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技術 新規の細胞タグの発現

出願人 イントレキソンコーポレーション
発明者 シャー,ルトゥルエムテージ,ピーターヤルラガッダ,ラムヤ
出願日 2018年6月6日 (2年6ヶ月経過) 出願番号 2019-567571
公開日 2020年9月17日 (3ヶ月経過) 公開番号 2020-527937
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 動物,微生物物質含有医薬 ペプチド又は蛋白質 化合物または医薬の治療活性 微生物、その培養処理 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 医薬品製剤 微生物による化合物の製造
主要キーワード 閉止構造 基準数値 低温材料 ロテーター 表面結合剤 温度調節性 左側アーム 右側アーム
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年9月17日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

本明細書では、免疫療法的適用における使用のための細胞タグをコードするポリヌクレオチドと、細胞の活性を調節するための、ポリヌクレオチドによる細胞タグを含むシステムとが開示される。本明細書で記載される組成物、方法、およびシステムは、対象における遺伝子操作細胞の活性を調節するためのツールをもたらす。

概要

背景

細胞療法は、従来型医薬により十分に処置されえない疾患を処置するのに有望である。輸血は、最初の種類の、血液悪性腫瘍を処置する細胞療法であった。細胞の単離技術、誘導技術、および遺伝子導入技術における近年の進歩は、多様な疾患、例えば、がん心血管疾患皮膚疾患神経疾患、および眼科疾患の処置のための、多様な細胞型初代細胞および不死化細胞)の遺伝子改変を可能としている。多くの場合、治療目的の選択された細胞の拡大を可能とするのに必要な純度を達成するには、患者における輸注の前に、遺伝子改変された細胞療法製品濃縮し、かつ/または非遺伝子改変細胞型または他の細胞型を消失させることが、極めて重要である。加えて、例えば、サイトカインキメラ抗原受容体(CAR)、およびT細胞受容体(TCR)を使用する養子細胞免疫療法は、腫瘍細胞の殺滅の方向付け成功するのに、極めて有望であることが示されている。この新規の技術は、有望であるが、改変免疫細胞の、腫瘍を保有する個体への投与は、安全性問題、例えば、CAR−T細胞療法の場合、毒性、腫瘍溶解、およびサイトカイン放出症候群(すなわち、「サイトカインストーム」)を伴わないことはなかった。養子T細胞免疫療法によりもたらされる治療的可能性を十分に利用するために、治療時に、サイトカインストームなどの副作用を制御することが不可欠である。

参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

概要

本明細書では、免疫療法的適用における使用のための細胞タグをコードするポリヌクレオチドと、細胞の活性を調節するための、ポリヌクレオチドによる細胞タグを含むシステムとが開示される。本明細書で記載される組成物、方法、およびシステムは、対象における遺伝子操作細胞の活性を調節するためのツールをもたらす。

目的

本明細書では、対象(例えば、免疫療法を受ける)における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、対象へと、本明細書で開示されるポリヌクレオチド構築物をコードする遺伝子操作細胞を提供し、対象へと、細胞に結合し、これらの活性を調節する、所定の結合パートナーをさらに提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

少なくともHER1ドメインIIIまたはその断片と、トランケート型HER1ドメインIVとからなるトランケート型非免疫原性HER1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記HER1ポリペプチドが、抗HER1抗体に結合し、前記HER1ポリペプチドが、操作細胞内で発現される、ポリヌクレオチド。

請求項2

前記トランケート型HER1ドメインIVが、前記HER1ドメインIVのうちの、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%のトランケーションを含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。

請求項3

前記トランケート型HER1ドメインIVが、配列番号203、204、205、206、207、208、および209に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。

請求項4

前記トランケート型HER1ドメインIVが、配列番号203、204、205、206、207、208、および209に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項3に記載のポリヌクレオチド。

請求項5

前記HER1ドメインIIIまたはその断片が、配列番号200に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。

請求項6

前記HER1ドメインIIIが、配列番号200に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項5に記載のポリヌクレオチド。

請求項7

CD28膜貫通ドメインと、前記HER1ポリペプチドを、前記CD28膜貫通ドメインへと共役するためのペプチドリンカーとをさらにコードする、請求項1から6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項8

配列番号57に示される配列を含むポリペプチド配列を含むポリペプチド構築物をコードする、請求項7に記載のポリヌクレオチド。

請求項9

前記抗HER1抗体が、リツキシマブセツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも1つを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項10

抗CD20抗体に結合するトランケート型非免疫原性CD20ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記トランケート型非免疫原性CD20ポリペプチドが、内因性受容体に結合しない、ポリヌクレオチド。

請求項11

前記CD20ポリペプチドが、配列番号109に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項10に記載のポリヌクレオチド。

請求項12

前記CD20ポリペプチドが、配列番号109の配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項10に記載のポリヌクレオチド。

請求項13

前記CD20ポリペプチドが、天然CD20の、少なくとも50%、60%、70%、80%、または90%の結合効率で、前記抗CD20抗体に結合する、請求項10から12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項14

前記抗CD20抗体が、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも1つを含む、請求項13に記載のポリヌクレオチド。

請求項15

抗CD52抗体に結合するトランケート型非免疫原性CD52ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記トランケート型非免疫原性CD52ポリペプチドが、内因性受容体に結合せず、前記非免疫原性CD52ポリペプチドが、操作細胞内で発現される、ポリヌクレオチド。

請求項16

前記CD52ポリペプチドが、配列番号143に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項15に記載のポリヌクレオチド。

請求項17

前記CD52ポリペプチドが、配列番号143に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項16に記載のポリヌクレオチド。

請求項18

少なくとも1つの異種遺伝子をコードする、少なくとも1つの配列をさらに含む細胞内で発現される、請求項10から17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項19

前記少なくとも1つの異種遺伝子が、誘導性プロモーターによりモジュレートされる、請求項18に記載のポリヌクレオチド。

請求項20

前記少なくとも1つの異種遺伝子が、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、およびサイトカインのうちの少なくとも1つを含む、請求項18に記載のポリヌクレオチド。

請求項21

前記少なくとも1つの異種遺伝子が、CARを含み、前記CARが、CD19、CD33、BCMA、CD44、α−葉酸受容体CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP−2、EGP−40、HER2、HER3、葉酸結合性タンパク質GD2、GD3、IL−13R−a2、KDR、EDB−F、メソテリン、CD22、EGFR、MUC−1、MUC−16、MAGE−A1、h5T4、PSMA、TAG−72、EGFRvIII、CD123、およびVEGF−R2のうちの少なくとも1つに結合する、請求項20に記載のポリヌクレオチド。

請求項22

前記少なくとも1つの異種遺伝子が、サイトカインを含む、請求項18から20のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項23

前記サイトカインが、IL−15、IL−2、IL−12、IL−21、およびIL−15とIL−IL−15Rαとの融合体のうちの少なくとも1つを含む、請求項22に記載のポリヌクレオチド。

請求項24

前記サイトカインが、分泌形態である、請求項23に記載のポリヌクレオチド。

請求項25

前記サイトカインが、膜結合形態である、請求項23に記載のポリヌクレオチド。

請求項26

請求項10から25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター

請求項27

レンチウイルスベクターレトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項26に記載のベクター。

請求項28

前記非ウイルスベクターが、SleepingBeautyトランスポゾンである、請求項27に記載のベクター。

請求項29

ゲノム編集により、操作細胞へと組み込まれる、請求項10から25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項30

前記ゲノム編集が、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む、請求項29に記載のポリヌクレオチド。

請求項31

請求項10から25および29から30のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む操作細胞。

請求項32

T細胞またはNK細胞である、請求項31に記載の操作細胞。

請求項33

細胞表面ポリペプチドと、膜貫通二量体化ドメインとを含むポリペプチド構築物であって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化誘導し、前記細胞表面ポリペプチドが、所定の抗体またはその変異体もしくは断片に結合する、ポリペプチド構築物。

請求項34

前記細胞表面ポリペプチドが、HER1ポリペプチド、LNGRポリペプチド、CD20ポリペプチド、またはCD52ポリペプチドのうちの少なくとも1つを含む、請求項33に記載のポリペプチド構築物。

請求項35

前記細胞表面ポリペプチドが、HER1ポリペプチドを含み、前記HER1ポリペプチドが、配列番号211、212、213、214、215、216、または217に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項34に記載のポリペプチド構築物。

請求項36

前記HER1ポリペプチドが、配列番号211、212、213、214、215、216、または217に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項35に記載のポリペプチド構築物。

請求項37

前記細胞表面ポリペプチドが、CD20ポリペプチドを含み、前記CD20ポリペプチドが、配列番号218、配列番号219、または配列番号220に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項34に記載のポリペプチド構築物。

請求項38

前記CD20ポリペプチドが、配列番号218、配列番号219、または配列番号220に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項37に記載のポリペプチド構築物。

請求項39

前記細胞表面ポリペプチドが、LNGFRポリペプチドを含み、前記LNGFRポリペプチドが、配列番号156、配列番号158、または配列番号160に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項34に記載のポリペプチド構築物。

請求項40

前記細胞表面ポリペプチドが、LNGFRポリペプチドを含み、前記LNGFRポリペプチドが、配列番号156、配列番号158、または配列番号160に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項34に記載のポリペプチド構築物。

請求項41

前記細胞表面ポリペプチドが、内因性受容体に結合しない、請求項33から40のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項42

前記膜貫通二量体化ドメインが、相補的な二量体化ドメインと共に、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成しうる、請求項33から41のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項43

前記膜貫通二量体化ドメインが、少なくとも1つのシステイン残基を含む、請求項33から42のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項44

前記膜貫通二量体化ドメインが、グリコホリンA膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンA−インテグリンβ3キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、またはCD3ゼータ膜貫通ドメインを含む、請求項33から43のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項45

前記細胞表面ポリペプチドが、少なくともHER1ポリペプチドを含む、請求項44に記載のポリペプチド構築物。

請求項46

操作細胞内で発現される、請求項33から45のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項47

前記操作細胞が、動物細胞である、請求項46に記載のポリペプチド構築物。

請求項48

前記動物細胞が、ヒト細胞である、請求項47に記載のポリペプチド構築物。

請求項49

前記ヒト細胞が、T細胞またはNK細胞である、請求項48に記載のポリペプチド構築物。

請求項50

前記操作細胞が、SleepingBeautyトランスポザーゼをさらに含む、請求項46から49のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項51

前記操作細胞が、少なくとも1つの、さらなる外因性ポリペプチドをさらに発現する、請求項46から50のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項52

前記操作細胞が、少なくとも1つの、外因性受容体ポリペプチドまたはその断片をさらに発現する、請求項46から50のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項53

前記操作細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、およびサイトカインのうちの少なくとも1つをさらに発現する、請求項46から50のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項54

前記操作細胞が、少なくとも1つのCARをさらに発現し、前記CARが、CD19、CD33、BCMA、CD44、α−葉酸受容体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP−2、EGP−40、HER2、HER3、葉酸結合性タンパク質、GD2、GD3、IL−13R−a2、KDR、EDB−F、メソテリン、CD22、EGFR、MUC−1、MUC−16、MAGE−A1、h5T4、PSMA、TAG−72、EGFRvIII、CD123、およびVEGF−R2のうちの少なくとも1つに結合する、請求項53に記載のポリペプチド構築物。

請求項55

前記操作細胞が、少なくとも1つの組換えサイトインをさらに発現する、請求項52から53のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項56

前記組換えサイトカインが、IL−15、mbIL−15、IL−2、IL−12、またはIL−21である、請求項55に記載のポリペプチド構築物。

請求項57

ゲノム編集により、前記操作細胞へと組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされる、請求項46から56のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項58

前記ゲノム編集が、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む、請求項57に記載のポリペプチド構築物。

請求項59

前記細胞表面ポリペプチドを、前記膜貫通二量体化ドメインと融合させるリンカーを含む、請求項33から58のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項60

請求項33から59のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物を含む、ポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体。

請求項61

膜貫通二量体化ドメインと融合させた非免疫原性細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドであって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導する、ポリヌクレオチド。

請求項62

前記細胞表面ポリペプチドが、内因性受容体に結合しない、請求項61に記載のポリヌクレオチド。

請求項63

前記細胞表面ポリペプチドが、任意の内因性シグナル伝達機能またはトラフィッキング機能を含有しない、請求項61に記載のポリヌクレオチド。

請求項64

少なくとも1つの異種遺伝子をコードする、少なくとも1つの配列をさらに含む細胞内で発現された、請求項61から63のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項65

前記少なくとも1つの異種遺伝子が、誘導性プロモーターによりモジュレートされる、請求項64に記載のポリヌクレオチド。

請求項66

前記少なくとも1つの異種遺伝子が、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、およびサイトカインのうちの少なくとも1つを含む、請求項64に記載のポリヌクレオチド。

請求項67

前記少なくとも1つの異種遺伝子が、前記CARを含み、前記CARが、CD19、CD33、BCMA、CD44、α−葉酸受容体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP−2、EGP−40、HER2、HER3、葉酸結合性タンパク質、GD2、GD3、IL−13R−a2、KDR、EDB−F、メソテリン、CD22、EGFR、MUC−1、MUC−16、MAGE−A1、h5T4、PSMA、TAG−72、EGFRvIII、CD123、およびVEGF−R2のうちの少なくとも1つに結合する、請求項66に記載のポリヌクレオチド。

請求項68

前記少なくとも1つの異種遺伝子が、サイトカインを含む、請求項66から67のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項69

前記サイトカインが、IL−15、IL−2、IL−12、IL−21、およびIL−15とIL−IL−15Rαとの融合体のうちの少なくとも1つを含む、請求項68に記載のポリヌクレオチド。

請求項70

前記サイトカインが、分泌形態である、請求項68に記載のポリヌクレオチド。

請求項71

前記サイトカインが、膜結合形態である、請求項68に記載のポリヌクレオチド。

請求項72

2A、GSG−2A、GSGリンカー(配列番号16)、SGSGリンカー(配列番号18)、フューリンリンク変異体、およびそれらの誘導体を含むポリペプチドリンカーをコードする、少なくとも1つの配列を含む、請求項61から71のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項73

前記2Aリンカーが、p2Aリンカー、T2Aリンカー、F2Aリンカー、またはE2Aリンカーである、請求項72に記載のポリヌクレオチド。

請求項74

前記ポリペプチド構築物が、細胞を濃縮するか、細胞を選択するか、または前記細胞表面ポリペプチドを発現する細胞における細胞死を誘導するタグとして作用する、請求項61から73のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項75

前記細胞表面ポリペプチドが、HER1ポリペプチド、LNGFRポリペプチド、CD20ポリペプチド、およびCD52ポリペプチドのうちの少なくとも1つを含む、請求項61から74のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項76

前記膜貫通二量体化ドメインが、グリコホリンA膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンA−インテグリンβ3キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、またはCD3ゼータ膜貫通ドメインを含む、請求項61から75のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項77

請求項61から76のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

請求項78

レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項77に記載のベクター。

請求項79

前記非ウイルスベクターが、SleepingBeautyトランスポゾンである、請求項78に記載のベクター。

請求項80

ゲノム編集により、操作細胞へと組み込まれる、請求項61から76のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

請求項81

前記ゲノム編集が、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む、請求項80に記載のポリヌクレオチド。

請求項82

対象における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、前記対象へ、膜貫通二量体化ドメインと融合させた細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードする、ある量の遺伝子操作細胞を提供するステップであって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導し、前記細胞表面ポリペプチドが、所定の結合パートナーまたはその変異体もしくは断片に結合する、ステップと;前記遺伝子操作細胞に結合し、それにより、前記遺伝子操作細胞の活性を調節するのに十分な量で、前記対象へ、前記所定の結合パートナーを提供するステップとを含む方法。

請求項83

前記細胞表面ポリペプチドが、非免疫原性ポリペプチドである、請求項82に記載の方法。

請求項84

前記細胞表面ポリペプチドが、HER1ポリペプチド、LNGFRポリペプチド、CD20ポリペプチド、およびCD52ポリペプチドのうちの少なくとも1つを含む、請求項82から83のいずれか一項に記載の方法。

請求項85

前記細胞表面ポリペプチドが、内因性受容体に結合しない、請求項82から84のいずれか一項に記載の方法。

請求項86

前記膜貫通二量体化ドメインが、相補的な二量体化ドメインと共に、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成しうる、請求項82から85のいずれか一項に記載の方法。

請求項87

前記膜貫通二量体化ドメインが、少なくとも1つのシステイン残基を含む、請求項82から85のいずれか一項に記載の方法。

請求項88

前記膜貫通二量体化ドメインが、グリコホリンA膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンA−インテグリンβ3キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、またはCD3ゼータ膜貫通ドメインを含む、請求項82から85のいずれか一項に記載の方法。

請求項89

前記結合パートナーが、抗体、またはその細胞表面ポリペプチド結合性領域を含む、請求項82から88のいずれか一項に記載の方法。

請求項90

前記抗体が、モノクローナル抗体、scFv、scFabダイアボディー、およびラクダ科動物抗体のうちの少なくとも1つを含む、請求項89に記載の方法。

請求項91

前記抗体が、リツキシマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、パニツムマブ、およびネシツムマブのうちの少なくとも1つを含む、請求項89に記載の方法。

請求項92

前記遺伝子操作細胞が、T細胞およびNK細胞のうちの少なくとも1つを含む、請求項82から91のいずれか一項に記載の方法。

請求項93

前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも1つが、少なくとも1つの、さらなる外因性ポリペプチドをさらに発現する、請求項82から92のいずれか一項に記載の方法。

請求項94

前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも1つが、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、およびサイトカインのうちの少なくとも1つをさらに発現する、請求項82から92のいずれか一項に記載の方法。

請求項95

前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも1つが、少なくとも1つのCARをさらに発現し、前記CARが、CD19、CD33、BCMA、CD44、α−葉酸受容体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP−2、EGP−40、HER2、HER3、葉酸結合性タンパク質、GD2、GD3、IL−13R−a2、KDR、EDB−F、メソテリン、CD22、EGFR、MUC−1、MUC−16、MAGE−A1、h5T4、PSMA、TAG−72、EGFRvIII、CD123、およびVEGF−R2のうちの少なくとも1つに結合する、請求項94に記載の方法。

請求項96

前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも1つが、少なくとも1つの組換えサイトカインをさらに発現する、請求項94に記載の方法。

請求項97

前記組換えサイトカインが、IL−15、mbIL−15、IL−2、IL−12、およびIL−21のうちの少なくとも1つを含む、請求項96に記載の方法。

請求項98

前記所定の結合パートナーを、サイトカインストームまたは全身性炎症性応答と関連する、少なくとも1つの症状の軽減を引き起こすのに十分な量で提供する、請求項82から97のいずれか一項に記載の方法。

請求項99

前記所定の結合パートナーを、腫瘍溶解症候群と関連する、少なくとも1つの症状の軽減を引き起こすのに十分な量で提供する、請求項82から98のいずれか一項に記載の方法。

請求項100

前記ポリペプチド構築物が、ゲノム編集により、前記操作細胞へと組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされる、請求項82から99のいずれか一項に記載の方法。

請求項101

前記ゲノム編集が、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む、請求項100に記載の方法。

請求項102

請求項1〜25、29〜30、61〜76、および80〜81のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。

請求項103

がん処置する方法であって、対象へ、有効量の、請求項1〜25、29〜30、61〜76、および80〜81のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む操作細胞を投与するステップを含む方法。

請求項104

前記操作細胞上で発現させたポリペプチドへの結合が可能な、少なくとも1つの結合パートナーを投与するステップをさらに含む、請求項103に記載の方法。

請求項105

前記結合パートナーが、抗体である、請求項104に記載の方法。

請求項106

対象における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、前記対象へ、第1のトランケート型非免疫原性ポリペプチドと、第2のトランケート型非免疫原性ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドである細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードする、ある量の遺伝子操作細胞を提供するステップであって、前記細胞表面ポリペプチドが、少なくとも1つの所定の結合パートナーまたはその変異体もしくは断片に結合する、ステップと;前記遺伝子操作細胞に結合し、それにより、前記遺伝子操作細胞の活性を調節するのに十分な量で、前記対象へ、前記所定の結合パートナーを提供するステップとを含む方法。

請求項107

前記第1のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、EGFRファミリーメンバーの断片または誘導体を含む、請求項106に記載の方法。

請求項108

前記第2のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、EGFRファミリーのメンバーの断片または誘導体を含む、請求項106または107に記載の方法。

請求項109

前記第1のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、HER1ポリペプチドを含む、請求項106から108のいずれか一項に記載の方法。

請求項110

前記HER1ポリペプチドが、配列番号211、212、213、214、215、216、または217に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項109に記載の方法。

請求項111

前記HER1ポリペプチドが、配列番号211、212、213、214、215、216、または217に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項110に記載の方法。

請求項112

前記HER1ポリペプチドが、配列番号211に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項111に記載の方法。

請求項113

前記第2のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、HER2ポリペプチド、ErbB3ポリペプチド、またはErbB4ポリペプチドを含む、請求項109から112のいずれか一項に記載の方法。

請求項114

前記ポリペプチド構築物が、配列番号89、配列番号93、配列番号97、配列番号101、または配列番号105に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項113に記載の方法。

請求項115

前記少なくとも1つの所定の結合パートナーが、前記HER1ポリペプチドに結合する、請求項109に記載の方法。

請求項116

前記少なくとも1つの所定の結合パートナーが、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも1つを含む、請求項115に記載の方法。

請求項117

前記少なくとも1つの所定の結合パートナーが、前記第2のトランケート型非免疫原性ポリペプチドに結合する、第2の所定の結合パートナーをさらに含む、請求項116に記載の方法。

請求項118

前記第2のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、HER2ポリペプチドであり、前記第2の所定の結合パートナーが、ペルツズマブである、請求項117に記載の方法。

請求項119

前記ポリペプチド構築物が、シグナルペプチドをさらに含む、請求項106に記載の方法。

請求項120

前記ポリペプチド構築物が、膜貫通ドメインをさらに含む、請求項106に記載の方法。

請求項121

前記膜貫通ドメインが、膜貫通二量体化ドメインを含む、請求項120に記載の方法。

請求項122

前記膜貫通二量体化ドメインが、グリコホリンA膜貫通ドメイン、グリコホリンA−インテグリンβ3キメラ膜貫通ドメイン、またはCD3ゼータ膜貫通ドメインを含む、請求項121に記載の方法。

請求項123

前記膜貫通二量体化ドメインが、配列番号26、配列番号28、配列番号30、または配列番号32に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項121に記載の方法。

請求項124

前記膜貫通二量体化ドメインが、配列番号26、配列番号28、配列番号30、または配列番号32に示されるポリペプチド配列を含む、請求項123に記載の方法。

請求項125

前記第1のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、CD20ポリペプチドを含む、請求項106に記載の方法。

請求項126

前記CD20ポリペプチドが、配列番号218、配列番号219、または配列番号220に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項125に記載の方法。

請求項127

前記CD20ポリペプチドが、配列番号218、配列番号219、または配列番号220に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項126に記載の方法。

請求項128

前記少なくとも1つの所定の結合パートナーが、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも1つを含む、請求項125から127のいずれか一項に記載の方法。

請求項129

HER1ドメインIIIと、トランケート型HER1ドメインIVとからなるトランケート型非免疫原性HER1ポリペプチドであって、抗HER1抗体に結合するHER1ポリペプチドと;CD28膜貫通ドメインと;前記HER1ポリペプチドを、前記CD28膜貫通ドメインへと共役するためのペプチドリンカーとを含むポリペプチド構築物であって、操作細胞内で発現される、ポリペプチド構築物。

請求項130

前記HER1ドメインIIIが、配列番号200に示される配列を含むポリペプチド配列を含み、前記HER1ドメインIVが、配列番号203に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項129に記載のポリペプチド構築物。

請求項131

前記CD28膜貫通ドメインが、配列番号36に示される配列を含むポリペプチド配列を含み、前記ペプチドリンカーが、G4Sペプチドリンカー(配列番号221)を含む、請求項130に記載のポリペプチド構築物。

請求項132

前記G4Sペプチドリンカー(配列番号221)が、配列番号22に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項131に記載のポリペプチド構築物。

請求項133

配列番号57に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項132に記載のポリペプチド構築物。

請求項134

前記抗HER1抗体が、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも1つを含む、請求項129から133のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

請求項135

抗CD20抗体に結合するトランケート型非免疫原性CD20ポリペプチドを含むポリペプチド構築物であって、操作細胞内で発現されるポリペプチド構築物。

請求項136

配列番号109に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有する、請求項135に記載のポリペプチド構築物。

請求項137

配列番号109に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項136に記載のポリペプチド構築物。

請求項138

前記抗CD20抗体が、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも1つを含む、請求項135から137のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、2017年6月7日に出願された米国特許仮出願第62/516,639号明細書の利益を主張する。

0002

配列表
本出願は、ASCIIフォーマットにおいて、電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2018年5月30日に作成された前記ASCIIコピーは、50471_708_601_SL.txtと名付けられ、464,445バイトのサイズである。

背景技術

0003

細胞療法は、従来型医薬により十分に処置されえない疾患を処置するのに有望である。輸血は、最初の種類の、血液悪性腫瘍を処置する細胞療法であった。細胞の単離技術、誘導技術、および遺伝子導入技術における近年の進歩は、多様な疾患、例えば、がん心血管疾患皮膚疾患神経疾患、および眼科疾患の処置のための、多様な細胞型初代細胞および不死化細胞)の遺伝子改変を可能としている。多くの場合、治療目的の選択された細胞の拡大を可能とするのに必要な純度を達成するには、患者における輸注の前に、遺伝子改変された細胞療法製品濃縮し、かつ/または非遺伝子改変細胞型または他の細胞型を消失させることが、極めて重要である。加えて、例えば、サイトカインキメラ抗原受容体(CAR)、およびT細胞受容体(TCR)を使用する養子細胞免疫療法は、腫瘍細胞の殺滅の方向付け成功するのに、極めて有望であることが示されている。この新規の技術は、有望であるが、改変免疫細胞の、腫瘍を保有する個体への投与は、安全性問題、例えば、CAR−T細胞療法の場合、毒性、腫瘍溶解、およびサイトカイン放出症候群(すなわち、「サイトカインストーム」)を伴わないことはなかった。養子T細胞免疫療法によりもたらされる治療的可能性を十分に利用するために、治療時に、サイトカインストームなどの副作用を制御することが不可欠である。

0004

参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

0005

上記の欠損のうちの1または複数に対処するように、細胞内で発現させうるポリペプチド構築物およびポリヌクレオチドが提供される。

0006

ポリペプチド構築物およびポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド、天然ポリペプチドトランケート型変異体を含むポリペプチド構築物が提供される。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、膜貫通ドメインもしくはその断片、シグナルペプチド、および/またはペプチドリンカーをさらに含みうる。本明細書ではまた、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド構築物を発現する操作細胞(engineered cell)も提示される。操作細胞は、ポリペプチド構築物を、細胞表面において発現し、これにより、一部の実施形態では、操作細胞を固有に同定する、細胞マーカー(または「細胞タグ」)をもたらしうる。

0007

本明細書ではさらに、ポリペプチド構築物およびポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド、天然ポリペプチドのトランケート型変異体と膜貫通ドメインとを含むポリペプチド構築物が提示される。ある特定の実施形態では、トランケート型変異体は、細胞外ドメインまたはその部分と、膜貫通ドメインまたはその部分とを含む。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、異なる天然タンパク質由来する膜貫通ドメインと、トランケート型変異体とを含みうる。場合によって、ポリペプチド構築物のトランケート型変異体である膜貫通ドメインは、1回膜貫通型膜貫通ドメインである。他の場合には、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、複数回膜貫通型膜貫通ドメインである。

0008

本明細書では、ポリペプチド構築物およびポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド、細胞表面ポリペプチド(例えば、膜貫通ドメインへと融合させたトランケート型変異体)を、細胞表面において、第2の細胞表面ポリペプチドへと共役する(coupling)ことが可能な、膜貫通二量体化ドメインを含むポリペプチド構築物が提示される。ある特定の実施形態では、膜貫通二量体化ドメインを介して、細胞表面ポリペプチドを共役することは、非二量体化立体配置と比べて、細胞表面ポリペプチドに由来するシグナル増幅しうる。

0009

本明細書ではなおさらに、ポリペプチド構築物およびポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド、異なる天然タンパク質に由来するドメインまたはその断片を含むポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、天然ポリペプチドのトランケート型変異体、膜貫通ドメイン、トランケート型変異体を、膜貫通ドメインへと接続する、任意選択のペプチドリンカー、およびポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付けるシグナルペプチドを含みうる。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、トランケート型変異体またはその断片へと、直接的にまたは間接的に融合させた膜貫通ドメインまたはその断片と異なる天然タンパク質に由来するトランケート型変異体またはその断片を含有する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物の特定のドメイン(例えば、細胞外ドメイン)は、キメラであり、異なる天然タンパク質に由来するアミノ酸配列を含有する。

0010

場合によって、細胞表面ポリペプチドと、膜貫通二量体化ドメインとを含むポリペプチド構築物であって、膜貫通二量体化ドメインが、細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導し、細胞表面ポリペプチドが、所定の抗体またはその変異体もしくは断片に結合する、ポリペプチド構築物を含む方法および組成物が提示される。本明細書ではまた、本明細書で記載されるポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド配列も提示される。

0011

本明細書では、HER1、CD20、LNGFR、およびCD52などのポリペプチドのトランケート型変異体を含む細胞タグを含む方法および組成物が提示される。場合によって、ポリペプチドのトランケート型変異体は、内因性受容体に結合しない。開示されるトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、細胞タグとして、例えば、細胞マーカー、枯渇マーカー、または殺滅タグとして使用することができる。

0012

本明細書では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物またはポリヌクレオチドを発現する操作細胞を含む組成物が提示される。場合によって、操作細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、および/またはサイトカインのうちの少なくとも1つをさらに発現する。

0013

本明細書では、対象(例えば、免疫療法を受ける)における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、対象へと、本明細書で開示されるポリヌクレオチド構築物をコードする遺伝子操作細胞を提供し、対象へと、細胞に結合し、これらの活性を調節する、所定の結合パートナーをさらに提供するステップを含む方法が提示される。また、方法における使用のためのシステムおよびキットも提示される。

0014

細胞表面ポリペプチドと、膜貫通二量体化ドメインとを含むポリペプチド構築物であって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導し、前記細胞表面ポリペプチドが、所定の抗体またはその変異体もしくは断片に結合する、ポリペプチド構築物が提供される。

0015

一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、HER1ポリペプチド、LNGFRポリペプチド、CD20ポリペプチド、およびCD52ポリペプチドのうちの少なくとも1つを含む。場合によって、前記細胞表面ポリペプチドは、HER1ポリペプチドを含み、前記HER1ポリペプチドは、配列番号211、212、213、214、215、216、または217に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記HER1ポリペプチドは、配列番号211、212、213、214、215、216、または217に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。

0016

一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、CD20ポリペプチドを含み、前記CD20ポリペプチドは、配列番号218、配列番号219、または配列番号220に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、前記CD20ポリペプチドは、配列番号218、配列番号219、または配列番号220に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。

0017

一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、LNGFRポリペプチドを含み、前記LNGFRポリペプチドは、配列番号156、配列番号158、または配列番号160に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、前記細胞表面ポリペプチドは、LNGFRポリペプチドを含み、前記LNGFRポリペプチドは、配列番号156、配列番号158、または配列番号160に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

0018

一部の場合には、前記細胞表面ポリペプチドは、内因性受容体に結合しない。場合によって、前記膜貫通二量体化ドメインは、相補的な二量体化ドメインと共に、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成しうる。一部の場合には、前記膜貫通二量体化ドメインは、少なくとも1つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、前記膜貫通二量体化ドメインは、グリコホリンA膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンA−インテグリンβ3キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、あるいはCD3ゼータ膜貫通ドメインを含む。場合によって、このような細胞表面ポリペプチドは、少なくともHER1ポリペプチドを含む。

0019

場合によって、前記ポリペプチド構築物を、操作細胞内で発現させる。一部の実施形態では、前記操作細胞は、動物細胞である。一部の場合には、前記動物細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、前記ヒト細胞は、T細胞またはNK細胞である。場合によって、前記操作細胞は、SleepingBeautyトランスポザーゼをさらに含む。

0020

一部の場合には、前記操作細胞は、少なくとも1つの、さらなる外因性ポリペプチドをさらに発現する。場合によって、前記操作細胞は、少なくとも1つの、外因性受容体ポリペプチドまたはその断片をさらに発現する。一部の場合には、前記操作細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、およびサイトカインのうちの少なくとも1つをさらに発現する。一部の実施形態では、前記操作細胞は、少なくとも1つのCARをさらに発現し、前記CARは、CD19、CD33、BCMA、CD44、α−葉酸受容体CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP−2、EGP−40、HER2、HER3、葉酸結合性タンパク質GD2、GD3、IL−13R−a2、KDR、EDB−F、メソテリン、CD22、EGFR、MUC−1、MUC−16、MAGE−A1、h5T4、PSMA、TAG−72、EGFRvIII、CD123、およびVEGF−R2のうちの少なくとも1つに結合する。

0021

場合によって、前記操作細胞は、少なくとも1つの組換えサイトインをさらに発現する。一部の場合には、前記組換えサイトカインは、IL−15、mbIL−15、IL−2、IL−12、およびIL−21のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、ゲノム編集により、前記操作細胞へと組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされる。場合によって、前記ゲノム編集は、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む。一部の場合には、前記ポリペプチド構築物は、前記細胞表面ポリペプチドを、前記膜貫通二量体化ドメインと融合させるリンカーを含む。場合によって、ポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体は、ポリペプチド構築物を含む。

0022

膜貫通二量体化ドメインと融合させた非免疫原性細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物であって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導する、ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、内因性受容体に結合しない。場合によって、前記細胞表面ポリペプチドは、任意の内因性シグナル伝達機能またはトラフィッキング機能を含有しない。

0023

一部の場合には、前記ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの異種遺伝子をコードする、少なくとも1つの配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも1つの異種遺伝子は、誘導性プロモーターによりモジュレートされる。場合によって、前記少なくとも1つの異種遺伝子は、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、およびサイトカインのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも1つの異種遺伝子は、前記CARを含み、前記CARは、CD19、CD33、BCMA、CD44、α−葉酸受容体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP−2、EGP−40、HER2、HER3、葉酸結合性タンパク質、GD2、GD3、IL−13R−a2、KDR、EDB−F、メソテリン、CD22、EGFR、MUC−1、MUC−16、MAGE−A1、h5T4、PSMA、TAG−72、EGFRvIII、CD123、およびVEGF−R2のうちの少なくとも1つに結合する。

0024

一部の実施形態では、前記少なくとも1つの異種遺伝子は、サイトカインを含む。場合によって、前記サイトカインは、IL−15、IL−2、IL−12、IL−21、およびIL−15とIL−15Rαとの融合体のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記サイトカインは、分泌形態である。一部の場合には、前記サイトカインは、膜結合形態である。

0025

一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、2A、GSG−2A、GSGリンカー(配列番号16)、SGSGリンカー(配列番号18)、フューリンリンク変異体、およびそれらの誘導体からなる群から選択されるポリペプチドリンカーを含む、少なくとも1つの配列を含む。一部の実施形態では、前記2Aリンカーは、p2Aリンカー、T2Aリンカー、F2Aリンカー、またはE2Aリンカーである。

0026

一部の場合には、前記ポリペプチド構築物は、細胞を濃縮するか、細胞を選択するか、または前記細胞表面分子を発現する細胞における細胞死を誘導するタグとして作用する。場合によって、前記細胞表面ポリペプチドは、HER1ポリペプチド、LNGFRポリペプチド、CD20ポリペプチド、およびCD52ポリペプチドのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記膜貫通二量体化ドメインは、グリコホリンA膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンA−インテグリンβ3キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、あるいはCD3ゼータ膜貫通ドメインを含む。

0027

場合によって、ベクターは、ポリヌクレオチドを含む。一部の場合には、前記ベクターは、レンチウイルスベクターレトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、SleepingBeautyトランスポゾンである。場合によって、前記ポリヌクレオチドは、ゲノム編集により、操作細胞へと組み込まれる。場合によって、前記ゲノム編集は、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む。

0028

対象における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、前記対象へと、膜貫通二量体化ドメインと融合させた細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードする、ある量の遺伝子操作細胞を提供するステップであって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導し、前記細胞表面ポリペプチドが、所定の結合パートナーまたはその変異体もしくは断片に結合する、ステップと;前記遺伝子操作細胞に結合し、それにより、前記遺伝子操作細胞の活性を調節するのに十分な量で、前記対象へと、前記所定の結合パートナーを提供するステップとを含む方法が提供される。

0029

一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、非免疫原性ポリペプチドである。一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、HER1ポリペプチド、LNGFRポリペプチド、CD20ポリペプチド、およびCD52ポリペプチドのうちの少なくとも1つを含む。一部の場合には、前記細胞表面ポリペプチドは、内因性受容体に結合しない。場合によって、前記膜貫通二量体化ドメインは、相補的な二量体化ドメインと共に、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成しうる。一部の実施形態では、前記膜貫通二量体化ドメインは、少なくとも1つのシステイン残基を含む。一部の場合には、前記膜貫通二量体化ドメインは、グリコホリンA膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンA−インテグリンβ3キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、あるいはCD3ゼータ膜貫通ドメインを含む。

0030

場合によって、前記結合パートナーは、抗体、またはその細胞表面ポリペプチド結合性領域を含む。一部の実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体、scFv、scFabダイアボディー、およびラクダ科動物(camelid)抗体のうちの少なくとも1つを含む。一部の場合には、前記抗体は、リツキシマブセツキシマブアレムツズマブパニツムマブ、およびネシツムマブのうちの少なくとも1つを含む。

0031

場合によって、前記遺伝子操作細胞は、T細胞およびNK細胞のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも1つは、少なくとも1つの、さらなる外因性ポリペプチドをさらに発現する。一部の場合には、前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも1つは、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、およびサイトカインのうちの少なくとも1つをさらに発現する。場合によって、前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも1つは、少なくとも1つのCARをさらに発現し、前記CARは、CD19、CD33、BCMA、CD44、α−葉酸受容体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP−2、EGP−40、HER2、HER3、葉酸結合性タンパク質、GD2、GD3、IL−13R−a2、KDR、EDB−F、メソテリン、CD22、EGFR、MUC−1、MUC−16、MAGE−A1、h5T4、PSMA、TAG−72、EGFRvIII、CD123、およびVEGF−R2のうちの少なくとも1つに結合する。

0032

一部の実施形態では、前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも1つは、少なくとも1つの組換えサイトカインをさらに発現する。一部の場合には、前記組換えサイトカインは、IL−15、mbIL−15、IL−2、IL−12、およびIL−21のうちの少なくとも1つを含む。場合によって、前記所定の結合パートナーを、サイトカインストームまたは全身性炎症性応答と関連する、少なくとも1つの症状の軽減を引き起こすのに十分な量で提供する。一部の実施形態では、前記所定の結合パートナーを、腫瘍溶解症候群と関連する、少なくとも1つの症状の軽減を引き起こすのに十分な量で提供する。一部の場合には、前記ポリペプチド構築物は、ゲノム編集により、前記操作細胞へと組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされる。場合によって、前記ゲノム編集は、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む。

0033

抗CD20抗体に結合するトランケート型非免疫原性CD20ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記トランケート型非免疫原性CD20ポリペプチドが、内因性受容体に結合しない、ポリヌクレオチドが提供される。

0034

一部の実施形態では、前記CD20ポリペプチドは、配列番号109に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、前記CD20ポリペプチドは、配列番号109の配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記CD20ポリペプチドは、天然native)CD20の、少なくとも50%、60%、70%、80%、または90%の結合効率で、前記抗CD20抗体に結合する。一部の実施形態では、前記抗CD20抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも1つを含む。

0035

少なくともHER1ドメインIIIまたはその断片と、トランケート型HER1ドメインIVとからなるトランケート型非免疫原性HER1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記HER1ポリペプチドが、抗HER1抗体に結合し、前記HER1ポリペプチドが、操作細胞内で発現される、ポリヌクレオチドが提供される。

0036

一部の実施形態では、前記トランケート型HER1ドメインIVは、前記HER1ドメインIVのうちの、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%のトランケーションを含む。

0037

場合によって、前記トランケート型HER1ドメインIVは、配列番号203、204、205、206、207、208、または209に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記トランケート型HER1ドメインIVは、配列番号203、204、205、206、207、208、または209に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記HER1ドメインIIIまたはその断片は、配列番号200に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、前記HER1ドメインIIIは、配列番号200に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。

0038

一部の場合には、前記ポリヌクレオチドは、CD28膜貫通ドメインと、前記HER1ポリペプチドを、前記CD28膜貫通ドメインへと共役するためのペプチドリンカーとをさらにコードする。場合によって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号57に示される配列を含むポリペプチド配列を含むポリペプチド構築物をコードする。一部の実施形態では、前記抗HER1抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも1つを含む。

0039

抗CD52抗体に結合するトランケート型非免疫原性CD52ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記トランケート型非免疫原性CD52ポリペプチドが、内因性受容体に結合せず、前記CD52ポリペプチドが、操作細胞内で発現される、ポリヌクレオチドが提供される。

0040

場合によって、前記CD52ポリペプチドは、配列番号143に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記CD52ポリペプチドは、配列番号143に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。

0041

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを、少なくとも1つの異種遺伝子をコードする、少なくとも1つの配列をさらに含む細胞内で発現させる。一部の実施形態では、前記少なくとも1つの異種遺伝子は、誘導性プロモーターによりモジュレートされる。一部の場合には、前記少なくとも1つの異種遺伝子は、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、およびサイトカインのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも1つの異種遺伝子は、CARを含み、前記CARは、CD19、CD33、BCMA、CD44、α−葉酸受容体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP−2、EGP−40、HER2、HER3、葉酸結合性タンパク質、GD2、GD3、IL−13R−a2、KDR、EDB−F、メソテリン、CD22、EGFR、MUC−1、MUC−16、MAGE−A1、h5T4、PSMA、TAG−72、EGFRvIII、CD123、およびVEGF−R2のうちの少なくとも1つに結合する。

0042

一部の実施形態では、前記少なくとも1つの異種遺伝子は、サイトカインを含む。一部の実施形態では、前記サイトカインは、IL−15、IL−2、IL−12、IL−21、およびIL−15とIL−IL−15Rαとの融合体のうちの少なくとも1つを含む。場合によって、前記サイトカインは、分泌形態である。一部の場合には、前記サイトカインは、膜結合形態である。

0043

一部の実施形態では、ベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。場合によって、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の場合には、前記非ウイルスベクターは、SleepingBeautyトランスポゾンである。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ゲノム編集により、操作細胞へと組み込まれる。一部の場合には、前記ゲノム編集は、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む。場合によって、操作細胞は、ポリヌクレオチドをコードする。場合によって、操作細胞は、T細胞またはNK細胞である。場合によって、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする。

0044

本明細書ではさらに、がんを処置する方法であって、対象へと、有効量の、ポリヌクレオチドを含む操作細胞を投与するステップを含む方法が提示される。一部の実施形態では、方法は、前記操作細胞上で発現させたポリペプチドへの結合が可能な、少なくとも1つの結合パートナーを投与するステップをさらに含む。場合によって、前記結合パートナーは、抗体である。

0045

本明細書では、対象における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、前記対象へと、第1のトランケート型非免疫原性ポリペプチドと、第2のトランケート型非免疫原性ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドである細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードする、ある量の遺伝子操作細胞を提供するステップであって、前記細胞表面ポリペプチドが、少なくとも1つの所定の結合パートナーまたはその変異体もしくは断片に結合する、ステップと;前記遺伝子操作細胞に結合し、これにより、これらの活性を調節するのに十分な量で、前記対象へと、前記所定の結合パートナーを提供するステップとを含む方法が提示される。

0046

一部の実施形態では、前記第1のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、EGFRファミリーメンバーの断片または誘導体を含む。場合によって、前記第2のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、EGFRファミリーのメンバーの断片または誘導体を含む。一部の場合には、前記第1のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、HER1ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、前記HER1ポリペプチドは、配列番号211、212、213、214、215、216、または217に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記HER1ポリペプチドは、配列番号211、212、213、214、215、216、または217に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。場合によって、前記HER1ポリペプチドは、配列番号211に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。

0047

場合によって、前記第2のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、HER2ポリペプチド、ErbB3ポリペプチド、およびErbB4ポリペプチドのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号89、配列番号93、配列番号97、配列番号101、または配列番号105に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

0048

一部の実施形態では、前記少なくとも1つの所定の結合パートナーは、前記HER1ポリペプチドに結合する。一部の場合には、前記少なくとも1つの所定の結合パートナーは、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも1つを含む。場合によって、前記少なくとも1つの所定の結合パートナーは、前記第2のトランケート型非免疫原性ポリペプチドに結合する、第2の所定の結合パートナーをさらに含む。場合によって、前記第2のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、HER2ポリペプチドであり、前記第2の所定の結合パートナーは、ペルツズマブである。

0049

一部の場合には、前記ポリペプチド構築物は、シグナルペプチドをさらに含む。一部の場合には、前記ポリペプチド構築物は、膜貫通ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、前記膜貫通ドメインは、膜貫通二量体化ドメインを含む。場合によって、前記膜貫通二量体化ドメインは、グリコホリンA膜貫通ドメイン、グリコホリンA−インテグリンβ3キメラ膜貫通ドメイン、またはCD3ゼータ膜貫通ドメインを含む。場合によって、前記膜貫通二量体化ドメインは、配列番号26、配列番号28、配列番号30、または配列番号32に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記膜貫通二量体化ドメインは、配列番号26、配列番号28、配列番号30、または配列番号32に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。

0050

一部の場合には、前記第1のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、CD20ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、前記CD20ポリペプチドは、配列番号218、配列番号219、または配列番号220に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、前記CD20ポリペプチドは、配列番号218、配列番号219、または配列番号220に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも1つの所定の結合パートナーは、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも1つを含む。

0051

HER1ドメインIIIと、トランケート型HER1ドメインIVとからなるトランケート型非免疫原性HER1ポリペプチドであって、抗HER1抗体に結合するHER1ポリペプチドと;CD28膜貫通ドメインと;前記HER1ポリペプチドを、前記CD28膜貫通ドメインへと共役するためのペプチドリンカーとを含むポリペプチド構築物であって、操作細胞内で発現されるポリペプチド構築物が提供される。

0052

一部の実施形態では、前記HER1ドメインIIIは、配列番号200に示される配列を含むポリペプチド配列を含み、前記HER1ドメインIVは、配列番号203に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記CD28膜貫通ドメインは、配列番号36に示される配列を含むポリペプチド配列を含み、前記ペプチドリンカーは、G4Sペプチドリンカー(配列番号221)を含む。場合によって、前記G4Sペプチドリンカー(配列番号221)は、配列番号22に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号57に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。

0053

場合によって、前記抗HER1抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも1つを含む。

0054

抗CD20抗体に結合するトランケート型非免疫原性CD20ポリペプチドを含むポリペプチド構築物であって、操作細胞内で発現されるポリペプチド構築物が提供される。

0055

一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号109に示される配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または99.5%の同一性を有する。場合によって、前記ポリペプチド構築物は、配列番号109に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記抗CD20抗体は、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも1つを含む。

0056

本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。

図面の簡単な説明

0057

リツキシマブを使用するフローサイトメトリーにより検出される、全長CD20細胞タグ(配列番号107に対応する)、およびトランケート型CD20(配列番号109に対応するCD20t1および配列番号115に対応するCD20t4)の2つの形態の、HEK−293T細胞内の、対照細胞タグと比較した発現レベルを示す図である。影を付した領域が、モックトランスフェクト対照細胞を描示するのに対し、影を付していない領域は、トランスフェクト細胞からの細胞タグの発現を描示する。各トランスフェクションは、三連で実施した。
両方の遺伝子をコードするSleepingBeautyトランスポゾンベクターを共トランスフェクトされたヒト末梢血単核細胞(PBMC)内(右パネル)の、CD20t1細胞タグ(配列番号109に対応する;y軸)、およびキメラ抗原受容体(CAR;x軸)の、非トランスフェクト細胞内(左パネル)と比較した共発現を示す図である。
CD20t−1をトランスフェクトされたJurkat細胞系内の、リツキシマブにより誘導される、特異的で用量依存的な、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用(誘導倍数により表される;y軸)を示す図である。非トランスフェクト親Jurkat細胞および非特異的抗体セツキシマブは、活性を示さなかった。
本明細書で記載されるポリペプチド構築物についての実施形態を例示する概略図である。上パネルは、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付けるためのシグナルペプチドと、天然ポリペプチドのトランケート型変異体と、任意選択のリンカーと、膜貫通(TM)ドメインとを含むポリペプチド構築物についての実施形態を示す。下パネルは、本明細書で記載される操作細胞内で発現させたポリペプチド構築物についての実施形態を例示する。ポリペプチド構築物は、任意選択のペプチドリンカーを介して、細胞外指向性トランケート型変異体と融合させた膜貫通(TM)ドメインにより、細胞表面へとアンカリングさせる。ある実施形態では、示されるリンカーは、トランケート型変異体を、細胞表面から方向付け、伸長させ、これにより、抗体または結合パートナー(抗トランケート型変異体抗体により表される)の、トランケート型変異体のエピトープへの結合を最適化する伸長部として用いられる。
本明細書で記載されるポリペプチド構築物についての実施形態を例示する概略図である。図4bでは、図4Aによるトランケート型変異体および任意選択のリンカーを、HER(m)ドメインIIIおよびHER(n)ドメインIVで置きかえる[mおよびnは、HER1、HER2、ErbB3、およびErbB4を含む、EGFR/HERファミリーの任意のメンバーを表す(すなわち、m=1〜4であり、n=1〜4であるが、nとmとは等しくない)]。ある実施形態では、示される、HER(m)ドメインIIIおよびHER(n)ドメインIVの各々は、異なる抗体(すなわち、それぞれ、抗HER(m)抗体および抗HER(n)抗体)により認識される、異なるエピトープを提示する。
図4BのHER(m)ドメインIIIが、抗EGFR抗体により認識されるEGFRドメインIIIであって、C末端において、HER2、ErbB3、またはErbB4のドメインIVに続きTMドメインへと融合させたEGFRドメインIIIに対応する、具体的実施形態を例示する概略図である。
異なるEGFR−Erb4キメラ(配列番号101に対応するトランケート型EGFR−ErbB4(JM−a)、および配列番号105に対応するトランケート型EGFR−ErbB4(JM−b))をトランスフェクトし、アイソタイプ対照(「アイソタイプ」)と比較した、抗HER1t抗体で染色した(「染色」)ヒトドナーPBMC内、およびHER1tをトランスフェクトされていないモック細胞内で発現させたトランケート型HER1(HER1t)ポリペプチドの発現を示す図である。
異なるHER1t変異体(配列番号57に対応するHER1t1、配列番号59に対応するHER1t2、配列番号61に対応するHER1t3、配列番号63に対応するHER1t4、配列番号65に対応するHER1t5、配列番号67に対応するHER1t6、および配列番号69に対応するHER1t7)をトランスフェクトされたヒトドナーPBMC内の、HER1tポリペプチドの、HER1tをトランスフェクトされていないモック細胞と比較した発現を示す図である。
HER1tまたはCARをトランスフェクトされていない対照細胞内(左パネル)と比較した、両方のタンパク質をコードするレンチウイルスベクターを共トランスフェクトされた細胞内(右パネル)のフローサイトメトリーにより測定される、HER1t1の発現(配列番号57に対応する;y軸)およびCARの発現(x軸)の、抗体ベースの検出を示す図である。
CAR単独(左パネル)およびHER1t1と併せたCAR(右パネル)をコードする、Sleeping Beautyトランスポゾンベクターをトランスフェクトされ、アイソタイプ対照(上パネル)と比較した、抗HER1抗体およびCAR特異的タンパク質(下パネル)により染色された細胞内の、HER1t1(配列番号57に対応する;y軸)およびCAR(x軸)のレベルを示す図である。
NK細胞内(左)、CD16 NK細胞内(中)、ならびにCARおよびHER1t1をトランスフェクトされたCD16 NK細胞内(右)の、セツキシマブおよびアレムツズマブにより媒介されるADCC活性(特異的殺滅%として表される;y軸)を示す図である。セツキシマブは、HER1t1の存在下における特異的ADCCを示した。
図7Aは、遺伝子改変SUP−T1レポーター細胞系(SUP−T1/CAR−HER1t1)内のフローサイトメトリーにより測定されるCARおよびHER1t1細胞タグ(配列番号57に対応する)の発現を示す図である。SUP−T1/CAR−HER1t1細胞系を、FACSにより分取して、フローサイトメトリーにより検出されたHER1t1発現の高レベル(中パネル)または中レベル(右パネル)について濃縮した。左パネルは、フローサイトメトリーのために、アイソタイプ抗体対照を使用する、SUP−T1/CAR−HER1t1の染色を示す。図7Bは、HER1t1発現およびセツキシマブの用量レベルに依存する、セツキシマブにより誘導される、SUP−T1/CAR−HER1t1細胞系の特異的ADCC(誘導倍数により表される;y軸)を示す図である。非特異的抗体リツキシマブは、SUP−T1/CAR−HER1t1に対するADCCを示さなかった。
遺伝子改変されたSUP−T1細胞系内の、HER1t1細胞タグの発現を示すウェスタンブロット解析を示す図である。レーン1:IP抗体のみ;レーン2:Jurkat細胞のみ;レーン3:SUPT1/HER1t1(高レベルのHER1t1);レーン4:SUPT1/HER1t1(低レベルのHER1t1);レーン5:全長HER1を発現するA431細胞;レーン6:マーカーである。太字矢印は、A431を除く全ての細胞系内で、セツキシマブによりプルダウンされたタンパク質を指示する。HER1t1は、配列番号57に対応する。
セツキシマブまたは非特異的抗体であるリツキシマブの存在下における、ADCC(左パネル)およびCDC(右パネル)による、HER1t1細胞タグを共発現するCD19 CAR−T細胞の消失の有効性を示す図である。
本明細書で記載されるポリペプチド構築物についての、異なる実施形態を示す概略図である。第1世代トランケート型細胞タグ(上)は、任意選択のペプチドリンカーにより接続されたトランケート型変異体と、非二量体化膜貫通ドメイン(TM)とを含む。次世代トランケート型細胞タグ(下パネル)は、細胞表面上の、トランケート型変異体の二量体化を容易とする、膜貫通二量体化ドメイン(TM−A)を含む。いずれの場合にも、抗トランケート型変異体抗体は、トランケート型変異体上のエピトープに結合する。
CD19 CARと、HER1t細胞タグとを共発現するように改変された初代T細胞内の、CD19 CARの発現レベルを裏付ける図である。用いられるHER1t細胞タグは、CD19 CAR単独を発現する(親に対する%)T細胞と比較して、膜貫通二量体化ドメインを伴うトランケート型HER1ポリペプチド(変異体である、配列番号71に対応するHER1t8、配列番号75に対応するHER1t9、および配列番号79に対応するHER1t10)、および膜貫通二量体化ドメインを伴わないトランケート型HER1ポリペプチド(配列番号57に対応するHER1t1)を含む。
CD19 CARと、HER1t細胞タグとを共発現するように改変された初代T細胞内の、HER1t細胞タグの発現レベルを裏付ける図である。用いられるHER1t細胞タグは、CD19 CAR単独を発現する(親に対する%)T細胞と比較して、膜貫通二量体化ドメインを伴うトランケート型HER1ポリペプチド(変異体である、配列番号71に対応するHER1t8、配列番号75に対応するHER1t9、および配列番号79に対応するHER1t10)、および二量体化ドメインを伴わないトランケート型HER1ポリペプチド(配列番号57に対応するHER1t1)を含むポリペプチド構築物を含む。
図13Aおよび13Bは、セツキシマブにより媒介される、二量体化ドメインを伴うトランケート型HER1ポリペプチド(変異体である、配列番号71に対応するHER1t8、配列番号75に対応するHER1t9、および配列番号79に対応するHER1t10)を含むポリペプチド構築物を共発現するCD19 CAR−T標的細胞に対するADCC(特異的溶解%により表される;y軸)の、二量体化ドメインを伴わないトランケート型HER1ポリペプチド(配列番号57に対応するHER1t対照)を含むポリペプチド構築物によるADCCよりも優れた効果を示す図である。NK細胞を、エフェクター細胞として用いた。リツキシマブを、ADCCアッセイのための非特異的抗体対照として用いた。
同上。
セツキシマブ媒介性ADCCによる、HER1t1を発現する遺伝子改変T細胞(CD19 CAR−mbIL−15−T細胞)の選択的消失を示す図である。

0058

以下の記載および例は、本発明の実施形態について、詳細に例示する。本発明は、本明細書で記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、変動しうることを理解されたい。当業者は、本発明には、多数の変動および改変がなされ、これらは、その範囲内に包含されることを認識するであろう。

0059

全ての用語は、それらが、当業者により理解される通りに理解されることを意図する。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。

0060

本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される主題を限定するものと見なすべきではない。

0061

本発明の多様な特色は、単一の実施形態の文脈で記載しうるが、特色はまた、個別に提示される場合もあり、任意の適切な組合せで提示される場合もある。逆に、本明細書では、明確さのために、本発明を、個別の実施形態の文脈で記載しうるが、本発明はまた、単一の実施形態でも、実施することができる。

0062

以下の定義は、当技術分野における定義を補完し、本出願へと方向付けられ、いかなる関連または非関連の案件、例えば、共同所有される、いかなる特許または出願にも帰属しない。本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法および材料を、本開示の試験の実施において使用しうるが、本明細書では、好ましい材料および方法について記載する。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではない。

0063

本出願では、そうでないことが別段に言明されない限りにおいて、単数形の使用は、複数形を含む。本明細書で使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」は、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。本出願では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および/または」を意味する。さらに、「〜を含むこと」という用語のほか、「〜を含む(include)」、「〜を含む(includes)」、および「含まれた」など、他の形態の使用は、限定的ではない。

0064

本明細書における、「一部の実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、または特徴が、本発明の、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、全ての実施形態には、必ずしも含まれないことを意味する。

0065

本明細書および特許請求の範囲で使用される「〜を含むこと(comprising)」(「〜を含む(comprise)」および「〜を含む(comprises)」など、「〜を含むこと(comprising)」の任意の形態)、「〜を有すること」(「〜を有する(have)」および「〜を有する(has)」など、「〜を有すること」の任意の形態)、「〜を含むこと(including)」(「〜を含む(include)」および「〜を含む(includes)」など、「〜を含むこと(including)」の任意の形態)、または「〜を含有すること」(「〜を含有する(contain)」および「〜を含有する(contains)」など、「〜を含有すること」の任意の形態)という語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。さらに、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。

0066

本明細書で使用される基準数値およびその文法同等物に関する、「約」という用語およびその文法的同等物は、数値自体と、この数値±10%の範囲の値とを含みうる。例えば、「約10」という量は、9〜11の、任意の量を含む。例えば、基準数値との関係における「約」という用語はまた、値±この値から10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%の範囲も含む。

0067

「単離」とは、その天然環境からの核酸摘出を意味する。「精製」とは、所与の核酸が、天然から摘出されたもの(ゲノムDNAおよびmRNAを含む)であれ、合成されたもの(cDNAを含む)であれ、かつ/または検査室条件下で増幅されたのであれ、純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であり、「絶対純度」ではないことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているものとしうることを理解されたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、許容可能な担体または希釈剤と混合することが典型的である。

0068

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドポリマー形態を指す。この用語は、分子一次構造だけを指す。したがって、この用語は、二本鎖DNAおよび一本鎖DNA三重鎖DNAのほか、二本鎖RNAおよび一本鎖RNAも含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチル化および/またはキャッピングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含みうる。用語はまた、天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドのほか、ヌクレオチド類似体を含む分子を含むことも意図する。

0069

「ポリペプチド」は、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語と互換的に使用され、アミノ酸残基ポリマーを指す。「成熟タンパク質」とは、全長タンパク質であり、任意選択で、グリコシル化または所与の細胞内環境内のタンパク質に典型的な他の修飾を含むタンパク質である。

0070

本明細書で開示されるポリペプチドおよびタンパク質(これらの機能的部分および機能的変異体を含む)は、1または複数の、天然のアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含みうる。当技術分野では、このような合成アミノ酸が公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸ノルロイシン、α−アミノn−デカン酸ホモセリン、S−アセチルアミノメチルシステイン、trans−3−ヒドロキシプロリンおよびtrans−4−ヒドロキシプロリン、4−アミノフェニルアラニン、4−ニトロフェニルアラニン、4−クロロフェニルアラニン、4−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシンインドリン−2−カルボン酸、1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N’−ベンジル−N’−メチルリシン、N’,N’−ジベンジルリシン、6−ヒドロキシリシンオルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−(2−アミノ−2−ノルボルナン)カルボン酸、α,γ−ジアミノ酪酸、α,β−ジアミノプロピオン酸ホモフェニルアラニン、およびα−tert−ブチルグリシンを含む。本開示は、操作細胞内の、本明細書で記載されるポリペプチドの発現が、ポリペプチド構築物の、1または複数のアミノ酸の翻訳後修飾と関連しうることをさらに想定する。翻訳後修飾の非限定例は、リン酸化アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化(N連結型およびO連結型を含む)、アミド化ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化ユビキチン化ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化ミリストイル化パルミトイル化イソプレニル化ファルネシル化ゲラニル化、グリオン化、リポイル化、およびヨード化を含む。

0071

本明細書で使用される「抗体」とは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。全抗体は、典型的に、4つのポリペプチド:重(H)鎖ポリペプチドの2つの同一なコピー、および軽(L)鎖ポリペプチドの2つの同一なコピーからなる。重鎖の各々は、1つのN末端可変(VH)領域と、3つのC末端の定常(CH1、CH2、およびCH3)領域とを含有し、各軽鎖は、1つのN末端の可変(VL)領域と、1つのC末端の定常(CL)領域とを含有する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、抗体の抗原結合性部位を形成する。VH領域と、VL領域とは、各領域が、それらの配列が比較的保存されている、4つのフレームワーク領域を含む、共通の一般的な構造を有する。フレームワーク領域は、3つの相補性決定領域(CDR)により接続されている。CDR1、CDR2、およびCDR3として公知である、3つのCDRは、抗原への結合の一因となる、抗体の「超可変領域」を形成する。

0072

抗原認識部分またはドメイン」とは、抗原に特異的に結合する分子または分子の部分を指す。一部の実施形態では、抗原認識部分は、抗体、抗体様分子、またはこれらの断片であり、抗原は、腫瘍抗原である。

0073

「抗体様分子」は、例えば、パートナーに選択的に結合することが可能な、Igスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質でありうる。MHC分子およびT細胞受容体は、このような分子である。一部の実施形態では、抗体様分子は、TCRである。一部の実施形態では、TCRは、そのMHCへの結合アフィニティーを増大させるように改変されている。

0074

本明細書では、「抗体の断片」、「抗体断片」、「抗体の機能的断片」、および「抗原結合性部分」という用語を、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の、1または複数の断片または部分を意味するように、互換的に使用する(一般に、Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005)を参照されたい)。抗体断片は、例えば、1もしくは複数のCDR、可変領域(またはその部分)、定常領域(またはその部分)、またはこれらの組合せを含むことが所望される。抗体断片の例は、(i)VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一価断片である、Fab断片;(ii)ストーク領域におけるジスルフィド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価断片である、F(ab’)2断片;(iii)抗体の単一のアームのVLドメインおよびVHドメインからなる、Fv断片;(iv)2つのドメインを、単一のポリペプチド鎖として合成することを可能とする合成リンカーにより接合された、Fv断片の2つのドメイン(すなわち、VLおよびVH)からなる一価分子である、単鎖Fv(scFv)(例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); and Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)を参照されたい);ならびに(v)各ポリペプチド鎖が、同じポリペプチド鎖上のVHとVLとの間の対合を可能とするには短すぎるペプチドリンカーにより、VLへと接続されたVHを含み、これにより、2つの機能的な抗原結合性部位を有する二量体分子を作出するように、異なるVH−VLポリペプチド鎖上の相補的ドメインの間の対合を駆動する、ポリペプチド鎖の二量体である、ダイアボディーを含むがこれらに限定されない。当技術分野では、抗体断片が公知であり、例えば、米国特許第8,603,950号明細書において、より詳細に記載されている。

0075

核酸および/または核酸配列は、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および/またはタンパク質配列は、それらのコードDNAが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、相同である。相同な分子は、相同体と称する場合がある。例えば、本明細書で記載される、任意の天然タンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発法により修飾することができる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパク質と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、2つまたはこれを超える核酸またはタンパク質(またはこれらの配列)の間の配列同一性から推定される。相同性を確立するのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と共に変動するが、少なくとも25%の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベルの配列同一性、例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは99%、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに使用することができる。

0076

ポリペプチドの、2つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、「同一」または「配列同一性」という用語は、指定された比較域にわたり、最大の照応関係についてアライメントされた場合に同じである、2つの配列内の残基を指す。一部の実施形態では、本明細書におけるポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、BLASTP(もしくはCLUSTAL、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア)により測定される通り、基準ポリペプチドまたはその断片と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、98%の99%、または100%同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸に照らして記載することもでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、BLASTN(もしくはCLUSTAL、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア)により測定される通り、基準核酸またはその断片と50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、98%、99%、または100%同一でありうる。1つの分子が、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するという場合、これは、2つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、前記百分率の残基は、2つの分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基を見出すことを意味する。

0077

「トランスポゾン」または「転移性エレメント」(TE)とは、ゲノム内のその位置を変化させ、場合によって、突然変異創出または保存し、細胞のゲノムサイズを変更する、ベクターDNA配列である。転移は、TEの重複を結果としてもたらすことが多い。クラスIのTEは、2段階でコピーされる:まず、クラスIのTEは、DNAからRNAへと転写され、次いで、産生されたRNAは、DNAへと逆転写される。次いで、この、コピーされたDNAは、ゲノム内の新たな位置へと挿入される。逆転写ステップは、TE自身によりコードされうる、逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特徴は、HIVなどのレトロウイルスと同様である。クラスIIのTEによるカットアンドペースト転移機構は、RNA中間体を伴わない。転移は、いくつかのトランスポザーゼ酵素により触媒される。あるトランスポザーゼは、DNA内の任意の標的部位に非特異的に結合するのに対し、他のトランスポザーゼは、特異的DNA配列標的に結合する。トランスポザーゼは、標的部位において、互い違いの(staggered)切断をもたらす結果として、5’側または3’側における、一本鎖のDNA突出(粘着(sticky)末端)をもたらす。このステップは、DNAトランスポゾンを切り出し、次いで、DNAトランスポゾンは、新たな標的部位へとライゲーションされるが、この過程は、ギャップを埋めるDNAポリメラーゼの活性と、糖リン酸骨格つなぎ合わせるDNAリガーゼの活性とを伴う。これは、標的部位の重複を結果としてもたらす。DNAトランスポゾンの挿入部位は、標的DNA内が互い違いに切断され、DNAポリメラーゼにより埋められることにより創出されうる短い直接的なリピート、ならびにそれらに続く、トランスポザーゼによるTEの切出しに重要な一連逆位リピートにより同定されうる。細胞周期のS期において、ドナー部位は既に複製されているが、標的部位はまだ複製されていない場合に転移が生じるとカットアンドペーストTEは重複される。転移は、クラスI TEおよびクラスII TEのいずれにおいても、「自律型」または「非自律型」として分類することができる。自律型TEが、それ自身で移動しうるのに対し、非自律型TEは、移動するのに、別のTEの存在を必要とする。これは、非自律型TEが、トランスポザーゼ(クラスIIの場合)または逆転写酵素(クラスIの場合)を欠くためであることが多い。

0078

「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機構または複製性転移機構による、トランスポゾンの、ゲノムの別の部分への移動を触媒する酵素を指す。一部の実施形態では、トランスポザーゼの触媒活性を用いて、遺伝子を、ベクターからゲノムへと移動させることができる。

0079

本明細書で開示または想定される核酸配列およびベクターは、細胞へと、「トランスフェクション」、「形質転換」、「ヌクレオフェクション」または「形質導入」により導入することができる。本明細書で使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、1または複数の外因性ポリヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野では、多くのトランスフェクション法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムDNA共沈殿法(例えば、Murray E. J. (ed.), Methodsin Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)を参照されたい);DEAEデキストラン法;電気穿孔法カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法;タングステン粒子促進型遺伝子銃法(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990));リン酸ストロンチウム共沈殿法(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987));およびヌクレオフェクション(Trompeter et al., J. Immunol. Methods 274:245-256 (2003))を含む。ファージベクターまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケージング細胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。

0080

本明細書で使用される「腫瘍抗原」とは、腫瘍細胞内で産生されるかまたは過剰発現する、任意の抗原性物質を指す。腫瘍抗原は、例えば、宿主における免疫応答を誘発しうる。代替的に、本開示の目的では、腫瘍抗原は、健常細胞および腫瘍細胞のいずれもが発現するが、ある特定の腫瘍型を同定するため、適切な治療標的であるタンパク質でありうる。

0081

プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す。プロモーターは、DNAの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、上流に(センス鎖の5’側領域に向かって)位置する。あるプロモーターが、細胞内の全ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、誘導性プロモーターは、特異的刺激応答して調節され、活性となる。

0082

プロモーター活性」という用語は、その活性が測定されるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるRNA転写物の量を決定することにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することもできる。

0083

本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーターテトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部である。

0084

本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結された核酸配列の転写を増大させるDNA配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、DNAのメチル化パターン、またはDNA構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である(例えば、ATCCなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から)。プロモーター(一般に使用されるCMVプロモーターなど)を含む、多数のポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあり、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Igエンハンサー」という用語は、免疫グロブリン(Ig)遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に由来するエンハンサーエレメント(このようなエンハンサーは、例えば、重鎖(ミュー)5’側エンハンサー、軽鎖(カッパ)5’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに3’側エンハンサーを含む)を指す(一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363、および米国特許第5,885,827号明細書を参照されたい)。

0085

本明細書で使用される「コード配列」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。領域または配列には、5’末端の近傍では、開始コドンが結合し、3’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディングフレームと称することもできる。

0086

本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、DNAセグメントの、別のDNAセグメントへの、物理的な連結および/または機能的な連結であって、セグメントが、それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコードするDNA配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および/またはサイレンサーなどの調節配列に、DNA配列の転写のモジュレーションを、直接的または間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている。例えば、DNA配列は、それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲーションされており、DNA配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。エンハンサーまたはサイレンサーは、それが、それぞれ、DNA配列の転写を増加または減少させるように、DNA配列へとライゲーションされている場合に、遺伝子産物をコードするDNA配列に作動可能に連結されている。エンハンサーおよびサイレンサーは、DNA配列のコード領域の上流に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナル配列のDNAは、ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結されている。DNA配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションにより、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、アダプターまたはリンカーを介して達せられる。

0087

「転写調節因子」という用語は、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性DNA配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント(例えば、リプレッサータンパク質または核阻害性タンパク質)、または、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性DNA配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化学的エレメント(例えば、インデューサーまたはエンハンサー)を指す。

0088

「誘導」という用語は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモーターの活性、および/またはプロモーターの発現の、何らかの転写基礎レベルと比べた上昇を指す。

0089

「標的」遺伝子または「異種」遺伝子または「目的の遺伝子(GOI)」とは、遺伝子導入により宿主細胞へと導入される遺伝子を指す。

0090

本明細書で使用される「リコンビナーゼ」とは、規定された部位の間の部位特異的組換えを容易としうる酵素群であって、部位が、単一のDNA分子上で物理的に隔てられているか、または部位が、別個のDNA分子上に存在する、酵素群を指す。規定された組換え部位のDNA配列は、必ずしも同一ではない。組換えの開始は、タンパク質−DNA間相互作用に依存し、酵素群内には、ファージの組込みおよび切出し(例えば、λインテグラーゼ、ΦC31)、環状プラスミドの切断(resolution)(例えば、Tn3、ガンマデルタ、Cre、Flp)、代替的遺伝子の発現のためのDNAの反転(例えば、Hin、Gin、Pin)、発生時における遺伝子(例えば、アナベナ属(Anabaena)による窒素固定遺伝子)のアセンブリ、および転移(例えば、IS607トランスポゾン)を触媒する、多数のタンパク質が存在する。大半の部位特異的リコンビナーゼは、進化的類縁性および機構的類縁性に基づき、2つのファミリーのうちの1つに収まる。これらは、λインテグラーゼファミリーまたはチロシンリコンビナーゼ(例えば、Cre、Flp、XerD)、およびレゾルバーゼ/インテグラーゼファミリー、またはセリンリコンビナーゼファミリー(例えば、ΦC31、TP901−1、Tn3、ガンマデルタ)である。

0091

「組換え接合部位」とは、本明細書で記載されるリコンビナーゼ酵素により認識される、特異的ポリヌクレオチド配列である。典型的に、1つの部位が、標的核酸(例えば、真核生物または原核生物染色体またはエピソーム)内に存在し、別の部位が、標的組換え部位において統合される核酸上に存在する、2つの異なる部位(「相補的部位」と称する)が関与する。本明細書では、それぞれ、細菌標的およびファージドナーに由来する、接合(または組換え)部位を指す、「attB」および「attP」という用語が使用されるが、特定の酵素のための組換え部位は、異なる名称を有しうる。組換え部位は、典型的に、コア領域またはスペーサー領域により隔てられた、左側アームおよび右側アームを含む。したがって、attB組換え部位は、BOB’[配列中、BおよびB’は、それぞれ、左側アームおよび右側アームであり、Oは、コア領域である]からなる。同様に、attPとは、POP’[配列中、PおよびP’は、アームであり、Oは、ここでもまた、コア領域である]である。attB部位と、attP部位との組換え時、および標的における、同時の核酸の組込み時に、組み込まれるDNAを挟む組換え部位を、「attL」および「attR」と称する。したがって、上記の用語法を使用する、attL部位およびattR部位は、それぞれ、BOP’およびPOB’’からなる。本明細書における一部の表示では、「O」を省き、attBおよびattPを、例えば、それぞれ、BB’およびPP’と呼ぶ。

0092

「遺伝子編集」または「ゲノム編集」という用語は、生物のゲノム内のDNAのヌクレオチドの挿入、欠失、または置きかえを指す。典型的に、ゲノム編集は、ゲノムの所定の位置において、部位特異的二本鎖切断を創出しうる、操作ヌクレアーゼを使用する。本開示は、ゲノムを編集するための任意の手段を想定する。ゲノム編集法の非限定的な例は、CRISPR、Argonaute、およびAttSite部位特異的セリンリコンビナーゼ系を含む。本明細書では、「CRISPR遺伝子編集系」(CRISPR gene editing system)または「CRISPR系」(CRISPR system)とは、DNA配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲティングするための、任意のRNA誘導型のCasタンパク質媒介性過程を指す。本明細書では、「Argonaute遺伝子編集系」とは、DNA配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲティングするための、任意の一本鎖DNA誘導型のArgonauteエンドヌクレアーゼ媒介性過程を指す。本明細書では、「AttSite遺伝子編集系」または「部位特異的セリンリコンビナーゼ遺伝子編集系」または「部位特異的セリンリコンビナーゼ系」とは、第1の組換え接合部位および第2の組換え接合部位を含む真核細胞を用意するステップと;第1の組換え接合部位および第2の組換え接合部位を、原核細胞リコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え部位の間の組換えをもたらすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドが、第1の組換え接合部位と、第2の組換え接合部位との組換えを媒介することが可能であり、第1の組換え接合部位が、ファージゲノム組換え接合部位(attP)、または細菌ゲノム組換え接合部位(attB)であり、第2の組換え接合部位が、attBまたはattPであり、第1の組換え接合部位が、attBである場合、第2の組換え接合部位が、attPであり、第1の組換え接合部位が、attPである場合、第2の組換え接合部位が、attBであるという条件で、リコンビナーゼが、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)のファージリコンビナーゼ、枯草菌(Bacillus subtilis)のファージリコンビナーゼ、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)のファージリコンビナーゼからなる群から選択される、任意の工程を指す。AttSiteセリンリコンビナーゼ系についての実施形態の例は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第9,034,650号明細書において提示されている。

0093

本明細書で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの分子に言及して使用される「内因性」という用語は、野生型の細胞または生物において見出されうる分子の、天然の形態を指す。生物において内因的に見出される分子は、典型的に、天然のものではない、本明細書で記載される操作分子と対比することができる。例えば、操作分子は、天然のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの変異体を含みうる。一部の実施形態では、天然のポリペプチドの変異体は、天然のポリペプチドのトランケート型変異体である。本明細書では、「トランケート型変異体」という用語は、アミノ酸による1または複数の配列および/またはドメインを、タンパク質またはポリペプチドの内因性変化形と比べて逸失している、タンパク質またはポリペプチドを指す。例えば、本明細書で記載されるポリペプチド構築物へと組み込まれたトランケート型変異体は、通常、内因性タンパク質内に存在するドメイン(例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、リガンド結合ドメインなど)に対応するアミノ酸の配列を逸失している場合がある。トランケート型ポリペプチドの天然変化形は、マウスラットウサギ、およびヒトなどの哺乳動物種を含む、任意の生物に由来しうる。本明細書で記載される操作ポリヌクレオチドおよび操作ポリペプチドは、操作細胞内で発現させうる。本明細書では、操作細胞は、その天然状態または内因性状態から改変された細胞である。操作細胞の例は、天然ポリペプチドのトランケート型変異体または天然ポリヌクレオチドのトランケート型変異体をコードするように改変された(例えば、細胞へのポリヌクレオチドのトランスフェクションにより)、本明細書で記載される細胞である。

0094

ポリペプチド構築物
本明細書では、ポリペプチド構築物、これをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド構築物およびポリヌクレオチドを保有し、かつ/または発現する操作細胞、ならびに操作細胞の活性を調節する方法が開示される。本明細書で記載される操作細胞は、サイトカイン、キメラ抗原受容体、およびT細胞受容体をコードし、かつ発現するように操作された免疫エフェクター細胞を含みうる。

0095

本明細書で、操作細胞またはその中で発現させるポリペプチド構築物に言及して使用される場合の「〜を調節すること」または「調節」という用語は、一般に、対象への投与の後における、操作細胞の活性または量の調節を指す。一部の実施形態では、操作細胞の活性の調節とは、対象における操作細胞の枯渇を指す。一部の実施形態では、操作細胞の活性の調節とは、対象へと、ある量の、操作細胞上で発現させたポリペプチド構築物に結合する抗体または結合パートナーを投与する結果としての、対象における、一部の操作細胞の枯渇を指す。一部の実施形態では、操作細胞の活性の調節とは、抗体または結合パートナーの、前記操作細胞上で発現させるか、またはこれと関連する、本明細書で記載されるポリペプチド構築物への結合を介して、細胞死を活性化させる結果としての、操作細胞の枯渇を指す。一部の実施形態では、操作細胞の活性の調節とは、操作細胞内のADCC経路またはCDC経路を活性化させることを指す。

0096

本明細書で開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、および操作細胞は、まとめて、従来型の免疫療法の有効性を改善し、特に、養子細胞療法の有効性を改善するのに使用しうる、一連の治療的ツールを表す。例えば、本明細書で記載される操作細胞は、細胞表面において、新規の細胞タグとして、ポリペプチド構築物をコードし、これを発現しうる。一部の実施形態では、細胞タグは、細胞タグを発現する細胞を、操作細胞として、標識化するか、マークするか、またはFlagタグ付けする(flag)、細胞マーカーとして機能しうる。複数の実施形態では、細胞タグを、内因性タンパク質により認識されるエピトープを欠くように操作した場合、このような細胞タグは、例えば、養子細胞免疫療法時に、生物において、操作細胞を、他の細胞から固有に識別するように機能しうる。

0097

他の例では、本明細書で記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、および操作細胞を使用して、安全性が懸念される(例えば、サイトカインストームの発生に対する潜在的可能性に起因して)場合に、対象における免疫療法の毒性を、最小化するか、または消失させることができる。本明細書で記載される細胞タグは、免疫療法時に導入される抗体により認識されて、これにより、治療的アウトプット緩徐化し、かつ/または治療の可能な副作用を軽減する細胞機構を誘導する、1または複数のエピトープを含みうる。一部の実施形態では、抗体は、エピトープに結合して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害作用(CDC)を誘導する。したがって、本明細書で記載される細胞タグは、医療従事者が、治療的アウトプットを制御し、これにより、治療の有効性および安全性を最適化することを可能とする、操作細胞に固有の枯渇マーカーまたは「キルタグ」をもたらしうる。

0098

本明細書で記載される免疫療法的手段は、養子細胞療法的介入に対する制御への潜在的可能性をもたらすことにより、従来型の免疫療法を改善する。一部の実施形態では、操作細胞は、操作細胞の表面で、二量体化または多量体化することが可能なポリペプチド構築物を発現させることにより、細胞枯渇戦略に対して感作されうる。このような二量体化ポリペプチドまたは多量体化ポリペプチドを使用して、枯渇シグナルを増幅し、これにより、治療と関連する副作用を受けやすいか、またはこれを被りつつある対象における操作免疫細胞療法を、迅速に下方調節するか、または消失させることができる。二量体化ポリペプチド構築物または多量体化ポリペプチド構築物を発現する操作細胞の投与は、細胞枯渇による介入に対する、さらなる制御および最適化をもたらしうる。さらなる実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチド構築物の、誘導性プロモーターを用いる「キルスイッチ」(または「自殺スイッチ」)系としての実装は、特定のポリペプチド構築物を発現させる時点に対する制御を可能とし、これにより、転写レベルおよび翻訳後レベルの両方において、免疫療法に対する、さらなる制御点を付与しうる。

0099

別の実施形態では、本明細書で記載される細胞タグを使用して、このような細胞タグを特異的に発現する操作細胞を濃縮することができる。例えば、治療目的の選択された細胞の拡大を可能とするのに必要な純度を達成するために、細胞タグを使用して、このような細胞タグのみを発現するある特定の操作細胞を単離するように、ある特定の操作細胞を濃縮することができる。必要に応じて、FAC、カラムによる精製、または磁気ビーズベースの方法など、多様な方法を用いることができる。

0100

本明細書で開示されるポリペプチド構築物は、1もしくは複数のドメインまたはこれらの特異的断片を含みうる。典型的に、ポリペプチド構築物は、それらの各々が、所望される特定の特性を、ポリペプチド構築物へと付与するように機能する、シグナルペプチド配列、細胞外ドメイン、ペプチドリンカー、および膜貫通ドメインを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物を、翻訳後に、細胞表面へと方向付ける、シグナルペプチドと;ポリペプチドドメインを、細胞へとアンカリングする膜貫通ドメインと;天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含みうる、細胞外部分と;膜貫通ドメインを、細胞外部分へと接続するペプチドリンカーとを含みうる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ポリペプチドの細胞外部分を、細胞外マトリックス内に配置し、これにより、この部分を、細胞タグの機能性を付与する(例えば、抗体に結合するためのアクセスを与えるエピトープを提示するか、または伸長させる)のに利用可能とする、細胞外のペプチド伸長部として機能する。ある特定の実施形態では、上記のドメインのうちの1または複数は、ポリペプチド構築物内に存在しない場合もある。例えば、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を、ペプチドリンカードメインを欠くように操作することができる。他の実施形態では、ポリペプチド構築物は、異なるタンパク質に由来する(すなわち、ポリペプチド構築物は、キメラである)、1または複数のドメインを含む。

0101

本明細書で、ポリペプチド構築物の部分に言及して使用される場合の「細胞外」という用語は、細胞膜の外側に位置するポリペプチドのアミノ酸を指す。一部の実施形態では、細胞外部分は、細胞表面ポリペプチドと称することができる。典型的に、細胞表面ポリペプチドの部分(例えば、遠位部分)は、遠位において、細胞の細胞膜から、細胞外腔へと伸長または突出する。一部の場合には、伸長部分は、伸長部分の構造と相補的であり、かつこれに特異的な構造を有する抗体または抗原認識ポリペプチドに結合し、これにより、これらに認識される。細胞表面ポリペプチドは、細胞表面において天然に見出される、ポリペプチドまたはその断片のほか、天然では、細胞表面において見出されない、ポリペプチドまたはその断片(例えば、天然ポリペプチドのトランケート型変異体)を包含しうる。

0102

細胞外部分または細胞表面ポリペプチドは、天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含みうる。トランケート型変異体は、例えば、細胞膜(例えば、膜貫通ドメインへと接続されるか、またはこれと隣接するリンカーを介して)の外側から、細胞外腔へと伸長しうる。ある特定の実施形態では、トランケート型変異体は、ポリペプチドの天然変化形では、細胞内ドメインおよび/または膜貫通ドメインに寄与するアミノ酸を逸失している。トランケート型変異体は、細胞タグの細胞外部分をもたらすように、任意の形で、内因性ポリペプチドから修飾することができる。例えば、トランケート型変異体は、通常、抗原または受容体などの内因性タンパク質により認識されうる、細胞外ドメイン内のエピトープを含むように機能するアミノ酸を低減するか、または消失させるように修飾することができる。通常、(例えば、細胞シグナル伝達経路内で)細胞外分子とのインターフェースをなすアミノ酸を除去することにより、トランケート型変異体を、細胞表面において、非反応性であるか、または免疫学的/エピトープ的にサイレントとすることもでき、内因性分子との、その反応性もしくは結合を、低減もしくは最小化することもできる。本明細書では、天然エピトープを除去する、天然ポリペプチドに対する、任意の修飾であって、細胞外ドメインの全部または一部のトランケーション、およびエピトープの一部を形成するか、またはエピトープの一部を形成するように翻訳後修飾される、1または複数のアミノ酸の除去を含む修飾が想定される。

0103

本明細書で記載されるトランケート型変異体は、内因性シグナル伝達経路に関して、エピトープ的にサイレントであるが、トランケート型変異体は、通常、本明細書で記載される操作細胞に対応する細胞表面に接触しない分子(例えば、抗体)による認識が可能な、1または複数のエピトープを含みうる。一部の実施形態では、トランケート型変異体のエピトープに特異的な抗体または結合パートナーを、外因的に(例えば、養子細胞を使用する免疫療法時に)導入する。この点で、導入される抗体またはその断片による認識が可能な、トランケート型変異体のエピトープは、休眠エピトープまたは静止エピトープと称することができる。すなわち、養子免疫療法に使用される操作細胞の細胞表面に組み込まれる細胞タグは、適正な分子を、対象へと導入して、細胞タグ誘因か、またはこれ活性化させる(すなわち、エピトープの認識を介して)まで、休眠状態にあるエピトープを含有しうる。このようなエピトープは、治療が所望される通りに進行している場合には、操作細胞の治療アウトプットに干渉しない(すなわち、エピトープが、サイレントまたは静止を維持する)が、任意の理由で、免疫療法を緩和する必要がある場合には、細胞のアウトプットを下方調節するように活性化させうる誘因をもたらす。本開示は、このような細胞の消失(例えば、ADCC、またはCDCを介する)を介して、タグを発現する操作細胞の治療的アウトプットを抑制するように、細胞タグのエピトープを認識することが可能な、任意の抗体または低分子の使用を想定する。細胞タグの細胞外ドメイン(例えば、トランケート型変異体)のエピトープを認識するのに使用されうる抗体の非限定的な例は、リツキシマブ、セツキシマブ、ゲフィチニブエルロチニブ、アファニブブリガチニブ、イコチニブ、オシメルチニブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、オファツムマブオカラツズマブ、オクレリズマブ、TRU−015(Trubion)、ベルツズマブ(IMMU−106)、アレムツズマブ、ANT1034、HI186(Bio Rad)、YTH34.5(Bio Rad)、およびYTH66.9HL(Bio−Rad)、トラスツズマブ、およびペルツズマブを含む。

0104

本明細書で想定されるトランケート型変異体を作製するのに、内因性ポリペプチドに対して施されうる修飾の別の例は、通常、細胞内シグナル伝達経路および/またはトラフィッキング経路に寄与または参与する、1または複数のアミノ酸を除去することである。シグナル伝達ドメインを除去する、内因性ポリペプチドのトランケーションは、その休眠状態において、細胞の機能(例えば、養子細胞療法時の養子細胞内の)に干渉しない、休眠的で誘導性の細胞マーカーとしての細胞タグの機能を強化する。

0105

一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の細胞表面ポリペプチドは、受容体チロシンキナーゼのトランケート型変異体を含みうる。非限定的な例は、EGF受容体ファミリー(例えば、HER1のトランケート型変異体)、PDGF受容体ファミリー、VEGF受容体ファミリー、インスリン受容体ファミリー、FGF受容体ファミリー、Trk受容体ファミリー、およびEph受容体ファミリーの受容体に由来するトランケート型変異体を含む。他の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、CDタンパク質(例えば、CD20またはCD52)のトランケート型変異体、またはLNFGR(CD271)のトランケート型変異体を含みうる。

0106

ある特定の実施形態では、細胞タグの細胞表面ポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは内因性ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達部分を除去するように改変されたトランケート型変異体を含みうる。膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達部分のトランケーションは、ポリペプチドの細胞表面部分または細胞外部分を、その内因性文脈から解放し、例えば、異なる天然タンパク質に由来する膜貫通ドメイン(例えば、リンカーを介して)へと融合させた細胞表面ポリペプチドを含むキメラポリペプチド構築物への組込みに利用可能とする。このようなキメラポリペプチド構築物は、細胞表面ポリペプチド(例えば、トランケート型変異体)に、ポリペプチドの内因形と比較して、変更された活性または特徴を付与しうる。一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、キメラポリペプチド構築物内で発現させると、二量体化が可能である。

0107

本開示は、複数の異なるポリペプチド構築物を、同じ操作細胞内で発現させうることを想定する。例えば、本明細書で開示される細胞は、細胞表面ポリペプチドおよび/または膜貫通ドメインの識別が異なる、複数のポリペプチド構築物を発現しうる。

0108

本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、天然ポリペプチドのトランケート型変異体と、細胞表面ポリペプチドへと融合させた膜貫通ドメインと、任意選択で、トランケート型変異体を、膜貫通ドメインへと接続するリンカーと、細胞タグを、操作細胞の細胞表面へと方向付けるシグナルペプチドとを含む細胞表面ポリペプチドを含みうる。

0109

シグナルペプチド
シグナルペプチドは、新たに合成されるタンパク質またはポリペプチドのN末端に位置することが典型的なアミノ酸配列であって、タンパク質またはポリペプチドを、細胞表面へと方向付けるアミノ酸配列である。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、細胞膜へと挿入される(例えば、膜貫通ドメインを介して)ポリペプチドを、細胞表面へと方向付ける。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、シグナルペプチドと共に合成されるが、次いで、成熟ポリペプチド構築物が、シグナルペプチドのアミノ酸配列を欠くように、翻訳後プロセシングされて、シグナルペプチドを切断する。他の実施形態では、シグナルペプチド配列は、切断されず、成熟ポリペプチド構築物内に残存する。

0110

本開示は、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付け、かつ/またはトラフィッキングすることが可能な、任意の、公知または未知のシグナルペプチドを含むポリペプチド構築物を提示する。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、GMCSFRα、Igカッパ、免疫グロブリンE、CD8α、TVB2(T21A)、CD52、または低アフィニティー神経増殖因子受容体(LNGFR、TNFRSF16)のシグナルペプチドに対応するシグナル配列を含む。

0111

複数の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、または配列番号13からなるリストから選択されるヌクレオチド配列との、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、および配列番号14からなるリストから選択されるアミノ酸配列との、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0112

ペプチドリンカー
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物のドメインまたはその断片を、ポリペプチド構築物の、異なるドメインまたはその断片へと接続するペプチドリンカーを含みうる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインを、ポリペプチド構築物の細胞表面ポリペプチド(例えば、天然ポリペプチドのトランケート型変異体)へと接続する。例えば、ポリペプチド構築物は、GSGリンカー(配列番号16)、SGSGリンカー(配列番号18)、(G4S)3リンカー(配列番号20)、(G4S)4リンカー(配列番号22)、および/またはホイトローリンカーを含むペプチドリンカーを含みうる。

0113

本明細書では、膜貫通ドメインを、細胞表面ポリペプチド(例えば、トランケート型変異体)へと連結する、任意の長さまたはサイズのペプチドリンカーが提示される。例えば、一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、トランケート型変異体と、膜貫通ドメインとの距離を、ポリペプチドの天然非トランケート形と、その内因性膜貫通ドメインとの間で生じる距離とほぼ同じ距離に維持するサイズである。複数の実施形態では、本明細書で記載されるトランケート型変異体を、異なるサイズのG4Sリンカー(G4S)n[配列中、n=0、1、2、3、4、5](配列番号222)を介して、膜貫通ドメインへと連結して、HER1tと、膜貫通タンパク質との「天然」の距離を維持する。例えば、同じ天然ポリペプチドの、2つの異なるトランケート型変異体が、異なる長さである場合、両方のトランケート型変異体を、細胞表面から、ほぼ同じ距離に配置するために、長さの短いトランケート型変異体を、大きなサイズのリンカーで補完することができる。

0114

ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーを使用して、膜貫通ドメイン以外のドメインまたはその部分を、併せて連結することができる。例えば、ペプチドリンカーは、細胞表面ポリペプチドの、2つのタンパク質部分を接続しうる。場合によって、細胞表面ポリペプチドは、キメラポリペプチドであることが可能であり、ペプチドリンカーを介して接続されうる、複数の天然ポリペプチドに由来するトランケート型変異体を含む。例は、EGFRファミリー(例えば、HER2、ErbB3、およびErbB4)の別のメンバーの、1または複数のトランケート型変異体と合わせた、HER1tを含むポリペプチド構築物である。他の場合には、細胞表面ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して接続された、2コピーまたはこれを超えるトランケート型変異体のコンカタマー(例えば、SGSリンカーを介して連結された、2コピーのCD20トランケート型ポリペプチドを含む配列番号123)を含みうる。

0115

複数の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号15;配列番号17;配列番号19;配列番号21;および配列番号23からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号16;配列番号18;配列番号20;配列番号22;および配列番号24からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0116

膜貫通ドメイン
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、細胞膜へと挿入されて、ポリペプチド構築物を、細胞表面にアンカリングしうる膜貫通ドメインを含みうる。本開示は、任意の公知もしくは未知の膜貫通ドメインまたはその断片のうちの1または複数を含むポリペプチド構築物を提示する。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、1または複数の天然タンパク質に由来し、かつ/またはこれと相同な膜貫通ドメインを含みうる。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、単一の天然タンパク質の膜貫通ドメインに対応するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、2つまたはこれを超える天然タンパク質に由来するアミノ酸配列を含む、キメラ膜貫通ドメインを含む。

0117

本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、1回膜貫通型(single-pass)または複数回膜貫通型(multi-pass)である膜貫通ドメインを含みうる。CD8αは、1回膜貫通型膜貫通ドメインを有するタンパク質の例である。一部の実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチド構築物は、CD8αタンパク質に由来する膜貫通ドメインまたはその断片に対応し、かつ/またはこれと相同な膜貫通ドメインを含む。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、配列番号33のヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号34のアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0118

複数回膜貫通型タンパク質の例は、CD28である。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、CD28タンパク質に由来する膜貫通ドメインまたはその断片に対応し、かつ/またはこれと相同な膜貫通ドメインを含みうる。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、配列番号35のヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号36のアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0119

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜貫通二量体化ドメインである。本明細書では、「膜貫通二量体化ドメイン」とは、細胞の細胞膜内で、第2の膜貫通ドメインまたはその断片と、物理的に相互作用するか、または「二量体化すること」が可能な、膜貫通ドメインまたはその断片を指す。典型的に、膜貫通二量体化ドメインは、膜貫通二量体化ドメインを介して、第2のポリペプチドと二量体化する、第1のポリペプチド構築物内に含まれる。第1のポリペプチドの膜貫通二量体化ドメインを、その遠位(細胞外指向性)末端において、第1の細胞表面ポリペプチドと融合させ、第2のポリペプチドの膜貫通二量体化ドメインを、その遠位末端において、第2の細胞表面ポリペプチドと融合させる場合、細胞膜内の、第1の膜貫通ドメインと、第2の膜貫通ドメインとの物理的相互作用は、第1の細胞表面ポリペプチドと、第2の細胞表面ポリペプチドとの二量体化を結果としてもたらしうる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、多量体化して、三量体四量体、または多量体を形成しうる。

0120

ある特定の実施形態では、膜貫通二量体化ドメインは、細胞外誘導剤(例えば、リガンドまたは細胞表面ポリペプチドのエピトープに特異的な抗体)を必要とせずに、細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導する。例えば、膜貫通二量体化ドメインは、細胞の細胞膜内の、第2の膜貫通二量体化ドメインと、自発的に、物理的に相互作用または共役することにより、細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導しうる。したがって、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を発現する細胞は、本明細書で記載される抗体、タンパク質、リガンド、または分子を含む、任意の細胞外細胞表面結合剤の投与の前に、細胞の細胞表面上に、二量体化させた細胞表面ポリペプチドを提示しうることが理解されるであろう。膜貫通二量体化ドメインを介する、細胞表面ポリペプチドの二量体化は、二量体化させた細胞表面ポリペプチドが、リガンドまたは抗体に接触し、これらを認識する場合に、細胞の応答を増強するように、このようなポリペプチド構築物を発現する細胞を利用しうる。例えば、ポリペプチド構築物が、HER1tを含む細胞表面ポリペプチドを含む場合、HER1t細胞表面ポリペプチドの対を、セツキシマブなどのCDC誘導剤またはADCC誘導剤との接触前または接触時に二量体化させることができる。セツキシマブ結合性細胞表面ポリペプチドの二量体化立体配置の結果として、苦痛時(例えば、サイトカインストーム中)の結合剤の投与は、細胞傷害性効果を増幅し、これにより、細胞を殺滅する可能性を増大させうる。一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチド(例えば、二量体化させた細胞表面ポリペプチド)に結合して、本明細書で開示されるポリペプチド構築物を発現する操作細胞内で、細胞応答を誘導する薬剤は、外因的に施され、かつ/または内因的には存在しない。本開示は、HER1t、LNGFRt、CD20t、およびCD52tなど、天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含む、任意の細胞表面ポリペプチドの二量体化を容易とする、膜貫通二量体化ドメインを提示する。

0121

一部の実施形態では、膜貫通二量体化ドメインは、第2の膜貫通ドメインとの共有結合的連結を形成して、細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導する。一部の実施形態では、共有結合的接続は、隣接する膜貫通ドメインの各々の中に存在するシステインアミノ酸の間で形成される、ジスルフィド結合の形態である。他の実施形態では、細胞膜内の膜貫通二量体化ドメインは、第2の膜貫通ドメインとの非共有結合的接続を形成して、細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導する。

0122

本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、別の膜貫通二量体化ドメインと物理的に相互作用する、膜貫通二量体化ドメインを有しうる。このような場合に、それぞれの第1のポリペプチド構築物および第2のポリペプチド構築物の、第1の膜貫通二量体化ドメインおよび第2の膜貫通二量体化ドメインは、同じアミノ酸配列(すなわち、膜貫通二量体化ドメインに関して、ホモ二量体)を有する場合もあり、異なるアミノ酸配列(すなわち、膜貫通二量体化ドメインに関して、ヘテロ二量体)を有する場合もある。ある特定の実施形態では、二量体化ポリペプチド対の、それぞれの各膜貫通二量体化ドメインは、第1の膜貫通二量体化ドメイン内および第2の膜貫通二量体化ドメイン内の、対応するシステイン残基の間のジスルフィド架橋の形成を媒介する、少なくとも1つのシステイン残基を含む。

0123

ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、タンパク質であるグリコホリンAのアミノ酸配列に対応し、かつ/またはこれと相同なアミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物へと組み込まれた、グリコホリンAのアミノ酸配列は、グリコホリンAの膜貫通ドメインまたはその断片を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、通常、グリコホリンA膜貫通ドメインに隣接する、1または複数のアミノ酸を含みうる。一部の実施形態では、グリコホリンA膜貫通ドメインの全部または一部を含むポリペプチド構築物は、グリコホリンA膜貫通ドメインの全部または一部を含む、第2のポリペプチド構築物と二量体化すること(例えば、ホモ二量体化すること)が可能である。このような場合に、グリコホリンAから、ポリペプチド構築物へと組み込まれたアミノ酸配列は、膜貫通二量体化ドメインを規定しうる。例えば、グリコホリンA二量体化ドメインは、二量体化モチーフであるGXXXGを含みうる。

0124

一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、グリコホリンAの、少なくともアミノ酸E91〜R116を含む膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、グリコホリンAの、少なくともアミノ酸I92〜I114を含む膜貫通ドメインを含む。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号25および配列番号27からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされた、グリコホリンAドメインまたはその断片に対応する膜貫通ドメインを含む。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号26および配列番号28からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する、グリコホリンAドメインまたはその断片に対応する膜貫通ドメインを含む。

0125

本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、2つまたはこれを超える天然ポリペプチドに由来するアミノ酸配列のキメラである膜貫通ドメインを含みうる。例えば、膜貫通ドメインは、第2のタンパク質に由来するアミノ酸配列へと連結されるか、または融合させたグリコホリンAドメインまたはその部分に対応するアミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態では、このようなキメラ膜貫通ドメインは、第2の膜貫通ドメイン(例えば、キメラまたは非キメラ)との二量体化が可能であり、したがって、膜貫通二量体化ドメインをもたらすことが可能である。例えば、グリコホリンA膜貫通ドメインまたはその断片に対応するアミノ酸配列を、インテグリンβ3のドメインまたはその断片に対応するアミノ酸配列へと融合させて、ポリペプチド構築物のキメラ膜貫通ドメインを形成することができる。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、インテグリンβ3のアミノ酸A737〜W741へと融合させたグリコホリンAのアミノ酸I92〜L109を含む膜貫通ドメインを含む。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号29のヌクレオチド配列との、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりによりコードされた、グリコホリンA−インテグリンβ3キメラ配列に対応する膜貫通ドメインを含む。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号30のアミノ酸配列との、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する膜貫通ドメインを含む。

0126

ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、CD3ゼータ鎖の膜貫通ドメイン内のアミノ酸配列に対応し、かつ/またはこれと相同なアミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態では、CD3ゼータ鎖の膜貫通ドメインまたはその断片を含むポリペプチド構築物は、CD3ゼータ鎖の膜貫通ドメインまたはその断片を含む、第2のポリペプチド構築物と二量体化すること(例えば、ホモ二量体化すること)が可能である。このような場合に、CD3ゼータ鎖膜貫通ドメインに対応するアミノ酸配列は、膜貫通二量体化ドメインを規定しうる。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号31のヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされた膜貫通ドメインを含む。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号31のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号32のアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する膜貫通ドメインを含む。

0127

他の実施形態では、本明細書におけるポリヌクレオチド構築物の膜貫通ドメインは、タンパク質であるCTLA4(細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4)および/もしくはLNGFR(TNFRSF16)に由来する膜貫通ドメインまたはその断片に対応し、かつ/またはこれと相同なアミノ酸配列を含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、配列番号37および配列番号39からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされた膜貫通ドメインを含みうる。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号38および配列番号40からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する膜貫通ドメインを含む。

0128

トランケート型変異体
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、膜貫通ドメインへと連結された細胞表面ポリペプチドを含みうる。ある特定の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含む。本明細書では、多種多様な天然ポリペプチドが、ポリペプチド構築物へと組み込まれるトランケート型変異体を産生する、前駆体または基質として提示される。各天然ポリペプチド前駆体は、本明細書で記載されるポリペプチド構築物における使用のための、多数の可能なトランケート型変異体をもたらすように、複数の異なるトランケーションにさらにかけることができる。

0129

前駆体の例は、表皮増殖因子受容体(EGFRまたはHER1)アイソフォーム前駆体(例えば、配列番号50);受容体チロシンタンパク質キナーゼErbB2(HER2)アイソフォーム前駆体(例えば、配列番号51);受容体チロシンタンパク質キナーゼErbB3(HER3)アイソフォーム1前駆体(例えば、配列番号52)、受容体チロシンタンパク質キナーゼErbB4(HER4)アイソフォームJM−a/CVT−1前駆体(例えば、配列番号53)、受容体チロシンタンパク質キナーゼErbB4(HER4)アイソフォームJM−bアイソフォームX7(例えば、配列番号54)、CD20前駆体(例えば、配列番号108)、CD52前駆体、およびLNGFR前駆体(例えば、配列番号154)を含む。

0130

ある特定の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、トランケート型HER1ポリペプチド(本明細書では、HER1tまたはEGFRtと称する)を含む。天然HER1は、ドメインI、II、III、およびIVを含む細胞外領域、膜貫通ドメイン、ならびに細胞内チロシンキナーゼおよび調節領域を含む。ADCCを誘導することが可能な、ある特定の抗体(例えば、パニツムマブおよびセツキシマブ)は、内因性HER1のドメインIIIに結合することが公知である。

0131

本明細書では、内因性HER1の、任意のアミノ酸、ドメイン、または断片がトランケートされたHER1ポリペプチドを含むポリペプチド構築物が提示される。本明細書では、HER1ポリペプチドは、HER1tポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、HER1ポリペプチドは、HER1tポリペプチドからなるか、またはこれから本質的になる。他の実施形態では、HER1ポリペプチドは、他のHER1ドメイン(例えば、HER1膜貫通ドメイン)に加えて、HER1tポリペプチドを含みうる。複数の実施形態では、HER1ポリペプチドは、チロシンキナーゼドメインおよび調節性領域を含む、HER1内に通常見出される、細胞内ドメインまたはその断片を欠く場合がある。一部の実施形態では、HER1ポリペプチドは、HER1内に通常見出される、膜貫通ドメインまたはその断片を欠く場合がある。一部の実施形態では、HER1ポリペプチドは、HER1内で通常見出される、ドメインI、ドメインII、およびドメインIVの全部または一部を含む、HER1内に通常見出される、細胞外ドメインまたはその断片を欠く場合がある。

0132

一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、HER1内に通常見出されるドメインIIIを欠くHER1tポリペプチドを含む。一部の実施形態では、HER1tポリペプチドは、内因性HER1タンパク質のドメインIIIの全部または一部からなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、HER1tポリペプチドは、内因性HER1タンパク質のドメインIIIの全部からなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたHER1tドメインIIIは、配列番号199のヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたHER1tドメインIIIは、配列番号200のアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する。

0133

一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたHER1tポリペプチドは、内因性HER1のドメインIVまたはその断片を含む。内因性HER1ドメインIVは、配列番号201のヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。ある実施形態では、内因性HER1tドメインIVは、配列番号202のアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する。他の実施形態では、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたHER1tポリペプチドは、トランケート型ドメインIVを含みうる。HER1tトランケート型ドメインIVは、天然HER1のうちの、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%のトランケーションを含みうる。ある実施形態では、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたHER1tトランケート型ドメインIVは、配列番号203、配列番号 配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、および配列番号209からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する。

0134

本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、HER1ドメインIIIおよびドメインIVを含むHER1tポリペプチドを含みうる。ある実施形態では、HER1tポリペプチドは、配列番号210のアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するHER1ドメインIIIおよびドメインIVを含む。

0135

本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、HER1のドメインIIIと、ドメインIVの断片とを含むHER1tポリペプチドを含みうる。ある実施形態では、HER1tポリペプチドは、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、および配列番号217からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する。

0136

天然HER1はまた、ドメインIV内の、複数のジスルフィド結合対も含有する。一部の実施形態では、HER1tトランケート型ドメインIVは、ジスルフィド結合対を保存する位置において、トランケーションを含みうる。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるHER1t変異体を、異なるサイズのG4Sリンカー(G4S)n[配列中、n=0、1、2、3、4、5](配列番号222)を介して、膜貫通ドメインへと連結して、HER1tと、膜貫通タンパク質との「天然」の距離を維持する。さらなる実施形態では、このリンカーは、EGFリガンドの活性化をもたらすEGFR受容体の二量体化において役割を果たすので、ドメインIVとEGFR膜貫通ドメインとの間の7残基のリンカーを、さらに除去することができる。

0137

本明細書で記載される、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたHER1tポリペプチドは、外因的に導入された結合パートナーまたは抗体により認識されうるエピトープを含みうる。一部の実施形態では、HER1tポリペプチドには、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を発現する細胞の、ターゲティングされた枯渇を容易とするために、セツキシマブ結合性ドメインを組み込みうる。枯渇は、例えば、CDCおよび/またはADCCから生じる細胞死に起因しうる。HER1tを含む細胞表面ポリペプチド上のエピトープに結合し、かつ/またはこれを認識するように内因的に導入されうる分子の非限定的な例は、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ブリガチニブ、イコチニブ、オシメルチニブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、およびマツズマブを含みうる。多様な実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、scFv、scFab、ダイアボディー、またはラクダ科動物抗体でありうる。別の実施形態では、抗体を、薬物または毒素へとコンジュゲートさせることができる。

0138

本明細書で記載されるポリペプチド構築物へと組み込まれる細胞表面ポリペプチドは、複数の異なる天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含みうる。例えば、細胞表面ポリペプチドは、EGFRファミリーに由来する複数のトランケート型ポリペプチドを含むポリペプチドキメラを含みうる。図4Bは、細胞タグの機能性を付与する、ポリペプチド構築物についての実施形態を例示するが、この場合、細胞表面ポリペプチドは、HER/EGFRファミリーの1つのメンバー(HER(m))のドメインIIIと、HER/EGFRファミリーの異なるメンバー(HER(n))に由来するドメインIVまたはその断片とを含む。本明細書では、EGFR/HER1、HER2、ErbB3、およびErbB4のうちの、2つまたはこれを超えるものに由来する細胞外ドメインの任意の組合せを含むキメラ細胞表面ポリペプチドが提示される。図4Cは、ドメインIIIが、EGFR/HER1に由来する、具体的な場合を描示する。このようなキメラ細胞表面ポリペプチドの利点は、各個別のトランケーションが、養子細胞治療時に、外因的に導入される抗体により認識されうるエピトープを保存しながら、内因性分子に結合する傾向がある、それぞれの天然ポリペプチドのエピトープを除去しうることである。例えば、キメラ細胞表面ポリペプチドが、EGFRに由来するドメインIIIと、HER2に由来するドメインIVとを含む場合、ポリペプチドを発現する操作細胞は、抗体である、セツキシマブ(EGFRに由来するドメインIIIを認識する)、およびトラスツズマブ(HER2に由来するドメインIVを認識する)の両方に対して、感受性でありうる。したがって、本明細書で記載されるキメラ細胞表面ポリペプチドは、複数の抗生剤/結合パートナーに対する結合部位をもたらすことにより、免疫療法時に免疫細胞の挙動を制御する、さらなる機構をもたらす。例えば、養子細胞療法時に副作用を被る対象が、キメラ細胞表面ポリペプチド内のトランケート型変異体のうちの1つにおけるエピトープをターゲティングする、投与された抗生剤(例えば、セツキシマブ)に応答しない状況下では、異なる抗体(例えば、トラスツズマブ)を、対象へと投与して、キメラ細胞表面ポリペプチドの、他のトランケート型変異体上の、異なるエピトープを介して、同じ操作細胞をターゲティングすることができる。

0139

一部の実施形態では、キメラ細胞表面ポリペプチドを、EGFRファミリーメンバーと相同な膜貫通ドメインと融合させることができる。例えば、膜貫通ドメインは、EGFR/HER1、HER2、ErbB3、またはErbB4に由来する膜貫通ドメインに対応しうる。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、および配列番号40に対応する膜貫通ドメインを含む、非EGFR膜貫通ドメインと相同でありうる。

0140

一部の実施形態では、キメラ細胞表面ポリペプチドは、HER1tポリペプチドと、トランケート型HER2(HER2t)ポリペプチドまたはその断片とのキメラを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、HER1ドメインIIIを含む、HER1t/EGFRtポリペプチドと、HER2ドメインIVを含むHER2tポリペプチドと、HER2膜貫通ドメインとを含みうる。ある実施形態では、HER2膜貫通ドメインへと融合させたEGFR−HER2キメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号88および配列番号92(デルタ16)からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。ある実施形態では、HER2膜貫通ドメインへと融合させたEGFR−HER2キメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号89および配列番号93(デルタ16)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する。

0141

一部の実施形態では、キメラ細胞表面ポリペプチドは、HER1tポリペプチドと、トランケート型ErbB3(ErbB3t)ポリペプチドまたはその断片とのキメラを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、HER1ドメインIIIを含む、HER1t/EGFRtポリペプチドと、ErbB3ドメインIVを含むErbB3tポリペプチドと、ErbB3膜貫通ドメインとを含みうる。ある実施形態では、ErbB3膜貫通ドメインへと融合させたEGFR−ErbB3キメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号96のヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。ある実施形態では、ErbB3膜貫通ドメインへと融合させたEGFR−ErbB3キメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号97のアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する。

0142

一部の実施形態では、キメラ細胞表面ポリペプチドは、HER1tポリペプチドと、トランケート型ErbB4(ErbB4t)ポリペプチドまたはその断片とのキメラを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、ドメインIIIを含む、HER1t/EGFRtポリペプチドと、ErbB4ドメインIVを含むErbB4tポリペプチドと、ErbB4膜貫通ドメインとを含みうる。一部の実施形態では、ErbB4tポリペプチドは、ErbB4 JM−aの代替転写物によりコードされるErbB4 JM−a細胞外膜近傍ドメインを含みうる。一部の実施形態では、ErbB4tポリペプチドは、ErbB4 JM−bの代替転写物によりコードされるErbB4 JM−b細胞外膜近傍ドメインを含みうる。ある実施形態では、ErbB4膜貫通ドメインへと融合させたキメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号100(EGFR−ErbB4(JM−a))および配列番号104(EGFR−ErbB4(JM−b))からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。ある実施形態では、ErbB4膜貫通ドメインへと融合させたEGFR−ErbB4キメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号101(EGFR−ErbB4(JM−a))および配列番号105(EGFR−ErbB4(JM−b))からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する。

0143

本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、シグナルペプチドと、HER1tポリペプチド(例えば、HER1tのみを含むか、またはHER1tを含むキメラポリペプチド)を含む細胞表面ポリペプチドと、膜貫通ドメインと、任意選択で、リンカーとの任意の組合せを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、HER1tポリペプチドまたはHER1tを含むキメラポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドであって、リンカー(例えば、1または複数(例えば、1〜4)コピーのG4S(配列番号221))を介して、CD28膜貫通ドメインの誘導体または断片へと連結されるか、または融合させた細胞表面ポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、配列番号56(HER1t1);配列番号58(HER1t2);配列番号60(HER1t3);配列番号62(HER1t4);配列番号64(HER1t5);配列番号66(HER1t6);配列番号68(HER1t7);配列番号72(HER1t8);配列番号76(HER1t9);配列番号80(HER1t10);および配列番号84(HER1t11)からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるHER1tポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、配列番号55(HER1t);配列番号57(HER1t1);配列番号59(HER1t2);配列番号61(HER1t3);配列番号63(HER1t4);配列番号65(HER1t5);配列番号67(HER1t6);配列番号69(HER1t7);配列番号73(HER1t8);配列番号77(HER1t9);配列番号81(HER1t10);および配列番号85(HER1t11)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むHER1tポリペプチドを含みうる。

0144

一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、シグナルペプチド、HER1tポリペプチドまたはHER1tポリペプチドを含むキメラポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチド、膜貫通二量体化ドメインを含む膜貫通ドメイン、および膜貫通ドメインと、細胞表面ポリペプチドとを接続するリンカーを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、Igカッパシグナルペプチド、HER1の特定のトランケート型変異体、リンカー(例えば、(G4S)4(配列番号22))、および膜貫通二量体化ドメイン(例えば、グリコホリンAのI92〜I114またはCD3ゼータに由来する膜貫通ドメインを含む)を含みうる。複数の実施形態では、HER1tポリペプチドと、膜貫通二量体化ドメインとを含むポリペプチド構築物は、配列番号70(グリコホリンA;HER1t8);配列番号74(グリコホリンA;HER1t9);配列番号78(グリコホリンA;HER1t10);および配列番号82(CD3ゼータ;HER1t11)からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、HER1tポリペプチドと、膜貫通二量体化ドメインとを含むポリペプチド構築物は、配列番号71(グリコホリンA;HER1t8);配列番号75(グリコホリンA;HER1t9);配列番号79(グリコホリンA;HER1t10);および配列番号83(CD3ゼータ;HER1t11)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0145

別の実施形態では、ポリペプチド構築物は、HER2膜貫通ドメインへと連結された、HER1t−HER2tキメラを含む、細胞表面ポリペプチドを含みうる。トランケート型HER1t−HER2tキメラおよび膜貫通ドメインを、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付ける、シグナルペプチド(例えば、GMCSFRα)へとさらに接続することができる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号86および配列番号90(デルタ16)からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号87および配列番号91(デルタ16)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

0146

別の例では、ポリペプチド構築物は、ErbB3膜貫通ドメインへと連結された、HER1t−ErbB3tキメラを含む、細胞表面ポリペプチドを含みうる。ある実施形態では、HER1t−ErbB3tキメラおよび膜貫通ドメインを、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付ける、シグナルペプチド(例えば、GMCSFRα)へとさらに接続する。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号94のヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号95のアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

0147

さらに別の例では、ポリペプチド構築物は、ErbB4膜貫通ドメインへと連結された、HER1t−ErbB4tキメラを含む、細胞表面ポリペプチドを含みうる。ある実施形態では、HER1t−ErbB4tキメラおよび膜貫通ドメインを、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付ける、シグナルペプチド(例えば、GMCSFRα)へとさらに接続する。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号98(JM−a変異体)および配列番号102(JM−b変異体)からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号99(JM−a変異体)および配列番号103(JM−b変異体)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。

0148

HER1tポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付けることが可能な、任意のシグナルペプチドを含みうる。例えば、HER1tポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチド(例えば、配列番号200、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216および配列番号217からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む)を、配列番号2(GMCSFRα)、配列番号4(Igカッパ)、配列番号6(免疫グロブリンE)、配列番号8(CD8α)、配列番号10(TVB2)、配列番号12(CD52)、または配列番号14(LNFGR)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドと融合させることができる。

0149

HER1tポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、二量体化ドメインを含まない膜貫通ドメインを含む、任意の膜貫通ドメインを含みうる。例えば、HER1tポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチド(例えば、配列番号200、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216および配列番号217からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む)は、配列番号26(グリコホリンA E91〜R116)、配列番号28(グリコホリンA I92〜I114)、配列番号30(グリコホリンA(I92〜L109).インテグリンβ3(A737〜W741)、配列番号32(CD3ゼータ鎖)、配列番号34(CD8α)、配列番号36(CD28)、配列番号38(CTLA4)および配列番号40(LNGFR)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を含む膜貫通ドメインへと連結することができる。

0150

HER1tポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、任意のペプチドリンカーを含みうる(または、一部の実施形態では、ペプチドリンカーを含みえない)。例えば、HER1tを含む細胞表面ポリペプチド(例えば、配列番号200、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216および配列番号217からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む)を、配列番号16(GSG)、配列番号18(SGSG)、配列番号20((G4S)3)、配列番号22((G4S)4)および配列番号24(ホイットロー)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーと融合させることができる。

0151

細胞表面ポリペプチドには、トランケート型CDポリペプチドを組み込みうる。例えば、細胞表面ポリペプチドは、トランケート型CD20ポリペプチド(本明細書では、CD20tと称する)を含みうる。天然CD20ポリペプチドは、4回膜貫通ドメインサブファミリーAメンバー1(MS4A1)遺伝子によりコードされる、複数回膜貫通型膜貫通タンパク質である。ある特定の実施形態では、全長CD20は、配列番号106のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、全長CD20アミノ酸配列は、配列番号107のアミノ酸配列に対応しうる。一部の実施形態では、CD20は、アミノ酸57〜78、85〜105、121〜141、および189〜209を包含する、4つの膜貫通ドメイン膜貫通部分を含む。一部の実施形態では、CD20は、アミノ酸79〜84および142〜188を包含する、2つの細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、CD20は、アミノ酸1〜56、106〜120、および210〜297を包含する、3つの細胞質ドメインを含む。

0152

本明細書では、内因性CD20の、任意のアミノ酸、ドメイン、または断片がトランケートされたCD20ポリペプチドを含むポリペプチド構築物が提示される。本明細書では、CD20ポリペプチドは、CD20tポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、CD20ポリペプチドは、CD20tポリペプチドからなるか、またはこれから本質的になる。他の実施形態では、CD20ポリペプチドは、別のCD20ドメインまたはその部分(例えば、CD20膜貫通ドメインおよび/または細胞質ドメイン)に加えて、CD20tポリペプチドを含みうる。例えば、CD20ポリペプチドは、細胞内細胞質(例えば、シグナル伝達)ドメインもしくはその部分、膜貫通(例えば、ヘリックス)ドメインもしくはその部分、および/または細胞外ドメインもしくはその部分をトランケートすることができる。一部の実施形態では、CD20ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて、複数のドメインまたはドメインの複数の部分を逸失している場合がある。ある実施形態では、CD20ポリペプチドは、内因性CD20のM1〜E263(配列番号109;CD20t1)、内因性CD20のM117〜N214(配列番号111(CD20t2)、内因性CD20のM1〜N214(配列番号115;CD20t4)、内因性CD20のV82〜N214(配列番号117;CD20t5)、または内因性CD20のV82〜I186(配列番号119、CD20t6)を含む。

0153

ある実施形態では、CD20tポリペプチドは、細胞外ドメインまたはその断片を含みうる。ある実施形態では、CD20tポリペプチドは、配列番号218、配列番号219、および配列番号220からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する。一部の実施形態では、CD20tポリペプチドは、膜貫通ドメインまたはその断片へと連結することができる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、CD20膜貫通ドメインへと連結されたCD20tポリペプチドを含む。一部の実施形態では、CD20膜貫通ドメインへと連結されたCD20tポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、配列番号108(M1〜E263をコードするCD20t1);配列番号110(M117〜N214をコードするCD20t2);配列番号114(M1〜N214をコードするCD20t4);配列番号116(V82〜N214をコードするCD20t5);配列番号118(V82〜I186をコードするCD20t6);配列番号132(M1〜A54およびC111〜P297をコードするCD20t13);配列番号134(M1〜A54およびC111〜E281をコードするCD20t14);配列番号136(M1〜A54およびC111〜E263をコードするCD20t15);配列番号138(M1〜A54およびC111〜V228をコードするCD20t16);および配列番号140(M1〜V8およびC111〜P297をコードするCD20t17)からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、CD20膜貫通ドメインへと連結されたCD20tポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、配列番号109(CD20t1:M1〜E263);配列番号111(CD20t2:M117〜N214);配列番号115(CD20t4:M1〜N214);配列番号117(CD20t5:V82〜N214);配列番号119(CD20t6:V82〜I186);配列番号133(CD20t13:M1〜A54およびC111〜P297);配列番号135(CD20t14:M1〜A54およびC111〜E281);配列番号137(CD20t15:M1〜A54およびC111〜E263);配列番号139(CD20t16:M1〜A54およびC111〜V228);および配列番号141(CD20t17:M1〜V8およびC111〜P297)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。

0154

一部の実施形態では、CD20tポリペプチドは、Philip et al., (2014), “A highly compact epitope-based marker/suicide gene for easier and safer T-cell therapy,” Blood: 124: 1277-1287において記載されている通り、内因性CD20のリツキシマブ結合性ミモトープの、少なくとも1つのコピーを保持しうる。一部の実施形態では、CD20tの、1または複数コピーのリツキシマブ結合性エピトープを、抗CD34モノクローナル抗体の結合を容易とする、CD34の、アミノ末端の40アミノ酸など、1または複数のCD34由来のアミノ酸配列と融合させることができる。一部の実施形態では、CD20tポリペプチドは、除去された複数のドメイン、または除去された複数のドメインの部分を有しうる。

0155

CD20tポリペプチドを組み込んだ細胞表面ポリペプチドは、外因的に導入された抗体または結合パートナーにより認識されうるエピトープを含みうる。例えば、細胞表面ポリペプチド内に含まれるCD20tポリペプチドには、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を発現する細胞の、ターゲティングされた枯渇(例えば、CDCおよび/または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性ADCCを介する)を容易とするために、リツキシマブ結合性ドメインを組み込みうる。CD20tポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドのエピトープに結合しうるように使用される抗体の非限定的な例は、リツキシマブ、hOUBM3/6、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、オファツムマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、TRU−015(Trubion)、およびベルツズマブ(IMMU−106)を含む。多様な実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、scFv、scFab、ダイアボディー、またはラクダ科動物抗体でありうる。他の実施形態では、抗体を、薬物または毒素へとコンジュゲートさせることができる。一部の実施形態では、CD20tポリペプチドは、内因性CD20の細胞外ドメイン内で見出されるエピトープを含む。一部の実施形態では、CD20tポリペプチドのエピトープは、内因性CD20のアミノ酸170〜185を含む。一部の実施形態では、CD20tポリペプチドのエピトープは、内因性CD20のアミノ酸170〜173および182〜185を含む。

0156

さらなる実施形態では、CD20tポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドは、1または複数のさらなるポリペプチドのトランケート型変異体についてキメラである。例えば、キメラ細胞表面ポリペプチドは、CD20tポリペプチドと、トランケート型CD8α(CD8αt)ポリペプチドとを含みうる。

0157

細胞表面ポリペプチドは、複数のCD20t連結配列を、コンカタマーとして、併せてさらに含みうる。例えば、細胞表面ポリペプチドは、連続で繰り返される、同じCD20tアミノ酸配列を含む場合もあり、併せて接続された、異なるCD20t変異体を含む場合もある。一部の実施形態では、CD20tアミノ酸配列を、細胞表面ポリペプチド内で、ペプチドリンカーにより併せて連結する。ある実施形態では、SGSリンカーまたはSG4Sリンカー(配列番号223)を使用して、SG4Sリンカー(配列番号223)により、CD28膜貫通ドメインへと連結された細胞表面ポリペプチドをさらに含む、細胞表面ポリペプチド内の、反復するCD20アミノ酸配列を、併せて連結することができる(例えば、配列番号123(SGSリンカー)および配列番号129(SG4Sリンカー(配列番号223)を参照されたい)。

0158

本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、シグナルペプチドと、CD20tポリペプチド(例えば、CD20tのみを含むか、またはCD20tキメラポリペプチド)を含む細胞表面ポリペプチドと、膜貫通ドメインと、任意選択で、リンカーとの任意の組合せを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、CD20tポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドを、膜貫通ドメインへと接続するか、または融合させるSG4Sリンカー(配列番号223)を含みうる。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD20、CD28、またはCD8αに由来する膜貫通ドメインまたはその断片に由来するか、またはこれと相同である。ある実施形態では、CD20tを含むポリペプチド構築物は、配列番号112(CD20t(K142〜S188)およびCD8α(I183〜T203)膜貫通ドメインをコードするCD20t3);配列番号120(CD20t(P160〜Q187)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD28(I96〜D172)膜貫通ドメインをコードするCD20t7);配列番号122(CD20tコンカタマー(SGSリンカーにより隔てられたP160〜Q187)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD28(I96〜D172)膜貫通ドメインをコードするCD20t8);配列番号124(CD20t(P160〜Q187)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD8α(P120〜V201)膜貫通ドメインをコードするCD20t9);配列番号126(CD20t(C167〜C183)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD28(I96〜D172)膜貫通ドメインをコードするCD20t10;配列番号128(CD20コンカタマー(SG4Sリンカー(配列番号223)により隔てられたC167〜C183)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD28(I96〜D172)膜貫通ドメインをコードするCD20t11);および配列番号130(CD20t(C167〜C183)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD8α(P120〜V201)膜貫通ドメインをコードするCD20t12)からなるリストから選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、CD20tを含むポリペプチド構築物は、配列番号113(CD20t3;CD20t(K142〜S188)およびCD8α(I183〜T203)膜貫通ドメイン);配列番号121(CD20t(P160〜Q187)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD28(I96〜D172)膜貫通ドメインをコードするCD20t7);配列番号123(CD20tコンカタマー(SGSリンカーにより隔てられたP160〜Q187)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD28(I96〜D172)膜貫通ドメインをコードするCD20t8);配列番号125(CD20t(P160〜Q187)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD8α(P120〜V201)膜貫通ドメインをコードするCD20t9);配列番号127(CD20t(C167〜C183)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD28(I96〜D172)膜貫通ドメインをコードするCD20t10);配列番号129(CD20コンカタマー(SG4Sリンカー(配列番号223)により隔てられたC167〜C183)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD28(I96〜D172)膜貫通ドメインをコードするCD20t11);および配列番号131(CD20t(C167〜C183)、SG4Sリンカー(配列番号223)、およびCD8α(P120〜V201)膜貫通ドメインをコードするCD20t12)からなるリストから選択されるアミノ酸配列を含む。

0159

CD20tポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付けることが可能な、任意のシグナルペプチドを含みうる。例えば、CD20tポリペプチドを含むポリペプチド構築物(例えば、配列番号218、配列番号219、および配列番号220からなるリストから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド)を、配列番号2(GMCSFRα)、配列番号4(IGカッパ)、配列番号6(免疫グロブリンE)、配列番号8(CD8α)、配列番号10(TVB2)、配列番号12(CD52)、または配列番号14(LNFGR)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドと融合させることができる。

0160

CD20tポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、二量体化ドメインを含むか、または二量体化ドメインを含まない膜貫通ドメインを含む、任意の膜貫通ドメインを含みうる。例えば、CD20tポリペプチドを含むポリペプチド構築物(例えば、配列番号218、配列番号219、および配列番号220からなるリストから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド)を、配列番号26(グリコホリンA E91〜R116)、配列番号28(グリコホリンA I92〜I114)、配列番号30(グリコホリンA (I92〜L109).インテグリンβ3(A737〜W741)、配列番号32(CD3ゼータ鎖)、配列番号34(CD8α)、配列番号36(CD28)、配列番号38(CTLA4)および配列番号40(LNGFR)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと融合させることができる。CD20tを含むポリペプチド構築物は、CD28および/またはCD8αに由来するか、またはこれと相同な膜貫通ドメインをさらに含みうる。

0161

CD20tポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、任意のペプチドリンカーを含みうる(または、一部の実施形態では、ペプチドリンカーを含みえない)。例えば、CD20tポリペプチドを含むポリペプチド構築物(例えば、配列番号218、配列番号219、および配列番号220からなるリストから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド)を、配列番号16(GSG)、配列番号18(SGSG)、配列番号20((G4S)3)、配列番号22((G4S)4)および配列番号24(ホイットロー)からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーと融合させることができる。

0162

トランケートされ、本明細書で記載される細胞タグへと組み込まれうるCDポリペプチドの別の例は、CD52である。CD52は、そのC末端において、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーへと連結された、12アミノ酸のペプチドとして、ヒトにおいて内因的に生じる。一部の実施形態では、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)を使用して、本明細書で記載されるポリペプチドを、細胞表面へとアンカリングすることができる。

0163

本明細書では、内因性CD52の、任意のアミノ酸、ドメイン、または断片がトランケートされたCD52ポリペプチドを含むポリペプチド構築物が提示される。本明細書では、CD52ポリペプチドは、トランケート型CD52(CD52t)ポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、CD52ポリペプチドは、CD52tポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドからなるか、またはこれらから本質的になる。他の実施形態では、CD52ポリペプチドは、他のCD52ドメイン(例えば、CD52シグナルペプチド)に加えて、CD52tポリペプチドを含む、細胞表面ポリペプチドを含みうる。

0164

本明細書では、トランケート型CD52tポリペプチドを含む、細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では、トランケート型変異体を、細胞表面へと方向付けるために、CD52シグナルペプチドを、CD52tポリペプチドへと連結する。一部の実施形態では、CD52tポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドには、外因的に導入された抗体または結合パートナーにより認識されうる、1または複数のエピトープを組み込みうる。例えば、CD52tポリペプチドには、1または複数のアレムツズマブ結合性ドメインを組み込み、これにより、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を発現する細胞の、ターゲティングされた枯渇が容易となりうる。一部の実施形態では、ターゲティングされた枯渇は、アレムツズマブにより媒介されたCDCおよび/もしくADCC、またはアレムツズマブによる認識の細胞傷害性効果を媒介する、別の細胞機構から生じうる。CD52tポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドを認識しうる、抗CD52分子の非限定的な例は、アレムツズマブ、ANT1034、HI186(Bio Rad)、YTH34.5(Bio Rad)、およびYTH66.9HL(Bio−Rad)を含む。多様な実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、scFv、scFab、ダイアボディー、またはラクダ科動物抗体でありうる。ある実施形態では、CD52エピトープをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号142のヌクレオチド配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、CD52エピトープは、配列番号143のアミノ酸配列に対する、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%の同一性を有する。

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