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課題・解決手段

肺炎連鎖球菌B群連鎖球菌インフルエンザ菌チフス菌及び髄膜炎菌莢膜多糖の精製の、改良された費用効果の高いかつ短縮された方法が開示される。この方法には、酵素処理カクテル接線流濾過、及びマルチモードクロマトグラフィ精製が含まれる。グラム陰性菌については、エンドトキシン除去方法エンドトラップHD樹脂関与する。この短縮された方法は、ヒトワクチン調製における使用のためにWHO/EP/BPが必要とする純度を達成し、従来の方法と比較して、簡単なステップ及びより高い収率を有した。この方法のステップは、実施するために費用と時間を要し、及び/又は商業的使用について健康被害を有する、例えば、アルコールフェノールのような有機溶媒、及び超遠心分離の使用を避ける。また、開示された方法は、簡単で、効率的で、毒性がなく、スケールアップが容易で、環境に優しい。

概要

背景

<2.背景記述
精製されたCPS(莢膜多糖)は、ワクチン、特にCPSが由来する細菌が生じる感染に対して有効なワクチンの製造に用いられる。従来の方法では、細菌は工業用バイオリアクター、及び所定の又は所望の純度要件まで精製したCPS中で培養される。ワクチン生産のための細菌CPSの伝統的な精製処理は、エタノール及びフェノールのような溶媒、並びにカチオン性浄化剤によるいくつかの選択的沈殿テップに基づいている。

インフルエンザ菌(H.influenzae)、髄膜炎菌(N.meningitidis)、B群連鎖球菌(Group B Streptococcus)、及び肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)は、乳児及び免疫不全成人における髄膜炎肺炎及び菌血症の最も一般的な病原体の一部である。莢膜多糖(CPS)は宿主の免疫系に対する防御機構として作用し、それらをこれらの細菌の病原性主要因子とする。これらの微生物に由来する多糖ベースとするワクチンは、成人集団に有効である。多糖ワクチン免疫原性特性については、いくつかの研究がある。精製処理は、収量を最大限にし、処理コストを最小限に抑えながら、所望の仕様生成物を得ることを目的としている。従来の手順の最終精製ステップは、生産効率汚染物質の除去との間に代償がある一連精製ステップを含む。CPSの精製における汚染物は、例えば、タンパク質核酸顔料及び不要な多糖、例えば、グラム陽性菌については細胞壁多糖又はグラム陰性菌についてはリポ多糖LPS)である。

CPSの従来の精製処理は、エタノールによる濃縮/精製及び/又はアニオン性浄化剤による選択的沈殿、フェノールによる及びグラム陰性菌についてはLPSを排除するための超遠心法によるタンパク質抽出の一般的な方法に続く。

例えば、髄膜炎菌からの多糖の従来の精製には、カチオン性浄化剤セタブロンによる沈殿沈殿物の1M CaCl2への再懸濁、エタノールによる2回の沈殿、フェノールによる3回の抽出段階による徐蛋白透析及びさらなるエタノール沈殿が含まれる。LPSは、超遠心法によりCPSから分離される。

肺炎連鎖球菌のCPSのための従来の精製処理は、デオキシコレート浄化剤による全細胞溶解、濃縮/透析濾過、エタノール沈殿の4段階、フェノール処理及び活性炭による徐蛋白を含む。

インフルエンザ菌のPRPの従来の精製処理は、フェノール、ホルムアルデヒド又はチメロサールによる細胞不活性化、及び遠心分離による培養ブロスの分離から始まる。次いで、清澄された上清を50〜100kDaカットオフ膜による接線流限外濾過によって濃縮し、カチオン性浄化剤セタブロン及び塩化カルシウム可溶化した複合体PRP−セタブロンで沈殿させた後、数回のエタノール沈殿及びフェノールでの抽出による除蛋白及びさらなるエタノール沈殿を行う。リポ多糖は超遠心法によりPRPから分離される。

莢膜多糖からタンパク質及び細胞壁C−多糖のような他の不純物の除去を対象とする複数の精製手順が現在利用可能である。例えば、米国特許第4,242,501号は、肺炎球菌莢膜多糖の精製を対象とし、微生物莢膜多糖からのタンパク質及び他の不純物(C−多糖)の除去方法に関する。1572 MUM/2010。米国特許第5,714,354号、同第5,847,112号、及び同第4,242,501号はそれぞれ、肺炎球菌多糖からの精製処理を対象とする。国際公開第WO2006/082527号は、カチオン性浄化剤による沈殿を伴うB群連鎖球菌の莢膜多糖の精製処理に関する。国際公開第WO2008/045852号は、加熱及び低pH沈殿処理を使用した肺炎球菌多糖の精製処理に関する。国際公開第WO2012/127485号は、肺炎球菌多糖の精製のためのアルコール及びCTABを含まない方法に関する。CPS精製に関する他の刊行物としては、「Purification of Capsular Polysaccharide Produced by Streptococcus pneumoniae Serotype 19A」J.Microbiol.Biotechnol, 21(7)、734−738、2011;「Production of Capsular Polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 14 and Its Purification by Affinity Chromatography」、Appl Environ Microbiol、67(2)、969−971、2011年2月が挙げられる。

従来のCPS精製処理は長く、複雑であり、高度に訓練された個人を必要とし、複数の費用のかかる供給品及び組成物を利用する。さらに、間違えるリスクは大きく、間違いがしばしば発生し、時間及び資源の両方において処理が非常に非効率になっている。したがって、効率的で効果的な多糖精製手順が依然として必要である。

概要

肺炎連鎖球菌、B群連鎖球菌、インフルエンザ菌、チフス菌及び髄膜炎菌の莢膜多糖の精製の、改良された費用効果の高いかつ短縮された方法が開示される。この方法には、酵素処理カクテル接線流濾過、及びマルチモードクロマトグラフィ精製が含まれる。グラム陰性菌については、エンドトキシン除去方法エンドトラップHD樹脂関与する。この短縮された方法は、ヒトワクチン調製における使用のためにWHO/EP/BPが必要とする純度を達成し、従来の方法と比較して、簡単なステップ及びより高い収率を有した。この方法のステップは、実施するために費用と時間を要し、及び/又は商業的使用について健康被害を有する、例えば、アルコール、フェノールのような有機溶媒、及び超遠心分離の使用を避ける。また、開示された方法は、簡単で、効率的で、毒性がなく、スケールアップが容易で、環境に優しい。

目的

本発明は、現在の戦略及び設計に関連する課題及び欠点を克服し、多糖を精製するための新しい組成物及び手順を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

多糖精製方法であって、グラム陽性菌及び/又はグラム陰性菌発酵回収物を提供する工程と、デオキシコレートにより前記発酵回収物を清澄化する工程と、清澄化した多糖を、第一の透析濾過により濃縮する工程と、不純物消化するために、第一の透析濾過をされた前記多糖を、酵素により処理する工程と、酢酸により前記酵素を沈殿させる工程と、前記多糖を第二の透析濾過により濃縮する工程と、第二の透析濾過をされた前記多糖を、マルチモードクロマトグラフィ樹脂及び/又はエンドトキシン除去樹脂に通す工程と、精製された前記多糖を回収する工程とを含む、方法。

請求項2

前記多糖が、細菌細胞表面の多糖を含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記細菌細胞表面の多糖が、莢膜多糖及び/又は菌体外多糖を含む、請求項2に記載の方法。

請求項4

前記発酵回収物が、肺炎連鎖球菌B群連鎖球菌インフルエンザ菌ネズミチフス菌及び/又は髄膜炎菌を含む、請求項1に記載の方法。

請求項5

清澄化後、約pH3.5〜5.0にpH調整する、請求項1に記載の方法。

請求項6

前記pH調整が、酸の添加を含む、請求項5に記載の方法。

請求項7

前記酸が、酢酸を含む、請求項6に記載の方法。

請求項8

前記酵素が、ベンゾナーゼ、ムタノリシンリゾチーム、β−D−N−アセチルグルコサミニダーゼ及び/又はプロテイナーゼKの1つ以上を含む、請求項1に記載の方法。

請求項9

酵素による処理が、複数の異なる酵素を連続的に、単独で、又は組み合わせて実施される、請求項1に記載の方法。

請求項10

前記不純物が、タンパク質核酸細胞壁成分及び/又はペプチドグリカンを含む、請求項1に記載の方法。

請求項11

前記マルチモードクロマトグラフィ樹脂に通すことが、フロースルーモード接線流濾過モード、及び/又は濾過モードで実施される、請求項1に記載の方法。

請求項12

前記マルチモードクロマトグラフィ樹脂に通すことが、接線流濾過モードで実施される、請求項1に記載の方法。

請求項13

前記発酵回収物が、グラム陰性菌を含む、請求項1に記載の方法。

請求項14

第一の透析濾過をされた多糖を接線流濾過に通すことをさらに含む、請求項13に記載の方法。

請求項15

前記接線流濾過が、デオキシコレート/EDTA/Ca−塩緩衝液を含む、請求項14に記載の方法。

請求項16

前記接線流濾過が、50〜100kDaの膜に通すことをさらに含む、請求項13に記載の方法。

請求項17

前記発酵回収物が、グラム陽性菌を含む、請求項1に記載の方法。

請求項18

第一の透析濾過をされた多糖を接線流濾過に通すことをさらに含む、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記接線流濾過が、デオキシコレート/EDTA/Ca−塩緩衝液を含む、請求項18に記載の方法。

請求項20

前記接線流濾過が、50〜100kDaの膜に通すことをさらに含む、請求項17に記載の方法。

請求項21

第二の透析をされた前記多糖が、エンドトキシン除去樹脂を通過する、請求項1に記載の方法。

請求項22

前記発酵回収物が、肺炎連鎖球菌を含む、請求項1に記載の方法。

請求項23

前記肺炎連鎖球菌が、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24、33F及び35Bの1つ以上を含む、請求項22に記載の方法。

請求項24

前記発酵回収物が、B群連鎖球菌を含む、請求項1に記載の方法。

請求項25

前記B群連鎖球菌が、血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII及びIXの1つ以上を含む、請求項24に記載の方法。

請求項26

前記発酵回収物が、インフルエンザ菌を含む、請求項1に記載の方法。

請求項27

前記インフルエンザ菌が、血清型a、b、c、d、e及びfの1つ以上を含む、請求項26に記載の方法。

請求項28

前記発酵回収物が、チフス菌(S.typhi)を含む、請求項1に記載の方法。

請求項29

前記チフス菌が、Vi−多糖を含む、請求項28に記載の方法。

請求項30

前記発酵回収物が、髄膜炎菌を含む、請求項1に記載の方法。

請求項31

前記髄膜炎菌が、1つ以上の血清型A、B、C、X、Y、及びW−135を含む、請求項30に記載の方法。

請求項32

請求項1に記載の方法により精製された多糖。

請求項33

請求項32に記載の精製された多糖を組み込んだ又はそれに由来する免疫学的組成物

請求項34

アジュバントをさらに含む、請求項33に記載の免疫学的組成物。

請求項35

アジュバントを含まない、請求項33に記載の免疫学的組成物。

請求項36

請求項33に記載の免疫学的組成物を投与することを含む、感染に対してヒトを治療する方法。

請求項37

前記感染が、肺炎連鎖球菌、B群連鎖球菌、インフルエンザ菌、ネズミチフス菌及び/又は髄膜炎菌を含む、請求項36に記載の方法。

請求項38

多糖の精製方法であって、肺炎連鎖球菌、B群連鎖球菌、インフルエンザ菌、ネズミチフス菌及び/又は髄膜炎菌の発酵回収物を提供する工程と、約3.5〜5.0のpHでデオキシコレートにより前記発酵回収物を清澄化する工程と、清澄化した多糖を第一の透析濾過により濃縮する工程と、不純物を除去するために、前記第一の透析濾過をされた多糖を、酵素により処理する工程と、前記多糖が上清中に残るように、酢酸により酵素を沈殿させる工程と、第二の透析濾過により上清の前記多糖を濃縮する工程と、デオキシコレート/EDTA/Ca−塩緩衝液を用いた接線流濾過により、前記第二の透析をされた多糖を、マルチモードクロマトグラフィ樹脂及び/又はエンドトキシン除去樹脂に通す工程と、精製された前記多糖を回収する工程とを含む、方法。

技術分野

0001

<関連出願への参照>
本出願は、2017年7月5日に出願された米国仮出願第62/528,683号に対する優先権を主張するものであり、該仮出願の全体は参照により本明細書に援用される。

0002

背景
<1.発明の分野>
本発明は、細菌多糖の効果的な精製のための方法及び組成物を対象とする。方法は効率的で、費用対効果が高く、規模の拡大が可能であり、共役型ワクチンをはじめとするワクチンの調製のための不純物の除去を含む。

背景技術

0003

<2.背景の記述
精製されたCPS(莢膜多糖)は、ワクチン、特にCPSが由来する細菌が生じる感染に対して有効なワクチンの製造に用いられる。従来の方法では、細菌は工業用バイオリアクター、及び所定の又は所望の純度要件まで精製したCPS中で培養される。ワクチン生産のための細菌CPSの伝統的な精製処理は、エタノール及びフェノールのような溶媒、並びにカチオン性浄化剤によるいくつかの選択的沈殿テップに基づいている。

0004

インフルエンザ菌(H.influenzae)、髄膜炎菌(N.meningitidis)、B群連鎖球菌(Group B Streptococcus)、及び肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)は、乳児及び免疫不全成人における髄膜炎肺炎及び菌血症の最も一般的な病原体の一部である。莢膜多糖(CPS)は宿主の免疫系に対する防御機構として作用し、それらをこれらの細菌の病原性主要因子とする。これらの微生物に由来する多糖をベースとするワクチンは、成人集団に有効である。多糖ワクチン免疫原性特性については、いくつかの研究がある。精製処理は、収量を最大限にし、処理コストを最小限に抑えながら、所望の仕様生成物を得ることを目的としている。従来の手順の最終精製ステップは、生産効率汚染物質の除去との間に代償がある一連精製ステップを含む。CPSの精製における汚染物は、例えば、タンパク質核酸顔料及び不要な多糖、例えば、グラム陽性菌については細胞壁多糖又はグラム陰性菌についてはリポ多糖LPS)である。

0005

CPSの従来の精製処理は、エタノールによる濃縮/精製及び/又はアニオン性浄化剤による選択的沈殿、フェノールによる及びグラム陰性菌についてはLPSを排除するための超遠心法によるタンパク質抽出の一般的な方法に続く。

0006

例えば、髄膜炎菌からの多糖の従来の精製には、カチオン性浄化剤セタブロンによる沈殿沈殿物の1M CaCl2への再懸濁、エタノールによる2回の沈殿、フェノールによる3回の抽出段階による徐蛋白透析及びさらなるエタノール沈殿が含まれる。LPSは、超遠心法によりCPSから分離される。

0007

肺炎連鎖球菌のCPSのための従来の精製処理は、デオキシコレート浄化剤による全細胞溶解、濃縮/透析濾過、エタノール沈殿の4段階、フェノール処理及び活性炭による徐蛋白を含む。

0008

インフルエンザ菌のPRPの従来の精製処理は、フェノール、ホルムアルデヒド又はチメロサールによる細胞不活性化、及び遠心分離による培養ブロスの分離から始まる。次いで、清澄された上清を50〜100kDaカットオフ膜による接線流限外濾過によって濃縮し、カチオン性浄化剤セタブロン及び塩化カルシウム可溶化した複合体PRP−セタブロンで沈殿させた後、数回のエタノール沈殿及びフェノールでの抽出による除蛋白及びさらなるエタノール沈殿を行う。リポ多糖は超遠心法によりPRPから分離される。

0009

莢膜多糖からタンパク質及び細胞壁C−多糖のような他の不純物の除去を対象とする複数の精製手順が現在利用可能である。例えば、米国特許第4,242,501号は、肺炎球菌莢膜多糖の精製を対象とし、微生物莢膜多糖からのタンパク質及び他の不純物(C−多糖)の除去方法に関する。1572 MUM/2010。米国特許第5,714,354号、同第5,847,112号、及び同第4,242,501号はそれぞれ、肺炎球菌多糖からの精製処理を対象とする。国際公開第WO2006/082527号は、カチオン性浄化剤による沈殿を伴うB群連鎖球菌の莢膜多糖の精製処理に関する。国際公開第WO2008/045852号は、加熱及び低pH沈殿処理を使用した肺炎球菌多糖の精製処理に関する。国際公開第WO2012/127485号は、肺炎球菌多糖の精製のためのアルコール及びCTABを含まない方法に関する。CPS精製に関する他の刊行物としては、「Purification of Capsular Polysaccharide Produced by Streptococcus pneumoniae Serotype 19A」J.Microbiol.Biotechnol, 21(7)、734−738、2011;「Production of Capsular Polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 14 and Its Purification by Affinity Chromatography」、Appl Environ Microbiol、67(2)、969−971、2011年2月が挙げられる。

0010

従来のCPS精製処理は長く、複雑であり、高度に訓練された個人を必要とし、複数の費用のかかる供給品及び組成物を利用する。さらに、間違えるリスクは大きく、間違いがしばしば発生し、時間及び資源の両方において処理が非常に非効率になっている。したがって、効率的で効果的な多糖精製手順が依然として必要である。

0011

米国特許第4,242,501号明細書
米国特許第5,714,354号明細書
米国特許第5,847,112号明細書
米国特許第4,242,501号明細書
国際公開第2006/082527号
国際公開第2008/045852号
国際公開第2012/127485号

先行技術

0012

「Purification of Capsular Polysaccharide Produced by Streptococcus pneumoniae Serotype 19A」J.Microbiol.Biotechnol, 21(7)、734−738、2011
「Production of Capsular Polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 14 and Its Purification by Affinity Chromatography」、Appl Environ Microbiol、67(2)、969−971、2011年2月

0013

本発明は、現在の戦略及び設計に関連する課題及び欠点を克服し、多糖を精製するための新しい組成物及び手順を提供する。

0014

本発明の一実施形態は、グラム陽性及び/又はグラム陰性菌の発酵回収物を提供することを含む、細菌細胞表面の多糖を精製する方法を対象とする。発酵回収物は、好ましくは、pH3.5〜5.0のような酸性pHにおいて、デオキシコレート又は機能的に類似したもので、清澄化される。清澄化された多糖は、好ましくは透析濾過によって濃縮され、ペプチドグリカン及び/又は他の細胞膜構造に付着し得る宿主細胞タンパク質、核酸、及び細胞壁多糖などの不純物を除去するための酵素で処理される。酵素は好ましくは酢酸で沈殿させられ、酵素処理した多糖を透析濾過により濃縮し、フロースルーモード接線流濾過、及び/又はCAPTO(商標)Adhere樹脂による濾過マルチモードクロマトグラフィ樹脂に通される。好ましくは、細菌細胞表面の多糖は、莢膜多糖及び/又は菌体外多糖を含む。好ましくは、細菌の回収物は、肺炎連鎖球菌、B群連鎖球菌、インフルエンザ菌、ネズミチフス菌(S.typhimurium)又は髄膜炎菌を含む。好ましくは、清澄化に続いて、酢酸を用いて酸性pH3.5〜5に、又は2M酢酸を用いてpH3.5未満又はpH4.5未満にpHを調整する。好ましくは、酵素は、ベンゾナーゼ、ムタノリシンリゾチーム、β−D−N−アセチルグルコサミニダーゼ及びプロテイナーゼKからなる群から選択される。好ましくは、酵素処理は、単独又は組み合わせのいずれかで連続的に行われる。好ましくは、発酵回収物はグラム陰性菌を含み、酵素処理及び透析濾過された多糖は、デオキシコレート/EDTA/Ca−塩緩衝液を用いた接線流濾過を通過する。好ましくは、接線流濾過は、多糖を50〜100kDaの膜に通すことを含む。好ましくは、発酵回収物はグラム陽性菌を含み、酵素処理及び透析濾過された多糖は、CAPTO(商標) Adhere樹脂を用いたマルチモードクロマトグラフィを通過する。好ましくは、発酵回収物はグラム陰性菌を含み、さらに、樹脂クロマトグラフィ、より具体的にはフロースルーモードでのEndoTrap HD樹脂を用いたエンドトキシンの除去を含む。好ましくは、発酵回収物は、1つ以上の血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24、33F及び35B、又はワクチン調製に使用される別の血清型を含む肺炎連鎖球菌を含む。好ましくは、発酵回収物は、血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII及びIXの1つ以上を含むB群連鎖球菌を含む。好ましくは、発酵回収物は、亜系a、b、c、d、e及びf血清型を含むインフルエンザ菌を含む。好ましくは、発酵回収物は、Vi−多糖を含むチフス菌を含む。好ましくは、発酵回収物は、1つ以上の血清型A、B、C、X、Y、及びW−135を含む髄膜炎菌を含む。

0015

本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の本発明の方法によって精製された多糖を含む。

0016

本発明の別の実施形態は、本発明の精製多糖を組み込んだ、又は本発明の精製多糖に由来するワクチンのような免疫学的組成物を含む。本開示に従って調製されたワクチンは、アジュバントを含んでいても含んでいなくてもよい。

0017

本発明の他の実施形態及び利点は、以下に続く本明細書の一部に記載されており、部分的には、本明細書から明白であり得るか、又は本発明の実践から習得することができる。

図面の簡単な説明

0018

精製戦略−1を用いた、多糖が細胞壁多糖(CWPS)を含まないことを示す精製多糖の1HNMR分析。肺炎連鎖球菌3型多糖、サイズが低下した多糖、SEC—HPLC−による<50kDaの分子サイズ分布(3.2PPMで未検出のC−多糖)。
精製戦略−1を用いた、多糖が細胞壁多糖(CWPS)を含まないことを示す精製多糖の1H NMR分析。肺炎連鎖球菌1型多糖−サイズが低下した多糖、SEC−HPLC−による<50kDaの分子サイズ分布(3.2PPMで未検出のC−多糖)。

0019

<本発明の記述>
液体からの固体の分離は、これらの細菌に対するワクチンの製造に使用される精製されたCPS中での連続遠心分離に基づく。液体からの固体の分離は、防爆設備での連続遠心分離に基づく。

0020

従来の手順のエタノール沈殿、フェノールの使用、及び超遠心ステップを排除するCPS精製法が驚くべきことに開発された。本開示の方法は、例えば30〜100kDaのような所望の分子量カットオフ値を有する膜を用いた限外濾過ステップを含み、酵素消化及び好ましくは30〜100kDaのカットオフ膜を用いた接線流濾過(TFF)によって残留タンパク質及び核酸を除去する。得られた精製CPSは、70%を超える収率を有し、総CPSに関して1%以下のタンパク質及び1%以下の核酸を含む。精製CPSは、タンパク質分解酵素活性を有さず、必要な品質試験合格する。

0021

本発明の一般的な利点は、多糖を精製すると同時に、簡単で、効率的で、商業的に拡大可能なステップによって非常に短時間で不純物を除去し、それによって、関連するWHO仕様及び他の品質基準を満たすか、又は超える高品質多糖を生成する、細菌細胞表面の莢膜多糖(CPS)の精製のための迅速で、効率的かつ効果的な方法を提供することを含む。

0022

本発明の一実施形態は、多糖の精製方法を対象とする。この方法は、多糖を大幅に短縮された時間で精製する、新規で、迅速で、費用効果の高い、かつ規模の拡大が可能な方法を記載する。選択された菌株発酵槽内で最適化した培養培地上で培養し、発酵回収物の遠心分離を行い、細胞残屑を除去した後、分子量カットオフ膜を用いるTFFにより方法が進行する。本発明の方法は、多糖を調製する新規かつ迅速な方法を提供するなど、先行技術を上回るいくつかの利点を示す。この方法は、総ステップ数を減少させ、単一のクロマトグラフィスクリーニングを必要とするので、費用効果が高い。追加の利点は、この方法が完全に規模の拡大が可能であることである。

0023

大部分の任意の多糖の精製は、本開示の方法に従って行うことができるが、特に、好ましい方法は、ワクチン生産のための髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌b型、ネズミチフス菌、及びB群連鎖球菌に由来する多糖の精製を含む。本方法は、細菌の発酵回収物又は他の多糖源を提供し、デオキシコレートにより発酵回収物を、例えば約3.5〜5.0のpHで清澄化し、第一の透析濾過による清澄化多糖の濃縮及び不純物を除去するための第一の透析濾過された多糖の酵素による処理、多糖が上清中に残るように酢酸による酵素の沈殿、第二の透析濾過による上清の多糖の濃縮、マルチモードクロマトグラフィ樹脂及び/又はデオキシコレート/EDTA/Ca−塩緩衝液による接線流濾過によるエンドトキシン除去樹脂に第二の透析濾過された多糖を通し、並びに精製された多糖の回収を含む。

0024

本開示の方法は、エタノール、フェノール、及び浄化剤沈殿物の必要性及び使用を排除し、代わりに、連続的な溶菌酵素処理に続いて限外濾過を行い、望ましい場合には、疎水性相互作用クロマトグラフィ又は混合モードイオン交換樹脂クロマトグラフィによるさらなる精製を含む。

0025

ヌクレアーゼであるベンゾナーゼは、残存するゲノムDNA及びRNAを加水分解し、得られた低分子量オリゴヌクレオチドは、第二のTFUFにおいて膜を通して濾過される。ペプチドグリカン及びペプチドグリカンに付着した細胞壁多糖(CWPS又はB群炭水化物)は、ムタノリシン/チゾチーム/B−D−N−アセチルグルコサミニダーゼ酵素(活性単位比:1:1:0.1)カクテル組み合わせにより分解及び/又はサイズ低下する。タンパク質及びLPSは、酵素処理及びTFUF 30〜100kDaによる第二の濃縮/透析濾過後に除去される。グラム陰性菌については、LPSの除去は、浄化剤及びキレート剤、好ましくはDOC/EDTAの存在下でTFUFを用いて行うことが好ましい。浄化剤デオキシコレート、DOCは、脂質部分脂肪酸疎水性相互作用破壊し、凝集体を解き、30〜100kDaの膜中で自由に濾過することができるLPSの低分子量モノマーを生成する。

0026

本発明の精製方法は、部分的には、分子サイズに基づく。最初のTFUFでは、カットオフされた細孔よりも小さいサイズの分子が除去され、その大部分は培養培地から除去される。酵素が汚染物質、タンパク質、核酸のサイズを低下させた後、第二のTFUFがそれらの除去を行う。LPSに由来する低分子量モノマーは、浄化剤及びキレート剤の存在下で限外濾過される。

0027

本発明の方法は、アルコール、フェノール、又はカチオン性浄化剤を使用する従来の方法で必要とされる複数の沈殿ステップを排除し、代わりに、酵素処理及び/又は限外濾過を含み、要求された又は所望の純度最終生成物を得る。

0028

超遠心分離法と比較して、酵素処理と接線限外濾過の組み合わせはスケールアップがより容易で、はるかに安価である。接線流用の膜は所定の位置で洗浄され、(例えば使い捨て膜を使用して)繰り返し使用できるように保管される。本開示の方法は、商業開発のために容易にスケールアップされる、簡単で、効率的で、環境に優しい方法を提供する。

0029

以下の実施例は本発明の実施形態を例示するが、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。

0030

[実施例1]
<細菌の培養>
細菌の培養は、各菌株に適した培地及び条件を含む5〜10Lの発酵槽で行った。バイオリアクターの全ブロスを0.15%デオキシコレートで沈殿させ、デカントし、遠心分離した。接線精密濾過法により培養ブロスから細胞を分離した。肺炎連鎖球菌及び追加の菌株についても、CPS精製には細胞を含まない精密濾液を用いた。

0031

<濃縮/デフィルトレーション(defiltration)>
細胞を含まないCPSを30〜100kDaの接線流限外濾過(TFUF)膜により1〜20倍に濃縮した。この濃縮物を緩衝液で生物濾過した。

0032

<酵素処理及び濃縮/透析濾過>
ナイセリア又は連鎖球菌に由来する可溶性CPS画分のpHをpH7に調整した。組換え酵素を連続的に添加した:ベンゾナーゼ(2mM MgCl2及び20mM NaClを含むTris—HCl 50mM);ムタノリシン/リゾチーム(1:1);β−D−N−アセチルグルコサミニダーゼ;及びプロテイナーゼKをそれらの間の2〜4時間間隔で添加し、50〜100rpmでアルカリ性pH(pH8.8〜10.5)下で37℃〜56℃で12〜24時間インキュベートした。酵素分解及び浄化剤処理から生じる低分子量汚染物質を、30〜100kDaカットオフの第二のTFUF膜によって除去した。精製CPSを0.2μmの膜で無菌濾過し、マイナス20℃で保存した。

0033

多糖の精製には2つの異なる精製戦略を用いた。グラム陽性菌多糖の精製処理には一般的に一つの精製方法(精製戦略−1)を用い、グラム陰性菌多糖の精製処理には一つの精製方法(精製戦略−2)を用いた。

0034

<精製戦略−1(グラム陽性菌の場合)>
ベンゾナーゼ、ムタリノシン/リゾチームの組み合わせ、β−D−N−アセチルグルコサミニダーゼ、プロテイナーゼKを含む酵素カクテルに続く接線流濾過(TFF)、最終的にはマルチモードアオン交換体CAPTO(商標) Adhere樹脂クロマトグラフィ(プロセススケールでのモノクローナル抗体ポストプロテインA精製用に設計されたマルチモード媒体樹脂)を用いた多糖精製。

0035

肺炎連鎖球菌及びB群連鎖球菌血清型のいずれかに由来する複数の血清型多糖を精製した。精製したすべての多糖は、多糖純度に関するWHO/若しくはBP/の基準又はEP基準を満たすか、又は上回った。さらなる純度は、残留タンパク質、核酸及びエンドトキシンマルチモードクロマトグラフィステップに対する重量によって達成された。また、精製ステップ中に使用した残留酵素を除去するために、マルチモードクロマトグラフィを使用した。

0036

細胞分離、接線限外濾過による濃縮>
細菌の培養後、発酵液を0.15%デオキシコレートで不活性化(pHを4.5〜5に調整)し、デカンティング後遠心分離して細胞を除去し、0.9%生理食塩水、続いてTris−HCl緩衝液(50mM、pH7.0)を用いて50KDa〜100KDaのPES膜を使用して細胞を含まない清澄化されたブロスを濃縮し透析濾過した。

0037

<酵素処理及び接線限外濾過による第二の濃縮>
多糖溶液のpHをpH7.0からpH9〜9.5に上げ、2mM MgCl2を加え、42℃で、50〜75rpmで15分間インキュベートした。酵素ベンゾナーゼを加え、PS溶液ml当たり10〜20単位を加え、1〜2時間インキュベートした。その後、溶液1ml当たり50単位でムタノリシン/リゾチーム(1:1)の酵素の組み合わせを加え、1〜2時間インキュベートした。酵素β−N−アセチル−D−グルコサミニダーゼを多糖溶液100ml当たり1単位で加えた。プロテイナーゼKを加え、pH9.5〜10.5で、56℃で2〜4時間インキュベートした。全酵素反応を6〜8時間以内に完了させた。使用した酵素はすべて組換え酵素であった。

0038

酵素処理後、酢酸(2M)を用いて溶液のpHを3.5〜4.5に低下させ、沈殿物を深層濾過により除去し、多糖溶液のpHをpH7.0に調整した。清澄化された多糖溶液を0.9%生理食塩水、続いて50mMリン酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.4〜7.6)を用いて50kDa〜100kDaのPES膜で濃縮し、透析濾過した。

0039

<CAPTO(商標) Adhere樹脂を使用したカラムクロマトグラフィ
多糖の最終精製はCAPTO(商標) Adhere樹脂クロマトグラフィを用いた単純フロースルーモードで達成し、最終的にpH7.4〜7.6で50mMリン酸ナトリウム+1.0M NaClを用いて溶出した。結果を表1及び図1に示す。

0040

0041

<精製戦略−2(グラム陰性菌の場合)>
ベンゾナーゼ、プロテイナーゼKを含む酵素カクテル、それに続く接線流濾過(TFF)、及びマルチモードアニオン交換体CAPTO(商標) Adhere樹脂クロマトグラフィ及び/又はENDOTRAP(R)−HD樹脂によるLPS除去を用いた多糖精製

0042

インフルエンザ菌、髄膜炎菌、ネズミチフス菌血清型のいずれかに由来する複数の血清型多糖を精製した。精製したすべての多糖は、多糖純度に関するWHO/若しくはBP/の基準又はEP基準を満たすか、又は上回った。エンドトキシン除去ステップを用いて、残留エンドトキシンを除去した。精製ステップ中に使用した残留酵素を除去するために、マルチモードクロマトグラフィを任意にした。

0043

<細胞分離、接線限外濾過による濃縮>
細菌の培養後、発酵液を0.15%デオキシコレート又は0.6%ホルムアルデヒドによって不活性化した。細胞をデカンティング及び/又は遠心分離のいずれかによって除去し、細胞を含まない清澄化されたブロスを、0.9%生理食塩水、続いてTris−HCl緩衝液(50mM、pH7.0)を用いて、50kDa〜100kDaのPES膜を使用して濃縮し、透析濾過した。

0044

<酵素処理、接線限外濾過による第二の濃縮>
多糖溶液のpHを7.0から8.5〜8.8に上げ、2mM MgCl2を加え、37℃で、50〜75rpmで15分間インキュベートした。酵素ベンゾナーゼをPS溶液1ml当たり10〜20単位で添加し、溶液を1〜2時間インキュベートした。プロテイナーゼKを添加し、pH 9.5〜10.5で、45℃で2〜4時間インキュベートした。全酵素反応を6〜8時間以内に完了させた。使用したすべての酵素は組換え酵素であった。

0045

酵素処理後、酢酸(2M)を用いて溶液のpHを3.5〜4.5に低下させた。沈殿物を深層濾過で除去し、多糖溶液のpHをpH7.0に調整した。清澄化された多糖溶液を0.2%DOC及び1〜2mMEDTA、続いて50mMリン酸Na塩緩衝液(50mM、pH6.0〜6.4)を用いて50kDa〜100kDaのPES膜で濃縮し、透析濾過して、エンドトキシン不純物を減少させた。

0046

<Endotrap HD樹脂を用いたエンドトキシン除去>
多糖溶液中の残留エンドトキシンは、ENDOTRAP(R)−HD樹脂(エンドトキシン除去樹脂、Hyglos GmbH、ドイツ)を用いて単純フロースルーモードで除去した。使用する緩衝液は、pH6.4〜7.4の100〜200mMのTRIS又はHEPESのいずれかであり、NaClは50〜80mMである。緩衝液中に存在するカルシウムイオン及びEDTAもエンドトキシンの除去を高めた。再生後、数回ENDOTRAP(R)−HD樹脂を使用することができる。

0047

<CAPTO(商標) Adhere樹脂を使用したカラムクロマトグラフィ>
多糖の精製はCAPTO(商標) Adhere樹脂クロマトグラフィを用いた単純フロースルーモードで達成し、pH 7.4〜7.6で50mMリン酸ナトリウム+1.0M NaClを用いて溶出した。残留酵素活性が観察された場合、及びまたENDOTRAP(R)−HD樹脂からの漏出が観察された場合にも、このクロマトグラフィステップは任意とした。結果を表2及び図2に示す。

0048

実施例

0049

本発明の他の実施形態及び使用は、本発明の明細書の検討及び本明細書に開示された実践から当業者に明白であろう。すべての刊行物、米国及び外国特許及び特許出願をはじめとする、本明細書に引用されたすべての参考文献は、参照により具体的かつ完全に援用される。明細書及び実施例は例示的とのみみなされることが意図され、本発明の真の範囲及び精神は次の特許請求の範囲によって示される。さらに、「含む」という用語は、「からなる」及び「本質的にからなる」という用語を含む。

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