるべきであり、用語「有する」は「少なくとも〜を有する」として解釈されるべきであり、用語「含む(includes)」は「これらに限定されないが、〜が挙げられる」として解釈されるべきである等)ことが理解されよう。当業者には、具体的な数の導入された請求項の詳述が意図される場合、このような意図は請求項において明確に詳述され、このような詳述が存在しない場合にはこのような意図は存在しないことがさらに理解されよう。例えば、理解の手助けとして、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の詳述を導入するために、導入のための表現「少なくとも1つの」及び「1つ又は複数の」の使用を含み得る。しかし、このような表現の使用は、不定詞「a」又は「an」による請求項の詳述の導入が、このような導入された請求項の詳述を含む任意の特定の請求項を、同一の請求項が導入のための表現「1つ又は複数の」或いは「少なくとも1つの」及び「a」又は「an」などの不定冠詞(例えば、「a」及び/又は「an」は「少なくとも1つの」或いは「1つ又は複数の」を意味すると典型的には解釈されるべきである)を含む場合であっても、このような詳述を1つだけ含む発明に限定することを暗に示すと解釈されるべきではない。同様のことが、請求項の列挙を導入するために使用される定冠詞の使用にも当てはまる。さらに、具体的な数の導入される請求項の列挙が明確に列挙されていても、当業者は、このような列挙が少なくとも列挙された数を意味する(例えば、他の修飾語句を伴わない「2つの列挙」という無冠詞の列挙は、少なくとも2つの列挙又は2つ以上の列挙を典型的には意味する)と典型的には解釈されるべきであることが認識されよう。さらに、「A、B、及びCなどの少なくとも1つ」に類似の規定が使用される場合、通常、このような構文は、当業者がその規定を理解するであろう意味で意図される(例えば、「A、B、及びCの少なくとも1つを有するシステム」は、これらに限定されないが、例えばAのみを、Bのみを、Cのみを、A及びBを共に、A及びCを共に、B及びCを共に、並びに/又はA、B、及びCを共に有するシステムを含む)。「A、B、又はCなどの少なくとも1つ」に類似の規定が使用される場合では、通常、このような構文は、当業者がその規定を理解する意味で意図される(例えば、「A、B、又はCの少なくとも1つを有するシステム」は、これらに限定されないが、例えばAのみを、Bのみを、Cのみを、A及びBを共に、A及びCを共に、B及びCを共に、並びに/又はA、B、及びCを共に有するシステムを含む等)。当業者には、事実上全ての、2つ以上の代替的な用語を表す離接語及び/又は表現が、明細書、特許請求の範囲、又は図面のいずれにおいても、その用語の一方、その用語のいずれか、又はその用語の両方を含む可能性を検討すると理解されるべきであることがさらに理解されよう。例えば、表現「A又はB」は、「A」又は「B」又は「A及びB」の可能性を含むと理解されよう。

0090

[0103]当業者には、多くの及び様々な修正が、本技術の趣旨から逸脱することなくなされ得ることが理解されよう。したがって、本技術の形式が例示的なものにすぎず、本技術の範囲を限定することを意図したものではないことが、明らかに理解される。

実施例

0091

[0104]本明細書において引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

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