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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、例えば対象からの、セルフリーDNAのドナー特異的画分の量を評価するための方法および組成物に関する。 本明細書において提供される方法および組成物は、移植対象における状態、例えば移植臓器傷害(例えば細胞の傷害)、細胞性拒絶グレード、抗体媒介性拒絶、心臓同種移植片脈管障害、および/または心停止リスクを決定するために用いることができる。

概要

背景

発明の分野
本発明は、移植対象からの試料中のドナー特異的核酸の量を評価するための方法および組成物に関する。かかる量は、移植の後の対象の特定の状態、例えば、移植された臓器の状態または疾患に関連するリスク、例えば、心臓同種移植片脈管障害もしくは心停止細胞性拒絶グレードもしくは細胞性拒絶グレードに関連するリスク、抗体媒介性拒絶もしくは抗体媒介性拒絶に関連するリスク、または細胞傷害などの移植臓器傷害、もしくは細胞の傷害などの移植臓器傷害に関連するリスクを評価するために用いることができる。本発明は、さらに、前述のものなどの多様な状態の評価のために、多重最適化ミスマッチ増幅(multiplexed optimized mismatch amplification:MOMA)および/または配列決定技術を用いて、ドナー特異的セルフリーデオキシリボ核酸の量を評価するための方法および組成物に関する。

概要

本発明は、例えば対象からの、セルフリーDNAのドナー特異的画分の量を評価するための方法および組成物に関する。 本明細書において提供される方法および組成物は、移植対象における状態、例えば移植臓器傷害(例えば細胞の傷害)、細胞性拒絶グレード、抗体媒介性拒絶、心臓同種移植片脈管障害、および/または心停止のリスクを決定するために用いることができる。

目的

一側面において、全セルフリーDNAおよび/もしくはドナー特異的セルフリーDNAの量または本明細書において提供される分析の方法のいずれか1つに基づいて、対象を処置する、対象のための処置レジメンを決定する、または対象に対する処置についての情報を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

移植対象からの試料を評価する方法であって、(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DScf−DNA)の量を決定すること、ここで、対象は、細胞性拒絶グレード(例えばCR1、CR2もしくはそれより低い、CR1以上、またはCR2もしくはそれより高い)を有するか、またはこれを有することが疑われる;ならびに(b)DScf−DNAの量を報告および/または記録することを含む、前記方法。

請求項2

(c)DScf−DNAの量を、閾値DScf−DNAまたは少なくとも1つの前のDS−cf−DNA値と比較することをさらに含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

(d)閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、対象についての細胞性拒絶グレードを当てはめるか、またはリスクが増大しているものとして当てはめることをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

移植対象を評価する方法であって、(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DScf−DNA)の量を得ること、ここで、対象は、細胞性拒絶グレード(例えばCR1、CR2もしくはそれより低い、CR1以上、またはCR2もしくはそれより高い)を有するか、またはこれを有することが疑われる;(b)DScf−DNAの量を、閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較すること;ならびに(c)閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングレジメンを決定することを含む、前記方法。

請求項5

閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、細胞性拒絶グレードを対象に当てはめることをさらに含む、請求項4に記載の方法。

請求項6

対象が、細胞性拒絶グレード(例えばCR0もしくはCR1の、または例えばCR2もしくはCR3)有するか、またはこれを有することが疑われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

対象が、細胞性拒絶グレード(例えばCR1、CR2もしくはそれより低い、CR1以上、またはCR2もしくはそれより高い)を有することが決定されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

対象が、細胞性拒絶グレード(例えばCR0もしくはCR1の、または例えばCR2もしくはCR3)を有することが決定されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

対象における移植拒絶を評価するために前に適用された1つ以上のさらなる検査により、対象が細胞性拒絶グレードを有することが決定されたか、または、対象における移植拒絶を評価するために1つ以上のさらなる検査を行うことをさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

閾値が、0.2である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

閾値が、0.3である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

閾値が、0.8である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

DScf−DNAの量が、0.14、0.15または0.2未満である場合に、CR0の細胞性拒絶グレードを対象に当てはめる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

DScf−DNAの量が、0.14、0.15または0.2より高いか、0.14〜0.8、0.15〜0.8または0.2〜0.8である場合に、CR1の細胞性拒絶グレードを対象に当てはめる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

DScf−DNAの量が、それぞれ0.8以上である場合に、CR2以上の細胞性拒絶グレードを対象に当てはめる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。

請求項16

DScf−DNAの量が、0.14〜0.5、0.15〜0.5、0.2〜0.5または0.3〜0.5である場合に、1つ以上のさらなる検査が示される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。

請求項17

移植対象からの試料を評価する方法であって、(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DScf−DNA)の量を決定すること、ここで、対象が、移植された臓器の状態または疾患を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある;ならびに(b)DScf−DNAの量を報告および/または記録することを含む、前記方法。

請求項18

(c)DScf−DNAの量を閾値DScf−DNAの値または少なくとも1つの前のDScf−DNA値と比較することをさらに含む、請求項17に記載の方法。

請求項19

閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、状態または疾患が示されるか、または対象が増大したリスクを有する、請求項17または18に記載の方法。

請求項20

移植対象を評価する方法であって、(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DScf−DNA)の量を得ること、ここで、対象が、移植された臓器の状態または疾患を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある;(b)DScf−DNAの量を、閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較すること;ならびに(c)閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定することを含む、前記方法。

請求項21

閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、状態または疾患が示されるか、または対象が増大したリスクを有する、請求項20に記載の方法。

請求項22

対象が、心臓同種移植片脈管障害を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある、請求項17〜21のいずれか一項に記載の方法。

請求項23

対象が、心停止を既に有しているか、これを有するリスクがある、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。

請求項24

対象が、心臓同種移植片脈管障害を有することが決定されているか、または心停止を既に有している、請求項17〜23のいずれか一項に記載の方法。

請求項25

対象を評価するために前に適用された1つ以上のさらなる検査により、対象が心臓同種移植片脈管障害を有することが決定されたか、または、対象を評価するために1つ以上のさらなる検査を行うことをさらに含む、請求項17〜24のいずれか一項に記載の方法。

請求項26

閾値が、0.2または0.3である、請求項17〜25のいずれか一項に記載の方法。

請求項27

DScf−DNAの量が0.2または0.3と等しいかまたはこれより高い場合、心臓移植片脈管障害または心停止のリスクが示される、請求項17〜26のいずれか一項に記載の方法。

請求項28

移植対象からの試料を評価する方法であって、(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DScf−DNA)の量を決定すること、ここで、対象は、抗体媒介性拒絶を有するか、またはこれを有することが疑われる;ならびに(b)DScf−DNAの量を報告および/または記録することを含む、前記方法。

請求項29

(c)DScf−DNAの量を閾値DScf−DNAの値または少なくとも1つの前のDScf−DNA値と比較することをさらに含む、請求項28に記載の方法。

請求項30

(d)閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、対象を、抗体媒介性拒絶を有する、またはリスクが増大しているものとして分類することをさらに含む、請求項28または29に記載の方法。

請求項31

移植対象を評価する方法であって、(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DScf−DNA)の量を得ること、ここで、対象は、抗体媒介性拒絶を有するか、またはこれを有することが疑われる;(b)DScf−DNAの量を、閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較すること;ならびに(c)閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定することを含む、前記方法。

請求項32

閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、対象を、抗体媒介性拒絶を有するか、またはリスクが増大しているものとして分類することをさらに含む、請求項31に記載の方法。

請求項33

対象が、抗体媒介性拒絶を有することが決定されている、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。

請求項34

対象における移植拒絶を評価するために前に適用された1つ以上のさらなる検査により、対象が抗体媒介性拒絶を有することが決定されたか、対象を評価するために1つ以上のさらなる検査を行うことをさらに含む、請求項28〜33のいずれか一項に記載の方法。

請求項35

閾値が、0.2である、請求項28〜34のいずれか一項に記載の方法。

請求項36

DScf−DNAの量が0.2よりも高い場合に、対象が抗体媒介性拒絶を有する、請求項28〜35のいずれか一項に記載の方法。

請求項37

移植対象からの試料を評価する方法であって、(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DScf−DNA)の量を決定すること、ここで、対象は、移植臓器傷害を有するか、またはこれを有することが疑われる、ならびに(b)DScf−DNAの量を報告および/または記録することを含む、前記方法。

請求項38

(c)DScf−DNAの量を閾値DScf−DNAの値または少なくとも1つの前のDScf−DNA値と比較することをさらに含む、請求項37に記載の方法。

請求項39

(d)閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、対象が移植臓器傷害を有するか否かを決定するか、またはリスクが増大しているものとして決定することをさらに含む、請求項37または38に記載の方法。

請求項40

対象が24未満である、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。

請求項41

対象が16歳未満である、請求項40に記載の方法。

請求項42

対象が体重30kg未満である、請求項37〜41のいずれか一項に記載の方法。

請求項43

対象が体重20kg未満である、請求項42に記載の方法。

請求項44

移植対象を評価する方法であって、(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DScf−DNA)の量を得ること、ここで、対象は、移植臓器傷害を有するか、またはこれを有することが疑われる;(b)DScf−DNAの量を、閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較すること;ならびに(c)閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定することを含む、前記方法。

請求項45

閾値DScf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDScf−DNA量と比較した、決定されたDScf−DNAの量に基づいて、対象が移植臓器傷害を有するか否かを決定するか、またはリスクが増大しているものとして決定することをさらに含む、請求項44に記載の方法。

請求項46

対象が24歳未満である、請求項44または45に記載の方法。

請求項47

対象が16歳未満である、請求項46に記載の方法。

請求項48

対象が体重30kg未満である、請求項44〜47のいずれか一項に記載の方法。

請求項49

対象が体重20kg未満である、請求項48に記載の方法。

請求項50

少なくとも1つの量が、移植臓器に対する傷害の1、5、10または15分後に対象から採取された試料において決定される、請求項37〜49のいずれか一項に記載の方法。

請求項51

1つ以上のさらなる検査が、生検を含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。

請求項52

生検が、心内膜心筋生検(EMB)である、請求項51に記載の方法。

請求項53

量が、レポートにおいて提供される、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法。

請求項54

レポートにおいて量が提供され、レポートがまた、対象からの試料中のものであったDS−cfDNAの少なくとも1つの前の量を含む、請求項53に記載の方法。

請求項55

量が、データベースにおいて記録される、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。

請求項56

データベースがまた、対象からの試料中のものであったDScf−DNAの少なくとも1つの前の量を含む、請求項55に記載の方法。

請求項57

DScf−DNAの量が、(a)複数の単一ヌクレオチドバリアント(SNV)標的に対して、試料またはその一部に対して、少なくとも2組のプライマーペアにより、ポリメラーゼ連鎖反応PCR)定量アッセイなどの増幅ベースの定量アッセイを行うこと、ここで、各々のプライマーペアは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも2組のプライマーペアの一方は、SNV標的の一方のアレルと比較して、プライマー中に3’の最後から2番目ミスマッチを含むが、SNV標的の他方のアレルと比較して3’の二重のミスマッチは含まず、SNV標的の一方のアレルを特異的に増幅し、少なくとも2組のプライマーペアの他方は、SNV標的の他方のアレルを特異的に増幅する、ならびに(b)結果に基づいてDScf−DNAの量を評価することにより決定されるかまたは得られる、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。

請求項58

ドナーの遺伝子型既知である、請求項57に記載の方法。

請求項59

ドナーの遺伝子型が不明である、請求項57に記載の方法。

請求項60

DScf−DNAの量が、(a)複数の遺伝子座の各々のアレルを決定すること;(b)アレルの決定に基づいて、複数の遺伝子座から少なくとも1つのインフォーマティブな遺伝子座を選択すること;(c)複数の遺伝子座、対象の第1の核酸および対象にとってネイティブではない第2の核酸を含む核酸を同定すること;(d)統計学的分布を用いて、少なくとも1つのインフォーマティブな遺伝子座における第1のアレルの推定アレル頻度を計算すること;ならびに(e)推定アレル頻度に基づいて、DScf−DNAの量を決定することにより決定されるかまたは得られる、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。

請求項61

ドナーの遺伝子型が既知である、請求項60に記載の方法。

請求項62

ドナーの遺伝子型が不明である、請求項60に記載の方法。

請求項63

少なくとも1つの量が、臓器移植の4、5、6、7または8日後に対象から採取される試料において決定される、請求項1〜62のいずれか一項に記載の方法。

請求項64

閾値より高いか、および/またはより早い時点からの量と比較して増大したDScf−DNAの量が、増大したかまたは増大中のリスクを表す、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。

請求項65

閾値より低いか、および/またはより早い時点からの量と比較して低下したDScf−DNAの量が、低下したかまたは低下中のリスクを表す、請求項1〜64のいずれか一項に記載の方法。

請求項66

モニタリングレジメンを決定することが、対象において経時的にもしくはその後の時点においてDScf−DNAの量を決定すること、またはかかるモニタリングを対象に提案することを含む、請求項1〜65のいずれか一項に記載の方法。

請求項67

対象が、毎日または1週間ごとに評価される、請求項66に記載の方法。

請求項68

対象が、1ヵ月ごとまたは2ヵ月ごとに評価される、請求項66に記載の方法。

請求項69

対象が、6ヵ月まで、8ヵ月まで、10ヵ月まで、または1年までにわたり評価される、請求項1〜68のいずれか一項に記載の方法。

請求項70

DScf−DNAの量が、閾値またはより早い時点からの量と比較して高い場合、試料採取の間の時間が短縮される、請求項1〜69のいずれか一項に記載の方法。

請求項71

DScf−DNAのさらなる量が、記録または報告される、請求項1〜70のいずれか一項に記載の方法。

請求項72

さらなる量が、レポートにおいて提供される、請求項71に記載の方法。

請求項73

さらなる量が、データベースにおいて記録される、請求項71または72に記載の方法。

請求項74

モニタリングレジメンを決定することが、対象における移植拒絶を評価するための1つ以上のさらなる検査を用いること、またはこの使用を提案することを含む、請求項1〜73のいずれか一項に記載の方法。

請求項75

1つ以上のさらなる検査が、生検を含む、請求項74に記載の方法。

請求項76

生検が、心内膜心筋生検(EMB)である、請求項75に記載の方法。

請求項77

DScf−DNAの量が、本明細書において提供される閾値のいずれか1つと等しいかまたはこれより高い場合、1つ以上のさらなる検査が示される、請求項1〜76のいずれか一項に記載の方法。

請求項78

処置レジメンを決定することが、対象のための処置を選択または示唆することを含む、請求項1〜77のいずれか一項に記載の方法。

請求項79

処置レジメンを決定することが、対象を処置することを含む、請求項1〜78のいずれか一項に記載の方法。

請求項80

処置が、抗拒絶療法を含む、請求項1〜79のいずれか一項に記載の方法。

請求項81

処置が、心臓同種移植片脈管障害のための処置、例えば再移植経皮的冠動脈形成術PCI)、冠動脈バイパス移植術(CABG)、経心筋レーザー血行再建術またはヘパリン誘導型/媒介型体外LDLプラスマフェレーシスHELP)を含む、請求項1〜80のいずれか一項に記載の方法。

請求項82

心臓同種移植片脈管障害が示される場合、処置が、スタチン降圧剤または抗サイトメガロウイルス(抗CMV)剤による処置を含む、請求項1〜81のいずれか一項に記載の方法。

請求項83

降圧剤が、カルシウムチャネル遮断薬である、請求項82に記載の方法。

請求項84

心停止のリスクの増大が示される場合、処置が、経皮的冠動脈形成術(冠動脈形成術)、冠動脈バイパス移植術、または植込み型除細動器ICD)の付加などの心停止のための処置を含む、請求項1〜83のいずれか一項に記載の方法。

請求項85

心停止のリスクの増大が示される場合、処置が、抗不整脈剤不随意神経系遮断薬、または血圧医薬を含む、請求項1〜84のいずれか一項に記載の方法。

請求項86

処置レジメンを決定することが、処置についての情報を対象に提供することを含む、請求項1〜85のいずれか一項に記載の方法。

請求項87

試料が、血液、血漿または血性試料である、請求項1〜86のいずれか一項に記載の方法。

請求項88

血液試料血漿試料である、請求項87に記載の方法。

請求項89

移植対象が心臓移植対象である、請求項1〜88のいずれか一項に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願
本願は、2017年6月20日に出願された米国仮出願番号62/522,547、2017年6月20日に出願された米国仮出願番号62/522,556、2017年6月20日に出願された米国仮出願番号62/522,560、2017年8月8日に出願された米国仮出願番号62/542,787、2017年8月8日に出願された米国仮出願番号62/542,790、2017年8月17日に出願された米国仮出願番号62/546,798、2017年8月17日に出願された米国仮出願番号62/546,848、2017年8月17日に出願された米国仮出願番号62/546,872、2017年10月12日に出願された米国仮出願番号62/571,709、2017年10月12日に出願された米国仮出願番号62/571,715、2017年10月24日に出願された米国仮出願番号62/576,641、2018年2月20日に出願された米国仮出願番号62/632,960、および2018年4月5日に出願された米国仮出願番号62/653,261に対する、35U.S.C.§119下における優先権の利益を主張し、これらの各々の全内容は、本明細書において参照として組み込まれる。

背景技術

0002

発明の分野
本発明は、移植対象からの試料中のドナー特異的核酸の量を評価するための方法および組成物に関する。かかる量は、移植の後の対象の特定の状態、例えば、移植された臓器の状態または疾患に関連するリスク、例えば、心臓同種移植片脈管障害もしくは心停止細胞性拒絶グレードもしくは細胞性拒絶グレードに関連するリスク、抗体媒介性拒絶もしくは抗体媒介性拒絶に関連するリスク、または細胞傷害などの移植臓器傷害、もしくは細胞の傷害などの移植臓器傷害に関連するリスクを評価するために用いることができる。本発明は、さらに、前述のものなどの多様な状態の評価のために、多重最適化ミスマッチ増幅(multiplexed optimized mismatch amplification:MOMA)および/または配列決定技術を用いて、ドナー特異的セルフリーデオキシリボ核酸の量を評価するための方法および組成物に関する。

0003

発明の要旨
本開示は、少なくとも部分的に、臓器移植の後の対象における特定の状態、例えば、心臓同種移植片脈管障害、心停止、細胞性拒絶、細胞の傷害、および/または抗体媒介性拒絶のリスクを、対象のドナー特異的セルフリーDNAレベルを用いて予測または評価することができるという驚くべき発見に基づく。試料中のドナー特異的セルフリーDNAを定量するための多様な手段のいずれか1つを用いて、心臓同種移植片脈管障害、心停止、細胞性拒絶、抗体媒介性拒絶、移植臓器傷害に関連するリスク、および/またはこれらに関連するリスクを、経時的に、決定すること、ならびにこれらをモニタリングすることができる。

0004

本明細書において提供されるのは、かかる決定に関する方法、組成物およびキットである。方法、組成物、またはキットは、それぞれ、本明細書において提供される方法、組成物、またはキットのいずれか1つであってよく、これは、例または図面のもののいずれか1つを含む。
提供される方法のいずれか1つの一態様において、方法は、対象から試料を得ることをさらに含む。

0005

一態様において、本明細書において提供される方法についての態様のいずれか1つは、提供される組成物、キットまたはレポートのいずれか1つについての態様であってよい。一態様において、本明細書において提供される組成物、キットまたはレポートについての態様のいずれか1つは、本明細書において提供される方法のいずれか1つについての態様であってよい。
一側面において、本明細書において提供される量の1つ以上を含む、レポートまたはデータベースが提供される。

0006

一側面において、CR1以上の細胞性拒絶グレードなどの細胞性拒絶グレードまたはそのリスクを決定するための方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、本明細書において提供される方法のいずれか1つである。一側面において、CR0、CR1、CR2またはCR3の細胞性拒絶グレードまたはそのリスクを決定するための方法が提供される。別の側面において、移植対象を評価する(例えば対象が心臓同種移植片脈管障害または心停止を有するか、またはこれを有するリスクがあるか否かを決定する)ための方法が提供される。さらに別の側面において、抗体媒介性拒絶またはそのリスクを決定するための方法が提供される。さらなる態様において、移植臓器傷害(例えば細胞の傷害)またはそのリスクを評価するための方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、本明細書において提供される方法のいずれか1つである。

0007

一側面において、本明細書において提供される方法のいずれか1つが提供される。本明細書において提供される方法のいずれか1つの一態様において、本明細書において提供される状態、またはそのリスクのいずれか1つの指標である量は、本明細書において記載されるカットポイントのいずれか1つまたはその範囲である。本明細書において提供される方法のいずれか1つの一態様において、試料を得るための時間は、本明細書において記載される時間のいずれか1つである。本明細書において提供される方法のいずれか1つの一態様において、対象は、本明細書において記載される対象のいずれか1つである。

0008

一側面において、全セルフリーDNAおよび/もしくはドナー特異的セルフリーDNAの量または本明細書において提供される分析の方法のいずれか1つに基づいて、対象を処置する、対象のための処置レジメンを決定する、または対象に対する処置についての情報を提供する方法が提供される。かかる方法のいずれか1つの一態様において、方法は、対象を処置するステップ、または対象に対する処置についての情報を提供するステップを含む。処置の方法のいずれか1つの一態様において、処置は、本明細書において提供される処置のいずれか1つであってよい。処置の方法のいずれか1つの一態様において、処置は、本明細書において提供される状態のいずれか1つのためのものである;その例は、本明細書において提供されるか、さもなければ当業者に公知である。
一側面において、本明細書において提供される方法のいずれか1つは、心臓移植対象などの移植対象を処置する方法であってよい。

0009

添付の図面は、原寸において描写されることは意図されていない。図面は、単なる説明であり、本開示の実施可能用件のために必要とされるものではない。

図面の簡単な説明

0010

図1は、MOMAプライマーの例示的な非限定的な図を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応PCRアッセイにおいて、SNV Aを含む配列の伸長が起こることが期待され、これはSNV Aの検出がもたらし、これはその後定量することができる。しかし、SNV Bの伸長は、二重ミスマッチに起因して起こらないと期待される。
図2は、再構築実験からの結果を示す。
図3は、ドナーの遺伝子型を予測するための期待値最大化の使用を示す。破線=第1の反復(first iteration)、実線=第2の反復(second iteration)、最終コール(Final call)=10%。
図4は、ドナーの遺伝子型を予測するための期待値最大化の使用を示す。最終コール(Final call)=5%。再構築実験からの結果を示す。
図5は、ドナー遺伝子型を予測する能力を示す再構築実験データを提供する。データは、95のSNV標的のセットにより作製した。

0011

図6は、これによりいくつかの態様を作動させることができるコンピューターシステムの例を説明する。
図7は、細胞性グレード2(以上)の拒絶カットポイントの閾値(カットポイント)を決定するための異なる方法の感度および特異度を示すグラフを含む。方法1および方法2(上の行)は、移植患者からのドナー特異的セルフリーDNA(cf−DNA)を用いて示す。
図7は、細胞性グレード2(以上)の拒絶カットポイントの閾値(カットポイント)を決定するための異なる方法の感度および特異度を示すグラフを含む。方法1および方法2(上の行)は、移植患者からのドナー特異的セルフリーDNA(cf−DNA)を用いて示す。
図8は、ドナー特異的cf−DNAおよび2つの異なる方法を用いた、CR0およびCR1(上の行)、ならびにCR0およびCR2(下の行)についての閾値(「カットポイント」)の実験による決定を示す。
図8は、ドナー特異的cf−DNAおよび2つの異なる方法を用いた、CR0およびCR1(上の行)、ならびにCR0およびCR2(下の行)についての閾値(「カットポイント」)の実験による決定を示す。
図9は、MOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、CR0についての閾値の実験による決定を示す。
図10は、MOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、CF0についての閾値の実験による決定を示す。

0012

図11は、異なる方法のMOMA(ドナー遺伝子型情報ありおよびなし)の結果の比較を示す。
図12は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、細胞性拒絶グレード2(CR2)についての閾値点の実験による決定を示す。
図13は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、細胞性拒絶グレード2(CR2)についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。
図14は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード2(CR2)についての閾値点の実験による決定を示す。
図15は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード2(CR2)についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。

0013

図16は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、細胞性拒絶グレード2(CR2)についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
図17は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード2(CR2)についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
図18は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード2(CR2)についての閾値点の実験による決定を示す。
図19は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード2(CR2)についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
図20は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、細胞性拒絶グレード1(CR1)についての閾値点の実験による決定を示す。

0014

図21は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、細胞性拒絶グレード1(CR1)についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、除外した。
図22は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、細胞性拒絶グレード1(CR1)についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。
図23は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード1(CR1)についての閾値点の実験による決定を示す。
図24は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード1(CR1)についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、除外した。
図25は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード1(CR1)についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。

0015

図26は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、細胞性拒絶グレード0(CR0)についての閾値点の実験による決定を示す。
図27は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、細胞性拒絶グレード0(CR0)についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、除外した。
図28は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、細胞性拒絶グレード0(CR0)についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。
図29は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード0(CR0)についての閾値点の実験による決定を示す。
図30は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード0(CR0)についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、除外した。

0016

図31は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、細胞性拒絶グレード0(CR0)についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。
図32は、実験により決定された抗体媒介性拒絶(グレード0対グレード1または2)についての閾値(カットポイント)を表す2つのグラフを示す。
図32は、実験により決定された抗体媒介性拒絶(グレード0対グレード1または2)についての閾値(カットポイント)を表す2つのグラフを示す。
図33は、MOMA(既知のドナー遺伝子型)を用いた、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント(閾値)の実験による決定を示すグラフである。
図34は、MOMA(既知のドナー遺伝子型)を用い、機械的サポートを受けている対象からの試料を除外した、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント(閾値)の実験による決定を示すグラフである。
図35は、MOMA(既知のドナー遺伝子型)および各々の対象からの最後の試料を用いた、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント(閾値)の実験による決定を示すグラフである。

0017

図36は、MOMA(ドナー遺伝子型不明)用いた、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント(閾値)の実験による決定を示すグラフである。
図37は、MOMA(ドナー遺伝子型不明)用い、機械的サポートを受けている対象からの試料を除外した、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント(閾値)の実験による決定を示すグラフである。
図38は、MOMA(ドナー遺伝子型不明)および各々の対象からの最後の試料を用いた、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント(閾値)の実験による決定を示すグラフである。
図39は、2つの異なる方法(上の行)によるドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)を用いた、心臓同種移植片脈管障害のカットポイント(閾値)の実験による決定を示す。
図39は、2つの異なる方法(上の行)によるドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)を用いた、心臓同種移植片脈管障害のカットポイント(閾値)の実験による決定を示す。
図40は、2つの異なる方法(上の行)によるドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)を用いた、心停止のカットポイント(閾値)の実験による決定を示す。
図40は、2つの異なる方法(上の行)によるドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)を用いた、心停止のカットポイント(閾値)の実験による決定を示す。

0018

図41は、214の試料を用いてMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
図42は、機械的サポートを受けている対象からの試料を除外してMOMA(ドナー遺伝子型情報あり)を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
図43は、214の試料を用いてMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
図44は、機械的サポートを受けている対象からの試料を除外してMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
図45は、各々の対象から得られた最後の試料(N=79)を用いてMOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。

0019

図46は、MOMA(ドナー遺伝子型情報なし)を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
図47は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型あり)を用いた、心停止についての閾値の実験による決定を示す。
図48は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型あり)を用いた、心停止についての閾値の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
図49は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(ドナー遺伝子型あり)を用い、各々の対象から得られた最後の試料を用いた、心停止についての閾値の実験による決定を示す。
図50は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(既知のドナー遺伝子型なし)を用いた、心停止についての閾値の実験による決定を示す。

0020

図51は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(既知のドナー遺伝子型なし)を用いた、心停止についての閾値の実験による決定を示し、機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
図52は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(既知のドナー遺伝子型なし)を用いる、各々の対象から得られた最後の試料を用いての、心停止についての閾値の実験による決定を示す。
図53は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(既知のドナー遺伝子型なし)を用いる、心停止についての閾値の実験による決定を示す。
図54は、ドナー特異的cf−DNAおよびMOMA(既知のドナー遺伝子型なし)を用いる、心停止についての閾値の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料を、分析から除外した。
図55は、プレ生検(pre-biopsy)およびポスト生検(post-biopsy)のドナー特異的画分(DF)セルフリーDNA(cf−DNA)の%の増大を示す。

0021

図56は、プレ生検およびポスト生検の血漿1mLあたりのドナーゲノム当量(GE)の増大を示す。
図57は、全試料においてMOMA(既知のドナー遺伝子型によるもの)を用いた、CR1/2/3およびCR0の実験による識別を示す。
図58は、MOMA(既知のドナー遺伝子型によるもの)を用いた、CR1/2/3およびCR0の実験による識別を示す。CR0を有する健常試料は、以下のいずれをも有さないものであった:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、およびがん
図59は、対象1人あたり1つの試料を用いてMOMA(既知のドナー遺伝子型によるもの)を用いた、CR1/2/3およびCR0の実験による識別を示す。CR1/2/3群の第1の拒絶を試料として用い、「健常」群の各々のメンバーからの第1の試料を用いた。
図60は、血漿試料を用いてMOMA(既知のドナー遺伝子型によるもの)を用いた、CR1/2/3およびCR0の実験による識別を示す。CR0を有する健常試料は、以下のいずれをも有さないものであった:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、およびがん。

0022

図61は、健常な対象(以下のいずれをも有さないもの:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、およびがん)からの全血試料を用いてMOMA(既知のドナー遺伝子型によるもの)を用いた、CR1/2/3およびCR0の実験による識別を示す。
図62は、全試料においてMOMA(不明なドナー遺伝子型によるもの)を用いた、CR1/2/3およびCR0の実験による識別を示す。
図63は、MOMA(不明なドナー遺伝子型によるもの)を用いた、CR1/2/3およびCR0の実験による識別を示す。CR0を有する健常試料は、以下のいずれをも有さないものであった:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、およびがん。
図64は、MOMA(不明なドナー遺伝子型によるもの)を用い、対象1人あたり1つの試料を用いた、CR1/2/3およびCR0の実験による識別を示す。CR1/2/3群の第1の拒絶を試料として用い、「健常」群の各々のメンバーからの第1の試料を用いた。
図65は、血漿試料を用いてMOMA(不明なドナー遺伝子型によるもの)を用いた、CR1/2/3およびCR0の実験による識別を示す。CR0を有する健常試料は、以下のいずれをも有さないものであった:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、およびがん。

0023

図66は、全血試料を用いてMOMA(不明なドナー遺伝子型によるもの)を用いた、CR1/2/3およびCR0の実験による識別を示す。CR0を有する健常試料は、以下のいずれをも有さないものであった:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、およびがん。
図67は、MOMA(既知のドナー遺伝子型によるもの)を行った試料についてのデータ分布を説明する模式図である。ドナー画分について利用可能な1133の試料データが存在した。
図68は、MOMA(不明なドナー遺伝子型によるもの)を行った試料についてのデータ分布を説明する模式図である。ドナー画分について利用可能な1204の試料データが存在した。
図69は、方法1(既知のドナー遺伝子型によるもの;左のグラフ)により、および方法2(不明なドナー遺伝子型によるもの;右のグラフ)により、DFcfDNAの、細胞性拒絶(CR)グレード(CR0対CR1またはCR2)との関連を、受信者動作特性(ROC)曲線により示す、2つのグラフを含む。

実施例

0024

発明の詳細な説明
ドナー特異的cf−DNA(DS cf−DNA)またはドナー画分(DF)cf−DNAが、特定の状態、例えば、心臓同種移植片脈管障害、心停止、細胞性拒絶、移植臓器傷害(例えば細胞の傷害)、および抗体媒介性拒絶と相関し、これらの各々は、組み合わせて、または別々に、結果として、対象を評価および/またはモニタリングするために用いることができることを見出した。したがって、本開示の側面は、少なくとも部分的に、細胞性拒絶、抗体媒介性拒絶、移植臓器傷害(例えば細胞の傷害)、心臓同種移植片脈管障害および/または心停止、またはこれらに関連するリスクのグレードを評価または決定するために、試料中のDS cf−DNAを定量する方法に関する。

0025

本明細書において用いられる場合、「ドナー特異的核酸」とは、移植レシピエントにおいて見出すことができる、移植ドナーからのものである核酸を指す。かかる核酸は、好ましくは、セルフリーDNAである。「セルフリーDNA」(またはcf−DNA)とは、細胞の外側、例えば対象の血液、血漿、血清、尿などにおいて存在するDNAである。本明細書において用いられる場合、本明細書において提供される組成物および方法は、移植レシピエント中に見出すことができるドナーに特異的なセルフリーDNAの量、またはドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)を決定するために用いることができる。本明細書において用いられる場合、「移植」は、レシピエントの損傷を受けたかまたは欠損している臓器または組織を置き換えることを目的として、ドナーからレシピエントに臓器または組織を移動することを指す。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つは、臓器または組織の移植を受けた対象からの試料に対して用いてもよい。いくつかの態様において、移植は、心臓移植である。

0026

対象は、任意の年齢のものであってよい;しかし、いくつかの態様において、対象は、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1未満である。別の態様において、対象は、24歳以上、例えば、26、28、30、32、34、36、38、40、45、50、55、60、65、70、75または80歳以上である。対象は、任意の体重のものであってよい;しかし、いくつかの態様において、対象は、30kg未満、例えば、28、26、24、22、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11または10kg未満である。一態様において、対象は、16歳未満である。他の態様において、対象は、30kg以上、例えば、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100kg以上である。一態様において、対象は、体重20kg未満である。

0027

重要なことに、DS cf−DNAの量は、低いグレードの細胞性拒絶をも含む移植拒絶のグレードを評価または決定するために用いることができる。本明細書において提供される場合、CR2以下の細胞性拒絶グレードを有するか、またはこれを有することが疑われる対象を評価するために、方法のいずれか1つを用いることができる。また、本明細書において提供される場合、CR2以上の細胞性拒絶グレードを有するか、またはこれを有することが疑われる対象を評価するために、方法のいずれか1つを用いることができる。DS cf−DNAの量はまた、心臓同種移植片脈管障害および/または心停止、またはそのリスクを評価または決定するために、用いることができる。本明細書において提供される場合、方法のいずれか1つを、心臓同種移植片脈管障害および/または心停止を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある対象を評価するために用いることができる。加えて、DS cf−DNAの量は、抗体媒介性拒絶を評価または決定するために、用いることができる。本明細書において提供される場合、方法のいずれか1つを、抗体媒介性拒絶を有するか、またはこれを有することが疑われる対象を評価するために用いることができる。DS cf−DNAの量はまた、移植臓器傷害、例えば細胞の傷害(生検の後のものなど)を評価または決定するために、用いることができる。本明細書において提供される場合、方法のいずれか1つを、移植臓器傷害を有するか、またはこれを有することが疑われる対象を評価するために、用いることができる。本明細書において用いられる場合、「有することが疑われる」とは、それにより対象が特定の状態、例えば特定の細胞性拒絶グレード、心臓同種移植片脈管障害、抗体媒介性拒絶、移植臓器傷害(例えば細胞の傷害)を有する可能性が存在すると医師信じる対象を指す。

0028

本明細書において提供される方法のいずれか1つの一態様において、対象は、本明細書において提供されるグレードのいずれか1つの細胞性拒絶を有するもの、または本明細書において提供される拒絶のグレードのいずれか1つを有する可能性が存在すると医師が信じるものであってよい。かかる対象は、細胞性拒絶グレードの症状(および/またはその不在)に基づいて、特定のグレードの細胞性拒絶を有することが疑われるものであってもよい。しかし、いくつかの態様において、対象は、1つ以上の他の検査により、例えば生検により、特定のグレードの拒絶を有すると決定されているものである。

0029

本明細書において提供される方法のいずれか1つの一態様において、対象は、心臓同種移植片脈管障害および/または心停止を有するか、これを有したことがあるもの、あるいは、心臓同種移植片脈管障害および/または心停止を有する可能性が存在すると医師が信じるものであってよい。かかる対象は、症状(および/またはその不在)に基づいて、心臓同種移植片脈管障害および/または心停止を有することが疑われるか、またはその可能性があるものであってよい。しかし、いくつかの態様において、前述のものは、1つ以上の他の検査に基づくもの、例えば生検によるものであってもよい。

0030

本明細書において提供される方法のいずれか1つの一態様において、対象は、抗体媒介性拒絶を有するもの、または、抗体媒介性拒絶を有する可能性が存在すると医師が考えるものであってよい。かかる対象は、抗体媒介性拒絶の症状(および/またはその不在)に基づいて、抗体媒介性拒絶を有することが疑われるものであってよい。しかし、いくつかの態様において、対象は、1つ以上の他の検査により、例えば生検により、抗体媒介性拒絶を有することが決定されたものである。

0031

本明細書において提供される方法のいずれか1つの一態様において、対象は、本明細書において提供されるような移植された臓器に対する傷害を有するもの、または本明細書において提供されるような移植された臓器に対する傷害を有する可能性が存在すると医師が考えるものであってよい。かかる対象は、傷害の症状(および/またはその不在)に基づいて、移植臓器に対する傷害を有することが疑われるものであってもよい。しかし、いくつかの態様において、対象は、1つ以上の他の検査により、例えば生検により、またはさらなる生検により、移植された臓器に対する傷害を有することが決定されたものである。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、状態の悪化または改善について、かかる知見を確認するか、またはかかる対象をモニタリングするために用いることができる。

0032

細胞性拒絶は、国際心肺移植学会(International Society for Heart and Lung Transplantation:ISHLT)のグレード付けスキームに従うもののように、CR0、CR1、CR2またはCR3として、グレードにより分類することができる。例示的なグレード付けスキームを、以下に提供する。

0033

対象は、DS cf−DNAの1つ以上の量を決定するかまたはこれを得ることにより、評価することができる。DS cf−DNAの量は、本明細書において別の場所で提供されるものなどの実験技術を用いて決定することができる。「得ること」とは、本明細書において用いられる場合、それによりそれぞれの情報または材料を得ることができる任意の方法を指す。したがって、それぞれの情報は、実験方法により得ることができる。それぞれの材料は、いくつかの態様において、多様な実験または研究方法を用いて作製、設計などを行うことができる。それぞれの情報または材料はまた、レポートなどの情報、または材料を与えられるかまたはこれを提供されることにより得ることができる。いくつかの態様において、材料は、商業的手段を通して(すなわち、購入することにより)与えられるかまたは提供されてもよい。

0034

DS cf−DNAなどのドナー特異的核酸の量を決定する能力、ならびに細胞性拒絶グレード、心臓同種移植片脈管障害、心停止、抗体媒介性拒絶、および移植臓器傷害(例えば細胞の傷害)との相関に起因して、本明細書において提供される方法および組成物は、本明細書において提供されるように対象を評価するために用いることができる。したがって、拒絶の状態を改善するかまたは悪化させるリスクを、かかる対象において決定することができる。「リスク」とは、本明細書において提供される場合、対象における任意の望ましくない状態の存在または不在または進行、またはかかる状態の存在または不在または進行の可能性の増大を指す。本明細書において提供される場合、「リスクの増大」とは、対象における任意の望ましくない状態の存在または進行、またはかかる状態の存在または進行の可能性の増大を指す。本明細書において提供される場合、「リスクの低下」とは、対象における任意の望ましくない状態または進行の不在、またはかかる状態の存在または進行(または不在または非進行の可能性の増大)の可能性の低下を指す。

0035

本明細書において提供される場合、細胞性拒絶、心臓同種移植片脈管障害、心停止、抗体媒介性拒絶、および/または移植臓器傷害(例えば細胞性拒絶)状態の早期の検出またはモニタリングにより、処置を容易にして臨床成績を改善することができる。上述のとおり、提供される方法のいずれか1つは、本明細書において提供されるような対象に対して行うことができる。かかる方法は、対象を、処置と共に、または処置することなく、経時的にモニタリングするために用いることができる。さらに、かかる方法は、処置または治療の選択、投与および/またはモニタリングを補助することができる。したがって、本明細書において提供される方法は、処置またはモニタリングのレジメンを決定するために用いることができる。

0036

「処置レジメンを決定すること」、本明細書において用いられる場合、臨床的に処置可能な拒絶を起こしている対象のための行為のコースの決定を指す。本明細書において提供される方法のいずれか1つの一態様において、処置レジメンを決定することは、適切な治療を決定することまたは対象に提供するべき適切な治療に関する情報を提供することを含む。本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、決定することは、対象に対する適切な治療に関して適切な治療または情報を提供することを含む。本明細書において用いられる場合、処置または治療またはモニタリングに関する情報は、書面の形態または電子形態において提供されてもよい。いくつかの態様において、情報は、コンピューター可読の指示として提供されてもよい。いくつかの態様において、情報は、口頭で提供されてもよい。

0037

治療は、例えば細胞性拒絶を処置するためのもの、例えば抗拒絶反応治療であってよい。抗拒絶反応治療として、例えば免疫抑制剤が挙げられる。免疫抑制剤として、これらに限定されないが、以下が挙げられる:副腎皮質ステロイド(例えば、プレドニゾロンまたはヒドロコルチゾン)、糖質コルチコイド細胞分裂阻害剤アルキル化剤(例えば、ナイトロジェンマスタードシクロホスファミド)、ニトロソウレア白金化合物、シクロホスファミド(Cytoxan))、代謝拮抗薬(例えば、メトトレキサートなどの葉酸アナログアザチオプリンおよびメルカプトプリンなどのプリンピリミジンアナログ、およびタンパク質合成阻害剤)、細胞傷害性抗生物質(例えば、ダクチノマイシンアントラサイクリンマイトマイシンCブレオマイシンミトラマイシン)、抗体(例えば、抗CD20、抗IL−1、抗IL−2Rアルファ、抗T細胞または抗CD−3モノクローナルおよびポリクローナル、例えばAtgamおよびサイモグロブリン)、イムノフィリンに作用する薬物、シクロスポリンタクロリムスシロリムスインターフェロンオピオイド、TNF結合タンパク質ミコフェノール酸フィンゴリモドおよびミリオシン。いくつかの態様において、抗拒絶反応治療は、血液移植(blood transfer)または骨髄移植を含む。治療はまた、静脈内注射流体(intravenous fluid)、抗生物質、外科排膿法、早期目標指向型治療(early goal directed therapy:EGDT)、昇圧剤ステロイド活性化タンパク質C、ドロトレコギンアルファ活性化型)、酸素および臓器不全のための適切なサポートを含んでもよい。これは、腎不全における血液透析肺機能不全における人工呼吸血液製剤輸血、ならびに循環不全における薬物および輸液療法を含んでもよい。適切な栄養を確保すること(好ましくは経腸栄養により、しかし必要な場合には非経口栄養により)もまた、長期の疾病の間には特に含まれ得る。他の関連する治療は、インスリンならびに深部静脈血栓症および胃潰瘍を予防するための医薬を含んでもよい。他のかかる治療は、当業者には公知である。

0038

治療は、例えば、抗体媒介性拒絶を処置するためのものであってよい。抗体媒介性拒絶治療として、例えば、免疫抑制剤、プラスマフェレーシス血漿交換免疫グロブリン静注、副腎皮質ステロイド、抗リンパ球抗体および脾摘出術が挙げられる。

0039

心臓同種移植片脈管障害治療として、例えば、再移植経皮的冠動脈形成術PCI)、冠動脈バイパス移植術(CABG)、経心筋レーザー血行再建術および/またはヘパリン誘導性/媒介性体外LDLプラスマフェレーシス(HELP)、ならびにスタチン降圧剤、および/または抗サイトメガロウイルス(抗CMV)剤の投与が挙げられる。

0040

心停止が示される症例のための治療として、これらに限定されないが、経皮的冠動脈形成術(冠動脈形成術)、冠動脈バイパス形成術、または植込み型除細動器ICD)の付加が挙げられる。さらなる治療として、これらに限定されないが、抗不整脈剤不随意神経系遮断薬または血圧の医薬が挙げられる。さらに、対象に、冠動脈カテーテルおよび/または心臓除細動器(cardioverter-defibrillator)を移植してもよい。

0041

治療は、例えば、臓器傷害を処置するためのものであってよく、単独で、または抗拒絶療法などの移植合併症に関連する他の治療と組み合わせて用いてもよい。抗拒絶療法として、例えば、免疫抑制剤(上記)が挙げられる。
他のかかる治療は、当業者に公知である。

0042

処置または治療の投与は、当該分野において公知の任意の方法により達成することができる(例えば、Harrison’s Principle of Internal Medicine, McGraw Hill Inc.を参照)。好ましくは、処置または治療の投与は、治療有効量において起こる。投与は、局所性または全身性であってよい。投与は、非経口(例えば、静脈内、皮下、または皮内)または経口であってよい。投与の様々な経路のための組成物は、当該分野において公知である(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinを参照)。

0043

処置および臨床経過は、対象の細胞性拒絶グレードおよび/または関連する期待される結果により決定することができる。例えば、DS cf−DNAの量が0.8以上である場合、CR2以上の細胞性拒絶グレードが示され、対象は、上記のもののように、抗拒絶反応治療により処置されるか、またはそれに関連する情報を提供され得る。別の例として、DS cf−DNAの量が0.2または0.3と等しいかまたはこれらより高い場合、心臓同種移植片脈管障害および/または心停止が示され得、対象は、上記のもののように、治療により処置されるか、またはそれに関連する情報を提供され得る。いくつかの態様において、DS cf−DNAの量が0.2以上である場合、抗体媒介性拒絶が示され得、対象を上記のもののような抗拒絶療法により処置するか、または対象にそれらに関する情報を提供してもよい。

0044

「モニタリングのレジメンを決定すること」とは、本明細書において用いられる場合、対象における状態を経時的にモニタリングするために行為のコースを決定することを指す。本明細書において提供される方法のいずれか1つの一態様において、モニタリングのレジメンを決定することは、経時的に、またはその後の時点において、対象におけるDS cf−DNAの量を決定するため、またはかかるモニタリングを対象に提案するための、行為の適切なコースを決定することを含む。このことは、臨床状態におけるバリエーションの測定を可能にし得るか、および/または、正常値または基線レベルの計算(ならびにそれらとの比較)を可能にし得る。本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様においてモニタリングのレジメンを決定することは、対象から試料を得るタイミングおよび/もしくは頻度を決定すること、ならびに/またはDS cf−DNAの量を決定するかもしくはこれを得ることを含む。

0045

本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、DS cf−DNAは、移植手術の4日後には早くも、検出することができる。他の態様において、DS cf−DNAは、移植の5、6、7または8日後、またはそれより後に定量してもよい。対象のDS cf−DNAレベルをモニタリングするために、試料は、1ヵ月ごと、2ヵ月ごと、またはより頻繁な間隔において、6ヵ月まで、8ヵ月まで、10ヵ月まで、12ヵ月まで、またはそれより長くにわたり、採取してもよい。

0046

移植臓器傷害の場合、本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、DS cf−DNAレベルは、傷害の1分後には早くも検出することができる。他の態様において、DS cf−DNAは、傷害の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60分後に定量してもよい。別の態様において、DS cf−DNAは、傷害の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10時間後に定量してもよい。対象のDS cf−DNAレベルをモニタリングするために、試料は、1ヵ月ごと、2ヵ月ごと、またはより頻繁な間隔において、6ヵ月まで、8ヵ月まで、10ヵ月まで、12ヵ月まで、またはそれより長くにわたり、採取してもよい。

0047

DS cf−DNAのレベルの増大は、リスクの増大と相関することが見出されたことから、医師は、対象のDS cf−DNAおよび/または全cf−DNAが複数の時点の間で増大することが見出される場合、より頻繁な試料採取を受けるべきであることを決定することができる。対象が、複数の時点の間で低下しているDS cf−DNAのレベルを有することが見出される場合、医師は、より頻度が低い試料採取が十分であることを決定することができる。モニタリングのタイミングおよび/または頻度はまた、1つ以上の閾値との比較によっても決定することができる。例えば、DS cf−DNAの量が、0.1、0.2または0.3(または本明細書において提供される閾値のいずれか1つ)と等しいかまたはこれより高い、および/または増大中である場合、より頻繁な試料採取が必要であり得るが、一方、DS cf−DNAの量が、0.1、0.2または0.3(または本明細書において提供される閾値のいずれか1つ)より低く、および/または増大中ではない場合、より頻度が低い試料採取が必要とされ得る。一般に、より高いかまたは増大中のDS cf−DNAの量を有する対象は、より近いモニタリングおよびより頻繁な試料採取を必要とする。本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、各々の量および時点は、レポートにおいて、またはデータベースにおいて、記録することができる。

0048

本明細書において提供されるような値のいずれか1つ以上によるレポートがまた、一側面において提供される。レポートは、口頭、書面(またはハードコピー)、または電子形態におけるもの、例えば可視化または表示することができる形態におけるものであってよい。好ましくは、レポートは、試料中のドナー特異的な核酸の量を提供する。いくつかの態様において、レポートは、対象からの試料中のドナー特異的な核酸の量を経時的に提供してもよい。

0049

いくつかの態様において、量は、データベース中にあるか、またはデータベース中に入力される。一側面において、かかる量および/または値を有するデータベースが提供される。量から、医師は、対象の処置またはモニタリングの必要性を評価することができる。したがって、本明細書において提供される方法のいずれか1つにおいて、方法は、1つより多くの時点において対象における核酸の量を評価することを含んでもよい。かかる評価は、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つにより行うことができる。

0050

本明細書において用いられる場合、「量」とは、任意の定量的値を指し、絶対量または相対量において示され得る。さらに、量は、合計量、頻度、比、パーセンテージなどであってもよい。本明細書において用いられる場合、「レベル」という用語は、「量」の代わりに用いることができるが、同じ型の値を指すことが意図される。一般に、別段に提供されない限り、本明細書において提供される量は、試料中の、合計に対して相対的なDS cf−DNAの比またはパーセンテージを表す。

0051

いくつかの態様において、本明細書において提供される方法のいずれか1つは、リスクが増大または低下した対象を同定するために、ドナー特異的核酸の量を閾値と、または1つ以上の前の量と比較することを含んでもよい。本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、閾値と、または1つ以上の前の量と比較してドナー特異的核酸の量が高い対象は、リスクが増大したものとして同定される。本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、閾値と、または1つ以上の前の量と比較してドナー特異的核酸の量が低いか同様の対象は、リスクが低下したか増大していないものとして同定される。

0052

「閾値」または「閾値」または「カットポイント」とは、本明細書において用いられる場合、状態の存在もしくは不在、またはリスクの存在もしくは不在の指標でとなる、任意の予め決定されたレベルまたはレベルの範囲を指す。閾値は、多様な形態をとってよい。それは、中央値または平均値などの単一のカットオフ値であってもよい。それは、例えば1つの規定群におけるリスクが、別の規定群におけるリスクの2倍となる場合などには、閾値は、比較群に基づいて確立してもよい。それは、例えば、検査集団を、等分に(または不等分に)群に、低リスク群、中リスク群および高リスク群に、または四分位に(最も低い四分位は、最も低いリスクを有する対象であり、最も高い四分位は、最も高いリスクを有する対象である)分ける場合には、閾値は、範囲であってもよい。閾値は、選択された特定の集団に依存し得る。例えば、見かけ上健常な集団は、異なる「正常」範囲を有するであろう。別の例として、閾値を、状態もしくはリスクが存在する前に、または処置の経過の後に、基線値から決定することができる。かかる基線は、それについて検査がなされているリスクまたは状態と相関しない、対象における正常または他の状態の指標となり得る。いくつかの態様において、閾値は、検査されている対象の基線値であってよい。したがって、選択された予め決定された値は、対象が該当するカテゴリーを考慮し得る。当業者は、慣用的な実験のみを用いて、適切な範囲およびカテゴリーを選択することができる。本明細書において提供される方法、レポート、データベースなどのいずれか1つの閾値は、本明細書において提供される閾値のいずれか1つ、例えば例または図面におけるものであってよい。

0053

本明細書において提供される閾値は、対象にとっての細胞性拒絶グレードを決定するか、またはこれを対象に当てはめるために用いることができる。したがって、測定されたDS cf−DNAの量が0.2未満である場合、対象を、CR0の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。測定されたDS cf−DNAの量が、0.15未満である場合、対象を、CR0の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。量が0.15〜0.8である場合、対象を、CR1の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。量が0.15〜0.8であるが0.8未満である場合、対象を、CR1の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。量が0.2〜0.8である場合、対象を、CR1の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。量が、0.2〜0.8であるが0.8未満である場合、対象を、CR1の細胞性拒絶グレード当てはめることができる。量が0.25または0.3〜0.75または0.8であるが0.75または0.8未満である場合、場合、対象を、CR1の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。量が0.8または0.9以上である場合、対象を、CR2以上の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。拒絶グレードの指定は、本明細書において提供されるような比較のいずれか1つに基づいて、かかるグレードの他の指標を用いてまたはこれを用いずに、行うことができる。

0054

本明細書において提供される閾値はまた、対象における心臓同種移植片脈管障害および/または心停止を決定するために用いることができる。したがって、測定されたDS cf−DNAの量が、0.2、0.3、0.4または0.5と等しいかまたはこれより高い場合、心臓同種移植片脈管障害および/または心停止が示され得る。評価または決定は、心臓同種移植片脈管障害および/または心停止の他の指標を用いて、またはこれを用いることなく、本明細書において提供されるような比較のいずれか1つに基づいて、行うことができる。

0055

本明細書において提供される閾値はまた、対象における抗体媒介性拒絶またはこれに関連するリスクの存在または不在を決定するために用いることができる。したがって、測定されたDS cf−DNAの量が0.2未満である場合、対象が抗体媒介性拒絶を有しない可能性がある。量が0.2以上である場合、対象は、抗体媒介性拒絶を有する可能性がある。抗体媒介性拒絶の存在または不在の決定は、本明細書において提供されるような比較のいずれか1つに基づいて、かかる状態の他の指標を用いてまたはこれを用いずに、行うことができる。

0056

本明細書において提供される閾値はまた、対象が移植臓器傷害を有するか否かを決定するために用いることができる。したがって、測定されたDS cf−DNAの量が閾値より低い場合、対象は、移植臓器傷害を有さない場合がある。量が閾値より高い場合、対象は、移植臓器傷害を有し得る。また、傷害は、いくつかの態様においては、対象における、例えば基線と相対的なDS cf−DNAの増加の倍率を、試験することにより、測定することができる。分析のために、傷害の前の時点において、第1の試料を採取してもよく、傷害の後1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分以内、またはそれより後に、第2の試料を採取してもよい。2つの試料の間の増加の倍率を、決定することができる。増加の倍率が閾値よりも高い場合、それは、対象が、移植臓器傷害を有するか、またはこれを有するリスクがあることを示し得る;増加の倍率が閾値よりも低い場合、それは、対象が、移植臓器傷害を有さないか、またはこれを有するリスクがないことを示し得る。

0057

閾値はまた、処置および/またはモニタリングの決定を行うための比較のために用いることができる。例えば、DS cf−DNAの量が、0.1、0.2または0.3と等しいかまたはこれより高い、および/または経時的に増加している場合、さらなるモニタリングが示され得る。さらなる例として、量が0.8以上である場合、対象の処置が示され得る。量が、例えば0.3〜0.5、0.3〜0.6または0.3〜0.7である場合、対象のさらなる検査(生検によるものなど)が示され得る。量が、本明細書において提供される閾値のいずれか1つと等しいかまたはこれより高い場合、対象のさらなる検査(生検によるものなど)が示され得る。

0058

したがって、本明細書において提供される方法のいずれか1つは、対象を評価するためのさらなる検査、または対象にかかるさらなる検査を提案する(またはかかるさらなる検査についての情報を提供する)ステップをさらに含んでもよい。さらなる検査は、本明細書において提供される方法のいずれか1つであってよい。さらなる検査は、適宜、本明細書において提供されるかまたは当該分野において他に公知の他の方法のいずれか1つであってよい。

0059

例示的な対象のためのさらなる検査として、これらに限定されないが、心エコー冠動脈造影、血管内超音波検査(IVUS)、生検(例えば、心内膜心筋生検)、負荷心エコー、CT冠動脈造影、冠血流予備比評価(造影心エコー)、負荷心筋血流シンチグラフィーポジトロン断層撮影(PET)走査、ならびにBNPおよび/またはトロポニンなどの血清バイオマーカーの測定が挙げられる。さらなる検査の型は、対象の状態の重篤度に依存し、十分に当業者の決定能力の範囲内である。

0060

例示的なさらなる検査として、これらに限定されないが、ドナー特異的抗体HLA抗体)の存在、生検(例えば、腎生検、心内膜心筋生検)における陽性C4d染色、および抗体により媒介される傷害の病理組織学的エビデンス(例えば、糸球体炎尿細管周囲毛細血管炎、動脈炎)が挙げられる。本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、他の検査は、移植レシピエントにおけるBNPおよび/またはトロポニンのレベルの決定である。本明細書において提供される方法のいずれか1つの他の態様において、BNPおよび/またはトロポニンのレベルに加えての、またはこれに替えての他の検査は、心エコーである。さらなる検査の型は、状態、疑われる状態、またはその重篤度に依存し、十分に当業者の決定能力の範囲内である。

0061

DS cf−DNAの量は、多数の方法により決定することができる。いくつかの態様において、かかる方法は、配列決定に基づく方法である。例えば、cf−DNAは、試料のDNAを分析して複数の遺伝子座を同定することにより測定することができ、遺伝子座の各々のアレルを決定してもよく、決定されたアレルに基づいてインフォーマティブな遺伝子座を選択してもよい。本明細書において用いられる場合、「遺伝子座」とは、核酸中のヌクレオチドの位置、例えば、染色体上または遺伝子中のヌクレオチドの位置を指す。本明細書において用いられる場合、「インフォーマティブな遺伝子座」とは、対象の遺伝子型がメジャーアレルについてホモ接合型であり、一方、ドナーの遺伝子型がマイナーアレルについてホモ接合型またはヘテロ接合型である遺伝子座を指す。本明細書において用いられる場合、「マイナーアレル」とは、ある遺伝子座について核酸の集団において頻度がより低いアレルを指す。いくつかの態様において、マイナーアレルは、ドナーの核酸中での当該遺伝子座におけるヌクレオチド同一性である。一方、「メジャーアレル」とは、集団においてより頻繁なアレルを指す。いくつかの態様において、メジャーアレルは、対象の核酸中での当該遺伝子座におけるヌクレオチド同一性である。

0062

いくつかの態様において、インフォーマティブな遺伝子座およびアレルは、対象の核酸およびドナーの核酸の前の遺伝子型判定に基づいて決定することができる。例えば、レシピエントおよびドナーの遺伝子型を比較して、インフォーマティブな遺伝子座を、あるヌクレオチド同一性についてレシピエントがホモ接合型であり、異なるヌクレオチド同一性についてドナーがヘテロ接合型またはホモ接合型である遺伝子座として同定することができる。遺伝子型判定のための方法は、当該分野において周知であり、本明細書においてさらに記載される。この例において、マイナーおよびメジャーアレルは、インフォーマティブな遺伝子座における各々のアレルの相対量を決定することにより同定してもよく、および/または、ドナーDNA(マイナーアレル)およびレシピエントDNA(メジャーアレル)中のインフォーマティブな遺伝子座におけるヌクレオチド同一性として同定してもよい。したがって、提供される方法は、レシピエントおよびドナーを遺伝子型判定するステップ、またはかかる遺伝子型を得るかまたはこれらを提供されるステップを、さらに含んでもよい。

0063

インフォーマティブな遺伝子座における推定アレル頻度(推定されるマイナーアレル頻度など)を、次いで、好適な様式において計算することができる。いくつかの態様において、推定されるアレル頻度は、統計学的分布を用いてインフォーマティブな遺伝子座におけるアレル(マイナーアレルなど)のカウント数モデリングすることに基づいて、計算することができる。例えば、推定されるアレル頻度は、二項分布を用いてアレルのリードカウント(read count)をモデリングすることにより、計算することができる。いくつかの態様において、かかる分布ピークが決定され、これは、ドナー特異的cf−DNAのパーセントの指標である。インフォーマティブな遺伝子座におけるマイナーアレルの頻度もまた、最尤法を用いて計算することができる。いくつかの態様において、マイナーアレル頻度(MAF)は、対象の血漿DNAからの遺伝子型により計算することができ、インフォーマティブな遺伝子座についてのドナー遺伝子型は、期待値最大化を用いて推測することができる。いくつかの態様において、メジャーおよび/またはマイナーアレルについてのリードカウントは、アレル頻度を推定することに先立って訂正することができる。

0064

DNAは、任意の好適な次世代のまたはハイスループットな配列決定および/または遺伝子型判定の技術を用いて分析することができる。次世代のおよびハイスループットな配列決定および/または遺伝子型判定の技術の例として、これらに限定されないが、大規模並列シグネチャー配列決定(massively parallel signature sequencing:MPSS)、ポロニーシークエンシング(polony sequencing)、454パイロシークエンシング、Illumina(Solexa)シークエンシング、SOLiDシークエンシング、イオン半導体シークエンシング、DNAナノボールシークエンシング、ヘリスコープ(heliscope)単分子シークエンシング、単分子リアルタイムSMRT)シークエンシング、MassARRAY(登録商標)、およびDigital Analysis of Selected Regions(DANSR(商標))が挙げられる(例えば、 Stein RA(2008年9月1日)、「Next-Generation Sequencing Update」、Genetic Engineering & Biotechnology News 28(15);Quail, Michael; Smith, Miriam E; Coupland, Paul; Otto, Thomas D; Harris, Simon R; Connor, Thomas R; Bertoni, Anna; Swerdlow, Harold P; Gu, Yong(2012年1月1日)、「A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion torrent, pacific biosciences and illumina MiSeq sequencers」、BMCGenomics 13(1): 341;Liu, Lin; Li, Yinhu; Li, Siliang; Hu, Ni; He, Yimin; Pong, Ray; Lin, Danni; Lu, Lihua; Law, Maggie(2012年1月1日)、「Comparison of Next-Generation Sequencing Systems」、Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012: 1-11;Qualitative and quantitative genotypingusing single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MassARRAY(登録商標))、MethodsMol Biol. 2009;578:307-43; Chu T, Bunce K, Hogge WA, Peters DG. A novel approach toward the challenge of accurately quantifying fetal DNA in maternal plasma. Prenat Diagn 2010;30:1226-9;およびSuzuki N, Kamataki A, Yamaki J, Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. Clinica chimica acta; International Journal of Clinical Chemistry 2008;387:55-8 を参照)。

0065

一態様において、DS cf−DNAを決定するための方法のいずれか1つは、米国公開番号2015−0086477−A1の方法のいずれか1つであってよく、かかる方法は、その全体において本明細書において参考として援用される。
DS cf−DNAの量はまた、MOMAアッセイにより決定することができる。一態様において、DS cf−DNAを決定するための方法のいずれか1つは、PCT公開番号WO2016/176662A1の方法のいずれか1つであってよく、かかる方法は、その全体において本明細書において参考として援用される。

0066

DS cf−DNAは、対象の遺伝子型とドナーの遺伝子型との間の配列同一性差異を用いて決定することができる。かかる差異は、単一ヌクレオチドバリアント(SNV)であってよい;しかし、本明細書においてSNVが言及される場合は常に、レシピエント特異的核酸とドナー特異的核酸との間の配列同一性の任意の差異もまた、適用可能であると意図される。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つは、配列同一性に差異が存在する場合には、レシピエント特異的核酸、対、ドナー特異的核酸に適用することができる。本明細書において用いられる場合、「単一ヌクレオチドバリアント」とは、好ましくはいくつかの態様においては単一のヌクレオチドにおいて、その中で配列変異性が存在する核酸配列を指す。これらのSNVは、DS cf−DNAに対して特異的な、またはこれを同定することができる、任意の変異を含む。SNVのいずれか1つ以上に対して、本明細書において提供されるようにプライマーを調製することができる。

0067

その中で配列同一性の変異性が存在する核酸配列は、一般に、「標的」として言及される。本明細書において用いられる場合、「SNV標的」とは、その中で、例えば単一のヌクレオチドにおいて、配列変異性が存在する核酸配列を指す。SNV標的は、1つより多くのアレルを有し、好ましい態様において、SNV標的は、両アレル型である。ドナー特異的核酸は、NV標的に対して特異的なプライマーを用いて増幅ベースの定量アッセイ、例えば定量PCRアッセイを行うことにより、極めて低いレベルにあってすら、定量することができる。いくつかの態様において、ドナー特異的核酸の量は、複数のSNV標的に対するプライマーを用いて増幅ベースの定量アッセイ、例えば定量PCRを試みることにより決定される。「複数のSNV標的」とは、各々の標的について少なくとも2つのアレルが存在する、1つより多くのSNV標的を指す。好ましくは、いくつかの態様において、各々のSNV標的が、両アレル型であることが期待され、SNV標的の各々のアレルに対して特異的なプライマーペアを用いて各々のアレルの核酸を特異的に増幅し、ここで、特異的アレルの核酸が試料中に存在する場合には、増幅が起こる。本明細書において用いられる場合、1つのアレルは、標的配列のドナー特異的バージョンであってよく、別のアレルは、当該配列のレシピエント特異的バージョンである。

0068

本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つの一態様において、SNV標的に対する1つ以上のプライマーペアは、SNV標的がインフォーマティブであろうという知識に基づいて((例えばドナーの)遺伝子型の知識などにより)、予め選択することができる。かかる態様において、ドナーの遺伝子型は、既知であるか、または決定することができる。したがって、本明細書において提供される方法のいずれか1つは、ドナーを遺伝子型判定するステップ、またはドナーの遺伝子型を得るステップを含んでもよい。

0069

本明細書において提供される方法のいずれか1つの他の態様においては、ドナーの遺伝子型が不明である。かかる場合の一態様においては、ドナー遺伝子型は、期待値最大化法により推測することができる。一例として、既知のレシピエント遺伝子型を用いて、レシピエントにおいてホモ接合型であると知られている標的を選択することができる。任意の混入物がドナー特異的核酸に起因し得、結果として生じるアッセイのコレクションは、三峰性分布;非インフォーマティブなアッセイ、半インフォーマティブなアッセイおよび完全にインフォーマティブなアッセイからなるであろう。十分な数のレシピエントホモ接合型アッセイにより、ドナーの完全インフォーマティブなアッセイの存在を推測することができる。

0070

例えば、レシピエント遺伝子型がホモ接合型であり既知である場合、レシピエント遺伝子型と関連しない測定値(真にドナー−ホモ接合型であるもの)は、最も高いクラスターを有し、半予想値(half the guess)でしかない(半インフォーマティブ)ドナー−ヘテロ接合型であるものと比較して、予想値(guess)に等しい(完全インフォーマティブ)。次いで、確率分布プロットし、期待値最大化アルゴリズムEM)を用いてドナー遺伝子型を推測することができる。EMアルゴリズムを用いて、本明細書において提供される方法のいずれか1つにおいて、ドナー遺伝子型頻度を推測することができる。したがって、EMアルゴリズムは、全てのアッセイされたSNV標的において最も確率が高いドナー遺伝子型を推測するために用いてもよい。推測されたドナー遺伝子型を用いて、定量は、上で議論される全情報シナリオにおけるもののように進行することができる。EMは、アッセイにおいて見出されるマイナーアレル比が三峰性分布に従う(レシピエント(A)およびドナー(B)の各組み合わせ、すなわち、AA、ABおよびBBについて1つずつ)という推定において始まり得る。全ての不明なドナー遺伝子型により、ほぼゼロのマイナーアレルを示す任意のアッセイは、ドナーAA(すなわち、レシピエントアレル)であり、最高のものは、ドナーBBであるという知識からブートストラップすることが可能である。全てのドナー遺伝子型についての最初の予想値を記録してもよく、各々のクラスターの平均を計算することができる。ドナーBBアッセイの平均がドナーABのものの2倍となるように強制することは、検索を制限する。アルゴリズムは、次いで、クラスターおよびビルトイン仮説に基づいて、予想されたドナー遺伝子型を再割り当てする。プロセスは、それ以上変更が行われなくなるまでは、反復性である。最終結果は、それらの測定されたバックグラウンドからの発散(divergence)を考慮して、最も確率が高いドナー遺伝子型のセットである。一般に、全ての標的が、モデルに該当する;結果は、最大化の後の群の間にあれば、除外することができる。

0071

本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つの別の態様において、複数のSNV標的に対するプライマーペアを、少なくとも1つ(またはより多くの)がインフォーマティブであり得る可能性のために選択することができる。かかる態様において、本明細書において提供される方法のいずれか1つにおいて、SNV標的のパネルに対するプライマーペアを用いる。いくつかの態様において、SNV標的のパネルは、少なくとも30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95またはそれより多くの可能な標的のパネルである。

0072

本明細書において用いられる場合、「インフォーマティブなSNV標的」とは、本明細書において提供されるようなプライマーによる増幅が起こるものであり、その結果は、インフォーマティブである。「インフォーマティブな結果」とは、本明細書において提供される場合、試料中のドナー特異的核酸のレベルを定量するために用いることができる結果である。いくつかの態様において、インフォーマティブな結果は、「コールなし(no call)」とみなされる結果、または誤ったコール結果を除外する。提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、インフォーマティブな結果から、標準曲線を用いて、アレルパーセンテージを計算することができる。提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、ドナー特異的核酸の量は、それぞれ、ドナー特異的核酸についてのインフォーマティブな結果の間の平均を表す。

0073

ドナー特異的核酸の量は、メジャーおよびマイナーアレルの量、ならびにレシピエントの遺伝子型により決定することができる。いくつかの態様において。本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、アレルは、対象の前の遺伝子型判定に基づいて、決定することができる。遺伝子型判定のための方法は、当該分野において周知である。かかる方法は、次世代、ハイブリダイゼーションマイクロアレイ、他の分離技術またはPCRアッセイなどの配列決定法を含む。本明細書において提供される方法のいずれか1つは、かかる遺伝子型を得るステップを含んでもよい。

0074

MOMAアッセイにおける使用のためのプライマーを得てもよく、本明細書において提供される方法のいずれか1つは、PCRアッセイなどの増幅ベースの定量アッセイを行うための1つ以上のプライマーペアを得るステップを含んでもよい。一般に、プライマーは、核酸の量を定量することにおけるそれらの使用を促進するユニークな特性を有する。例えば、プライマーペアのフォワードプライマーは、3’ヌクレオチド(例えば、最後から2番目の3’ヌクレオチド)においてミスマッチを有していてもよい。提供される方法または組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、このミスマッチは、3’ヌクレオチドにおけるものであるが、SNVの位置に隣接している。提供される方法または組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、SNVの位置に対して相対的なプライマーのミスマッチの配置を、図1において示す。一般に、かかるフォワードプライマーは、3’ミスマッチを有していても、PCR反応などの増幅反応において増幅生成物を生成し(好適なリバースプライマーと組み合わせて)、それにより、それぞれのSNVによる核酸の増幅と、結果としてその検出を可能にする。特定のSNVが存在しない場合、かつSNV標的の他のアレルに関して二重ミスマッチが存在する場合、増幅生成物は、一般に、生成されないであろう。好ましくは、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、各々のSNV標的に対して、それにより各々のアレルの特異的な増幅が他のアレルの増幅を伴うことなく起こり得るプライマーペアを得る。「特異的増幅」とは、別の核酸の実質的な増幅を伴わない、またはバックグラウンドもしくはノイズより高い別の核酸配列の増幅を伴わない、標的の特異的アレルの増幅を指す。いくつかの態様において、特異的な増幅は、特異的アレルの増幅のみをもたらす。

0075

本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、両アレル型である各々のSNV標的に対して、2つのプライマーペアが存在し、各々が、2つのアレルのうちの一方に対して特異的であり、したがって、それが増幅すべきアレルに関して単一のミスマッチ、およびそれが増幅すべきではないアレル(これらのアレルの核酸が存在する場合)に関して二重ミスマッチを有する。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、ミスマッチプライマーは、フォワードプライマーである。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、各々のSNV標的に対する2つのプライマーペアのリバースプライマーは、同じである。

0076

これらの概念は、本明細書において提供される方法および組成物のいずれか1つについて、プライマーペアの設計において用いることができる。フォワードおよびリバースプライマーは、鋳型の特異的な遺伝子座のフラグメントを増幅させるために、反対の鎖(例えばセンス鎖およびアンチセンス鎖)に結合するように設計されることが理解されるべきである。プライマーペアのフォワードおよびリバースプライマーは、例えば本開示によるSNV標的のアレルの存在を検出するために、任意の好適なサイズの核酸フラグメントを増幅するように設計することができる。本明細書において提供される方法のいずれか1つは、本明細書において記載されるような1つ以上のプライマーペアを得るための1つ以上のステップを含んでもよい。

0077

本明細書において記載されるプライマーペアは、PCRアッセイなどの多重増幅ベースの定量アッセイにおいて用いてもよいことが理解されるべきである。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、プライマーペアは、PCR反応において他のプライマーペアと適合可能であるように設計される。例えば、プライマーペアは、PCR反応において、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5などの他のプライマーペアと適合可能であるように、設計されてもよい。本明細書において用いられる場合、PCR反応におけるプライマーペアは、それらが同じPCR反応においてそれらの標的を増幅することができる場合に、「適合可能である」。いくつかの態様において、プライマーペアは、当該プライマーペアが、同じPCR反応において多重化された場合に、それらの標的DNAを増幅することを、1%以下、2%以下、3%以下、4%以下、5%以下、10%以下、15%以下、20%以下、25%以下、30%以下、35%以下、40%以下、45%以下、50%以下、または60%以下、阻害される場合に、適合可能である。プライマーペアは、限定されないが、プライマーダイマーの形成および別のプライマーペアを妨害し得る鋳型上のオフターゲット部位への結合を含む多数の理由のために、適合可能ではない場合がある。したがって、本開示のプライマーペアは、他のプライマーペアとのダイマーの形成を防止するか、またはオフターゲット結合部位の数を限定するように設計されていてもよい。多重PCRアッセイにおける使用のためのプライマーを設計するための例示的な方法は、当該分野において公知であるか、本明細書において別段に記載される。

0078

いくつかの態様において、本明細書において記載されるプライマーペアは、ドナー特異的核酸の量を定量するために、PCRアッセイなどの多重増幅ベースの定量アッセイにおいて用いられる。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、プライマーペアは、潜在的に非二倍体であるゲノム領域を検出するために設計されたプライマーペアを除外して、二倍体であるゲノム領域を検出するために設計される。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、本開示により用いられるプライマーペアは、既知のコピー数可変の領域であるリピートマスク領域(repeat-masked region)、または非二倍体であり得る他のゲノム領域を検出しない。

0079

本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、増幅ベースの定量的アッセイは、任意の定量的アッセイであって、それにより核酸が増幅され、核酸の量を決定することができるようなものである。かかるアッセイは、それにより、本明細書において記載されるようなMOMAプライマーにより核酸が増幅され、定量されるものを含む。かかるアッセイは、単純な増幅および検出、ハイブリダイゼーション技術、電気泳動などの分離技術、次世代配列決定法などを含む。

0080

本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、PCRは、定量PCRであり、これは、核酸の量を決定することができることを意味する。定量PCRとして、リアルタイムPCR、デジタルPCR、TAQMAN(商標)などが挙げられる。本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、PCRは、「リアルタイムPCR」である。かかるPCRは、増幅プロセスがなお進行している間に、液相において反応動態学をモニタリングすることができるPCR反応を指す。従来のPCRと対照的に、リアルタイムPCRは、増幅反応において、リアルタイムで、同時に検出または定量する能力を提供する。特異的な色素からの蛍光強度の増大に基づいて、増幅がプラトーに達する前であっても、標的の濃度を決定することができる。

0081

複数のプローブの使用は、単一プローブリアルタイムPCRの能力を拡大することができる。多重リアルタイムPCRは、複数のプローブベースのアッセイを用い、ここで、各々のアッセイがユニークな蛍光色素で標識された特異的プローブを有していてよく、これにより、各々のアッセイについて観察される色が異なるものとなる。リアルタイムPCR機器は、異なる色素から生成される蛍光を区別することができる。異なるプローブは、各々がユニークな発光スペクトルを有する異なる色素で標識することができる、スペクトルシグナルは、別々の光学素子により収集され、一連フィルターセットを通過して、検出器アレイにより収集される。行列代数により実験データをデコンボリューションする(deconvolute)ために、色素間のスペクトルオーバーラップは、純粋な色素のスペクトルを用いて補正してもよい。

0082

プローブは、本開示の方法のために、特に定量ステップを含む方法のために、有用であり得る。本明細書において提供される方法のいずれか1つは、PCRアッセイの実施においてプローブの使用を含んでもよく、一方、本明細書において提供される組成物またはキットのいずれか1つは、1つ以上のプローブを含んでもよい。重要なことに、本明細書において提供される方法のいずれか1つ以上のいくつかの態様において、PCR定量アッセイの1つ以上または全てにおけるプローブは、ミスマッチプライマーと同じ鎖上にあり、反対の鎖上にはない。PCR反応においてプローブをそのように組み込むことにおいて、さらなるアレル特異的な区別を提供することができることを見出した。

0083

一例として、TAQMAN(商標)プローブは、FAM(商標)またはVIC(登録商標)色素標識を5’末端に、副溝結合剤(MGB)非蛍光消光剤(NFQ)を3’末端に有する、加水分解プローブである。TAQMAN(商標)プローブの原理は、一般に、相補的プローブ結合領域へのハイブリダイゼーションおよびフルオロフォアベースの検出の間に二重標識TAQMAN(商標)プローブを切断するために、Taq(登録商標)ポリメラーゼの5’−3’エクソヌクレアーゼ活性に依存する。TAQMAN(商標)プローブは、定量PCR反応の対数ステージの間の定量的測定における検出の特異度を増大することができる。

0084

PCR系は、一般に、そのシグナルが、反応におけるPCR生成物の量に対して直接比例して増大する、蛍光色素またはレポーターの検出および定量に依存する。例えば、最も単純かつ最も経済的な形式において、そのレポーターは、二本鎖DNAに特異的な色素SYBR(登録商標)Green(Molecular Probes)であってよい。SYBR(登録商標)Greenは、二本鎖DNAの副溝に結合する色素である。SYBR(登録商標)Green色素が二本鎖DNAに結合すると、蛍光強度が増大する。より多くの二本鎖アンプリコンが生成されるにつれ、SYBR(登録商標)Green色素シグナルは増大するであろう。

0085

本明細書において提供されるPCR条件は、本明細書において記載される方法のいずれか1つに従って機能するために、改変または最適化してもよいことが、理解されるべきである。典型的には、PCR条件は、用いられる酵素標的鋳型および/またはプライマーに基づく。いくつかの態様において、PCR反応の1つ以上のコンポーネントが、改変または最適化される。最適化することができるPCR反応のコンポーネントの非限定的な例として、鋳型DNA、プライマー(例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマー)、デオキシヌクレオチド(dNTP)、ポリメラーゼ、マグネシウム濃度バッファー、プローブ(例えばリアルタイムPCRを行う場合)、バッファー、および反応容積が挙げられる。

0086

前述の態様のいずれかにおいて、熱安定性ポリメラーゼを含む任意のDNAポリメラーゼ(DNAヌクレオチドのDNA鎖への重合触媒する酵素)を利用することができる。好適なポリメラーゼ酵素は、当業者には公知であり、E. coli DNAポリメラーゼ、E. coli DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、T7 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、Klenowクラスのポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、バクテリオファージ29、REDTaq(商標)ゲノムDNAポリメラーゼ、またはシーケナーゼを含む。例示的なポリメラーゼとして、これらに限定されないが、Bacillus stearothermophilusのpol I、Thermus aquaticus(Taq)pol I、Pyrccoccus furiosus(Pfu)、Pyrococcus woesei(Pwo)、Thermus flavus(Tfl)、Thermus thermophilus(Tth)、Thermus litoris(Tli)およびThermotoga maritime(Tma)が挙げられる。これらの酵素、これらの酵素の改変されたバージョン、および酵素の組み合わせは、Roche、Invitrogen、Qiagen、StratageneおよびApplied Biosystemsを含むベンダーから市販されている。代表的な酵素として、PHUSION(登録商標)(New England Biolabs、Ipswich、MA)、Hot MasterTaq(商標)(Eppendorf)、PHUSION(登録商標)Mpx(Finnzymes)、PyroStart(登録商標)(Fermentas)、KOD(EMD Biosciences)、Z-Taq(TAKARA)、およびCS3AC/LA(KlenTaq、UniversityCity、MO)が挙げられる。

0087

塩およびバッファーは、当業者が精通しているものを含み、これは、それぞれ、MgCl2、ならびにTris−HClおよびKClを含むものを含む。典型的には、TaqDNAポリメラーゼにとって1.5〜2.0nMのマグネシウムが最適であるが、最適マグネシウム濃度は、鋳型、バッファー、DNAおよびdNTPに依存し得る。なぜならば、各々が、マグネシウムをキレートする可能性を有するからである。マグネシウムの濃度[Mg2+]が低すぎる場合、PCR生成物が形成されない可能性がある。マグネシウム[Mg2+]が高すぎる場合、望ましくないPCR生成物が観察される場合がある。いくつかの態様において、マグネシウム濃度は、マグネシウム濃度を0.1mMまたは0.5mMの増加において約5mMまで補充することにより、最適化することができる。

0088

本開示に従って用いられるバッファーは、界面活性剤ジメチルスルホキシドDMSO)、グリセロールウシ血清アルブミンBSA)およびポリエチレングリコール(PEG)、ならびに当業者が精通している他のものなどの添加物を含んでもよい。ヌクレオチドは、一般に、デオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、およびデオキシチミジン三リン酸(dTTP)などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸であって、これらはまた、標的核酸の増幅のために適切な量で反応に添加される。いくつかの態様において、1つ以上のdNTP(例えば、dATP、dCTP、dGTP、dTTP)の濃度は、約10μM〜約500μMであり、これは、PCR反応において生成されるPCR生成物の長さおよび数に依存し得る。

0089

いくつかの態様において、PCR反応において用いられるプライマーの濃度を、改変または最適化してもよい。いくつかの態様において、PCR反応中のプライマー(例えばフォワードまたはリバースプライマー)の濃度は、例えば、約0.05μM〜約1μMであってよい。特定の態様において、各々のプライマーの濃度は、約1nM〜約1μMである。本開示に従うプライマーは、PCR反応において同じまたは異なる濃度で用いてもよいことが、理解されるべきである。例えば、プライマーペアのフォワードプライマーを0.5μMの濃度で用いてもよく、当該プライマーペアのリバースプライマーを0.1μMで用いてもよい。プライマーの濃度は、これらに限定されないが、プライマーの長さ、GC含有量純度、標的DNAとのミスマッチまたはプライマーダイマーを形成する可能性を含む要因に基づき得る。

0090

いくつかの態様において、PCR反応の熱プロフィールを、改変または最適化する。PCRの熱プロフィールの改変の非限定的な例として、変性の温度および持続時間、アニーリングの温度および持続時間、ならびに伸長時間が挙げられる。
PCR反応溶液の温度は、変性状態、アニーリング状態、および伸長状態の間で、予め決定されたサイクルの数にわたり、連続的に周回され得る。実際の時間および温度は、酵素、プライマー、および標的に依存的であり得る。任意の所与の反応について、変性状態、ある態様においては、約70℃〜約100℃の範囲であり得る。加えて、アニーリングの温度および時間は、プライマーが標的核酸中の特定の遺伝子座に結合する特異度および効率に影響を及ぼし得、特定のPCR反応について重要であり得る。任意の所与の反応について、アニーリング状態は、ある態様においては、約20℃〜約75℃の範囲であり得る。いくつかの態様において、アニーリング状態は、約46℃〜64°Cであり得る。ある態様において、アニーリング状態は、室温(例えば、約20℃〜約25℃)において行うことができる。

0091

伸長の温度および時間はまた、アレル生成物の収率に影響を及ぼし得る。所与の酵素について、伸長状態は、ある態様においては、約60℃〜約75℃の範囲であり得る。
PCRアッセイからのアレルの量の定量は、本明細書において提供されるように行うことができるか、別段に当業者には明らかであろう。一例として、一貫性および強力な定量のために、増幅のトレースを分析する。サイクルの閾値をインプット核酸(例えばDNA)の量に換算するために、内部標準を用いてもよい。アレルの量は、性能(performant)アッセイの平均として計算することができ、遺伝子型について補正することができる。

0092

本明細書において提供される方法のいずれか1つは、対象から得られた試料からセルフリーDNA(例えばドナー特異的セルフリーDNA)などの核酸を抽出することを含んでもよい。かかる抽出は、当該分野において公知の任意の方法を用いて、または本明細書において別段に提供されるように、行うことができる(例えば、 Current Protocols in Molecular Biology 、最新版を参照、またはQIAamp循環用核酸キットまたは他の適切な市販のキット)。血液からセルフリーDNAを単離するための例示的な方法を記載する。EDTAまたはDTAなどの抗凝固剤を含む血液を、対象から採取する。cf−DNAを含む血漿を、血液中に存在する細胞から分離する(例えば、遠心分離またはろ過により)。任意の残留する細胞を血漿から取り除くために、任意の二次的な分離を行ってもよい(例えば、第2の心分離またはろ過ステップ)。次いで、当該分野において公知の任意の方法を用いて、例えば市販のキット(Qiagenにより製造されるものなど)を用いて、cf−DNAを抽出する。cf−DNAを抽出するための他の例示的な方法は、当該分野において公知である(例えば、 Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock. Clin. Chem. 2008, v. 54, p. 1000-1007;Prediction of MYCN Amplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction. JCO 2005, v. 23, p.5205-5210;Circulating Nucleic Acidsin Blood of Healthy Male and Female Donors. Clin. Chem. 2005, v. 51, p.1317-1319;Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction: Toward Automation of Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics. Clin. Chem. 2003, v. 49, p. 1953-1955;Chiu RWK, PoonLLM, Lau TK, Leung TN, WongEMC, Lo YMD. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 2001;47:1607-1613;およびSwinkels et al. Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma. Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, no. 3, 525-526 を参照)。

0093

本明細書において提供される方法のいずれか1つのいくつかの態様において、プレ増幅ステップを行う。かかる増幅の例示的な方法は、以下のとおりであり、かかる方法は、本明細書において提供される方法のいずれか1つにおいて含まれ得る。約15ngのセルフリー血漿DNAを、Q5DNAポリメラーゼを用いて、約13の標的により、PCRにおいて増幅し、ここで、プールされたプライマーは、合計で4uMであった。試料は、約25サイクルを経る。反応は、合計で25ulである。増幅後、試料を、AMPUREビーズクリーンアップ、ビーズ精製、または単純にExoSAP-IT(商標)またはZymoを含むいくつかのアプローチを用いて、クリーンアップしてもよい。

0094

本明細書において用いられる場合、対象からの試料は、生物学的試料であってよい。かかる生物学的試料の例として、全血、血漿、血清、尿などが挙げられる。いくつかの態様において、さらなる核酸、例えば標準物の、試料への添加を行ってもよい。
別の側面において、本明細書において提供されるような1つ以上のプライマーペアを含む組成物およびキットが提供される。PCRアッセイなどのアッセイを行うための他の試薬もまた、組成物またはキット中に含まれていてもよい。

0095

本発明の多様な側面は、単独で、組み合わせて、または前述のものにおいて記載される態様においては具体的には議論されていない多様な配置において用いてもよく、したがって、それらの適用において、前述の説明において記載される、または図面において説明されるコンポーネントの詳細および配置に限定されない。例えば、一態様において記載される側面は、他の態様において記載される側面と、任意の様式において組み合わせることができる。
また、本発明の態様は、そのうちの一例が提供されている1つ以上の方法として実行してもよい。方法の一部として行われる行為は、任意の好適な方法において指令することができる。したがって、説明されたものとは異なる順序において行為が行われる態様が構築されてもよく、これは、いくつかの行為を、それが説明的態様においては連続的な行為として示されるものであっても、同時に行うことを含んでもよい。

0096

通常の用語、例えば「第1」、「第2」、「第3」などの、請求の範囲において請求項の要素を修飾するための使用は、それ自体によっては、1つの請求項の要素の、別の要素に対するいかなる優先順位先行もしくは順序、または方法の行為が行われる時間的順序暗示しない。かかる用語は、単に、ある名称を有する1つの請求項の要素を、(当該通常の用語の使用がなければ)同じ名称を有する別の要素と区別するための標識として用いられる。
本明細書において用いられる語法および用語法は、記載を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。「含むこと(including)」、「含むこと(comprising)」、「有すること(having)」、「含むこと(containing)」、「含むこと(involving)」、およびこれらのバリエーションの使用は、その後に列記される項目およびさらなる項目を包含することを意図される。

0097

本発明のいくつかの態様を詳細に説明したことを考慮すれば、当業者には、多様な改変および改善が容易に想起されるであろう。かかる改変および改善は、本発明の精神および範囲の内であることが意図される。したがって、前述の記載は、単なる例であり、限定するものとして意図されるものではない。以下の記載は、本明細書において提供される方法の例を提供する。

0098


例1−レシピエントおよびドナーの遺伝子型情報を用いるMOMAアッセイ
SNV標的選択
本開示に従って多重化するための標的の同定は、以下のステップの1つ以上を含んでもよい。初めに、いくつかの人種対照集団において、高度にヘテロ接合型のSNPをスクリーニングし(ハーディワインベルグp>0.25)、既知の困難な領域を除外した。困難な領域として、患者において異常である可能性が高い症候性の領域、ならびに染色体のセントロメアおよびテロメアを含む低複雑度領域が挙げられる。所望される長さの標的フラグメントを、次いでコンピューターシミュレーションにより設計した。具体的には、各々のSNPの70bpのウィンドウにわたる2つの20〜26bpのプライマーを設計した。全ての候補プライマーを、次いで、BLASTを用いてGCRh3に対して問い合わせた。十分に特異的であることが見出されたプライマーを保持し、オフターゲットヒットについて(特にフラグメントの3’末端において)モニタリングした。オフターゲット候補ヒットを、サイズ選択を通るであろうペアワイズフラグメント作製について分析した。選択されたプライマーを、次いで、コンピューターシミュレーションによる多重化評価に供した。計算されたプライマーの融解温度およびグアニンシトシンパーセンテージ(GC%)を用いて、中程度の範囲の配列についてフィルタリングした。反復遺伝子アルゴリズムおよびシミュレーションされたアニーリングを用いて、400の標的について適合可能な候補プライマーを選択し、最終的に800のプライマーの選択肢がもたらされた。800のプライマーを作製し、共通の融解温度において共通の溶液中で、多重化能力について物理的に試験した。具体的には、プライマーを、多重スクリーンにおける一様な増幅および中程度の読み取り深度(read depth)ウィンドウに基づいてフィルタリングした。最上の性能の多重化SNPを用いるMOMAのために、48のアッセイを設計した。各々のSNPは、WT/MUTにおいて4つのミスマッチの選択において設計されたプローブを有した;1アッセイあたり8つのプローブが存在した。70bpの濃縮されたフラグメント中に新たなネステッドプライマーを設計した。最後に、既知のヘテロ接合型個体により、プライマーを実験的に増幅し、増幅効率を評価した(TAQMAN(商標)を用いて、8プローブ×48アッセイを3部)。

0099

各アッセイの演繹的遺伝子型判定のインフォーマティブ性
各々のアッセイされたSNPにおいて既知のレシピエントおよびドナー遺伝子型を用いて、インフォーマティブなアッセイのサブセットを選択した。ドナーが任意の他の遺伝子型であるレシピエントホモ接合型部位を用いることができることに留意する。加えて、ドナー遺伝子型が不明である場合、それは、例えば血漿データの矛盾を用いることにより、推測することができる。遺伝子型はまた、配列決定、SNPマイクロアレイ、または既知の0%(クリーンな(clean)レシピエント)の試料に対するMOMAアッセイの適用を通して、学習することができる。

0100

多重アッセイ性能のポストプロセッシング分析
患者特異的MOMAプローブの偏りを、実験コホートの間で推定した。選択を、反復的に精密化して、最終的なドナーのパーセントのコールを行った。さらに、自動外れ値検出が、患者特異的な異常ゲノム領域を提供した。

再構築実験
既知の混合比により再構築された血漿試料を用いて、アッセイの感度および正確性を評価した。具体的には、1:10、1:20、1:100、1:200および1:1000の比を評価した。
再構築実験の結果を、図2において示す。ホモ接合型レシピエントに対するホモ接合型ドナーが存在する1つの標的は、完全にインフォーマティブである(網掛けされたデータポイント)。ホモ接合型レシピエントに対するヘテロ接合型ドナーが存在する他の標的は、半インフォーマティブである(オープンなデータポイント)。

0101

例2−レシピエントの遺伝子型情報を用いるがドナーの遺伝子型情報を用いないMOMAアッセイ
ドナー遺伝子型情報なしで研究するために、インフォーマティブなアッセイを推測して、血漿試料中のドナー特異的セルフリーDNAの定量を可能にするために、以下の手順を行うことができる。全アッセイを、完全な情報のシナリオにおいて性能について評価した。この手順は、したがって、各々のアッセイにおけるクリーンなAA/AB/BB遺伝子型および各々の定量の不偏挙動を推測した。レシピエントの遺伝子型により、レシピエントにおいてホモ接合型であると知られるアッセイを選択した。任意の混入物が、ドナー核酸に起因し得、アッセイの集合は、非インフォーマティブ、半インフォーマティブおよび完全インフォーマティブなアッセイに対応する3つのアッセイのクラスターによる三峰性分布を作成した。十分な数のレシピエントホモ接合型アッセイにより、ドナーの完全にインフォーマティブなアッセイの存在を推測することができる。

0102

レシピエント遺伝子型がホモ接合型かつ既知である場合、レシピエントの遺伝子型ではない測定値が観察され、真にドナー−ホモ接合型であるプローブは、最も高いクラスターを有し、予想値に等しく、一方、ナーヘテロ接合型であるものは、予想値の半分となるであろう。確率分布を、プロットしてもよく、期待値最大化アルゴリズム(EM)を使用して、ドナー遺伝子型を推定してもよい。このようなものを用いて、本明細書において提供される方法のいずれか1つにおいて、ドナー遺伝子型頻度を推測することができる。したがって、EMアルゴリズムを用いて、全てのアッセイされたSNV標的において最も確率が高いドナー遺伝子型を推定した。推測されたドナー遺伝子型により、定量は、完全な情報のシナリオにおけるもののように進行し得る。EMは、あるアッセイにおいて見出されるマイナーアレル比は、全てのアッセイがレシピエントにおいて「AA」である(または一般性を失うことなく「BB」からはじき出された)と仮定して、三峰性分布(1つずつ、レシピエントおよびドナーの各々の組み合わせについて)に従うという推測から始まり得る。全ての不明なドナー遺伝子型により、ほぼゼロのマイナーアレルを示す任意のアッセイは、ドナーAAであるという知識からブートストラップすることが可能であり、最も高いものはドナーBBである。全てのドナー遺伝子型についての最初の予想値を記録し、各々のクラスターの平均を計算した。ドナーBBアッセイの平均がドナーABのものの2倍になるように強制することにより、検索が制限される。次いで、アルゴリズムが、クラスターおよびビルトイン仮説に基づいて、予想されるドナー遺伝子型を再割り当てする。プロセスは、それ以上変更が行われなくなるまでは、反復性である。最終結果は、それらの測定されたバックグラウンドからの発散を考慮して、最も確率が高いドナー遺伝子型のセットである。一般に、全ての標的が、モデルに該当する;結果は、最大化の後の群の間にあれば、除外する(toss)ことができる。

0103

図3および4は、この様式において扱われる血漿試料からの例示的な結果を示す。x軸は、レシピエントをホモ接合型であると見出した任意のアッセイについてのドナー%である。点の行は、個々のPCRアッセイ結果を表す。最も下の円の行は、ドナー遺伝子型の最初の予想値を表し、いくつかはAAであり、いくつかはA/Bであり、いくつかはBBである。次いで、最初のアッセイにおいて中心となったベータ分布を表す実線の曲線を引き、これはホモ接合型(完全インフォーマティブ)であることが見出され、白色はヘテロ接合型(半インフォーマティブ)、黒い曲線は非インフォーマティブなアッセイの分布またはバックグラウンドノイズを表す。アッセイを再割り当てし、予想値を第2の行においてアップデートした。第2の行の曲線は、破線を用いる。変化が起こらなかったので、一番上の行が最終的な推定値である。白色の破線の曲線のピークを2倍すると、約10%における、または点線の曲線の平均に等しい、最尤ドナー%のコールに対応する。

0104

2人の個体からのDNAを用いた再構築実験(Recon1)を10%、5%、1%、0.5%および0.1%において作成した。全てのミックスを、標的の多重ライブラリーにより増幅し、浄化し、次いでMOMA法を用いて定量的に遺伝子型判定した。分析は、各個体の真の遺伝子型を知るために、彼らを遺伝子型判定することにより行った。メジャー個体の遺伝子型の前の知識を用いて(ホモ接合型部位を探して)、第2の個体が異なっていた場合、インフォーマティブな標的を決定し、インフォーマティブな標的を用いて画分(パーセンテージ)を計算するために用いた。次いで画分を計算した(黒色で表し、「遺伝子型あり」情報を表示する)。

0105

第2の再構築実験(Recon2)は、メジャーおよびマイナーの2個体を用いて開始し、これもまた10%、5%、1%、0.5%および0.1%において作成した。全てのミックスを、標的の多重ライブラリーにより増幅し、浄化し、次いでMOMA法を用いて定量的に遺伝子型判定した。分析は、各個体の真の遺伝子型を知るために、彼らを遺伝子型判定することにより行った。上記のように第2の個体の遺伝子型の前の知識を用いてインフォーマティブな標的を決定した。次いで画分を計算した(黒色で表し、「遺伝子型あり」情報を表示する)。
これらの再構築を、翌日再び実行した(Recon3)。

0106

同じ再構築試料(Recon 1、2、3)を、次いで、第1の個体(メジャーDNA寄与体)について利用可能な遺伝子型判定情報のみを用いて、再び分析した。第2の個体(マイナーDNA寄与体)からの遺伝子型判定情報は用いなかった。約38〜40の標的を用いて、遺伝子型判定を用いずに(ドナーなしでシミュレーションする)画分を計算した;をれらを、網掛け点として表す(図5)。レシピエントホモ接合型であった各々の標的が、一般に有用であることを見出した。円は、第1の推定値、二値化を示す;右側のものは、完全にインフォーマティブであると考えられ、左側のものはそうではない。上部に沿った三角形は、同じ標的であったが、最終的なインフォーマティブ性の決定のために、それらを色替えした。

0107

例3−MOMA cf−DNAアッセイ
MOMA cf−DNAアッセイの原理および手順
この例示的なアッセイは、移植レシピエントの血液試料中に存在するDS cf−DNAのパーセンテージを決定するために設計される。この態様において、レシピエントの血液試料は、EDTA管中に収集し、遠心分離して、血漿およびバフィーコートを分離する。血漿およびバフィーコートは、2つの別々の15mL円錐管中に等分して凍結することができる。血漿試料は、定量的遺伝子型判定(qGT)のために用いることができ、一方、バフィーコートは、基本的なレシピエントの遺伝子型判定(bGT)のために用いることができる。移植レシピエントの血液試料に加えて、ドナーからの廃棄された組織または血液試料の小片を、基本的な遺伝子型判定のために用いることができる。

0108

プロセス中の第1のステップは、血漿試料(qGTのために用いられる)からセルフリーDNAを、バフィーコート、全血または組織試料(bGTのために用いられる)からゲノムDNA(gDNA)抽出することであってよい。cfDNAの合計量を、qPCRにより決定して、標的濃度に対して正規化することができる。このプロセスは、cfDNA定量として公知である。gDNAは、UV分光光度法を用いて定量し、正規化することができる。15ngのDNAが、一般に、正確かつ有効な結果を提供する。

0109

正規化された患者DNAは、例えば各々がMOMA標的部位のうちの1つを含む領域を増幅する96のプライマーペアを含む、高度に多重化されたライブラリーPCR増幅反応中へのインプットとして用いることができる。結果として生じるライブラリーは、MOMA標的プライマーおよびプローブ部位を有するPCRアンプリコンからなるので、bGTまたはqGTアッセイのいずれかのためのインプットとして用いることができる。このステップは、高度に特異的なqPCR増幅の前に各々の標的のコピー数を増大させることにより、アッセイ全体の感度を改善することができる。対照および標準物質(calibrator)/標準(standard)を、患者の試料と共に多重ライブラリーにより増幅してもよい。ライブラリー増幅の後で、下流の増幅が妨げられることを防ぐために、酵素によるクリーンアップを行って過剰なプライマーおよび組み込まれなかったデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)を取り除いてもよい。

0110

平行したワークフローにおいて、マスターミックスを調製して、384ウェルPCRプレートに移してもよい。増幅された試料、対照および標準物質/標準を、次いで、ライブラリー希釈バッファーで 、予め決定された容積および濃度まで希釈してもよい。希釈された試料および対照を、6ウェルのリザーバプレートに等分して、アコスティックリキッドハンドラー(acoustic liquid handler)を用いて384ウェルのPCRプレートに移してもよい。次いで、プレート密封して、リアルタイムPCR増幅および検出系に移動してもよい。

0111

MOMAは、移植ドナーとレシピエントとの間で区別し得る可能性が高くそれらを高度にインフォーマティブにしている両アレル型SNPを標的とすることにより、基本的なおよび定量的な両方の遺伝子型判定分析を行うことができる。基本的な遺伝子型判定分析は、レシピエントおよびドナーを、各々の標的(例えばホモ接合型REF、ヘテロ接合型REFおよびVAR、ならびにホモ接合型VAR)において、3つの可能な遺伝子型で標識することができる。この情報は、マイナー種率(minor-species proportion)として知られる各々の標的についてのアレル比を定量するために、標準曲線と共に、定量的遺伝子型判定分析のために用いることができる。全てのインフォーマティブなおよび品質管理を通過したアレル比の中央値を、DS cfDNAの%を決定するために用いることができる。

0112

例4−コンピューターにより実行される態様の例
いくつかの態様において、上記の診断技術は、対象について試料を(例えば経時的に)分析し、試料中の核酸(セルフリーDNAなど)を測定し、試料中の核酸(セルフリーDNAなど)を測定し、および試料のうちの1つ以上に基づいて結果(診断結果など)をもたらすために、1つ以上のソフトウェア設備を実行する1つ以上のコンピューター処理デバイスを介して、実装することができる。図6は、いくつかの態様が作動することができるコンピューターシステムの例を説明するが、態様は、図6において説明される型の系により作動することに限定されないことが、理解されるべきである。

0113

図6のコンピューターシステムは、対象802、および対象806から試料806を得ることができる医師804を含む。前述のものから理解されるであろうが、試料806は、対象802における核酸(セルフリーDNAなど)の存在を測定するために用いてもよい、対象802についての生物材料の任意の好適な試料であってよく、これは、血液試料を含む。試料806を、分析デバイス808に提供することができ、当業者は前述のものから理解するであろうが、これが、核酸(セルフリーDNAなど)の量(試料806および/または対象802におけるDS核酸(DSセルフリーDNAなど)の量を含む)を決定する(推定することを含む)ために、試料808を分析する。説明を容易にするために、分析デバイス808を単一のデバイスとして表すが、分析デバイス808は任意の好適な形態をとってよく、いくつかの態様においては複数のデバイスとして実装されてもよいことが、理解されるべきである。試料806および/または対象802中の核酸(セルフリーDNAなど)の量を決定するために、分析デバイス808は、上記の技術のいずれを行ってもよく、任意の特定の分析を行うことに限定されない。分析デバイス808は、ソフトウェアにおいて実装される分析設備を実行するための1つ以上のプロセッサーを含んでもよく、これは、他のハードウェアを作動させるプロセッサーを駆動して、他のハードウェアにより行われたタスクの結果を受け取って分析の全結果(これは試料806および/または対象802中の核酸(セルフリーDNAなど)の量であってもよい)を決定することができる。分析設備は、デバイス808のメモリーなどの1つ以上のコンピューター可読ストレージ媒体中に記憶されていてもよい。他の態様において、本明細書において記載される試料を分析するための技術は、部分的にまたは完全に、Application Specific IntegratedCircuits(ASIC)などの1つ以上の特別な目的のコンピューターコンポーネントにおいて、またはソフトウェア実装の代わりとなり得る任意の他の好適なコンピューターコンポーネントの形態を通して、実装してもよい。

0114

いくつかの態様において、医師804は、試料806を分析デバイス808に直接提供してもよく、および対象802から試料806を得ることに加えてデバイス808を操作してもよく、一方、他の態様においては、デバイス808は、医師804および対象802から地理的に離れて位置していてもよく、試料806は、分析デバイス808の位置に輸送されるか、別段に移されてもよい。試料806は、いくつかの態様においては、試料806および/または対象802について、試料806が得られた日付および/または時間についての識別子、または試料806を記載または同定する他の情報と一緒に(例えば、任意の好適なインターフェースを介して入力される)、分析デバイス808に提供することができる。

0115

分析デバイス808は、いくつかの態様において、試料806に対して行われた分析の結果を、コンピューター処理デバイス810に提供するように設計されていてもよい。デバイス810は、データストア810Aを含んでもよく、これは、データベースまたは他の好適なデータストアとして実装することができる。コンピューター処理デバイス810は、いくつかの態様においては、1つ以上のサーバーとして実装してもよく、これは、1つ以上の物理的計算機および/またはクラウドサービスプロバイダーなどの分散コンピューティングプラットフォーム仮想計算機を含む。他の態様において、デバイス810は、デスクトップまたはラップトップパーソナルコンピュータースマートモバイルフォンタブレットコンピューター、特別な目的のハードウェアデバイス、または他のコンピューター処理デバイスとして、実装してもよい。

0116

いくつかの態様において、分析デバイス808は、その分析の結果を、1つ以上の有線および/または無線の、ローカルおよび/または広域のコンピューターコミュニケーションネットワークインターネットを含む)を介して、デバイス810に伝達することができる。分析の結果は、任意の好適なプロトコルを用いて伝達することができ、試料806および/または対象802についての、試料806が得られた日付および/または時間についてのまたは試料806が得られた日付および/または時間についての識別子などの、試料806を記載または同定する情報と一緒に伝達することができる。

0117

コンピューター処理デバイス810は、ソフトウェアにおいて実装される診断設備を実行するための1つ以上のプロセッサーを含んでもよく、これは、本明細書において記載される診断技術を行うためのプロセッサーを駆動することができる。診断設備は、デバイス810のメモリーなどの1つ以上のコンピューター可読ストレージ媒体に記録されていてもよい。他の態様において、本明細書において記載される試料を分析するための技術は、部分的にまたは完全に、Application Specific IntegratedCircuits(ASIC)などの1つ以上の特別な目的のコンピューターコンポーネントにおいて、またはソフトウェア実装の代わりとなり得る任意の他の好適なコンピューターコンポーネントの形態を通して、実装してもよい。

0118

診断設備は、分析の結果および試料806を記載または同定する情報を受け取ってもよく、その情報をデータストア810Aにおいて記録してもよい。情報は、対象802についての前の試料に関する情報が先に受け取られており、診断設備により記録されている場合などにおいては、対象802についての他の情報と関連づけてデータストア810Aにおいて記録することができる。複数の試料に関する情報は、対象802についての識別子などの共通の識別子を用いて、関連づけることができる。いくつかの場合において、データストア810Aは、複数の異なる対象についての情報を含んでもよい。

0119

診断設備はまた、対象802についての診断を決定するために、ユーザーの入力により同定される特定の対象802についての1つ以上の試料806の分析の結果を分析するために、作動させることができる。診断は、対象802が特定の状態を有するか、これを有し得るか、または将来的にこれを発症し得るリスクの結論であってよい。診断設備は、特定の試料806について決定された核酸(セルフリーDNAなど)の量を、1つ以上の閾値と比較することによるもの、または試料806について経時的に決定された核酸(セルフリーDNAなど)の量の経時的な変化を、1つ以上の閾値などと比較することによるものを含む、上記の多様な例のいずれかを用いて、診断を決定することができる。例えば、診断設備は、1つ以上の試料806についての核酸(セルフリーDNAなど)の量を1つの閾値と比較すること、および同じ試料806についての核酸(セルフリーDNAなど)の量を別の閾値と比較することにより、対象802にとっての状態のリスクを決定することができる。閾値との比較に基づいて、診断設備は、対象802にとっての状態のリスクの指標である出力をもたらすことができる。

0120

前述のものから理解されるであろうが、いくつかの態様において、診断設備は、核酸(セルフリーDNAなど)の量を比較することができる異なる閾値を用いて、設計することができる。異なる閾値は、例えば、異なる人口統計学的な群(年齢、性別、人種、経済的なクラス、既往歴における特定の手順/状態/その他の存在もしくは不在、または他の人口統計学的なカテゴリー)、異なる状態、および/または他のパラメーターもしくはパラメーターの組み合わせに対応し得る。かかる態様において、診断設備は、コンピューター処理デバイス810のメモリーにおいて記録された異なる閾値を用いて、それに対して核酸(セルフリーDNAなど)の量を比較すべき閾値を選択するように設計することができる。選択は、したがって、人工統計学的群に基づいて閾値が異なる態様においては、対象802についての人工統計学的情報に基づいたものであってよく、これらの場合においては、対象802についての人工統計学的情報は、診断設備に提供されても、あるいは、対象802についての識別子を用いて、診断設備により(別のコンピューター処理デバイス、もしくはデータストア810Aと同じであっても異なっていてもよいデータストアから、または任意の他の好適なソースから)検索されてもよい。選択は、さらに、または代替的に、リスクを決定すべき状態に基づいたものであってよく、診断設備は、リスクを決定する前に、入力として条件を受け取り、リスクの決定が基づく閾値を選択するために当該条件を用いてもよい。診断設備は、複数の閾値が支持される態様において、任意の特定の様式において閾値を選択することに限定されないことが、理解されるべきである。

0121

いくつかの態様において、診断設備は、対象802についてのリスクの診断および/または診断のための基礎を含むユーザーインターフェースをユーザーに提示するために出力するように設計することができる。診断についての基礎は、例えば、対象802についての1つ以上の試料806において検出された核酸(セルフリーDNAなど)の量を含んでもよい。いくつかの態様において、ユーザーインターフェースは、上で議論された結果、値、量、グラフなどの例のうちのいずれを含んでもよい。それらは、経時的な結果、値、量などを含んでもよい。例えば、いくつかの態様において、ユーザーインターフェースは、本明細書において提供される図面のいずれか1つにおいて示されるものと類似のグラフを取り込んでもよい。かかる場合において、いくつかの場合においては、グラフの異なる領域がグラフにおいて提示されるデータの分析からもたらされ得る異なる診断にどのように対応し得るかをユーザーに示すために、グラフに注釈をつけてもよい。例えば、グラフ表示されたデータを分析を決定するために比較することができる閾値を、グラフ上に組付け(impose)してもよい。

0122

グラフ(特に線および/または網掛けを有するもの)を含むユーザーインターフェースは、ユーザーに、核酸(セルフリーDNAなど)の量に基づいて対象802のリスクを決定するために、他のユーザーインターフェースを通して提供され得るものよりもはるかにより直観的であり、かつレビューがより早いインターフェースを提供する。しかし、態様は、任意の特定のユーザーインターフェースにより実装されることに限定されないことが、理解されるべきである。

0123

いくつかの態様において、診断設備は、診断またはユーザーインターフェースを、対象802および/または医師(医師804または別の医師であってよい)により操作され得る1つ以上の他のコンピューター処理デバイス814(デバイス814A、814Bを含む)に出力することができる。診断設備は、診断および/またはユーザーインターフェースを、ネットワーク812を介してデバイス814に伝達することができる。

0124

本明細書において記載される原理に従って作動する技術は、任意の好適な様式において実装することができる。上の議論に含まれるのは、核酸(セルフリーDNAなど)の量の分析に基づいて状態のリスクを決定する多様なプロセスのステップおよび行為を示す、一連のフローチャートである。上で議論されるプロセッシングおよび決定のブロックは、これらの多様なプロセスを実行するアルゴリズム中に含まれ得るステップおよび行為を代表する。これらのプロセスに由来するアルゴリズムは、統合されたソフトウェアとして実装することができ、1つ以上の専用プロセッサーまたは多目的プロセッサーの操作を指揮することは、デジタル信号処理(DSP)回路または特定用途向け集積回路(ASIC)などの機能的に等価な回路として実装してもよく、または任意の他の好適な様式において実装してもよい。態様が、任意の特定のシンタックス、または任意の特定の回路もしくは任意の特定のプログラミング言語の作動、またはプログラミング言語の型に限定されないことが、理解されるべきである。むしろ、当業者は、本明細書において記載される技術の型を行う特定の装置のプロセッシングを実施するために、回路を製造するため、またはコンピューターソフトウェアアルゴリズムを実装するために、上の記載を使用することができる。本明細書において別段に示されない限り、上記のステップおよび/または行為の特定の配列は、実装することができるアルゴリズムの単なる説明であって、本明細書において記載される原理の実装および態様において異なっていてもよいことが、理解されるべきである。

0125

したがって、いくつかの態様において、本明細書において記載される技術は、アプリケーションソフトウェアシステムソフトウェアファームウェアミドルウェア、埋め込みコード、または任意の他の好適な型のコンピューターコードを含むソフトウェアとして実装された、コンピューターにより実行可能な指示において、具体化することができる。かかるコンピューターにより実行可能な指示は、多数の好適なプログラミング言語および/またはプログラミングもしくはスクリプトツールのうちのいずれかを用いて記述することができ、また、フレームワークまたは仮想計算機上で実行される、実行可能なマシン原語コードまたは中間コードとしてコンパイルすることができる。

0126

本明細書において記載される技術をコンピューターにより実行可能な指示として具体化する場合、これらのコンピューターにより実行可能な指示は、任意の好適な様式において実装することができ、これは、これらの技術に従って作動するアルゴリズムの実行を完了するために、各々が1つ以上の作動を提供する多数の機能設備を含む。「機能設備」は、インスタンス化されている場合であっても、1つ以上のコンピューターと統合されてこれにより実行される場合、当該1つ以上のコンピューターに特定の演算子(operational role)を実行させる、コンピューターシステムの構造的コンポーネントである。機能設備は、全ソフトウェアエレメントの一部であってもよい。例えば、機能設備は、プロセスの関数として、別個のプロセスとして、または任意の他の好適なプロセッシングの単位として、実装することができる。本明細書において記載される技術が複数の機能設備として実装される場合、各々の機能設備は、それ自体の方法において実装することができる;全てが同じ方法で実装される必要はない。加えて、これらの機能設備は、適宜、並行しておよび/または連続的に実行することができ、それらが実行中のコンピューター上の共用メモリーを用いて、メッセージパッシングプロトコルを用いて、または任意の他の好適な方法において、互いに情報を受け渡すことができる。

0127

一般に、機能設備は、特定のタスクを行う、または特定の抽象データ型を実装する、ルーチンプログラムオブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。典型的には、機能設備の機能性は、それらが作動する系において所望されるように、組み合わせるかまたは分散させることができる。いくつかの実装において、本明細書における技術を実施する1つ以上の機能設備は、一緒になって、完全なソフトウェアパッケージを形成することができる。これらの機能設備は、代替的態様において、他の無関係な機能設備および/またはプロセスと相互作用するように、ソフトウェアプログラムアプリケーションを実装するために、適応させることができる。

0128

いくつかの例示的な機能設備は、1つ以上のタスクを実施するために、本明細書において記載してきた。しかし、記載されるタスクの機能設備および部門は、単に、本明細書において記載される例示的な技術を実装することができる機能設備の型を説明するものであって、態様は、任意の特定の機能設備の数、部門、または型において実装されることに限定されないことが、理解されるべきである。いくつかの実装において、全ての機能性は、単一の機能設備において実装することができる。また、いくつかの実装において、本明細書において記載される機能設備のうちのいくつかは、他のものと共に、またはこれらとは別に(すなわち、単一の単位として、または別々の単位として)実装してもよく、あるいはこれらの機能設備のうちのいくつかは、実装されなくともよいことが、理解されるべきである。

0129

本明細書において記載される技術を実装する(1つ以上の機能設備として、または任意の他の様式において実装される場合)、コンピューターにより実行可能な指示は、いくつかの態様において、媒体に機能性を提供するために、1つ以上のコンピューター可読媒体上でコード化されていてもよい。コンピューター可読媒体として、ハードディスクドライブなどの磁気媒体コンパクトディスク(CD)もしくはデジタルバータイルディスク(DVD)などの光学媒体永続的もしくは非永続的ソリッドステートメモリー(例えば、フラッシュメモリー磁気RAMなど)、または任意の他の好適なストレージ媒体が挙げられる。かかるコンピューター可読媒体は、任意の好適な様式において実装することができ、これは、コンピューター処理デバイスの一部としてのもの、またはスタンドアローンの別のストレージ媒体としてのものを含む。本明細書において用いられる場合、「コンピューター可読媒体」(また「コンピューター可読ストレージ媒体」とも称される)とは、有体ストレージ媒体を指す。有体ストレージ媒体は、非一過性であり、少なくとも1つの物理的な構造的コンポーネントを有する。「コンピューター可読媒体」において、本明細書において用いられる場合、少なくとも1つの物理的な構造的コンポーネントは、情報が埋め込まれた媒体を作成するプロセス、その上に情報を記録するプロセス、または情報を有する媒体をコード化する任意の他のプロセスの間に、何らかの方法において変更することができる、少なくとも1つの物理的特性を有する。例えば、コンピューター可読媒体の物理的構造の一部の磁化状態は、記録プロセスの間に変更することができる。

0130

全てではないがいくつかの、技術がコンピューターにより実行可能な指示として具体化され得る実装において、これらの指示は、任意の好適なコンピューターシステムにおいて作動する1つ以上の好適なコンピューター処理デバイス上で実行することができ、これは、図6の例示的なコンピューターシステムを含むか、または1つ以上のコンピューター処理デバイス(または1つ以上のコンピューター処理デバイスの1つ以上のプロセッサー)を、コンピューターにより実行可能な指示を実行するようにプログラムすることができる。コンピューター処理デバイスまたはプロセッサーは、コンピューター処理デバイスまたはプロセッサーにアクセス可能な様式において、例えばデータストア(例えば、オンチップキャッシュまたは命令レジスターバスを介してアクセス可能なコンピューター可読ストレージ媒体など)において、指示が記録される場合、指示を実行するようにプログラムすることができる。これらのコンピューターにより実行可能な指示を含む機能設備は、単一の多目的のプログラム可能デジタルコンピュータ処理デバイス処理能力共有して本明細書において記載される技術を共同で実施する2つ以上の多目的コンピューター処理デバイスの同調系、本明細書において記載される技術を実行することに特化した単一コンピューター処理デバイスまたはコンピューター処理デバイスの同調系(共同設置されているか、または地理的に分散したもの)、本明細書において記載される技術を実施するための1つ以上のField-Programmable Gate Array(FPGA)、または任意の他の好適な系と統合されて、その作動を指揮することができる。

0131

回路および/またはコンピューターにより実行可能な指示において技術が実装される態様を記載してきた。いくつかの態様は、少なくとも1つの例が提供されている方法の形態におけるものであってよいことが、理解されるべきである。方法の一部として行われる行為は、任意の好適な方法において順序付けることができる。したがって、説明されたものと異なる順序において行為が行われる態様を構築することができ、これは、説明的態様においては連続的な行為として示されたものであっても、いくつかの行為が同時に行われることを含んでもよい。前述のデバイス、系、態様、方法、技術、アルゴリズム、媒体、ハードウェア、ソフトウェア、インターフェース、プロセッサー、ディスプレイ、ネットワーク、入力、出力、またはこれらの任意の組み合わせを含む前述のもののいずれか1つは、本明細書において他の側面において提供される。

0132

例5−ドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の細胞性拒絶グレードとの相関
MOMAアッセイを用いて、移植レシピエントのドナー特異的cf−DNAを定量し、かかるアッセイについての例示的なステップは、本明細書において提供される。図67および68は、既知の遺伝子型によるMOMA(図67)および不明なドナー遺伝子型によるMOMA(図68)についてのデータ分布を示す。例示的な図7〜31および57〜66において示されるとおり、細胞性拒絶のグレードおよび/またはそれに付随するリスクを予測することができるように、閾値(「カットポイント」)値を、実験により決定した。また、いくつかの結果を、表にして、以下の表1〜24において示す。

表1.既知のドナー遺伝子型を用いる方法および不明なドナー遺伝子型を用いる方法を用いた統計学的試験

0133

表2.実験により決定されたCR0カットポイントを用いたクロス集計(既知のドナー遺伝子型を用いるMOMA)

0134

表3.実験により決定されたCR0カットポイントを用いたクロス集計(不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA)

0135

表4.実験により決定されたCR1カットポイントを用いたクロス集計(不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA)

0136

表5.実験により決定されたCR2カットポイントを用いたクロス集計(既知のドナー遺伝子型を用いるMOMA)

0137

表6.実験により決定されたCR2カットポイントを用いたクロス集計(不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA)

0138

表7.CR1/2/3対CR0(既知のドナー遺伝子型を用いるMOMA)
(「健常ではない」試料を含む)

0139

表8.CR1/2/3対CR0(既知のドナー遺伝子型を用いるMOMA)−健常(以下のいずれでもない:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、がん)

0140

表9.CR1/2/3対CR0(既知のドナー遺伝子型を用いるMOMA−1試料/対象)
CR1/2/3群において、用いた試料は、第1の拒絶からのものであった;CR0群において、それは、採取された第1の試料であった。

0141

表10.CR1/2/3対CR0(血漿を用いる、既知のドナー遺伝子型を用いるMOMA)−健常(以下のいずれでもない:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、がん)

0142

表11.CR1/2/3対CR0(全血を用いる、既知のドナー遺伝子型を用いるMOMA)−健常(以下のいずれでもない:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、がん)

0143

表12.既知のドナー遺伝子型を用いるMOMAについてのクロス集計(全血および血漿)

0144

表13.既知のドナー遺伝子型を用いるMOMAについてのクロス集計(血漿)

0145

表14.既知のドナー遺伝子型を用いるMOMAについてのクロス集計(全血)

0146

表15.CR1/2/3対CR0(不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA)
(「健常ではない」試料を含む)

0147

表16.CR1/2/3対CR0(不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA)−健常(以下のいずれでもない:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、がん)

0148

表17.CR1/2/3対CR0(不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA−1試料/対象)
CR1/2/3群において、用いた試料は、第1の拒絶からのものであった;CR0群において、それは、採取された第1の試料であった。

0149

表18.CR1/2/3対CR0(血漿を用いる、不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA)−健常(以下のいずれでもない:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、がん)

0150

表19.CR1/2/3対CR0(全血を用いる、不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA)−健常(以下のいずれでもない:死亡、心停止、MCS、感染のための処置、AMR1&2、移植片脈管障害、がん)

0151

表20.不明なドナー遺伝子型を用いるMOMAについてのクロス集計(全血および血漿)

0152

表21.不明なドナー遺伝子型を用いるMOMAについてのクロス集計(血漿)

0153

表22.不明なドナー遺伝子型を用いるMOMAについてのクロス集計(全血)

0154

表23.拒絶間での既知のドナー遺伝子型を用いるMOMA(移植後7日、拒絶のための処置後14日は除外した)




拒絶間でのWB+血漿:
CR0対CR2:p=0.04(CR2がCR0より高い);CR1対CR2:p=0.01(CR2がCR1より高い);CR0対CR1:p=0.39;
拒絶間での全血:
CR0対CR2:p=0.16;CR1対CR2:p=0.04(CR2がCR1より高い);CR0対CR1 p=0.11
拒絶間での血漿:CR0対CR1:p<0.0001(CR1がCR0より高い)

0155

表24.拒絶間での不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA(移植後7日、拒絶のための処置後14日は除外した)




拒絶間でのWB+血漿:
CR0対CR2:p=0.05;CR1対CR2:p=0.08;
CR0対CR1:p=0.83;
拒絶間での全血:
CR0対CR2:p=0.20;CR1対CR2:p=0.14(CR2がCR1より高い);CR0対CR1:p=0.62
拒絶間での血漿:CR0対CR1:p<0.0001(CR1がCR0より高い)

0156

例6−心臓移植後の非侵襲性の指標としてのドナー特異的セルフリーDNA
目的
心臓移植レシピエントのサーベイランスのための現在の至適基準は、心内膜心筋生検(EMB)であり、これは、小児を一定の傷害のリスクに曝し、妥当なスクリーニングの頻度を限定し、雑駁なプロセスとして拒絶が起こることから感度が本質的に限定される。侵襲性サーベイランス生検の必要性に取って代わるために、循環中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cfDNA)の正確な定量に基づく、小児および成人の心臓移植レシピエントのための非侵襲性の診断スクリーニングツールを開発した。

0157

方法
ウィスコシン小児病院(Children’s Hospital of Wisconsin:CHW)において追跡された全ての心臓移植レシピエントを、この盲検研究において参加するように招待した。3〜10ミリリットル(ml)の抗凝固剤処置された血液を採取して、以下の臨床シナリオにおいてcf−DNAの循環レベルを評価した:移植後の第1、4、7および28日、任意のEMBの前24時間以内、拒絶のための処置の開始後の第1、4、7および28日。試料は、すぐにコード化し、匿名化し、MyTAI(心臓)検査(TAI diagnostics, Milwaukee, WI)を用いる処理のために研究室送達された。臨床、研究室、心臓生検、脈管障害、カテーテル処置、および心エコーデータを、全て、試料採取の時点で記録した。全生検レポートのうちの病理学レポートを見直し、2004 International Society for Heart and Lung Transplantation(ISHLT)グレードを記録した。感染のための処置、拒絶のための処置、心停止、心臓再移植、機械的循環サポートの開始、および死亡を含む全ての重要なイベントの日付および時間を記録した。ターゲティングされたアプローチを用いてドナー特異的(ds)セルフリーDNA(cf−DNA)を定量し、ドナー遺伝子型を用いる(方法1)、およびドナー遺伝子型を用いない(方法2)2つの別々の方法を用いて、関連する生検および脈管障害の結果と比較した。

0158

結果
成人および小児の両方の87人のユニークな移植レシピエント対象からの合計で158の試料が、QC基準を通り、分析のために利用可能であった。1個体は、最初の移植の後および再移植の後の両方の研究に参加し、2つのユニークなドナー/レシピエントが一致しないDNAを考慮して、2人のユニークな対象として分析した。移植時の患者の平均年齢は、7.9+/−7.5歳(0.03〜24.2歳の範囲)であった。採血時の平均年齢は、12.7+/−8.1歳(0.08〜30.2歳の範囲)であった。59.6%(51/87)の対象は男性であり、65.5%(57/87)は白人であった。移植から採血までの平均時間は、4.8+/−4.2年であった。134の生検はグレードCR0であり、21の生検はグレードCR1であり、3つの生検は、グレードCR2であった。平均のドナー特異的cf−DNA画分は、グレードCR0生検に関連する試料においては0.11%(IQR:0.06〜0.21%)、グレードCR1に関連する試料においては0.37%(IQR:0.15〜0.72%)、グレードCR2に関連する試料においては0.97%(IQR:0.88〜1.06%)であった(p=0.027)。関連するROC曲線に基づいてグレードCR2の拒絶を除外するための経験的最適カットポイントは、0.87%[95%CI:0.78〜0.97%(p=0.009)]であった。曲線下面積は、0.97であった。感度は100%であり、特異度は93%であった。

0159

別の例として、ドナー遺伝子型なしで、平均ドナーcf−DNA画分は、グレードCR0生検に関連する試料においては0.25%(IQR:0.17〜0.39%)、グレードCR1生検に関連する試料においては0.89%(IQR:0.44〜5.35%)、グレードCR2生検に関連する試料においては1.22%(IQR:1.04〜5.18%)であった(p<0.001)。関連するROC曲線に基づいてグレードCR2の拒絶を除外するための経験的最適カットポイントは、0.89%[95%CI:0.46〜1.70% (p=0.725)]であった。曲線下面積は、0.95であった。感度は100%であり、特異度は89%であった。

0160

結論
ドナー特異的cf−DNAの定量のためのターゲティングされたハイスループットアッセイが、心臓移植レシピエントにおける急性細胞性拒絶サーベイランスについて、優れた感度を有することを見出した。驚くべきことに、CR0、CR1およびCR2に関連する生検の間で、ドナー特異的cf−DNAの段階的増加が観察され、このことは、拒絶グレードの増大に伴う漸進的な同種移植片傷害を示唆している。

0161

例7−ドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の心臓同種移植片脈管障害との相関
MOMAを用いて移植レシピエント(n=273)のドナー特異的cf−DNAを定量した。図39において示されるとおり、心臓同種移植片脈管障害(移植片脈管障害)についての閾値(「カットポイント」)値を、2つの異なる方法を用いて、既知のドナー遺伝子型により(方法1)、および不明なドナー遺伝子型により(方法2)、実験により決定した。加えて、全セルフリーDNAを試験し、閾値を実験により決定した。さらに、以下の表25は、さらなる統計学を示す。

0162

図41〜46においてさらなる例が提供される。全試料集団(N=214)を用いて、ドナー遺伝子型が既知の場合(図41)および不明の場合(図43)の、実験的な閾値を決定した。機械的サポートを受けている対象をデータから除外した後に、同じ閾値が決定された。結果を、図42および図44において示す。図45は、各々の対象からの最後の試料のみを用いる場合の結果を示す(N=79)(ドナー遺伝子型が不明であった場合)。
表25.移植片脈管障害の統計学

0163

例8−ドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の心停止との相関
同様に、MOMAを用いて移植レシピエント(n=71〜77)のドナー特異的cf−DNAを定量した。図40において示されるとおり、心停止についての閾値(「カットポイント」)値を、2つの異なる方法を用いて実験により決定した。さらに、以下の表26は、さらなる統計学を示す。
表26.心停止の統計学

0164

図47〜52は、異なる方法を用いて見出された心停止についての閾値(カットポイント)の実験による決定を示す。図47〜49は、3つの集団:全試料集団(図47)、機械的サポートを受けている対象を除く全試料集団(図48)、および各々の対象から得られた最後の試料(図49)において、MOMAを用いて(既知のドナー遺伝子型により)得られた閾値を示す。図50〜52は、3つの集団:全試料集団(図50)、機械的サポートを受けている対象を除く全試料集団(図51)、および各々の対象から得られた最後の試料(図52)において、MOMAを用いて(不明なドナー遺伝子型により)得られた閾値を示す。試験のための統計学を、表27において表す。
表27.心停止の統計学−不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA

0165

図53および54は、さらなる結果を示す。図53において、試料の全集団(N=214)を用いた。図54は、集団が、機械的サポートを受けていなかった対象からの試料に限定された場合の結果を示す。研究の他の結果を、以下の表28において示す。
表28.心停止の統計学−不明なドナー遺伝子型による、かつ上界なしのMOMA

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