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技術 腫瘍細胞において免疫モジュレーターおよび抗がん治療剤を産生するようにプログラムされた微生物

出願人 シンロジックオペレーティングカンパニーインコーポレイテッド
発明者 フィッシャー,アダムビー.リー,ニンローラ,ジョセエム.
出願日 2018年7月11日 (2年7ヶ月経過) 出願番号 2019-564936
公開日 2020年9月3日 (5ヶ月経過) 公開番号 2020-527025
状態 未査定
技術分野 動物,微生物物質含有医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 微生物、その培養処理
主要キーワード 逆斜線 操作化 周期的プロセス BFO 身体箇所 消費体 安定平衡 正規化濃度
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年9月3日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

細菌またはウイルスなどの遺伝的にプログラムされた微生物、その医薬組成物、ならびにがんモジュレートおよび処置する方法が開示される。本開示は、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的とする微生物であって、腫瘍部位局所的に産生される1つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーター、あるいは1つもしくは複数の免疫イニシエーターおよび/または1つもしくは複数のサステナー組合せを産生することができる微生物の組成物、方法、および使用を提供する。

概要

背景

現行がん治療は、免疫療法外科手術化学療法放射線療法、またはこれらの何らかの組合せの使用を用いるのが一般的である(アメリカがん協会(American Cancer Society))。これらの薬物は、がん患者への大きな恩恵を示してきたが、多くのがんは、従来の治療法を使用して処置することが未だに困難である。現在、多くの従来のがん治療は、全身投与されるため健常組織に悪影響を及ぼし、結果として有意な副作用が生じることになる。例えば、多くのがん治療は、患者の抗腫瘍応答を後押しするために免疫系を活性化することに重点を置いている(Kongら、2014年)。しかし、そのような治療にもかかわらず、腫瘍の周囲の微小環境は、依然として高免疫抑制性である。加えて、全身的な免疫調節の変更は、日和見自己免疫障害および免疫関連有害事象の発生を含む、免疫不全を誘発する。

がん細胞を特異的に標的とする細胞傷害薬を開発するために、過去数十年にわたって大きな努力が払われてきた。近年、腫瘍学におけるパラダイムシフトし、がんの臨床的問題は、がん細胞の遺伝的異常の蓄積であるばかりでなく、免疫系によるこれらの異常細胞の寛容でもあると考えられている。その結果、最近の抗がん治療剤は、がん細胞ではなく免疫系を特異的に標的とするように設計されている。そのような治療法は、がん免疫寛容回復させること、および有効な抗腫瘍免疫応答を刺激することを目標とする。例えば、現行の免疫療法は、パターン認識受容体PRRアゴニストである免疫刺激性分子、または腫瘍微小環境浸潤する様々な免疫細胞集団を標的とする免疫刺激性モノクローナル抗体を含む。しかし、それらの免疫標的設計にもかかわらず、これらの治療法は、あたかも免疫療法の全身投与(例えば、2〜3週間ごとの静脈内注入)に頼る従来の抗がん薬であるかのように、臨床開発されてきた。結果として、多くの現行の免疫療法は、高い投薬要求量に起因して毒性に悩まされ、そしてまた、望ましくない自己免疫応答または他の免疫関連有害事象をもたらすことが多い。

概要

細菌またはウイルスなどの遺伝的にプログラムされた微生物、その医薬組成物、ならびにがんをモジュレートおよび処置する方法が開示される。本開示は、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的とする微生物であって、腫瘍部位局所的に産生される1つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーター、あるいは1つもしくは複数の免疫イニシエーターおよび/または1つもしくは複数のサステナーの組合せを産生することができる微生物の組成物、方法、および使用を提供する。

目的

本開示は、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的とする微生物であって、腫瘍部位で局所的に産生される1つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーター、あるいは1つもしくは複数の免疫イニシエーターおよび/または1つもしくは複数のサステナーの組合せを産生することができる微生物の組成物、方法、および使用を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

少なくとも1つの免疫イニシエーターおよび少なくとも1つの免疫サステナーを産生することができる、改変された微生物

請求項2

前記免疫イニシエーターが、腫瘍溶解を増強すること、抗原提示細胞APC)を活性化すること、ならびに/またはT細胞プライミングおよび活性化することができる、請求項1に記載の改変された微生物。

請求項3

前記免疫イニシエーターが、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる治療用分子、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成もしくは異化経路の少なくとも1つの酵素、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成もしくは異化経路の少なくとも1つの酵素によって産生される少なくとも1つの治療用分子、またはRNA干渉マイクロRNA応答もしくは阻害TLR応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合、もしくは遺伝子編集を媒介する核酸分子である、請求項1または請求項2に記載の改変された微生物。

請求項4

前記免疫イニシエーターが、サイトカインケモカイン単鎖抗体リガンド代謝変換因子、T細胞共刺激受容体、T細胞共刺激受容体リガンド操作化学療法、または溶解性ペプチドである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項5

前記免疫イニシエーターが、STINGアゴニストアルギニン、5−FU、TNFα、IFNγ、IFNβ1、アゴニスト抗CD40抗体、CD40L、SIRPα、GMCSF、アゴニスト抗OXO40抗体、OXO40L、アゴニスト抗4−1BB抗体、4−1BBL、アゴニスト抗GIR抗体、GITRL、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、またはアズリンである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項6

前記免疫イニシエーターが、STINGアゴニストである、請求項5に記載の改変された微生物。

請求項7

前記STINGアゴニストが、c−ジAMP、c−GAMP、またはc−ジGMPである、請求項6に記載の改変された微生物。

請求項8

前記免疫イニシエーターを産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項9

前記免疫イニシエーターをコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、dacA遺伝子配列である、請求項8に記載の改変された微生物。

請求項10

前記免疫イニシエーターをコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、cGAS遺伝子配列である、請求項8に記載の改変された微生物。

請求項11

前記cGAS遺伝子配列が、ヒトcGAS遺伝子配列、VerminephrobactereiseniaecGAS遺伝子配列、KingelladenitrificanscGAS遺伝子配列、およびNeisseriabacilliformiscGAS遺伝子配列から選択される、請求項10に記載の改変された微生物。

請求項12

前記免疫イニシエーターをコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、前記改変された微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項8〜11のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項13

前記免疫イニシエーターをコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、誘導性プロモーター作動可能に連結されている、請求項8〜11のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項14

前記誘導性プロモーターが、低酸素嫌気、またはハイポシック条件によって誘導される、請求項13に記載の改変された微生物。

請求項15

前記免疫イニシエーターが、アルギニンである、請求項5に記載の改変された微生物。

請求項16

アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む、請求項15に記載の改変された微生物。

請求項17

前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、フィードバック耐性argAを含む、請求項15に記載の改変された微生物。

請求項18

前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argJ、carA、およびcarBからなる群から選択される、請求項16に記載の改変された微生物。

請求項19

アルギニンリプレッサー遺伝子(argR)の欠失または突然変異をさらに含む、請求項17または請求項18に記載の改変された微生物。

請求項20

アルギニンの産生のための前記少なくとも1つの遺伝子配列が、前記改変された微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項16〜19のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項21

前記アルギニンの産生のための前記少なくとも1つの遺伝子配列が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項16〜20のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項22

前記誘導性プロモーターが、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導される、請求項21に記載の改変された微生物。

請求項23

前記免疫イニシエーターが、5−FUである、請求項5に記載の改変された微生物。

請求項24

5−FCを5−FUに変換することができる酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む、請求項23に記載の改変された微生物。

請求項25

前記少なくとも1つの遺伝子配列が、codAである、請求項24に記載の改変された微生物。

請求項26

前記少なくとも1つの遺伝子配列が、前記改変された微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項24または請求項25に記載の改変された微生物。

請求項27

前記免疫イニシエーターをコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項24〜26のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項28

前記誘導性プロモーターが、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導される、請求項27に記載の改変された微生物。

請求項29

前記免疫サステナーが、T細胞の移動および浸潤を増強すること、T細胞によるがん細胞の認識を増強すること、エフェクター細胞応答を増強すること、および/または免疫抑制を克服することができる、請求項1に記載の改変された微生物。

請求項30

前記免疫サステナーが、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる治療用分子、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成もしくは異化経路の少なくとも1つの酵素、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成もしくは異化経路の少なくとも1つの酵素によって産生される少なくとも1つの治療用分子、またはRNA干渉、マイクロRNA応答もしくは阻害、TLR応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合、もしくは遺伝子編集を媒介する核酸分子である、請求項1または請求項29に記載の改変された微生物。

請求項31

前記免疫サステナーが、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、T細胞共刺激受容体、またはT細胞共刺激受容体リガンドである、請求項1、29、または30のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項32

前記免疫サステナーが、代謝変換因子、アルギニン、STINGアゴニスト、CXCL9、CXCL10、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、アゴニスト抗GITR抗体もしくはGITRL、アゴニスト抗OX40抗体もしくはOX40L、アゴニスト抗4−1BB抗体もしくは4−1BBL、IL−15、IL−15sushi、IFNγ、またはIL−12である、請求項1または29〜31のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項33

前記免疫サステナーが、代謝変換因子である、請求項32に記載の改変された微生物。

請求項34

前記代謝変換因子が、キヌレニン消費経路の少なくとも1つの酵素またはアデノシン消費経路の少なくとも1つの酵素である、請求項33に記載の改変された微生物。

請求項35

前記キヌレニン消費経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む、請求項33または請求項34に記載の改変された微生物。

請求項36

前記キヌレニン消費経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、キヌレニナーゼ遺伝子配列である、請求項35に記載の改変された微生物。

請求項37

前記少なくとも1つの遺伝子配列が、kynUである、請求項36に記載の改変された微生物。

請求項38

前記少なくとも1つの遺伝子配列が、構成的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項37に記載の改変された微生物。

請求項39

前記キヌレニン消費経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、前記微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項35〜38のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項40

trpEの欠失または突然変異を含む、請求項35〜39のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項41

アデノシン消費経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む、請求項32または請求項33に記載の改変された微生物。

請求項42

前記アデノシン消費経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、add、xapA、deoD、xdhA、xdhB、およびxdhCから選択される、請求項41に記載の改変された微生物。

請求項43

前記アデノシン消費経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項42に記載の改変された微生物。

請求項44

前記アデノシン消費経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、前記微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項41〜43のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項45

前記微生物にアデノシンを移入するための酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む、請求項41〜44のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項46

前記微生物にアデノシンを移入するための前記酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、nupCまたはnupGである、請求項45に記載の改変された微生物。

請求項47

免疫サステナーが、アルギニンである、請求項32または請求項33に記載の改変された微生物。

請求項48

アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む、請求項47に記載の改変された微生物。

請求項49

前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも1つの酵素が、フィードバック耐性argAを含む、請求項48に記載の改変された微生物。

請求項50

前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argJ、carA、およびcarBからなる群から選択される、請求項48または請求項49に記載の改変された微生物。

請求項51

前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項48〜50のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項52

前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも1つの酵素をコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、前記改変された微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項48〜51のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項53

アルギニンリプレッサー遺伝子(argR)の欠失または突然変異をさらに含む、請求項47〜52のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項54

前記免疫サステナーが、STINGアゴニストである、請求項32または請求項33に記載の改変された微生物。

請求項55

前記STINGアゴニストが、c−ジAMP、c−GAMP、またはc−ジGMPである、請求項54に記載の改変された微生物。

請求項56

前記STINGアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む、請求項54〜55のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項57

前記免疫サステナーをコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、dacA遺伝子配列である、請求項56に記載の改変された微生物。

請求項58

前記免疫サステナーをコードする前記少なくとも1つの遺伝子配列が、cGAS遺伝子配列である、請求項56に記載の改変された微生物。

請求項59

前記cGAS遺伝子配列が、ヒトcGAS遺伝子配列、VerminephrobactereiseniaecGAS遺伝子配列、KingelladenitrificanscGAS遺伝子配列、およびNeisseriabacilliformiscGAS遺伝子配列から選択される、請求項58に記載の改変された微生物。

請求項60

細菌または酵母である、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項61

E.coli細菌である、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項62

E.coliNissle細菌である、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項63

1つまたは複数の栄養要求体をもたらす遺伝子において少なくとも1つの突然変異または欠失を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項64

前記少なくとも1つの欠失または突然変異が、dapA遺伝子および/またはthyA遺伝子におけるものである、請求項63に記載の改変された微生物。

請求項65

ファージ欠失を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変された微生物。

請求項66

免疫イニシエーターを産生することができる少なくとも1つの改変された微生物と、免疫サステナーとを含む、組成物

請求項67

前記少なくとも1つの改変された微生物が、前記免疫イニシエーターおよび前記免疫サステナーを産生することができる、請求項66に記載の組成物。

請求項68

前記少なくとも1つの改変された微生物が、前記免疫イニシエーターを産生することができ、少なくとも第2の改変された微生物が、前記免疫サステナーを産生することができる、請求項66に記載の組成物。

請求項69

前記免疫サステナーが、前記組成物中の改変された微生物によって産生されない、請求項66に記載の組成物。

請求項70

免疫サステナーを産生することができる少なくとも1つの改変された微生物と、免疫イニシエーターとを含む、組成物。

請求項71

前記少なくとも1つの改変された微生物が、前記免疫イニシエーターおよび前記免疫サステナーを産生することができる、請求項70に記載の組成物。

請求項72

前記少なくとも1つの改変された微生物が、前記免疫サステナーを産生することができ、少なくとも第2の改変された微生物が、前記免疫イニシエーターを産生することができる、請求項70に記載の組成物。

請求項73

前記免疫イニシエーターが、前記組成物中の改変された微生物によって産生されない、請求項70に記載の組成物。

請求項74

請求項1〜65のいずれか一項に記載の改変された微生物または請求項66〜73のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物。

請求項75

腫瘍内投与のために製剤化される、請求項74に記載の薬学的に許容される組成物。

請求項76

請求項74または請求項75に記載の薬学的に許容される組成物と、その使用のための説明書とを含む、キット

請求項77

対象におけるがんを処置する方法であって、請求項74または請求項75に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象におけるがんを処置する、方法。

請求項78

対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、請求項74または請求項75に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記免疫応答を誘導および維持する、方法。

請求項79

腫瘍を有する対象においてアブスコパル効果を誘導する方法であって、請求項74または請求項75に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記アブスコパル効果を誘導する、方法。

請求項80

腫瘍を有する対象において免疫学的記憶を誘導する方法であって、請求項74または請求項75に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記免疫学的記憶を誘導する、方法。

請求項81

対象において腫瘍の部分的な退縮を誘導する方法であって、請求項74または請求項75に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記腫瘍の前記部分的な退縮を誘導する、方法。

請求項82

前記部分的な退縮が、前記腫瘍のサイズの少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、または少なくとも約75%の減少である、請求項81に記載の方法。

請求項83

対象において腫瘍の完全な退縮を誘導する方法であって、請求項74または請求項75に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記腫瘍の前記完全な退縮を誘導する、方法。

請求項84

前記腫瘍が、前記薬学的に許容される組成物の投与後に、前記対象において検出可能ではない、請求項83に記載の方法。

請求項85

対象におけるがんを処置する方法であって、第1の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第1の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、第2の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第2の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、前記対象におけるがんを処置する、方法。

請求項86

対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、第1の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第1の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、第2の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第2の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、前記対象において前記免疫応答を誘導および維持する、方法。

請求項87

前記投与するステップが、同時に行われるか、前記第1の改変された微生物を前記対象に投与するステップが、前記第2の改変された微生物を前記対象に投与するステップの前に生じるか、または前記第2の改変された微生物を前記対象に投与するステップが、前記第1の改変された微生物を前記対象に投与するステップの前に生じる、請求項85または請求項86に記載の方法。

請求項88

対象におけるがんを処置する方法であって、第1の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第1の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、免疫サステナーを前記対象に投与するステップと、を含み、それによって、前記対象におけるがんを処置する、方法。

請求項89

対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、第1の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第1の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、免疫サステナーを前記対象に投与するステップと、を含み、それによって、前記対象において前記免疫応答を誘導および維持する、方法。

請求項90

前記投与するステップが、同時に行われるか、前記第1の改変された微生物を前記対象に投与するステップが、前記免疫サステナーを前記対象に投与するステップの前に生じるか、または前記免疫サステナーを前記対象に投与するステップが、前記第1の改変された微生物を前記対象に投与するステップの前に生じる、請求項88または請求項89に記載の方法。

請求項91

対象におけるがんを処置する方法であって、免疫イニシエーターを前記対象に投与するステップと、第1の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第1の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、前記対象におけるがんを処置する、方法。

請求項92

対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、免疫イニシエーターを前記対象に投与するステップと、第1の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第1の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、前記対象において前記免疫応答を誘導および維持する、方法。

請求項93

前記投与するステップが、同時に行われるか、前記第1の改変された微生物を前記対象に投与する前記ステップが前記免疫イニシエーターを前記対象に投与する前記ステップの前に生じるか、または前記免疫イニシエーターを前記対象に投与する前記ステップが、前記第1の改変された微生物を前記対象に投与する前記ステップの前に生じる、請求項91または請求項92に記載の方法。

請求項94

前記投与するステップが、腫瘍内注射である、請求項77〜93のいずれか一項に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願
本出願は、2017年7月12日に出願された米国仮出願第62/531,784号、2017年8月9日に出願された米国仮出願第62/543,322号、2017年8月30日に出願された米国仮出願第62/552,319号、2017年11月29日に出願された米国仮出願第62/592,317号、2017年12月18日に出願された米国仮出願第62/607,210号、2018年1月5日に出願されたPCT出願PCT/US2018/012698、2018年2月9日に出願された米国仮出願第62/628,786号、2018年3月13日に出願された米国仮出願第62/642,535号、2018年4月13日に出願された米国仮出願第62/657,487号、および2018年6月22日に出願された米国仮出願第62/688,852号に対する優先権を主張する。前述の出願のそれぞれの全内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表

0002

本出願は、ASCII形式電子的に提出した配列表を含み、この配列表は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。2018年7月10日に作成された前記ASCIIコピーは、126046−31320_SL.txtという名であり、サイズは1,784,310バイトである。

背景技術

0003

現行がん治療は、免疫療法外科手術化学療法放射線療法、またはこれらの何らかの組合せの使用を用いるのが一般的である(アメリカがん協会(American Cancer Society))。これらの薬物は、がん患者への大きな恩恵を示してきたが、多くのがんは、従来の治療法を使用して処置することが未だに困難である。現在、多くの従来のがん治療は、全身投与されるため健常組織に悪影響を及ぼし、結果として有意な副作用が生じることになる。例えば、多くのがん治療は、患者の抗腫瘍応答を後押しするために免疫系を活性化することに重点を置いている(Kongら、2014年)。しかし、そのような治療にもかかわらず、腫瘍の周囲の微小環境は、依然として高免疫抑制性である。加えて、全身的な免疫調節の変更は、日和見自己免疫障害および免疫関連有害事象の発生を含む、免疫不全を誘発する。

0004

がん細胞を特異的に標的とする細胞傷害薬を開発するために、過去数十年にわたって大きな努力が払われてきた。近年、腫瘍学におけるパラダイムシフトし、がんの臨床的問題は、がん細胞の遺伝的異常の蓄積であるばかりでなく、免疫系によるこれらの異常細胞の寛容でもあると考えられている。その結果、最近の抗がん治療剤は、がん細胞ではなく免疫系を特異的に標的とするように設計されている。そのような治療法は、がん免疫寛容回復させること、および有効な抗腫瘍免疫応答を刺激することを目標とする。例えば、現行の免疫療法は、パターン認識受容体PRRアゴニストである免疫刺激性分子、または腫瘍微小環境浸潤する様々な免疫細胞集団を標的とする免疫刺激性モノクローナル抗体を含む。しかし、それらの免疫標的設計にもかかわらず、これらの治療法は、あたかも免疫療法の全身投与(例えば、2〜3週間ごとの静脈内注入)に頼る従来の抗がん薬であるかのように、臨床開発されてきた。結果として、多くの現行の免疫療法は、高い投薬要求量に起因して毒性に悩まされ、そしてまた、望ましくない自己免疫応答または他の免疫関連有害事象をもたらすことが多い。

課題を解決するための手段

0005

したがって、脈管形成不良の低酸素腫瘍領域を標的とすることができる、がん性細胞を特異的に標的とする一方で正常組織にはほとんど影響を及ぼさず、がん免疫寛容を回避することまたは回復させることを含めて免疫系を腫瘍と闘うように後押しする、有効ながん治療に対するまだ対処されていない要求がある。

0006

本開示は、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的とする微生物であって、腫瘍部位局所的に産生される1つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーター、あるいは1つもしくは複数の免疫イニシエーターおよび/または1つもしくは複数のサステナーの組合せを産生することができる微生物の組成物、方法、および使用を提供する。ある特定の態様では、本開示は、1つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターおよび/またはサステナーを産生するように操作されている、微生物を提供する。ある特定の態様では、操作された微生物は、細菌、例えば、Salmonella typhimurium、Escherichia coli Nissle、Clostridium novyiNT、およびClostridium butyricum miyairi、ならびに本明細書で提供される他の例示的菌株であり、これらは、腫瘍微小環境に選択的にホーミングすることができる。したがって、ある特定の実施形態では、操作された微生物は、例えば、経口投与静脈内注射皮下注射、腫瘍内注射、または他の手段により、全身投与され、腫瘍部位に選択的にコロニー形成することができる。

0007

一態様では、少なくとも1つの免疫イニシエーターを産生することができる、改変された微生物が、本明細書において開示される。一態様では、少なくとも1つの免疫サステナーを産生することができる、改変された微生物が、本明細書において開示される。一態様では、少なくとも1つの免疫イニシエーターおよび少なくとも1つの免疫サステナーを産生することができる、改変された微生物が、本明細書において開示される。

0008

別の態様では、免疫イニシエーター、例えば、サイトカインケモカイン単鎖抗体リガンド代謝変換因子、T細胞共刺激受容体、T細胞共刺激受容体リガンド操作化学療法、または溶解性ペプチドと、少なくとも1つの免疫サステナーを産生することができる第1の改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。さらに別の態様では、免疫サステナー、例えば、ケモカイン、サイトカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、T細胞共刺激受容体、またはT細胞共刺激受容体リガンドと、少なくとも1つの免疫イニシエーターを産生することができる第1の改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。別の態様では、少なくとも1つの免疫イニシエーターを産生することができる第1の改変された微生物と、少なくとも1つの免疫サステナーを産生することができる少なくとも第2の改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。

0009

一実施形態では、免疫イニシエーターは、腫瘍溶解を増強すること、抗原提示細胞APC)を活性化すること、ならびに/またはT細胞をプライミングおよび活性化することができる。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、腫瘍溶解を増強することができる。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、APCを活性化することができる。さらに別の実施形態では、免疫イニシエーターは、T細胞をプライミングおよび活性化することができる。

0010

一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる治療用分子である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成経路または異化経路の少なくとも1つの酵素である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成経路または異化経路の少なくとも1つの酵素によって産生される、少なくとも1つの治療用分子である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、RNA干渉マイクロRNA応答もしくは阻害TLR応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合、または遺伝子編集を媒介する、核酸分子である。

0011

一実施形態では、免疫イニシエーターは、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、T細胞共刺激受容体、T細胞共刺激受容体リガンド、操作化学療法、または溶解性ペプチドである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、分泌されるペプチドまたは提示されるペプチドである。

0012

一実施形態では、免疫イニシエーターは、STINGアゴニスト、アルギニン、5−FU、TNFα、IFNγ、IFNβ1、アゴニスト抗CD40抗体、CD40L、SIRPα、GMCSF、アゴニスト抗OXO40抗体、OXO40L、アゴニスト抗4−1BB抗体、4−1BBL、アゴニスト抗GIR抗体、GITRL、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、またはアズリンである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、STINGアゴニストである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、5−FUである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、TNFαである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、IFNγである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、IFNβ1である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗CD40抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、SIRPαである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、CD40Lである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、GMCSFである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗OXO40抗体である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、OXO40Lである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗4−1BB抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、4−1BBLである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗GITR抗体である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、GITRLである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗PD1抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗PDL1抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アズリンである。

0013

一実施形態では、免疫イニシエーターは、STINGアゴニストである。一実施形態では、STINGアゴニストは、c−ジAMPである。一実施形態では、STINGアゴニストは、c−GAMPである。一実施形態では、STINGアゴニストは、c−ジGMPである。

0014

一実施形態では、改変された微生物は、免疫イニシエーターを産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、dacA遺伝子配列である。一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、cGAS遺伝子配列である。一実施形態では、cGAS遺伝子配列は、ヒトcGAS遺伝子配列である。一実施形態では、cGAS遺伝子配列は、ヒトcGAS遺伝子配列、Verminephrobacter eiseniae cGAS遺伝子配列、Kingella denitrificans cGAS遺伝子配列、およびNeisseria bacilliformis cGAS遺伝子配列から選択される。

0015

一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、改変された微生物の染色体に組み込まれている。一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、プラスミド上に存在する。一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、誘導性プロモーター作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、低酸素、嫌気、またはハイポシック条件によって誘導される。

0016

一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンである。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素である。

0017

一実施形態では、微生物は、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、フィードバック耐性argAを含む。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argJ、carA、およびcarBからなる群から選択される。一実施形態では、微生物は、アルギニンリプレッサー遺伝子(argR)の欠失または突然変異をさらに含む。一実施形態では、アルギニンの産生のための少なくとも1つの遺伝子配列は、改変された微生物の染色体に組み込まれている。一実施形態では、アルギニンの産生のための少なくとも1つの遺伝子配列は、プラスミド上に存在する。一実施形態では、アルギニンの産生のための少なくとも1つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導される。

0018

一実施形態では、免疫イニシエーターは、5−FUである。

0019

一実施形態では、微生物は、5−FCを5−FUに変換することができる酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、codAである。一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、改変された微生物の染色体に組み込まれている。別の実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、プラスミド上に存在する。一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、FNRプロモーターである。

0020

一実施形態では、免疫サステナーは、T細胞の移動および浸潤を増強すること、T細胞によるがん細胞の認識を増強すること、エフェクター細胞応答を増強すること、および/または免疫抑制を克服することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、T細胞の移動および浸潤を増強することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、T細胞によるがん細胞の認識を増強することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、エフェクターT細胞応答を増強することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、免疫抑制を克服することができる。

0021

一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる治療用分子である。一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成または異化経路の少なくとも1つの酵素である。一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成または異化経路の少なくとも1つの酵素によって産生される、少なくとも1つの治療用分子である。一実施形態では、免疫サステナーは、RNA干渉、マイクロRNA応答もしくは阻害、TLR応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合、または遺伝子編集を媒介する、核酸分子である。

0022

一実施形態では、免疫サステナーは、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、T細胞共刺激受容体、T細胞共刺激受容体リガンド、または分泌もしくは提示されるペプチドである。

0023

一実施形態では、免疫サステナーは、代謝変換因子、アルギニン、STINGアゴニスト、CXCL9、CXCL10、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、アゴニスト抗GITR抗体もしくはGITRL、アゴニスト抗OX40抗体もしくはOX40L、アゴニスト抗4−1BB抗体もしくは4−1BBL、IL−15、IL−15 sushi、IFNγ、またはIL−12である。一実施形態では、免疫サステナーは、分泌されるペプチドまたは提示されるペプチドである。

0024

一実施形態では、免疫サステナーは、代謝変換因子である。一実施形態では、代謝変換因子は、キヌレニン消費経路の少なくとも1つの酵素である。別の実施形態では、代謝変換因子は、アデノシン消費経路の少なくとも1つの酵素である。別の実施形態では、代謝変換因子は、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素である。

0025

一実施形態では、微生物は、キヌレニン消費経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、キヌレニン消費経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、キヌレニナーゼ遺伝子配列である。一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、kynUである。一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、キヌレニン消費経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、微生物の染色体に組み込まれている。別の実施形態では、キヌレニン消費経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、プラスミド上に存在する。一実施形態では、微生物は、trpEの欠失または突然変異を含む。

0026

一実施形態では、微生物は、アデノシン消費経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、アデノシン消費経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、add、xapA、deoD、xdhA、xdhB、およびxdhCから選択される。一実施形態では、アデノシン消費経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、アデノシン消費経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、微生物の染色体に組み込まれている。別の実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、プラスミド上に存在する。一実施形態では、改変された微生物は、微生物にアデノシンを移入するための酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、微生物にアデノシンを移入するための酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、nupCまたはnupGである。

0027

一実施形態では、免疫サステナーは、アルギニンである。一実施形態では、微生物は、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、フィードバック耐性argAを含む。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argJ、carA、およびcarBからなる群から選択される。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、改変された微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する。一実施形態では、微生物は、アルギニンリプレッサー遺伝子(argR)の欠失または突然変異をさらに含む。

0028

一実施形態では、免疫サステナーは、STINGアゴニストである。一実施形態では、STINGアゴニストは、c−ジAMP、c−GAMP、またはc−ジGMPである。別の実施形態では、改変された微生物は、STINGアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、免疫サステナーをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、dacA遺伝子配列である。一実施形態では、免疫サステナーをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、cGAS遺伝子配列である。一実施形態では、cGAS遺伝子配列は、ヒトcGAS遺伝子配列、Verminephrobacter eiseniae cGAS遺伝子配列、Kingella denitrificans cGAS遺伝子配列、およびNeisseria bacilliformis cGAS遺伝子配列から選択される。

0029

一実施形態では、免疫イニシエーターは、免疫サステナーと同じではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、免疫サステナーとは異なる。

0030

一実施形態では、改変された微生物は、STINGアゴニストを産生することができる酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、STINGアゴニストをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、dacA遺伝子である。一実施形態では、STINGアゴニストをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、cGAS遺伝子である。一実施形態では、STINGアゴニストは、c−ジAMPである。一実施形態では、STINGアゴニストは、c−GAMPである。一実施形態では、STINGアゴニストは、c−ジGMPである。

0031

一実施形態では、細菌は、細菌が腫瘍に存在する場合に補完されない遺伝子における栄養要求株である。一実施形態では、細菌が腫瘍に存在する場合に補完されない遺伝子は、dapA遺伝子である。一実施形態では、dapA遺伝子の発現は、1つまたは複数の免疫イニシエーターの発現を微調整する。一実施形態では、細菌は、細菌が腫瘍に存在する場合に補完される遺伝子における栄養要求株である。一実施形態では、細菌が腫瘍に存在する場合に補完される遺伝子は、thyA遺伝子である。

0032

一実施形態では、細菌は、内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含む。

0033

一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、低酸素または嫌気条件によって誘導される。一実施形態では、誘導性プロモーターは、腫瘍のハイポキシック環境によって誘導される。一実施形態では、プロモーターは、FNRプロモーターである。

0034

一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、細菌の染色体に組み込まれている。一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、細菌のプラスミド上に位置する。

0035

一実施形態では、細菌は、非病原性である。一実施形態では、細菌は、Escherichia coli Nissleである。

0036

一態様では、エフェクター分子を産生することができる改変された微生物であって、エフェクター分子が、CXCL9、CXCL10、ヒアルロニダーゼ、およびSIRPαからなる群から選択される、改変された微生物が、本明細書において開示される。

0037

一実施形態では、改変された微生物は、CXCL9をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、CXCL9をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに連結されている。

0038

一実施形態では、改変された微生物は、CXCL10をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、CXCL10をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに連結されている。

0039

一実施形態では、改変された微生物は、ヒアルロニダーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに連結されている。

0040

一実施形態では、改変された微生物は、SIRPαをコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、SIRPαをコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに連結されている。

0041

一実施形態では、エフェクター分子は、分泌される。別の実施形態では、エフェクター分子は、細胞表面に提示される。

0042

一態様では、5−FCを5−FUに変換することができる改変された微生物が、本明細書において開示される。別の態様では、5−FCを5−FUに変換することができる改変された微生物であって、さらに、STINGアゴニストを産生することができる、改変された微生物が、本明細書において開示される。

0043

一実施形態では、微生物は、5−FCを5−FUに変換することができる酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、codAである。一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、codA::upp融合体である。一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、FNRプロモーターである。一実施形態では、少なくとも1つの遺伝子配列は、微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する。

0044

一実施形態では、5−FCを5−FUに変換することができる微生物は、さらに、STINGアゴニストを産生することができる。一実施形態では、STINGアゴニストは、c−ジAMP、c−GAMP、またはc−ジGMPである。一実施形態では、改変された微生物は、STINGアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、STINGアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、dacA遺伝子配列である。一実施形態では、STINGアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、cGAS遺伝子配列である。一実施形態では、cGAS遺伝子配列は、ヒトcGAS遺伝子配列である。一実施形態では、STINGアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、FNRプロモーターである。一実施形態では、STINGアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列は、微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する。

0045

別の態様では、二量体化IL−12を分泌することができる改変された微生物であって、リンカー配列によってp40 IL−12サブユニット遺伝子配列に連結されたp35 IL−12サブユニット遺伝子配列を含む遺伝子配列と、分泌タグ配列とを含む、改変された微生物が、本明細書において開示される。一実施形態では、分泌タグ配列は、配列番号1235、1146〜1154、1156、および1168からなる群から選択される。一実施形態では、リンカー配列は、配列番号1194を含む。一実施形態では、p35 IL−12サブユニット遺伝子配列は、配列番号1192を含み、p40 IL−12サブユニット遺伝子配列は、配列番号1193を含む。一実施形態では、遺伝子配列は、配列番号1169〜1179からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、FNRプロモーターである。一実施形態では、遺伝子配列は、微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する。

0046

別の態様では、IL−15融合タンパク質を分泌することができる改変された微生物であって、sushiドメイン配列に融合されたIL−15遺伝子配列を含む配列を含む、改変された微生物が、本明細書において開示される。一実施形態では、配列は、配列番号1195〜1198からなる群から選択される。

0047

一実施形態では、本明細書に開示される改変された微生物は、細菌である。一実施形態では、本明細書に開示される改変された微生物は、酵母である。一実施形態では、改変された微生物は、E.coli細菌である。一実施形態では、改変された微生物は、E.coli Nissle細菌である。

0048

一実施形態では、本明細書に開示される改変された微生物は、1つまたは複数の栄養要求体をもたらす遺伝子の少なくとも1つの突然変異または欠失を含む。一実施形態では、少なくとも1つの欠失または突然変異は、dapA遺伝子および/またはthyA遺伝子におけるものである。

0049

一実施形態では、本明細書に開示される改変された微生物は、ファージ欠失を含む。

0050

一態様では、免疫イニシエーターを産生することができる少なくとも第1の改変された微生物と、免疫サステナーを産生することができる少なくとも第2の改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。

0051

一態様では、免疫サステナーと、免疫イニシエーターを産生することができる少なくとも1つの改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。一実施形態では、少なくとも1つの改変された微生物は、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーの両方を産生することができる。別の実施形態では、少なくとも1つの改変された微生物は、免疫イニシエーターを産生することができ、少なくとも第2の改変された微生物は、免疫サステナーを産生することができる。さらに別の実施形態では、免疫サステナーは、組成物中の改変された微生物によって産生されない。

0052

一態様では、免疫イニシエーターと、免疫サステナーを産生することができる少なくとも1つの改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。一実施形態では、少なくとも1つの改変された微生物は、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーの両方を産生することができる。別の実施形態では、少なくとも1つの改変された微生物は、免疫サステナーを産生することができ、少なくとも第2の改変された微生物は、免疫イニシエーターを産生することができる。さらに別の実施形態では、免疫イニシエーターは、組成物中の改変された微生物によって産生されない。

0053

一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニン、TNFα、IFNγ、IFNβ1、GMCSF、抗CD40抗体、CD40L、アゴニスト抗OX40抗体、OXO40L、アゴニスト抗41BB抗体、41BBL、アゴニスト抗GITR抗体、GITRL、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、および/またはアズリンではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、TNFαではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、IFNγではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、IFNβ1ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗CD40抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、CD40Lではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、GMCSFではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗OXO40抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、OXO40Lではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗4−1BB抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、4−1BBLではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗GITR抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、GITRLではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗PD1抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗PDL1抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アズリンではない。

0054

一実施形態では、免疫サステナーは、キヌレニン消費経路の少なくとも1つの酵素でも、アデノシン消費経路の少なくとも1つの酵素でも、抗PD1抗体でも、抗PDL1抗体でも、抗CTLA4抗体でも、IL−15でも、IL−15 sushiでも、IFNγでも、アゴニスト抗GITR抗体でも、GITRLでも、アゴニスト抗OX40抗体でも、OX40Lでも、アゴニスト抗4−1BB抗体でも、4−1BBLでも、IL−12でもない。一実施形態では、免疫サステナーは、キヌレニン消費経路の少なくとも1つの酵素ではない。一実施形態では、免疫サステナーハ、アデノシン消費経路の少なくとも1つの酵素ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アルギニンではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アルギニン生合成経路の少なくとも1つの酵素ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、抗PD1抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、抗PDL1抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、抗CTLA4抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アゴニスト抗GITR抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、GITRLではない。一実施形態では、免疫サステナーは、IL−15ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、IL−15 sushiではない。一実施形態では、免疫サステナーは、IFNγではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アゴニスト抗OX40抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、OX40Lではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アゴニスト抗4−1BB抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、4−1BBLではない。一実施形態では、免疫サステナーは、IL−12ではない。

0055

一態様では、本明細書に開示される改変された微生物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物が、本明細書において開示される。一態様では、本明細書に開示される組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物が、本明細書において開示される。一実施形態では、組成物は、腫瘍内注射用に製剤化される。別の実施形態では、薬学的に許容される組成物は、がんを有する対象の処置において使用するためのものである。別の実施形態では、薬学的に許容される組成物は、対象における免疫応答の誘導およびモジュレートに使用するためのものである。

0056

一態様では、本明細書に開示される薬学的に許容される組成物と、その使用のための説明書とを含む、キットが、本明細書において開示される。

0057

一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、本明細書に開示される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象におけるがんを処置する、方法が、本明細書において開示される。

0058

一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、本明細書に開示される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する、方法が、本明細書において開示される。

0059

一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、本明細書に記載される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する、方法が、本明細書において開示される。

0060

別の態様では、腫瘍を有する対象においてアブスコパル効果を誘導する方法であって、本明細書に記載される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象においてアブスコパル効果を誘導する、方法が、本明細書において開示される。

0061

一態様では、腫瘍を有する対象において免疫学的記憶を誘導する方法であって、本明細書に記載される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象において免疫学的記憶を誘導する、方法が、本明細書において開示される。

0062

一態様では、対象において腫瘍の部分的な退縮を誘導する方法であって、本明細書に記載される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象において腫瘍の部分的な退縮を誘導する、方法が、本明細書において開示される。一実施形態では、部分的な退縮は、腫瘍のサイズの少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、または少なくとも約75%の減少である。

0063

一態様では、対象において腫瘍の完全な退縮を誘導する方法であって、本明細書に記載される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象において腫瘍の完全な退縮を誘導する、方法が、本明細書において開示される。一実施形態では、腫瘍は、薬学的に許容される組成物の投与の後に、対象において検出可能ではない。

0064

一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、第1の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第1の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、第2の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第2の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、対象におけるがんを処置する、方法が、本明細書において開示される。

0065

一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、第1の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第1の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、第2の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第2の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する、方法が、本明細書において開示される。

0066

一実施形態では、投与するステップは、同時に行われる。一実施形態では、第1の改変された微生物を対象に投与するステップが、第2の改変された微生物を対象に投与するステップの前に生じる。一実施形態では、第2の改変された微生物を対象に投与するステップが、第1の改変された微生物を対象に投与するステップの前に生じる。

0067

一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、第1の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第1の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、免疫サステナーを対象に投与するステップと、を含み、それによって、対象におけるがんを処置する、方法が、本明細書において開示される。

0068

一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、第1の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第1の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、免疫サステナーを対象に投与するステップと、を含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する、方法が、本明細書において開示される。

0069

一実施形態では、投与するステップは、同時に行われる。一実施形態では、第1の改変された微生物を対象に投与するステップが、免疫サステナーを対象に投与するステップの前に生じる。別の実施形態では、免疫サステナーを対象に投与するステップが、第1の改変された微生物を対象に投与するステップの前に生じる。

0070

一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、免疫イニシエーターを対象に投与するステップと、第1の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第1の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、対象におけるがんを処置する、方法が、本明細書において開示される。

0071

一態様では、対象における免疫応答を誘導および維持する方法であって、免疫イニシエーターを対象に投与するステップと、第1の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第1の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、対象における免疫応答を誘導および維持する、方法が、本明細書において開示される。

0072

一実施形態では、投与するステップは、同時に行われる。一実施形態では、第1の改変された微生物を対象に投与するステップが、免疫イニシエーターを対象に投与するステップの前に生じる。一実施形態では、免疫イニシエーターを対象に投与するステップが、第1の改変された微生物を対象に投与するステップの前に生じる。

0073

一実施形態では、投与するステップは、腫瘍内注射である。

0074

したがって、本開示は、1つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列を含む、1つまたは複数の改変された細菌を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫イニシエーターであり、これは、例えば、腫瘍溶解、樹状細胞もしくはマクロファージによる抗原提示、またはT細胞の活性化もしくはプライミングをモジュレート、例えば、促進し得る。そのような免疫イニシエーターの例としては、サイトカインもしくはケモカイン、例えば、TNFα、IFN−ガンマ、およびIFN−ベータ1、単鎖抗体、例えば、抗CD40抗体、または(3)リガンド、例えば、SIRPαもしくはCD40L、代謝酵素(生合成または異化)、例えば、STINGアゴニスト産生酵素、または(5)細胞傷害性化学療法が挙げられる。免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターは、自然には遺伝子配列と会合していないプロモーターに作動可能に連結していてもよい。

0075

一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、1つまたは複数のSTINGアゴニスト、例えば、c−ジ−AMP、3’3’−cGAMP、および/またはc−2’3’−cGAMPを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、Listeria monocytogenesからの、例えば、DacAをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、3’3’−cGAMPシンターゼをコードする遺伝子配列を含む。本開示において記載されている3’3’−cGAMPシンターゼの非限定的な例としては、Verminephrobacter eiseniae(EF01−2 Earthworm symbiont)の3’3’−cGAMPシンターゼ、Kingella denitrificans(ATCC33394)由来の3’3’−cGAMP シンターゼ、およびNeisseria bacilliformis(ATCC BAA−1200)由来の3’3’−cGAMPシンターゼが挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、2’3’−cGAMPシンターゼ、例えば、ヒトcGASをコードする遺伝子配列を含む。

0076

一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、OX40、GITR、41BBを含むがこれらに限定されない、共刺激受容体のアゴニストをコードする遺伝子配列を含む。

0077

一部の実施形態では、本開示の組成物は、操作化学療法をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌を含む。操作化学療法の一例は、腫瘍の場合、5−FCを5−FUに変換することができる、操作された細菌によって提供され得る。

0078

一部の実施形態では、組成物は、腫瘍浸潤もしくはT細胞応答をモジュレート、例えば、増強し得るか、または免疫抑制をモジュレート、例えば、軽減し得る、免疫サステナーを産生するための遺伝子配列を含む、1つまたは複数の遺伝子操作された微生物をさらに含む。そのようなサステナーは、サイトカインまたはケモカイン、単鎖抗体アンタゴニストペプチドまたはリガンド、および代謝酵素経路から選択され得る。

0079

遺伝子操作された細菌によって産生され得る免疫維持サイトカインの例としては、IL−15およびCXCL10が挙げられ、これらは、腫瘍微小環境に分泌され得る。単鎖抗体の非限定的な例としては、抗PD−1、抗PD−L1、または抗CTLA−4が挙げられ、これらは、腫瘍微小環境に分泌されるか、または微生物の細胞表面上に提示され得る。

0080

一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、1つまたは複数の代謝変換のための回路網をコードする遺伝子配列を含む、すなわち、細菌は、自然には生合成または異化のいずれかであり得る、1つまたは複数の酵素に触媒される反応を行うことができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫開始および/もしくは免疫維持をモジュレート、例えば、促進するかもしくはそれに寄与する代謝物を産生することができるか、または免疫抑制をモジュレート、例えば、促進する代謝物を消費することができる。例えば、一部の実施形態では、組成物は、例えば、例としてPseudomonas fluorescensに由来するキヌレニナーゼを発現させることにより、免疫抑制性代謝物であるキヌレニンを消費することができる、遺伝子操作された細菌を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン異化経路および必要に応じてアデノシン輸送体をコードする遺伝子配列を含み、腫瘍微小環境内で、腫瘍成長を促進する代謝物であるアデノシンを破壊することができる。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、T細胞活性化およびプライミングの刺激因子であるアルギニンを産生することができる。一部の実施形態では、細菌は、腫瘍微小環境においてアンモニアを消費し、腫瘍成長を支持する窒素へのアクセスを低減することができる。

0081

これらの組成物のいずれにおいても、免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターおよび/または免疫サステナーを産生するための遺伝子配列に作動可能に連結されるプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、低酸素または嫌気条件によって、例えば、腫瘍のハイポキシック環境によって、誘導される。本開示のそのような低酸素誘導性プロモーターの非限定的な例としては、FNR誘導性プロモーター、ANR誘導性プロモーター、およびDNR誘導性プロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生するための遺伝子配列に作動可能に連結されるプロモーターは、通常は腫瘍内に存在しない化学インデューサーによって、直接的または間接的に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、適切な成長容器における発酵の間に、in vitroで誘導される。一部の実施形態では、化学インデューサーは、テトラサイクリンIPTG、アラビノース、クメート(cumate)、およびサリチレートから選択される。

0082

一部の実施形態では、組成物は、特定の代謝物の栄養要求株である細菌を含む、例えば、細菌は、微生物が腫瘍に存在する場合には補完されない遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、細菌は、DapA遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、組成物は、特定の代謝物の栄養要求株である細菌を含む、例えば、細菌は、微生物が腫瘍に存在する場合に補完される遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、細菌は、ThyA遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、細菌は、TrpE遺伝子における栄養要求株である。

0083

一部の実施形態では、細菌は、グラム陽性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、偏性嫌気性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、通性嫌気性細菌である。本開示において企図される細菌の非限定的な例としては、Clostridium novyiNT、およびClostridium butyricum、およびBifidobacterium longumが挙げられる。一部の実施形態では、細菌は、E.coli NissleおよびE.coli K−12から選択される。

0084

一部の実施形態では、細菌は、抗生物質耐性遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列のうちの1つまたは複数は、染色体上に存在する。一部の実施形態では、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列のうちの1つまたは複数は、プラスミド上に存在する。

0085

加えて、1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤、例えば、CTLA−4阻害剤、PD−1阻害剤、およびPD−L1阻害剤をさらに含む、医薬組成物が、提供される。そのようなチェックポイント阻害剤は、遺伝子操作された細菌と組み合わせて、逐次的に、または同時に投与されてもよい。

0086

加えて、共刺激受容体、例えば、OX40、GITR、および/または41BBに結合することができるリガンドまたはアゴニスト抗体などのアゴニスト分子を含むがこれらに限定されない、共刺激受容体、例えば、OX40、GITR、および/または41BBの1つまたは複数のアゴニストをさらに含む、医薬組成物が、提供される。そのようなアゴニスト分子は、遺伝子操作された細菌と組み合わせて、逐次的に、または同時に投与されてもよい。

0087

これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌の組合せは、外科手術、化学療法、標的療法、放射線療法、トモセラピー、免疫療法、がんワクチンホルモン療法温熱療法幹細胞移植末梢血骨髄、および臍帯血移植)、光線力学的療法、治療、ならびに血液製剤輸血および輸注、ならびに腫瘍溶解性ウイルスなどの、従来のがん治療と併用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、1つまたは複数の細胞毒または細胞溶解性ペプチドを産生することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、がんまたは腫瘍ワクチンと併用することができる。

0088

一実施形態では、少なくとも1つの免疫イニシエーターを含む改変された細菌であって、免疫イニシエーターが、インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)アゴニストを産生することができる、改変された細菌が、本明細書において開示される。

図面の簡単な説明

0089

図1は、抗原提示細胞におけるSTING経路を示す概略図を表す。

0090

図2は、LC/MSによって測定した場合のin vitroでの細胞外および細胞内環状ジAMP蓄積を示す棒グラフを表す(SYN3527)。dacA発現構築物を含有しない対照株では環状ジAMP蓄積は測定されなかった。

0091

図3は、SYN3527の導入時の環状ジAMP産生を示す棒グラフを表す。

0092

図4Aおよび図4Bは、生きた細菌(図4A)および熱殺菌した細菌(図4B)で処置したRAW 267.4細胞における相対的IFNb1mRNA発現を表す。SYN=ストレプトマイシン抵抗性Nissle。SYN−STING=p15−ptet−DacA(Listeria monocytogenesからのもの)を含むSYN3527。

0093

図5Aおよび図5Bは、SYN3527(Listeria monocytogenesからのテトラサイクリン誘導性DacAを含む)による刺激の4時間後のWTまたはTLR4−/−マウス骨髄由来樹状細胞培養物におけるINF−b1産生(図5A)またはIFN−b1mRNA発現(図5B)を示すグラフを表す。SYN3527を、未誘導で放置した(「STING−UN」)か、または実験前にテトラサイクリンにより誘導した「STING−IN」。TLR4−/−細胞は、LPSに応答することができない。非誘導細菌における低乃至は負のIFNbレベルは、IFNb誘導がSTINGアゴニストの発現に依存することを示す。同様のIFNb誘導レベルがWTおよびTLR4−/−で観察された。これは、IFNbのSTINGアゴニスト媒介誘導がLPS/TLR4に依存しないことを実証する。図5Cおよび図5Dは、SYN3527(Listeria monocytogenesからのテトラサイクリン誘導性DacAを含む)による刺激の4時間後のWTまたはTLR4−/−マウス骨髄由来樹状細胞におけるIL−6 mRNA発現(図5C)またはCD80 mRNA発現(図5D)を示すグラフを表す。SYN3527を、未誘導で放置した(「STING−UN」)か、または実験前にテトラサイクリンにより誘導した「STING−IN」。TLR4−/−細胞は、LPSに応答することができない。IL−6およびCD80レベルは、非誘導のものまたはSYN94と比較して誘導SYN3527への曝露時に同様であり、これは、LPS/TLR4シグナル伝達が、IL−6およびCD80上方調節をもたらすシグナルの大部分の原因となる可能性が高いことを示す。
同上。

0094

図6Aおよび図6Bは、RAW 264.7細胞における様々な感染多重度MOI)でのIFN−ベータ1誘導に対するSTINGアゴニスト産生株の4時間(図6A)ならびに4時間および45分(図6B)の時点での活性のin vitro分析折れ線グラフを表し、SYN3527(テトラサイクリン誘導性dacA構築物を含む)が、RAW264.7細胞(不死化マウスマクロファージ細胞系)における用量依存的IFN−ベータ1誘導を駆動することを実証する。簡単に説明すると、細菌(WT Nissle(グラフ中に「SYN」と標識されている)またはSYN3527(グラフ中に「SYN−STING」と標識されており、Listeria monocytogenesからのテトラサイクリン誘導性DacAを含む)を様々な感染多重度(MOI)で0.5×106個のRAW264.7細胞とともに共培養した。SYN3527を、実験前に未誘導で放置したか、または示されているようにテトラサイクリンにより誘導した。共培養物を示されているように4時間または45分間インキュベートし、タンパク質抽出物を分析した。

0095

図7Aは、in vivoマウス試験概要を示す概略図を表し、その結果を図7Bおよび図7Cに示す。図7Bは、B16−F10腫瘍を移植し、食塩水、SYN94(ストレプトマイシン抵抗性野生型Nissle)、またはSYN3527(テトラサイクリン誘導性dacA構築物を含む)によって処置したマウスの平均腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図7Cは、試験における個々のマウスの腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図7Dは、9日目での腫瘍重量を示すグラフを表す。図7Eはフローサイトメトリーを介して測定した9日目での腫瘍流入領域リンパ節におけるT細胞総数を示すグラフを表す。図7Fは、CD4(従来の)およびCD8 T細胞サブセット中の活性化(CD44 high)T細胞のパーセンテージを示すグラフを表し、図7Gは、フローサイトメトリーを介して測定した9日目での腫瘍流入領域リンパ節におけるSTING注射時のTregの活性化の欠如を示すグラフを表す。図7Hは、腫瘍コロニー形成を示すグラフを表す。N.D.=検出されなかった。
同上。
同上。
同上。
同上。

0096

図8Aおよび図8Bは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Nissleによって処置したマウスと比較した場合の、tet誘導性STINGアゴニスト産生株SYN3527の投与および誘導の2日後(図8A)または9日後(図8B)にLuminex Beadアッセイによって測定したB16腫瘍におけるIFN−b1の濃度を示す棒グラフを表す。

0097

図9A、図9Bおよび図9Cは、SYN−STINGで処置したB16F10腫瘍のサイトカイン動態分析を示す。B16F10腫瘍を本明細書に記載の通り処置し、処置開始後2および9日目に腫瘍のコホート収集した。腫瘍をホモジナイズし、プロテアーゼ阻害剤で処置し、将来の分析のために凍結した。融解したホモジネートを、特別注文のLuminexサイトカインアレイを利用して分析した。図9Aにおけるパネルは、SYN−STING処置に応答して上方調節を示す自然免疫細胞応答を示すサイトカインを示す。図9Bおよび図9Cにおけるパネルは、細胞溶解性および活性化エフェクターT細胞に関連するサイトカインを示す。図9Dにおけるパネルは、細菌注射に応答して上方調節されたサイトカインを示す。コホート内の実験群を比較する多重検定用に調整したホルム・シダック方法を使用して判定した統計的有意性。食塩水と比較した群;*P<0.05、**P<0.005。SYN(WT)と比較した群;#P<0.05。図9Aは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Nissleによって処置したマウスと比較した場合の、tet誘導性STINGアゴニスト産生株SYN3527の投与および誘導の2日および9日後にLuminex Beadアッセイによって測定したB16腫瘍におけるIL−6(左のパネル)、IL−1ベータ(中央のパネル)およびMCP−1(右のパネル)の濃度を示す棒グラフを表す。図9Bは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Nissleによって処置したマウスと比較した場合のtet誘導性STINGアゴニスト産生株SYN3527の投与および誘導の2日および9日後にLuminex Beadアッセイによって測定したB16腫瘍におけるグランザイムB(左のパネル)、IL−2(中央のパネル)、およびIL−15(右のパネル)の濃度を示す棒グラフを表す。図9Cは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Nissleによって処置したマウスと比較した場合のtet誘導性STINGアゴニスト産生株SYN3527の投与および誘導の2日および9日後にLuminex Beadアッセイによって測定したB16腫瘍におけるIFNg(上のパネル)およびIL−12p70(下のパネル)の濃度を示す棒グラフを表す。図9Dは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Nissleによって処置したマウスと比較した場合のtet誘導性STINGアゴニスト産生株SYN3527の投与および誘導の2日および9日後にLuminex Beadアッセイによって測定したB16腫瘍におけるTNF−a(上のパネル)およびGM−CSF(下のパネル)の濃度を示す棒グラフを表す。図9A、図9Bおよび図9C中の各パネルにおける棒グラフは、図9Aおよび図9Bと同じ順序、すなわち、食塩水(左)、ストレプトマイシン抵抗性野生型Nissle(中央)そしてSYN3527(SYN−STING、右)、で並べられている。
同上。
同上。
同上。

0098

図10A、図10Bおよび図10Cは、樹状細胞(DC)およびマクロファージとの共培養後のSYN−STING(SYN3527)活性のin vitro分析を示すグラフを表す。簡単に説明すると、抗原提示細胞集団におけるSTING経路を活性化するSYN−STINGの能力を評価した。細菌(WT NissleまたはSYN3527(Listeria monocytogenesからテトラサイクリン誘導性DacAを含む)を様々な感染多重度(MOI)で0.5×106個のRAW264.7細胞(不死化マウスマクロファージ細胞系)またはマウス骨髄由来DCとともに共培養した。SYN3527を、未誘導で放置した(「STINGun」)か、または実験前にテトラサイクリンにより誘導した「STINGin」。共培養物を示されているように2または4時間インキュベートし、タンパク質抽出物を分析したか、またはmRNAを収集して定量的PCRによってIFNβ1遺伝子誘導を測定した。図10Aおよび図10Bは、刺激の4時間後(図10A)または刺激の2および4時間後(図10B)のマウス骨髄由来樹状細胞におけるIFNβ1(図10A)またはIFN−b1 mRNA誘導(図10B)を示すグラフを表す。図10Cは、2時間の時点でのRAW 264.7細胞における平均IFNβ1遺伝子誘導(mRNAレベル)を表す。60℃で30分間、熱殺菌した細菌を生じさせた。平均Ctrl=対象PBS;LPS=100ng/mLのリポ多糖。PBS処置対照に対して正規化されたすべてのシグナル。
同上。

0099

図11は、3つの異なる用量(1×10^7、5×10^7および1×10^8)でのSTINGアゴニスト産生株の腫瘍体積に対する効果を経時的に示すin vivo分析の折れ線グラフを表し、SYN3527(テトラサイクリン誘導性Listeria monocytogenes dacA構築物を含む)がA20リンパ腫モデルにおいて用量依存的腫瘍制御を駆動することを実証する。

0100

図12A、図12B、図12Cおよび図12Dは、図11に示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。
同上。

0101

図13は、A20腫瘍モデルにおいてSYN3527(WT Tet−STING)により惹起された完全退縮が長期にわたる免疫学的記憶をもたらすことを示す折れ線グラフを表す。未処置対照とは対照的に、以前にSYN3527で処置され、完全退縮を示した動物では、2回目の移植が完全に拒絶された。グラフは、示されている実験群についての個々の腫瘍測定を示す。

0102

図14Aは、STINGアゴニストの産生のための1つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列を発現し、キヌレニン消費酵素の発現のための1つまたは複数の遺伝子配列をさらに発現するように微生物が遺伝子操作される、本開示の非限定的な例の概略図を表す。STINGアゴニストの産生のためのそのような酵素の非限定的な例としては、例えばListeria monocytogenesからの、dacAが挙げられる。そのようなキヌレニン消費酵素の非限定的な例としては、キヌレニナーゼ(例えば、Pseudomonas fluorescensからのキヌレニナーゼ)が挙げられる。より一般的には、免疫イニシエーター回路(STINGアゴニスト産生体または本明細書に記載の他のもの)を免疫サステナー回路(例えば、キヌレニン消費または本明細書に記載の他のもの)と組み合わせることができる。図14Bは、免疫イニシエーター回路(STINGアゴニスト)および免疫サステナー回路(キヌレニン回路)を発現するように遺伝子操作されている微生物が、先ず高レベル免疫刺激因子(例えばListeria monocytogenesからの、STINGアゴニスト産生酵素、例えばDacA)を産生し、その後の時点で免疫サステナー(例えばPseudomonas fluorescensからの、キヌレニナーゼ)を産生する、本開示の一実施形態を示す、グラフの概略図を表す。一部の実施形態では、免疫イニシエーター(この場合は、STINGアゴニスト産生酵素、例えばdacA)の発現は、インデューサーにより誘導される。一部の実施形態では、免疫サステナー(この場合はキヌレニナーゼ)は、インデューサーにより誘導される。一部の実施形態では、免疫イニシエーター(STINGアゴニスト産生酵素、例えばdacA)と免疫サステナー(例えばキヌレニナーゼ)は両方とも、1つまたは複数のインデューサーにより誘導される。インデューサー#1(例えば、免疫イニシエーターdacA発現を誘導する)およびインデューサー#2(例えば、免疫サステナーキヌレニナーゼ発現を誘導する)は、同じであることもあり、または異なることもある。インデューサー#1およびインデューサー#2を、逐次的にまたは同時に投与することができる。インデューサーの非限定的な例としては、in vivo条件、消化管もしくは腫瘍微小環境(低酸素、ある特定の栄養素など)の条件、in vitro成長条件、または化学的インデューサー(例えば、アラビノース、クミン酸塩およびサリチル酸塩、IPTGもしくは本明細書に記載の他の化学的インデューサー)が挙げられる。他の実施形態では、免疫イニシエーター(STINGアゴニスト産生酵素、例えばdacA)および免疫サステナー(例えばキヌレニナーゼ)は、本明細書に記載のものを含むがそれらに限定されない、構成的プロモーターにより駆動される。一部の実施形態では、免疫イニシエーター(STINGアゴニスト産生酵素、例えばdacA)は、誘導性プロモーターにより駆動され、免疫サステナー(例えばキヌレニナーゼ)は、構成的プロモーターにより駆動される。一部の実施形態では、免疫イニシエーター(STINGアゴニスト産生酵素、例えばdacA)は、構成的プロモーターにより駆動され、免疫サステナー(例えばキヌレニナーゼ)は、誘導性プロモーターにより駆動される。一部の実施形態では、両方の回路が、細菌染色体に組み込まれていることもある。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在することもある。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在することもある。一部の実施形態では、一方の回路は、細菌染色体に組み込まれていることがあり、もう一方の回路は、プラスミド上に存在することがある。

0103

さらに別の実施形態では、STINGアゴニスト産生回路網、例えばdacA、を発現する遺伝子操作された細菌の1つまたは複数の株、およびキヌレニン消費回路網(例えば、キヌレニナーゼ)を発現する遺伝子操作された細菌の1つまたは複数の別の株を、逐次的に投与することができ、例えば、STINGアゴニスト産生体(免疫刺激因子)をキヌレニン消費体(免疫サステナー)の前に投与することができる。より一般的には、免疫開始のための回路網を発現する細菌株を、免疫維持のための回路網を発現する別の細菌株とともに投与することができ、例えば、免疫イニシエーター株を免疫サステナー株の前に投与することができる。例えば、免疫開始のための回路網を発現する細菌株を、免疫維持のための回路網を発現する別の細菌株、例えば免疫イニシエーター株、の前に投与することができる。あるいは、免疫開始のための回路網を発現する細菌株を、免疫維持のための回路網を発現する別の細菌株、例えば免疫イニシエーター株、の後に投与することができる。さらに別の実施形態では、免疫開始のための回路網を発現する細菌株を、免疫維持のための回路網を発現する別の細菌株、例えば免疫イニシエーター株、と同時に投与することができる。

0104

図15は、本開示の遺伝子操作された細菌が、免疫不全の際に間質のものを補完することにより、広い抗腫瘍活性を達成するように腫瘍微小環境を変換することができる方法を示す、概略図を表す。

0105

図16は、抗腫瘍活性改善のための機序の組合せを示す概略図を表す。

0106

図17Aおよび図17Bは、STINGアゴニスト産生体SN3527、キヌレニン消費体SYN2028、および組合せ株(STINGアゴニスト産生体+キヌレニン消費体)SYN3831の環状ジAMPの産生(図17A)およびキヌレニンの消費(図17B)を示す棒グラフを表す。

0107

図18Aは、示されているような72時間の期間にわたってのCT26腫瘍における栄養要求性突然変異体ΔUraA、ΔThyAおよびΔDapAの成長腫瘍組織グラムあたりのCFU)を示すグラフを表す。図18Bおよび図18Cは、示されているような72時間にわたってのB16F10(図18B)およびEL4(図18C)腫瘍における野生型E.coli Nissle(SYN94)と比較した栄養要求性突然変異体ΔThyA(SYN1605)の成長(腫瘍組織1グラムあたりのCFU)を示すグラフを表す。
同上。

0108

図19Aは、B16F10モデルにおける2つの異なる用量(1e7および1e8 CFU)でのSYN4023(テトラサイクリン誘導性Listeria monocytogenes dacA構築物およびΔDapA突然変異を含む)の腫瘍成長(腫瘍体積中央値)に対する効果を食塩水対照と比較して経時的に示すin vivo分析の折れ線グラフを表す。図19B、図19Cおよび図19Dは、図19Aに示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。
同上。

0109

図20Aおよび図20Bは、B16F10腫瘍を移植し、その後、1e7 CFUSYN3527(dacA、投与の4時間後にテトラサイクリンで誘導)、1e7 CFU SYN3527(dacA、未誘導で放置)、1e8 CFU SYN4023(dacA、およびΔDapA、誘導)、SYN94(未改変細菌)、または対照としての食塩水のいずれかによって処置したマウスの血液中の、示されているような様々な時点での、敗血症およびサイトカイン急増関連サイトカインIL−1β(図20A)およびTNF−α(図20B)の濃度を示すグラフを表す。LPS処置を敗血症についての陽性対照として含めた。図20Cおよび図20Dは、示されているような様々な時点での腫瘍におけるC−ジAMP濃度(図20C)またはCFU数(図20D)を示すグラフを表す。
同上。

0110

図21Aは、A20腫瘍モデルにおける腫瘍成長(腫瘍体積中央値)に対する食塩注射対照と比較したSYN4023(テトラサイクリン誘導性Listeria monocytogenes dacA構築物およびΔDapA突然変異を含む)の効果を示すin vivo分析の折れ線グラフを表す。図21Bおよび図21Cは、図21Aに示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。

0111

図22Aは、B16F10モデルにおける、単独での、または免疫刺激因子(アゴニスト抗OX40、抗41BB、もしくは抗GITR抗体)と組み合わせた、SYN4023(テトラサイクリン誘導性Listeria monocytogenes dacA構築物とΔDapA突然変異とを含むDAP−STING)の腫瘍体積中央値に対する効果を、単独での対照または単剤(SYN4023、抗ox40、抗41BBもしくは抗GITR抗体+食塩水)と比較して経時的に示す、in vivo分析の折れ線グラフを表す。図22B、図22C、図22D、図22E、図22F、図22Gおよび図22Hは、図22Aに示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。
同上。
同上。

0112

図23Aは、腫瘍内注射抗OX40抗体と組み合わせたSYN4023(tet誘導性dacAおよびデルタdapAを含む)がA20腫瘍モデルにおいてアブスコパル効果を惹起することができることを示す折れ線グラフを表す。腫瘍体積平均中央値を各処置群について示す。処置/注射した腫瘍をグラフの右側に示し、その一方で、処置を施していない(未注射)腫瘍を左側に示す。図23Bおよび図23Cは、個々のマウス(図23Bには未処置マウス、および図23CにはSYN4023によって処置したマウス)の腫瘍体積を経時的に示す折れ線グラフを表す。図23Dは、図23Aに示す試験期間にわたってのマウスの生存を示すグラフを表す。図23Eは、試験期間にわたっての平均体重を示すグラフを表す。図23Fは、以前にSYN4023で処置したマウス(図23A〜23Eに示されている通りであり、少なくとも30日間のモニタリング時に完全退縮を示した)の左脇腹にA20腫瘍を移植し、右脇腹にCT26腫瘍を移植した再投与試験の結果を、同じ腫瘍を移植した未処置同齢マウスと比較して示す、折れ線グラフを表す。腫瘍体積平均中央値を各処置群について示す。図23Gおよび図23Hは、図23Fに示す試験からの個々のマウス(図23Gには未処置マウス、および図23HにはSYN4023によって以前に処置したマウス)の腫瘍体積を経時的に示す折れ線グラフを表す。図23Iは、アブスコパル効果および免疫学的記憶能力を問い合わせる2部構成の試験全体を示すグラフを表す(A20の再投与を表す)。グラフは、個々の実験群についての個々の腫瘍測定を示す。
同上。
同上。
同上。
同上。

0113

図24は、示されているように1および16時間の時点でB16腫瘍モデルにおいてインデューサーの存在または非存在下でATCアスピリン、クミン酸塩および低酸素(FNR)誘導性プロモーターにより達成されたGFP発現レベルのin vivo分析を示す棒グラフを表す。回収したすべての細菌(RFP+)のうちの誘導された細菌(GFP+)のパーセンテージ。

0114

図25は、図24に記載の分析のGFP+/RFP+細菌についての幾何平均蛍光強度MFI)によって測定した場合の遺伝子発現レベルを示す。

0115

図26A、図26B、図26Cおよび図26Dは、3つの異なる用量(1e7(図26B)、1e8(図26C)および1e9(図26D))でのSTINGアゴニスト産生株SYN4449のB16−F10腫瘍体積に対する効果を経時的に示すin vivo分析における個々のマウスの折れ線グラフを表し、1e9の用量でのSYN4449の投与がB16.F10腫瘍モデルにおいてこの期間にわたって腫瘍成長の拒絶または制御をもたらすことを示す。図26Aは、食塩水対照で処置した個々のマウスの折れ線グラフを示す。
同上。

0116

図27A、図27Bおよび図27Cは、3つの異なる用量(1e6、1e7および1e8)でのSTINGアゴニスト産生株SYN4449の腫瘍体積に対する効果を経時的に示すin vivo分析における個々のマウスの折れ線グラフを表し、SYN4449(プラスミドに基づくFNR−dacAおよびデルタdapAを含む)がA20リンパ腫モデルにおいて用量依存的腫瘍制御を駆動することを実証する。CR=完全奏効。図27Dは、食塩水対照で処置した個々のマウスの折れ線グラフを示す。
同上。

0117

図28Aは、プラスミドにdapA突然変異およびFNR−dacA(ΔDAP、15A−fnr−dacA)を含むSYN4449をSYN94(ストレプトマイシン抵抗性Nissle)と比較して示す棒グラフであって、SYN4449がc−ジAMPを産生することを実証する棒グラフを表す。図28Bおよび図28Cは、SYN4910(図28B)およびSYN4939(図28C)のin vitroでのc−ジAMP産生をSYN94と比較して示す棒グラフを表す。図28Dは、0、2および4時間の時点でのSYN2306、SYN4939およびSYN94についてのin vitroでのキヌレニン消費の比較を示す棒グラフを表す。SYN4910は、ファージ欠失、DAPA栄養要求体、ThyA栄養要求体、およびHA9/10部位に組み込まれたFNR−DacA(ΔΦ、ΔDAP、ΔThyA、HA9/10::fur−DacA)を含む。c−ジAMP産生とキヌレニン消費の組合せの株であるSYN4939は、染色体に組み込まれており構成的プロモーターの制御下にあるキヌレニナーゼと、TrpEの欠失と、ファージ欠失と、DapA栄養要求体と、ThyA栄養要求体と、HA9/10部位に組み込まれているFNR−DacA(PSynJ23119−pKYNase、ΔTrpE、ΔΦ、ΔDAP、ΔThyA、HA9/10::fnr−DacA)を含む。SYN2306は、構成的に発現されたキヌレニナーゼ(Pseudomonas fluorescens)と、TrpEの欠失(HA3/4::PSynJ23119−pKYNaseデルタTrpE)を含む。SYN94対照:ストレプトマイシン抵抗性Nissle。
同上。

0118

図29Aおよび図29Bは、SYN94(ストレプトマイシン抵抗性Nissle)とSYN4739(図29A)またはSYN4939(図29B)によるin vitroでのc−ジAMP産生の比較を示す棒グラフを表す。図29Cおよび図29Dは、SYN94とSYN2028およびSYN4739(図29C)またはSYN2306およびSYN4939(図29D)による0、2および4時間の時点でin vitroでのキヌレニン消費の比較を示す棒グラフを表す。SYN4739は、Pseudomonas fluorescensからの構成的に発現されたキヌレニナーゼ、TrpEの欠失と、ThyA栄養要求体(HA3/4::PSynJ23119−pKYNase、ΔTrpE、ΔThyA、HA9/10::fnr−DacA)を含む。c−ジAMP産生とキヌレニン消費の組合せの株であるSYN4939は、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にあるキヌレニナーゼと、TrpEの欠失と、ファージ欠失と、DAPA栄養要求体と、ThyA栄養要求体と、HA9/10部位に組み込まれているFNR−DacA(PSynJ23119−pKYNase、ΔTrpE、ΔΦ、ΔDAP、ΔThyA、HA9/10::fnr−DacA)を含む。SYN2028は、Pseudomonas fluorescenceからの構成的プロモーターの制御下にあり染色体に組み込まれているキヌレニナーゼと、TrpEの欠失(HA3/4::PSynJ23119−pKYNaseデルタTrpE)を含む。SYN2306は、構成的に発現されたキヌレニナーゼ(Pseudomonas fluorescens)と、TrpEの欠失(HA3/4::PSynJ23119−pKYNaseデルタTrpE)を含む。SYN94:ストレプトマイシン抵抗性Nissle。
同上。

0119

図30および図31は、0、2および4時間の時点でin vitroでのc−ジAMP産生およびin vitroでのキヌレニン消費についての、SYN2306とSYN4789とSYN4939とSYN94の間の比較を示す棒グラフを表す。SYN2306は、構成的に発現されたキヌレニナーゼ(Pseudomonas fluorescens)と、TrpEの欠失(HA3/4::PSynJ23119−pKYNaseデルタTrpE)を含む。SYN94:ストレプトマイシン抵抗性Nissle。SYN4789は、Pseudomonas fluorescensからの構成的に発現されたキヌレニナーゼと、TrpEの欠失と、ThyA栄養要求体(HA3/4::PSynJ23119−pKYNase、ΔTrpE、ΔThyA、HA9/10::fnr−DacA)を含む。c−ジAMP産生とキヌレニン消費の組合せの株であるSYN4939は、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にあるキヌレニナーゼと、TrpEの欠失と、ファージ欠失と、DAPA栄養要求体と、ThyA栄養要求体と、HA9/10部位に組み込まれているFNR−DacA(PSynJ23119−pKYNase、ΔTrpE、ΔΦ、ΔDAP、ΔThyA、HA9/10::fnr−DacA)を含む。SYN94:ストレプトマイシン耐性Nissle。
図30および図31は、0、2および4時間の時点でin vitroでのc−ジAMP産生およびin vitroでのキヌレニン消費についての、SYN2306とSYN4789とSYN4939とSYN94の間の比較を示す棒グラフを表す。SYN2306は、構成的に発現されたキヌレニナーゼ(Pseudomonas fluorescens)と、TrpEの欠失(HA3/4::PSynJ23119−pKYNaseデルタTrpE)を含む。SYN94:ストレプトマイシン抵抗性Nissle。SYN4789は、Pseudomonas fluorescensからの構成的に発現されたキヌレニナーゼと、TrpEの欠失と、ThyA栄養要求体(HA3/4::PSynJ23119−pKYNase、ΔTrpE、ΔThyA、HA9/10::fnr−DacA)を含む。c−ジAMP産生とキヌレニン消費の組合せの株であるSYN4939は、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にあるキヌレニナーゼと、TrpEの欠失と、ファージ欠失と、DAPA栄養要求体と、ThyA栄養要求体と、HA9/10部位に組み込まれているFNR−DacA(PSynJ23119−pKYNase、ΔTrpE、ΔΦ、ΔDAP、ΔThyA、HA9/10::fnr−DacA)を含む。SYN94:ストレプトマイシン耐性Nissle。

0120

図32は、RAW 264.7細胞におけるIFN−ベータ1誘導に対する様々な感染多重度(MOI)でのSTINGアゴニスト産生株SYN4737の4時間の時点での活性のin vitro分析の折れ線グラフを表し、SYN4737(ファージ欠失と、DAPA栄養要求体と、HA9/10部位に組み込まれているFNR−DacA(ΔΦ、ΔDAP、HA9/10::fnr−DacA)を含む)がRAW 264.7細胞(不死化マウスマクロファージ細胞系)において用量依存的IFN−ベータ1誘導を駆動することを実証する。簡単に説明すると、細菌(WT Nissle(グラフ中に「SYN」と標識されている))またはSYN4737を、4時間、嫌気的チャンバー内で前誘導してSTINGアゴニスト合成を誘導し、次いで、4時間、0.5×106個RAW264.7細胞とともに様々な感染多重度(MOI)で共培養し、RAW264.7細胞上清中に存在するタンパク質を分析した。

0121

図33Aおよび図33Bは、cGASオルソログ推定的cGAMPシンターゼ)を含む様々な株の、c−ジAMPおよび細菌cGAMPのin vitroでの産生を示すグラフを表す。
同上。

0122

図34Aおよび図34Bは、5−FCを5−FUに変換するE.coli Nissle株SYN3529(Nissle p15A Ptet−CodA)およびSYN3620(Nissle p15A Ptet−CodA::Upp融合体)の能力を示す棒グラフを表す。グラフは、2時間のアッセイ時間後の5−FCレベル(図34A)および5−FUレベル(図34B)を示す。

0123

図35Aは、in vivoマウス試験の概要を示す概略図を表し、この試験の結果を図35B、図35C、図35Dおよび図35Eに示す。図35Bは、B16−F10腫瘍を移植し、PBS、SYN3620(pUC−Kan−tet−CodA::Upp融合体を含む)またはSYN3529(pUC−Kan−tet−CodA(シトシンデアミナーゼ)を含む)で処置したマウスの平均腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図35Cは、この試験における個々のマウスの腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図35Dは、6日目の腫瘍重量を示すグラフを表す。図35Eは、質量分析によって測定した6日目の5−FCの腫瘍内濃度を示すグラフを表す。
同上。
同上。

0124

図36Aは、in vivoマウス試験の概要を示す概略図を表し、その結果を図36Bおよび36Cに示す。図36Bは、コロニー形成単位(CFU)によって測定した腫瘍の細菌定着を示すグラフを表す。図36Cは、フローサイトメトリーを介して測定した8日目のCT26腫瘍から単離した腫瘍内リンパ球の表記の免疫細胞集団における平均蛍光強度(MFI)の中央値によって測定したCCR7(左)またはCD40(右)の相対的発現を示すグラフを表す。
同上。

0125

図37は、TNFα分泌体SYN2304(PAL::Cm p15a TetR Ptet−phoA TNFa)、親対照SYN1557、および組換えIL−15対照の上清によって処置した場合の、HeLa細胞におけるIカッパアルファの分解を示す細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフを表す。

0126

図38Aは、in vivoマウス試験の概要を示す概略図を表し、この試験の結果を図38B〜38Dに示す。図38Bは、コロニー形成単位(CFU)により測定した場合の腫瘍の細菌コロニー形成を示すグラフを表す。図38Cは、ELISAにより測定した場合のCT26腫瘍におけるTNFαの相対濃度を示すグラフを表す。図38Dは、CT26腫瘍を移植し、SYN(DOM突然変異体)またはSYN−TNFα(PAL::CM p15a TetR Ptet−PhoA−TNFαを含む)で処置したマウスの平均腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。
同上。

0127

図39Aおよび図39Bは、IFNガンマ分泌体SYN3543(PAL::Cm p15a Ptet−87K PhoA−mIFNg)、親対照SYN1557、および組換えIL−15対照の上清によって処置した場合の、マウスRAW264.7細胞におけるSTATリン酸化を示す細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフを表す。

0128

図40Aは、in vivoマウス試験の概要を示す概略図を表し、この試験の結果を図40Bおよび図40Cに示す。図40Bは、コロニー形成単位(CFU)により測定した場合の腫瘍の細菌コロニー形成を示すグラフを表す。図40Cは、ELISAにより測定した場合のCT26腫瘍におけるINFγの相対濃度を示すグラフを表す。
同上。

0129

図41は、誘導(+ATC)条件および非誘導(−ATC)条件下、酸素の存在下(+O2)または非存在下(−O2)でのストレプトマイシン抵抗性Nissle(SYN−UCD103)、SYN−UCD205、およびSYN−UCD204によって産生されたin vitroアルギニンレベルの棒グラフを表す。SYN−UCD103は、対照のNissle構築物である。SYN−UCD205は、低コピー数プラスミドにおいてFNR誘導性プロモーターの制御下で発現されるΔArgRおよびargAfbrを含む。SYN−UCD205は、低コピー数プラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現されるΔArgRおよびargAfbrを含む。SYN−UCD204は、低コピー数プラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現されるΔArgRおよびargAfbrを含む。

0130

図42Aおよび図42Bは、嫌気的誘導後の様々な時点での培地中のアンモニアレベルの棒グラフを表す。図42Aは、0、30、60、および120分の時点で測定したSYN−UCD205、SYN−UCD206、およびSYN−UCD301のアルギニン産生レベルの棒グラフを表す。図42Bは、SYN−UCD204(ΔArgRと、低コピー数プラスミド上のPfnrS−ArgAfbrと、野生型ThyAとを含む)、SYN−UCD301、SYN−UCD302およびSYN−UCD303(これらの3つ全てが、組み込まれたFNR−ArgAfbr構築物を含み、SYN−UCD301は、ΔArgRおよびwtThyAを含み、SYN−302およびSYN−UCD303の両方は、ΔArgRおよびΔThyAを含み、それぞれ、クロラムフェニコール抵抗性またはカナマイシン抵抗性を有する)のアルギニン産生レベルの棒グラフを表す。結果は、FNR ArgA fbrの染色体組み込みによって、同じ構築物を発現する低コピー数プラスミド株に関して認められるように類似のレベルのアルギニン産生が得られることを示している。
同上。

0131

図43は、malEK座でfnr誘導性プロモーターによって駆動されるArgAfbrの染色体挿入を有し、ΔArgRおよびΔThyAを有し、抗生物質抵抗性を有さない、操作された細菌株(SYN−UCD303)の、in vitro有効性(アンモニアからのアルギニン産生)を評価したことを示す、折れ線グラフを表す。ストレプトマイシン抵抗性E.coli Nissle(Nissle)を参照として使用する。

0132

図44Aは、40A、40B、40C、44Eおよび44Fに示す試験の投与スキーマを示すチャートを表す。図44B、44C、44D、44Eおよび44Fは、化学療法剤シクロホスファミド(骨髄非破壊性化学療法、プレコンディショニング)およびアルギニン産生株(SYN−UCD304;組み込まれたFNR−ArgAfbr構築物;ΔArgR、図44E)、またはキヌレニン消費株(SYN2028、図44F)による組合せ処置の腫瘍体積に対する効果のin vivo分析の各個々のマウスについての折れ線グラフを表す。組合せ処置の効果をビヒクル単独(図44B)、シクロホスファミド単独(図44C)、またはSYN94(ストレプトマイシン抵抗性野生型Nissle、図44D)による処置と比較した。データは、シクロホスファミドと組み合わせたアルギニン産生株およびキヌレニン消費株の抗腫瘍活性を示唆する。本試験では、BALB/cマウスにCT26腫瘍を移植し、シクロホスファミド(CP)を100mg/kgでIP投与し、細菌1×10e7個(100μl体積中)を腫瘍内に投与した。投与スキーマを図44Aに示す。
同上。

0133

図45Aおよび図45Bは、遊走細胞の数を、SYN細菌上清中で様々な濃度で希釈したSYN−CXCL10上清の添加後にフローサイトメトリーを介して測定するヒトT細胞トランスウェルアッセイの結果を表す。抗CXCR3を、100%SYN−CXCL10上清を含有する対照ウェルに添加し、CXCL10−CXCR3経路に関する遊走特異性を確認した。図45Aは、遊走細胞の総数を表す。図45Bは、サイトカインなしの対照と比較した遊走を表す。

0134

図46は、IL−15分泌体SYN3525(PAL::Cm p15a Ptet−PpiA(ECOLIN_18620)−IL−15−Sushi)、親対照SYN1557、および組換えIL−15対照の上清によって処置した場合のCD3+IL15RAアルファ+T細胞におけるSTAT5リン酸化を示す細胞に基づくアッセイの結果を示す折れ線グラフを表す。

0135

図47は、株SYN1565(PfnrS−nupCを含む)、SYN1584(PfnrS−nupC;PfnrS−xdhABCを含む)、SYN1655(PfnrS−nupC;PfnrS−add−xapA−deoDを含む)、およびSYN1656(PfnrS−nupC;PfnrS−xdhABC;PfnrS−add−xapA−deoDを含む)が、グルコースが存在する場合であっても、in vitroでアデノシンを分解できることを示す棒グラフを表す。

0136

図48は、in vivoの腫瘍環境予想されるアデノシンレベルに対応する1μMアデノシンの存在下で、基質制限条件でのアデノシン分解を示す棒グラフを表す。結果は、低濃度の活性化SYN1656(1e6個細胞)(および同様に表示の他の株)が、定量限界より下でアデノシンを分解できることを示している。

0137

図49は、操作されたE.coli Nissle(SYN1656)の単独または抗PD1との組合せによるアデノシン消費が腫瘍体積に及ぼす効果のin vivo分析の折れ線グラフを表す。データは、単剤としての、およびPD−1と組み合わせたアデノシン消費株の抗腫瘍活性を示唆する。

0138

図50Aおよび図50Bは、アデノシン消費株SYN1656(SYN−Ade)と抗PD−1/抗CTLA4カクテルの組合せが多数の腫瘍拒絶を惹起することを示すグラフを表す。抗PD−1/抗CTLA4チェックポイント阻害と組み合わせたSYN1656の抗腫瘍活性を調査するために、C57BL6マウスにMC38腫瘍を定着させた。腫瘍が60〜80mm3のサイズになったら、動物を、隔週で食塩水対照によって腫瘍内処置するか、抗PD−1および抗CTLA4抗体(それぞれ、10および5mg/kg)のカクテルで腫瘍内処置するか、または未改変細菌(SYN)もしくはSYN1656(SYN−Ade)と抗PD−1/抗CTLA4の組合せで腫瘍内処置し、腫瘍体積を週2回評価した。図50Aは、腫瘍体積中央値を表し、図50Bは、<2000mm3を生存サロゲートとして使用して試験時に残存する動物のパーセンテージを経時的に表し、図50C、図50D、図50Eおよび図50Fは、各処置群からの個々の動物についての腫瘍体積を示すグラフを表す。
同上。

0139

図51は、75μMキヌレニンを補充したM9培地における、当初の株およびALEから進化させたキヌレニナーゼ発現株のキヌレニン消費速度を示す棒グラフを表す。株を以下のように標識する:SYN1404:Trp:Eに欠失を含み、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でPseudomonas fluorescensからのキヌレニナーゼを発現する、中コピー数プラスミドを含むE.coli Nissle(NissleデルタTrpE::CmR+Ptet−Pseudomonas KYNU p15a KanR);SYN2027:Trp:Eに欠失を含み、HA3/4部位でゲノムに組み込まれた構成的プロモーター(内因性のlppプロモーター)の制御下でPseudomonas fluorescensからのキヌレニナーゼを発現するE.coli Nissle(HA3/4::Plpp−pKYNase KanR TrpE::CmR);SYN2028:Trp:Eに欠失を含み、HA3/4部位でゲノムに組み込まれた構成的プロモーター(合成J23119プロモーター)の制御下でPseudomonas fluorescensからのキヌレニナーゼを発現するE.coli Nissle(HA3/4::PSynJ23119−pKYNase KanR TrpE::CmR);SYN2027−R1:親SYN2027株に由来し、ALEに起因する第1の進化株(Plpp−pKYNase KanR TrpE::CmR進化株レプリケート1)。SYN2027−R2:親SYN2027株に由来し、ALEに起因する第2の進化株(Plpp−pKYNase KanR TrpE::CmR進化株レプリケート2)。SYN2028−R1:親SYN2028株に由来し、ALEに起因する第1の進化株(HA3/4::PSynJ23119−pKYNase KanR TrpE::CmR進化株レプリケート1)。SYN2028−R2:親SYN2028株に由来し、ALEに起因する第2の進化株(HA3/4::PSynJ23119−pKYNase KanR TrpE::CmR進化株レプリケート1)。

0140

図52Aおよび図52Bは、Pseudomonas fluorescensからのキヌレニナーゼを産生する株による腫瘍内キヌレニン枯渇を示すドットプロットを表す。図52Aは、中コピー数プラスミドにおいて構成的に発現されたPseudomonase fluorescensキヌレニナーゼを有するキヌレニン消費株SYN1704に関して観察された腫瘍内濃度を示すドットプロットを表す。図52Bは、Pseudomonase fluorescensキヌレニナーゼの構成的に発現された染色体組み込みコピーを有するキヌレニン消費株SYN2028に関して観察された腫瘍内濃度を示すドットプロットを表す。IDOインヒビターNCB024360を陽性対照として使用する。

0141

図53Aおよび図53Bは、CT26腫瘍を移植して食塩水またはSYN1704のどちらかを投与したマウスにおいて測定された腫瘍内キヌレニン濃度(図53A)および血漿キヌレニン濃度(図53B)を示すドットプロットを表す。キヌレニンの腫瘍内(P<0.001)および血漿中(P<0.005)濃度の有意な低減が、食塩水対照と比較してキヌレニン消費株SYN1704に関して観察された。トリプトファンレベルは一定のままであった(データは示していない)。
同上。

0142

図54A、図54Bおよび図54Cは、CT26腫瘍内へのKYN消費株の単回投与が腫瘍中の腫瘍KYNレベル(図54A)および血漿中の腫瘍KYNレベル(図54B)および腫瘍重量(図54C)に及ぼす効果を示すグラフを表す。マウスに、SYN94またはSYN1704を1e8 CFU/mLで腫瘍内投与を介して投与した。動物を犠牲にして採血し、表記の時間に組織を収集した。
同上。

0143

図55は、E.coli株SYN3366およびSYN3367によって分泌されたマウスCD40L1(47−260)およびCD40L2(112−260)がmCD40抗体によって検出されることを示す細菌上清のウェスタンブロット解析を表す。

0144

図56は、ビヒクルまたは抗CTLA−4抗体単独と比較した、単独または抗CTLA4抗体と組み合わせた、Pseudomonas fluorescensキヌレニナーゼの構成的に発現された染色体に組み込まれたコピーを有するキヌレニン消費株SYN2028によるキヌレニン消費が腫瘍体積に及ぼす効果のin vivo分析の折れ線グラフを表す。データは、単剤としての、および抗CTLA4抗体と組み合わせたキヌレニン消費株の抗腫瘍活性を示唆し、SYN2028が、CT26においてαCTL−4媒介抗腫瘍活性を改善することを示唆している。本試験では、BALB/cマウスにCT26腫瘍を移植し;抗CTLA4抗体を100μg/マウスでIP投与した;細菌1×10e7個を腫瘍内に投与した;細菌および抗体を全て隔週で投与した。

0145

図57A、図57B、図57Cおよび図57Dは、図56に示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。図57Eは、対応するカプラン・マイヤープロットを表す。
同上。
同上。

0146

図58A、図58B、図58C、図58D、図58Eは、抗CTL−4および抗PD1抗体と組み合わせたKyn消費体SYN2028がMC38腫瘍において抗腫瘍活性を改善したことを示す折れ線グラフを表す。図58B、図58C、図58Dおよび図58Eは、図58Aに示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。抗CTL−4および抗PD1抗体と組み合わせたKyn消費体SYN2028は、MC38腫瘍において、ビヒクル(図58B)、抗CTLA4および抗PD1抗体単独(図58C)、またはSYN94(ストレプトマイシン抵抗性E.coli Nissle)+抗CTLA4および抗PD1抗体(図58D)と比較して改善された抗腫瘍活性を有する(図58E);すなわち、キヌレニン消費体には、抗CTLA−4/抗PD1抗体媒介抗腫瘍活性を改善する能力がある。図58Fは、対応するカプラン・マイヤープロットを表す。
同上。
同上。

0147

図59Aおよび図59Bは、B16F10腫瘍モデルにおけるキヌレニン消費株SYN2028(SYN−Kyn)の腫瘍コロニー形成およびin vivo活性の分析を表す。約40〜80mm3の腫瘍サイズへの到達時に、マウスに1e6 CFUの未改変(SYN−WT)またはSYN2028(SYN−Kyn)を腫瘍内注射によって施した。注射の24および72時間後に、腫瘍をホモジナイズし、LB抗生物質選択プレートへのプレーティングによりコロニー形成単位(CFU)を判定した(図59A)か、またはLCMSによりキヌレニンレベルを判定した(図59B)。

0148

図60Aおよび図60Bは、SYN1565(SYN−Ade)およびSYN2028(SYN−Kyn)が腫瘍内投与後に確固たる腫瘍コロニー形成を実証することを示すグラフを表す。アデノシン消費株SYN1565またはキヌレニン消費株SYN2028の腫瘍コロニー形成能力を評価するために、B16.F10腫瘍をC57BL6マウスに定着させた。腫瘍が100〜150mm3のサイズに達したら、SYN1565、SYN2028(1e6個細胞/用量)または食塩水対照を単回注射として腫瘍内投与した。腫瘍組織1グラムあたりのコロニー形成単位(CFU)を注射の7日後に計算した。結果を図60Aに示す。比較のために、1e6個細胞/用量の単回注射の7日後の未改変Nissle骨格(SYN)について腫瘍組織1グラムあたりのCFUを含めた(図60B)。

0149

図61は、野生型E.coli(レーン1)および抗PD1 scFvを発現する株(レーン2)の総サイトゾル抽出物のウェスタンブロット解析を表す。

0150

図62は、tet誘導性抗PD1−scFvを発現する株からの抽出物と共にインキュベートしたPD1発現EL4細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、E.coliにおいて発現された抗PD1−scFvがマウスEL4細胞上のPD1に結合することを示す。

0151

図63は、抗PD1 scFvを分泌する様々な株の総サイトゾル抽出物のウェスタンブロット解析を表す。単一のバンドがレーン1〜6において34kDa付近で検出され、それぞれSYN2767、SYN2769、SYN2771、SYN2773、SYN2775、およびSYN2777からの抽出物に対応した。

0152

図64は、tet誘導性抗PD1−scFvを分泌するE coli Nissle株からの抽出物と共にインキュベートしたPD1発現EL4細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、E.coli Nissleから分泌された抗PD1−scFvがマウスEL4細胞上のPD1に結合することを示す。

0153

図65は、tet誘導性抗PD1−scFvを分泌するE.coli Nissle株からの様々な量の抽出物(0、2、5、および15μl)と共にインキュベートしたPD1発現EL4細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、E.coli Nissleから分泌された抗PD1−scFvがマウスEL4細胞上のPD1に用量依存的に結合することを示す。

0154

図66Aおよび図66Bは、EL4細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表す。図66Bは、tet誘導性抗PD1−scFvを分泌するE coli Nissle株からの抽出物を、様々な量の可溶性PDL1(0、5、10、および30μg)と共にインキュベートする競合アッセイを表し、PDL1が、マウスEL4細胞上のPD1に対してE.coli Nissleから分泌された抗PD1−scFvの結合と用量依存的に競合することができることを示す。図66Bは、IgG対照を示す。

0155

図67は、SYN2996(レーン1)、SYN3159(レーン2)、SYN3160(レーン3)、SYN3021(レーン4)、SYN3020(レーン5)、およびSYN3161(レーン6)からの細菌上清のウェスタンブロット解析を表し、WT mSIRPα、mCV1SIRPα、mFD6x2SIRPα、mCV1SIRPα−IgG4、mFD6SIRPα−IgG4、および抗mCD47 scFvがそれぞれ、これらの株から分泌されることを示す。

0156

図68は、SYN1557(1;ΔPAL親株)、SYN2996(2;tet誘導性mSIRPαを発現する)、SYN3021(3;tet誘導性抗mCD47scFvを発現する)、SYN3161(4;tet誘導性mCV1SIRPα−hIgG融合体を発現する)からの上清と共にインキュベートしたCD47発現CT26細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、E.coliにおいて発現された分泌産物がマウスCT26細胞上のCD47に結合することができることを示す。

0157

図69は、SYN1557(1;ΔPAL親株)、SYN3020(2;tet誘導性mFD6SIRPα−hIgG融合体を発現する)、SYN3160(3;tet誘導性FD1x2SIRPαを発現する)、SYN3159(4;tet誘導性mCV1SIRPαを発現する)、SYN3021(5;tet誘導性mCV1SIRPα−hIgG融合体を発現する)からの上清と共にインキュベートしたCD47発現CT26細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、E.coliにおいて発現された分泌産物がマウスCT26細胞上のCD47に結合することができることを示す。

0158

図70は、CT26細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表す。tet誘導性マウスSIRPαを分泌するE.coli Nissle株からの抽出物を組換えSIRPαと共にインキュベートする競合アッセイを実施し、組換えSIRPαがCT26細胞上のCD47に対してE.coli Nissleから分泌されたSIRPαの結合と競合することができることを示す。

0159

図71は、CT26細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表す。tet誘導性マウスSIRPαを分泌するE.coli Nissle株からの抽出物を抗CD47抗体と共にインキュベートする競合アッセイを実施し、抗体がCT26細胞上のCD47に対してE.coli Nissleから分泌されたSIRPαの結合と競合することができることを示す。

0160

図72は、SYN2997(レーン1)およびSYN2998(レーン2)からの細菌上清のウェスタンブロット解析を表し、マウスおよびヒトヒアルロニダーゼがそれぞれ、これらの株から分泌されることを示す。

0161

図73は、ELISAアッセイにおけるヒアルロナン分解の測定としてのSYN1557(親株ΔPAL)、SYN2997、およびSYN2998のヒアルロニダーゼ活性を示す棒グラフを表す。

0162

図74Aは、テトラサイクリン誘導性ヒルヒアルロニダーゼを発現するSYN3369(レーン1)およびSYN1557(親株ΔPAL)(レーン2)からの細菌上清のウェスタンブロット解析を表し、ヒルヒアルロニダーゼがSYN3369から分泌されることを示す。M=マーカー。図74Bおよび図74Cは、ELISAアッセイにおけるヒアルロナン分解の測定としてのヒアルロニダーゼ活性を示す棒グラフを表す。図74Bは、組換えヒアルロニダーゼによる陽性対照を示す。図74Cは、SYN1557(親株ΔPAL)、およびテトラサイクリン誘導性ヒルヒアルロニダーゼを発現するSYN3369のヒアルロニダーゼ活性を示す。
同上。

0163

図75は、E.coli 1917 Nissle染色体内の例示的な組み込み部位のマップを表す。これらの部位は、回路の構成要素が、本質的な遺伝子発現に干渉することなく、染色体に挿入されうる領域を示している。逆斜線(/)は、挿入が発散性または収束性に発現される遺伝子の間で起こることを示すために使用される。生合成遺伝子、例えばthyA内の挿入は、栄養要求株を作製するために有用でありうる。一部の実施形態では、個々の回路の構成要素を表記の部位の1つより多くに挿入する。一部の実施形態では、複数の異なる回路を表記の部位の1つより多くに挿入する。したがって、E.coli 1917 Nissle染色体の複数の部位に回路を挿入することによって、遺伝子操作された細菌は、複数の作用機序(MoA)を可能にする回路を含みうる。

0164

図76は、腫瘍において100μLのSYN94(ストレプトマイシン抵抗性Nissle)またはSYN1557(Nissle ΔPAL::CmR)(1e7個細胞/用量)の腫瘍内(IT)投与後の様々な時点で検出された細菌のCFUを示すグラフを表す。これらの時点で、血液中で検出された細菌はなかった。

0165

図77は、腫瘍(CT26)において1e7および1e8個細胞/用量での100μLのSYN94(ストレプトマイシン抵抗性Nissle)の腫瘍内(IT)投与後の様々な時点で検出された細菌のCFUを示すグラフを表す。腫瘍組織における細菌数は、両方の用量で同様であった。

0166

図78Aおよび図78Bは、腫瘍内107 CFU/用量のSYN94(ストレプトマイシン抵抗性Nissle)投与または食塩水投与の48時間後に、および未処置動物において、様々な組織で検出された細菌濃度図78A)ならびに血清、腫瘍および肝臓中で測定されたTNFaレベル(図78B)を示すグラフを表す。細菌は、主として腫瘍内に存在し、試験した他の組織には非存在であった。測定されたTNFaレベルは、血清、腫瘍および肝臓すべてにおいて、SYN94処置群と食塩水処置群と未処置群の間で同様であった。

0167

図79は、DacA(プラスミドに基づくFNR−DacA、ΔDAP)の発現を駆動するために低酸素プロモーター(FNRプロモーター)を使用する嫌気的誘導によって高レベルのc−ジAMP産生がin vivoで達成されることを示すグラフを表す。2e5個のB16細胞を移植し、移植後14日目に、腫瘍が約250〜400mm3に達したら、マウスを3つの実験群に分けた。群1にはPBSを1回注射し(n=1)、群2(n=3)にはSYN766(DAP−WT;1e9個細胞)を注射した。群3(n=3)にはSYN4449(プラスミドに基づくFNR−DacA、ΔDAP;1e9個細胞)を注射し、投与の24時間後に、腫瘍を抽出し、c−ジAMP産生をLC−MS/MSにより測定した。

0168

図80は、組み込まれたDacAの発現を駆動するために低酸素プロモーター(FNRプロモーター)を使用する嫌気的誘導によって高レベルのc−ジAMP産生がin vivoで達成されることを示すグラフを表す。2e5個のB16細胞を移植し、移植後14日目に、腫瘍が約250〜400mm3に達したら、マウスを2つの実験群に分けた。群1にはPBSを1回注射し(n=3)、群2(n=3)にはSYN4910(ΔThyAおよびΔDapA栄養要求体ならびにファージ欠失をさらに含む、組み込まれているDAP−FNR−STING;1e9個細胞)を注射し、投与の24時間後に、腫瘍を抽出し、c−ジAMP産生をLC−MS/MSにより測定した。

0169

図81A、図81B、図81Cおよび図81Dは、B16モデルにおけるSYN4910(ΔThyAおよびΔDapA栄養要求体ならびにファージ欠失をさらに含む、組み込まれているDAP−FNR−STING)の有効性を示すグラフを表す。簡単に説明すると、B16細胞を上記のように移植した。腫瘍が約100mm^3に達するまで、腫瘍成長をモニタリングした。0日目に、マウスを次のように腫瘍内投与の群(1群あたりN=10)に無作為化した:PBS(群1、ビヒクル対照)、SYN4740(ΔThyA、ΔDapA、ΔΦ;群2、1e9 CFU)、SYN4910(群3、1e9 CFU)。腫瘍サイズを測定し、0、2および5日目に細菌またはPBSをマウスにI.T.注射した。腫瘍体積を週に2回記録した。結果は、SYN4910の投与がB16腫瘍リンパ腫モデルにおいて腫瘍制御および拒絶を駆動することを示す。
同上。

0170

図82は、ヒトサイクリックGAMPシンターゼ(hcGAS)の発現による、ヒトサイクリックGAMP(2’3’−cGAMP)アナログの産生を示すグラフを表す。hcGASの遺伝子回路は、p15a起点プラスミドと、E.coliにおける発現のためにコドン最適化されたhcGASタンパク質コード配列の発現を駆動するテトラサイクリン誘導性プロモーター(Ptet)とを含む。示されている通り、次のような株を生成した:(1)プラスミド単独を含む株;(2)p15−ptet−hcGASとdapA栄養要求性修飾とを含む株;(3)p15−ptet−hcGASとキヌレニン消費回路(構成的プロモーターの制御下にあり染色体に組み込まれているキヌレニナーゼ)とを含む株;(4)p15−ptet−hcGASと、構成的プロモーターの制御下にあり染色体に組み込まれているキヌレニナーゼと、低酸素誘導性FNRプロモーターの制御下にあるフィードバック耐性ArgAを含むアルギニン産生回路と、内在性またはネイティブargR遺伝子の欠失とを含む株。2’3’−cGAMPアナログを産生するために、一晩培養物および対照株を、適切な抗生物質を含有するLB中で成長させた。これらを、0.5%グルコースと適切な抗生物質とを含有するM9最少培地に逆希釈した。これらを2時間成長させた後、500ng/mLのアンヒドロテトラサイクリン(ATC)で誘導入し、次いでその後、さらに2時間放置してインキュベートした。1mLの培養物を除去し、8000xgで5分間、遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、これらのペレットをLC/MSによる2’3’−cGAMP STINGアゴニストの細胞内濃度の定量に使用した。

0171

ある特定の腫瘍は、従来の治療法を使用して管理することが特に困難である。ハイポキシアは、がん性細胞が非常に低い酸素濃度で存在する固形腫瘍特有の特徴である。ハイポキシアの領域は、多くの場合、壊死組織を包囲し、固形のがんがそれらの脈管構造より大きくなると発生する。血管供給が、腫瘍の代謝要求を満たすことができないと、腫瘍の微量環境は酸欠になる。腫瘍内の複数のエリアは、正常組織内の3〜15%酸素と比較して<1%酸素を含有し(VaupelおよびHockel、1995年)、無血管領域腫瘍塊の25〜75%を占めることもある(Dangら、2001年)。腫瘍のおおよそ95%は、ある程度は低酸素である(Huangら、2004年)。全身送達される抗がん剤は、腫瘍脈管構造
に頼って送達されるが、不良な脈管形成が、急速に分裂する細胞への酸素供給を妨げ、その結果、脈管形成不良の低酸素腫瘍領域における細胞増殖を標的とする治療に対するそれらの細胞の感受性が低くなる。放射線療法は、酸素が放射線誘細胞死の必要エフェクターであるため、低酸素細胞死滅させることができない。低酸素細胞には、放射線療法に対して、正常な酸素レベルを有する細胞の3倍までの抵抗性がある(Bettegowdaら、2003年;Tiecher、1995年;Wachsbergerら、2003年)。これらのすべての理由のため、切除不能局所進行腫瘍は、従来の治療法を使用して管理することが特に困難である。

0172

低酸素環境を標的とすることに関連する課題に加えて、がんを特異的に標的とし、破壊する治療法は、遺伝的変更と、ハイポキシアおよび壊死のエリアを有する不均質な塊をもたらす病態生理学的変化とを含む、正常組織と悪性組織との差を認識しなければならない。

0173

本開示は、遺伝子操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌、その医薬組成物、およびがんをモジュレートまたは処置するための方法に関する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん性細胞を標的とすることができる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、特に、低酸素腫瘍環境などの低酸素条件で、がん性細胞を標的とすることができる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞に局所送達される。ある特定の態様では、本明細書で開示される組成物および方法を使用して、1つもしくは複数の免疫モジュレーターをがん性細胞に送達すること、またはがん性細胞において1つもしくは複数の免疫モジュレーターを産生することができる。

0174

本開示は、がんを処置するために免疫モジュレーターを局所的かつ腫瘍特異的に送達するための、組成物および治療方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、がん性細胞を標的とすることができ、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーター、例えば、本明細書で提供されるエフェクター分子のいずれかを産生することができる、遺伝子操作された微生物に関する。ある特定の態様では、本開示は、がん性細胞を標的とすることができ、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる、遺伝子操作された細菌に関する。ある特定の態様では、本開示は、がん性細胞、特に、腫瘍の低酸素領域におけるがん性細胞を標的とすることができ、酸素レベル誘導性プロモーターの制御下で1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる、遺伝子操作された細菌に関する。既存の従来の治療法とは対照的に、腫瘍の低酸素エリアは、嫌気性細菌の成長のための完璧なニッチを提供し、その使用は、周囲の脈管形成良好な酸素正常状態の組織を温存して、進行した局所腫瘍を正確に根絶する機会をもたらす。

0175

具体的には、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、1つもしくは複数の免疫イニシエーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、1つもしくは複数の免疫イニシエーターと組み合わせて、1つもしくは複数の免疫サステナーを産生することができる。

0176

一部の態様では、本開示は、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーター(例えば、免疫イニシエーターおよび/または免疫サステナー)を腫瘍細胞または腫瘍微小環境に送達することができる、遺伝子操作された微生物を提供する。一部の態様では、本開示は、全身的に、例えば本開示に記載の送達手段のいずれかによって、送達され、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、本明細書に記載の免疫イニシエーターおよび/または免疫サステナーを産生することができる、遺伝子操作された微生物に関する。一部の態様では、本開示は、局所的に、例えば局所腫瘍内投与によって、送達され、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫イニシエーターおよび/または免疫サステナーを産生することができる、遺伝子操作された微生物に関する。一部の態様では、本明細書で開示される組成物および方法を使用して、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫イニシエーターおよび/または免疫サステナーを腫瘍細胞に選択的に送達することによって、全身性細胞傷害性または全身性免疫不全、例えば、自己免疫事象または他の免疫関連有害事象の発生を低減させることができる。

0177

本開示をより容易に理解することができるように、ある特定の用語が最初に定義される。これらの定義は、本開示の残部に照らし合わせて、また当業者により理解されるように、読まれたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。さらなる定義は、詳細な説明の至る所に示される。

0178

がんに対する免疫の生成は、「がん−免疫サイクル」(ChenおよびMellman、Oncology Meets Immunology: The Cancer−Immunity Cycle; Immunity、(2013年)、39巻:1〜10頁)と称されている潜在的に自己伝播性周期的プロセスであり、これにより、T細胞応答の広範化および増幅がもたらされ得る。サイクルは、サイクル内の様々なステップにおいて免疫調節性フィードバック機序を引き起し発達を停止させるかまたは免疫を制限し得る、阻害因子によって妨害される。

0179

サイクルは、本質的に、抗がん免疫応答の開始が成功するために起こる必要のある一連のステップを含む。サイクルには、免疫応答が開始されるために起こる必要のあるステップと、免疫応答が維持される(すなわち、進行および拡大増殖することが可能となり、衰えない)ために、続いて起こる必要のある第2の一連の事象とが含まれる。これらのステップは、「がん−免疫サイクル」(ChenおよびMellman、2013年)と称されており、本質的には、以下のものである。

0180

1.腫瘍細胞内容物の放出(腫瘍溶解)および/または獲得:腫瘍細胞が破壊され、その内容物が流出し、結果としてネオ抗原の放出が起こり、それが、プロセシングのために抗原提示細胞(樹状細胞およびマクロファージによって取り込まれる。あるいは、抗原提示細胞が、能動的に、腫瘍細胞に直接食作用を行ってもよい。

0181

2.抗原提示細胞(APC)(樹状細胞およびマクロファージ)の活性化:上記の第1のステップに加えて、次のステップには、抗原提示細胞の活性化およびそれに続く抗がんT細胞応答をもたらすために、瀕死の腫瘍細胞からのDAMPまたはPAMPの放出の結果として、炎症性サイトカインの放出または炎症性サイトカインの生成が含まれなければならない。抗原提示細胞の活性化は、腫瘍由来抗原に対する末梢寛容を回避するために、極めて重要である。適正に活性化されると、抗原提示細胞は、その表面で以前に内部移行された抗原を、MHCIおよびMHCII分子の状況下で、適正な共刺激シグナル(CD80/86、サイトカインなど)とともに提示して、T細胞をプライミングおよび活性化する。

0182

3.T細胞のプライミングおよび活性化:DCおよびマクロファージによる抗原提示は、免疫系によって「外来」として認識される、がん特異的抗原に対するエフェクターT細胞応答のプライミングおよび活性化をもたらす。このステップは、エフェクターT細胞の数量および質、ならびに調節性T細胞の寄与を決定することにより、抗がん免疫応答の強度および範囲に極めて重要である。加えて、T細胞の適正なプライミングは、より優れたメモリーT細胞の形成および永続的な免疫をもたらし得る。

0183

4.移動および浸潤:次に、活性化エフェクターT細胞は、腫瘍に移動し、腫瘍に浸潤しなければならない。

0184

5.T細胞およびT細胞支持体によるがん細胞の認識、ならびにエフェクターT細胞応答の増強および拡大増殖:腫瘍部位に到達すると、T細胞は、それらのT細胞受容体(TCR)を介してがん細胞を認識し、それに結合することができ、TCRは、がん細胞上にMHC分子の状況で提示されているそれらの同種抗原に特異的に結合し、続いて、標的がん細胞を死滅させる。がん細胞の死滅により、腫瘍細胞の細胞溶解を通じて腫瘍関連抗原が放出され、サイクルが再度開始され、それによって、後続の回のサイクルにおける応答の量が増大する。MHC−IまたはMHC−IIのいずれかに制限されるT細胞による抗原認識は、さらなるエフェクター機能、例えば、ケモカインおよびエフェクターサイトカインの放出をもたらし、強固な抗腫瘍応答をさらに強化し得る。

0185

6.免疫抑制の克服:最後に、がんに対する免疫応答におけるある特定の欠損を克服することおよび/またはがんの防御戦略を克服すること、すなわち、がんが免疫応答と戦う際に用いる弱点を克服することは、サイクルにおける別の極めて重要なステップとして解釈することができる。一部の事例では、T細胞のプライミングおよび活性化が生じたとしても、他の免疫抑制細胞サブセット、すなわち、調節性T細胞または骨髄系(myloid)由来サプレッサー細胞が、腫瘍微小環境に対して能動的に動員および活性化される。他の事例では、T細胞は、適正に腫瘍にホーミングするための正しいシグナルを受容しない可能性があるか、または腫瘍に浸潤することから能動的に除外され得る。最後に、腫瘍微小環境には、サイクルの結果として産生されるエフェクター細胞を抑制または抑止することができる、ある特定の機序が存在している。そのような耐性機序には、通常、免疫寛容を媒介し、がん組織損傷を弱める、免疫チェックポイントと称されることも多い免疫阻害経路が組み入れられている(例えば、Pardoll、(2012年)、The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy; Nature Reviews Cancer、12巻、252〜264頁を参照されたい)。

0186

1つの重要な免疫チェックポイント受容体は、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)であり、これは、T細胞活性化の振幅ダウンモジュレートする。一部の免疫チェックポイント受容体、例えば、プログラム細胞死タンパク質1(PD1)は、組織内のT細胞エフェクター機能を制限する。PD1のリガンドを上方調節することによって、腫瘍細胞および抗原提示細胞は、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を遮断する。いくつかは様々な種類の腫瘍細胞においては選択的に上方調節される、複数の追加の免疫チェックポイント受容体およびリガンドは、特に、抗腫瘍免疫応答の開始または活性化を増強するアプローチとの組合せにおいて、遮断の重要な標的である。

0187

6つのステップのうちの1つまたは複数において、がん−免疫サイクルを経ての進行を促進および支持するための治療法が、開発されている。これらの治療法は、広義には、免疫応答の開始を促進する治療法および免疫応答を維持するのに役立つ治療法として、分類することができる。

0188

本明細書で使用される場合、「免疫開始」または「免疫応答を開始すること」という用語は、免疫応答の生成および確立をもたらすステップを通じた前進を指す。例えば、これらのステップには、上述のがん免疫サイクルの最初の3つのステップ、すなわち、抗原獲得のプロセス(ステップ(1))、樹状細胞およびマクロファージの活性化(ステップ(2))、ならびに/またはT細胞のプライミングおよび活性化(ステップ(3))が含まれ得る。

0189

本明細書で使用される場合、「免疫維持」または「免疫応答を維持すること」という用語は、免疫応答が、経時的に広範化および強化されるのを確実にし、免疫応答の減弱または抑制を予防するステップを通じた前進を指す。例えば、これらのステップには、記載されるサイクルのステップ4から6、すなわち、T細胞の移動および腫瘍浸潤、TCRを通じたがん細胞の認識、ならびに免疫抑制を克服すること、すなわち、調節性T細胞の枯渇または阻害、およびエフェクター応答の他の能動的な抑制の確立を予防することが含まれ得る。

0190

したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、サイクル内のステップのうちの1つまたは複数をモジュレートすること、例えば、活性化すること、促進すること、支持することによって、がん免疫サイクルをモジュレート、例えば、前進させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化するステップを、モジュレート、例えば、促進することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の維持を増強するサイクル内のある特定のステップを、モジュレート、例えば、ブーストすることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化すること、および免疫応答の持続をモジュレート、例えば、増強することができる。

0191

したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化する、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の維持をモジュレート、例えば、増強する、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化する、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーター、ならびに免疫応答の維持をモジュレート、例えば、増強する、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる。

0192

したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化する、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列を含む。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の維持をモジュレート、例えば、増強する、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列を含む。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化する、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーター、ならびに免疫応答の維持をモジュレート、例えば、増強する、1つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列を含む。

0193

「エフェクター」、「エフェクター物質」、または「エフェクター分子」は、目的の1つまたは複数の分子、治療用物質、または薬物を指す。一実施形態では、「エフェクター」は、改変された微生物、例えば、細菌によって産生される。別の実施形態では、本明細書に記載される第1のエフェクターを産生することができる改変された微生物は、第2のエフェクター、例えば、改変された微生物によって産生されないが、第1のエフェクターを産生する改変された微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される第2のエフェクターと組み合わせて、投与される。

0194

そのようなエフェクターまたはエフェクター分子の非限定的な例は、「免疫モジュレーター」であり、本明細書に記載される免疫サステナーおよび/または免疫イニシエーターが含まれる。一部の実施形態では、改変された微生物は、2つまたはそれより多いエフェクター分子または免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、改変された微生物は、3、4、5、6、7、8、9、または10個のエフェクター分子または免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、がんのモジュレーションまたは処置に有用である治療用分子である。別の実施形態では、本明細書に記載される第1の免疫モジュレーターを産生することができる改変された微生物は、第2の免疫モジュレーター、例えば、改変された微生物によって産生されないが、第1の免疫モジュレーターを産生する改変された微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される第2の免疫モジュレーターと組み合わせて、投与される。

0195

一部の実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる治療用分子である。他の実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。代替実施形態では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生化学的または生合成経路によって産生される治療用分子である。別の実施形態では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生化学的、生合成、または異化経路の少なくとも1つの酵素である。一部の実施形態では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、RNA干渉、マイクロRNA応答もしくは阻害、TLR応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合(アプタマーまたはデコイオリゴ)、または遺伝子編集、例えば、CRISPR干渉を媒介する核酸分子であり得る。他の種類のエフェクターおよび免疫モジュレーターは、本明細書に記載および列挙されている。

0196

エフェクター分子および/または免疫モジュレーターの非限定的な例としては、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、CTLA−4抗体、PD−1抗体、PDL−1抗体)、細胞傷害剤(例えば、Cly A、FASL、TRAIL、TNFα)、免疫刺激性サイトカインおよび共刺激分子(例えば、OX40抗体またはOX40L、CD28、ICOS、CCL21、IL−2、IL−18、IL−15、IL−12、IFN−ガンマ、IL−21、TNF、GM−CSF)、抗原および抗体(例えば、腫瘍抗原、ネオ抗原、CtxB−PSA融合タンパク質、CPV−OmpA融合タンパク質、NY−ESO−1腫瘍抗原、RAF1、免疫サプレッサー分子に対する抗体、抗VEGF、抗CXR4/CXCL12、抗GLP1、抗GLP2、抗ガレクチン1、抗ガレクチン3、抗Tie2、抗CD47、免疫チェックポイントに対する抗体、免疫抑制性サイトカインおよびケモカインに対する抗体)、DNA転移ベクター(例えば、エンドスタチントロンボスポンジン−1、TRAIL、SMAC、Stat3、Bcl2、FLT3L、GM−CSF、IL−12、AFP、VEGFR2)、ならびに酵素(例えば、E.coli CD、HSV−TK)、免疫刺激性代謝物およびそれらを産生する生合成経路の酵素(STINGアゴニスト、例えば、c−ジAMP、3’3’−cGAMP、および2’3’−cGAMP、アルギニン、トリプトファン)が挙げられる。

0197

エフェクターにはまた、免疫抑制性または腫瘍成長促進性代謝物、例えば、キヌレニン、アデノシン、およびアンモニアの異化をもたらす、酵素もしくは他のポリペプチド(例えば、輸送体または調節タンパク質)または他の改変(例えば、ある特定の内在性遺伝子、例えば、栄養要求体の不活性化)も含まれ得る。キヌレニン、アデノシン、およびアンモニアの消費回路の非限定的な例は、本明細書に記載されている。

0198

免疫モジュレーターには、とりわけ、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーが含まれる。

0199

本明細書で使用される場合、「免疫イニシエーター」または「イニシエーター」という用語は、あるクラスのエフェクターまたは分子、例えば、免疫モジュレーター、または物質を指す。免疫イニシエーターは、(1)腫瘍細胞の細胞溶解(腫瘍溶解)、(2)APC(樹状細胞およびマクロファージ)の活性化、ならびに/または(3)T細胞のプライミングおよび活性化を含む、がん免疫サイクルの1つまたは複数のステップをモジュレート、例えば、強化または増強し得る。一実施形態では、免疫イニシエーターは、本明細書に記載される改変された微生物、例えば、細菌によって産生され得るか、または本開示の改変された微生物と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書に記載される第1の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生することができる改変された微生物は、第2の免疫イニシエーター、例えば、改変された微生物によって産生されないが、第1の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生する改変された微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される第2の免疫イニシエーターと組み合わせて、投与される。このような免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書にさらに詳細に記載されている。

0200

一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる治療用分子である。このような治療用分子の非限定的な例は、本明細書に記載されており、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体(アゴニストまたはアンタゴニスト)、リガンド(アゴニストまたはアンタゴニスト)、共刺激受容体/リガンドなどが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。このような酵素の非限定的な例は、本明細書に記載されており、STINGアゴニストを産生するDacAおよびcGASが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも1つの酵素である。このような生合成経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、アルギニンの産生に関与する酵素が挙げられるが、これに限定されない。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる異化経路の少なくとも1つの酵素である。このような異化経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、有害な代謝物の異化に関与する酵素が挙げられるが、これに限定されない。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも1つの酵素によって産生される少なくとも1つの分子である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、代謝変換によって産生される治療用分子である、すなわち、免疫イニシエーターは、代謝変換因子である。他の実施形態では、免疫イニシエーターは、RNA干渉、マイクロRNA応答または阻害、TLR応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合(アプタマーまたはデコイオリゴ)、遺伝子編集、例えば、CRISPR干渉を媒介する核酸分子であり得る。

0201

「免疫イニシエーター」という用語はまた、内在性遺伝子の任意の改変、例えば、突然変異または欠失も指し得る。一部の実施形態では、細菌は、生化学的、生合成、または異化経路を発現するように操作されている。一部の実施形態では、細菌は、第2のメッセンジャー分子を産生するように操作されている。

0202

広義には、微生物、例えば、細菌は、「免疫イニシエーター」を産生することができる場合、本明細書において、「免疫イニシエーター微生物」と称される場合がある。

0203

特定の実施形態では、改変された微生物は、(1)腫瘍細胞の細胞溶解および/もしくは腫瘍抗原の取込みのステップ、(2)APCの活性化のステップ、ならびに/または(3)T細胞のプライミングおよび活性化のステップのうちの1つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する、1つまたは複数の免疫イニシエーターを産生することができる。一部の実施形態では、改変された微生物は、(1)腫瘍細胞の細胞溶解および/もしくは腫瘍抗原の取込みのステップ、(2)APCの活性化のステップ、ならびに/または(3)T細胞のプライミングおよび活性化のステップのうちの1つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する、1つまたは複数の免疫イニシエーターの産生のための遺伝子回路網を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、(1)腫瘍溶解および/もしくは腫瘍抗原の取込みのステップ、(2)APCの活性化のステップ、ならびに/または(3)T細胞のプライミングおよび活性化のステップのうちの1つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する、1つまたは複数の免疫イニシエーターをコードする1つまたは複数の遺伝子を含む。任意の免疫イニシエーターを、がん免疫サイクルにおける同じかまたは異なるステップをモジュレートする1つまたは複数の追加の同じかまたは異なる免疫イニシエーターと組み合わせてもよい。

0204

一実施形態では、改変された微生物は、腫瘍溶解または腫瘍抗原の取込み(ステップ(1))をモジュレートする、1つまたは複数の免疫イニシエーターを産生する。抗原獲得をモジュレートする免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知であり、溶解性ペプチド、CD47遮断抗体、SIRP−アルファおよびバリアント、TNFα、IFN−γ、ならびに5FUが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、改変された微生物は、APCの活性化(ステップ(2))をモジュレートする、1つまたは複数の免疫イニシエーターを産生する。APCの活性化をモジュレートする免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知であり、Toll様受容体アゴニスト、STINGアゴニスト、CD40L、およびGM−CSFが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、改変された微生物は、T細胞のプライミングおよび活性化(ステップ(3))をモジュレート、例えば、増強する、1つまたは複数の免疫イニシエーターを産生する。T細胞のプライミングおよび活性化をモジュレート、例えば、増強する、免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知であり、抗OX40抗体、OXO40L、抗41BB抗体、41BBL、抗GITR抗体、GITRL、抗CD28抗体、抗CTLA4抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、IL−15、およびIL−12などが挙げられるが、これらに限定されない。

0205

本明細書で使用される場合、「免疫サステナー」または「サステナー」は、あるクラスのエフェクターもしくは分子、例えば、免疫モジュレーター、または物質を指す。免疫サステナーは、(4)移動及び浸潤、(5)T細胞およびT細胞支持体によるがん細胞の認識、ならびに/または(6)免疫抑制を克服する能力を含む、がん免疫サイクルの1つまたは複数のステップをモジュレート、例えば、ブーストまたは増強することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、本明細書に記載される改変された微生物、例えば、細菌によって産生され得る。別の実施形態では、免疫サステナーは、本明細書に記載される改変された微生物と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書に記載される第1の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生することができる改変された微生物は、第2の免疫サステナー、例えば、改変された微生物によって産生されないが、第1の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生する改変された微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される第2の免疫サステナーと組み合わせて、投与される。

0206

一部の実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる治療用分子である。このような治療用分子の非限定的な例は、本明細書に記載されており、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体(アゴニストまたはアンタゴニスト)、リガンド(アゴニストまたはアンタゴニスト)などが挙げられる。別の実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。このような酵素の非限定的な例は、本明細書に記載されており、表8に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成経路または異化経路の少なくとも1つの酵素である。このような生合成経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、アルギニンの産生に関与する酵素が挙げられるが、これに限定されない。このような異化経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、キヌレニンの触媒作用に関与する酵素またはアデノシンの触媒作用に関与する酵素が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも1つの遺伝子によってコードされる生合成、生化学的、または異化経路の少なくとも1つの酵素によって産生される少なくとも1つの分子である。別の実施形態では、免疫サステナーは、代謝変換によって産生される治療用分子である、すなわち、免疫イニシエーターは、代謝変換因子である。他の実施形態では、免疫サステナーは、RNA干渉、マイクロRNA応答または阻害、TLR応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合(アプタマーまたはデコイオリゴ)、遺伝子編集、例えば、CRISPR干渉を媒介する核酸分子であり得る。

0207

特定の実施形態では、改変された微生物は、有害な代謝物、例えば、細胞分裂、増殖、がんの成長を促進する、および/または例えばがん免疫サイクルを経ての進行を防止することによって免疫系を抑制する代謝物を、破壊することができる。したがって、「免疫サステナー」という用語はまた、有害な分子の低減または排除も指し得る。そのような事例では、「免疫サステナー」という用語は、1つまたは複数の遺伝子によってコードされ得る、有害な代謝物を破壊する異化経路の1つまたは複数の酵素も指すために使用され得る。「免疫サステナー」という用語は、異化酵素をコードする回路網、異化酵素を産生するための回路網、または微生物によって発現される異化酵素を指し得る。

0208

「免疫サステナー」という用語はまた、内在性遺伝子の任意の改変、例えば、突然変異または欠失も指し得る。一部の実施形態では、微生物は、生化学的、生合成、または異化経路を発現するように改変されている。一部の実施形態では、微生物は、第2のメッセンジャー分子を産生するように操作されている。

0209

広義には、微生物、例えば、細菌は、「免疫サステナー」を産生することができる場合、「免疫サステナー微生物」と称される場合がある。

0210

一部の実施形態では、改変された微生物は、(4)T細胞の移動および浸潤のステップ、(5)T細胞および/もしくはT細胞支持体によるがん細胞の認識のステップ、ならびに/または(6)免疫抑制を克服する能力のステップのうちの1つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする、1つまたは複数の免疫サステナーを産生することができる。任意の免疫サステナーを、同じかまたは異なるステップをモジュレートする1つまたは複数の追加の免疫サステナーと組み合わせてもよい。一部の実施形態では、改変された微生物は、(4)T細胞の移動および浸潤のステップ、(5)T細胞および/もしくはT細胞支持体によるがん細胞の認識のステップ、ならびに/または(6)免疫抑制を克服する能力のステップのうちの1つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする、1つまたは複数の免疫サステナーの産生のための遺伝子回路網を含む。一部の実施形態では、改変された微生物は、(4)T細胞の移動および浸潤のステップ、(5)T細胞および/もしくはT細胞支持体によるがん細胞の認識のステップ、ならびに/または(6)免疫抑制を克服する能力のステップのうちの1つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする、1つまたは複数の免疫サステナーをコードする1つまたは複数の遺伝子を含む。

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