図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2020年10月1日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (5)

課題・解決手段

本出願は、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分と、有効量の1つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物とを混合するステップを含む、湿潤製粉工程におけるトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び/又はグルテン収量を改善する方法を提供し、前記加水分解酵素の少なくとも1つは、GH30ポリペプチド、GH5ポリペプチド又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

概要

背景

従来のトウモロコシ湿式製粉は、デンプンと、胚芽グルテンタンパク質)、及び繊維をはじめとするいくつかの副産物との回収及び精製のために設計された方法である。繊維は最も価値のない副産物であるため、産業界では、繊維の割合を減らしながら、デンプンやグルテンなどのより価値の高い製品収率を増加させることにかなりの努力を注いでいる。高品質デンプンは、乾燥デンプン改質デンプンデキストリン甘味料、及びアルコールなどの製品にさらに加工された後に、様々な商業目的に使用され得るので価値がある。グルテンは通常、コーングルテンミール(約60%のタンパク質)又はコーングルテンフィード(約20%のタンパク質)として、動物飼料のために使用される。

湿式製粉工程は、使用される特定の製粉装置に顕著に依存して変動し得るが、通常、工程は、穀粒洗浄、浸漬、粉砕、胚芽分離、二次粉砕繊維分離、グルテン分離、及びデンプン分離を含む。トウモロコシ穀粒が洗浄された後、それらは典型的には、時間及び温度が制御された状態下で水又は希釈SO2溶液に浸漬することによって軟化される。次に、穀粒を粉砕して果皮を砕き、胚芽を穀粒の残りの部分から分離する。主に繊維、デンプン、及びグルテンからなる残留スラリーは、繊維洗浄工程で微粉砕及び掛けされ、繊維がデンプン及びグルテンから分離された後、グルテンとデンプンが分離され、デンプンは洗浄/濾過工程で精製され得る。

湿式製粉工程の浸漬ステップのための酵素の使用など、湿式製粉工程のいくつかのステップにおける酵素の使用が示唆されている。市販の酵素製品Steepzyme(登録商標)(Novozymes A/Sから入手可能)は、湿式製粉工程の第1のステップ、すなわちトウモロコシ穀粒を水に浸す浸漬ステップに適することが示されている。

より最近では、トウモロコシ湿式製粉における全処理時間を顕著に短縮し、処理剤としての二酸化硫黄に対する必要を排除する、修正された湿式製粉である「酵素的製粉」が開発されている。Johnston et al.,Cereal Chem,81,p.626−632(2004)。

米国特許第6,566,125号明細書は、トウモロコシ穀粒を水に浸漬して浸漬トウモロコシ穀粒を製造し、浸漬トウモロコシ穀粒を粉砕して粉砕トウモロコシスラリーを製造し、粉砕トウモロコシスラリーを酵素(例えば、プロテアーゼ)と共にインキュベートすることを伴う、トウモロコシからデンプンを得る方法を開示する。

米国特許第5,066,218号明細書は、穀粒を洗浄し、穀粒を水に浸漬して軟化させ、次に穀粒をセルラーゼ酵素と共に製粉することを含む、穀粒、特にトウモロコシを製粉する方法を開示する。

国際公開第2002/000731号パンフレットは、穀粒を水に1〜12時間浸漬し、浸漬穀粒を湿式製粉して、穀粒を酸性プロテアーゼなどの1つ又は複数の酵素で処理することを含む、作物穀粒を処理する方法を開示する。

国際公開第2002/000911号パンフレットは、製粉デンプンを酸性プロテアーゼに曝すことを含む、デンプングルテンを分離する方法を開示する。

国際公開第2002/002644号パンフレットは、デンプンスラリーを酸性プロテアーゼの有効量を含む水溶液で洗浄することを含む、製粉工程のデンプンとグルテンの分離ステップから得られたデンプンスラリーを洗浄する方法を開示する。

国際公開第2014/082566号パンフレット及び国際公開第2014/082564号パンフレットは、湿式製粉で使用するためのセルロース分解性組成物を開示する。

概要

本出願は、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分と、有効量の1つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物とを混合するステップを含む、湿潤製粉工程におけるトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び/又はグルテン収量を改善する方法を提供し、前記加水分解酵素の少なくとも1つは、GH30ポリペプチド、GH5ポリペプチド又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

目的

本発明の目的は、好ましくは繊維洗浄手順中にトウモロコシ穀粒を加水分解酵素組成物で処理することによって、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒から得られ得るデンプン及び/又はグルテン収量を改善する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分と、有効量の1つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物とを混合するステップを含む、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び/又はグルテン収量を改善する方法であって、前記加水分解酵素の少なくとも1つが、GH30ポリペプチド、GH5ポリペプチド又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。

請求項2

前記湿式製粉工程における繊維から放出されるデンプン及び/又はグルテンの量が増加する、請求項1に記載の方法。

請求項3

a)前記トウモロコシ穀粒を水に浸漬して浸漬穀粒を製造するステップと;b)前記浸漬穀粒を粉砕して、浸漬粉砕穀粒を製造するステップと;c)前記浸漬粉砕穀粒から胚芽を分離して、繊維、デンプン、及びグルテンを含むトウモロコシ穀粒塊を製造するステップと;d)前記得られたトウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップとを含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。

請求項4

前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分が、請求項3に記載のステップd)の前、最中又は後に、前記1つ又は複数の加水分解酵素と混合される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分が、請求項3に記載のステップd)の最中に、前記1つ又は複数の加水分解酵素と混合される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分が、少なくとも15分間にわたり、前記1つ又は複数の加水分解酵素と反応させられる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

前記繊維洗浄手順が、1つ又は複数の加水分解酵素の導入のために最適化された繊維洗浄システムの使用を含み、前記繊維洗浄システムが、前記繊維洗浄システムにおける少なくとも35分間且つ48時間未満の総保持時間を提供するように構成された空間を含む、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

前記繊維洗浄システムに組み込まれた前記空間内のインキュベーション時間が、少なくとも5分間且つ48時間未満である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

前記インキュベーション温度が25℃〜95℃である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

前記GH5ポリペプチドがキシラナーゼ活性を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

前記GH30ポリペプチドがキシラナーゼ活性を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

前記GH5ポリペプチドが、エンド−β−1,4−グルカナーゼセルラーゼ(EC3.2.1.4)活性及び/又はエンド−β−1,4−キシラナーゼ(EC3.2.1.8)活性及び/又はβ−グルコシダーゼ(EC3.2.1.21)活性及び/又はβ−マンノシダーゼ(EC3.2.1.25)活性及び/又はβ−グルコシルセラミダーゼ(EC3.2.1.45)活性及び/又はグルカンβ−1,3−グルコシダーゼ(EC3.2.1.58)活性及び/又はリケニナーゼ(EC3.2.1.73)活性及び/又はエキソ−β−1,4−グルカナーゼ/セロデキストリナーゼ(EC3.2.1.74)活性及び/又はグルカンエンド−1,6−β−グルコシダーゼ(EC3.2.1.75)活性及び/又はマンナンエンド−β−1,4−マンノシダーゼ(EC3.2.1.78)活性及び/又はセルロースβ−1,4−セロビオシダーゼ(EC3.2.1.91)活性及び/又はステリルβ−グルコシダーゼ(EC3.2.1.104)活性又はエンドグリコセラミダーゼ(EC3.2.1.123)活性及び/又はキトサナーゼ(EC3.2.1.132)活性及び/又はβ−プリメベロシダーゼ(EC3.2.1.149)活性及び/又はキシログルカン−特定のエンド−β−1,4−グルカナーゼ(EC3.2.1.151)活性及び/又はエンド−β−1,6−ガラクタナーゼ(EC3.2.1.164)活性及び/又はヘスペリジン6−O−α−L−ラムシル−β−グルコシダーゼ(EC3.2.1.168)活性及び/又はβ−1,3−マンナナーゼ(EC3.2.1.−)活性及び/又はアラビノキシラン−特定のエンド−β−1,4−キシラナーゼ(EC3.2.1.−)活性及び/又はマンナントランスグリコシラーゼ(EC2.4.1.−)活性の1つ又は複数をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

前記GH30ポリペプチドが、エンド−β−1,4−キシラナーゼ(EC3.2.1.8)活性及び/又はβ−グルコシダーゼ(EC3.2.1.21)活性及び/又はβ−グルクロニダーゼ(EC3.2.1.31)活性及び/又はβ−キシロシダーゼ(EC3.2.1.37)活性及び/又はβ−フコシダーゼ(EC3.2.1.38)活性及び/又はグルコシルセラミダーゼ(EC3.2.1.45)活性及び/又はβ−1,6−グルカナーゼ(EC3.2.1.75)活性及び/又はグルクロノアラビノキシランエンド−β−1,4−キシラナーゼ(EC3.2.1.136)活性及び/又はエンド−β−1,6−ガラクタナーゼ(EC:3.2.1.164)活性及び/又は[還元末端]β−キシロシダーゼ(EC3.2.1.−)活性の1つ又は複数をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

前記GH5ポリペプチドが、i)配列番号1〜3、配列番号8、配列番号10又は配列番号12に記載されるアミノ酸配列成熟ポリペプチド;ii)i)の成熟ポリペプチドと少なくとも60%の同一性を有する、成熟ポリペプチド;iii)i)及びii)のいずれか1つの成熟ポリペプチドの部分配列からなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

前記GH30ポリペプチドが、i)配列番号4;配列番号5;配列番号6又は配列番号7に記載されるアミノ酸配列の成熟ポリペプチド;ii)i)の成熟ポリペプチドと少なくとも60%の同一性を有する、成熟ポリペプチド;iii)i)及びii)のいずれか1つの成熟ポリペプチドの部分配列からなる群から選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。

請求項16

前記酵素組成物が、セルラーゼ(EC3.2.1.4)、キシラナーゼ(EC3.2.1.8)、アラビノフラノシダーゼ(EC3.2.1.55(非還元末端α−L−アラビノフラノシダーゼ);EC3.2.1.185(非還元末端β−L−アラビノフラノシダーゼ)セロビオヒドロラーゼI(EC3.2.1.150)、セロビオヒドロラーゼII(E.C.3.2.1.91)、セロビオシダーゼ(E.C.3.2.1.176)、β−グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.21)、β−キシロシダーゼ(EC3.2.1.37)又はプロテアーゼ(E.CXXXX)からなる群から選択される1つ又は複数の酵素をさらに含む1つ又は複数の加水分解酵素を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。

請求項17

前記加水分解酵素の1つ又は複数が、トリコデルマリーゼイ(Trichodermareesei)などのセルラーゼバックグラウンドを有する生物において発現される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。

請求項18

前記1つ又は複数の加水分解酵素が精製される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。

請求項19

前記1つ又は複数の加水分解酵素が液体組成物中にある、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。

請求項20

前記1つ又は複数の加水分解酵素が固体組成物中にある、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。

請求項21

前記トウモロコシ穀粒塊の1つ又は複数の画分と混合される1つ又は複数の加水分解酵素の有効量が、0.005〜0.5kgの酵素タンパク質/前記湿潤製粉工程に入るトウモロコシ穀粒の計量トンである、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。

請求項22

請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法によって得られる、トウモロコシ繊維を含む組成物

請求項23

請求項1〜21のいずれか一項で定義される湿式製粉工程においてトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び/又はグルテン収量を改善する方法における、GH30ポリペプチド及び/又はGH5ポリペプチドの使用。

技術分野

0001

本発明は、好ましくは繊維洗浄中に、トウモロコシ穀粒と、GH30ポリペプチド、GH5ポリペプチド又はそれらの組み合わせを含む酵素組成物とを接触させることによって、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒からのデンプン及び/又はグルテン収量を改善する方法に関する。

背景技術

0002

従来のトウモロコシの湿式製粉は、デンプンと、胚芽、グルテン(タンパク質)、及び繊維をはじめとするいくつかの副産物との回収及び精製のために設計された方法である。繊維は最も価値のない副産物であるため、産業界では、繊維の割合を減らしながら、デンプンやグルテンなどのより価値の高い製品収率を増加させることにかなりの努力を注いでいる。高品質デンプンは、乾燥デンプン改質デンプンデキストリン甘味料、及びアルコールなどの製品にさらに加工された後に、様々な商業目的に使用され得るので価値がある。グルテンは通常、コーングルテンミール(約60%のタンパク質)又はコーングルテンフィード(約20%のタンパク質)として、動物飼料のために使用される。

0003

湿式製粉工程は、使用される特定の製粉装置に顕著に依存して変動し得るが、通常、工程は、穀粒洗浄、浸漬、粉砕、胚芽分離、二次粉砕繊維分離、グルテン分離、及びデンプン分離を含む。トウモロコシ穀粒が洗浄された後、それらは典型的には、時間及び温度が制御された状態下で水又は希釈SO2溶液に浸漬することによって軟化される。次に、穀粒を粉砕して果皮を砕き、胚芽を穀粒の残りの部分から分離する。主に繊維、デンプン、及びグルテンからなる残留スラリーは、繊維洗浄工程で微粉砕及び掛けされ、繊維がデンプン及びグルテンから分離された後、グルテンとデンプンが分離され、デンプンは洗浄/濾過工程で精製され得る。

0004

湿式製粉工程の浸漬ステップのための酵素の使用など、湿式製粉工程のいくつかのステップにおける酵素の使用が示唆されている。市販の酵素製品Steepzyme(登録商標)(Novozymes A/Sから入手可能)は、湿式製粉工程の第1のステップ、すなわちトウモロコシ穀粒を水に浸す浸漬ステップに適することが示されている。

0005

より最近では、トウモロコシ湿式製粉における全処理時間を顕著に短縮し、処理剤としての二酸化硫黄に対する必要を排除する、修正された湿式製粉である「酵素的製粉」が開発されている。Johnston et al.,Cereal Chem,81,p.626−632(2004)。

0006

米国特許第6,566,125号明細書は、トウモロコシ穀粒を水に浸漬して浸漬トウモロコシ穀粒を製造し、浸漬トウモロコシ穀粒を粉砕して粉砕トウモロコシスラリーを製造し、粉砕トウモロコシスラリーを酵素(例えば、プロテアーゼ)と共にインキュベートすることを伴う、トウモロコシからデンプンを得る方法を開示する。

0007

米国特許第5,066,218号明細書は、穀粒を洗浄し、穀粒を水に浸漬して軟化させ、次に穀粒をセルラーゼ酵素と共に製粉することを含む、穀粒、特にトウモロコシを製粉する方法を開示する。

0008

国際公開第2002/000731号パンフレットは、穀粒を水に1〜12時間浸漬し、浸漬穀粒を湿式製粉して、穀粒を酸性プロテアーゼなどの1つ又は複数の酵素で処理することを含む、作物穀粒を処理する方法を開示する。

0009

国際公開第2002/000911号パンフレットは、製粉デンプンを酸性プロテアーゼに曝すことを含む、デンプングルテンを分離する方法を開示する。

0010

国際公開第2002/002644号パンフレットは、デンプンスラリーを酸性プロテアーゼの有効量を含む水溶液で洗浄することを含む、製粉工程のデンプンとグルテンの分離ステップから得られたデンプンスラリーを洗浄する方法を開示する。

0011

国際公開第2014/082566号パンフレット及び国際公開第2014/082564号パンフレットは、湿式製粉で使用するためのセルロース分解性組成物を開示する。

発明が解決しようとする課題

0012

当該技術分野では、トウモロコシの湿式製粉において、トウモロコシ穀粒の浸漬(steeping)/浸漬(soaking)中、トウモロコシ穀粒の粉砕中、及びデンプンとグルテンの分離中に酵素を使用することの効果が研究されているが、トウモロコシ湿式製粉に関連するエネルギー消費量とコストを低下させ、デンプン及びグルテンの収率増大を与えてもよい、改善された酵素技術に対する必要性がなおもある。

課題を解決するための手段

0013

第1の態様では、本発明は、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分と、有効量の1つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物とを混合するステップを含む、湿潤製粉工程におけるトウモロコシ穀粒から得られ得る総デンプン収量及び/又はグルテン収量を改善する方法に関し、前記加水分解酵素の少なくとも1つは、GH30ポリペプチド、GH5ポリペプチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

0014

第2の態様では、本発明は、単離されたGH30ポリペプチド、単離されたGH5ポリペプチド、又はその双方を含む酵素組成物、並びに湿式製粉工程でトウモロコシ穀粒から得られ得る総デンプン収量及び/又はグルテン収量を改善するためのこのような酵素組成物の使用に関する。

0015

第3の態様では、本発明は、コーンスターチ、コーングルテン又はトウモロコシ繊維を含む組成物に関し、前記組成物は、本発明の第1の態様及び実施形態に記載される方法によって得られる。

0016

その他の態様では、本発明は、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドと、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとに関する。

0017

第4の態様では、本発明は、
(a)配列番号10又は12の成熟ポリペプチドと、少なくとも80%の配列同一性を有する、ポリペプチド;
(b)配列番号9又は配列番号11成熟ポリペプチドのコード配列と、少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド;
(c)1つ又は複数の位置における置換欠失、及び/又は挿入を含む、配列番号10又は12の成熟ポリペプチドの変異型;及び
(d)キシラナーゼ活性を有する、(a)、(b)、又は(c)のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、キシラナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。

0018

第5の態様では、本発明は、本発明の第4の態様に記載のポリペプチドを含む組成物に関する。

0019

本発明はまた、発現宿主でポリペプチドの産生を指示する、1つ又は複数の制御配列作動可能に連結された本発明の第4の態様のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクト又は発現ベクターにも関する。

0020

本発明、特に本発明による好ましい実施形態を添付の図面を参照して、より詳細に説明する。図面は本発明を具現化する方法を示し、添付の特許請求の範囲内に含まれるその他の可能な実施形態を限定するものとして解釈されるべきではない。

図面の簡単な説明

0021

本発明による向流繊維洗浄システムの第1の実施形態を概略的に示す。
本発明によるシステムのさらなる実施形態を概略的に示す。
内蔵インキュベーターを有する篩ユニットを概略的に示す。
液体サイクロンの形態の篩ユニットを概略的に示す。

0022

本発明の目的は、好ましくは繊維洗浄手順中にトウモロコシ穀粒を加水分解酵素組成物で処理することによって、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒から得られ得るデンプン及び/又はグルテン収量を改善する方法を提供することである。本発明者らは、驚くことに、GH5ポリペプチド又はGH30ポリペプチド又はそれらの組み合わせによるトウモロコシ穀粒の酵素処理が、繊維からの結合デンプン及びグルテンの放出を改善し、したがって得られ得るデンプン及び/又はグルテン収量を改善することを発見した。

0023

湿式製粉工程:
トウモロコシ穀粒は、穀粒を割って、穀粒をその4つの主要成分であるデンプン、胚芽、繊維、及びグルテンに分離するために、湿式製粉される。

0024

湿式製粉工程は、製粉機毎に顕著に変動し得るが、従来の湿式製粉は通常以下のステップを含む。
1.浸漬及び胚芽分離、
2.繊維洗浄手順、
3.デンプン/グルテン分離、及び
4.デンプン洗浄。

0025

1.浸漬、粉砕、及び胚芽分離
約50℃、例えば、約45℃〜60℃の温度で、約30分間〜約48時間、好ましくは30分間〜約15時間、例えば、約1時間〜約6時間にわたり、水に浸漬することによってトウモロコシ穀粒を軟化させる。浸漬中に穀粒は水分を吸収し、水分レベルが15パーセントから45パーセントに増加してサイズは2倍を超える。例えば、0.1パーセント二酸化硫黄(SO2)及び/又はNaHSO3を水に任意に添加することは、温かい環境内における過剰な細菌増殖を防ぐ。トウモロコシが膨潤して軟化するにつれて、浸漬水弱酸性がトウモロコシ中のグルテン結合を緩め始め、デンプンを放出する。トウモロコシ穀粒が浸漬された後、それらは挽き割られて胚芽が放出される。胚芽はコーンオイルを含有する。胚芽は、厳密に制御された条件下で、その他の物質を含まない胚芽部分を本質的に「浮遊させる」ことによって、デンプン、グルテン、及び繊維のより高密度の混合物から分離される。この方法は、後時の加工ステップにおける微量のコーンオイルの悪影響を排除するのに役立つ。

0026

2.繊維洗浄手順
最終製品中の繊維を最小限に抑えながら、最大のデンプン及びグルテンの回収率を得るためには、加工中に遊離デンプン及びグルテンを繊維から洗い流す必要がある。繊維は収集されてスラリー化され、スクリーニングされて、あらゆる残留デンプン又はグルテンが回収される。

0027

3.デンプングルテン分離
製粉デンプンと称される、繊維洗浄ステップからのデンプン−グルテン懸濁液は、デンプン及びグルテンに分離される。グルテンは、デンプンと比較して密度が低い。製粉デンプンを遠心分離機に通過させることによって、グルテンは容易に遠心脱水される、

0028

4.デンプン洗浄
デンプン分離ステップからのデンプンスラリーは、いくらか不溶性タンパク質及び多くの可溶性物質を含む。最高品質のデンプン(高純度デンプン)を製造する前に、それらを除去する必要がある。わずか1又は2パーセントのタンパク質が残留するデンプンは、ヒドロクローン(hydroclones)内で希釈され、8〜14回浄洗され、再希釈され、再洗浄されて、最後の微量のタンパク質が除去され、典型的に純度99.5%を超える高品質デンプンが製造される。

0029

湿式製粉の製品:湿式製粉を使用して、限定されるものではないが、コーンスティープリカー、コーングルテンフィード、胚芽、コーンオイル、コーングルテンミール、コーンスターチ、改質コーンスターチ、コーンシロップなどのシロップ、及びコーンエタノールが製造され得る。

0030

酵素の定義:
セルロース分解酵素又はセルラーゼセルラーゼ活性又はセルロース分解活性があるポリペプチド:「セルロース分解酵素」、「セルラーゼ」、及びセルラーゼ活性又はセルロース分解活性があるポリペプチドという用語は、本明細書で同義的に使用され、繊維などのセルロースを含む任意の材料を含むセルロース系材料加水分解する、1つ又は複数の(例えば、いくつかの)酵素を指す。セルロース分解酵素としては、エンドグルカナーゼ(E.C3.2.1.4)、セロビオヒドロラーゼ(E.C3.2.1.91及びE.C3.2.1.150)、β−グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.21)、又はそれらの組み合わせが挙げられる。セルロース分解酵素活性を測定するための2つの基本的なアプローチとしては、以下が挙げられる:(1)総セルロース分解酵素活性を測定する、及び(2)Zhang et al.,2006,Biotechnology Advances 24:452−481で概説されるように、個々のセルロース分解酵素活性(エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼ)を測定する。総セルロース分解酵素活性は、ワットマン#1濾紙微結晶セルロース細菌セルロース藻類セルロース、綿、前処理リグノセルロースなどの不溶性基質を使用して測定され得る。最も一般的な総セルロース分解活性アッセイは、ワットマン#1濾紙を基質として使用する濾紙アッセイである。アッセイは、国際純正応用化学連合(IUPAC)によって確立された(Ghose,1987,Pure Appl.Chem.59:257−68)。

0031

セルロース分解性酵素活性はまた、以下の条件下における、セルロース分解性酵素によるセルロース系材料の加水分解中の糖生成/放出の増加を測定することによって判定され得る:1〜50mgのセルロース分解性酵素タンパク質/前処理トウモロコシ茎葉PCS)(又はその他の前処理セルロース系材料)中のセルロースg、40℃〜80℃、例えば、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、又は80℃などの適切な温度で3〜7日間、及び4〜9、例えば、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、又は9.0などの適切なpH、セルロース分解性酵素タンパク質の添加なしの対照加水分解との比較。典型的な条件は、1mlの反応物、洗浄又は未洗浄PCS、5%不溶性固体乾燥重量)、50mM酢酸ナトリウム5、pH5、1mMのMnSO4、50℃、55℃、又は60℃で72時間、AMINEX(登録商標)HPX−87Hカラムクロマトグラフィー(Bio−Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)による糖分析である。

0032

加水分解酵素又はヒドロラーゼ加水分解酵素活性があるポリペプチド:「加水分解酵素」及び加水分解酵素活性があるポリペプチドは、本明細書で同義的に使用され、水を使用して基質を分解する任意の触媒タンパク質を指す。加水分解酵素としては、セルラーゼ(EC3.2.1.4)、キシラナーゼ(EC3.2.1.8)アラビノフラノシダーゼ(EC3.2.1.55(非還元末端α−L−アラビノフラノシダーゼ);EC3.2.1.185(非還元末端β−L−アラビノフラノシダーゼ)セロビオヒドロラーゼI(EC3.2.1.150)、セロビオヒドロラーゼII(E.C.3.2.1.91)、セロビオシダーゼ(E.C.3.2.1.176)、β−グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.21)、β−キシロシダーゼ(EC3.2.1.37)が挙げられる。

0033

キシラナーゼ/キシラナーゼ活性があるポリペプチド:「キシラナーゼ」及びキシラナーゼ活性があるポリペプチドという用語は、本明細書で同義的に使用され、キシランの1,4−β−D−キシロシド結合のエンド加水分解を触媒する、1,4−β−D−キシラン−キシロヒドロラーゼ(E.C.3.2.1.8)を指す。キシラナーゼ活性は、0.01%トリトン(登録商標)X−100及び200mMリン酸ナトリウム、pH6、37℃中で、0.2%AZCL−アラビノキシランを基質として使用して測定され得る。キシラナーゼ活性の1単位は、pH6の200mMリン酸ナトリウム中で、基質としての0.2%AZCL−アラビノキシランから、37℃及びpH6で毎分1.0μモルアズリンを生成する、キシラナーゼ活性の量として定義される。

0034

その他の定義:
文脈では、用語は当業者に普通であるように使用される。これらの用語のいくつかを以下で説明する。

0035

接触時間:1つ又は複数の酵素が基質と反応するためには、1つ又は複数の酵素が基質と接触していなければならない。「接触時間」とは、1つ又は複数の酵素の有効量が、基質塊の少なくとも一部と接触している時間を指す。酵素は、接触時間中に全ての基質塊と接触していなくてもよいが、1つ又は複数の酵素を基質塊と混合することで、接触時間中に基質塊の一部が酵素触媒加水分解されるようにする。

0036

トウモロコシ穀粒:例えば、デントコーンフリントコーンポッドコーン、ストライプメイズ、甘味種トウモロコシ、ワキシーコーンなどをはじめとする、様々なトウモロコシ穀粒が知られている。いくつかのトウモロコシ穀粒は、穀粒中の胚芽を保護する「果皮」と称される外被を有する。それは水と水蒸気抵抗し、昆虫及び微生物にとって望ましくない。「果皮」によって被覆されていない穀粒の唯一の領域は「先端キャップ」であり、これは穀粒の穂軸への付着点である。

0037

トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分:この用語は、湿式製粉工程を通じてトウモロコシ穀粒を記述するために使用される。トウモロコシ穀粒が分解され処理される際にこの用語が使用される場合、トウモロコシ穀粒の全ての分画された部分が包含されると見なされる。この用語には、例えば、浸漬穀粒、粉砕穀粒、トウモロコシ穀粒塊、トウモロコシ穀粒塊の第1の画分、第2の画分、1つ又は複数の画分などが含まれる。

0038

トウモロコシ穀粒塊:好ましくは、繊維、グルテン、及びデンプンを含む塊に言及するために使用され、好ましくは、作物穀粒を蒸煮及び粉砕し、繊維、グルテン及びデンプンを含む塊を胚芽から分離することによって得られる。トウモロコシ穀粒塊が繊維洗浄を通過するにつれて、それは第1の画分(s)及び第2の画分(f)などのいくつかの画分に分離される。したがって、「トウモロコシ穀粒塊の画分」及び「トウモロコシ穀粒塊の1つ又は複数の画分」は、とりわけこれらの第1(s)及び第2の画分(f)を指す。

0039

cDNA」という用語は、真核細胞又は原核細胞から得られる成熟スプライスされたmRNA分子からの逆転写によって調製され得る、DNA分子を意味する。cDNAは、対応するゲノムDNA中に存在してもよい、イントロン配列欠く。最初の一次RNA転写物はmRNAの前駆体であり、それはスプライシングをはじめとする一連のステップを経てプロセッシングされ、成熟しスプライスされたmRNAとして出現する。

0040

コード配列:「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接特定する、ポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は一般に、ATG、GTG、又はTTGなどの開始コドンで始まり、TAA、TAG、又はTGAなどの停止コドンで終わる、開いた読み枠によって決定される。コード配列は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、又はそれらの組み合わせであってもよい。

0041

制御配列:「制御配列」という用語は、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにとって、天然(すなわち、同一遺伝子由来する)又は外来性(すなわち、異なる遺伝子に由来する)であってもよく、又は互いに天然又は外来性であってもよい。このような制御配列としては、リーダーポリアデニル化配列プロペプチド配列プロモーターシグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。少なくとも、制御配列には、プロモーター、転写及び翻訳停止シグナルが含まれる。制御配列は、制御配列と、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域とのライゲーションを促進する、特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。

0042

発現:「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳翻訳後修飾、及び分泌をはじめとするが、これに限定されるものではない、ポリペプチドの産生に関与するあらゆるステップを含む。

0043

発現ベクター:「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、その発現を提供する制御配列に作動可能に連結された、線状又は環状DNA分子を意味する。

0044

断片:「断片」という用語は、成熟ポリペプチドのアミノ及び/又はカルボキシル末端に存在しない、1つ又は複数の(例えば、いくつかの)アミノ酸を有するポリペプチドを意味し、断片はペクチンリアーゼ活性を有する。

0045

胚芽:「胚芽」はトウモロコシ穀粒の唯一の生きている部分である。それは、穀粒がトウモロコシ植物成長するのに不可欠な遺伝情報、酵素、ビタミン、及びミネラルを含有する。黄色デントコーンでは、胚芽の約25パーセントがコーンオイルである。胚芽に被覆され又は取り囲まれている内胚乳は、穀粒乾燥重量の約82%を構成し、発芽種子エネルギー源(デンプン)及びタンパク質源である。内胚乳には、軟質及び硬質の2種類がある。硬質内胚乳では、デンプンはしっかりと詰まっている。軟質内胚乳では、デンプンはほぐれている。

0046

GH5ポリペプチド:酵素活性があるポリペプチドを指し、ポリペプチドは、炭水化物活性酵素(Carbohydrate−Active enZYmes)(CAZymes)のデータベース(http://www.cazy.org/)中で、グリコシドヒドロラーゼファミリー5のメンバーとして分類されている。

0047

GH30ポリペプチドは、酵素活性を有するポリペプチドを指し、ポリペプチドは炭水化物活性酵素(CAZymes)データベース(http://www.cazy.org/)において、グリコシドヒドロラーゼファミリー30のメンバーとして分類される。

0048

グルテン:グルテンは、2つの小型タンパク質であるグルテニングリアジンから構成されるタンパク質である。本明細書において「グルテン」とは、トウモロコシ穀粒に見られるタンパク質の大部分を指す。トウモロコシ湿式製粉からのグルテンの主な製品は、コーングルテンミール(約60%のタンパク質)とコーングルテンフィード(約20%のタンパク質)である。

0049

粉砕する又は粉砕:「粉砕」という用語は、トウモロコシ穀粒をより小さな成分に破壊することを指す。

0050

宿主細胞:「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターを用いた、形質転換形質移入形質導入などを受け易い、任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の子孫を包含する。

0051

単離された:「単離された」という用語は、天然には存在しない形態又は環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的例としては、(1)任意の非天然物質、(2)それが天然に結合している1つ又は複数の又は全ての天然に存在する構成物から少なくとも部分的に除去された、任意の酵素、変異型、核酸、タンパク質、ペプチド又は補因子をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の物質;(3)天然に見られる物質と比較して、人の手によって修飾された任意の物質;又は(4)それが天然に結合しているその他の構成要素と比較して、物質の量を増やすことによって修飾された任意の物質(例えば、宿主細胞内の組換え生産;物質をコードする遺伝子の複数のコピー;及び物質をコードする遺伝子と天然に結合しているプロモーターよりも、強力なプロモーターの使用)が挙げられる。

0052

インキュベーション時間:トウモロコシ穀粒塊の1つ又は複数の画分が、篩掛けされることなく、繊維洗浄中に加水分解酵素と接触する時間。

0053

多くの好ましい実施形態では、本発明による方法は、空間(V)又は「インキュベーター」を含むシステムを利用し、その内部では、材料は酵素によって「影響を受けるまま」であり、このような状況では、インキュベーション時間は、



によって決定されてもよい。代案としては、インキュベーターへの流入が単位時間当たりの容積で表されるならば:

0054

成熟ポリペプチド:「成熟ポリペプチド」という用語は、翻訳に続く、そしてN末端プロセシングC末端切断、グリコシル化リン酸化などの任意の翻訳後修飾に続く、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。一態様では、成熟ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸1〜20がシグナルペプチドであると予測するコンピュータプログラムSignalP(Nielsen et al.,1997,Protein Engineering 10:1−6)に基づく、配列番号2のアミノ酸21〜678である。宿主細胞が、同一ポリヌクレオチドによって発現される、2つ以上の異なる成熟ポリペプチド(すなわち、異なるC末端及び/又はN末端アミノ酸がある)の混合物を産生してもよいことは、当該技術分野で公知である。異なる宿主細胞が異なる方法でポリペプチドをプロセッシングし、したがって、ポリヌクレオチドを発現する1つの宿主細胞が、同一ポリヌクレオチドを発現する別の宿主細胞と比較して、異なる成熟ポリペプチド(例えば、異なるC末端及び/又はN末端アミノ酸を有する)を産生してもよいこともまた、当該技術分野で公知である。

0055

成熟ポリペプチドコード配列:「成熟ポリペプチドコード配列」という用語は、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

0056

製粉装置:「製粉装置」は、製粉で使用される全ての装置を指す。湿式製粉工程は、利用可能な製粉装置に応じて変化する。製粉装置の例は、浸漬タンク蒸発器スクリュープレス回転乾燥機脱水篩、遠心分離機、液体サイクロンなどであり得る。各製粉装置/製粉ラインのサイズ及び数は、製粉機によって変動し得て、それは製粉工程に影響を及ぼすであろう。例えば、繊維洗浄篩ユニットの数は変動し得て、遠心分離機のサイズについても同様である。

0057

核酸コンストラクト:「核酸コンストラクト」という用語は、1つ又は複数の制御配列を含み、天然に存在する遺伝子から単離されるか、そうでなければ天然には存在せず又は合成である、核酸のセグメントを含むように修飾された、一本鎖又は二本鎖のどちらかである核酸分子を意味する。

0058

作動可能に連結された:「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がコード配列の発現を指示するように、制御配列がポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に配置された形状を意味する。

0059

保持時間:1つ又は複数の加水分解酵素とトウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分が、繊維洗浄手順中に反応させられる時間。

0060

いくつかの実施形態では、滞留時間は、第1の篩ユニット(S1)に受け入れられたトウモロコシ穀粒塊及びその1つ又は複数の画分が、繊維洗浄システムを再び出る前に、1つ又は複数の加水分解酵素の有効量と接触する時間である。滞留時間中に、トウモロコシ穀粒塊の1つ又は複数の画分は、最上流篩ユニット(S1)からの第1の画分(s1)の一部として、又は最下流篩ユニット(S4)からの第2の画分(f4)の一部として繊維洗浄システムを出る前に、空間(V)内で1つ又は複数の加水分解酵素と共にインキュベートされる。

0061

保持時間は、本発明に関連して定義されるように、好ましくは、固形物が繊維洗浄システム中で費やす平均時間として推定されてもよい。これは以下の関係によって推定されてもよい:



代案としては、システムへの流入が単位時間当たりの容積で表されるならば:



システムの容積は典型的に、システム内の全ての空隙の容積の合計に等しく設定される;しかし、システム内の管材料は典型的には小さく作られるので、管の容積を棄却することが好ましくあってもよい。

0062

篩掛け:「篩掛け」又は「篩掛けする」という用語は、トウモロコシ穀粒塊を第1の画分s及び第2の画分fに分離する工程、及び1つの篩ユニットから別のユニットへのこれらの画分の移動を指す。非篩掛け時間は、トウモロコシ穀粒塊又はその画分と酵素とのインキュベーションのために提供される、非分離時間である。

0063

配列同一性:2つのアミノ酸配列間又は2つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって記述される。

0064

本発明の目的で、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443−453)を用いて、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276−277)で実装されているように、好ましくはバージョン3.0.0以降で判定される。バージョン6.1.0が用いられた。

0065

使用されるオプションのパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップ伸長ペナルティ、及びEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされた(−nobriefオプションを使用して取得された)Needleの出力が同一性百分率として使用され、以下のように計算される:(同一残基×100)/(アラインメント長さ−アラインメント中のギャップ総数)。

0066

デンプン:「デンプン」という用語は、アミロース及びアミロペクチンからなる、貯蔵顆粒の形態で植物組織中に広く存在するグルコース単位からなる、植物の複合多糖類からなる任意の材料を意味し、(C6H10O5)nとして表され、式中、nは任意の数値である。

0067

浸漬(steeping)又は浸漬(soaking):「浸漬」という用語は、穀粒を水及び任意選択的にSO2に浸漬することを意味する。

0068

発明の説明:本発明の一態様は、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分と、有効量の1つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物とを混合するステップを含む、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒から得られ得る総デンプン収量及び/又はグルテン収量を改善する方法を提供することであり、前記加水分解酵素の少なくとも1つは、GH30ポリペプチド、GH5ポリペプチド又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

0069

トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分中のデンプン及び/又はグルテンの一部は、繊維画分に結合し、湿式製粉工程中には決して放出されなくてもよい。しかし、トウモロコシ穀粒に存在する基質を水を使用して分解し得る任意の触媒タンパク質が含まれてもよい加水分解酵素の添加は、結合デンプン及び/又はグルテンの一部を放出させてもよく、したがって湿式製粉工程におけるデンプン及び/又はグルテンの総収量が改善される。本発明者らは、驚くことに、GH5ポリペプチド及びGH30ポリペプチドが、繊維画分中の結合デンプン及びグルテンの量を減少させるのに特に有効であることを発見した。

0070

一実施形態では、本発明の方法は、繊維洗浄手順中などの工程中に、繊維から放出されるデンプン及び/又はグルテンの量の増加をもたらす。

0071

湿式粉砕工程で用いられる特定の手順及び装置は変動し得るが、工程の主な原理は同じままである(湿式粉砕工程の説明を参照されたい)。

0072

一実施形態では、本発明の方法は、
a)トウモロコシ穀粒を水に浸漬して浸漬穀粒を製造するステップと;
b)浸漬穀粒を粉砕して、浸漬粉砕穀粒を製造するステップと;
c)浸漬粉砕穀粒から胚芽を分離して、繊維、デンプン、及びグルテンを含むトウモロコシ穀粒塊を製造するステップと;
d)得られたトウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップと
を含む。

0073

最終製品中の繊維を最小限に抑えながら、最大のデンプン及びグルテンの回収量を得るためには、加工中に遊離デンプン及びグルテンを繊維画分から洗い流す必要がある。典型的には、トウモロコシ穀粒の浸漬、粉砕、胚芽の分離(湿式粉砕工程の説明を参照されたい)後に、繊維が、収集、スラリー化、及び篩い分けされ、トウモロコシ穀粒塊中の残留デンプン又はグルテンが回収される。この工程は、本明細書で繊維洗浄手順と称される。

0074

一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分は、トウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップの前、最中、又は後に、前記1つ又は複数の加水分解酵素と混合される。

0075

一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分は、トウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップの前に、前記1つ又は複数の加水分解酵素と混合される。この実施形態によれば、トウモロコシ穀粒は、好ましくは、浸漬中に、粉砕中に、及び/又は胚芽分離中に、前記1つ又は複数の加水分解酵素と混合される。

0076

一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分は、トウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップの後に、前記1つ又は複数の加水分解酵素と混合される。

0077

好ましい実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分は、トウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップの最中に、前記1つ又は複数の加水分解酵素と混合される。

0078

一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分は、前記1つ又は複数の加水分解酵素と、少なくとも20分間、少なくとも25分間、少なくとも30分間、少なくとも35分間、少なくとも40分間、少なくとも45分間、少なくとも50分間、少なくとも55分間、少なくとも60分間、少なくとも70分間、少なくとも80分間、少なくとも90分間、少なくとも100分間、少なくとも110分間又は少なくとも120分間など、少なくとも15分間反応させられる。

0079

繊維洗浄手順で使用される特定の機器は変動し得るが、工程の主な原則は同じままである。

0080

一実施形態では、前記繊維洗浄手順は、1つ又は複数の加水分解酵素の導入のために最適化された繊維洗浄システムの使用を含み、繊維洗浄システムは、少なくとも40分間、少なくとも45分間、少なくとも50分間、少なくとも60分間、少なくとも70分間、少なくとも80分間、少なくとも90分間、少なくとも100分間、少なくとも110分間又は少なくとも120分間など、少なくとも35分間、及び40時間未満、36時間未満、30時間未満、24時間未満、20時間未満、12時間未満、10時間未満、8時間未満、6時間未満、5時間未満、4時間未満、3時間未満など、48時間未満の繊維洗浄システム中の総反応時間(保持時間)を提供するように構成された空間(V)を含む。一実施形態では、繊維洗浄システム中の総保持時間は、35分間〜24時間、35分間〜12時間、35分間〜6時間、35分間〜5時間、35分間〜4時間、35分間〜3時間、35分間〜2時間、45分間〜48時間、45分間〜24時間、45分間〜時間、45分間〜6時間、45分間〜5時間、45分間〜4時間、45分間〜3時間、45分間〜2時間1〜48時間、1〜24時間、1〜12時間、1〜6時間、1〜5時間、1〜4時間、1〜3時間、1〜2時間など、35分間〜48時間である。

0081

一実施形態では、繊維洗浄システムは、以下を含む:
向流洗浄構成で流体連結された複数の篩ユニット(S1...S4);各篩ユニットは、トウモロコシ穀粒塊と液体の流れを第1の画分(s)と第2の画分(f)の2つの画分に分離するように構成されており、前記第2の画分(f)は、重量%繊維での測定で第1の画分(s)よりも多い量を含有し;
−空間(V)がシステム内に配置され、前記第1の画分の(s)、前記第2の画分(f)、又は混合された第1及び第2の画分(s、f)、好ましくは第2の画分(f)のみを受け入れるように流体連結され、前記空間内に受け入れられた片方又は双方の画分に対してインキュベーション時間を提供するように構成されており;それによってインキュベートされた片方又は双方の画分を下流の篩ユニット(S4)に排出し、
システムは、以下のために構成されている:
−トウモロコシ穀粒塊及び液体を最上流の篩ユニット(S1)に注入し、
−最上流の篩ユニットt(S1)からの第1の画分(s1)をデンプンを含有する生成流として排出し、
プロセス水を注入し、好ましくはプロセス水を最下流の篩ユニット(S4)に注入するように配置され、
−最下流の篩ユニット(S4)から、前記第2の画分(f4)を、前記最初のトウモロコシ穀粒塊よりも少ない量のデンプン及びグルテンを含有する洗浄されたトウモロコシ穀粒塊として排出し、
−前記システムに加水分解酵素を導入する。

0082

図1は、上述のように繊維洗浄システムの実施形態を概略的に示す。図1に示されるように、繊維洗浄システムは、向流洗浄構成で流体的に接続されている複数の篩ユニットS1、S2、S3、S4を含む。流体連結は、典型的には、篩ユニット間で物質を輸送するためのパイプなどの流路を使用して、篩ユニットが連結されていることを意味する。篩ユニットS1〜S4のそれぞれは、トウモロコシ穀粒塊と液体の流れを2つの画分、すなわち第1の画分s(s1、s2、s3、s4)と第2の画分f(f1、f2、f3、f4)とに分離するように構成される。当業者は理解するであろうように、繊維洗浄システムにおいて生成される第1の画分の数は、システムに含まれる篩ユニットの数に左右される。システム内の篩ユニットの数は、好ましくは2〜8であり、このような実施形態では、第1及び第2の画分の数もまた2〜8である。篩ユニットは、典型的には、固体が別の流れ中で分離され、それによって第2の画分fは、重量%繊維での測定で第1の画分sよりも多い量を含有するように構成される。図において、表記「s」は、好ましくは繊維のない流れ(デンプンを含有する)を指し、表記「f」は、好ましくは繊維を含有する流れを指す。f及びsの指数は、流れの起源を指す。第1の画分sがいかなる繊維も含まないことが好ましいが、これは実用的設定では達成し難いことに留意されたい。

0083

システム内の流れは、下流方向と上流方向に、各篩ユニットを有し、例えば篩ユニットS3は、例えばS2の上流の篩ユニットから、例えばf2の流れを受け入れ、例えばs3の流れを例えばS2の上流篩ユニットへ送達する。同様に、篩ユニットS3は、下流篩ユニットS4から流れs4を受け入れ、流れf3を下流篩ユニットS4に送達する。

0084

図1に示されるように、典型的にはシステム内の洗浄水として使用される水であるプロセス水は、最下流の篩ユニットS4に供給され、プロセス水は典型的には繊維を含有しない水である。トウモロコシ穀粒塊は、典型的には最上流の篩ユニットS1に供給される、液体懸濁液(典型的には水中懸濁液)である。これは図1では、「製粉から」と表示される矢印によって示される。それによって、そして篩ユニット間の流体連結によって、トウモロコシ穀粒塊及びその画分fはシステムの下流に流れ、プロセス水はシステムの上流に移動する。したがって、システム内の流体構成は、トウモロコシ穀粒塊が、最上流篩ユニットS1内で大量のデンプンを含有する流体によって洗浄され、最下流篩ユニットS4内で少量のデンプンを含有する流体によって洗浄されると見なされ得る。さらに、最上流篩ユニットS1内のトウモロコシ穀粒塊は、最下流篩ユニットS4内のトウモロコシ穀粒塊の画分fよりも、多量のデンプンを含有する。

0085

上述した繊維洗浄システムを使用する1つの目的は、繊維からのデンプン除去効率を高めるために、システム中で、トウモロコシ穀粒塊又はその画分と酵素との間に、少なくとも40分間、少なくとも45分間、少なくとも50分間、少なくとも60分間、少なくとも70分間、少なくとも80分間、少なくとも90分間、少なくとも100分間、少なくとも110分間又は少なくとも120分間など、少なくとも35分間の接触時間を提供することである。繊維洗浄システム中における酵素とトウモロコシ穀粒塊又はその画分との接触時間/反応時間は、滞留時間とも称される。空間(V)内の酵素と、トウモロコシ穀粒塊又はその画分との接触時間/反応時間は、インキュベーション時間と称される。

0086

一実施形態では、繊維洗浄システムに組み込まれた前記空間(V)内のインキュベーション時間は少なくとも10分間、少なくとも15分間、少なくとも20分間、少なくとも30分間、少なくとも40分間、少なくとも45分間、少なくとも50分間、少なくとも60分間、少なくとも70分間、少なくとも80分間、少なくとも90分間、少なくとも100分間、少なくとも110分間又は少なくとも120分間など、少なくとも5分間、及び40時間未満、36時間未満、30時間未満、24時間、20時間未満、12時間未満、10時間未満、8時間未満、6時間未満、5時間未満、4時間未満、3時間未満など、48時間未満である。

0087

一実施形態では、前記空間(V)内のインキュベーション時間は、35分間〜24時間、35分間〜時間、35分間〜6時間、35分間〜5時間、35分間〜4時間、35分間〜3時間、35分間〜2時間、45分間〜48時間、45分間〜24時間、45分間〜12時間、45分間〜6時間、45分間〜5時間、45分間〜4時間、45分間〜3時間、45分間〜2時間1〜48時間、1〜24時間、1〜12時間、1〜6時間、1〜5時間、1〜4時間、1〜3時間、1〜2時間など、35分間〜48時間である。

0088

一実施形態では、前記空間(V)内のインキュベーション温度は、25〜90℃、25〜85℃、25〜80℃、25〜75℃、25〜70℃、25〜65℃、25〜60℃、25〜55℃、25〜53℃、25〜52℃、30〜90℃、30〜85℃、30〜80℃、30〜75℃、30〜70℃、30〜65℃、30〜60℃、30〜55℃、30〜53℃、30〜52℃、35〜90℃、35〜85℃、35〜80℃、35〜75℃、35〜70℃、35〜65℃、35〜60℃、35〜55℃、35〜53℃、35〜52℃、39〜90℃、39〜85℃、39〜80℃、39〜75℃、39〜70℃、39〜65℃、39〜60℃、39〜55℃、39〜53℃、39〜52℃など、25〜95℃である。

0089

最上流篩ユニットS1の下流且つ最下流篩ユニットS4の上流の位置に、酵素を添加することが有利であることが分かった;図1の実施形態では、酵素の添加は、篩ユニットS3の流体位置にあるものとして示されている(「酵素」と表示された図1の矢印によって示される。

0090

繊維洗浄システムの最適点で酵素を添加することによって、滞留時間が延長され得て、それは繊維からのデンプンの除去又は分離の効率を高めてもよい。典型的な製粉機によって提供されるよりも長い滞留時間を提供するために、空間V(図1では図示されない)がシステム内に配置され、前記第1の画分sの1つ、前記第2の画分fの1つ、又は混合された第1及び第2の画分s、f、好ましくは第2の画分fのみを受け入れるように流体連結され、空間内に受け入れられた片方又は双方の画分にインキュベーション時間を提供し;それによってインキュベートされた画分を下流篩ユニットS4に排出するように構成されてもよい。システム内に配置された別個のインキュベーターユニットを有することが好ましくあってもよい一方で、篩ユニットを連結する流路もまた、空間を提供するために使用されてもよいことに留意されたい。

0091

繊維洗浄システムが2つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第1と第2の篩ユニットとの間で、又は篩ユニット1と篩ユニット2との間に構成された空間内で行われることが好ましい。

0092

繊維洗浄システムが3つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第2の篩ユニット内で、又は篩ユニット1と篩ユニット3との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット2内で、又は篩ユニット2と3の間に構成された空間内で行われることが好ましい。

0093

繊維洗浄システムが4つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第2又は第3の篩ユニット内で、又は篩ユニット1と篩ユニット4との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット2内で、又は篩ユニット2と3の間に構成された空間内で行われることが好ましい。

0094

繊維洗浄システムが5つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第2、第3又は第4の篩ユニット内で、又は篩ユニット1と篩ユニット5との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット3内で、又は篩ユニット3と4の間に構成された空間内で行われることが好ましい。

0095

繊維洗浄システムが6つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第2、第3、第4、又は第5の篩ユニット内で、又は篩ユニット1と篩ユニット6との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット4内で、又は篩ユニット4と5の間に構成された空間内で行われることが好ましい。

0096

繊維洗浄システムが7つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第2、第3、第4、第5又は第6の篩ユニット内で、又は篩ユニット1と篩ユニット7との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット4内で、又は篩ユニット4と5の間に構成された空間内で行われることが好ましい。

0097

繊維洗浄システムが8つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第2、第3、第4、第5、第6又は第7の篩ユニット内で、又は篩ユニット1と篩ユニット8との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット5内で、又は篩ユニット5と6の間に構成された空間内で行われることが好ましい。

0098

したがって、本発明の好ましい実施形態に記載のシステムは、以下のために構成される。
−好ましくは物質を最上流篩ユニットS1に供給するシステムへの入口を含むことによって、トウモロコシ穀粒塊及び液体を最上流の篩ユニットS1に注入する;
−好ましくはシステムからの繊維のない流れを供給する最上流篩ユニットからの出口を含むことによって、デンプンを含有する生成流として、第1の画分s1を最上流篩ユニットS1から排出する;
−好ましくはプロセス水を最下流篩ユニットS4に注入するように配置されてプロセス水を注入し;プロセス水の入口が、好ましくは最下流篩ユニットS4の入口である;
−好ましくは最下流篩ユニットからの出口を含むことによって、元のトウモロコシ穀粒塊よりも少量のデンプン及びグルテンを含有する洗浄されたトウモロコシ穀粒塊として、第2の画分f4を最下流篩ユニットS4から排出する。

0099

システムはまた、システム内に加水分解酵素を導入するようにも構成され、それは、トウモロコシ穀粒塊又はその画分と1つ又は複数の加水分解酵素との接触を可能にするために、好ましい位置に配置された入口であってもよい。

0100

本発明によるシステムのさらなる実施形態を概略的に示す、図2を参照する。図1で使用されたのと同じ表記法が、図2で使用される。図2に示されるように、篩ユニットS1〜S4は、全て篩ユニットの内側に傾斜した点線で示される篩要素(篩)を含む。この傾斜した点線は、繊維を含有する画分と、好ましくはいかなる繊維も含有しない画分とを分離するように構成された装置を図示し;これは、例えば、内壁部分に配置されて篩ユニットの内部空隙画定する、バンドフィルター又はフィルター全般によって提供され得る。

0101

図2に示される実施形態では、混合されるべき様々な画分は、篩ユニットS1〜S4の外側で混合されるように示されている。しかし、それらは篩ユニット内で混合されてもよい。

0102

これもまた図2に示されるように、空間Vは篩ユニットS3に流体連結された別個の容器であり、それによって篩ユニットS3は、空間V内で繊維及び酵素を含む流体がインキュベーション時間を経た後に、繊維及び酵素を含む流体を受け入れる。図2に概略的に示されるように、空間Vは、流体が容器の入口から出口へ直線的に流れないことを確実にするための邪魔板を有してもよく、それはショートカットを防いでインキュベーション時間を提供し得る。

0103

図2はまた、酵素が、空間Vに入る流れf2及びs4に適用されることも示す。示される実施形態では、酵素は、クランク軸によって駆動されるピストンポンプとして概略的に示される投入ポンプ10によって投入され、投入される酵素の量はクランク軸の回転によって制御される(一方向入口及び出口弁シリンダー又はシリンダーヘッドに存在するが図示されない)。

0104

したがって、本発明によるシステムは、好ましくは、加水分解酵素を前記第1の画分に(s)、及び/又は前記第2の画分に(f)、及び/又は混合された第1及び第2の画分に及び/又はシステムに供給されるプロセス水流に導入するように構成される。

0105

篩ユニットSの数は、例えば2つの流れに分離するための容積容量及び/又は他の設計目的に従って選択されてもよい。しかし、本発明によるシステムは、一般に、最上流篩ユニット、最下流篩ユニット、及び好ましくは最上流篩ユニットと最下流篩ユニットとの間に流体配置された1つ又は複数の中間篩ユニットを有するであろう。すなわち、図1及び2を参照すると、好ましいシステムは、最上流篩ユニットS1及び最下流篩ユニットS4と、それらの間に配置されたいくつか(例えば2個)の篩ユニットを含み、間に配置されたとは、図1及び2に示されるように流体連結されていることを指す。

0106

詳細には、図1及び図2に開示されるような流体連結向流洗浄構成は、典型的には、上流篩ユニットS1によって生成される第2の画分f1が、下流篩ユニットS3によって生成される第1の画分s3と混合され、前記混合された画分が、前記上流及び前記下流篩ユニットS1、S3の中間にある篩ユニットS2によって第1の画分s2と第2の画分f2とに分離されるように配置された、複数の篩ユニットS1…S4を含む。

0107

本開示は、篩ユニットS3を参照してなされている一方で、篩S2などの任意の中間篩ユニット又はその他の中間篩ユニットにも同じ説明が当てはまり、中間篩ユニットは、最上流篩ユニットの下流且つ最下流の篩ユニットの上流に配置された、篩ユニットを指す。

0108

図2に示されるように、いくつかの実施形態では、第2の画分f1と第1の画分s3との混合は、中間篩ユニットS2へ注入される前に行われることが好ましい。このような混合は、典型的には流体の激しい撹拌を提供する撹拌手段を含む混合チャンバーに、2つの画分を注入することによって提供されてもよく、又は混合は、それぞれの流れのための入口と、混合された流れのための出口とを有するマニホルドによって提供されてもよい。

0109

篩ユニットへの注入前の混合の代案として、第2の画分f1及び第1の画分3との混合は、中間篩ユニットS2の内部で行われてもよい。これは、例えば、篩ユニットの内部に、典型的には篩ユニット内の流体を激しく撹拌する撹拌手段を装着することによって、達成されてもよい。

0110

図1及び2で開示される実施形態は、2つを超える篩ユニットを含むように示されているが、システムは、わずか2つの篩ユニットで完全に動作可能であると考えられる。したがって、典型的には、図1又は2に示されるように配置された、2〜8個の篩ユニットを含むシステムが好ましい。

0111

さらに、空間の寸法(m3)は、好ましくは、少なくとも10分間、少なくとも15分間、少なくとも20分間、少なくとも25分間、少なくとも30分間、少なくとも35分間、少なくとも40分間、少なくとも45分間、少なくとも50分間、少なくとも55分間、少なくとも60分間、少なくとも70分間、少なくとも80分間、少なくとも90分間、少なくとも100分間、少なくとも110分間、少なくとも120分間などの少なくとも少なくとも5分間のインキュベーション時間を提供するように構成される。インキュベーションのために指定された空間(V)は、好ましくは少なくとも30m3、少なくとも40m3、少なくとも50m3、少なくとも60m3、少なくとも70、m3、少なくとも80、m3、少なくとも90、m3、少なくとも100m3、少なくとも110m3、少なくとも120m3、少なくとも130m3、少なくとも140m3、少なくとも150m3、少なくとも160m3、少なくとも170m3、少なくとも180m3、少なくとも190m3、少なくとも200m3、少なくとも210m3、少なくとも220m3、少なくとも230m3、少なくとも240m3、少なくとも250m3、少なくとも260m3、少なくとも270m3、少なくとも280m3、少なくとも290m3、少なくとも300m3、少なくとも400m3、又は少なくとも500m3の体積を有する。インキュベーション時間はまた、総容積又は合わせた容積が、少なくとも100m3、少なくとも110m3、少なくとも120m3、少なくとも130m3、少なくとも140m3、少なくとも150m3、少なくとも160m3、少なくとも170m3、少なくとも180m3、少なくとも190m3、少なくとも200m3、少なくとも210m3、少なくとも220m3、少なくとも230m3、少なくとも240m3、少なくとも250m3、少なくとも260m3、少なくとも270m3、少なくとも280m3、少なくとも290m3、少なくとも300m3、少なくとも400m3、少なくとも500m3である2つ以上の空間Vにあってもよい。

0112

インキュベーション時間中、空間Vに受け入れられた流体は、篩掛けされないことが好ましい。したがって、空間Vを出る流体は、空間Vに受け入れられる流体と、例えばデンプン及び繊維の同一組成を有するが、好ましくは繊維から放出されたより高い比率のデンプンを含有する。

0113

酵素と繊維間の密着を確実にするために、ローター又はインペラを含むことなどによって、前記空間Vに含有される物質の撹拌のために空間Vを構成することが好ましくあってもよい。

0114

図2に示されるように、空間Vが最上流篩ユニットS1の下流且つ前記最下流篩ユニットS4の上流に配置されることが好ましく;特に、図2の実施形態は、空間Vが最下流から2番目の篩ユニットS3に流体を供給するように配置されることを示す。

0115

本明細書で開示されるように、空間は、様々な様式で提供されてもよく、図2に示されるように、空間Vは、好ましくは別個のインキュベーターユニットとして提供されてもよい。インキュベーターユニットは、第1の画分s、第2の画分f、又は第1及び第2の画分の組み合わせs、f、好ましくは第2の画分fのみを受け入れ、それによってインキュベートされた材料を下流篩ユニットS3に送り出す、適切な流体ラインによって構成されてもよい。

0116

内蔵インキュベーター/空間Vを有する篩ユニットを概略的に示す、図3を参照する。図示されるように、篩ユニット/インキュベーターは下端に篩要素14を含み、その上に空間Vがある。空間内には、(図3の開示された実施形態では分画f1及びs3を受け入れる)上端部から、篩要素14に向かう流体の流れのショートカットを回避するように、邪魔板が配置される。これもまた図示されているように、繊維を含まない流れs2が篩分けされて、繊維含有画分f2が提供される。

0117

トウモロコシ穀粒塊からデンプンを放出させるのに使用される酵素は、典型的には、酵素放出が最も効率的である温度範囲を有し、したがって空間Vなどのシステム内の選択された位置で温度を制御できることが有利であってもよい。これについては、本発明によるシステムは、好ましくは熱電対を含み、前記空間(V)内部で、好ましくは35〜70℃の範囲、例えば40〜60℃の範囲、例えば39〜53℃の範囲、例えば45〜53℃の範囲、例えば39〜48℃の範囲、例えば47℃の流体のインキュベーション温度を提供してもよい。(図2のように)空間が別個のインキュベーションユニットとして提供される実施形態では、熱電対は、インキュベーションユニットの内側に、及び/又はインキュベーションユニットの囲壁を画定するシェル上に配置されてもよい。

0118

熱電対は、好ましくは、温度を測定し、空間への/空間からの熱流束を変化させ、空間に含有される材料の温度を既定の範囲内に制御するように適応された、温調可能な加熱/冷却要素である。

0119

いくつかの好ましい実施形態では、温調可能な加熱エレメントは、電気加熱冷却素子又は液体加熱/冷却素子及び温度センサーを含む。

0120

本明細書に提示されるように、篩ユニットは2つの画分s及びfへの流体の分離を提供し、篩ユニットは典型的には機械的様式で篩掛けし、全ての篩ユニットなどの1つ又は複数の篩ユニットは、既定サイズ未満の固体を通過させるように構成された(例えば、図2では傾斜した点線で示されている)開口部を有する、1つ又は複数の篩要素を含む。規定サイズは、いくつかの設計基準に従って定義されてもよい。しかし、典型的には、いかなる繊維も開口部を通過しないことが好ましい。他方、小さな開口部はブロックされる傾向を有することもあり、多くの場合、開口部の実際のサイズは、ブロッキング側面及び篩掛け側面を考慮することによって選択され、その結果、少量の繊維が通過することもある。

0121

いくつかの好ましい実施形態では、全ての篩ユニットなどの1つ又は複数の篩ユニットは、前記2つの画分s、fを提供するように構成された、ローターブレード及び/又は篩を含む。全ての篩ユニットのような1つ又は複数の開口部によって構成された篩要素の代案は、図4に概略的に示されるような液体サイクロン16であってもよい。

0122

上で開示されるように、システムは、投入装置の手段によって、加水分解酵素を前記第1の画分sに及び/又は前記第2の画分fに及び/又は混合された第1及び第2の画分に及び/又はプロセス水に導入するように構成されており、図2を参照されたい。

0123

このような投入装置は典型的には、好ましくは酵素量とトウモロコシ穀粒塊の供給量との間の所定の特定の比率に従って、制御可能な投入量の酵素をシステムに供給するように適応されている。これを達成するために、投入装置10は、図2のピストンポンプによって示されるような定量ポンプであり得る。

0124

代案としては、投入装置は、流動バルブを通って流れる酵素の量を調節するように構成された、制御可能な流出バルブを有する重力流計量分配装置であってもよい。

0125

一実施形態では、本発明のGH5ポリペプチドはキシラナーゼ活性を有する。

0126

一実施形態では、本発明のGH30ポリペプチドはキシラナーゼ活性を有する。

0127

一実施形態では、本発明のGH5ポリペプチドは、
i.トウモロコシの湿式製粉工場からの圧搾繊維のサンプルを提供するステップと;
ii.サンプルを緩衝液(pH4、0.02Mの酢酸Na)に再懸濁し、5%の乾燥固形物を含有するスラリーを提供するステップと;
iii.乾燥固体基質1g当たり280μgの酵素タンパク質(EP)に対応する量のセルロース分解酵素と組み合わせて、乾燥固体基質1g当たり70μgの酵素タンパク質(EP)など、乾燥固体基質1g当たり35μgの酵素タンパク質(EP)に対応する量のGH5ポリペプチドをスラリーに添加するステップと;
iv.120分間にわたり絶えず振盪しながら、空気加熱インキュベーター中で40又は52℃の温度でサンプルをインキュベートするステップと;
v.処理前に氷水(5℃)中でサンプルを急速冷却するステップと;
vi.スラリーを150ミクロンの篩に移し、通過した濾液を収集するステップと;
vii.篩上に保持された繊維を圧搾し、通過した濾液を収集し、収集された濾液を第1の濾液と合わせるステップと;
viii.圧搾された繊維を200mlの水を含有するビーカーに移し、混合物を撹拌するステップと;
ix.スラリーを150ミクロンの篩に移し、通過した濾液を収集し、収集された濾液を第1の濾液と合わせるステップと;
x.篩上に保持された繊維を圧搾し、通過した濾液を収集し、収集された濾液を第1の濾液と合わせるステップと;
xi.ステップviii〜xをもう1回繰り返すステップと;
xii.150ミクロンの篩を通過した繊維から放出される溶性固形物を保持するガラスマイクロ濾紙(Whatman)を介して、合わせた濾液を真空濾過するステップと;
xiii.200mlの水を濾紙に通過させ、あらゆる痕跡量可溶物を除去するステップと;
xiv.濾紙上に保持された総不溶性固形物を乾燥させて量し、繊維乾物から放出されたデンプン及びグルテン(w/w)として報告するステップと
を含む手順において、繊維乾物の少なくとも16%、17%、18%、19%、20%21%又は少なくとも22%(w/w)などの繊維乾物の少なくとも15%(w/w)の量のデンプン及びグルテンを放出するのに十分な量のキシラナーゼ活性を有する。

0128

一実施形態では、本発明のGH5ポリペプチドは、以下の活性の1つ又は複数をさらに含む:エンド−β−1,4−グルカナーゼ/セルラーゼ(EC3.2.1.4)活性、エンド−β−1,4−キシラナーゼ(EC3.2.1.8)活性、β−グルコシダーゼ(EC3.2.1.21)活性、β−マンノシダーゼ(EC3.2.1.25)活性、β−グルコシルセラミダーゼ(EC3.2.1.45)活性、グルカンβ−1,3−グルコシダーゼ(EC3.2.1.58)活性、リケニナーゼ(EC3.2.1.73)活性、エキソ−β−1,4−グルカナーゼ/セロデキストリナーゼ(EC3.2.1.74)活性及び/又はグルカンエンド−1,6−β−グルコシダーゼ(EC3.2.1.75)活性、マンナンエンド−β−1,4−マンノシダーゼ(EC3.2.1.78)活性、セルロースβ−1,4−セロビオシダーゼ(EC3.2.1.91)活性、ステリルβ−グルコシダーゼ(EC3.2.1.104)活性、エンドグリコセラミダーゼ(EC3.2.1.123)活性、キトサナーゼ(EC3.2.1.132)活性、β−プリメベロシダーゼ(EC3.2.1.149)活性、キシログルカン−特異的エンド−β−1,4−グルカナーゼ(EC3.2.1.151)活性、エンド−β−1,6−ガラクタナーゼ(EC3.2.1.164)活性、ヘスペリジン6−O−α−L−ラムシル−β−グルコシダーゼ(EC3.2.1.168)活性、β−1,3−マンナナーゼ(EC3.2.1.−)活性及びアラビノキシラン−特異的エンド−β−1,4−キシラナーゼ(EC3.2.1.−)活性及びマンナントランスグリコシラーゼ(EC2.4.1.−)活性。

0129

一実施形態では、本発明のGH30ポリペプチドは、以下の活性の1つ又は複数をさらに含む:エンド−β−1,4−キシラナーゼ(EC3.2.1.8)活性、β−グルコシダーゼ(EC3.2.1.21)活性、β−グルクロニダーゼ(EC3.2.1.31)活性、β−キシロシダーゼ(EC3.2.1.37)活性、β−フコシダーゼ(EC3.2.1.38)活性、グルコシルセラミダーゼ(EC3.2.1.45)活性、β−1,6−グルカナーゼ(EC3.2.1.75)活性、グルクロノアラビノキシランエンド−β−1,4−キシラナーゼ(EC3.2.1.136)活性、エンド−β−1,6−ガラクタナーゼ(EC:3.2.1.164)活性、及び[還元末端]β−キシロシダーゼ(EC3.2.1.−)活性。

0130

一実施形態では、本発明のGH5ポリペプチドは、
i)配列番号1〜3、配列番号8、配列番号10又は配列番号12のいずれか1つに記載されるアミノ酸配列の成熟ポリペプチド;
ii)i)の成熟ポリペプチドと、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性などの少なくとも60%の配列同一性を有する、成熟ポリペプチド;
iii)i)及びii)の成熟ポリペプチドのいずれか1つの部分配列
からなる群から選択され、好ましくは、部分配列はキシラナーゼ活性を有する。

0131

一実施形態では、本発明のGH30ポリペプチドは、
i)配列番号4;配列番号5;配列番号6又は配列番号7に記載されるアミノ酸配列の成熟ポリペプチド;
ii)i)の成熟ポリペプチドと、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性などの少なくとも60%の配列同一性を有する、成熟ポリペプチド;
iii)i)及びii)の成熟ポリペプチドのいずれか1つの部分配列
からなる群から選択され、好ましくは、部分配列はキシラナーゼ活性を有する。

0132

「成熟ポリペプチド」という用語は、翻訳に続く、そしてN末端プロセシング、C末端切断、グリコシル化、リン酸化などの任意の翻訳後修飾に続く、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。

0133

一実施形態では、配列番号1の成熟ポリペプチドは、アミノ酸1〜655を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号1の成熟ポリペプチドは、配列番号1の28〜655アミノ酸を含む/からなる/から本質的になり、配列番号1のアミノ酸1〜27はシグナルペプチドである。別の実施形態では、配列番号1の成熟ポリペプチドは、配列番号36の1〜655アミノ酸を含む/からなる/から本質的になり、配列番号1のアミノ酸28〜35はhis−tagである。別の実施形態では、配列番号1の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号1のアミノ酸37〜655を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号1の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号1のアミノ酸40〜655を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号1の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号1のアミノ酸45〜655を含む/からなる/から本質的になる。

0134

一実施形態では、配列番号2の成熟ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸1〜555を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号2の成熟ポリペプチドは、配列番号2の7〜555アミノ酸を含む/からなる/から本質的になり、配列番号2のアミノ酸1〜6はhis−tagである。別の実施形態では、配列番号2の成熟ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸10〜555を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号2の成熟ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸15〜555を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号2の成熟ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸20〜555を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号2の成熟ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸30〜555を含む/からなる/から本質的になる。

0135

一実施形態では、配列番号3の成熟ポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸1〜585を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号3の成熟ポリペプチドは、配列番号3の28〜585アミノ酸を含む/からなる/から本質的になり、配列番号3のアミノ酸1〜27はシグナルペプチドである。別の実施形態では、配列番号3の成熟ポリペプチドは、配列番号3の36〜585アミノ酸を含む/からなる/から本質的になり、配列番号3のアミノ酸28〜35はhis−tagである。別の実施形態では、配列番号3の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号3のアミノ酸37〜585を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号3の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号3のアミノ酸40〜585を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号3の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号3のアミノ酸45〜585を含む/からなる/から本質的になる。

0136

一実施形態では、配列番号4の成熟ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸1〜391を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号4の成熟ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸5〜391を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号4の成熟ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸10〜391を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号4の成熟ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸15〜391を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号4の成熟ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸20〜391を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号4の成熟ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸30〜391を含む/からなる/から本質的になる。

0137

一実施形態では、配列番号5の成熟ポリペプチドは、配列番号5のアミノ酸1〜417を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号5の成熟ポリペプチドは、配列番号5の27〜417アミノ酸を含む/からなる/から本質的になり、配列番号5のアミノ酸1〜26はシグナルペプチドである。

0138

一実施形態では、配列番号6の成熟ポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸1〜417を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号6の成熟ポリペプチドは、配列番号6の27〜417アミノ酸を含む/からなる/から本質的になり、配列番号6のアミノ酸1〜26はシグナルペプチドである。

0139

一実施形態では、配列番号7の成熟ポリペプチドは、配列番号7のアミノ酸1〜417を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号7の成熟ポリペプチドは、配列番号7の27〜417アミノ酸を含む/からなる/から本質的になり、配列番号7のアミノ酸1〜26はシグナルペプチドである。

0140

一実施形態では、配列番号8の成熟ポリペプチドは、アミノ酸1〜557を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号8の成熟ポリペプチドは、配列番号8の8〜557アミノ酸を含む/からなる/から本質的になり、配列番号8のアミノ酸1〜7はhis−tagである。別の実施形態では、配列番号8の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号8のアミノ酸28〜557を含む/からなる/から本質的になる。

0141

一実施形態では、配列番号10の成熟ポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸1〜576を含む/からなる/から本質的になる。別の実施形態では、配列番号10の成熟ポリペプチドは、配列番号10の24〜576アミノ酸を含む/からなる/から本質的になり、配列番号10のアミノ酸1〜23はシグナルペプチドである。

0142

一実施形態では、配列番号12の成熟ポリペプチドは、配列番号12のアミノ酸1〜565を含む/からなる/から本質的になる。

0143

本発明の文脈において、「部分配列」という用語は、成熟ポリペプチドのアミノ(N−)末端及び/又はカルボキシ(C−)末端に、1つ又は複数の(例えば、いくつかの)アミノ酸残基が存在しないポリペプチドを意味し;部分配列はキシラナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、「部分配列」中に存在しないアミノ酸残基の数は、最大19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は最大でも1アミノ酸残基など、最大でも20である。

0144

いくつかの実施形態では、任意の1つの成熟ポリペプチドの部分配列は、少なくとも150アミノ酸長又は少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも400アミノ酸長又は少なくとも450アミノ酸長又は少なくとも500アミノ酸長又は少なくとも550アミノ酸長又は少なくとも600アミノ酸長又は少なくとも650アミノ酸長であってもよい。

0145

一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号1の部分配列は、少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも400アミノ酸長又は少なくとも450アミノ酸長又は少なくとも500アミノ酸長又は少なくとも550アミノ酸長又は少なくとも600アミノ酸長又は少なくとも650アミノ酸長であってもよい。

0146

一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号2の部分配列は、少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも400アミノ酸長又は少なくとも450アミノ酸長又は少なくとも500アミノ酸長又は少なくとも550アミノ酸長であってもよい。

0147

一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号3の部分配列は、少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも400アミノ酸長又は少なくとも450アミノ酸長又は少なくとも500アミノ酸長又は少なくとも550アミノ酸長又は少なくとも560アミノ酸長又は少なくとも570アミノ酸長又は少なくとも580アミノ酸長であってもよい。

0148

一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号4の部分配列は、少なくとも150アミノ酸長又は少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも360アミノ酸長又は少なくとも370アミノ酸長又は少なくとも380アミノ酸長又は少なくとも390アミノ酸長であってもよい。

0149

一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号5の部分配列は、少なくとも150アミノ酸長又は少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも360アミノ酸長又は少なくとも370アミノ酸長又は少なくとも380アミノ酸長又は少なくとも390アミノ酸長であってもよい。

0150

一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号6の部分配列は、少なくとも150アミノ酸長又は少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも360アミノ酸長又は少なくとも370アミノ酸長又は少なくとも380アミノ酸長又は少なくとも390アミノ酸長であってもよい。

0151

一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号7の部分配列は、少なくとも150アミノ酸長又は少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも360アミノ酸長又は少なくとも370アミノ酸長又は少なくとも380アミノ酸長又は少なくとも390アミノ酸長であってもよい。

0152

一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号8の部分配列は、少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも400アミノ酸長又は少なくとも450アミノ酸長又は少なくとも500アミノ酸長又は少なくとも550アミノ酸長又は少なくとも600アミノ酸長又は少なくとも650アミノ酸長であってもよい。

0153

一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号10の部分配列は、少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも400アミノ酸長又は少なくとも450アミノ酸長又は少なくとも500アミノ酸長又は少なくとも550アミノ酸長又は少なくとも600アミノ酸長又は少なくとも650アミノ酸長であってもよい。

0154

一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号12の部分配列は、少なくとも200アミノ酸長又は少なくとも250アミノ酸長又は少なくとも300アミノ酸長又は少なくとも350アミノ酸長又は少なくとも400アミノ酸長又は少なくとも450アミノ酸長又は少なくとも500アミノ酸長又は少なくとも550アミノ酸長又は少なくとも600アミノ酸長又は少なくとも650アミノ酸長であってもよい。

0155

一実施形態では、酵素組成物は、セルラーゼ(EC3.2.1.4)、キシラナーゼ(EC3.2.1.8)、アラビノフラノシダーゼ(EC3.2.1.55(非還元末端α−L−アラビノフラノシダーゼ);EC3.2.1.185(非還元末端β−L−アラビノフラノシダーゼ)セロビオヒドロラーゼI(EC3.2.1.150)、セロビオヒドロラーゼII(E.C.3.2.1.91)、セロビオシダーゼ(E.C.3.2.1.176)、β−グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.21)、β−キシロシダーゼ(EC3.2.1.37)又はプロテアーゼ(E.C3.4)からなる群から選択される1つ又は複数の酵素をさらに含む、1つ又は複数の加水分解酵素を含む。

0156

一実施形態では、加水分解酵素の1つ又は複数は、トリコデルマリーゼイ(Trichoderma reesei)などのセルラーゼバックグラウンドを有する生物において発現される。これらの実施形態によれば、本発明により定義されるGH5及び/又はGH30ポリペプチドは、トリコデルマ属(Trichoderma)からの内因性セルラーゼと共に発現される。

0157

一実施形態では、1つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物は、精製又は半精製形態で酵素組成物に添加される、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)で発現されるセルラーゼ、及びその他の加水分解酵素を含んでもよい。

0158

一実施形態では、1つ又は複数の加水分解酵素は精製される。精製された酵素は、本発明のその他の実施形態に記載される酵素組成物で使用されてもよい。

0159

一実施形態では、1つ又は複数の加水分解酵素は、液体組成物である。組成物は、同種又は異種であってもよい。

0160

一実施形態では、1つ又は複数の加水分解酵素は、固体組成物である。

0161

一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒塊の1つ又は複数の画分と混合される1つ又は複数の加水分解酵素の有効量は、0.010〜0.5kgEP/MTトウモロコシ穀粒など、0.05〜0.5kg/MTトウモロコシ穀粒など、又は0.075〜0.5kg/MT又は0.1〜0.5kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.005〜0.4kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.01〜0.4kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.05〜0.4kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.075〜0.4kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.1〜0.4kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.005〜0.3kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.01〜0.3kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.05〜0.3kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.075〜0.3kg/MT又は0.1〜0.3kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.005〜0.2kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.010〜0.2kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.05〜0.2kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.075〜0.2kg/MT又は0.1〜0.2kg/MTトウモロコシ穀粒又は0.075〜0.10kg/MTトウモロコシ穀粒など、又は0.075〜0.11kg/MTトウモロコシ穀粒など、0.005〜0.5kgの酵素タンパク質(EP)/湿式製粉工程に入るトウモロコシ穀粒の計量トン(MT)である。

0162

少なくとも1つのGH5ポリペプチド、又は少なくとも1つのGH30ポリペプチド、又は少なくとも1つのGH5と、少なくとも1つのGH30ポリペプチドとの組み合わせを含む加水分解酵素組成物を用いた、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分の酵素処理は、当該技術分野で公知のその他の方法によって生産された製品と異なる、コーンスターチ、コーングルテン及びトウモロコシ繊維製品を提供する。

0163

一態様では、本発明は、本発明の方法によって得られるコーンスターチを含む組成物に関する。

0164

一態様では、本発明は、本発明の方法によって得られるコーングルテンを含む組成物に関する。

0165

一態様では、本発明は、本発明の方法によって得られるトウモロコシ繊維を含む組成物に関する。

0166

一態様では、本発明は、本明細書で定義される単離されたGH30ポリペプチドを含む酵素組成物に関する。

0167

一態様では、本発明は、本明細書で定義される単離されたGH5ポリペプチドを含む酵素組成物に関する。

0168

一態様では、本発明単明細書で定義される単離されたGH30ポリペプチドと、本明細書で定義される単離されたGH5ポリペプチドとを含む、酵素組成物に関する。

0169

一実施形態では、前記加水分解酵素の少なくとも1つが、GH30ポリペプチド、GH5ポリペプチド、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明による酵素組成物は、セルラーゼ(EC3.2.1.4)、キシラナーゼ(EC3.2.1.8)アラビノフラノシダーゼ(EC3.2.1.55(非還元末端α−L−アラビノフラノシダーゼ);EC3.2.1.185(非還元末端β−L−アラビノフラノシダーゼ)セロビオヒドロラーゼI(EC3.2.1.150)、セロビオヒドロラーゼII(E.C.3.2.1.91)、セロビオシダーゼ(E.C.3.2.1.176)、β−グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.21)、β−キシロシダーゼ(EC3.2.1.37)又はプロテアーゼ(E.C3.4)からなる群から選択される、1つ又は複数の酵素をさらに含む。

0170

好ましい実施形態では、酵素組成物は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)ATCC26921の培養物などのトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)の培養物から得られるセルラーゼを含む。例えば、NovozymesA/Sからの商品名Celluclast(登録商標)などの適切なセルラーゼが利用できる。

0171

本発明のさらなる態様は、トウモロコシ湿式製粉におけるGH30ポリペプチドの使用に関する。

0172

GH30ポリペプチドは、特に、本明細書で上記に定義されるポリペプチドであってもよい。好ましくは、トウモロコシ湿式粉砕は、上記で定義される湿式粉砕工程を使用して実施される。

0173

別の態様では、本発明は、トウモロコシ湿式製粉におけるGH5ポリペプチドの使用を提供する。GH5ポリペプチドは、特に、本明細書で上記に定義されるポリペプチドであってもよい。好ましくは、トウモロコシ湿式粉砕は、上記のいずれかで定義される湿式粉砕工程を使用して実施される。

0174

本発明のなおも別の態様は、トウモロコシ湿式製粉における、好ましくは上記で定義されるトウモロコシ湿式製粉工程における、上記で定義される酵素組成物の使用を提供する。

0175

好ましくは、本発明による使用に際して、GH30ポリペプチド、GH5ポリペプチド及び/又は酵素組成物は、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び/又はグルテン収量を増加させる目的で使用される。

0176

キシラナーゼ活性を有するポリペプチド
一実施形態では、本発明は、配列番号10の成熟ポリペプチドと、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有する、キシラナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。一態様では、ポリペプチドは、配列番号10の成熟ポリペプチドと、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10など、最大10個のアミノ酸が異なる。

0177

本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号10のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異型;又はキシラナーゼ活性を有するその断片を含み、又はそれからなる。別の態様では、ポリペプチドは、配列番号10の成熟ポリペプチドを含み、又はそれからなる。別の態様では、ポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸24〜576を含み、又はそれからなる。

0178

一実施形態では、本発明は、配列番号12の成熟ポリペプチドと、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有する、キシラナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。一態様では、ポリペプチドは、配列番号12の成熟ポリペプチドと、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10など、最大10個のアミノ酸が異なる。

0179

本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号12のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異型;又はキシラナーゼ活性を有するその断片を含み、又はそれからなる。別の態様では、ポリペプチドは、配列番号12の成熟ポリペプチドを含み、又はそれからなる。

0180

別の実施形態では、本発明は、配列番号9又は配列番号11の成熟ポリペプチドコード配列又はそのcDNA配列と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるペクチンリアーゼ活性を有する単離ポリペプチドに関する。

0181

別の実施形態では、本発明は、1つ又は複数の(例えば、いくつかの)位置における、置換、消去、及び/又は挿入を含む、配列番号10又は配列番号12の成熟ポリペプチドの変異型に関する。一実施形態では、配列番号10又は配列番号12の成熟ポリペプチドに導入される、アミノ酸置換、欠失及び/又は挿入の数は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10など、最大10である。アミノ酸変化は、タンパク質の折り畳み及び/又は活性に有意な影響を及ぼさない、典型的には1〜30アミノ酸の小規模な欠失;アミノ末端メチオニン残基などの小型のアミノ末端又はカルボキシル末端延長;最大20〜25残基の小型のリンカーペプチド;又は、正味電荷又はポリヒスチジントラクト抗原性エピトープ又は結合ドメインなどの別の機能を変化させることによって、精製を容易にする小規模な延長などの保存的アミノ酸置換又は挿入である、軽微性質のものであってもよい。

0182

保存的置換の例は、塩基性アミノ酸アルギニンリジン、及びヒスチジン)、酸性アミノ酸グルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸グルタミン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸ロイシンイソロイシン、及びバリン)、芳香族アミノ酸フェニルアラニントリプトファン、及びチロシン)、及び小型アミノ酸(グリシンアラニンセリンスレオニン、及びメチオニン)のグループ内にある。通常、比活性変質させないアミノ酸置換は、当該技術分野で公知であり、例えば、H.Neurath and R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New Yorkによって記載される。一般的な置換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、及びAsp/Glyである。

0183

あるいは、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの物理化学的特性が変化するような性質のものである。例えば、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの熱的安定性を改善し、基質特異性改変させ、最適pH値を変化させるなどしてもよい。

0184

ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発などの当該技術分野で公知の手順によって同定し得る(Cunningham and Wells,1989,Science 244:1081−1085)。後者の技術では、分子中の各残基に単一アラニン変異を導入し、結果として生じる変異分子をペクチンリアーゼ活性について試験して、分子活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Hilton et al.,1996,J.Biol.Chem.271:4699−4708もまた参照されたい。酵素の活性部位又はその他の生物学的相互作用はまた、推定接触部位アミノ酸の変異と併せて、核磁気共鳴結晶構造解析電子回析、又は光親和性標識などの技術による判定で、構造の物理的分析によって判定し得る。例えば、de Vos et al.,1992,Science 255:306−312;Smith et al.,1992,J.Mol.Biol.224:899−904;Wlodaver et al.,1992,FEBSLett.309:59−64を参照されたい。必須アミノ酸のアイデンティティーはまた、関連ポリペプチドのアラインメントから推論し得る。

0185

単一又は複数アミノ酸置換、欠失、及び/又は挿入を作製して、変異誘発、組換え、及び/又はシャフリングの公知の方法と、それに続く、Reidhaar−Olson and Sauer,1988,Science 241:53−57;Bowie and Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152−2156;国際公開第95/17413号パンフレット;又は国際公開第95/22625号パンフレットによって開示されるものなどの妥当なスクリーニング手順を使用して試験し得る。利用し得るその他の方法としては、誤りがちPCRファージディスプレイ(例えば、Lowman et al.,1991,Biochemistry 30:10832−10837;米国特許第5,223,409号明細書;国際公開第92/06204号パンフレット)、及び領域特異的変異誘発(Derbyshire et al.,1986,Gene 46:145;Ner et al.,1988,DNA 7:127)が挙げられる。

0186

変異誘発/シャッフリング法は、高スループット自動スクリーニング法と組み合わされて、宿主細胞によって発現されたクローン化され変異誘発されたポリペプチドの活性が検出され得る(Ness et al.,1999,NatureBiotechnology 17:893−896)。活性ポリペプチドをコードする変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、当該技術分野の標準法を使用して迅速に配列決定され得る。これらの方法は、ポリペプチドの個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な判定を可能にする。

0187

ポリペプチドは、1つのポリペプチドの領域が、別のポリペプチドの領域のN末端又はC末端で融合する、雑種ポリペプチドであってもよい。

0188

ポリペプチドは、別のポリペプチドが、本発明ポリペプチドのN末端又はC末端で融合する、融合ポリペプチド又は切断可能融合ポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることによって生成される。融合ポリペプチドを生産する技術は当該技術分野で公知であり、それらがインフレームになり、融合ポリペプチドの発現が同一プロモーター及びターミネーターの制御下になるように、ポリペプチドをコードするコード配列をライゲートすることが挙げられる。融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドが翻訳後に生成されるインテイン技術を用いて、構築されてもよい(Cooper et al.,1993,EMBO J.12:2575−2583;Dawson et al.,1994,Science 266:776−779)。

0189

融合ポリペプチドは、2つのポリペプチド間に切断部位をさらに含み得る。融合タンパク質の分泌に際して、部位が切断されて2つのポリペプチドが放出される。切断部位の例としては、Martin et al.,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568−576;Svetina et al.,2000,J.Biotechnol.76:245−251;Rasmussen−Wilson et al.,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488−3493;Ward et al.,1995,Biotechnology 13:498−503;and Contreras et al.,1991,Biotechnology 9:378−381;Eaton et al.,1986,Biochemistry 25:505−512;Collins−Racie et al.,1995,Biotechnology 13:982−987;Carter et al.,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240−248;及びStevens,2003,Drug Discovery World 4:35−48で開示される部位が挙げられるが、これに限定されるものではない。

0190

キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの供給源
本発明のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物から得られてもよい。本発明の目的のために、所与の供給源に関連して本明細書で使用される「から得られる」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、供給源によって、又は供給源由来のポリヌクレオチドが挿入された株によって、産生されることを意味するものとする。一態様では、所与の供給源から得られるポリペプチドは、細胞外に分泌される。

0191

ポリペプチドは、細菌ポリペプチドであってもよい。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドペクチンリアーゼ活性を有するバチルス属(Bacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、腸球菌属(Enterococcus)、Geobacillus、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、オセアノバシラス属(Oceanobacillus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、又はストレプトミセス属(Streptomyces)などのグラム陽性細菌ポリペプチド、又はカンピロバクター属(Campylobacter)、大腸菌(E.coli)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、フゾバクテリウム属(Fusobacterium)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、イリバクター属(Ilyobacter)、ナイセリア属(Neisseria)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、又はウレアプラスマ属(Ureaplasma)ポリペプチドなどのグラム陰性細菌ポリペプチドであってもよい。

0192

一態様では、ポリペプチドは、バチルスアルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・サークランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウシイ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・ファーマス(Bacillus firmus)、バチルス・ラウタス(Bacillus lautus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、又はバチルス・チューリンエンシス(Bacillus thuringiensis)ポリペプチドである。

0193

別の態様では、ポリペプチドは、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Streptococcus equisimilis)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ユベリス(Streptococcus uberis)、又はストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)亜株ズーエピミクス(Zooepidemicus)ポリペプチドである。

0194

別の態様では、ポリペプチドは、ストレプトミセスアクロモゲネス(Streptomyces achromogenes)、ストレプトミセス・アベルチリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)、ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、又はストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)ポリペプチドである。

0195

ポリペプチドは、真菌ポリペプチドであってもよい。例えば、ポリペプチドは、カンジダ属(Candida)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、又はヤロウィア属(Yarrowia)ポリペプチドなどの酵母ポリペプチド;又はアクレモニウム属(Acremonium)、アガリクス属(Agaricus)、アルテルナリア属(Alternaria)、アスペルギルス属(Aspergillus)、アウレオバシジウム属(Aureobasidium)、ボトリオスファエリア属(Botryospaeria)、セリポリオプシス属(Ceriporiopsis)、ケトミジウム属(Chaetomidium)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、コクリオボルス属(Cochliobolus)、ヒトヨタケ属(Coprinopsis)、イエシロアリ属(Coptotermes)、コリナスカス属(Corynascus)、クリフォクトリア属(Cryphonectria)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、ジプロディア属(Diplodia)、エクシデイア属(Exidia)、フィリバシジウム属(Filibasidium)、フザリウム属(Fusarium)、ジベレラ属(Gibberella)、ホロマスチゴトイデス属(Holomastigotoides)、フミコラ属(Humicola)、イルペックス属(Irpex)、シイタケ属(Lentinula)、レプトスパエリア属(Leptospaeria)、マグナポルテ属(Magnaporthe)、メラカルパス属(Melanocarpus)、メリピルス属(Meripilus)、ケカビ属(Mucor)、ミセリオフトラ属(Myceliophthora)、ネオカリマスティクス属(Neocallimastix)、ニューロスポラ属(Neurospora)、ペシロミセス属(Paecilomyces)、ペニシリウム属(Penicillium)、ファネロカエテ属(Phanerochaete)、ピロミセス属(Piromyces)、ポイトシア属(Poitrasia)、シュープレクタニア属(Pseudoplectania)、シュードトリニンファ属(Pseudotrichonympha),リゾムコール属(Rhizomucor)、スエヒロタケ属(Schizophyllum)、シタリジウム属(Scytalidium)、タラロミセス属(Talaromyces)、サーモアスクス属(Thermoascus)、チエラビア属(Thielavia)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)、トリコデルマ属(Trichoderma)、トリコファエア属(Trichophaea)、ベルチシリウム属(Verticillium)、フクロタケ属(Volvariella)、又はクロサイワイタケ属(Xylaria)ポリペプチドなどの糸状菌ポリペプチドであってもよい。

0196

別の態様では、ポリペプチドは、サッカロミセスカールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ジアスタティクス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミセス・ドウグラシイ(Saccharomyces douglasii)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)、又はサッカロミセス・オビフォルミス(Saccharomyces oviformis)ポリペプチドであってもよい。

0197

別の態様では、ポリペプチドは、アクレモニウムセルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)、アスペルギルス・アクレアツス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フォエティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、クリソスポリウム・イノプス(Chrysosporium inops)、クリソスポリウム・ケラチノフィルム(Chrysosporium keratinophilum)、クリソスポリウム・ラクノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、クロソスポリウム・メルダリウム(Chrysosporium merdarium)、クリソスポリウム・パンコラ(Chrysosporium pannicola)、クリソスポリウム・クィーンズランディカム(Chrysosporium queenslandicum)、クリソスポリウム・トロピカム(Chrysosporium tropicum)、クリソスポリウム・ゾナタム(Chrysosporium zonatum)、フザリウム・バクトリジオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルッウエレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモルム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンディ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レチクラツム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイデス(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、フミコラ・グリセア(Humicola grisea)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ウスバタケ(Irpex lacteus)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)、ペニシリウム・パープロゲナム(Penicillium purpurogenum)、ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、チエラビア・アクロマチカ(Thielavia achromatica)、チエラビア・アルボミセス(Thielavia albomyces)、チエラビア・アルボピロサ(Thielavia albopilosa)、チエラビア・アウストラレインシス(Thielavia australeinsis)、チエラビア・フィメチ(Thielavia fimeti)、チエラビア・ミクロスポラ(Thielavia microspora)、チエラビア・オビスポラ(Thielavia ovispora)、チエラビア・ペルビアナ(Thielavia peruviana)、チエラビア・セトサ(Thielavia setosa)、チエラビア・スペデドニウム(Thielavia spededonium)、チエラビア・サブサーモフィラ(Thielavia subthermophila)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブキアツム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、又はトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)ポリペプチドである。

0198

前述の種について、本発明は、それらがその知られている種の名称に関係なく、完全状態及び不完全状態の双方と、例えば無性世代などのその他の分類学的均等物とを包含することが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。

0199

これらの種の株は、米国微生物系統保存機関(ATCC)、ドイツ微生物細胞培養コレクション(DSMZ)、オランダ微生物株保存センター(CBS)、及び部地域研究センター(NRRL)の農業研究用特許培養株コレクションなどのいくつかの培養コレクションで一般に容易にアクセスできる。

0200

ポリペプチドは、自然界(例えば、土壌堆肥、水など)から単離された微生物をはじめとするその他の供給源から、又は前述したプローブを使用して天然材料(例えば、土壌、堆肥、水など)から直接得られたDNAサンプルから、同定され得られてもよい。微生物及びDNAを自然生息地から直接単離する技術は、当該技術分野で周知である。次にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、別の微生物又は混合されたDNAサンプルのゲノムDNA又はcDNAライブラリを同様にスクリーニングすることによって、得られてもよい。ひとたびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されると、当業者に知られている技術を利用することによって、ポリヌクレオチドが単離又はクローン化され得る(例えば、前出のSambrook et al.,1989を参照されたい)。

0201

ポリヌクレオチド
本発明はまた、本明細書に記載の本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。

0202

ポリヌクレオチドを単離又はクローン化するために使用される技術は当該技術分野で公知であり、ゲノムDNA又はcDNA、又はそれらの組み合わせからの単離が挙げられる。ゲノムDNAからのポリヌクレオチドのクローニングは、例えば、良く知られているポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又は発現ライブラリの抗体スクリーニングを使用して、共有構造的特徴があるクローン化DNA断片を検出することによって、もたらされ得る。例えば、Innis et al.,1990,PCR:A Guide to Methodsand Application,Academic Press,New Yorkを参照されたい。リガーゼ連鎖反応(LCR)、ライゲーション活性化転写(LAT)、及びポリヌクレオチドベース増幅(NASBA)などのその他の核酸増幅手順が使用されてもよい。

0203

本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似したポリペプチドを合成するために必要であってもよい。ポリペプチドに「実質的に類似」という用語は、ポリペプチドの天然に存在しない形態を指す。これらのポリペプチドは、例えば、比活性、熱安定性、最適pH値などが異なる変異型など、何らかの操作された様式で、その天然原料から単離されたポリペプチドと異なってもよい。変異型は、配列番号9又は配列番号11の成熟ポリペプチドコード配列として提示されるポリヌクレオチド、又は例えば、それらの部分配列などのそのcDNA配列に基づいて、及び/又はポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらさないが、酵素の産生が意図される宿主生物コドン使用頻度に対応するヌクレオチド置換の導入によって、又は異なるアミノ酸配列を生じてもよいヌクレオチド置換の導入によって、構築されてもよい。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、Ford et al.,1991,Protein Expression and Purification 2:95−107を参照されたい。

0204

核酸コンストラクト
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を指示する、1つ又は複数の制御配列に作動可能に連結された、本発明のポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクトにも関する。

0205

ポリヌクレオチドは様々な方法で操作されて、ポリペプチドの発現が提供されもよい。ベクターへの挿入に先だつポリヌクレオチドの操作は、発現ベクター次第で望ましくあっても又は必要であってもよい。組換えDNA法を利用してポリヌクレオチドを修飾する技術は、当技術分野で周知である。

0206

制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドである、プロモーターであってもよい。プロモーターは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、短縮型、及び雑種のプロモーターをはじめとする、宿主細胞内で転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってもよく、宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドのどちらかをコードする遺伝子から得られてもよい。

0207

糸状菌宿主細胞における本発明の核酸コンストラクトの転写を指示する適切なプロモーターの例は、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)グルコアミラーゼ(glaA)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼ(国際公開第96/00787号パンフレット)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)アミログルコシダーゼ(国際公開第00/56900号パンフレット)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)Daria(国際公開第00/56900号パンフレット)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)Quinn(国際公開第00/56900号パンフレット)、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドロラーゼI、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドロラーゼII、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼI、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼV、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼI、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼII、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)β−キシロシダーゼ、及びトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)翻訳伸長因子、並びにNA2−tpiプロモーター(未翻訳リーダーがアスペルギルス属(Aspergillus)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子からの未翻訳リーダーによって置換されている、アスペルギルス属(Aspergillus)中性α−アミラーゼ遺伝子からの修飾プロモーター;非限定的例としては、未翻訳リーダーがアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)又はアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子からの未翻訳リーダーによって置換されている、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)中性α−アミラーゼ遺伝子からの修飾プロモーターが挙げられる);及びそれらの変異体、短縮型、及び雑種プロモーターの遺伝子から得られるプロモーターである。その他のプロモーターは、米国特許第6,011,147号明細書に記載される。

0208

制御配列は、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる、転写ターミネーターであってもよい。ターミネーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの3’末端に作動可能に連結される。宿主細胞内で機能する任意のターミネーターが、本発明で使用されてもよい。

0209

糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドロラーゼI、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドロラーゼII、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼI、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼV、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼI、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼII、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)β−キシロシダーゼ、及びトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)翻訳伸長因子遺伝子から得られる。

0210

制御配列はまた、プロモーターの下流且つ遺伝子の発現を増加させる遺伝子のコード配列の上流である、mRNA安定化領域であってもよい。

0211

制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要なmRNAの非翻訳領域であるリーダーでもあってもよい。リーダーは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5’末端に作動可能に連結される。宿主細胞内で機能する任意のリーダーが、使用されてもよい。

0212

糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。

0213

制御配列はまた、ポリアデニル化配列、ポリヌクレオチドの3’末端に作動可能に連結された配列であってもよく、転写される場合は、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして、宿主細胞によって認識される。宿主細胞内で機能する任意のポリアデニル化配列が、使用されてもよい。

0214

糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)α−グルコシダーゼアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。

0215

制御配列はまた、ポリペプチドのN末端に連結するシグナルペプチドをコードしてポリペプチドを細胞の分泌経路誘導する、シグナルペプチドコード領域であってもよい。ポリヌクレオチドのコード配列の5’末端は、翻訳読み枠内でポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと天然に連結された、シグナルペプチドコード配列を本質的に含有してもよい。代案としては、コード配列の5’末端は、コード配列にとって外来性のシグナルペプチドコード配列を含有してもよい。コード配列がシグナルペプチドコード配列を天然に含まない場合、外来性シグナルペプチドコード配列が必要であってもよい。代案としては、ポリペプチドの分泌を増強するために、外来性シグナルペプチドコード配列が、天然シグナルペプチドコード配列を単純に置換してもよい。しかし、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導する、あらゆるシグナルペプチドコード配列が使用されてもよい。

0216

糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)セルラーゼ、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)エンドグルカナーゼV、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ、及びリゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。

0217

制御配列は、ポリペプチドのN末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列であってもよい。結果として得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド(又は場合によってはチモーゲン)として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的切断によって、活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード配列は、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)アルカリプロテアーゼ(aprE)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼ(nprT)、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)ラッカーゼ(国際公開第95/33836号パンフレット)、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α因子の遺伝子から得られてもよい。

0218

シグナルペプチド配列とプロペプチド配列の双方が存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのN末端の隣に位置し、シグナルペプチド配列はプロペプチド配列のN末端の隣に位置する。

0219

宿主細胞の成長に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することもまた、望ましくあってもよい。調節配列の例は、調節化合物の存在をはじめとする化学的又は物理的刺激応答して、遺伝子の発現をオン又はオフにするものである。糸状菌においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)TAKAα−アミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)グルコアミラーゼプロモーター、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドロラーゼIプロモーター、及びトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドロラーゼIIプロモーターが使用されてもよい。調節配列のその他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらの調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、及び重金属によって増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列に作動可能に連結されるであろう。

0220

発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター、転写及び翻訳停止シグナルを含む、組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチド及び制御配列が共に結合され、1つ又は複数の都合良い制限部位を含んでもよい組換え発現ベクターが生成されて、このような部位における、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換が可能になってもよい。代案としては、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを発現のための適切なベクターに挿入することによって発現されてもよい。発現ベクターを作成する際、コード配列は、コード配列が発現に適した制御配列と作動的に連結するように、ベクター内に位置する。

0221

組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に好都合に供されてポリヌクレオチドの発現をもたらし得る、任意のベクター(例えば、プラスミド又はウイルス)であってもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターがその中に導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状又は閉環状プラスミドであってもよい。

0222

ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体など、その複製が染色体の複製と無関係な染色体外実体として存在する、ベクターなどであってもよい。ベクターは、自己複製保証するための任意の手段を含有してもよい。代案としては、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれて、それがその中に組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。さらに、宿主細胞又はトランスポゾンのゲノムに導入される全DNAを一緒に含有する、単一ベクター若しくはプラスミド又は2つ以上のベクター若しくはプラスミドが使用されてもよい。

0223

ベクターは、好ましくは、形質転換、形質移入、又は形質導入などを受けた細胞の容易な選択を可能にする、1つ又は複数の選択可能マーカーを含有する。選択可能マーカーは、その産物が、殺生剤又はウイルス耐性重金属耐性栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。

0224

糸状菌宿主細胞内で使用するための選択可能マーカーとしては、adeA(ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンターゼ)、adeB(ホスホリボシル−アミノイミダゾールシンターゼ)、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸還元酵素)、pyrG(オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、及びtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、並びにそれらの均等物が挙げられるが、これに限定されるものではない。アスペルギルス属(Aspergillus)細胞で使用するのに好ましいのは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)又はアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)amdS及びpyrG遺伝子及びストレプトミセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)bar遺伝子である。トリコデルマ属(Trichoderma)細胞で使用するのに好ましいのは、adeA、adeB、amdS、hph、及びpyrG遺伝子である。

0225

選択可能マーカーは、国際公開第2010/039889号パンフレットに記載されるような二重選択可能マーカーシステムであってもよい。一態様では、二重選択可能マーカーは、hph−tk二重選択可能マーカーシステムである。

0226

ベクターは、好ましくは、ベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みを可能にし、又はゲノムとは無関係の細胞内のベクターの自律複製を可能にする、要素を含有する。

0227

宿主細胞ゲノムへの組み込みでは、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノムへの組み込みのために、ポリペプチド又はベクターの任意のその他の要素をコードする、ポリヌクレオチドの配列に依存してもよい。代案としては、ベクターは、染色体の正確な位置における、宿主細胞ゲノムへの相同組換えによる組み込みを指示するための追加的なポリヌクレオチドを含有してもよい。正確な位置における組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は、対応する標的配列と高度な配列同一性を有して相同組換えの可能性を高める、100〜10,000塩基対、400〜10,000塩基対、800〜10,000塩基対などの十分な数の核酸を含有すべきである。組み込み要素は、宿主細胞ゲノム中の標的配列と相同的な任意の配列であってもよい。さらに、組み込み要素は、非コード化又はコード化ポリヌクレオチドであってもよい。他方、ベクターは、非相同組換えによって、宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよい。

0228

自律複製では、ベクターは、ベクターが当該宿主細胞内で自律的に複製できるようにする、複製起点をさらに含んでもよい。複製起点は、細胞内で機能する自律複製を媒介する、任意のプラスミドレプリケーターであってもよい。「複製起点」又は「プラスミドレプリケーター」という用語は、プラスミド又はベクターが生体内で自己複製できるようにするポリヌクレオチドを意味する。

0229

糸状菌細胞で有用な複製起点の例は、AMA1とANS1である(Gems et al.,1991,Gene98:61−67;Cullen et al.,1987、Nucleic AcidsRes.15:9163−9175;国際公開第00/24883号パンフレット)。AMA1遺伝子の単離、及び同遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第00/24883号パンフレットで開示される方法に従って達成され得る。

0230

本発明のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを宿主細胞に挿入して、ポリペプチドの産生を増加させてもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも1つの追加的なコピーを宿主細胞ゲノムに組み込むことによって、又は増幅可能な選択可能マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることによって得られ得て、細胞は選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有し、その結果、適切な選択可能薬剤の存在下で細胞を培養することによって、ポリヌクレオチドの追加的なコピーが選択され得る。

0231

上述した要素を連結し本発明の組換え発現ベクターを構築するのに使用される手順は、当業者に良く知られている(例えば、前出のSambrook et al.,1989を参照されたい)。

0232

宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの産生を指示する1つ又は複数の制御配列に作動可能に連結された、本発明のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞にも関する。コンストラクト又はベクターが、染色体の組み込み体として維持され、又は前述の自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、ポリヌクレオチドを含むコンストラクト又はベクターが、宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその供給源に大きく依存する。

0233

宿主細胞は、真菌細胞であってもよい。「真菌」には、本明細書の用法では、子嚢菌門、担子菌門、糸状菌門、及び接合菌門、並びに卵菌類及び全ての栄養胞子形成菌が含まれる。(Hawksworth et al.,In,Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UKによって定義される通り)。

0234

真菌宿主細胞は、糸状菌細胞であってもよい。「糸状菌」には、真菌類及び卵菌類亜門の全ての糸状体が含まれる(前出のHawksworth et al.,1995によって定義される通り)。糸状菌は一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及びその他の複合多糖類から構成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長菌糸伸長によるもので、炭素異化作用偏性好気性である。

0235

糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム属(Acremonium)、アスペルギルス属(Aspergillus)、アウレオバシジウム属(Aureobasidium)、ヤケイロタケ属(Bjerkandera)、セリポリオプシス属(Ceriporiopsis)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、コプリナス属(Coprinus)、カワラタケ属(Coriolus)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、フィリバシジウム属(Filibasidium)、フザリウム属(Fusarium)、フミコラ属(Humicola)、マグナポルテ属(Magnaporthe)、ケカビ属(Mucor)、ミセリオフトラ属(Myceliophthora)、ネオカリマスティクス属(Neocallimastix)、ニューロスポラ属(Neurospora)、ペシロミセス属(Paecilomyces)、ペニシリウム属(Penicillium)、ファネロカエテ属(Phanerochaete)、シワウロコタケ属(Phlebia)、ピロミセス属(Piromyces)、ヒラタケ属(Pleurotus)、スエヒロタケ属(Schizophyllum)、タラロミセス属(Talaromyces)、サーモアスクス属(Thermoascus)、チエラビア属(Thielavia)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)、カワラタケ属(Trametes)、又はトリコデルマ属(Trichoderma)細胞であってもよい。

0236

例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フォエティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、ヤケイロタケ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・カレジエナ(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ジルベセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パンノシンタ(Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブロサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・スブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・スブベルミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora)、クリソスポリウム・イノプス(Chrysosporium inops)、クリソスポリウム・ケラチノフィルム(Chrysosporium keratinophilum)、クリソスポリウム・ラクノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、クロソスポリウム・メルダリウム(Chrysosporium merdarium)、クリソスポリウム・パンニコラ(Chrysosporium pannicola)、クリソスポリウム・クィーンズランディカム(Chrysosporium queenslandicum)、クリソスポリウム・トロピカム(Chrysosporium tropicum)、クリソスポリウム・ゾナタム(Chrysosporium zonatum)、ウシグソヒトヨタケ(Coprinus cinereus)、アラゲカワラタケ(Coriolus hirsutus)、フザリウム・バクトリジオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウエレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモルム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンディ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レチクラツム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイデス(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ペニシリウム・パープロゲナム(Penicillium purpurogenum)、ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、コガネシワウロコタケ(Phlebia radiata)、エリンギ(Pleurotus eryngii)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、フルイカワラタケ(Trametes villosa)、カワラタケ(Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアツム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、又はトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)細胞であってもよい。

0237

真菌細胞は、それ自体既知の様式での、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁再生が関与するプロセスによって、形質転換されてもよい。アスペルギルス属(Aspergillus)及びトリコデルマ属(Trichoderma)宿主細胞の形質転換に適した手順は、欧州特許第238023号明細書、Yelton et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470−1474、及びChristensen et al.,1988,Bio/Technology 6:1419−1422に記載される。フザリウム属(Fusarium)種の形質転換に適した方法は、Malardier et al.,1989,Gene 78:147−156、及び国際公開第96/00787号パンフレットによって記述される。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ