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課題・解決手段

本発明は、オリゴヌクレオチド、具体的にはSMAD7アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物、及びそれを調製するための方法に関する。

概要

背景

2.背景技術
オリゴヌクレオチドは、様々な生物学的及び生化学的用途に使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、創薬及び医薬品開発において、診断試験において、ポリメラーゼ連鎖反応PCR)におけるプライマーまたはプローブなどの研究剤として、目標検証におけるアンチセンス剤として、転写因子競合阻害剤として、リボザイムとして、アプタマーとして、免疫系の刺激物質として、または疾患を治療するための治療用生物学的薬剤として使用され得る。したがって、オリゴヌクレオチドの需要及び使用の増加は、それらの合成のための迅速、安価、かつ効率的な方法、より大きな複数キログラム規模の増加、及びGMP品質を有することに対する需要の増加をもたらした。

Mongersen(以前のGED−0301)は、ヒトSMAD7メッセンジャーRNAmRNA)にハイブリダイズする21塩基単鎖ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。Monteleone et al.2015,NEJM 372:1104−1113。第2相臨床試験において、mongersenを受けたクローン病を有する参加者は、プラセボを受けた参加者よりも顕著に高い寛解率及び臨床応答を有した。Monteleone et al.2015,NEJM 372:1104−1113。Mongersenは、配列5’−GTGCCCTTCT CCCCGC AGC−3’を有する21塩基オリゴヌクレオチドである。ホスホロチオエート化学は、ヌクレオチド間連結の各々において非結合酸素硫黄原子に置き換えることからなる。ヌクレオチド位置3及び16のシトシン残基は、5−メチル化によって修飾される。

天然に存在するオリゴヌクレオチド、ならびにホスホロチオエート及びホスホジチオエートオリゴヌクレオチドなどの修飾されたオリゴヌクレオチドを調製する現在の方法には、溶液及び固相合成手順が含まれる。例えば、固相合成において、手順は、成長オリゴヌクレオチド鎖の一端へのヌクレオチドの逐次付加に依存する。生物学的研究前臨床及び臨床試験、ならびに商業生産にしばしば必要である、MongersenなどのGMP品質を有する大量の複数キログラム量の単鎖ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの調製の必要性、ならびに迅速、安価、かつ効率的であり、また大きな複数キログラム規模で、及びGMPまたはCGMP品質を有する最終標的オリゴヌクレオチドを産生することができる、それを調製するための合成方法の必要性が依然として存在する。

概要

本発明は、オリゴヌクレオチド、具体的にはSMAD7アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物、及びそれを調製するための方法に関する。

目的

別の態様では、最大25重量%の水と、核酸配列
列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
を有するオリゴヌクレオチドを含む、少なくとも700mmolのオリゴヌクレオチド組成物であって、
1)Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表し、
2)オリゴヌクレオチドは、
a)固体支持体に結合されるリンカーを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

オリゴヌクレオチドの単一バッチ組成物であって、少なくとも700mmolの前記オリゴヌクレオチドと、最大25重量%の水と、を含み、前記オリゴヌクレオチドが、核酸配列:配列番号3:(5’−GTGCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有し、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、前記単一バッチ組成物。

請求項2

オリゴヌクレオチドの単一バッチ組成物であって、少なくとも2g/mmolの少なくとも700mmol合成スケールの前記オリゴヌクレオチドと、最大25重量%の水と、を含み、前記オリゴヌクレオチドが、核酸配列:配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有し、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、前記単一バッチ組成物。

請求項3

オリゴヌクレオチドの単一バッチ組成物であって、少なくとも2kgの前記オリゴヌクレオチドと、最大25重量%の水と、を含み、前記オリゴヌクレオチドが、核酸配列:配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有し、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、前記単一バッチ組成物。

請求項4

オリゴヌクレオチドの単一バッチ組成物であって、少なくとも1つの700mmol以上のオリゴヌクレオチド合成カラムから産生される(output)少なくとも50mol%の前記オリゴヌクレオチドと、最大25重量%の水と、を含み、前記オリゴヌクレオチドが、核酸配列:配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有し、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、前記単一バッチ組成物。

請求項5

前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間連結のうちの少なくとも1つが、O,O連結ホスホロチオエートである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単一バッチオリゴヌクレオチド組成物

請求項6

前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチド間連結のすべてが、O,O連結ホスホロチオエートである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の単一バッチオリゴヌクレオチド組成物。

請求項7

オリゴヌクレオチドの実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物であって、5’−末端ヌクレオシドの5’−ヒドロキシル基が保護され、前記オリゴヌクレオチドが、核酸配列:配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有し、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、前記実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物。

請求項8

前記5’−末端ヌクレオシドの前記5’−ヒドロキシル基のみが保護される、請求項7に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物。

請求項9

前記保護されたオリゴヌクレオチドが、切断及び合成カラムからの溶出後に得られる、請求項8に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物。

請求項10

前記組成物の純度が、60%以上である、請求項7〜9のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物。

請求項11

前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチド間連結のうちの少なくとも1つが、O,O連結ホスホロチオエートである、請求項7〜10のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物。

請求項12

前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチド間連結のすべてが、O,O連結ホスホロチオエートである、請求項7〜11のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物。

請求項13

前記オリゴヌクレオチドが、a)固体支持体に結合されるリンカーを提供することであって、前記リンカーが、保護されたヒドロキシル基を含む、前記固体支持体に結合されるリンカーを提供することと、b)前記リンカーの前記保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成することと、c)ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供することであって、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトが、保護されたヒドロキシル基及び保護されたホスホロアミダイトを含む、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供することと、d)前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを、前記リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成することと、e)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成することと、f)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングすることと、g)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護することと、h)前記提供、結合、チオール化、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップc)〜ステップg))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供することと、i)前記保護されたホスホロチオエート連結を脱保護することと、j)前記固体支持体から前記オリゴヌクレオチドを切断することと、k)前記固体支持体から前記オリゴヌクレオチドを溶出することと、l)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製することと、m)薄膜蒸発オリゴヌクレオチド化合物溶液濃縮することと、を含む、方法に従い調製される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の単一バッチオリゴヌクレオチド組成物、または請求項7〜12のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物。

請求項14

前記精製ステップl)が、1)溶出ステップk)からの前記オリゴヌクレオチド溶出物を前記イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填することと、2)前記保護されたヒドロキシル基を前記末端ヌクレオシドから脱保護することと、3)塩勾配を使用して、前記イオン交換クロマトグラフィーカラムから前記オリゴヌクレオチドを溶出することと、を含む、請求項13に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項15

前記精製ステップl)が、1)溶出ステップk)からの前記オリゴヌクレオチド溶出物を前記イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填することと、2)前記保護されたヒドロキシル基を前記末端ヌクレオシドから脱保護することと、3)塩勾配を使用して、前記イオン交換クロマトグラフィーカラムから前記オリゴヌクレオチドを溶出することと、4)限外濾過及び/または透析濾過により前記イオン交換カラムから前記オリゴヌクレオチド溶出物を脱塩することと、を含む、請求項13に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項16

結合されるリンカーを有する前記固体支持体が、架橋ポリスチレンである、請求項13〜15のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項17

前記未反応の脱保護されたヒドロキシル基が、アシル基でキャッピングされる、請求項13〜16のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項18

前記未反応の脱保護されたヒドロキシル基の前記キャッピングが、a)N−メチルイミダゾール(NMI)、ピリジン、及びアセトニトリルを含む、第1のキャッピング溶液(CapA)と、b)キャッピング剤及びアセトニトリルを含む、第2のキャッピング溶液(CapB)と、を添加することを含む、請求項13〜17のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項19

前記キャッピング剤が、イソ酪酸無水物である、請求項18に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項20

チオール化剤が、キサンタンヒドリド(XH)である、請求項13〜19のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項21

前記脱保護された固体支持体結合オリゴヌクレオチドの前記切断が、水酸化アンモニウムの溶液を提供することを含む、請求項13〜20のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項22

前記イオン交換クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項13〜21のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項23

前記オリゴヌクレオチド溶出物が、塩基性水溶液とともに前記イオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填される、請求項13〜22のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項24

前記イオン交換クロマトグラフィーカラム上の前記充填されたオリゴヌクレオチド溶出物の5’−ヒドロキシル保護基が、80%の水性酢酸で脱保護される、請求項13〜23のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項25

完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドが、塩基性塩勾配で前記イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出される、請求項13〜24のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項26

前記完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドが、限外濾過及び/または透析濾過工程により脱塩される、請求項13〜25のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項27

前記限外濾過及び/または透析濾過工程が、5〜8の範囲のpHの水を利用する、請求項13〜26のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項28

前記完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド溶出物が、薄膜蒸発で濃縮される、請求項13〜27のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項29

前記方法ステップが、列挙される順序で実施される、請求項13〜28のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項30

前記未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする前記任意選択のステップ及び前記ヌクレオシドの前記保護されたヒドロキシル基を脱保護する前記任意選択のステップが、最後の反復を除き、前記反応サイクルの各反復において実施される、請求項13〜29のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。

請求項31

医薬組成物であって、薬学的に許容されるアジュバント及び/または賦形剤とともに、請求項1〜6のいずれか1項に記載の単一バッチオリゴヌクレオチド組成物の少なくとも一部、請求項7〜12のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または請求項13〜30のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物を含む、前記医薬組成物。

請求項32

前記医薬組成物が、経口剤形である、請求項31に記載の医薬組成物。

請求項33

前記医薬組成物の前記経口剤形が、錠剤である、請求項32に記載の医薬組成物。

請求項34

前記錠剤が、コーティング錠剤である、請求項33に記載の医薬組成物。

請求項35

請求項1〜6のいずれか1項に記載の単一バッチオリゴヌクレオチド組成物の前記少なくとも一部、請求項7〜12のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または請求項13〜30のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物が、10〜500mgの範囲の、核酸配列:配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有する前記オリゴヌクレオチドを含み、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、請求項31〜34のいずれか1項に記載の医薬組成物。

請求項36

請求項1〜6のいずれか1項に記載の単一バッチオリゴヌクレオチド組成物の前記少なくとも一部、請求項7〜12のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または請求項13〜30のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物が、約40mgまたは約160mgの、核酸配列:配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有する前記オリゴヌクレオチドを含み、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、請求項31〜35のいずれか1項に記載の医薬組成物。

請求項37

炎症性腸疾患(IBD)を有する患者におけるIBDの治療または管理方法であって、請求項31〜36のいずれか1項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

請求項38

前記炎症性腸疾患(IBD)が、クローン病(CD)である、請求項37に記載の治療方法

請求項39

前記炎症性腸疾患(IBD)が、潰瘍性大腸炎(UC)である、請求項37に記載の治療方法。

請求項40

薬学的に許容されるアジュバント及び/または賦形剤とともに、請求項1〜6のいずれか1項に記載の単一バッチオリゴヌクレオチド組成物の前記少なくとも一部、請求項7〜12のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または請求項13〜30のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物を製剤化することを含む、請求項31〜36のいずれか1項に記載の医薬組成物の調製方法

請求項41

一連の錠剤の調製方法であって、請求項1〜6のいずれか1項に記載の単一バッチオリゴヌクレオチド組成物、請求項7〜12のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または請求項13〜30のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物を、経口投薬に適した一連の分量、量、または用量に分配することと、経口投薬に適した前記一連の分量、量、または用量の経口投薬に適した各分量、量、または用量を、薬学的に許容されるアジュバント及び/または賦形剤と組み合わせることと、を含む、前記方法。

請求項42

前記一連の錠剤が、少なくとも100の錠剤である、請求項41に記載の一連の錠剤の調製方法。

請求項43

前記一連の錠剤が、100〜1,000,000の錠剤である、請求項41に記載の一連の錠剤の調製方法。

請求項44

前記一連の錠剤が、一連のコーティング錠剤である、請求項41〜43のいずれか1項に記載の一連の錠剤の調製方法。

請求項45

経口投薬に適した前記一連の分量、量、または用量の経口投薬に適した各分量、量、または用量が、10〜500mgの範囲の、核酸配列:配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有する前記オリゴヌクレオチドを含み、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、請求項41〜44のいずれか1項に記載の一連の錠剤を調製する方法。

請求項46

経口投薬に適した前記一連の分量、量、または用量の経口投薬に適した各分量、量、または用量が、約40mgまたは約160mgの、核酸配列:配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有する前記オリゴヌクレオチドを含み、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、請求項41〜45のいずれか1項に記載の一連の錠剤を調製する方法。

請求項47

医薬組成物バッチであって、請求項1〜6のいずれか1項に記載の単一バッチオリゴヌクレオチド組成物の少なくとも一部、請求項7〜12のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または請求項13〜30のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物と、薬学的に許容されるアジュバント及び/または賦形剤と、を含む、前記医薬組成物バッチ。

請求項48

前記医薬組成物バッチが、少なくとも10重量%、少なくとも20重量%、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%、少なくとも50重量%、少なくとも60重量%、少なくとも70重量%、少なくとも80重量%、少なくとも90重量%、少なくとも95重量%、または100重量%の請求項1〜6のいずれか1項に記載の単一バッチオリゴヌクレオチド組成物、請求項7〜12のいずれか1項に記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または請求項13〜30のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド組成物を含む、請求項47に記載の医薬バッチ組成物

請求項49

前記医薬組成物バッチが、少なくとも1つの錠剤または少なくとも1つのコーティング錠剤を含む、請求項48または48に記載の医薬バッチ組成物。

請求項50

前記医薬組成物バッチが、一連の錠剤を含む、請求項48または48に記載の医薬バッチ組成物。

請求項51

前記一連の錠剤が、少なくとも100の錠剤である、請求項50に記載の医薬バッチ組成物。

請求項52

前記一連の錠剤が、100〜1,000,000の錠剤である、請求項50に記載の医薬バッチ組成物。

請求項53

前記一連の錠剤が、一連のコーティング錠剤である、請求項50〜52のいずれか1項に記載の医薬バッチ組成物。

請求項54

前記少なくとも1つの錠剤、前記少なくとも1つのコーティング錠剤、前記一連の錠剤の各々、または前記一連のコーティング錠剤の各々が、10〜500mgの範囲の、核酸配列:配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有する前記オリゴヌクレオチドを含み、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、請求項47〜53のいずれか1項に記載の医薬バッチ組成物。

請求項55

前記少なくとも1つの錠剤、前記少なくとも1つのコーティング錠剤、前記一連の錠剤の各々、または前記一連のコーティング錠剤の各々が、約40mgまたは約160mgの、核酸配列:配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’)を有する前記オリゴヌクレオチドを含み、配列中、Xが、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す、請求項47〜54のいずれか1項に記載の医薬バッチ組成物。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2017年7月28日出願の米国仮出願第62/538,504号の利益を主張する。前述の関連出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

0002

1.序論
本出願は、オリゴヌクレオチド、具体的にはSmad7アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物、及びそれを調製するための方法に関する。

背景技術

0003

2.背景技術
オリゴヌクレオチドは、様々な生物学的及び生化学的用途に使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、創薬及び医薬品開発において、診断試験において、ポリメラーゼ連鎖反応PCR)におけるプライマーまたはプローブなどの研究剤として、目標検証におけるアンチセンス剤として、転写因子競合阻害剤として、リボザイムとして、アプタマーとして、免疫系の刺激物質として、または疾患を治療するための治療用生物学的薬剤として使用され得る。したがって、オリゴヌクレオチドの需要及び使用の増加は、それらの合成のための迅速、安価、かつ効率的な方法、より大きな複数キログラム規模の増加、及びGMP品質を有することに対する需要の増加をもたらした。

0004

Mongersen(以前のGED−0301)は、ヒトSMAD7メッセンジャーRNAmRNA)にハイブリダイズする21塩基単鎖ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。Monteleone et al.2015,NEJM 372:1104−1113。第2相臨床試験において、mongersenを受けたクローン病を有する参加者は、プラセボを受けた参加者よりも顕著に高い寛解率及び臨床応答を有した。Monteleone et al.2015,NEJM 372:1104−1113。Mongersenは、配列5’−GTGCCCTTCT CCCCGC AGC−3’を有する21塩基オリゴヌクレオチドである。ホスホロチオエート化学は、ヌクレオチド間連結の各々において非結合酸素硫黄原子に置き換えることからなる。ヌクレオチド位置3及び16のシトシン残基は、5−メチル化によって修飾される。

0005

天然に存在するオリゴヌクレオチド、ならびにホスホロチオエート及びホスホジチオエートオリゴヌクレオチドなどの修飾されたオリゴヌクレオチドを調製する現在の方法には、溶液及び固相合成手順が含まれる。例えば、固相合成において、手順は、成長オリゴヌクレオチド鎖の一端へのヌクレオチドの逐次付加に依存する。生物学的研究前臨床及び臨床試験、ならびに商業生産にしばしば必要である、MongersenなどのGMP品質を有する大量の複数キログラム量の単鎖ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの調製の必要性、ならびに迅速、安価、かつ効率的であり、また大きな複数キログラム規模で、及びGMPまたはCGMP品質を有する最終標的オリゴヌクレオチドを産生することができる、それを調製するための合成方法の必要性が依然として存在する。

0006

3.発明の概要
一態様では、少なくとも700mmolのオリゴヌクレオチドと、最大25重量%の水と、を含むオリゴヌクレオチドの単一バッチ組成物が本明細書で提供され、オリゴヌクレオチドは、核酸配列
列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
を有し、配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す。

0007

別の態様では、少なくとも2g/mmolの少なくとも700mmol合成スケールのオリゴヌクレオチドと、最大25重量%の水と、を含むオリゴヌクレオチドの単一バッチ組成物が本明細書で提供され、オリゴヌクレオチドは、核酸配列:
配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
を有し、配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す。

0008

別の態様では、少なくとも2kgのオリゴヌクレオチドと、最大25重量%の水と、を含むオリゴヌクレオチドの単一バッチ組成物が本明細書で提供され、オリゴヌクレオチドは、核酸配列:
配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
を有し、配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す。

0009

別の態様では、少なくとも1つの700mmol以上のオリゴヌクレオチド合成カラムから産生される(output)少なくとも50mol%のオリゴヌクレオチドと、最大25重量%の水と、を含む オリゴヌクレオチドの単一バッチ組成物が本明細書で提供され、オリゴヌクレオチドは、核酸配列:
配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
を有し、配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す。

0010

別の態様では、オリゴヌクレオチドの実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物が本明細書で提供され、5’−末端ヌクレオシドの5’−ヒドロキシル基は保護され、オリゴヌクレオチドは、核酸配列:
配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
を有し、配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す。

0011

別の態様では、最大25重量%の水と、核酸配列:
配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
を有するオリゴヌクレオチドを含む、少なくとも700mmolのオリゴヌクレオチド組成物であって、
1)Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表し、
2)オリゴヌクレオチドは、
a)固体支持体に結合されるリンカーを提供することであって、リンカーが、保護されたヒドロキシル基を含む、固体支持体に結合されるリンカーを提供することと、
b)リンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成することと、
c)ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供することであって、ヌクレオシドホスホロアミダイトが、保護されたヒドロキシル基及び保護されたホスホロアミダイトを含む、ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供することと、
d)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成することと、
e)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成することと、
f)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングすることと、
g)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護することと、
h)提供、結合、チオール化、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップc)〜ステップg)を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供することと、
i)保護されたホスホロチオエート連結を脱保護することと、
j)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断することと、
k)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出することと、
l)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製することと、
m)薄膜蒸発オリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮することと、を含む方法に従い調製される。

0012

本明細書で開示される調製方法複数可)または調製方法に従い調製された単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド組成物のある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間連結のうちの少なくとも1つは、O,O連結ホスホロチオエートである。

0013

本明細書で開示される調製方法(複数可)または調製方法に従い調製された単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド組成物のある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間連結のすべてが、O,O連結ホスホロチオエートである。

0014

本明細書で開示される単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または調製方法のある特定の実施形態では、精製ステップl)は、
1)溶出ステップk)からのオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラムに充填することと、
2)保護されたヒドロキシル基を末端ヌクレオシドから脱保護することと、
3)塩勾配を使用して、イオン交換クロマトグラフィーカラムからオリゴヌクレオチドを溶出することと、を含む。

0015

本明細書で開示される単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または調製方法のある特定の実施形態では、精製ステップl)は、
1)溶出ステップk)からのオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラムに充填することと、
2)保護されたヒドロキシル基を末端ヌクレオシドから脱保護することと、
3)塩勾配を使用して、イオン交換クロマトグラフィーカラムからオリゴヌクレオチドを溶出することと、
4)限外濾過及び/または透析濾過によりイオン交換カラムからオリゴヌクレオチド溶出物を脱塩することと、を含む。

0016

本明細書で開示される単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または調製方法のある特定の実施形態では、濃縮ステップm)は、薄膜蒸発で、脱塩されたオリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮することを含む。

0017

本明細書で開示される単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または調製方法のある特定の実施形態では、充填されたオリゴヌクレオチド溶出物の末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基は、プロトン酸で脱保護される。

0018

本明細書で開示される単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または調製方法のある特定の実施形態では、5’−ヒドロキシル保護基は、80%の水性酢酸などの酢酸で脱保護される。

0019

本明細書で開示される単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または調製方法のある特定の実施形態では、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドは、限外濾過及び/または透析濾過工程により脱塩される。

0020

本明細書で開示される単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または調製方法のある特定の実施形態では、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド溶出物は、薄膜蒸発で濃縮される。

0021

本明細書で開示される単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または調製方法のある特定の実施形態では、薄膜蒸発による濃縮された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドは、液体組成物であり、凍結乾燥工程を受けない。

0022

本明細書で開示される単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または調製方法のある特定の実施形態では、薄膜蒸発による濃縮された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドは、凍結乾燥工程によりさらに濃縮される。

0023

本明細書で開示される単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または調製方法のある特定の実施形態では、本方法のステップは、列挙される順序で実施される。

0024

別の態様では、薬学的に許容されるアジュバント及び/または賦形剤とともに、本明細書で開示される単一バッチ組成物の少なくとも一部もしくは実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または本明細書で開示される調製方法に従い調製されたオリゴヌクレオチド組成物を含む医薬組成物が本明細書で提供される。

0025

医薬組成物のある特定の実施形態では、医薬組成物は、錠剤またはコーティング錠剤などの経口剤形である。

0026

医薬組成物のある特定の実施形態では、医薬組成物は、10〜500mgの範囲の、核酸配列:
配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
(配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す)を有するオリゴヌクレオチドを含む。

0027

医薬組成物のある特定の実施形態では、医薬組成物は、約40mgまたは約160mgの、核酸配列:
配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
(配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す)を有するオリゴヌクレオチドを含む。

0028

別の態様では、薬学的に許容されるアジュバント及び/または賦形剤とともに、本明細書で開示される単一バッチ組成物の少なくとも一部もしくは実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または本明細書で開示される調製方法に従い調製されたオリゴヌクレオチド組成物を製剤化することを含む、医薬組成物の調製方法が本明細書で提供される。

0029

別の態様では、本明細書で開示される単一バッチ組成物もしくは実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または本明細書で開示される調製方法に従い調製されたオリゴヌクレオチド組成物を、経口投薬に適した一連の分量、量、または用量に分配することと、経口投薬に適した一連の分量、量、または用量の経口投薬に適した各分量、量、または用量を、薬学的に許容されるアジュバント及び/または賦形剤と混合することと、を含む、一連の医薬組成物の調製方法が本明細書で提供される。

0030

一連の医薬組成物の調製方法のある特定の実施形態では、一連の医薬組成物は、少なくとも100の医薬組成物である。

0031

一連の医薬組成物の調製方法のある特定の実施形態では、一連の医薬組成物は、100〜1,000,000の医薬組成物である。

0032

一連の医薬組成物の調製方法のある特定の実施形態では、経口投薬に適した一連の分量、量、または用量の経口投薬に適した各分量、量、または用量は、10〜500mgの範囲の、核酸配列:
配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
(配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す)を有するオリゴヌクレオチドを含む。

0033

一連の医薬組成物の調製方法のある特定の実施形態では、経口投薬に適した一連の分量、量、または用量の経口投薬に適した各分量、量、または用量は、約40mgまたは約160mgの範囲の、核酸配列:
配列番号3:(5’−GTXGCCCCTTCT CCC XGC AGC−3’)
(配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジンを表す)を有するオリゴヌクレオチドを含む。

0034

一連の医薬組成物の調製方法のある特定の実施形態では、一連の医薬組成物は一連の錠剤である。

0035

一連の医薬組成物の調製方法のある特定の実施形態では、一連の医薬組成物は一連のコーティング錠剤である。

0036

別の態様では、本明細書で開示される単一バッチ組成物の少なくとも一部もしくは実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または本明細書で開示される調製方法に従い調製されたオリゴヌクレオチド組成物と、薬学的に許容されるアジュバント及び/または賦形剤と、を含む医薬組成物バッチが本明細書で提供される。

0037

医薬組成物バッチのある特定の実施形態では、医薬組成物バッチは、少なくとも10重量%、少なくとも20重量%、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%、少なくとも50重量%、少なくとも60重量%、少なくとも70重量%、少なくとも80重量%、少なくとも90重量%、少なくとも95重量%、または100重量%の、単一バッチ組成物、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド組成物、または本明細書で開示される調製方法に従い調製されたオリゴヌクレオチド組成物を含む。

0038

医薬組成物バッチのある特定の実施形態では、医薬組成物バッチは、錠剤またはコーティング錠剤などの少なくとも1つの経口剤形を含む。

0039

医薬組成物バッチのある特定の実施形態では、医薬組成物バッチは、一連の錠剤または一連のコーティング錠剤などの一連の経口剤形を含む。

0040

本明細書で開示される単一バッチ組成物、医薬組成物バッチ、単一バッチ組成物の調製方法、医薬組成物の調製方法、または一連の医薬組成物を調製する方法のある特定の実施形態では、単一バッチ組成物、医薬組成物バッチ、単一バッチ組成物を調製する方法、医薬組成物を調製する方法、または一連の医薬組成物の調製方法は、それぞれ、21 CFR 210.3(2)及び21 CFR 210.3(10)に基づいて定義される用語バッチまたはロットに従う。

0041

別の態様では、本明細書で開示される医薬組成物を投与することを含む、炎症性腸疾患(IBD)を有する患者におけるIBDの治療または管理方法が本明細書で提供される。

0042

炎症性腸疾患(IBD)を有する患者におけるIBDの治療または管理方法のある特定の実施形態では、炎症性腸疾患(IBD)はクローン病(CD)である。

0043

炎症性腸疾患(IBD)を有する患者におけるIBDの治療または管理方法のある特定の実施形態では、炎症性腸疾患(IBD)は潰瘍性大腸炎(UC)である。

0044

以下の図面は、開示される工程の態様を例示するが、本明細書で開示される工程または実施例の範囲を限定するものではない。

図面の簡単な説明

0045

4.図面の簡単な説明
本明細書で使用される単一バッチオリゴヌクレオチド組成物を調製するある特定の実施形態の略図である。

0046

5.発明を実施するための形態
本明細書で使用される場合、「抗SMAD7ODN」及び「抗SMAD7オリゴヌクレオチド」という用語は、SMAD7遺伝子から転写されたmRNA分子の核酸配列に相補的な核酸配列を含むオリゴヌクレオチド(ODN)を指すことが理解される。より具体的には、そのようなオリゴヌクレオチドは、そのようなmRNAのコード領域の核酸配列に相補的であってよい。ある特定の実施形態では、抗SMAD7 ODNは、細胞(例えば、免疫細胞、例えば、PBMC、pDC、またはB細胞)に導入される場合、SMAD7の発現を低減し得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7 ODNは、遺伝子から転写されたmRNAの発現を低減し得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7 ODNは、遺伝子によってコードされたタンパク質の発現を低減し得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7 ODNは、抗SMAD7 ODNが導入される細胞由来の遺伝子によってコードされるタンパク質の分泌を低減し得る。

0047

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」及び「ODN」という用語は、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは少なくとも30ヌクレオチド長、最大4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは最大30ヌクレオチド長、または10〜25、15〜30、15〜25、もしくは20〜30ヌクレオチド長、または18、19、20、21、22、23、24、25、もしくは26ヌクレオチド長の核酸配列を含む核酸を指すことが理解される。ある特定の実施形態では、ODNの2つの隣接するヌクレオシド間のヌクレオシド間連結は、リン酸塩連結、例えば、一リン酸塩連結であり得るか、またはホスホロチオエート連結であり得る。ある特定の実施形態では、ODNは、1つ以上のリン酸塩ヌクレオシド間連結と、1つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、ODNの2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオシドは、リン酸塩連結、例えば、一リン酸塩連結により連結される。例えば、ある特定の実施形態では、ODNの2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオシドは、ホスホロチオエート連結により連結される。ある特定の実施形態では、ODNのオリゴ(または糖)部分は、天然に存在する糖、例えば、フラノース環系(例えば、リボーズまたは2’−デオキシリボーズ環系)である。例えば、ある特定の実施形態では、ODNはデオキシリボヌクレオチドである(すなわち、ODNのオリゴ(または糖)部分はデオキシリボーズである)。ある特定の実施形態では、ODNはリボヌクレオチドである(すなわち、ODNのオリゴ(または糖)部分はリボーズである)。例えば、ある特定の実施形態では、所望のODNを調製するために利用されたヌクレオシド(複数可)のオリゴ(または糖)部分はデオキシリボーズである。ある特定の実施形態では、所望のODNを調製するために利用されたヌクレオシド(複数可)のオリゴ(または糖)部分はリボーズである。ある特定の実施形態では、ODNの1つ以上の塩基は、化学修飾され、例えば、メチル化される(例えば、5−メチル−シトシン、6−O−メチル−グアニン、または7−メチル−グアニン)。ODNの追加の例示的な化学修飾は、5.2節に記載される。

0048

本明細書で使用される場合、「SMAD7」(CRCS3、FLJ16482、MADH7、MADH8、MAD(mothers against decapentaplegic、Drosophila)ホモログ7、MADホモログ8、SMAD、mothers againstDPPホモログ7、mothers against DPPホモログ8としても知られる)という用語は、ヒトタンパク質、またはEntrez GeneID No.4092により同定された遺伝子及びその対立遺伝子変異型によってコードされるmRNA転写物のいずれかを意味することが理解される。

0049

本明細書で使用される場合、「単一バッチ組成物」及び「単一バッチオリゴヌクレオチド組成物」という用語は、所定量の充填容量の、固体支持体(例えば、それに結合されるリンカーを伴う固体支持体)を有する少なくとも1つのオリゴヌクレオチド合成カラム、または所定量の充填容量の、固体支持体を有するオリゴヌクレオチド合成カラム上での少なくとも1つの合成実行から得られるオリゴヌクレオチド組成物を指すことが理解される。例えば、ある特定の実施形態では、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)は、所定量の充填容量の、固体支持体(例えば、それに結合されるリンカーを伴う固体支持体)を有する複数のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)、または所定量の充填容量の、固体支持体を有するオリゴヌクレオチド合成カラム上での複数の合成実行(複数可)から得られるオリゴヌクレオチド組成物を指す。例えば、ある特定の実施形態では、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)は、所定量の充填容量の、固体支持体を有する最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは最大60のオリゴヌクレオチド合成カラム、または所定量の充填容量のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)上での合成実行(例えば、並列カラム上でのまたは互いに続く実行)、例えば、所定量の充填容量の、固体支持体を有する1〜60、1〜55、1〜50、1〜45、1〜40、1〜35、1〜30、1〜25、1〜20、1〜15、1〜10、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、3〜10、3〜8、3〜5、4〜6、5〜10、10〜60、10〜50、10〜40、10〜30、10〜25、10〜20、10〜15、20〜50、30〜60、もしくは40〜55以下のオリゴヌクレオチド合成カラム、または所定量の充填容量のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)上での合成実行(例えば、並列カラム上でのまたは互いに続く実行)から得られるオリゴヌクレオチド組成物を指す。例えば、ある特定の実施形態では、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)は、所定量の充填容量の、固体支持体(例えば、それに結合されるリンカーを伴う固体支持体)を有する少なくとも1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)、または所定量の充填容量の、固体支持体を有するオリゴヌクレオチド合成カラム上での少なくとも1回または複数の合成実行(複数可)から得られるオリゴヌクレオチド組成物を指し、所定量の充填容量の、固体支持体を有する少なくとも1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)(または合成実行(複数可))からのオリゴヌクレオチド合成産物(output)は、(1)単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)を液体オリゴヌクレオチド組成物もしくは固体オリゴヌクレオチド組成物として提供するか、または(2)プールもしくは組み合わされて(結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物が均一の特徴及び品質を有する、例えば、物理的及び化学的特性が該結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物全体に分布されるように)、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)を液体オリゴヌクレオチド組成物もしくは固体オリゴヌクレオチド組成物として提供することができる。例えば、ある特定の実施形態では、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)は、所定量の充填容量の、固体支持体(例えば、それに結合されるリンカーを伴う固体支持体)を有する少なくとも1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)、または所定量の充填容量の、固体支持体を有するオリゴヌクレオチド合成カラム上での少なくとも1回または複数の合成実行(複数可)から得られるオリゴヌクレオチド組成物を指し、所定量の充填容量の、固体支持体を有する少なくとも1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)(または合成実行(複数可))からのオリゴヌクレオチド合成産物は、(1)オリゴヌクレオチド化学変換工程(例えば、オリゴヌクレオチド脱保護または固体支持体からの切断)、オリゴヌクレオチド精製工程(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)、オリゴヌクレオチド脱塩工程(例えば、限外濾過及び/または透析濾過)、液体組成物濃縮工程(例えば、薄膜蒸発)もしくは乾燥工程(例えば、凍結乾燥)またはそれらの組み合わせを含む、少なくとも1つのさらなる工程(複数可)により、単一反復もしくは複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理されるか、(2)プールもしくは組み合わされ(結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物が均一の特徴及び品質を有する、例えば、物理的及び化学的特性が該結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物全体に分布されるように)、(a)少なくとも1つのさらなる工程(複数可)(またはそれらの組み合わせ)により、単一反復または複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理される前に、または(b)少なくとも1つのさらなる工程(複数可)(またはそれらの組み合わせ)により、複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理される前に、引き続き、結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物をより少ない分量に分配する、あるいは(3)少なくとも1つのさらなる工程(複数可)(またはそれらの組み合わせ)により、複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理される前に、より少ない分量に分配し得る。例えば、ある特定の実施形態では、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)は、所定量の充填容量の、固体支持体(例えば、それに結合されるリンカーを伴う固体支持体)を有する少なくとも1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)、または所定量の充填容量の、固体支持体を有するオリゴヌクレオチド合成カラム上での少なくとも1回または複数の合成実行(複数可)から得られるオリゴヌクレオチド組成物を指し、所定量の充填容量の、固体支持体を有する少なくとも1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)(または合成実行(複数可))からのオリゴヌクレオチド合成産物は、オリゴヌクレオチド化学変換工程(例えば、オリゴヌクレオチド脱保護または固体支持体からの切断)、オリゴヌクレオチド精製工程(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)、オリゴヌクレオチド脱塩工程(例えば、限外濾過及び/または透析濾過)、液体組成物濃縮工程(例えば、薄膜蒸発)もしくは乾燥工程(例えば、凍結乾燥)またはそれらの組み合わせを含む、少なくとも1つのさらなる工程(複数可)により、単一反復もしくは複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理され得、(1)オリゴヌクレオチド合成産物は、(a)プールもしくは組み合わされ(結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物が均一の特徴及び品質を有する、例えば、物理的及び化学的特性が該結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物全体に分布されるように)、(i)少なくとも1つのさらなる工程(複数可)(またはそれらの組み合わせ)により、単一反復または複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理される前に、または(ii)少なくとも1つのさらなる工程(複数可)(またはそれらの組み合わせ)により、複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理される前に、引き続き、結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物をより少ない分量に分配するか、あるいは(b)少なくとも1つのさらなる工程(複数可)(またはそれらの組み合わせ)により、複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理される前に、より少ない分量に分配し得、及び/または(2)少なくとも1つのさらなる工程(複数可)のうちのいずれか1つ、複数、もしくは各々から得られる産物は、(a)単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)を液体オリゴヌクレオチド組成物もしくは固体オリゴヌクレオチド組成物として提供するか、(b)プールもしくは組み合わされて(結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物が均一の特徴及び品質を有する、例えば、物理的及び化学的特性が該結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物全体に分布されるように)、(i)単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)を液体オリゴヌクレオチド組成物もしくは固体オリゴヌクレオチド組成物として提供するか、(ii)第2の、次の、もしくは下流の(例えば、図1を参照されたい)少なくとも1つのさらなる工程(複数可)(またはそれらの組み合わせ)により、単一反復または複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理される前に、または(iii)第2の、次の、もしくは下流の(例えば、図1を参照されたい)少なくとも1つのさらなる工程(複数可)(またはそれらの組み合わせ)により、複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理される前に、引き続き、結果として生じるプールされた/組み合わされたオリゴヌクレオチド組成物をより少ない分量に分配する、あるいは(c)第2の、次の、もしくは下流の(例えば、図1を参照されたい)少なくとも1つのさらなる工程(複数可)(またはそれらの組み合わせ)により、複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理される前に、より少ない分量に分配し得る。例えば、ある特定の実施形態では、特定の工程(オリゴヌクレオチド合成工程、化学変換工程、精製工程、脱塩工程、液体濃縮工程、及び/または乾燥工程、またはそれらの組み合わせなど)の産物(複数可)の、プールもしくは組み合わせ工程、またはプールもしくは組み合わせ工程から得られる結果として生じるオリゴヌクレオチド組成物(例えば、単一バッチ組成物または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)は、米国連規則集第21編第210条及び第211条(それぞれ、「21 CFR 210」及び「21 CFR 211」)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に基づくCGMP要件準拠している。例えば、ある特定の実施形態では、特定の工程(オリゴヌクレオチド合成工程、化学変換工程、精製工程、脱塩工程、液体濃縮工程、及び/または乾燥工程、またはそれらの組み合わせなど)の産物(複数可)の単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)及び/またはプールもしくは組み合わせ工程から得られる結果として生じるオリゴヌクレオチド組成物は、21 CFR 210.3(2)に基づいて定義される「バッチ」という用語を遵守し得る(バッチ」とは、規定制限内で均一の特徴及び品質を有することが意図され、同じ製造サイクル中に単一の製造指図書に従い生産される薬物または他の材料の具体的な量を意味する)。例えば、ある特定の実施形態では、特定の工程(オリゴヌクレオチド合成工程、化学変換工程、精製工程、脱塩工程、液体濃縮工程、及び/または乾燥工程、またはそれらの組み合わせなど)の産物(複数可)の単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)及び/またはプールもしくは組み合わせ工程から得られる結果として生じるオリゴヌクレオチド組成物は、21 CFR 210.3(10)に基づいて定義される「ロット」という用語を遵守し得る(「「ロット」とは、規定制限内で均一の特徴及び品質を有するバッチもしくはバッチの具体的に特定された分量を意味するか、または連続工程により生産される薬物製品の場合、それが規定制限内で均一の特徴及び品質を有することを確実にする様式で、時間もしくは量の単位において生産された具体的に特定された量である」)。ある特定の実施形態では、具体的な量は、少なくとも10
0mmol、例えば、少なくとも150mmol、少なくとも200mmol、少なくとも250mmol、少なくとも300mmol、少なくとも500mmol、少なくとも600mmol、少なくとも700mmol、少なくとも800mmol、少なくとも900mmol、少なくとも1,000mmol、少なくとも1,200mmol、少なくとも1,400mmol、少なくとも1,600mmol、少なくとも1,800mmol、少なくとも2,000mmol、少なくとも2,500mmol、少なくとも3,000mmol、少なくとも3,500mmol、少なくとも4,000mmol、または少なくとも5,000mmolであってよく、例えば、具体的な量は、300〜5,400mmolの範囲、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、300〜3,600mmol、300〜3,000mmol、600〜3,000mmol、700〜3,600mmol、700〜2,700mmol、700〜2,500mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,900mmol、700〜1,800mmol、700〜1,700mmol、700〜1,600mmol、700〜1,500mmol、700〜1,400mmol、700〜1,300mmol、700〜1,200mmol、700〜1,100mmol、700〜1,000mmol、700〜900mmol、800〜1,200mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,800mmol、900〜2,400mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,800〜2,700mmol、1,800〜3,600mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,500mmol、1,000〜2,000mmol、1,000〜1,500mmol、1,250〜1,750mmol、1,500〜3,000mmol、1,500〜2,500mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、2,000〜3,000mmol、2,500〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、または3,600〜5,400mmolの範囲であってよい。ある特定の実施形態では、所定量の充填容量の、固体支持体を有する少なくとも1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)(または合成実行(複数可))により合成された、及び/または該少なくとも1つもしくは該複数のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)(または合成実行(複数可))からの結果として生じるオリゴヌクレオチド合成産物に含まれるオリゴヌクレオチドの量は、オリゴヌクレオチドの具体定な量であり得る。ある特定の実施形態では、さらなる工程のうちの1つ以上またはさらなる工程の各々は、具体的な量のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド組成物を用いて実施され得る。ある特定の実施形態では、合成工程から下流のさらなる工程(例えば、オリゴヌクレオチド化学変換工程(例えば、オリゴヌクレオチド脱保護または固体支持体からの切断)、オリゴヌクレオチド精製工程(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)、オリゴヌクレオチド脱塩工程(例えば、限外濾過及び/または透析濾過)、液体組成物濃縮工程(例えば、薄膜蒸発)、及び/または乾燥工程(例えば、凍結乾燥))により処理されたオリゴヌクレオチドの量は、オリゴヌクレオチドの具体定な量であり得る。例えば、合成工程から下流のさらなる工程により処理されたオリゴヌクレオチドの具体的な量は、単一反復で処理され得るか、分配され、その後複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理され得るか、または複数の並列反復のうちの1つ以上または各々で(必ずしも同時に行われる必要はない)処理され得る。ある特定の実施形態では、さらなる工程のうちの1つ以上またはさらなる工程の各々は、単一反復で、例えば、オリゴヌクレオチドの具体的な量を伴うスケールで実施され得る。ある特定の実施形態では、さらなる工程のうちの1つ以上またはさらなる工程の各々は、複数の反復で、例えば、オリゴヌクレオチドの具体的な量を伴うスケールで、例えば、複数の並列反復で(必ずしも同時に行われる必要はない)実施され得るか、または同じ機器(例えば、合成カラム、イオン交換カラム)を連続的に利用して行われる複数の反復で、もしくはそれらの組み合わせで実施され得る。ある特定の実施形態では、複数の並列反復(必ずしも同時に行われる必要はない)は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または最大60以下の並列反復、例えば、2〜60、2〜55、2〜50、2〜45、2〜40、2〜35、2〜30、2〜25、2〜20、2〜15、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜10、3〜8、3〜5、4〜6、5〜10、10〜60、10〜50、10〜40、10〜30、10〜25、10〜20、10〜15、20〜50、30〜60、または40〜55以下の並列反復であり得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド合成産物、またはさらなる工程(化学変換されたオリゴヌクレオチド産物、精製されたオリゴヌクレオチド産物、脱塩されたオリゴヌクレオチド産物、濃縮されたオリゴヌクレオチド液体組成物の産物、及び/または乾燥させたオリゴヌクレオチド組成物の産物など)から生じる産物は、具体的な量のオリゴヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド合成工程またはさらなる工程のうちの1つ以上から生じる少なくとも1つの産物、プールもしくは組み合わされた産物、または分配された産物は、具体的な量のオリゴヌクレオチドであり得る(またはそれを含む)。ある特定の実施形態では、さらなる工程(複数可)は、次の順序で合成プロセルから下流で行われ得る:オリゴヌクレオチド化学変換工程(例えば、オリゴヌクレオチド脱保護または固体支持体からの切断)、オリゴヌクレオチド精製工程(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)、オリゴヌクレオチド脱塩工程(例えば、限外濾過及び/または透析濾過)、液体組成物濃縮工程(例えば、薄膜蒸発)、及び乾燥工程(例えば、凍結乾燥)。ある特定の実施形態では、さらなる工程(複数可)は、次の順序で合成プロセルから下流で行われ得る:オリゴヌクレオチド化学変換工程(例えば、オリゴヌクレオチド脱保護または固体支持体からの切断)、オリゴヌクレオチド精製工程(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)、及びオリゴヌクレオチド脱塩工程(例えば、限外濾過及び/または透析濾過)。この順序の後に、液体組成物濃縮工程(例えば、薄膜蒸発)及び/または乾燥工程(例えば、凍結乾燥)が続くか、または順序は、液体組成物濃縮工程(例えば、薄膜蒸発)及び/または乾燥工程(例えば、凍結乾燥)を含まなくてもよい。ある特定の実施形態では、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)は、液体オリゴヌクレオチド組成物(例えば、精製された液体オリゴヌクレオチド組成物、脱塩及び精製された液体オリゴヌクレオチド組成物、または濃縮されたオリゴヌクレオチド液体組成物)であり得る。ある特定の実施形態では、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)を調製するために利用される方法は、凍結乾燥工程などの乾燥工程を含まない。ある特定の実施形態では、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)を調製するために利用される方法は、薄膜蒸発工程などの液体組成物濃縮工程、及び凍結乾燥工程などの乾燥工程を含まない。ある特定の実施形態では、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)は、固体オリゴヌクレオチド組成物であり得る。ある特定の実施形態では、単一バッチ組成物(または単一バッチオリゴヌクレオチド組成物)を調製するために利用される方法は、凍結乾燥工程などの乾燥工程を含まない。

0050

本出願は、オリゴヌクレオチド化合物を得るために、結合、チオール化(または酸化)、(任意選択で)キャッピング及び(任意選択で)脱保護、固体支持体からの粗製の保護されたオリゴヌクレオチドの切断、粗製の保護されたオリゴヌクレオチドの分取陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上への充填、続いて脱保護、そして陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製、限外濾過/透析濾過による脱塩、ならびに薄膜蒸発による濃縮などのオリゴヌクレオチド化合物溶液の濃縮の反復合成サイクルを伴う固相オリゴヌクレオチド合成を含む多ステップ工程において、オリゴヌクレオチド化合物、例えば、ホスホロチオエート連結オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを調製する方法を提供する。

0051

より具体的には、反復合成工程は、ホスホロアミダイト化学、5’−(4,4’−ジメトキシトリチル)(DMT)保護基などのトリチル保護基及び固体支持体、例えば、それに結合されるリンカーを伴う架橋ポリスチレン固体支持体などの、制御された細孔ガラスまたは架橋ポリスチレン固体支持体を利用して、オリゴヌクレオチド配列を組み立て、反復合成は、結合、チオール化(または酸化)、(任意選択で)キャッピング、及び(任意選択で)5’−脱保護を伴う。ホスホロアミダイト化学を利用する結合反応は、選択されたデオキシリボ−アミイト活性化、支持体固定化された保護されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの遊離5’−ヒドロキシル基との反応を含む。規定数の反復合成サイクル後、リン酸塩連結またはホスホロチオエート連結上の保護基、例えばシアノエチル保護基を除去し、次いで、結果として生じる粗製のオリゴヌクレオチドを、粗製のオリゴヌクレオチド上の塩基性保護基も脱保護する塩基処理により、固体支持体から切断する。末端オリゴヌクレオシド上に5’−ヒドロキシル保護基をまだ有する、結果として生じる粗製のオリゴヌクレオチドを分取陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填し、末端5’−ヒドロキシル保護基をプロトン酸で脱保護する。脱保護されたオリゴヌクレオチドを、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、限外濾過/透析濾過により脱塩し、次いで、薄膜蒸発により濃縮するなど、濃縮して過剰の水を除去して、オリゴヌクレオチド化合物を得る。

0052

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、次のステップ:
a)固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップであって、リンカーが、保護されたヒドロキシル基を含む、固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップと、
b)リンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成するステップと、
c)ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供することであって、ヌクレオシドホスホロアミダイトが、保護されたヒドロキシル基及び保護されたホスホロアミダイトを含む、ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供するステップと、
d)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成するステップと、
e)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成するステップと、
f)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップと、
g)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップと、
h)提供、結合、チオール化、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップc)〜ステップg))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
i)保護されたホスホロチオエート連結を脱保護するステップと、
j)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するステップと、
k)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、
l)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製するステップと、
m)薄膜蒸発で濃縮するなど、オリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮するステップと、を含むか、またはそれらからなり得る。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップ及び/またはヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップを含む。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする任意選択のステップ及びヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を脱保護する任意選択のステップは、最後の反復を除き(すなわち、最後の反復では実施されない)、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い反応サイクルの各反復において実施される。

0053

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、次のステップ:
a)固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップであって、リンカーが、保護されたヒドロキシル基を含む、固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップと、
b)リンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成するステップと、
c)ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供するステップであって、ヌクレオシドホスホロアミダイトが、保護されたヒドロキシル基及び保護されたホスホロアミダイトを含む、ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供するステップと、
d)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成するステップと、
e)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成するステップと、
f)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップと、
g)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップと、
h)提供、結合、チオール化、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップc)〜ステップg))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
i)保護されたホスホロチオエート連結を脱保護するステップと、
j)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するステップと、
k)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、
l)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製するステップであって、
1)溶出ステップk)からのオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラムに充填するステップと、
2)末端ヌクレオシドからの保護されたヒドロキシル基を脱保護するステップと、
3)塩勾配を使用して、イオン交換クロマトグラフィーカラムからオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、
m)薄膜蒸発で濃縮するなど、オリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮するステップと、を含むか、またはそれらからなり得る。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップ及び/またはヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップを含む。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする任意選択のステップ及びヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を脱保護する任意選択のステップは、最後の反復を除き(すなわち、最後の反復では実施されない)、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い反応サイクルの各反復において実施される。

0054

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、次のステップ:
a)固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップであって、リンカーが、保護されたヒドロキシル基を含む、固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップと、
b)リンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成するステップと、
c)ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供するステップであって、ヌクレオシドホスホロアミダイトが、保護されたヒドロキシル基及び保護されたホスホロアミダイトを含む、ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供するステップと、
d)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成するステップと、
e)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成するステップと、
f)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップと、
g)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップと、
h)提供、結合、チオール化、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップc)〜ステップg))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
i)保護されたホスホロチオエート連結を脱保護するステップと、
j)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するステップと、
k)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、
l)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製するステップであって、
1)溶出ステップk)からのオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラムに充填するステップと、
2)保護されたヒドロキシル基を末端ヌクレオシドから脱保護するステップと、
3)塩勾配を使用して、イオン交換クロマトグラフィーカラムからオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、
4)限外濾過及び/または透析濾過によりイオン交換カラムからオリゴヌクレオチド溶出物を脱塩するステップと、
m)薄膜蒸発で濃縮するなど、脱塩されたオリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮するステップと、を含むか、またはそれらからなり得る。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップ及び/またはヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップを含む。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする任意選択のステップ及びヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を脱保護する任意選択のステップは、最後の反復を除き(すなわち、最後の反復では実施されない)、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い反応サイクルの各反復において実施される。

0055

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、次のステップ:
a)固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップであって、リンカーが、保護されたヒドロキシル基を含む、固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップと、
b)リンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成するステップと、
c)ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供することであって、ヌクレオシドホスホロアミダイトが、保護されたヒドロキシル基及び保護されたホスホロアミダイトを含む、ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供するステップと、
d)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成するステップと、
e)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成するか、または任意選択で、保護された亜リン酸トリエステル連結を独立して酸化し、それにより保護されたリン酸塩連結を形成するステップと、
f)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップと、
g)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップと、
h)提供、結合、チオール化、または任意選択の酸化、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップc)〜ステップg))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
i)保護されたホスホロチオエート連結及び任意選択の保護されたリン酸塩連結を脱保護するステップと、
j)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するステップと、
k)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、
l)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製するステップと、
m)薄膜蒸発で濃縮するなど、オリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮するステップと、を含むか、またはそれらからなり得る。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップ及び/またはヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップを含む。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする任意選択のステップ及びヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を脱保護する任意選択のステップは、最後の反復を除き(すなわち、最後の反復では実施されない)、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い反応サイクルの各反復において実施される。

0056

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、次のステップ:
a)固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップであって、リンカーが、保護されたヒドロキシル基を含む、固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップと、
b)リンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成するステップと、
c)ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供することであって、ヌクレオシドホスホロアミダイトが、保護されたヒドロキシル基及び保護されたホスホロアミダイトを含む、ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供するステップと、
d)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成するステップと、
e)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成するか、または任意選択で、保護された亜リン酸トリエステル連結を独立して酸化し、それにより保護されたリン酸塩連結を形成するステップと、
f)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップと、
g)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップと、
h)提供、結合、チオール化、または任意選択の酸化、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップc)〜ステップg))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
i)保護されたホスホロチオエート連結及び任意選択の保護されたリン酸塩連結を脱保護するステップと、
j)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するステップと、
k)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、
l)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製するステップであって、
1)溶出ステップk)からのオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラムに充填するステップと、
2)末端ヌクレオシドからの保護されたヒドロキシル基を脱保護するステップと、
3)塩勾配を使用して、イオン交換クロマトグラフィーカラムからオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、
m)薄膜蒸発で濃縮するなど、オリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮するステップと、を含むか、またはそれらからなり得る。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップ及び/またはヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップを含む。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする任意選択のステップ及びヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を脱保護する任意選択のステップは、最後の反復を除き(すなわち、最後の反復では実施されない)、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い反応サイクルの各反復において実施される。

0057

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、次のステップ:
a)固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップであって、リンカーが、保護されたヒドロキシル基を含む、固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップと、
b)リンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成するステップと、
c)ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供することであって、ヌクレオシドホスホロアミダイトが、保護されたヒドロキシル基及び保護されたホスホロアミダイトを含む、ヌクレオシドホスホロアミダイトを独立して提供するステップと、
d)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成するステップと、
e)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成するか、または任意選択で、保護された亜リン酸トリエステル連結を独立して酸化し、それにより保護されたリン酸塩連結を形成するステップと、
f)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップと、
g)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップと、
h)提供、結合、チオール化、または任意選択の酸化、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップc)〜ステップg))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
i)保護されたホスホロチオエート連結及び任意選択の保護されたリン酸塩連結を脱保護するステップと、
j)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するステップと、
k)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、
l)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製するステップであって、
1)溶出ステップk)からのオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラムに充填するステップと、
2)保護されたヒドロキシル基を末端ヌクレオシドから脱保護するステップと、
3)塩勾配を使用して、イオン交換クロマトグラフィーカラムからオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、
4)限外濾過及び/または透析濾過によりイオン交換カラムからオリゴヌクレオチド溶出物を脱塩するステップと、
m)薄膜蒸発で濃縮するなど、脱塩されたオリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮するステップと、を含むか、またはそれらからなり得る。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップ及び/またはヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップを含む。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする任意選択のステップ及びヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を脱保護する任意選択のステップは、最後の反復を除き(すなわち、最後の反復では実施されない)、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い反応サイクルの各反復において実施される。

0058

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、次のステップ:a)固体支持体に結合されるリンカーを提供することであって、リンカーが、保護されたヒドロキシル基を含む、固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップと、b)リンカーの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成するステップと、c)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成するステップと、d)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成する(または任意選択で、保護された亜リン酸トリエステル連結を独立して酸化し、それにより保護されたリン酸塩連結を形成する)ステップと、e)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップと、f)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップと、g)結合、チオール化(または任意選択の酸化)、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップc)〜ステップf))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供するステップと、h)保護されたホスホロチオエート連結を脱保護するステップと、i)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するステップと、j)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、k)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製するステップと、l)薄膜蒸発で濃縮するなど、イオン交換カラムからのオリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮するステップと、を含むか、またはそれらからなり得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップ及び/またはヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップを含む。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする任意選択のステップ及びヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を脱保護する任意選択のステップは、最後の反復を除き(すなわち、最後の反復では実施されない)、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い反応サイクルの各反復において実施される。

0059

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、次のステップ:a)固体支持体に結合されるリンカーを提供することであって、リンカーが、保護されたヒドロキシル基を含む、固体支持体に結合されるリンカーを提供するステップと、b)リンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成するステップと、c)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成するステップと、d)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成する(または任意選択で、保護された亜リン酸トリエステル連結を独立して酸化し、それにより保護されたリン酸塩連結を形成する)ステップと、e)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップと、f)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップと、g)結合、チオール化(または任意選択の酸化)、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップc)〜ステップf))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供するステップと、h)保護されたホスホロチオエート連結(及び任意選択の保護されたリン酸塩連結)を脱保護するステップと、i)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するステップと、j)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、k)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製するステップであって、1)溶出ステップj)からのオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填する、2)末端ヌクレオシドから保護されたヒドロキシル基を脱保護する、及び3)塩勾配を使用して、イオン交換クロマトグラフィーカラムからオリゴヌクレオチドを溶出する、精製するステップと、l)薄膜蒸発で濃縮するなど、イオン交換カラムからのオリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮するステップと、を含むか、またはそれらからなり得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法の精製ステップk)は、1)溶出ステップj)からのオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填する、2)末端ヌクレオシドから保護されたヒドロキシル基を脱保護する、3)塩勾配を使用して、イオン交換クロマトグラフィーカラムからオリゴヌクレオチドを溶出する、及び4)限外濾過及び/または透析濾過によりイオン交換カラムからのオリゴヌクレオチド溶出物を脱塩することを含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップ及び/またはヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップを含む。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする任意選択のステップ及びヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を脱保護する任意選択のステップは、最後の反復を除き(すなわち、最後の反復では実施されない)、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い反応サイクルの各反復において実施される。

0060

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドを調製する方法は、次のステップ:a)固体支持体に結合されるリンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成するステップと、b)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成するステップと、c)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成する(または任意選択で、保護された亜リン酸トリエステル連結を独立して酸化し、それにより保護されたリン酸塩連結を形成する)ステップと、d)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップと、e)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップと、f)結合、チオール化(または任意選択の酸化)、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップb)〜ステップe))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供するステップと、g)保護されたホスホロチオエート連結(及び任意選択の保護されたリン酸塩連結)を脱保護するステップと、h)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するステップと、i)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、j)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製するステップと、k)薄膜蒸発で濃縮するなど、イオン交換カラムからのオリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮するステップと、を含むか、またはそれらからなり得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップ及び/またはヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップを含む。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする任意選択のステップ及びヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を脱保護する任意選択のステップは、最後の反復を除き(すなわち、最後の反復では実施されない)、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い反応サイクルの各反復において実施される。

0061

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、次のステップ:a)固体支持体に結合されるリンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護し、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成するステップと、b)ヌクレオシドホスホロアミダイトを、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基に、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基に独立して結合し、それにより亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成するステップと、c)保護された亜リン酸トリエステル連結を独立してチオール化し、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成する(または任意選択で、保護された亜リン酸トリエステル連結を独立して酸化し、それにより保護されたリン酸塩連結を形成する)ステップと、d)任意選択で、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップと、e)任意選択で、ヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップと、f)結合、チオール化(または任意選択の酸化)、キャッピング、及び脱保護のステップ(ステップb)〜ステップe))を規定回数繰り返して、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供するステップと、g)保護されたホスホロチオエート連結(及び任意選択の保護されたリン酸塩連結)を脱保護するステップと、h)固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するステップと、i)固体支持体からオリゴヌクレオチドを溶出するステップと、j)イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、オリゴヌクレオチド溶出物を精製するステップ、ならびに1)溶出ステップi)からのオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填する、2)末端ヌクレオシドから保護されたヒドロキシル基を脱保護する、及び3)塩勾配を使用して、イオン交換クロマトグラフィーカラムからオリゴヌクレオチドを溶出する、ステップと、k)薄膜蒸発で濃縮するなど、イオン交換カラムからのオリゴヌクレオチド化合物の溶液を濃縮するステップと、を含むか、またはそれらからなり得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法の精製ステップj)は、1)溶出ステップi)からのオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填する、2)末端ヌクレオシドから保護されたヒドロキシル基を脱保護する、3)塩勾配を使用して、イオン交換クロマトグラフィーカラムからオリゴヌクレオチドを溶出する、及び4)限外濾過及び/または透析濾過によりイオン交換カラムからのオリゴヌクレオチド溶出物を脱塩することを含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基を独立してキャッピングするステップ及び/またはヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を独立して脱保護するステップを含む。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基をキャッピングする任意選択のステップ及びヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基を脱保護する任意選択のステップは、最後の反復を除き(すなわち、最後の反復では実施されない)、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い反応サイクルの各反復において実施される。

0062

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、該反復のうちの少なくとも1つにおいて、キャッピングステップf)と脱保護ステップg)との間に前膨潤ステップをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの調製方法は、該反復のうちの少なくとも1つにおいて、ステップのうちの1つ以上の間に、アセトニトリルなどの非プロトン性溶媒で支持体を任意選択で洗浄することをさらに含み得る。

0063

5.1SMAD7アンチセンスオリゴヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法を使用してSMAD7アンチセンスオリゴヌクレオチド(抗SMAD7ODNまたはSMAD7 AONと称される場合もある)を合成する。ある特定の実施形態では、抗SMAD7 ODNは化学修飾されたSMAD7 ODNである。

0064

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的タンパク質(例えば、SMAD7)をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に相補的な短い合成オリゴヌクレオチド配列である。理論に拘束されるものではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、mRNA分子の相補領域にハイブリダイズし、それにより、DNA/RNAハイブリッド鎖を分解し、よってタンパク質の翻訳を防止するRNaseHなどのユビキタス触媒酵素の活性化をもたらすことができる2本鎖ハイブリッドを産生することができる。理論に拘束されるものではないが、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAまたはDNAとしてその標的配列にハイブリダイズすることができる。したがって、DNA配列が標的として提供される場合でも、対応するRNA配列チミンの代わりにウラシルを含む)が含まれる。

0065

例えば、抗SMAD7ODNは、細胞内に導入されるかまたは細胞によって取り込まれる場合、細胞におけるSMAD7mRNAのレベルを低減することにより、または細胞におけるSMAD7タンパク質のレベルを低減することにより、細胞におけるSMAD7発現を低減することができる。具体的には、抗SMAD7 ODNは、インビトロ、例えば培養細胞において、またはインビボ、例えば対象において(ヒト患者など、または動物モデルの生物における)SMAD7発現を低減することができる。

0066

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドは化学修飾され得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、ナトリウム対イオン(「Na+」)を有する陰イオン型などの陰イオン型であり得るか、またはプロトン化されて酸性型を形成し得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、完全にまたは部分的にプロトン化されて酸性型を形成することができるホスホロチオエート骨格を含み得る。

0067

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、リン酸塩連結、例えば一リン酸塩連結である、少なくとも1つのヌクレオシド間連結を含み得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結である、少なくとも1つのヌクレオシド間連結を含み得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上のホスホロチオエート連結を含み得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドにおける少なくとも5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である。ある特定の実施形態では、すべてのヌクレオシド間連結はホスホロチオエート連結である。

0068

5.2オリゴヌクレオチド修飾
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法によって合成されるオリゴヌクレオチド(例えば、抗SMAD7ODN)は、化学修飾される。ある特定の具体的な実施形態では、本明細書で記載されるSMAD7 ODNは、SMAD7mRNAのヌクレオチド配列に相補的な配列を有し得る(すなわち、SMAD7 ODNはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る)。

0069

本明細書で記載される合成方法に従い調製された抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドには、例えば、天然に存在しない核酸塩基、修飾されたヌクレオシド間(骨格)連結、糖修飾、または修飾された5’−もしくは3’−末端が含まれ得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、天然に存在しない配列タグを含み得る。

0070

ある特定の実施形態では、本明細書で記載される合成方法に従い調製されたオリゴヌクレオチド、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドは、天然に存在する核酸塩基、糖、及び共有結合ヌクレオシド間(骨格)連結、ならびに天然に存在しない部分を含み得る。例えば、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、例えば、1つ以上のホスホロチオエート連結を含む、混合骨格を含み得る。

0071

ある特定の実施形態では、本明細書で記載される合成方法に従い調製されたオリゴヌクレオチド、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドは、核酸塩基の修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される場合、「未修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基アデニン(A)及びグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)が含まれる。化学修飾されたSMAD7ODNには、例えば、5−メチルシトシン(5−Me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシンキサンチンヒポキサンチン、2−アミノアデニン、6−メチル、ならびにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、2−プロピルならびに アデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミン及び2−チオシトシン、5−ハロウラシル及びシトシン、5−プロピニルウラシル及びシトシン、6−アゾウシル、シトシン及びチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル、ならびに他の8−置換アデニン及びグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチル、ならびに他の5−置換ウラシル及びシトシン、7−メチルグアニン及び7−メチルアデニン8−アザグアニン及び8−アザアデニン、7−デアザグアニン及び7−デアザアデニン、または3−デアザグアニン及び3−デアザアデニンなどの合成及び天然の核酸塩基が含まれ得る。抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、核酸塩基、例えば、米国特許第3,687,808号に開示されるもの、“The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering,”pages 858−859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990に開示されるもの、Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613により開示されるもの、またはSanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages 289−302、Crooke,S.T.and Lebleu,B.,ed.,CRCPress,1993により開示されるもの(これらは各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、化学修飾されたSMAD7 ODNの結合親和性を増加させることができる核酸塩基を含み得る。そのような核酸塩基には、例えば、2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシル、及び5−プロピニルシトシン5−メチルシトシン置換を含む、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、ならびにN−2、N−6、及びO−6置換プリンが含まれ得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メトキシエチル糖修飾と組み合わせて、上述の修飾された核酸塩基のうちの1つ以上を含むことができる。

0072

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、5−メチルシトシンで置き換えられる1つ以上のシトシン残基を有し得る。ある特定の実施形態では、1つ以上のシトシン残基は、CpG対の一部を形成する。

0073

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、デオキシシチジン及び/または5−メチル−2’−デオキシシチジンなどの人工ヌクレオシドを含み得るか、または5−メチル−2’−デオキシシチジン5’−一リン酸塩、及び/または5−メチル−2’−デオキシシチジン5’−モノホスホロチオエートなどの人工ヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の人工ヌクレオシドを含み得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の人工ヌクレオチドを含み得る。

0074

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、CGジヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、GCジヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、CGまたはGCジヌクレオチド配列は、複数のCGジヌクレオチド配列及び/または複数のGCジヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、複数のCGまたはGCジヌクレオチド配列は、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ以上のCGまたはGCジヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、複数のCGまたはGCジヌクレオチド配列は、1つ以上のCGジヌクレオチド配列と、1つ以上のGCジヌクレオチド配列と、を含む。ある特定の実施形態では、複数のCGまたはGCジヌクレオチド配列は、CGジヌクレオチド配列のみ、またはGCジヌクレオチド配列のみを含む。

0075

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、メチル化塩基(例えば、5−メチル−シトシン、6−O−メチル−グアニン、または7−メチル−グアニン)を含む、少なくとも1つのCGまたはGCジヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、CGまたはGCジヌクレオチド配列中のシトシンがメチル化される(例えば、5−メチル−シトシン)。ある特定の実施形態では、CGまたはGCジヌクレオチド配列中のグアニンがメチル化される(例えば、6−O−メチル−グアニンまたは7−メチル−グアニン)。ある特定の実施形態では、CGまたはGCジヌクレオチド配列中のシトシン及びグアニンがメチル化される。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、メチル化塩基(例えば、5−メチル−シトシン、6−O−メチル−グアニン、または7−メチル−グアニン)を含む、複数のCGまたはGCジヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、メチル化塩基(例えば、5−メチル−シトシン、6−O−メチル−グアニン、または7−メチル−グアニン)を含む複数のCGまたはGCジヌクレオチド配列は、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ以上のCGまたはGCジヌクレオチド配列である。

0076

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドにおけるCGまたはGCジヌクレオチド配列は、CGまたはGCリン酸ジヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドにおける1つ以上のCGまたはGCジヌクレオチド配列は、非天然のヌクレオシド間連結(例えば、ホスホロチオエート連結)を含む。ある特定の実施形態では、CGまたはGCジヌクレオチドは、CGまたはGCホスホロチオエートジヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドにおける2つ以上のCGまたはGCジヌクレオチド配列は、ホスホロチオエートジヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドにおけるすべてのCGまたはGCジヌクレオチド配列は、ホスホロチオエートジヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドにおけるCGまたはGCホスホロチオエートジヌクレオチド配列のうちの1つ以上は、1つまたは2つのメチル化塩基(例えば、5−メチル−シトシン、6−O−メチル−グアニン、または7−メチル−グアニン)を含む。ある特定の実施形態では、メチル化塩基を含むオリゴヌクレオチドにおける1つ以上のCGまたはGCジヌクレオチド配列は、ホスホロチオエートジヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、メチル化塩基を含むオリゴヌクレオチドにおけるすべてのCGまたはGCジヌクレオチド配列は、ホスホロチオエートジヌクレオチド配列である。

0077

ある特定の実施形態では、抗SMAD7ODNは、化学修飾された抗SMAD7 ODNである。ある特定の実施形態では、化学修飾された抗SMAD7 ODNは、例えば、天然に存在しないヌクレオシド間連結、天然に存在しない糖残基、天然に存在しない塩基、標識(例えば、重水素またはトリチウム標識などの蛍光標識または同位体標識)、または別の修飾を含む。

0078

ある特定の実施形態では、本明細書で記載される合成方法に従い調製されたオリゴヌクレオチドは、例えば、任意の哺乳類生物、及び限定されないが、霊長類(例えば、ヒト、サルチンパンジーオランウータン、またはゴリラ)、ネコイヌウサギ家畜(例えば、ウシウマヤギヒツジブタ)、またはゲッ歯類(例えば、マウスラットハムスター、またはモルモット由来のヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される合成方法に従い調製された抗SMAD7ODNは、例えば、任意の哺乳類生物、及び限定されないが、霊長類(例えば、ヒト、サル、チンパンジー、オランウータン、またはゴリラ)、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜(例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ)、またはゲッ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはモルモット)由来のSMAD7ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。

0079

ある特定の実施形態では、抗SMAD7ODNは、ヒトSMAD7の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、抗SMAD7 ODNは、8つ以上、10以上、12以上、14以上、16以上、18以上、20以上のヒトSMAD7のヌクレオチドの領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、抗SMAD7 ODNは、配列番号1のヌクレオチド配列または対応するRNA配列を含む、ヒトSMAD7配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。

0080

NM_005904.3の配列番号1(コード配列:CDS(288−1568);ホモサピエンスSMADファミリーメンバー7(SMAD7)、転写物変異型1、mRNA)(領域108〜128下線付き):

0081

ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法を使用して合成することができる抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヒトSMAD7配列、または対応するRNA配列の一部または領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。

0082

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、SMAD7mRNAの領域を含む多型にハイブリダイズする抗SMAD7オリゴヌクレオチドを合成するために使用され得る。例えば、国際出願第PCT/EP2015/074066号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい。

0083

ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法を使用して合成することができる抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヒトSMAD7ヌクレオチド配列または対応するRNA配列の領域108〜128に相補的なヌクレオチド配列を含む。

0084

ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法を使用して合成することができる抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヒトSMAD7ヌクレオチド配列のヌクレオチド403、233、294、295、296、298、299、もしくは533、または対応するRNA配列を含む領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。

0085

ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法を使用して合成することができる抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の核酸配列(配列番号2):
5’−GTXYCCCCTTCTCCCXYCAGC−3’
(配列中、
Xは独立して、シトシン、5−メチルシトシン、及び2’−O−メチルシトシンからなる群から選択される窒素塩基を含むヌクレオチドを表し、
Yは独立して、グアニン、5−メチルグアニン、または2’−O−メチルグアニンからなる群から選択される窒素塩基を含むヌクレオチドを表すが、
但し、ヌクレオチドXまたはYのうちの少なくとも1つはメチル化窒素塩基を含むものとする)
またはそれに対して相補的配列のうちの少なくとも10ヌクレオチド(例えば、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、または20以上のヌクレオチド)の一部を含むか、それらからなるか、またはその長さの最大21ヌクレオチドを含む。

0086

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、配列番号2を含むかまたはそれからなる配列を有し、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも1つは、ホスホロチオエート連結(すなわち、O,O連結ホスホロチオエート)である。ある特定の実施形態では、配列番号2を含むかまたはそれからなる配列を有する、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドであって、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10は、O,O連結ホスホロチオエートである。ある特定の実施形態では、配列番号2を含むかまたはそれからなる配列を有する、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドであって、ヌクレオシド間連結のすべては、O,O連結ホスホロチオエートである。

0087

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、米国特許第9,279,126号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載される配列を有する。

0088

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の配列(配列番号3):
5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC−3’
またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、
配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジン(「5−Me−dC」)を表し、少なくとも1つのヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはすべては、O,O連結ホスホロチオエート連結である。例えば、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号3またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジン(「5−Me−dC」)を表し、20のヌクレオチド間連結の各々は、O,O連結ホスホロチオエート連結である。

0089

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の配列(配列番号4):
5’−GTCGCCCCTTCTCCCCGCAG−3’
またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、
少なくとも1つのヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはすべては、O,O連結ホスホロチオエート連結である。

0090

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の(配列番号5):
5’−GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG−3’
またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、
配列中、Xは、5−メチル−2’−デオキシシチジン(「5−Me−dC」)を表し、少なくとも1つのヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはすべては、O,O連結ホスホロチオエート連結である。

0091

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の配列(配列番号6):
5’−GTTTGGTCCTGAACATGC−3’
またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、
少なくとも1つのヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはすべては、O,O連結ホスホロチオエート連結である。

0092

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の配列(配列番号7):
5’−GTTTGGTCCTGAACAT−3’
またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、
少なくとも1つのヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはすべては、O,O連結ホスホロチオエート連結である。

0093

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の配列(配列番号8):
5’−GTTTGGTCCTGAACATG−3’
またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、
少なくとも1つのヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはすべては、O,O連結ホスホロチオエート連結である。

0094

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の配列(配列番号9):
5’−AGCACCGAGTGCGTGAGC−3’
またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、
少なくとも1つのヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはすべては、O,O連結ホスホロチオエート連結である。

0095

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の配列(配列番号10):
5’−CGAACATGACCTCCGCAC−3’
またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、
少なくとも1つのヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはすべては、O,O連結ホスホロチオエート連結である。

0096

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の配列(配列番号11):
5’−GATCGTTTGGTCCTGAA−3’
またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、
少なくとも1つのヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはすべては、O,O連結ホスホロチオエート連結である。

0097

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、次の配列(配列番号12):
5’−ATCGTTTGGTCCTGAAC−3’
またはそれに対して相補的配列を含むか、またはそれからなり、
少なくとも1つのヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレオシド間連結のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはすべては、O,O連結ホスホロチオエート連結である。

0098

配列番号1〜12の各々の配列表は、表7にも提供される。

0099

本明細書で記載される方法を使用して、米国特許第9,279,126号に記載されるオリゴヌクレオチドを合成することができる。

0100

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの非天然のヌクレオシド、例えば、デオキシシチジン及び/または5−メチル−2’−デオキシシチジンを含み得る。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの非天然のヌクレオチド、例えば、例えば、5−メチル−2’−デオキシシチジン−5’−一リン酸塩または5−メチル−2’−デオキシシチジン−5’−モノホスホロチオエートを含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上のデオキシシチジン及び/または5−メチル2’−デオキシシチジンを含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド中の少なくとも5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%のヌクレオチドは、デオキシシチジン及び/または5−メチル−2’−デオキシシチジンを含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上のデオキシシチジン及び/または5−メチル2’−デオキシシチジンを含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1つ以上のデオキシシチジンを含み得、5−メチル2’−デオキシシチジンを含まない。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1つ以上の5−メチル2’−デオキシシチジンを含み得、デオキシシチジンを含まない。

0101

ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法を使用して合成された抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5’−及び/または3’−末端に置かれるメチルホスホネート連結を含み得る。

0102

ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される塩または溶媒和を含み得る。ある特定の実施形態では、溶媒和は水和物である。ある特定の実施形態では、抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩)またはアルカリ土類金属塩(例えば、マグネシウム塩)を含むか、またはそれであり、例えば、オリゴヌクレオチドは、任意選択で1〜20のO,O連結ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み得る配列番号3の核酸配列を含む。本明細書で記載される方法を使用して合成された抗SMAD7オリゴヌクレオチドまたは化学修飾された抗SMAD7オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドの企図される塩は、完全に中和されるものを含み得、例えば、各スホロチオエート連結は、Na+などのアルカリ金属イオン会合している。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、部分的にのみ中和され、例えば、すべてではないホスホロチオエート連結がアルカリ金属イオンまたはアルカリ土類金属イオンと会合している(例えば、99%未満、95%未満、90%未満、85%未満、80%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、3%未満、または1%未満が中和される)。

0103

5.3固体支持体及びリンカー
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に適した固体支持体は、架橋ポリスチレンまたは制御された細孔ガラスであり得る。例えば、ある特定の実施形態では、固体支持体は、それに結合されるリンカーを伴う架橋ポリスチレン、またはそれに結合されるリンカーを伴う多孔性多分散ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンであり、例えば、リンカーは、UNYLINKERなどの保護されたヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、例えば、架橋ポリスチレン固体支持体は、NITTOPHASE−HL、例えば、NITTOPHASE UNYLINKER 350もしくは高充填NITTOPHASE UNYLINKER 350、またはヌクレオチドで前充填されたNITTOPHASE固体支持体、例えば、2’−デオキシシチジンである。ある特定の実施形態では、例えば、多孔性の多分散ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン固体支持体は、PRIERSUPPORT5Gであり、この場合、リンカーはスクシニルベースのリンカーであり得る。固体支持体、例えば、それに結合されるリンカーを有する固体支持体の充填容量(または合成スケール)は、オリゴヌクレオチド、例えば、当モル量のオリゴヌクレオチドを調製するための反応に利用可能な、固体支持体、例えば、それに結合されるリンカーを有する固体支持体のモル量を指す。例えば、結合されるリンカーを有する固体支持体の充填容量に等しい調製されるオリゴヌクレオチドの量は、理論量と考えられる。結合されるリンカーを有する固体支持体を利用する本明細書で開示される方法に従い調製されたオリゴヌクレオチドの実際の量は、理論量と同一であり得るか、または理論量より少なくてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、結合されるリンカーを有する固体支持体を利用する本明細書で開示される方法に従い調製されたオリゴヌクレオチドの実際の量は、理論量よりも少なく、例えば、理論量の95%、例えば、理論量の90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、または50%であるか、または例えば、理論量の40〜98%、40〜95%、40〜90%、40〜85%、40〜80%、40〜75%、40〜70%、50〜98%、50〜95%、50〜90%、50〜85%、50〜80%、50〜75%、50〜70%、60〜98%、60〜95%、60〜90%、60〜85%、60〜80%、60〜75%、または60〜70%である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される結合されるリンカーを有する固体支持体は、300〜5,400mmolの範囲の量のオリゴヌクレオチドを調製する、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、300〜3,600mmol、300〜3,000mmol、600〜3,000mmol、700〜3,600mmol、700〜2,700mmol、700〜2,500mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,900mmol、700〜1,800mmol、700〜1,700mmol、700〜1,600mmol、700〜1,500mmol、700〜1,400mmol、700〜1,300mmol、700〜1,200mmol、700〜1,100mmol、700〜1,000mmol、700〜900mmol、800〜1,200mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,800mmol、900〜2,400mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,800〜2,700mmol、1,800〜3,600mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,500mmol、1,000〜2,000mmol、1,000〜1,500mmol、1,250〜1,750mmol、1,500〜3,000mmol、1,500〜2,500mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、2,000〜3,000mmol、2,500〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、または3,600〜5,400mmolの範囲の量のオリゴヌクレオチドを調製するのに十分な充填容量を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される結合されるリンカーを有する固体支持体は、少なくとも300mmolの量のオリゴヌクレオチドを調製する、例えば、少なくとも300mmol、例えば、少なくとも400mmol、少なくとも500mmol、少なくとも600mmol、少なくとも700mmol、少なくとも800mmol、少なくとも900mmol、少なくとも1,000mmol、少なくとも1,100mmol、少なくとも1,200mmol、少なくとも1,300mmol、少なくとも1,400mmol、少なくとも1,600mmol、少なくとも1,800mmol、少なくとも2,400mmol、少なくとも2,700mmol、少なくとも3,000mmol、少なくとも3,600mmol、または少なくとも4,500mmolの量のオリゴヌクレオチドを調製するのに十分な充填容量を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される結合されるリンカーを有する固体支持体は、300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol、または5,400mmolの量のオリゴヌクレオチドを調製するのに十分な充填容量を有する。

0104

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い調製されたオリゴヌクレオチド化合物の合成中に利用される固体支持体の量に対する固体支持体に結合されるリンカーの量の充填密度は、300〜400マイクロモルのリンカー/固体支持体のグラムの範囲、例えば、300〜375マイクロモルのリンカー/固体支持体のグラムの範囲、例えば、300〜350、300〜350、300〜325、325〜400、325〜375、350〜400、または350〜375マイクロモルのリンカー/固体支持体のグラムの範囲の充填密度である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い調製されたオリゴヌクレオチド化合物の合成中に利用される固体支持体の量に対する固体支持体に結合されるリンカーの量の充填密度は、少なくとも300マイクロモルリンカー/固体支持体のグラム、例えば、少なくとも320、少なくとも325、少なくとも330、少なくとも340、少なくとも350、または少なくとも360マイクロモルリンカー/固体支持体のグラムである。

0105

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される結合されるリンカーを有する固体支持体を収容するカラムは、35〜100cmの範囲のカラム内径、例えば、50〜100cm、50〜75cm、60〜80cm、55〜75cm、または75〜100cmの範囲の内径、例えば、35cm、40cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、または100cmの内径を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される結合されるリンカーを有する固体支持体は、4〜20cmの範囲のベッド高さ、例えば、7〜20cm、7〜15cm、7〜10cm、7.5〜8.5、8〜20cm、8〜15cm、8〜10cm、8〜9cm、8〜8.5cm、または8.5〜9cmの範囲のベッド高さ、例えば、4cm、5cm、6cm、7cm、7.25cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、7.75cm、8cm、8.25cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、8.75cm、9cm、9.25cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm、9.75cm、10cm、10.25cm、10.34cm、10.5cm、10.66cm、10.75cm、または11cmのベッド高さを有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される結合されるリンカーを有する固体支持体を収容するカラムは、35〜100cmの範囲の内径、例えば、35cm、40cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、または100cmの内径、及び4〜20cmの範囲のベッド高さ、例えば、7〜20cm、7〜15cm、7〜10cm、7.5〜8.5、8〜20cm、8〜15cm、8〜10cm、8〜9cm、8〜8.5cm、または8.5〜9cmの範囲のベッド高さを有する。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される結合されるリンカーを有する固体支持体を収容するカラムは60cmの内径を有し、固体支持体は、7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm、または10cmのベッド高さを有するか、あるいは固体支持体を収容するカラムは70cmの内径を有し、固体支持体は、7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm、または10cmのベッド高さを有するか、または固体支持体を収容するカラムは80cmの内径を有し、固体支持体は、7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm、または10cmのベッド高さを有するか、あるいは固体支持体を収容するカラムは90cmの内径を有し、固体支持体は、7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm、または10cmのベッド高さを有する。

0106

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される結合されるリンカーを有する固体支持体を収容するカラムは60cmの内径を有し、固体支持体は、7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm、または10cmのベッド高さを有し、固体支持体は、少なくとも600mmol、例えば、少なくとも700mmol、少なくとも900mmol、少なくとも1,600mmol、少なくとも2,400mmol、少なくとも2,700mmol、少なくとも3,000mmol、少なくとも3,600mmol、または少なくとも4,500mmolの量のオリゴヌクレオチドを調製するのに十分な充填容量を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される結合されるリンカーを有する固体支持体を収容するカラムは80cmの内径を有し、固体支持体は、7cm、7.34cm、7.5cm、7.66cm、8cm、8.34cm、8.5cm、8.66cm、9cm、9.34cm、9.5cm、9.66cm、または10cmのベッド高さを有し、固体支持体は、少なくとも600mmol、例えば、少なくとも700mmol、少なくとも900mmol、少なくとも1,600mmol、少なくとも2,400mmol、少なくとも2,700mmol、少なくとも3,000mmol、少なくとも3,600mmol、または少なくとも4,500mmolの量のオリゴヌクレオチドを調製するのに十分な充填容量を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される結合されるリンカーを有する固体支持体を収容するカラムは、50〜100cmの範囲の内径、例えば、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、または100cmの内径、及び20〜35Lの範囲のカラム体積、例えば、20〜25L、23.5〜30L、25〜30L、30〜35L、または20〜30Lの範囲のカラム体積、例えば、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35Lのカラム体積を有する。

0107

ある特定の実施形態では、本明細書で記載される固体支持体に結合されるリンカー上のヒドロキシル基のヒドロキシル保護基には、アセチル、i−ブチリル、t−ブチル、t−ブトキシメチル、メトキシメチルテトラヒドロピラニル、1−エトキシエチル、1−(2−クロロエトキシ)エチル、p−クロロフェニル、2,4−ジニトロフェニルベンジル、2,6−ジクロロベンジルジフェニルメチル、p−ニトロベンジルビス(2−アセトキシエトキシ)メチル(ACE)、2−トリメチルシリルエチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチルジフェニルシリルトリフェニルシリル、[(トリイソプロピルシリルオキシ]メチル(TOM)、ベンゾイルホルメートクロロアセチルトリクロロアセチルトリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、p−フェニルベンゾイル、9−フルオレニルメチルカーボネートメシレートトシレートトリフェニルメチル(トリチル)、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル(DMT)、トリメトキシトリチル、1(2−フルオロフェニル)−4−メトキシピペリジン−4−イル(FPMP)、9−フェニルキサンチン−9−イル(Pixyl)、及び9−(p−メトキシフェニル)キサンチン−9−イル(MOX)などの保護基が含まれ得る。ある特定の実施形態では、固体支持体に結合されるリンカー上のヒドロキシル保護基にはトリチル及びジメトキシトリチル(DMT)が含まれ得、例えば、ヒドロキシ保護基はジメトキシトリチル(DMT)である。

0108

5.4 脱保護リンカー
ある特定の実施形態では、リンカーの保護されたヒドロキシル基は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い脱保護され、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成する。例えば、ある特定の実施形態では、リンカーの保護されたヒドロキシル基は、プロトン酸、例えば芳香族溶媒中のジクロロ酢酸などのジクロロ酢酸、例えばトルエン中のジクロロ酢酸で脱保護される。ある特定の実施形態では、リンカーの保護されたヒドロキシル基は、芳香族溶媒中3〜15重量%のジクロロ酢酸(v/v)、例えばトルエン中3〜15重量%のジクロロ酢酸(v/v)などの芳香族溶媒中5重量%または10重量%のジクロロ酢酸(v/v)、例えばトルエン中5重量%または10重量%のジクロロ酢酸(v/v)で脱保護される。ある特定の実施形態では、トルエン中5重量%または10重量%のジクロロ酢酸(v/v)などのリンカーの保護されたヒドロキシル基を脱保護するために利用されるプロトン酸の体積は、1〜10カラム体積の範囲、例えば、1〜7カラム体積、1〜6カラム体積、1〜5カラム体積、1〜4カラム体積、1〜3カラム体積、2〜5カラム体積、2〜4カラム体積、2〜3カラム体積、3〜5カラム体積、または3〜4カラム体積の範囲である。ある特定の実施形態では、リンカーの保護されたヒドロキシル基の脱保護の後、支持体結合された脱保護された材料は、固体支持体に対する次の反応などの、方法の次のステップに備えてアセトニトリルなどの溶媒で洗浄され、例えば、支持体は、方法の次のステップに備えて、1〜7カラム体積、1〜5カラム体積、1〜4カラム体積、1〜3カラム体積、または2〜4カラム体積で洗浄され得る。

0109

5.5ヌクレオシドホスホロアミダイト結合
ある特定の実施形態では、リンカーの脱保護されたヒドロキシル基、または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護されたヒドロキシル基は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従いヌクレオシドホスホロアミダイトに結合され、それにより保護された亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドなどの亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドを形成する。ある特定の実施形態では、結合は、リンカーの脱保護された5’−ヒドロキシル基または反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの脱保護された5’−ヒドロキシル基がヌクレオシドホスホロアミダイトと反応するか、またはそれと結合する、ヌクレオシドホスホロアミダイトを固体支持体に提供することを伴う。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法の結合ステップは、亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシド、例えば、2−シアノエトキシ保護された亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドなどの2−シアノエトキシ保護基を含む亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドなどの保護された亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドの形成をもたらす。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトを提供する前に、本方法は、ジメチルホルムアミドDMF)などの極性非プロトン性溶媒で支持体を任意選択で前膨潤するなど、支持体を任意選択で前膨潤することをさらに含む。ある特定の実施形態では、支持体は、ヌクレオシドホスホロアミダイトを提供する前に前膨潤されない。ある特定の実施形態では、本方法は、結合ステップの完了時に、及びチオール化(または酸化)ステップの前に、アセトニトリルなどの非プロトン性溶媒で支持体を任意選択で洗浄することをさらに含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、支持体は、結合ステップの完了時に、及びチオール化(または酸化)ステップの前に、1〜7カラム体積、1〜6カラム体積、1〜5カラム体積、1〜4カラム体積、1〜3カラム体積、または2〜4カラム体積などの1〜10カラム体積で洗浄され得る。

0110

ある特定の実施形態では、結合は、活性化剤を含むヌクレオシドホスホロアミダイトのプレミックス溶液などのプレミックス溶液としてヌクレオシドホスホロアミダイト及び活性化剤を提供することなど、活性化剤を含むヌクレオシドホスホロアミダイトを提供すること、または例えばヌクレオシドホスホロアミダイトの溶液及び活性化剤の溶液を別個に提供することを含む。ある特定の実施形態では、活性化剤はジシアノイミダゾール(DCI)である。ある特定の実施形態では、活性化剤を含むヌクレオシドホスホロアミダイトのプレミックス溶液、またはヌクレオシドホスホロアミダイト及び活性化剤の別個の溶液の各々を調製するために利用される溶媒は、アセトニトリルなどの非プロトン性溶媒である。ある特定の実施形態では、本方法の結合ステップ中に提供される活性化剤の量は、固体支持体の当量に対して2〜8当量の範囲、例えば、固体支持体の当量に対して3〜8当量、4〜8当量、5〜8当量、6〜8当量、6〜7当量、または4〜7当量の範囲である。

0111

ある特定の実施形態では、結合ステップは、過剰量のヌクレオシドホスホロアミダイトを提供することを含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、5’−ヒドロキシル保護基及び3’−ヒドロキシル保護基を含む保護されたヌクレオシドホスホロアミダイトなどの保護されたヌクレオシドホスホロアミダイトである。

0112

ある特定の実施形態では、提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトの5’−ヒドロキシル保護基には、アセチル、i−ブチリル、t−ブチル、t−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、1−エトキシエチル、1−(2−クロロエトキシ)エチル、p−クロロフェニル、2,4−ジニトロフェニル、ベンジル、2,6−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、p−ニトロベンジル、ビス(2−アセトキシエトキシ)メチル(ACE)、2−トリメチルシリルエチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、[(トリイソプロピルシリル)オキシ]メチル(TOM)、ベンゾイルホルメート、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、p−フェニルベンゾイル、9−フルオレニルメチルカーボネート、メシレート、トシレート、トリフェニルメチル(トリチル)、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル(DMT)、トリメトキシトリチル、1(2−フルオロフェニル)−4−メトキシピペリジン−4−イル(FPMP)、9−フェニルキサンチン−9−イル(Pixyl)、及び9−(p−メトキシフェニル)キサンチン−9−イル(MOX)などの保護基が含まれ得る。ある特定の実施形態では、ヒドロキシル保護基には、ベンジル、2,6−ジクロロベンジル、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチルジフェニルシリル、ベンゾイル、メシレート、トシレート、ジメトキシトリチル(DMT)、9−フェニルキサンチン−9−イル(Pixyl)、及び9−(p−メトキシフェニル)キサンチン−9−イル(MOX)が含まれ得る。ある特定の実施形態では、ヒドロキシル保護基には、アセチル、i−ブチリル、及びジメトキシトリチル(DMT)が含まれ得る。ある特定の実施形態では、ヒドロキシル保護基はi−ブチリルである。ある特定の実施形態では、ヒドロキシル保護基はジメトキシトリチル(DMT)である。

0113

ある特定の実施形態では、提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトの3’−ヒドロキシル保護基は、(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピル−ホスホロアミダイト基などのホスホロアミダイト基である。

0114

例えば、ある特定の実施形態では、結合ステップで提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトは、以下からなる群から選択され得る:
3’−O−[(N,N−ジイソプロピルアミノ)−2−シアノエトキシホスフィニル]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N6−ベンゾイルデオキシアデノシン(dA−(Bz)またはBz−dA−ホスホロアミダイト);
3’−O−[(N,N−ジイソプロピルアミノ)−2−シアノエトキシホスフィニル]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイルデオキシシチジン(dC−(Bz)またはBz−dC−ホスホロアミダイト);
3’−O−[(N,N−ジイソプロピルアミノ)−2−シアノエトキシホスフィニル]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N2−イソブチリルデオキシグアノシン(dG−(iBu)またはi−Bu−dG−ホスホロアミダイト);
3’−O−[(N,N−ジイソプロピルアミノ)−2−シアノエトキシホスフィニル]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−チミジン(dTまたはdT−ホスホロアミダイト);及び
3’−O−[(N,N−ジイソプロピルアミノ)−2−シアノエトキシホスフィニル]−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−5−メチルデオキシシチジン(d5MeC−(Bz)または5−Me−dC−ホスホロアミダイト)。

0115

ある特定の実施形態では、本方法の結合ステップ中に提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトの量は、固体支持体の当量に対して過剰量の当量である。ある特定の実施形態では、本方法の結合ステップ中に提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトの量は、固体支持体の当量に対して1〜8当量の範囲であり、例えば、本方法の結合ステップ中に提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトの量は、固体支持体の当量に対して1〜7当量の範囲、例えば、固体支持体の当量に対して1〜6当量、1〜5当量、1〜4当量、1〜3当量、1〜2当量、1.1〜2当量、1.1〜1.75当量、1.2〜1.75当量、1.5〜1.75当量、1.5〜2当量、1.5〜2.5当量、2〜3当量、2〜4当量、または2〜5当量の範囲である。ある特定の実施形態では、本方法の結合ステップ中に提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトの量は、固体支持体の当量に対して1〜4当量の範囲であり、例えば、本方法の結合ステップ中に提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトの量は、固体支持体の当量に対して1当量、例えば、固体支持体の当量に対して1.1、1.2、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.5、または4当量である。ある特定の実施形態では、本方法の結合ステップ中に提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトの量は、提供される活性化剤の当量に対して0.1〜1当量の範囲、例えば、提供される活性化剤の当量に対して0.1〜0.9当量、0.1〜0.8当量、0.1〜0.7当量、0.1〜0.6当量、0.1〜0.5当量、0.1〜0.4当量、0.1〜0.3当量、0.1〜0.2当量、0.25〜0.9当量、0.25〜0.75当量、0.25〜0.5当量、0.3〜0.8当量、0.3〜0.75当量、または0.5〜1当量の範囲である。ある特定の実施形態では、本方法の結合ステップ中に提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトの量は、提供される活性化剤の当量に対して0.05〜1当量の範囲であり、例えば、本方法の結合ステップ中に提供されるヌクレオシドホスホロアミダイトの量は、提供される活性化剤の当量に対して0.1当量、例えば、提供される活性化剤の当量に対して0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、または1当量である。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、アセトニトリル溶液などの非プロトン性溶液として提供され、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、dA−(Bz)、dC−(Bz)、dG−(iBu)、dT、及びd5MeC−(Bz)からなる群から選択される。

0116

ある特定の実施形態では、結合は、1〜5:1のモル比、例えば、2〜5:1、例えば、3〜5:1、4:1、または3.5:1のモル比で活性化剤及びヌクレオシドホスホロアミダイトを提供することを含む。

0117

5.6チオール化または酸化
ある特定の実施形態では、反応サイクルの前の反復からの保護された亜リン酸トリエステル連結などの保護された亜リン酸トリエステル連結は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従いチオール化され、それにより保護されたホスホロチオエート連結を形成する。ある特定の実施形態では、2−シアノエトキシ保護された亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドなどの保護された亜リン酸トリエステル連結は、チオール化剤でチオール化され、それにより2−シアノエトキシ−保護されたホスホロチオエート連結などの保護されたホスホロチオエート連結が形成される。ある特定の実施形態では、チオール化剤は、固体支持体の当量に対して1〜8当量の範囲、例えば、固体支持体の当量に対して2〜8当量、3〜8当量、4〜8当量、5〜8当量、5〜7当量、5〜6当量、1〜5当量、または3〜6当量の範囲の量で提供される。ある特定の実施形態では、チオール化剤は、キサンタンヒドリド(XH)、例えばピリジン中のキサンタンヒドリド、ジスルフィド、例えば、フェニルアセチルジスルフィド(またはジ(フェニルアセチル)ジスルフィドもしくはスルホン酸のジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィドジベンゾイルテトラスルフィド、1,2,4−ジチアリン−5−オン(DtsNH)、3−エトキシ−1,2,4−ジチアゾリン−5−オン(EDITH)、チオリン酸化合物、Beaucage試薬、または3−アリール−1,2,4−ジチアゾリン−5−オン(米国特許第6,500,944号に開示される、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)であり得る。ある特定の実施形態では、本方法は、チオール化ステップの完了時、アセトニトリルなどの非プロトン性溶媒で支持体を任意選択で洗浄することをさらに含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、支持体は、チオール化ステップの完了時、1〜10カラム体積、例えば、1〜7カラム体積、1〜6カラム体積、1〜5カラム体積、1〜4カラム体積、1〜3カラム体積、または2〜4カラム体積で洗浄され得る。

0118

ある特定の実施形態では、反応サイクルの前の反復からの保護された亜リン酸トリエステル連結などの保護された亜リン酸トリエステル連結は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い酸化され、それにより保護されたリン酸塩連結を形成する。ある特定の実施形態では、2−シアノエトキシ保護された亜リン酸トリエステル連結ヌクレオシドなどの保護された亜リン酸トリエステル連結は、酸化剤で酸化され、それにより2−シアノエトキシ−保護されたリン酸塩連結などの保護されたリン酸塩連結を形成する。ある特定の実施形態では、酸化剤は、固体支持体の当量に対して1〜8当量の範囲、例えば、固体支持体の当量に対して2〜8当量の範囲、例えば、3〜8当量、4〜8当量、5〜8当量、5〜7当量、5〜6当量、1〜5当量、または3〜6当量の範囲の量で提供される。ある特定の実施形態では、酸化剤は、ヨウ素またはt−ブチルヒドロペルオキシドであり得る。ある特定の実施形態では、本方法は、酸化ステップの完了時、アセトニトリルなどの非プロトン性溶媒で支持体を任意選択で洗浄することをさらに含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、支持体は、酸化ステップの完了時、1〜10カラム体積、例えば、1〜7カラム体積、1〜6カラム体積、1〜5カラム体積、1〜4カラム体積、1〜3カラム体積、または2〜4カラム体積で洗浄され得る。

0119

5.7キャッピング
ある特定の実施形態では、反応サイクルの前の反復からの未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従いキャッピング(保護)され、それによりヒドロキシル基(複数可)を形成する。ある特定の実施形態では、未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)は、アルキルアシル基でキャッピングされるなど、アシル基でキャッピングされる。ある特定の実施形態では、アルキルアシル基はイソブチルアシル基である。ある特定の実施形態では、反応サイクルの前の反復からの未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピングは、N−メチルイミダゾール(NMI)、ピリジン、及びアセトニトリルを含む第1のキャッピング溶液(Cap A)を提供することと、キャッピング剤及びアセトニトリルを含む第2のキャッピング溶液(Cap B)を提供することと、を含む。ある特定の実施形態では、反応サイクルの前の反復からの未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピングは、10〜30%N−メチルイミダゾール(NMI)、20〜40%ピリジン、及び40〜60%アセトニトリル(v/v/v)を含む第1のキャッピング溶液(Cap A)、例えば、20%N−メチルイミダゾール(NMI)、30%ピリジン、及び50%アセトニトリル(v/v/v)を含む第1のキャッピング溶液(Cap A)を提供することと、アセトニトリル中10〜30%キャッピング剤(v/v)を含む第2のキャッピング溶液(Cap B)、例えば、アセトニトリル中20%キャッピング剤(v/v)を含む第2のキャッピング溶液(Cap B)を提供することと、を含む。ある特定の実施形態では、第1のキャッピング溶液(Cap A)及び第2のキャッピング溶液(Cap B)は、固体支持体に導入されて、反応サイクルの前の反復からの未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)をキャッピングする前に予め混合される。ある特定の実施形態では、N−メチルイミダゾール(NMI)、ピリジン、キャッピング剤、及びアセトニトリルを含む単一キャッピング溶液は、固体支持体に導入されて、反応サイクルの前の反復からの未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)をキャッピングする。ある特定の実施形態では、キャッピング剤は、アルキルエステルまたはアルキル無水物である。ある特定の実施形態では、キャッピング剤は、アルキルエステル、例えば、キャッピング剤は、イソプロピルメチルエステルなどのアルキルメチルエステルである。ある特定の実施形態では、キャッピング剤はアルキル無水物であり、例えば、キャッピング剤はイソ酪酸無水物である。ある特定の実施形態では、反応サイクルの前の反復からの未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピングの前に、本方法は、支持体を任意選択で前膨潤する、例えば、ジメチルホルムアミド(DMF)などの極性非プロトン性溶媒で支持体を任意選択で前膨潤することをさらに含む。ある特定の実施形態では、支持体は、反応サイクルの前の反復からの未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング前に前膨潤されない。ある特定の実施形態では、本方法は、キャッピングステップの完了時、アセトニトリルなどの非プロトン性溶媒で支持体を任意選択で洗浄することをさらに含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、支持体は、キャッピングステップの完了時、1〜10カラム体積、例えば、1〜7カラム体積、1〜6カラム体積、1〜5カラム体積、1〜4カラム体積、1〜3カラム体積、または2〜4カラム体積で洗浄され得る。

0120

5.8 5’−末端ヌクレオシドの脱保護
ある特定の実施形態では、反応サイクルの前の反復からのヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基などのヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い脱保護され、それにより脱保護されたヒドロキシル基を形成する。例えば、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基などのヌクレオシドの保護されたヒドロキシル基は、プロトン酸、例えば、ジクロロ酢酸、例えば、芳香族溶媒中のジクロロ酢酸、例えばトルエン中、またはジクロロメタンなどのハロゲン化溶媒中のジクロロ酢酸で脱保護される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基は、2〜15重量%のプロトン酸で脱保護され、例えば、2〜10重量%3〜10重量%のプロトン酸、例えば、3〜10重量%、5〜10重量%、3〜15重量%、10〜15重量%、3〜5重量%、5〜8重量%、または3〜7重量%のプロトン酸で脱保護される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基は、3〜10重量%などの芳香族溶媒中2〜15重量%のジクロロ酢酸(v/v)、例えば、芳香族溶媒中3重量%のジクロロ酢酸(v/v)で脱保護される。例えば、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基は、3〜10重量%などのトルエン中2〜15重量%のジクロロ酢酸(v/v)、例えば、トルエン中3重量%、5重量%、7重量%、または10重量%のジクロロ酢酸(v/v)で脱保護される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基を脱保護するために利用されるプロトン酸の体積、例えば、3〜10重量%などのトルエン中2〜15重量%のジクロロ酢酸(v/v)、例えば、トルエン中5重量%または10重量%のジクロロ酢酸(v/v)は、1〜10カラム体積の範囲、例えば、1〜7カラム体積、1〜6カラム体積、1〜5カラム体積、1〜4カラム体積、1〜3カラム体積、2〜5カラム体積、2〜4カラム体積、2〜3カラム体積、3〜5カラム体積、または3〜4カラム体積の範囲である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基を脱保護するために利用されるプロトン酸の体積は、オリゴヌクレオチドの調製にわたって体積が増加または体積が減少するなど、標的オリゴヌクレオチドを調製する際の合成サイクルごとに異なり得る。例えば、図示されるように、21量体オリゴヌクレオチドの調製において、オリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基を脱保護するために利用されるプロトン酸の体積、例えば、3〜10重量%などのトルエン中2〜15重量%のジクロロ酢酸(v/v)、例えば、トルエン中5重量%または10重量%のジクロロ酢酸(v/v)は、最初のサイクル中3〜4カラム体積の範囲、2〜16のサイクル中2〜3カラム体積の範囲、そして17〜21のサイクル中2〜3カラム体積の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護後、支持体結合された脱保護された材料は、固体支持体に対する次の反応などの方法の次のステップに備えてアセトニトリルなどの溶媒で洗浄され、例えば、支持体は、方法の次のステップに備えて、1〜7カラム体積、1〜6カラム体積、1〜5カラム体積、1〜4カラム体積、1〜3カラム体積、または2〜4カラム体積などの1〜10カラム体積で洗浄され得る。

0121

5.9反応サイクル反復
ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトの提供及び結合、形成された亜リン酸トリエステル連結のチオール化(または酸化)、任意選択で未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング、及び任意選択でオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護のステップは、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い規定回数繰り返されて(反応サイクル反復)、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトの結合、形成された亜リン酸トリエステル連結のチオール化(または酸化)、任意選択で未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング、及び任意選択でオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護のステップは、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い規定回数繰り返されて(反応サイクル反復)、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従う規定回数(反応サイクル反復)は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)の任意選択のキャッピングステップ及び最後の反応サイクル反復中のオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の任意選択の脱保護ステップの実施を含まない。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い、規定回数のサイクル(反応サイクル反復)のうちの1回以上は、未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング及びオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護のステップを実施し、最後の反応サイクル反復中のキャッピングステップ及び脱保護ステップの実施を含まない。ある特定の実施形態では、繰り返される規定ステップのうちの少なくとも1つの後、支持体結合材料は、次の反応に備えてアセトニトリルなどの溶媒で洗浄される。ある特定の実施形態では、初期の反応サイクル反復中、例えば、最大7回の反応サイクル反復などの最大最初の3〜10回の反応サイクル反復中の繰り返される規定ステップの各々の後、支持体結合材料は、次の反応に備えてアセトニトリルなどの溶媒で洗浄される。ある特定の実施形態では、繰り返される規定ステップの各々の後、支持体結合材料は、次の反応に備えてアセトニトリルなどの溶媒で洗浄される。

0122

ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトの提供及び結合、形成された亜リン酸トリエステル連結のチオール化(または酸化)、任意選択で未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング、及び任意選択でオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護のステップを実施する反応サイクルは、9〜99回繰り返されて、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供し、例えば、9〜79回、9〜69回、9〜59回、9〜49回、9〜39回、9〜29回、9〜24回、9〜20回、10〜30回、15〜25回、20〜30回、14〜24回、14〜20回、または10〜24回など、9〜89回繰り返される。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトの提供/結合、形成された亜リン酸トリエステル連結のチオール化(または酸化)、任意選択で未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング、及び任意選択でオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護のステップを実施する反応サイクルは、9〜99回繰り返されて、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供し、未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)の任意選択のキャッピングステップ及びオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の任意選択の脱保護ステップは、最後の反応サイクル反復中省かれ、例えば、9〜79回、9〜69回、9〜59回、9〜49回、9〜39回、9〜29回、9〜24回、9〜20回、14〜24回、14〜20回、または10〜24回など、9〜89回繰り返され、未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)の任意選択のキャッピングステップ及びオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の任意選択の脱保護ステップは、最後の反応サイクル反復中省かれる。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトの提供/結合、形成された亜リン酸トリエステル連結のチオール化(または酸化)、任意選択で未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング、及び任意選択でオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護のステップを実施する反応サイクルは、規定回数繰り返されて、10〜100の単量体サブユニットを有する、例えば、10〜90の単量体サブユニット、10〜80の単量体サブユニット、10〜70の単量体サブユニット、10〜60の単量体サブユニット、10〜50の単量体サブユニット、10〜40の単量体サブユニット、10〜30の単量体サブユニット、10〜25の単量体サブユニット、15〜25の単量体サブユニット、20〜30の単量体サブユニット、20〜25の単量体サブユニット、20〜90の単量体サブユニット、30〜90の単量体サブユニット、または40〜70の単量体サブユニットを有する固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供し、未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)の任意選択のキャッピングステップ及びオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の任意選択の脱保護ステップは、最後の反応サイクル反復中省かれる。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトの提供/結合、形成された亜リン酸トリエステル連結のチオール化(または酸化)、任意選択で未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング、及び任意選択でオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護のステップを実施する反応サイクルは、14回繰り返されて、固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供し、例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30回など、15回繰り返され、未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)の任意選択のキャッピングステップ及びオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の任意選択の脱保護ステップは、最後の反応サイクル反復中省かれる。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトの提供/結合、形成された亜リン酸トリエステル連結のチオール化(または酸化)、任意選択で未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング、及び任意選択でオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護のステップを実施する反応サイクルは、規定回数繰り返されて、15の単量体サブユニットを有する、例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の単量体サブユニットを有する固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供し、未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)の任意選択のキャッピングステップ及びオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の任意選択の脱保護ステップは、最後の反応サイクル反復中省かれる。

0123

ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトの提供/結合、形成された亜リン酸トリエステル連結のチオール化(または酸化)、任意選択で未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング、及び任意選択でオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護のステップを実施する反応サイクルは、規定回数繰り返されて、300mmol以上の量(合成スケールに基づいた理論量または結合されるリンカーを有する固体支持体の充填容量など)、例えば、600mmol以上、700mmol以上、800mmol以上、900mmol以上、1,000mmol以上、1,100mmol以上、1,200mmol以上、1,300mmol以上、1,400mmol以上、1,500mmol以上、1,600mmol以上、1,700mmol以上、1,800mmol以上、1,900mmol以上、2,000mmol以上、2,100mmol以上、2,200mmol以上、2,300mmol以上、2,400mmol以上、2,500mmol以上、2,600mmol以上、2,700mmol以上、2,800mmol以上、2,900mmol以上、3,000mmol以上、3,200mmol以上、3,400mmol以上、3,600mmol以上、4,000mmol以上、4,200mmol以上、4,500mmol以上、5,000mmol以上、もしくは5,400mmol以上の量、または例えば300〜5,400mmol、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、300〜3,600mmol、300〜3,000mmol、600〜3,000mmol、700〜3,600mmol、700〜2,700mmol、700〜2,500mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,900mmol、700〜1,800mmol、700〜1,700mmol、700〜1,600mmol、700〜1,500mmol、700〜900mmol、800〜1,200mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,800mmol、900〜2,400mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,800〜2,700mmol、1,800〜3,600mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,500mmol、1,000〜2,000mmol、1,000〜1,500mmol、1,250〜1,750mmol、1,500〜3,000mmol、1,500〜2,500mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、2,000〜3,000mmol、2,500〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、もしくは3,600〜5,400mmolの範囲の固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供し、未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)の任意選択のキャッピングステップ及びオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の任意選択の脱保護ステップは、最後の反応サイクル反復中省かれる。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホロアミダイトの提供/結合、形成された亜リン酸トリエステル連結のチオール化(または酸化)、任意選択で未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)のキャッピング、及び任意選択でオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の脱保護のステップを実施する反応サイクルは、規定回数繰り返されて、300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol、または5,400mmolの量(合成スケールに基づいた理論量または結合されるリンカーを有する固体支持体の充填容量など)の固体支持体結合オリゴヌクレオチドを提供し、未反応の脱保護されたヒドロキシル基(複数可)の任意選択のキャッピングステップ及びオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオシドの保護された5’−ヒドロキシル基の任意選択の脱保護ステップは、最後の反応サイクル反復中省かれる。

0124

5.10ホスホロチオエート連結の脱保護
ある特定の実施形態では、固体支持体結合オリゴヌクレオチドの保護されたホスホロチオエート連結は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い脱保護される。例えば、ある特定の実施形態では、固体支持体結合オリゴヌクレオチドの2−シアノエトキシ−保護されたホスホロチオエート連結が脱保護される。ある特定の実施形態では、固体支持体結合オリゴヌクレオチドの2−シアノエトキシ−保護されたホスホロチオエート連結などの保護されたホスホロチオエート連結は、アミンで脱保護される。ある特定の実施形態では、保護されたホスホロチオエート連結は、アミン、例えばトリエチルアミン、例えば、非プロトン性溶媒中10〜50%トリエチルアミン(v/v)で、例えばアセトニトリル中20%トリエチルアミン(v/v)などの非プロトン性溶媒中10〜30%トリエチルアミン(v/v)で脱保護される。ある特定の実施形態では、保護されたホスホロチオエート連結を脱保護するステップは、ホスホロチオエート連結、例えば保護されていないホスホロチオエート連結、またはホスホロチオエート連結のトリエチルアミン塩形態などのホスホロチオエート連結のアミン塩形態を形成する。ある特定の実施形態では、保護されたホスホロチオエート連結を脱保護するステップは、ホスホロチオエート連結を有する固体支持体結合オリゴヌクレオチド、例えば、保護されていないホスホロチオエート連結を有する固体支持体結合オリゴヌクレオチドを形成する。ある特定の実施形態では、脱保護ステップの後、支持体結合された脱保護された材料は、次の反応に備えてアセトニトリルなどの溶媒で洗浄され、例えば、支持体は、方法の次のステップに備えて、1〜7カラム体積、1〜6カラム体積、1〜5カラム体積、1〜4カラム体積、1〜3カラム体積、または2〜4カラム体積などの1〜10カラム体積で洗浄され得る。

0125

5.11固体支持体からの切断及び溶出
ある特定の実施形態では、保護されていないホスホロチオエート連結を有する固体支持体結合オリゴヌクレオチドは、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い、固体支持体から切断される。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法の切断ステップは、水酸化アンモニウム溶液、例えば、40℃、50℃、60℃、または65℃の温度などの40〜70℃または40〜60℃の温度の加熱された溶液など、加熱された水酸化アンモニウム溶液を提供すること、例えば、加熱された水酸化アンモニウム溶液を提供し、カラムハウジングを通して加熱された水酸化アンモニウム溶液を再循環させて、該脱保護された固体支持体結合オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断することを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法の切断ステップは、28〜30%アンモニア水溶液(w/w)、例えば、40℃、50℃、60℃、または65℃の温度などの40〜70℃または40〜60℃の温度の加熱された溶液など、加熱された28〜30%アンモニア水溶液(w/w)を提供すること、例えば、加熱された28〜30%アンモニア水溶液(w/w)を提供し、カラムハウジングを通して加熱されたアンモニア水溶液を再循環させて、該脱保護された固体支持体結合オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断することを含む。ある特定の実施形態では、加熱された溶液は、24時間など、8〜36時間の間、支持体を通して再循環される。ある特定の実施形態では、加熱された溶液は、支持体を通して再循環され、8〜36時間の間、例えば、24時間などの12〜36時間の間、該支持体と接触している。

0126

ある特定の実施形態では、本方法の切断ステップは、保護されていないホスホロチオエート連結を有する固体支持体結合オリゴヌクレオチドの、保護されていないホスホロチオエート連結を有する切断されたオリゴヌクレオチドの、または両方の環外アミノ保護基をさらに脱保護する。ある特定の実施形態では、環外アミノ保護基は、ベンゾイル及びイソブチリル基を含む。ある特定の実施形態では、切断ステップは、保護されていないホスホロチオエート連結を有する固体支持体結合オリゴヌクレオチドの、保護されていないホスホロチオエート連結を有する切断されたオリゴヌクレオチドの、または両方のベンゾイル−及びイソブチリル−アミノ保護基をさらに脱保護する。

0127

ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチドは5’−ヒドロキシル保護基を含み、例えば、切断されたオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドは、5’−ヒドロキシル保護基を含む。ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシル保護基には、アセチル、i−ブチリル、t−ブチル、t−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、1−エトキシエチル、1−(2−クロロエトキシ)エチル、p−クロロフェニル、2,4−ジニトロフェニル、ベンジル、2,6−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、p−ニトロベンジル、ビス(2−アセトキシエトキシ)メチル(ACE)、2−トリメチルシリルエチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、[(トリイソプロピルシリル)オキシ]メチル(TOM)、ベンゾイルホルメート、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、p−フェニルベンゾイル、9−フルオレニルメチルカーボネート、メシレート、トシレート、トリフェニルメチル(トリチル)、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル(DMT)、トリメトキシトリチル、1(2−フルオロフェニル)−4−メトキシピペリジン−4−イル(FPMP)、9−フェニルキサンチン−9−イル(Pixyl)、及び9−(p−メトキシフェニル)キサンチン−9−イル(MOX)などの保護基が含まれ得る。ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチドのヒドロキシル保護基は、トリチルまたはジメトキシトリチル(DMT)を含み得る。ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチドのヒドロキシル保護基は、ジメトキシトリチル(DMT)である。

0128

ある特定の実施形態では、固体支持体結合オリゴヌクレオチドの切断により、300mmol以上の量(合成スケールに基づいた理論量または結合されるリンカーを有する固体支持体の充填容量など)、例えば、600mmol以上、700mmol以上、800mmol以上、900mmol以上、1,000mmol以上、1,100mmol以上、1,200mmol以上、1,300mmol以上、1,400mmol以上、1,500mmol以上、1,600mmol以上、1,700mmol以上、1,800mmol以上、1,900mmol以上、2,000mmol以上、2,100mmol以上、2,200mmol以上、2,300mmol以上、2,400mmol以上、2,500mmol以上、2,600mmol以上、2,700mmol以上、2,800mmol以上、2,900mmol以上、3,000mmol以上、3,200mmol以上、3,400mmol以上、3,600mmol以上、4,000mmol以上、4,200mmol以上、4,500mmol以上、5,000mmol以上、もしくは5,400mmol以上の量、または例えば300〜5,400mmol、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、300〜3,600mmol、300〜3,000mmol、600〜3,000mmol、700〜3,600mmol、700〜2,700mmol、700〜2,500mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,900mmol、700〜1,800mmol、700〜1,700mmol、700〜1,600mmol、700〜1,500mmol、700〜900mmol、800〜1,200mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,800mmol、900〜2,400mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,800〜2,700mmol、1,800〜3,600mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,500mmol、1,000〜2,000mmol、1,000〜1,500mmol、1,250〜1,750mmol、1,500〜3,000mmol、1,500〜2,500mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、2,000〜3,000mmol、2,500〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、もしくは3,600〜5,400mmolの範囲の切断されたオリゴヌクレオチド、例えば、末端ヌクレオシド上に5’−ヒドロキシル保護基を含む切断されたオリゴヌクレオチドが提供される。ある特定の実施形態では、固体支持体結合オリゴヌクレオチドの切断により、300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol、または5,400mmolの量(合成スケールに基づいた理論量または結合されるリンカーを有する固体支持体の充填容量など)の切断されたオリゴヌクレオチド、例えば、末端ヌクレオシド上に5’−ヒドロキシル保護基を含む切断されたオリゴヌクレオチドが提供される。

0129

ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチドは、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い、固体支持体から溶出される。ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチド、例えば、末端ヌクレオシド上に5’−ヒドロキシル保護基を含む切断されたオリゴヌクレオチドの固体支持体からの溶出は、水で、例えば、水溶液または緩衝水溶液で支持体を洗浄することを含む。

0130

ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチドを固体支持体から溶出することにより、300〜5,400mmol、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、300〜3,600mmol、300〜3,000mmol、600〜3,000mmol、700〜3,600mmol、700〜2,700mmol、700〜2,500mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,900mmol、700〜1,800mmol、700〜1,700mmol、700〜1,600mmol、700〜1,500mmol、700〜900mmol、800〜1,200mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,800mmol、900〜2,400mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,800〜2,700mmol、1,800〜3,600mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,500mmol、1,000〜2,000mmol、1,000〜1,500mmol、1,250〜1,750mmol、1,500〜3,000mmol、1,500〜2,500mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、2,000〜3,000mmol、2,500〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、または3,600〜5,400mmolの範囲の量(合成スケールに基づいた理論量または結合されるリンカーを有する固体支持体の充填容量など)のオリゴヌクレオチド、例えば、末端ヌクレオシド上に5’−ヒドロキシル保護基を含む切断されたオリゴヌクレオチドが提供される。ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチドを固体支持体から溶出することにより、300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol、または5,400mmolの量(合成スケールに基づいた理論量または結合されるリンカーを有する固体支持体の充填容量など)のオリゴヌクレオチド、例えば、末端ヌクレオシド上に5’−ヒドロキシル保護基を含む切断されたオリゴヌクレオチドが提供される。

0131

5.12イオン交換精製
ある特定の実施形態では、固体支持体からの切断されたオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶出物は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い、イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。本明細書で開示される方法に従いイオン交換クロマトグラフィーによりオリゴヌクレオチドを精製するために利用されるイオン交換カラムの容量または精製スケールは、オリゴヌクレオチドを精製するためにイオン交換カラムにおいて利用可能なイオン交換容量のモル量を指す。したがって、利用されるイオン交換カラムの容量または精製スケールに等しい精製されたオリゴヌクレオチドの量は、理論量と考えられる。イオン交換カラムを利用する本明細書で開示される方法に従い精製されたオリゴヌクレオチドの実際の量は、理論量と同一であり得るか、または理論量よりも少なくてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、イオン交換カラムを利用する本明細書で開示される方法に従い精製されたオリゴヌクレオチドの実際の量は、理論量よりも少なく、例えば、理論量の95%、例えば、理論量の90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、または50%であるか、または例えば、理論量の40〜98%、40〜95%、40〜90%、40〜85%、40〜80%、40〜75%、40〜70%、50〜98%、50〜95%、50〜90%、50〜85%、50〜80%、50〜75%、50〜70%、60〜98%、60〜95%、60〜90%、60〜85%、60〜80%、60〜75%、または60〜70%である。

0132

ある特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した、切断されたオリゴヌクレオチド溶出物、例えば、末端ヌクレオシド上に5’−ヒドロキシル保護基を含む切断されたオリゴヌクレオチド溶出物の精製は、塩勾配、例えば塩化ナトリウム勾配を利用するか、または塩基性塩勾配、例えば塩基性塩化ナトリウム勾配を利用することを含む。ある特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーによる精製ステップは、切断されたオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラム上に直接充填するか、あるいはイオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填する前に、切断されたオリゴヌクレオチド溶出物を水性緩衝液希釈することを含む。ある特定の実施形態では、精製される切断されたオリゴヌクレオチド溶出物内に含まれる切断されたオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドの5’−ヒドロキシル基は、イオン交換カラム上への充填ステップ中保護されたままである。ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填された切断されたオリゴヌクレオチド溶出物内に含まれる切断されたオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドの5’−ヒドロキシル基は、該充填されたオリゴヌクレオチド溶出物に対して保護される唯一の基である。例えば、ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填された切断されたオリゴヌクレオチドなどの切断されたオリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシル保護基は、トリチルまたはジメトキシトリチル(DMT)を含み得る。ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチドまたは充填された切断されたオリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシル保護基は、ジメトキシトリチル(DMT)である。

0133

ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填される切断されたオリゴヌクレオチド溶出物内に含まれる切断されたオリゴヌクレオチド、例えば、末端ヌクレオシド上に5’−ヒドロキシル保護基を含む切断されたオリゴヌクレオチドの量は、300mmol以上、例えば、600mmol以上、700mmol以上、800mmol以上、900mmol以上、1,000mmol以上、1,100mmol以上、1,200mmol以上、1,300mmol以上、1,400mmol以上、1,500mmol以上、1,600mmol以上、1,700mmol以上、1,800mmol以上、1,900mmol以上、2,000mmol以上、2,100mmol以上、2,200mmol以上、2,300mmol以上、2,400mmol以上、2,500mmol以上、2,600mmol以上、2,700mmol以上、2,800mmol以上、2,900mmol以上、3,000mmol以上、3,200mmol以上、3,400mmol以上、3,600mmol以上、4,000mmol以上、4,200mmol以上、4,500mmol以上、5,000mmol以上、もしくは5,400mmol以上のものであり得るか、または例えば、300〜5,400mmol(例えば、精製スケールに関して)、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、300〜3,600mmol、300〜3,000mmol、600〜3,000mmol、700〜3,600mmol、700〜2,700mmol、700〜2,500mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,900mmol、700〜1,800mmol、700〜1,700mmol、700〜1,600mmol、700〜1,500mmol、700〜900mmol、800〜1,200mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,800mmol、900〜2,400mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,800〜2,700mmol、1,800〜3,600mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,500mmol、1,000〜2,000mmol、1,000〜1,500mmol、1,250〜1,750mmol、1,500〜3,000mmol、1,500〜2,500mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、2,000〜3,000mmol、2,500〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、もしくは3,600〜5,400mmolの範囲であり得る。ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填される切断されたオリゴヌクレオチド溶出物内に含まれる切断されたオリゴヌクレオチド、例えば、末端ヌクレオシド上に5’−ヒドロキシル保護基を含む切断されたオリゴヌクレオチドの量は、300mmol(例えば、精製スケールに関して)、例えば、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol、または5,400mmolの量であり得る。

0134

ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填される切断されたオリゴヌクレオチド溶出物内に含まれる切断されたオリゴヌクレオチド、例えば、末端ヌクレオシド上に5’−ヒドロキシル保護基を含む切断されたオリゴヌクレオチドの量は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のオリゴヌクレオチド合成カラム(または1つ以上の合成カラムを利用する合成実行)からプールされる量であるか、または例えば、1〜10のオリゴヌクレオチド合成カラム(または1つ以上の合成カラムを利用する合成実行)、例えば、1〜8、2〜10、3〜9、4〜7、4〜6、6〜10もしくは8〜10のオリゴヌクレオチド合成カラム(または1つ以上の合成カラムを利用する合成実行)からプールされる量である。ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填される前またはそれにより精製される前にプールされる、単一、複数、または各々のオリゴヌクレオチド合成カラム(複数可)(または1つ以上の合成カラム(複数可)を利用する合成実行(複数可))から得られる切断されたオリゴヌクレオチドの独立量は、300mmol以上の切断されたオリゴヌクレオチドの量であり得、例えば、600mmol以上、700mmol以上、800mmol以上、900mmol以上、1,000mmol以上、1,100mmol以上、1,200mmol以上、1,300mmol以上、1,400mmol以上、1,500mmol以上、1,600mmol以上、1,700mmol以上、1,800mmol以上、1,900mmol以上、2,000mmol以上、2,100mmol以上、2,200mmol以上、2,300mmol以上、2,400mmol以上、2,500mmol以上、2,600mmol以上、2,700mmol以上、2,800mmol以上、2,900mmol以上、3,000mmol以上、3,200mmol以上、3,400mmol以上、3,600mmol以上、4,000mmol以上、4,200mmol以上、4,500mmol以上、5,000mmol以上、もしくは5,400mmol以上の切断されたオリゴヌクレオチドの量であり得るか、または例えば、300〜5,400mmolの範囲、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、600〜3,000mmol、700〜3,600mmol、700〜3,000mmol、700〜2,700mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,500mmol、700〜1,000mmol、700〜900mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜2,400mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,000mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、1,500〜2,500mmol、1,500〜3,000mmol、2,000〜3,000mmol、2,000〜2,500mmol、2,500〜3,000mmol、2,600〜2,800mmol、2,700〜3,000mmol、900〜2,000mmol、900〜2,500mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,000〜4,000mmol、1,500〜3,500mmol、1,800〜3,600mmol、2,000〜4,000mmol、2,500〜3,500mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、もしくは3,600〜5,400mmolの範囲の切断されたオリゴヌクレオチドであり得る。

0135

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される単一、複数、または各々のイオン交換カラム(複数可)は、300〜5,400mmolの範囲の量の精製され完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを提供する、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、300〜3,600mmol、300〜3,000mmol、600〜3,000mmol、700〜2,500mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,900mmol、700〜1,800mmol、700〜1,700mmol、700〜1,600mmol、700〜1,500mmol、700〜1,400mmol、700〜1,300mmol、700〜1,200mmol、700〜1,100mmol、700〜1,000mmol、700〜900mmol、800〜1,200mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,800mmol、900〜2,400mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,800〜2,700mmol、1,800〜3,600mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,500mmol、1,000〜2,000mmol、1,000〜1,500mmol、1,250〜1,750mmol、1,500〜3,000mmol、1,500〜2,500mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、2,000〜3,000mmol、2,500〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、または3,600〜5,400mmolの範囲の量の精製され完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを提供するのに十分な充填容量(またはイオン交換容量)を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される単一、複数、または各々のイオン交換カラム(複数可)は、少なくとも300mmolの量の精製され完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを提供する、例えば、少なくとも300mmol、例えば、少なくとも400mmol、少なくとも500mmol、少なくとも600mmol、少なくとも700mmol、少なくとも800mmol、少なくとも900mmol、少なくとも1,000mmol、少なくとも1,100mmol、少なくとも1,200mmol、少なくとも1,300mmol、少なくとも1,400mmol、少なくとも1,600mmol、少なくとも1,800mmol、少なくとも2,400mmol、少なくとも2,700mmol、少なくとも3,000mmol、少なくとも3,600mmol、または少なくとも4,500mmolの量の精製され完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを提供するのに十分な充填容量を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される単一、複数、または各々のイオン交換カラム(複数可)は、300mmol、例えば、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,100mmol、3,200mmol、3,300mmol、3,400mmol、3,500mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol、または5,400mmolの量の精製され完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを提供するのに十分な充填容量(またはイオン交換容量)を有する。

0136

ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従いイオン交換クロマトグラフィーを使用する精製ステップは、陰イオン交換クロマトグラフィーであり、塩化ナトリウム勾配などの塩勾配を利用することを含む。ある特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーカラムは、支持媒体としてQ SepharoseFFを使用することを含む。

0137

ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチド溶出物は、イオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填され、次いで最初に塩基性溶液で洗浄されて、例えば、最初に水酸化ナトリウム溶液で洗浄されて、イオン交換カラム上への充填ステップを完了する。

0138

ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填し、続いて切断されたオリゴヌクレオチド充填カラムを洗浄する、例えば、切断されたオリゴヌクレオチド充填カラムを塩基性溶液で洗浄し、例えば、続いて切断されたオリゴヌクレオチド充填カラムを水酸化ナトリウム溶液で最初に洗浄し、その後切断されたオリゴヌクレオチド充填カラムを塩勾配、例えば、異なる量の塩化ナトリウム溶液及び水酸化ナトリウム溶液を含む勾配などの塩基性塩勾配で洗浄して、イオン交換カラム上への充填ステップを完了する。

0139

ある特定の実施形態では、切断されたオリゴヌクレオチド溶出物をイオン交換クロマトグラフィーカラム上に充填し、続いて切断されたオリゴヌクレオチド充填カラムを洗浄する、例えば、切断されたオリゴヌクレオチド充填カラムを塩基性溶液で洗浄し、例えば、続いて切断されたオリゴヌクレオチド充填カラムを水酸化ナトリウム溶液で最初に洗浄し、その後切断されたオリゴヌクレオチド充填カラムを塩勾配、例えば、異なる量の塩化ナトリウム溶液及び水酸化ナトリウム溶液を含む勾配などの塩基性塩勾配で洗浄し、次いで切断されたオリゴヌクレオチド充填カラムを塩基性溶液でさらに洗浄して、例えば、切断されたオリゴヌクレオチド充填カラムを水酸化ナトリウム溶液でさらに洗浄して、イオン交換カラム上への充填ステップを完了する。

0140

ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填された切断されたオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシド上の保護ヒドロキシル基は脱保護され、例えば、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い、陰イオン交換カラム上に充填された切断されたオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシド上の5’−ヒドロキシル保護基が脱保護され、その後洗浄される。例えば、ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填された切断されたオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドからの5’−ヒドロキシル保護基の脱保護は、酢酸溶液などのプロトン酸、例えば、80%の水性酢酸溶液をイオン交換カラムに導入することにより達成され得る。ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填された切断されたオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドからの5’−ヒドロキシル保護基の脱保護は、酢酸溶液などのプロトン酸溶液、例えば、80%の水性酢酸溶液をイオン交換カラムに提供し、プロトン酸溶液の流れを一定期間保持し、次いでイオン交換カラムを通して溶液の流れを再開して、イオン交換カラム上に充填された切断されたオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドからの5’−ヒドロキシル保護基の脱保護を完了することにより達成され得る。ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填された切断されたオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドからの5’−ヒドロキシル保護基を脱保護するために利用されるプロトン酸の体積は、少なくとも10L、例えば10〜40L、例えば、20〜40L、10〜30L、25〜35L、または15〜25Lの範囲であり得る。ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に充填された切断されたオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドからの5’−ヒドロキシル保護基を脱保護するために利用されるプロトン酸の体積は、少なくとも1カラム体積、例えば、1〜3、2〜4、3〜5、または1〜4カラム体積などの1〜5カラム体積の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、脱保護されるイオン交換カラム上に充填された切断されたオリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシル保護基は、トリチルまたはジメトキシトリチル(DMT)である。ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に残存する結果として生じる脱保護されたオリゴヌクレオチドは、保護基がない。

0141

ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上の充填され完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドは、塩勾配でイオン交換カラムから溶出される前に、塩基性溶液、例えば、0.1M水酸化ナトリウム溶液などの25〜200mM水酸化ナトリウム溶液で最初に中和される。

0142

ある特定の実施形態では、イオン交換カラム、例えば陰イオン交換カラム上に残存する結果として生じる脱保護されたオリゴヌクレオチドは、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い、塩勾配を使用してカラムから溶出される。例えば、ある特定の実施形態では、イオン交換カラムから結果として生じる脱保護されたオリゴヌクレオチドを溶出するために利用される塩勾配は、塩化ナトリウム勾配、例えば、異なる量の塩化ナトリウム溶液及び水酸化ナトリウム溶液を含む勾配などの塩基性塩勾配であり得る。ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に残存する結果として生じる脱保護されたオリゴヌクレオチドは、最初に水で洗浄され、次いで、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い、塩勾配を使用してイオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出される。ある特定の実施形態では、イオン交換カラム上に残存する結果として生じる脱保護されたオリゴヌクレオチドを、最初に水で洗浄し、第2に、水性水酸化ナトリウム溶液などの塩基性溶液で洗浄して、カラムのpHを調整し、第3に、塩化ナトリウム勾配または塩基性塩勾配などの塩勾配、例えば、異なる量の塩化ナトリウム溶液及び水酸化ナトリウム溶液を含む勾配を使用してイオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出し、それによりイオン交換カラムから結果として生じる脱保護されたオリゴヌクレオチドの溶出を完了する。ある特定の実施形態では、イオン交換カラムから結果として生じる脱保護されたオリゴヌクレオチドを溶出するために利用される塩勾配は、0.1〜2Mの範囲の、水性塩溶液、例えば塩基性水性塩溶液であり、例えば、塩勾配は塩化ナトリウムを含む0.1〜2Mの水性塩基性溶液の範囲であり、例えば塩勾配は水性塩基性溶液中0.2〜1.8M塩化ナトリウムの範囲である。ある特定の実施形態では、イオン交換カラムから結果として生じる脱保護されたオリゴヌクレオチドを溶出するために利用される塩勾配は、10〜50nM水性水酸化ナトリウム溶液中0.2〜1.8M塩化ナトリウムの塩勾配などの、10〜50nM水性水酸化ナトリウム溶液中0.1〜2M塩化ナトリウムの範囲である。ある特定の実施形態では、イオン交換カラムから溶出される結果として生じるオリゴヌクレオチドは、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドである。

0143

ある特定の実施形態では、イオン交換カラムから溶出される完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドの量は、300〜5,400mmolの範囲、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、300〜3,600mmol、300〜3,000mmol、600〜3,000mmol、700〜3,600mmol、700〜2,700mmol、700〜2,500mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,900mmol、700〜1,800mmol、700〜1,700mmol、700〜1,600mmol、700〜1,500mmol、700〜900mmol、800〜1,200mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,800mmol、900〜2,400mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,800〜2,700mmol、1,800〜3,600mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,500mmol、1,000〜2,000mmol、1,000〜1,500mmol、1,250〜1,750mmol、1,500〜3,000mmol、1,500〜2,500mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、2,000〜3,000mmol、2,500〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、または3,600〜5,400mmolの範囲であり得る。ある特定の実施形態では、イオン交換カラムから溶出される完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドの量は、300mmol、例えば、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol、または5,400mmolの量であり得る。

0144

ある特定の実施形態では、合成から始まってイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製ステップから収集されたオリゴヌクレオチドまでの、本明細書で開示される方法に従うオリゴヌクレオチドの調製の全収率は、260nmの波長での光学密度/mL(OD/mL)により決定される場合、少なくとも50%、例えば、260nmの波長でのOD/mLにより決定される場合、55〜95%、55〜90%、55〜85%、55〜80%、55〜75%、60〜100%、60〜90%、60〜80%、50〜75%、70〜100%、80〜90%、85〜95%、90〜100%、または95〜100%などの55〜100%の範囲である。ある特定の実施形態では、合成から始まってイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製ステップから収集されたオリゴヌクレオチドまでの、本明細書で開示される方法に従い調製されたオリゴヌクレオチドの純度は、RP−HPLCにより決定される場合、少なくとも50%であり、例えば、50〜95%、50〜85%、50〜75%、60〜90%、60〜80%、80〜100%、90〜100%、85〜95%、または95〜100%などの50〜100%の範囲の純度である。

0145

5.13限外濾過及び/または透析濾過(UFDF)工程
ある特定の実施形態では、イオン交換カラムからの完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを含む溶出物は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い限外濾過及び/または透析濾過工程により脱塩される。ある特定の実施形態では、イオン交換カラムから得られる完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを含む溶出物は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い限外濾過及び/または透析濾過工程により脱塩される前に、希釈水酸化ナトリウム溶液などの希釈塩性溶液で、または希釈塩酸溶液などの希釈酸性溶液で、または各々の組み合わせで任意選択で中和されて、pHが中性(例えば、6.5〜7.5などの6〜8の範囲のpH)に調整される。例えば、イオン交換カラムから得られる完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを含む溶出物は、希釈水酸化ナトリウム溶液(例えば、0.1〜1M水酸化ナトリウム)などの希釈塩基性溶液で、または希釈塩酸溶液(例えば、0.1〜1M塩酸)などの希釈酸性溶液、または各々の組み合わせで任意選択で中和されて、pHが中性(例えば、6.5〜7.5などの6〜8の範囲のpH)に調整され得る。ある特定の実施形態では、イオン交換カラムから得られる完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを含む溶出物(任意選択で中和され得る)を、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い限外濾過及び/または透析濾過工程により脱塩し、続いて、薄膜蒸発により濃縮するか、または薄膜蒸発により濃縮し、続いて凍結乾燥するなど、結果として生じる脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド残余分溶液を濃縮する。

0146

ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程により完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを脱塩する、例えば濃縮前に(例えば薄膜蒸発による濃縮など)脱塩する工程は、5〜8の範囲のpHの水溶液を利用して、脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド残余分溶液を提供し、例えば、6〜8、6.5〜8、6.8〜8、5.5〜7.5、6〜7.5、6.5〜7.5、6.8〜7.5、5.5〜7、6〜7、6.5〜7、6.8〜8、6.8〜7.5、または6.8〜7.3などの5.5〜8の範囲のpHの水溶液を利用して、脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド残余分溶液を提供する。ある特定の実施形態では、脱塩ステップは、6.8〜7.3の範囲のpHの水溶液を利用することから始まり、6.5〜7.5の範囲のpHの水溶液を利用して、脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド残余分溶液を提供することによって脱塩ステップを終わる。ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程により完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを脱塩する工程は、蒸留水または蒸留された脱イオン水を利用して、脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド残余分溶液を提供する。

0147

ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程により完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを含む溶出物を脱塩する、例えば濃縮前に(例えば薄膜蒸発による濃縮など)脱塩する工程は、1,000〜3,000Daの分子量カットオフを有する再生セルロース膜などの再生セルロース膜を使用して、脱塩工程を達成する。

0148

ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程による完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド溶出物の脱塩の有効性は、結果として生じる脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド残余分溶液の塩濃度を決定する手段として、結果として生じる透過物(すなわち、限外濾過及び/または透析濾過工程からの濾液)の伝導率測定により決定される。例えば、ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程による完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド溶出物の脱塩からの結果として生じる透過物(時折、透析濾過物と称される)の伝導率は、900uS/cm未満、例えば、800uS/cm未満、700uS/cm未満、600uS/cm未満、500uS/cm未満、400uS/cm未満、300uS/cm未満、200uS/cm未満、100uS/cm未満、または75uS/cm未満である。ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程による完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド溶出物の脱塩からの結果として生じる透過物の伝導率は、40〜900uS/cm、例えば、40〜850uS/cm、40〜750uS/cm、40〜650uS/cm、40〜550uS/cm、40〜450uS/cm、40〜350uS/cm、40〜250uS/cm、40〜150uS/cm、40〜100uS/cm、または40〜75uS/cmの範囲である。ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程による完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド溶出物の脱塩の有効性は、結果として生じる脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド残余分溶液のナトリウム含有量を、6〜8重量%、例えば、6〜7重量%、7〜8重量%、または6.5〜7.5重量%の範囲のレベルにすることにつながる。

0149

ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程により脱塩される、例えば濃縮前に(例えば薄膜蒸発による濃縮など)脱塩されるイオン交換カラムからの溶出物中の完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドの量は、300〜5,400mmolの範囲、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、300〜3,600mmol、300〜3,000mmol、600〜3,000mmol、700〜3,600mmol、700〜2,700mmol、700〜2,500mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,900mmol、700〜1,800mmol、700〜1,700mmol、700〜1,600mmol、700〜1,500mmol、700〜900mmol、800〜1,200mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,800mmol、900〜2,400mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,800〜2,700mmol、1,800〜3,600mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,500mmol、1,000〜2,000mmol、1,000〜1,500mmol、1,250〜1,750mmol、1,500〜3,000mmol、1,500〜2,500mmol、1,600〜2,400mmol、1,500〜2,000mmol、2,000〜3,000mmol、2,500〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、または3,600〜5,400mmolの範囲であり得る。ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程により脱塩される、例えば濃縮前に(例えば薄膜蒸発による濃縮など)脱塩されるイオン交換カラムからの溶出物中の完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドの量は、300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,400mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol、または5,400mmolの量であり得る。

0150

ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程により脱塩を受ける、例えば濃縮前に(例えば薄膜蒸発による濃縮など)脱塩を受けるイオン交換クロマトグラフィーによる精製後の完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドの量は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のイオン交換クロマトグラフィー精製カラム(または1つ以上のイオン交換クロマトグラフィー精製カラムを利用する精製実行)からプールされる量であり、例えば、1〜8、2〜10、3〜9、4〜7、4〜6、6〜10、または8〜10のイオン交換クロマトグラフィー生清カラム(または1つ以上のイオン交換クロマトグラフィー精製カラムを利用する精製実行)などの、1〜10のイオン交換クロマトグラフィー精製カラム(または1つ以上のイオン交換クロマトグラフィー精製カラムを利用する精製実行)からプールされる量である。ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程により脱塩される前にプールされる、単一、複数、または各々のイオン交換クロマトグラフィー精製カラム(複数可)(または1つ以上のイオン交換クロマトグラフィー精製カラム(複数可)を利用する精製実行(複数可))から得られる完全に脱保護され精製されたオリゴヌクレオチドの独立量は、700mmol以上の完全に脱保護され精製されたオリゴヌクレオチドの量であり得、例えば、800mmol以上、900mmol以上、1,000mmol以上、1,100mmol以上、1,200mmol以上、1,300mmol以上、1,400mmol以上、1,500mmol以上、1,600mmol以上、1,700mmol以上、1,800mmol以上、1,900mmol以上、2,000mmol以上、2,100mmol以上、2,200mmol以上、2,300mmol以上、2,400mmol以上、2,500mmol以上、2,600mmol以上、2,700mmol以上、2,800mmol以上、2,900mmol以上、3,000mmol以上、3,200mmol以上、3,400mmol以上、3,600mmol以上、4,000mmol以上、4,200mmol以上、4,500mmol以上、5,000mmol以上、もしくは5,400mmol以上の完全に脱保護され精製されたオリゴヌクレオチドの量であり得るか、または例えば、700〜5,400mmol、例えば、700〜4,500mmol、700〜4,000mmol、800〜4,000mmol、900〜4,000mmol、900〜3,000mmol、900〜3,600mmol、900〜3,000mmol、900〜2,700mmol、900〜2,500mmol、900〜2,400mmol、900〜2,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,500mmol、900〜1,000mmol、700〜1,000mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,000mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、1,500〜2,700mmol、1,500〜3,000mmol、2,000〜3,000mmol、2,000〜2,500mmol、2,500〜3,000mmol、2,600〜2,800mmol、2,700〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、1,000〜4,000mmol、1,500〜3,500mmol、2,000〜4,000mmol、2,500〜3,500mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、もしくは3,600〜5,400mmolの範囲の完全に脱保護され精製されたオリゴヌクレオチドの量であり得る。

0151

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される限外濾過及び/または透析濾過工程は、300〜5,400mmolの範囲の量の脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを提供する、例えば、300〜4,500mmol、300〜4,000mmol、300〜3,600mmol、300〜3,000mmol、600〜3,000mmol、700〜3,600mmol、700〜2,700mmol、700〜2,500mmol、700〜2,400mmol、700〜2,000mmol、700〜1,900mmol、700〜1,800mmol、700〜1,700mmol、700〜1,600mmol、700〜1,500mmol、700〜1,400mmol、700〜1,300mmol、700〜1,200mmol、700〜1,100mmol、700〜1,000mmol、700〜900mmol、800〜1,200mmol、800〜1,000mmol、900〜1,600mmol、900〜1,800mmol、900〜2,400mmol、900〜2,700mmol、900〜3,600mmol、1,800〜2,700mmol、1,800〜3,600mmol、1,000〜3,000mmol、1,000〜2,500mmol、1,000〜2,000mmol、1,000〜1,500mmol、1,250〜1,750mmol、1,500〜3,000mmol、1,500〜2,500mmol、1,500〜2,000mmol、1,600〜2,400mmol、2,000〜3,000mmol、2,500〜3,000mmol、2,700〜3,600mmol、2,700〜4,500mmol、3,000〜4,000mmol、3,600〜4,500mmol、または3,600〜5,400mmolの範囲の量の脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを提供するのに十分な充填容量を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される限外濾過及び/または透析濾過工程は、少なくとも300mmolの量の脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを提供する、例えば、少なくとも300mmol、例えば、少なくとも400mmol、少なくとも500mmol、少なくとも600mmol、少なくとも700mmol、少なくとも800mmol、少なくとも900mmol、少なくとも1,000mmol、少なくとも1,100mmol、少なくとも1,200mmol、少なくとも1,300mmol、少なくとも1,400mmol、少なくとも1,600mmol、少なくとも1,800mmol、少なくとも2,400mmol、少なくとも2,700mmol、少なくとも3,000mmol、少なくとも3,600mmol、または少なくとも4,500mmolの量の脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを提供するのに十分な充填容量を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において利用される限外濾過及び/または透析濾過工程は、300mmol、400mmol、500mmol、600mmol、700mmol、800mmol、900mmol、1,000mmol、1,100mmol、1,200mmol、1,300mmol、1,400mmol、1,500mmol、1,600mmol、1,700mmol、1,800mmol、1,900mmol、2,000mmol、2,100mmol、2,200mmol、2,300mmol、2,400mmol、2,500mmol、2,600mmol、2,700mmol、2,800mmol、2,900mmol、3,000mmol、3,100mmol、3,200mmol、3,300mmol、3,400mmol、3,500mmol、3,600mmol、4,000mmol、4,200mmol、4,500mmol、5,000mmol、または5,400mmolの量の脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを提供するのに十分な充填容量を有する。

0152

5.14液体組成物濃縮工程
ある特定の実施形態では、イオン交換カラムからの完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド溶出物は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い、薄膜蒸発(TFE)工程で濃縮されるなど、濃縮される。ある特定の実施形態では、限外濾過及び/または透析濾過工程からの脱塩された完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド残余分溶液は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの調製方法に従い、薄膜蒸発工程で濃縮されるなど、濃縮される。

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