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図面 (20)

課題・解決手段

本開示は、キメラ抗原受容体、構成、およびそれらの方法を提供する。一実施形態では、本開示は、対象における自己免疫疾患喘息治療し、臓器拒絶を予防またはメディエートする方法を提供する。

概要

背景

リンパ球一種であるT細胞は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。細胞表面にT細胞受容体(TCR)が存在することにより、B細胞ナチュラルキラー細胞NK細胞)などの他のリンパ球と区別される。CD4+TあるいはCD4T細胞と呼ばれるヘルパーT細胞にはCD4糖蛋白質が細胞表面上に発現している。ヘルパーT細胞は、MHC主要組織適合遺伝子複合体クラスII分子によって提示されるペプチド抗原にさらされると活性化される。一旦活性化されると、これらの細胞は急速に増殖し、免疫応答を調節するサイトカイン分泌する。CD8 + T細胞またはCD8 T細胞としても知られている細胞傷害性T細胞は、CD8糖蛋白質を細胞表面上に発現している。 CD8 + T細胞は、MHCクラスI分子によって提示されるペプチド抗原にさらされると活性化される。 T細胞のサブセットであるメモリーT細胞は、長期間生存し、過去における感染および/あるいは腫瘍細胞に対する“記憶”を免疫システムに提供することで、それらの同種抗原応答する。

T細胞は、その表面上にキメラ抗原受容体(CARs)とよばれる特別な受容体を産生するように遺伝子操作することができる。CARsは、腫瘍細胞上の特異的タンパク質抗原)を認識することができるT細胞上のタンパク質である。これらの設計されたCAR T細胞は、実験室において数十億に達するまで増殖させる。その後、増殖させたCAR T細胞の集団患者注入される。

今日までのキメラ抗原受容体(CAR)T細胞を用いた臨床試験では、標準化学療法耐性をもつ血液悪性腫瘍に対する治療方として非常に見込みがある。最も注目すべきことに、CD19-特異的CAR(CD19CAR)T細胞療法は、B細胞悪性腫瘍における長期間の寛解を含め、著しく良好な結果をしめした。(参照文献:Kochenderfer、Wilsonら、2010、Kalos、Levine et al。2011、Porter、Levine et al。 2011、Davila、Riviere et al。 2013、Grupp、Frey et al。 2013年、Grupp、Kalos al。 2013、Kalos、Nazimuddin et al。 2013、Kochenderfer、Dudley et al。 2013年、Kochenderfer、Dudley et al。 2013、Lee、Shah et al。 2013、Park、Riviere et al。 2013、Maude、Frey et al。 2014)。

概要

本開示は、キメラ抗原受容体、構成、およびそれらの方法を提供する。一実施形態では、本開示は、対象における自己免疫疾患喘息を治療し、臓器拒絶を予防またはメディエートする方法を提供する。

目的

T細胞のサブセットであるメモリーT細胞は、長期間生存し、過去における感染および/あるいは腫瘍細胞に対する“記憶”を免疫システムに提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

シグナルペプチド抗原認識ドメインヒンジ領域、膜貫通ドメインシグナル伝達ドメイン、および共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体ポリペプチド、そして前記抗原認識ドメインは、FcER1A、FcER1、IgE、CD19、BCMA、またはCD45のうちの1つを含む操作された細胞

請求項2

共刺激ドメインがCD28または4-1 BBであり、そしてシグナリングドメインはCD3ゼータである請求項1に記載の操作された細胞。

請求項3

IL-15 / IL-15 sushi、IL-15 / 1L-15 sushiアンカー、4-1BBL、およびIL-15からなる群から選択される1つまたは複数のエンハンサーをさらに含む、請求項1に記載の操作された細胞。

請求項4

シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体ポリペプチド、そして前記抗原認識ドメインは、FcER1A、CD19、BCMA、またはCD45のうちの1つを含み、そして、少なくとも1つのエンハンサー、そして高効率の切断部位がキメラ抗原受容体ポリペプチドとエンハンサーの間に配置されていることを含む操作されたポリペプチド

請求項5

改変ポリペプチドが2つのエンハンサーと2つの高効率切断部位を含む、請求項4に記載の操作されたポリペプチド。

請求項6

高効率切断部位が、P2A、T2A、E2A、およびF2Aからなる群から選択される、請求項4に記載の操作されたポリペプチド。

請求項7

請求項4に記載のポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド

請求項8

第1シグナルペプチド、第1抗原認識ドメイン、第1ヒンジ領域、第1膜貫通ドメイン、第1シグナル伝達ドメイン、および第1共刺激ドメインを含む第1キメラ抗原受容体ポリペプチド;そして第2シグナルペプチド、第2抗原認識ドメイン、第2ヒンジ領域、第2膜貫通ドメイン、第2シグナル伝達ドメイン、および第2共刺激ドメインを含む第2キメラ抗原受容体ポリペプチドドメインと第二の抗原認識ドメインは異なります。そして第1の抗原認識ドメインおよび第2の抗原拒絶ドメインは、CD4、CD19、CD33、CD123、CLL-1、BAFFR、BCMA、およびCS-1からなる群から選択される。からなる群から選択されることを含む操作された細胞。

請求項9

第1の抗原認識ドメインおよび第2の抗原認識ドメインが、CD19およびCD123、CD19およびBAFFR、BCMAおよびCD19、BCMAおよびCS1、CD123およびCD33、CD33およびCLL-1、CD4とCD123、CD19とCS-1、およびCD4とCLL-1を含む群から選択される、請求項8に記載の操作された細胞。

請求項10

第1シグナルペプチド、第1抗原認識ドメイン、第1ヒンジ領域、第1膜貫通ドメイン、第1シグナル伝達ドメイン、および第1共刺激ドメインを含む第1キメラ抗原受容体ポリペプチド、そして第2シグナルペプチド、第2抗原認識ドメイン、第2ヒンジ領域、第2膜貫通ドメイン、第2シグナル伝達ドメイン、および第2共刺激ドメインを含む第2キメラ抗原受容体ポリペプチド、ここで第1の抗原認識ドメインと第2の抗原認識ドメインは異なり、そして第1の抗原認識ドメインおよび第2の抗原拒絶ドメインは、CD4、CD19、CD33、CD123、BAFFR、CLL-1、BCMA、およびCS-1からなる群から選択されることを含む操作されたポリペプチド。

請求項11

第1の抗原認識ドメインおよび第2の抗原認識ドメインが、CD19およびCD123、BCMAおよびCD19、CD19およびBAFFR、BCMAおよびCS1、CD123およびCD33、CD33およびCLL-1、CD4とCD123、CD19とCS-1、およびCD4とCLL-1を含む群から選択される、請求項10に記載の操作されたポリペプチド。

請求項12

第1の共刺激ドメインと第2の共刺激ドメインが異なる、請求項10に記載の操作されたポリペプチド。

請求項13

高効率切断部位が、第1の抗原認識ドメインと第2の抗原認識ドメインとの間に配置される、請求項10に記載の操作されたポリペプチド。

請求項14

請求項9に記載のポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。

請求項15

ここで、キメラ抗原受容体は、FcER1AまたはFcER1を含む、請求項1に記載の操作された細胞を含む構成物を、それを必要とする患者投与することを含む喘息治療方法

請求項16

FcER1A FcER1またはIgE細胞表面抗原を有する標的細胞を溶解する方法であって、前記細胞を請求項1に記載の操作された細胞と接触させることを含む方法。

請求項17

標的細胞が、形質細胞マスト細胞、または好塩基球細胞を含む、請求項15に記載の方法。

請求項18

請求項1に記載の操作された細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む、自己免疫疾患治療する方法であって、ここで、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスSLE)、多発性硬化症(MS)、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチシェーグレン症候群、皮膚筋症、自己免疫性溶血性貧血視神経脊髄炎(NMOD)、NMOスペクトラム障害NMOSD)特発性血小板減少性紫斑病ITP)、全身性自己免疫小血管血管炎症候群または顕微鏡多発血管炎(MPA)に関連する抗好中球細胞質自己抗体(ANCA)、多発血管炎を伴う肉芽腫症(GPA、Wegener肉芽腫症、肉芽腫症、肉芽腫症、EG )または多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症(EGPA、チャーグ-ストラウス症候群)を含む、方法。

請求項19

請求項7に記載の操作された細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法であって、ここで、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症(MS)、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチ、シェーグレン症候群、皮膚筋症、自己免疫性溶血性貧血、視神経脊髄炎(NMOD)、NMOスペクトラム障害(NMOSD)特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、全身性自己免疫小血管血管炎症候群または顕微鏡的多発血管炎(MPA)に関連する抗好中球細胞質自己抗体(ANCA)、多発血管炎を伴う肉芽腫症(GPA、Wegener肉芽腫症、肉芽腫症、肉芽腫症、EG )または多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症(EGPA、チャーグ-ストラウス症候群)を含む、方法。

請求項20

標的細胞を請求項3に記載の操作された細胞と接触させることを含む、標的細胞を枯渇させる方法であって、ここで、前記標的細胞は、以下の細胞表面抗原FcER1A、FcERi、IgE、CD19、BCMA、またはCD45の1つ以上を有する、方法。

請求項21

標的細胞を請求項9に記載の操作された細胞と接触させることを含む、標的細胞を枯渇させる方法であって、ここで、前記標的細胞は、以下の細胞表面抗原CD4、CD19、CD33、CD123、BAFFR、CLL-1、BCMA、およびCS-1のうちの1つ以上を有する、方法。

請求項22

患者の喘息を治療する方法であって、請求項1に記載の有効量の細胞を前記患者に投与することを含む方法。

請求項23

患者の臓器拒絶を予防またはメディエートする方法であって、請求項7に記載の有効量の細胞を前記患者に投与することを含む方法。

請求項24

第1シグナルペプチド、第1抗原認識ドメイン、第1ヒンジ領域、第1膜貫通ドメイン、第1シグナル伝達ドメイン、および第1共刺激ドメインを含む第1キメラ抗原受容体ポリペプチド、そしてオプションで、1つまたはそれ以上、第2シグナルペプチド、第2抗原認識ドメイン、第2ヒンジ領域、第2膜貫通ドメイン、第2シグナル伝達ドメイン、および第2共刺激ドメインを含む第2キメラ抗原受容体ポリペプチド、ここで第一の抗原認識ドメインと第二の抗原認識ドメインは異なり、そして第1の抗原認識ドメインおよび第2の抗原拒絶ドメインは、CD4、CD19、CD33、CD123、CLL-1、BAFFR、BCMA、およびCS-1からなる群から選択される、またはIL-15 / IL-15 sushi、IL-15 / 1L-15 sushiアンカー、4-1BBL、およびIL-15からなる群から選択される1つまたは複数のエンハンサーを含む操作された細胞。

請求項25

以下、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体ポリペプチド、そして前記抗原認識ドメインは、GD2およびGD3の一方を含む操作された細胞。

請求項26

共刺激ドメインがCD28または4-1 BBでり、シグナリングドメインはCD3ゼータである、請求項25に記載の操作された細胞。

請求項27

IL-15/IL-15 sushi、IL-15/IL-15 sushiアンカー、4-1BBL、およびIL-15からなる群から選択される1つまたは複数のエンハンサーをさらに含む、請求項25に記載の操作された細胞。

請求項28

シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体ポリペプチド、ここで、前記抗原認識ドメインは、GD2およびGD3の一方を含み、オプションで、少なくとも1つのエンハンサー、ここでは高効率の切断部位がキメラ抗原受容体ポリペプチドとエンハンサーの間に配置されているのを含む操作されたポリペプチド。

請求項29

操作されたポリペプチドが2つのエンハンサーそして2つの高効率切断部位を含む、請求項28記載の操作されたポリペプチド。

請求項30

前記高効率切断部位が、P2A、T2A、E2A、およびF2Aからなる群から選択される、請求項29に記載の操作されたポリペプチド。

請求項31

請求項25の操作されたポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。

請求項32

以下、第1シグナルペプチド、GD2抗原認識ドメイン、第1ヒンジ領域、第1膜貫通ドメイン、第1シグナル伝達ドメインおよび第1共刺激ドメインを含む第1キメラ抗原受容体ポリペプチド、そして第2シグナルペプチド、GD3抗原認識ドメイン、第2ヒンジ領域、第2膜貫通ドメイン、第2シグナル伝達ドメイン、および第2共刺激ドメインを含む第2キメラ抗原受容体ポリペプチドを含む操作された細胞。

請求項33

以下、第1シグナルペプチド、GD2抗原認識ドメイン、第1ヒンジ領域、第1膜貫通ドメイン、第1シグナル伝達ドメイン、および第1共刺激ドメインを含む第1キメラ抗原受容体ポリペプチド、そして第2シグナルペプチド、GD3抗原認識ドメイン、第2ヒンジ領域、第2膜貫通ドメイン、第2シグナル伝達ドメイン、および第2共刺激ドメインを含む第2キメラ抗原受容体ポリペプチドを含む操作されたポリペプチド。

請求項34

第1共刺激ドメインと第2の共刺激ドメインが異なる、請求項33に記載の操作されたポリペプチド。

請求項35

高効率切断部位が、第1の抗原認識ドメインと第2の抗原認識ドメインとの間に配置される、請求項33に記載の操作されたポリペプチド。

請求項36

請求項33に記載の操作されたポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。

請求項37

患者におけるCAR操作細胞の持続性を増加させる方法であって、1つまたは複数のエンハンサーをGD2またはGD3操作CARポリペプチド共発現する操作細胞を患者に投与することを含む方法。

請求項38

GD2またはGD3細胞表面抗原を有する標的細胞を溶解する方法であって、標的細胞を請求項26に記載の操作された細胞と接触させることを含む方法。

請求項39

標的細胞を請求項25に記載の操作された細胞と接触させることを含む、標的細胞を枯渇させる方法であって、ここで、前記の標的細胞は、以下の細胞表面抗原、GD2およびGD3、の1つまたはそれ以上を有する、方法。

請求項40

請求項25に記載の操作された細胞をそれを必要とする患者に投与することを含む、細胞増殖性疾患を治療する方法。

請求項41

細胞増殖性疾患が、中枢神経系(CNS)の髄芽腫原発性神経外胚葉性腫瘍悪性神経膠腫神経芽腫網膜芽腫上衣腫肉腫黒色腫乳がん卵巣がん膠芽腫ユーイング肉腫小細胞肺がんからなる群から選択される、請求項40に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願への相互参照
この出願は、2017年6月21日に提出された以前の米国仮出願第62 / 523,147号および2017年6月 21日に提出された米国継続出願第15 / 538,620号の利益を主張し、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景技術

0002

リンパ球一種であるT細胞は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。細胞表面にT細胞受容体(TCR)が存在することにより、B細胞ナチュラルキラー細胞NK細胞)などの他のリンパ球と区別される。CD4+TあるいはCD4T細胞と呼ばれるヘルパーT細胞にはCD4糖蛋白質が細胞表面上に発現している。ヘルパーT細胞は、MHC主要組織適合遺伝子複合体クラスII分子によって提示されるペプチド抗原にさらされると活性化される。一旦活性化されると、これらの細胞は急速に増殖し、免疫応答を調節するサイトカイン分泌する。CD8 + T細胞またはCD8 T細胞としても知られている細胞傷害性T細胞は、CD8糖蛋白質を細胞表面上に発現している。 CD8 + T細胞は、MHCクラスI分子によって提示されるペプチド抗原にさらされると活性化される。 T細胞のサブセットであるメモリーT細胞は、長期間生存し、過去における感染および/あるいは腫瘍細胞に対する“記憶”を免疫システムに提供することで、それらの同種抗原応答する。

0003

T細胞は、その表面上にキメラ抗原受容体(CARs)とよばれる特別な受容体を産生するように遺伝子操作することができる。CARsは、腫瘍細胞上の特異的タンパク質抗原)を認識することができるT細胞上のタンパク質である。これらの設計されたCAR T細胞は、実験室において数十億に達するまで増殖させる。その後、増殖させたCAR T細胞の集団患者注入される。

0004

今日までのキメラ抗原受容体(CAR)T細胞を用いた臨床試験では、標準化学療法耐性をもつ血液悪性腫瘍に対する治療方として非常に見込みがある。最も注目すべきことに、CD19-特異的CAR(CD19CAR)T細胞療法は、B細胞悪性腫瘍における長期間の寛解を含め、著しく良好な結果をしめした。(参照文献:Kochenderfer、Wilsonら、2010、Kalos、Levine et al。2011、Porter、Levine et al。 2011、Davila、Riviere et al。 2013、Grupp、Frey et al。 2013年、Grupp、Kalos al。 2013、Kalos、Nazimuddin et al。 2013、Kochenderfer、Dudley et al。 2013年、Kochenderfer、Dudley et al。 2013、Lee、Shah et al。 2013、Park、Riviere et al。 2013、Maude、Frey et al。 2014)。

先行技術

0005

WO 01/96584
WO 01/29058
米国特許第6,326,193号

発明が解決しようとする課題

0006

B細胞白血病およびリンパ腫におけるCAR療法の成功にもかかわらず、T細胞悪性腫瘍に対するCAR療法は、まだ十分には確立されていない。T細胞悪性腫瘍は、B細胞の悪性腫瘍と比較して予後不良である(Abramson、Feldman et al。2014)、この点においてCAR療法はさらに大きな臨床におけるニーズに対応する可能性を秘めている。

0007

今日まで、現行の取り組みは様々なB細胞悪性腫瘍に対するCAR T細胞の効果を実証することに集中している。CD19CARを用いたB-ALLでの治療は、初期寛解率は約90%であるが、これらのほとんどは1年以内に再発する。再発は、少なくとも部分的には抗原エスケープによるものである。したがって、再発を防止するためのより効果的なCAR T細胞療法が緊急に必要とされている。その点における効果的なCAR設計の保障あるいはガイド等の一般的な規則がない為、標的の発見と選択が最初のステップである。

0008

CAR治療でのより広範囲アプローチ取り入れるのを妨げるいくつかの障害がある。最も一般的な課題として、(1)抗原標的およびキメラ抗原受容体の選択。(2)CARのデザイン。 (3)腫瘍不均一性、特に腫瘍抗原表面発現のばらつき。単一抗原を標的とすることは免疫エスケープの危険性を有し、これは複数の所望の抗原を標的とすることによって克服することができる。 (4)免疫抑制微小環境。CAR T細胞は、腫瘍部位へ到達すると抑制され、非活性化される場合もある。

0009

ほとんどのCARキメラ抗原レセプターモノクローナル抗体由来するscFvであり、これらのモノクローナル抗体のいくつかは疾患の臨床試験または治療に使用されている。しかしながら、それら有効性は限られており、CARのような代替的かつより強力な標的に対するアプローチが必要であることを示唆されている。scFvは、CARで最も一般的に使用されるキメラ抗原受容体である。しかしながら、CAR親和性結合および抗原上の認識されたエピトープの位置は、その機能に影響し得る可能性が有る。さらに、T細胞またはNK細胞上の表面CAR発現のレベルは、適切なリーダー配列およびプロモーターの影響を受ける。さらに、過剰発現されたCARタンパク質は、細胞にとって有毒でもあり得る。

0010

したがって、T細胞関連悪性腫瘍へのより効果的で安全で効率的に働く、改善されたキメラ抗原レセプターに基づく治療の必要性が依然として存在する。

課題を解決するための手段

0011

一実施形態では、本開示は、シグナルペプチド抗原認識ドメインヒンジ領域、膜貫通ドメイ ン、シグナル伝達ドメイン、および共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む改変細胞を提供する。ここで、前記抗原認識ドメインは、FcER1A、FcER1、IgE、CD19、BCMA、またはCD45のうちの 1つを含む。

0012

別の実施形態では、本開示は、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む操作されたポリペプチドを提供する。前記抗原認識ドメインは、FcER1A、CD19、BCMA、またはCD45のうちの1つを含み、そして高効率の切断部位がキメラ抗原受容体ポリペプチドとエンハンサーの間に配置されているおよび少なくとも1つのエンハンサーである。

0013

別の実施形態において、本開示は、第1のシグナルペプチド、第1の抗原認識ドメイン、第1のヒンジ領域、第1の膜貫通ドメイン、 第1のシグナル伝達ドメイン、および第1の共刺激を含む第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドを、そして、第2のシグナルペプチド、第2の抗原認識ドメイン、第 2のヒンジ領域、第2の膜貫通ドメイン、第2のシグナル伝達ドメイン、および第2の共刺激ドメインを含む第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む 操作された細胞を提供する。ここにおいて第1の抗原認識ドメインと第2の抗原認識ドメインは異なり、そして、第1の抗原認識ド メインおよび第2の抗原拒絶ドメインは、CD4、CD19、CD33、CD123、 CLL-1、BAFFR、BCMA、およびCS-1からなるグループより選択される。

0014

別の実施形態 において、本開示は、第1のシグナルペプチド、第1の抗原認識ドメイン、第1のヒンジ領域、第1の膜貫通ドメイン、第1のシグナル伝達ドメイン、および第1の共刺激を含む第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドを含み、そして、第2のシグナルペプチド、第 2の抗原認識ドメイン、第2のヒンジ領域、第2の膜貫通ドメイン、第2のシグナル伝達ドメイ ン、および第2の共刺激ドメインを含む第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドむ含む操作されたポリペプチドを提供する。ここでにおいて第1の 抗原認識ドメインと第2の抗原認識ドメインは異なり、そして、第1の抗原認識ドメインおよび 第2の抗原拒絶ドメインは、CD4、CD19、CD33、CD123、 BAFFR、CLL-1、BCMA、およびCS-1からなるグループより選択される。

0015

別の実施形態では、本開示は、自己免疫疾患を治療する方法を提供し、前記の方法は、それを必要 とする患者に上記の操作された細胞を投与することを含む。前記自己免疫疾患は全身性狼瘡を含むエリテマトーデスSLE)、多発性硬化症(MS)、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチ、シェ ーグレン症候群、皮膚筋症、自己免疫性溶血性貧血視神経脊髄炎(NMO)、NMOスペクトラ ム障害(NMOSD)、特発性血小板減少性紫斑病ITP)、全身性自己免疫性小血管血管炎症候群または顕微鏡多発血管炎(MPA)に関連する抗好中球細胞質自己抗体(ANCA)、多発血管炎を伴う肉芽腫症(GPA、ウェゲナー肉芽腫症)、 または多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症(EGPA、チャーグ-ストラウス症候群)を含む。

0016

別の実施形態では、本開示は喘息を治療する方法を提供する。 この方法は、上記の操作された細胞を投与することを含む。

0017

別の実施形態では、本開示は、臓器拒絶を治療する方法を提供する。この方法は、上記の操作された細胞を投与することを含む。

0018

一実施形態において、本開示は、第1の抗原認識ドメイン、第1のシグナルペプチド、第1のヒンジ領域、第1の膜貫通ドメイン、第1の共刺激ドメイン、および第 1のシグナルドメインを含む第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドを有し、そして第2の抗原認識ドメイン、第2のシグナルペプチド、第2のヒンジ領域、第2の膜貫通ドメイン、第2の共刺激ドメイン、そして第2のシグナル伝達ドメインを含む第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドを有する操作された細胞を提供する。ここにおいて第1の抗原認識ドメインは第2の抗原認識ドメインとは異なる。

0019

別の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体およびエンハンサーを含む改変ポリペプチドを 提供する。

0020

別の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体ポリペプチドおよびエンハンサーを 含む改変ポリペプチドを提供する。

0021

別の実施形態では、本開示は、シグナルペプチド、CD45抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含むポリペプチド、操作されたキメラ抗原レセプターポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、前述のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

0022

別の実施形態では、本開示は、上記の操作されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有する操作された細胞を提供する。

0023

別の実施形態では、本開示は、標的細胞の数を減少させる方法を提供する、以下の方法等が含まれる、(i)少なくとも1つのキメラ抗原レセプターポリペプチドを有する操作された細胞の有効量と 標的細胞とを接触させること、操作された細胞は様々なキメラ抗原レセプターポリペプチドをもち、各キメラ抗原レセプターポリペプチドは独立していること、また(ii)場合により、前記の標的細胞の数の減少を測定することを含む。標的細胞はインターロイキン6受容体、ROR1、PSMA、PSCA、MAGE A3、糖脂質グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEAHER-2 / neu、IL13Rα2、Met、メソセリン、EGFR、EGFRvIII、MUC16、NKG2Dリガンドサイログロブリン、MAGE -3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3 、MUC4、MUC5、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、免疫グロブリンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD19、CD20、CD22、CD38、CD45、BCMA、CS1、BAFF受容体、TACI、CD3、CD4、CD8 、CD5、CD7、CD2、CD45、CD70、CD138からなるグループより選択される少なくとも1つの細胞表面抗原を含む。

0024

別の実施形態において、本開示は、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫ホジキンリンパ腫多発性骨髄腫急性骨髄性白血病慢性骨髄性白血病慢性骨髄増殖性新生物骨髄異形成症候群顆粒球肉腫組織球性肉腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)、慢性骨髄単球性白血病、および細胞増殖性疾患を治療する方法であって、前記された如何なる操作された細胞を必要とする患者に投与することを含む。

0025

いくつかの実施形態では、開示された発明は、例えば、CAMPATHを使用してCAR T細胞または治療用T細胞などのT細胞の増殖を制御する方法および組成物を含む。本方法はさらに、腫瘍枯渇後または緊急の場合、例えばCAR療法によって引き起こされる予期しない副作用など、CAMPATHを使用してCAR T細胞を除去するための組成物および方法に関連する。 さらなる実施形態では、CD52は、CD5CAR操作細胞または任意のCAR操作細胞に組み込まれ、CAR治療の「安全スイッチ」として使用することができる。

図面の簡単な説明

0026

cCARコンストラクト(以下、「multiple CARまたはcompound CAR」とする)の概略図。Multiple またはcompound CARは複数の抗原(例えば、cell type 1またはcell type 2または同じcell type)を標的にする。Multiple またはcCAR T細胞による免疫療法は、異なる、あるいは同じ抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、様々な共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、それぞれの構成要素の CARを含む。
cCAR-Tコンストラクトの概略図。コンストラクトはP2AペプチドによってリンクされたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。リンカーが切断されると、cCARは分かれ、それぞれCD33および/またはCD123を発現する標的に関与する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインには、CD33 CARセグメント上の4-IBBおよびCD 123 CAR上のCD28領域が含まれるが、これに限定されない。
形質導入されたCD33CD123 cCAR-T細胞の発現を示すウエスタンブロット。この図は、2つの異なるCARタンパク質、すなわち、CD33 CARおよびCD123 CARの発現を示す。リンカーの切断時にCD33およびCD123 CARの両方を発現するcCAR-T細胞は、2つの明瞭かつ一貫して強いタンパク質バンドを示す。緑色蛍光タンパク質(GFP)は陰性対照として利用。
形質導入の効率を表すフローサイトメトリー。上のパネルは、UCB(臍帯血)およびPB(末梢血)で使用する前に最大形導入効率を測定するために、293FTHEK(ヒト胚性腎臓)細胞で試験したCD33CD123cCAR(またはCD33CD123-2G-CARとも呼ぶ)のレンチウイルス力価を示す。 下のパネルは、CD33CD123cCARコンストラクトおよびコントロールとしてのGFP形質導入細胞を含むレンチウイルスベクターで形質導入されたCD33CD123cCAR(CD33CD123-2G-CARとも呼ばれる)T細胞を示す。黄色の丸で示されたパーセンテージは、形質導入効率プロキシである。
compound CAR(cCAR)を作製する方法を示す概略図。HEK-293-FT細胞にcompound CARプラスミドDNAおよびリポフェクタミン2000でトランスフェクトし、約36時間および約60時間でウイルス上清回収、ろ過し、-80℃で保存した。T細胞を抗マウスCD3抗体およびIL-2で少なくとも2日間活性化する。活性化T細胞は、レトロネクチンコーティングされたプレート上で解凍されたレンチウイルスを用い、少なくとも1回形質導入され、0.3×106 T細胞数/mL細胞密度で約2日間、少なくとも1回の一晩の形質導入の後、形質導入効率を高めるためにT細胞数を減少させた。形質導入後、細胞を洗浄し、増殖させ、3日目にCARの効率を確認するために、フロー分析(F(Ab’)2ラベリング)を行い、計5-7日細胞を増殖させる。cCAR T細胞をインビトロで標的細胞と共培養し、癌細胞へのcCAR T細胞による死滅効果をin vivo(マウス)で評価する。
前骨髄球性白血病細胞株HL60とCD33CD123-2G CAR-T細胞(cCAR)とのインキュベーションを示す共培養アッセイ。 cCAR-T細胞(下のパネル)の能力はGFP形質導入T細胞のコントロール(上パネル)を用いて比較する。殺傷効力は、約24時間のインキュベーション後に残っているCD33 +細胞の集団によって測定される(黄色の丸で囲まれている)。
約100%のCD33および約50-80%のCD123を発現する骨髄性白血病細胞株KG-1aとcCAR-T細胞のインキュベーションによる共培養アッセイ。 cCAR-T細胞(下のパネル)をコントロールGFP形質導入T細胞(上パネル)と比較する。殺傷効力は、約24時間のインキュベーション後に残されたCD33 +細胞の集団によって測定される。
CD33CD123 cCAR-T細胞を、5:1でAML-9と共培養する。共培養アッセイはcCAR-T細胞とAML患者サンプル(ここではAML-9と称する)とのインキュベーションを示している。患者細胞は、例えば、白血病細胞単球および他のタイプの芽細胞のような、細胞の混合集団である。 CD33およびCD34は白血病細胞の特異的マーカーとして、CAR-T作用の指標として作用する。 CAR-Tパネル(右)をコントロールGFP形質導入T細胞(中央)と比較する。殺傷効力は、少なくとも24時間のインキュベーション後に残ったCD33 + / CD34 +細胞の集団によって測定される。
CD33CD123 cCAR-T細胞を、5:1でSp-BM-B6と共培養する。共培養アッセイはcCAR-T細胞とB-ALL患者サンプル(ここではSp-BM-B6と呼ぶ)とのインキュベーションを示している。患者の細胞は、例えば、白血病細胞、単球および他のタイプの芽細胞のような、細胞の混合集団である 。 CD34は、白血病細胞の特異的マーカーとして作用する。 CAR-Tパネル(右)をコントロールGFP形質導入T細胞(中央)と比較する。殺傷効力は、少なくとも24時間のインキュベーション後に残ったCD34 +細胞の集団によって計測される。
NK-92細胞におけるCD33CD123 cCARの発現。 CD33CD123 cCARの発現は、ヤギ抗マウスF(ab)2 抗体を用い検出される。
CD33CD123 cCAR NK-92細胞とHL-60とのインキュベーションを示す 共培養アッセイ。 cCAR NK-92細胞を、GFPにより形質導入されたNK-92細胞と比較する。殺傷効力は、約24時間のインキュベーション後に残ったCD33 +細胞の集団によって測定される。
cCAR NK-92細胞とKG1aとのインキュベーションを示す共培養アッセイ。 cCARNK細胞パネルを、GFPにより形質導入されたNK-92細胞と比較する。殺傷効力は、約24時間のインキュベーション後に残ったCD33 +細胞の集団によって計測される。
CD33CD123cCAR(CAR-CD33 / 123)NK-92細胞によるHL-60またはKG1aに対する用量依存的反応。殺傷効力は、約24時間のインキュベーション後に残ったCD33 +細胞の集団によって測定される。
CD33CD123 cCAR NK-92細胞によるKG11細胞の2つの集団における殺傷能力へのコントロールとの比較。アッセイは、CAR-CD33 / 123(CD33CD123cCAR NK-92細胞)と標的細胞kG1aとの間での異なる細胞比率で実施した。殺傷効力は、約24時間のインキュベーション後に残ったCD33 + CD123 +あるいはCD33 + CD123-細胞の集団によって測定される。
P2AおよびT2Aにより連結するこの図式は、単一のコンストラクトにcCAR-Tおよび4-1BBLの両方を含むことを示す。コンストラクトは2つのモジュラーユニットのCARs Aペプチドおよびエンハンサーである、4-1BBLの発現を駆動させるSFFVプロモーターからなる。リンカーの切断により、cCARおよび4-1BBLが開裂し、CD33および/またはCD123および4-1BBLを発現する標的に関与する。Compound CAR、CD33CD123 CAR T細胞は、CD28のみならず4-1BBリガンド(4-1BBLまたはCD137L)を介した共刺激を受ける。CD3-zetaシグナル伝達ドメインは、このCAR-Tのアセンブリを完成させる。
T細胞におけるCD33CD123-41BBL-2Gコンストラクトの発現。健康なドナーからの末梢血由来のT細胞に、CD33CD123-4-1BBL-2Gコンストラクトを、6ウェルプレートに2mlのウイルス上清液と共にインキュベートして形質導入した。CARの発現は、CARタンパク質の表面発現をF(ab)’標識を用いてアッセイされ、続いてFACS解析を受けた。形質導入された細胞は、対照T細胞と同時に標識することで比較した。形質導入期間の終了後、1日目に発現が定量され、形質導入された集団を囲んで示した。
P2AおよびT2Aにより連結するこの図式は、単一のコンストラクトにcCAR-TおよびIL-15/IL-15sushiの両方を含むことを示す。コンストラクトは2つのモジュラーユニットのCARsおよびエンハンサーである、IL-15/IL-15sushiの発現を駆動させるSFFVプロモーターからなる。リンカーの切断により、cCARおよびIL-15/IL-15sushiが開裂し、CD33および/またはCD123発現するターゲットに関与する。CD3-zetaシグナル伝達ドメインは、このCAR-Tのアセンブリを完成させる。エンハンサーには、cCAR上のIL-15 / IL-15sushiが含まれるが、これに限定されない。
cCARの略図。コンストクトは、リンカーによって連結されたCARの複数のモジュール単位の発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。リンカーの切断時に、cCARは開裂し、様々な標的抗原、CD19および/またはCD20、および/またはCD22および/またはCD138の組合せを発現する標的に関与する。Multiple cCARsは、同じまたは異なる共刺激ドメイン、 4-1BB(4-BBとも表記)および/またはCD28を制限することなく、利用する。
活性化されたT細胞は、CD19CD20-2G、CD19CD22-2G CAR T細胞を作製するために形質導入された(すべてL8である)。(16A) compound CARs.のデザイン。(16B) ウエスタンブロット。 HEK-293T細胞に、コントロールベクターレーン1)、CD19CD20-2G(レーン2)、およびCD19CD22-2G(レーン3)のレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、上清を除去し、細胞も回収した。細胞をウエスタンブロットのために溶解し、マウス抗ヒトCD3z一次抗体およびヤギ抗マウスHRP二次抗体プローブした。(16C) PMBCバフィコートT細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。コントロールベクター(左)、CD19CD20-2G(中)、またはCD19CD22-2G(右)のレンチウイルス上清のいずれかで細胞に形質導入した。 3日間のインキュベーション後 細胞を回収し、ビオチンと結合したヤギ抗マウスFab2またはヤギIgG抗体と共に30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、懸濁させ、ストレプトアビジン-PEおよびマウス抗ヒトCD3-PerCpで30分間染色した。細胞を洗浄し、2%ホルマリンに懸濁し、フローサイトメトリーで分析してCARの効率を測定した。(N=2)。
異なるリーダー配列を用いたcompound CD19CD22CAR T細胞の発現。PMBCバフィコートT細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。コントロールベクター(左)、L8-CD19CD22-2GCAR(中央左)、L45-CD19CD22-2GCAR(中央右)またはCSF-CD19CD22-2GCAR(右)レンチウイルス上清のいずれかで細胞に形質導入した。上清はそれぞれ3倍濃縮した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、ビオチンと結合したヤギ抗マウスFab2またはヤギIgG抗体と共に30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、懸濁させ、ストレプトアビジン-PEおよびマウス抗ヒトCD3-PerCpで30分間染色した。細胞を洗浄し、2%ホルマリンに懸濁し、フローサイトメトリーで分析してCARの効率を測定した。(N=2)。
濃縮と非濃縮されたL8-CD19CD22-2GまたはL8-CD19CD20-2Gレンチウイルス上清を用いた形質導入効率の比較。 A. PMBCバフィコートT細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。コントロールベクター(左)、非濃縮(中央)L8-CD19CD22-2GCARまたは3倍濃縮L8-CD19CD22-2GCAR(右)レンチウイルス上清のいずれかで細胞に形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、ビオチンと結合したヤギ抗マウスFab2またはヤギIgG抗体と共に30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、懸濁させ、ストレプトアビジン-PEおよびマウス抗ヒトCD3-PerCpで30分間染色した。細胞を洗浄し、2%ホルマリンに懸濁し、フローサイトメトリーで分析してCARの効率を測定した。(N=2)。B. 同じ実験を、L8-CD19CD20-2Gコンストラクトの非濃縮または2.5倍濃縮レンチウイルスベクターで行われた。
L8-CD19CD22-2G CAR T細胞は、一晩の共培養においてSP53腫瘍細胞を溶解する。コントロール(上段)、L8-CD19CD22-2G(下段)のレンチウイルス上清のいずれかを形質導入した活性化PMBC T細胞を、1:1(左)2:1(中)および5: 1(右)、エフェクター:標的細胞の割合でインキュベーションした。 37℃で24時間インキュベートした後、サンプルを洗浄し、抗ヒトCD3-PerCpおよび抗ヒトCD19-APCで染色し、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。右上にSP53細胞のみを示し、各比率での溶解率の要約は右下にある。(N=2)。
L8-CD19CD22-2G CAR T細胞は、一晩の共培養においてJeKo-1腫瘍細胞を溶解する。対照(左)または3倍濃縮したL8-CD19CD22-2Gレンチウイルス上清(中)のいずれかで形質導入された活性化PMBC T細胞をJeCo-1細胞と2:1(上)および5:1(下) 、エフェクター:標的細胞の割合でインキュベートした。 37℃で24時間インキュベートした後、サンプルを洗浄し、抗ヒトCD3-PerCpおよび抗ヒトCD19-APCで染色し、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。 JeKo-1細胞単独および細胞溶解の要約が右側に示されている。(N=2)。
L8-CD19CD22-2G CAR T細胞は、一晩の共培養でAML患者細胞を溶解する。対照(左)または3倍濃縮したL8-CD19CD22-2Gレンチウイルス上清(中)のいずれかで形質導入した活性化PMBC T細胞を、AML(PT1)と診断された患者のCMTMRでの染色細胞と2:1 (上)および5:1(下)、エフェクター:標的細胞の比でインキュベートした。 37℃で24時間インキュベートした後、サンプルを洗浄し、抗ヒトCD3-PerCpおよび抗ヒトCD19-APCで染色し、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。患者細胞単独および細胞溶解の要約が右側に示されている。(N=2)。
L8-CD19CD22-2G CAR T細胞は、CD19 + B-ALL患者細胞を減少させる。対照(左)またはL8-CD19CD22-2G(中央)レンチウイルス上清のいずれかで形質導入した活性化PMBC T細胞を、1:1の比でCMTMR染色したB-ALL(PT2)を有する患者からの細胞と共に4日間、2.5%FBSおよびIL-2の存在下でインキュベートした。この37℃でのインキュベーション後、サンプルを洗浄し、抗ヒトCD3-PerCpおよび抗ヒトCD19-APCで染色し、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。単独で4日間培養した染色済みの患者の細胞を右側に示す。
L-8-CD19CD22-2G cCAR T細胞は、CD22 + K562細胞に対する効果を示す。野生型K562細胞への形質導入を介して、CD22発現する人為的K562細胞株(K562xp22)を作製した。続いて、K562細胞のマイナーなCD22 +集団を標的とする、CD19CD22cCARの抗腫瘍作用を試験した。 1:1の比(有効:標的)での共培養実験は、コントロールと比較して、CD22を発現するK562集団に対して中程度の有意な細胞毒性効果を示す。共培養物をCD3、CD19およびCD22で染色して、フローサイトメトリーによってエフェクターおよび標的集団を分離した。結果はグラフ化された。細胞傷害性の結果は、人工抗原提示細胞株に対する抗腫瘍活性に関して報告された他の数値と一致している。
BC1cCARレンチウィルスの様々な形質導入スキーム。(A) 方法1は毎回24時間の2回の形質導入からなり、ベースラインとなる形質導入スキームである。スキームは、図に従って進行する。(B) 方法2は、方法1と同じ方法論を有するが、2回目の形質導入は、継続的なインキュベーションによって置き換えられる。(C)改訂された方法2は、細胞とウイルス上清を48時間直接インキュベートする。
CARコンストラクト図および形質導入方法論の比較。(24A )BC1cCARのモジュラーデザインは、抗CD269(BCMA)一本鎖可変断片(scFv)領域抗および自己切断型P2Aペプチドに融合されたCD319(CS1)scFv、CD8由来ヒンジ(H)および膜貫通(TM)領域、およびCD3ζシグナル伝達ドメインに連結されたタンデムCD28および4-1BB共活性化ドメインから成る。 T細胞表面上のCD3CAR分子の効率的な発現のために、強力な脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター(SFFV)およびCD8リーダー配列を使用した。(24B) BC1cCARの発現は、アイソタイプコントロールに対するフローサイトメトリーにより測定した。囲まれた集団は、形質導入されたCAR細胞を指す。
CARコンストラクト図および形質導入方法論の比較。(24A )BC1cCARのモジュラーデザインは、抗CD269(BCMA)一本鎖可変断片(scFv)領域抗および自己切断型P2Aペプチドに融合されたCD319(CS1)scFv、CD8由来ヒンジ(H)および膜貫通(TM)領域、およびCD3ζシグナル伝達ドメインに連結されたタンデムCD28および4-1BB共活性化ドメインから成る。 T細胞表面上のCD3CAR分子の効率的な発現のために、強力な脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター(SFFV)およびCD8リーダー配列を使用した。(24B) BC1cCARの発現は、アイソタイプコントロールに対するフローサイトメトリーにより測定した。囲まれた集団は、形質導入されたCAR細胞を指す。
CARコンストラクト図および形質導入方法論の比較。(24A )BC1cCARのモジュラーデザインは、抗CD269(BCMA)一本鎖可変断片(scFv)領域抗および自己切断型P2Aペプチドに融合されたCD319(CS1)scFv、CD8由来ヒンジ(H)および膜貫通(TM)領域、およびCD3ζシグナル伝達ドメインに連結されたタンデムCD28および4-1BB共活性化ドメインから成る。 T細胞表面上のCD3CAR分子の効率的な発現のために、強力な脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター(SFFV)およびCD8リーダー配列を使用した。(24B) BC1cCARの発現は、アイソタイプコントロールに対するフローサイトメトリーにより測定した。囲まれた集団は、形質導入されたCAR細胞を指す。
HEK-293FT細胞におけるBC1cCARおよびBCMA-CS1-2Gのタンパク質発現。HEK-293FT細胞にGFP(レーン1)、BC1cCAR(レーン2)のレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトし、48時間後に上清を除去し、細胞も除去した。細胞をウエスタンブロットの為に溶解し、マウス抗ヒトCD3z抗体でプローブした。最適な方法により形質導入効率が改善される。
骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T細胞のインビトロの評価。(25A) BC1cCARおよびコントロールT細胞を、BCMA高陽性MM1SおよびRPMI-8226細胞と共に、2:1および5:1のE:T比で24時間培養した。標的MM1SおよびRPMI-8226細胞を、Cytotracker色素(CMTMR)によって染色して、これをエフェクターT細胞と区別した。集団はCMTMR-PEとともに抗BCMA(CD269)および抗CS1(CD319抗体)によってゲートした。標的U266細胞をCytotracker(CMTMR)色素で標識して、これをエフェクターT細胞と区別した。(25B) U266標的の減少。 BC1cCARおよびコントロールT細胞を、BCMAおよびCS1のサブセットを発現するU266細胞と共にインキュベートした。標的腫瘍細胞を上記で述べたように染色し、同様のゲーティング条件を適用した。腫瘍集団は囲った。 (25C)ヒト骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T活性のインビトロ条件下の要約。 2:1および5:1のE:T比での種々の骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T細胞でのin vitroにおける細胞毒性グラフによる要約。
骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T細胞のインビトロの評価。(25A) BC1cCARおよびコントロールT細胞を、BCMA高陽性MM1SおよびRPMI-8226細胞と共に、2:1および5:1のE:T比で24時間培養した。標的MM1SおよびRPMI-8226細胞を、Cytotracker 色素(CMTMR)によって染色して、これをエフェクターT細胞と区別した。集団はCMTMR-PEとともに抗BCMA(CD269)および抗CS1(CD319抗体)によってゲートした。標的U266細胞をCytotracker(CMTMR)色素で標識して、これをエフェクターT細胞と区別した。(25B) U266標的の減少。 BC1cCARおよびコントロールT細胞を、BCMAおよびCS1のサブセットを発現するU266細胞と共にインキュベートした。標的腫瘍細胞を上記で述べたように染色し、同様のゲーティング条件を適用した。腫瘍集団は囲った。 (25C) ヒト骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T活性のインビトロ条件下の要約。 2:1および5:1のE:T比での種々の骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T細胞でのin vitroにおける細胞毒性のグラフによる要約。
骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T細胞のインビトロの評価。(25A) BC1cCARおよびコントロールT細胞を、BCMA高陽性MM1SおよびRPMI-8226細胞と共に、2:1および5:1のE:T比で24時間培養した。標的MM1SおよびRPMI-8226細胞を、Cytotracker 色素(CMTMR)によって染色して、これをエフェクターT細胞と区別した。集団はCMTMR-PEとともに抗BCMA(CD269)および抗CS1(CD319抗体)によってゲートした。標的U266細胞をCytotracker(CMTMR)色素で標識して、これをエフェクターT細胞と区別した。(25B) U266標的の減少。 BC1cCARおよびコントロールT細胞を、BCMAおよびCS1のサブセットを発現するU266細胞と共にインキュベートした。標的腫瘍細胞を上記で述べたように染色し、同様のゲーティング条件を適用した。腫瘍集団は囲った。 (25C) ヒト骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T活性のインビトロ条件下の要約。 2:1および5:1のE:T比での種々の骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T細胞でのin vitroにおける細胞毒性のグラフによる要約。
原発性骨髄腫腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞の抗腫瘍活性の特性。(26A) MM7-G原発性二重表現型腫瘍に対する用量依存的効果。 BC1cCARおよびコントロールT細胞を用いてBCMA + CS1 +原発性骨髄腫細胞MM7-Gに対して24時間培養した。標的細胞をCMTMRで事前に染色し、培養を2:1、5:1および10:1のE:T比で行った。集団は、CMTMRとともにBCMAおよびCS1によってゲートされ、丸で囲まれた集団を示すフローサイトメトリープロットは、標的腫瘍集団を表す(左)。分かりやすくするために、インビトロでの細胞傷害性を要約した棒グラフが用いられている(右)。(26B) MM10-Gにおける母集団での特異的減少。 MM10-G原発性腫瘍細胞との共培養を同様の条件で行った。抗CS1および抗BCMA抗体で染色した場合、MM10-Gは異なる個体群を明らかにする。 BCMA + CS1 +二重陽性集団は紫色に着色され、CS1 +集団のみが濃紺色に着色される。 BC1cCAR T細胞の各集団に対する細胞傷害性を下の棒グラフにまとめられている。(26C) CS1dim BCMAnegに対する用量依存的効果。MM11-G原発腫瘍。BCMAdimCS1dim原発細胞(MM11-G)を使用する第3の実験は、BC1cCAR細胞における傷害作用をE:T投薬量の範囲にわたって要約したものを示す。(26D) 様々なBCMAおよびCS1の混成を有する骨髄腫細胞株および原発性腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞細胞での細胞毒性を示すパネルグラフの概要
原発性骨髄腫腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞の抗腫瘍活性の特性。(26A) MM7-G原発性二重表現型腫瘍に対する用量依存的効果。 BC1cCARおよびコントロールT細胞を用いてBCMA + CS1 +原発性骨髄腫細胞MM7-Gに対して24時間培養した。標的細胞をCMTMRで事前に染色し、培養を2:1、5:1および10:1のE:T比で行った。集団は、CMTMRとともにBCMAおよびCS1によってゲートされ、丸で囲まれた集団を示すフローサイトメトリープロットは、標的腫瘍集団を表す(左)。分かりやすくするために、インビトロでの細胞傷害性を要約した棒グラフが用いられている(右)。(26B) MM10-Gにおける母集団での特異的減少。 MM10-G原発性腫瘍細胞との共培養を同様の条件で行った。抗CS1および抗BCMA抗体で染色した場合、MM10-Gは異なる個体群を明らかにする。 BCMA + CS1 +二重陽性集団は紫色に着色され、CS1 +集団のみが濃紺色に着色される。 BC1cCAR T細胞の各集団に対する細胞傷害性を下の棒グラフにまとめられている。(26C) CS1dim BCMAnegに対する用量依存的効果。MM11-G原発腫瘍 。BCMAdimCS1dim原発細胞(MM11-G)を使用する第3の実験は、BC1cCAR細胞における傷害作用をE:T投薬量の範囲にわたって要約したものを示す。(26D) 様々なBCMAおよびCS1の混成を有する骨髄腫細胞株および原発性腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞細胞での細胞毒性を示すパネルグラフの概要。
原発性骨髄腫腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞の抗腫瘍活性の特性。(26A) MM7-G原発性二重表現型腫瘍に対する用量依存的効果。 BC1cCARおよびコントロールT細胞を用いてBCMA + CS1 +原発性骨髄腫細胞MM7-Gに対して24時間培養した。標的細胞をCMTMRで事前に染色し、培養を2:1、5:1および10:1のE:T比で行った。集団は、CMTMRとともにBCMAおよびCS1によってゲートされ、丸で囲まれた集団を示すフローサイトメトリープロットは、標的腫瘍集団を表す(左)。分かりやすくするために、インビトロでの細胞傷害性を要約した棒グラフが用いられている(右)。(26B) MM10-Gにおける母集団での特異的減少。 MM10-G原発性腫瘍細胞との共培養を同様の条件で行った。抗CS1および抗BCMA抗体で染色した場合、MM10-Gは異なる個体群を明らかにする。 BCMA + CS1 +二重陽性集団は紫色に着色され、CS1 +集団のみが濃紺色に着色される。 BC1cCAR T細胞の各集団に対する細胞傷害性を下の棒グラフにまとめられている。(26C) CS1dim BCMAnegに対する用量依存的効果。MM11-G原発腫瘍 。BCMAdimCS1dim原発細胞(MM11-G)を使用する第3の実験は、BC1cCAR細胞における傷害作用をE:T投薬量の範囲にわたって要約したものを示す。(26D) 様々なBCMAおよびCS1の混成を有する骨髄腫細胞株および原発性腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞細胞での細胞毒性を示すパネルグラフの概要。
原発性骨髄腫腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞の抗腫瘍活性の特性。(26A) MM7-G原発性二重表現型腫瘍に対する用量依存的効果。 BC1cCARおよびコントロールT細胞を用いてBCMA + CS1 +原発性骨髄腫細胞MM7-Gに対して24時間培養した。標的細胞をCMTMRで事前に染色し、培養を2:1、5:1および10:1のE:T比で行った。集団は、CMTMRとともにBCMAおよびCS1によってゲートされ、丸で囲まれた集団を示すフローサイトメトリープロットは、標的腫瘍集団を表す(左)。分かりやすくするために、インビトロでの細胞傷害性を要約した棒グラフが用いられている(右)。(26B) MM10-Gにおける母集団での特異的減少。 MM10-G原発性腫瘍細胞との共培養を同様の条件で行った。抗CS1および抗BCMA抗体で染色した場合、MM10-Gは異なる個体群を明らかにする。 BCMA + CS1 +二重陽性集団は紫色に着色され、CS1 +集団のみが濃紺色に着色される。 BC1cCAR T細胞の各集団に対する細胞傷害性を下の棒グラフにまとめられている。(26C) CS1dim BCMAnegに対する用量依存的効果。MM11-G原発腫瘍 。BCMAdimCS1dim原発細胞(MM11-G)を使用する第3の実験は、BC1cCAR細胞における傷害作用をE:T投薬量の範囲にわたって要約したものを示す。(26D) 様々なBCMAおよびCS1の混成を有する骨髄腫細胞株および原発性腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞細胞での細胞毒性を示すパネルグラフの概要。
BC1cCAR抗原特異性の機能的検証。 (27A) 我々は、BCMAまたはCS1のいずれかをそれぞれ独立して発現させるために、CML細胞株K562を操作した。野生型K562は陰性ピークとして示す、一方、BCMA を発現するK562(BCMAxpK562)およびCS1を発現するK562(CS1xpK562)はそれぞれの抗原発現の割合に応じて集団シフトを示す。(27B) BC1cCAR T細胞において、BCMAxpK562またはCS1xpK562のいずれかに対する短期(4時間〜12時間)培養は、E:T用量の増加と相関する抗原特異的細胞傷害性を示す。野生型K562に対する実験は、ネガティブコントロールとして行った。 CS1xpK562細胞に対するBC1cCARとの効力を比較するために、CS1特異的のシングルCARを作製し、それぞれのプロットにおいて赤色バー描写した。抗CS1への特異的活性は、培養24時間後のCS1dim NK-92細胞に対しても見られた。 (27C) 混成細胞アッセイにおける単一抗原CARとBC1cCAR Tとの比較。長期培養は、BCMAxpK562細胞とCS1xpK562細胞との5:1割合での混合で48時間にわたって実施した。 BC1cCAR、CS1-CAR、BCMA-CAR、およびコントロールT細胞を各ウェルに5:1、E:T比で加えられ、フローサイトメトリー分析により解析された。 BCMAまたはCS1細胞の残留集団を示すヒストグラムプロットは、実験条件ごとに示され、赤色の線はT細胞または標的腫瘍集団の境界画定する。ヒストグラムプロットにおける数値は、標的腫瘍細胞の残存集団の割合を表す。(27D) BC1cCAR Tの、原発性骨髄吸引液中のCS1サブセットに対する活性。さらなる共培養実験を、CS1発現少数サブセットとして骨髄吸引サンプルを用いて行った。 BC1cCARまたはコントロールT細胞を2:1(左パネル)、5:1(中央パネル)、または10:1(右パネル)比で添加し、丸で囲んだ集団はCS1を発現する集団を表す。結果はフローサイトメトリー(上部)で解析される。骨髄サブセットに対する抗CS1活性の要約グラフ(下記)。
BC1cCAR抗原特異性の機能的検証。 (27A) 我々は、BCMAまたはCS1のいずれかをそれぞれ独立して発現させるために、CML細胞株K562を操作した。野生型K562は陰性ピークとして示す、一方、BCMA を発現するK562(BCMAxpK562)およびCS1を発現するK562(CS1xpK562)はそれぞれの抗原発現の割合に応じて集団シフトを示す。(27B) BC1cCAR T細胞において、BCMAxpK562またはCS1xpK562のいずれかに対する短期(4時間〜12時間)培養は、E:T用量の増加と相関する抗原特異的細胞傷害性を示す。野生型K562に対する実験は、ネガティブコントロールとして行った。 CS1xpK562細胞に対するBC1cCARとの効力を比較するために、CS1特異的のシングルCARを作製し、それぞれのプロットにおいて赤色バーで描写した。抗CS1への特異的活性は、培養24時間後のCS1dim NK-92細胞に対しても見られた。 (27C) 混成細胞アッセイにおける単一抗原CARとBC1cCAR Tとの比較。長期培養は、BCMAxpK562細胞とCS1xpK562細胞との5:1割合での混合で48時間にわたって実施した。 BC1cCAR、CS1-CAR、BCMA-CAR、およびコントロールT細胞を各ウェルに5:1、E:T比で加えられ、フローサイトメトリー分析により解析された。 BCMAまたはCS1細胞の残留集団を示すヒストグラムプロットは、実験条件ごとに示され、赤色の線はT細胞または標的腫瘍集団の境界を画定する。ヒストグラムプロットにおける数値は、標的腫瘍細胞の残存集団の割合を表す。(27D) BC1cCAR Tの、原発性骨髄吸引液中のCS1サブセットに対する活性。さらなる共培養実験を、CS1発現少数サブセットとして骨髄吸引サンプルを用いて行った。 BC1cCARまたはコントロールT細胞を2:1(左パネル)、5:1(中央パネル)、または10:1(右パネル)比で添加し、丸で囲んだ集団はCS1を発現する集団を表す。結果はフローサイトメトリー(上部)で解析される。骨髄サブセットに対する抗CS1活性の要約グラフ(下記)。
BC1cCAR抗原特異性の機能的検証。 (27A) 我々は、BCMAまたはCS1のいずれかをそれぞれ独立して発現させるために、CML細胞株K562を操作した。野生型K562は陰性ピークとして示す、一方、BCMA を発現するK562(BCMAxpK562)およびCS1を発現するK562(CS1xpK562)はそれぞれの抗原発現の割合に応じて集団シフトを示す。(27B) BC1cCAR T細胞において、BCMAxpK562またはCS1xpK562のいずれかに対する短期(4時間〜12時間)培養は、E:T用量の増加と相関する抗原特異的細胞傷害性を示す。野生型K562に対する実験は、ネガティブコントロールとして行った。 CS1xpK562細胞に対するBC1cCARとの効力を比較するために、CS1特異的のシングルCARを作製し、それぞれのプロットにおいて赤色バーで描写した。抗CS1への特異的活性は、培養24時間後のCS1dim NK-92細胞に対しても見られた。 (27C) 混成細胞アッセイにおける単一抗原CARとBC1cCAR Tとの比較。長期培養は、BCMAxpK562細胞とCS1xpK562細胞との5:1割合での混合で48時間にわたって実施した。 BC1cCAR、CS1-CAR、BCMA-CAR、およびコントロールT細胞を各ウェルに5:1、E:T比で加えられ、フローサイトメトリー分析により解析された。 BCMAまたはCS1細胞の残留集団を示すヒストグラムプロットは、実験条件ごとに示され、赤色の線はT細胞または標的腫瘍集団の境界を画定する。ヒストグラムプロットにおける数値は、標的腫瘍細胞の残存集団の割合を表す。(27D) BC1cCAR Tの、原発性骨髄吸引液中のCS1サブセットに対する活性。さらなる共培養実験を、CS1発現少数サブセットとして骨髄吸引サンプルを用いて行った。 BC1cCARまたはコントロールT細胞を2:1(左パネル)、5:1(中央パネル)、または10:1(右パネル)比で添加し、丸で囲んだ集団はCS1を発現する集団を表す。結果はフローサイトメトリー(上部)で解析される。骨髄サブセットに対する抗CS1活性の要約グラフ(下記)。
BC1cCAR抗原特異性の機能的検証。 (27A) 我々は、BCMAまたはCS1のいずれかをそれぞれ独立して発現させるために、CML細胞株K562を操作した。野生型K562は陰性ピークとして示す、一方、BCMA を発現するK562(BCMAxpK562)およびCS1を発現するK562(CS1xpK562)はそれぞれの抗原発現の割合に応じて集団シフトを示す。(27B) BC1cCAR T細胞において、BCMAxpK562またはCS1xpK562のいずれかに対する短期(4時間〜12時間)培養は、E:T用量の増加と相関する抗原特異的細胞傷害性を示す。野生型K562に対する実験は、ネガティブコントロールとして行った。 CS1xpK562細胞に対するBC1cCARとの効力を比較するために、CS1特異的のシングルCARを作製し、それぞれのプロットにおいて赤色バーで描写した。抗CS1への特異的活性は、培養24時間後のCS1dim NK-92細胞に対しても見られた。 (27C) 混成細胞アッセイにおける単一抗原CARとBC1cCAR Tとの比較。長期培養は、BCMAxpK562細胞とCS1xpK562細胞との5:1割合での混合で48時間にわたって実施した。 BC1cCAR、CS1-CAR、BCMA-CAR、およびコントロールT細胞を各ウェルに5:1、E:T比で加えられ、フローサイトメトリー分析により解析された。 BCMAまたはCS1細胞の残留集団を示すヒストグラムプロットは、実験条件ごとに示され、赤色の線はT細胞または標的腫瘍集団の境界を画定する。ヒストグラムプロットにおける数値は、標的腫瘍細胞の残存集団の割合を表す。(27D) BC1cCAR Tの、原発性骨髄吸引液中のCS1サブセットに対する活性。さらなる共培養実験を、CS1発現少数サブセットとして骨髄吸引サンプルを用いて行った。 BC1cCARまたはコントロールT細胞を2:1(左パネル)、5:1(中央パネル)、または10:1(右パネル)比で添加し、丸で囲んだ集団はCS1を発現する集団を表す。結果はフローサイトメトリー(上部)で解析される。骨髄サブセットに対する抗CS1活性の要約グラフ(下記)。
長期間での連続的殺傷アッセイおよび腫瘍の再負荷。(28A) 長期間連続殺傷アッセイの構築のためのスキーム。最初の培養をCAR細胞またはコントロール細胞をMM1S腫瘍細胞と1:1、E:T比でセットアップし、外来性のサイトカインなしで168時間にわたってアッセイを行った。 48時間後、少量の収集したサンプルについてフローサイトメトリー分析を行い、MM1S細胞を各処理ウェルに再び加えた。 これを168時間の時点まで繰り返す。(28B) 48時間後のT細胞増殖および応答。フローサイトメトリー解析の日に画像撮影し、細胞を抗BCMA、抗CS1、および抗CD3抗体で染色した。MM1S細胞は、多数のCS1 + 割合で高度にBCMA + として発現している。青色に着色した円で囲まれた集団は、MM1S腫瘍の存在を表す。(28C) 108時間後のCAR細胞増殖および抗原の減少。同様の画像撮影およびフローサイトメトリー分析を108時間の時点で行った。
長期間での連続的殺傷アッセイおよび腫瘍の再負荷。(28A) 長期間連続殺傷アッセイの構築のためのスキーム。最初の培養をCAR細胞またはコントロール細胞をMM1S腫瘍細胞と1:1、E:T比でセットアップし、外来性のサイトカインなしで168時間にわたってアッセイを行った。 48時間後、少量の収集したサンプルについてフローサイトメトリー分析を行い、MM1S細胞を各処理ウェルに再び加えた。 これを168時間の時点まで繰り返す。(28B) 48時間後のT細胞増殖および応答。フローサイトメトリー解析の日に画像撮影し、細胞を抗BCMA、抗CS1、および抗CD3抗体で染色した。MM1S細胞は、多数のCS1 + 割合で高度にBCMA + として発現している。青色に着色した円で囲まれた集団は、MM1S腫瘍の存在を表す。(28C) 108時間後のCAR細胞増殖および抗原の減少。同様の画像撮影およびフローサイトメトリー分析を108時間の時点で行った。
長期間での連続的殺傷アッセイおよび腫瘍の再負荷。(28A) 長期間連続殺傷アッセイの構築のためのスキーム。最初の培養をCAR細胞またはコントロール細胞をMM1S腫瘍細胞と1:1、E:T比でセットアップし、外来性のサイトカインなしで168時間にわたってアッセイを行った。 48時間後、少量の収集したサンプルについてフローサイトメトリー分析を行い、MM1S細胞を各処理ウェルに再び加えた。 これを168時間の時点まで繰り返す。(28B) 48時間後のT細胞増殖および応答。フローサイトメトリー解析の日に画像撮影し、細胞を抗BCMA、抗CS1、および抗CD3抗体で染色した。MM1S細胞は、多数のCS1 + 割合で高度にBCMA + として発現している。青色に着色した円で囲まれた集団は、MM1S腫瘍の存在を表す。(28C) 108時間後のCAR細胞増殖および抗原の減少。同様の画像撮影およびフローサイトメトリー分析を108時間の時点で行った。
BC1cCAR T細胞はインビボで抗白血病効果を示す。 (29A) MM1S Luc +を注入したマウスモデルのIVISイメージング。 NSGマウスに、致死量以下照射を行い、ルシフェラーゼ発現MM1S多発性骨髄腫細胞静脈注射して、測定可能腫瘍形成誘導した。 3日後、マウスに5x106 個のBC1cCAR T細胞またはコントロールGFP T細胞を静脈注射した。 3、6、8および11日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングで解析した。(29B) BC1cCAR T細胞はMM1S腫瘍増殖を制御する。 BC1cCAR T細胞を注入したマウスで測定した平均光強度を、GFPコントロールT細胞注入マウスの平均光強度と比較した。(29C) BC1cCAR T細胞は、マウス生存率を改善する。マウスの生存率を測定し、2つのグループ間で比較し、log-rank mantel-cox検定の実施により、生存率が有意に改善された。
BC1cCAR T細胞はインビボで抗白血病効果を示す。 (29A) MM1S Luc +を注入したマウスモデルのIVISイメージング。 NSGマウスに、致死量以下の照射を行い、ルシフェラーゼ発現MM1S多発性骨髄腫細胞を静脈注射して、測定可能な腫瘍形成を誘導した。 3日後、マウスに5x106 個のBC1cCAR T細胞またはコントロールGFP T細胞を静脈注射した。 3、6、8および11日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングで解析した。(29B) BC1cCAR T細胞はMM1S腫瘍増殖を制御する。 BC1cCAR T細胞を注入したマウスで測定した平均光強度を、GFPコントロールT細胞注入マウスの平均光強度と比較した。(29C) BC1cCAR T細胞は、マウス生存率を改善する。マウスの生存率を測定し、2つのグループ間で比較し、log-rank mantel-cox検定の実施により、生存率が有意に改善された。
BC1cCAR T細胞はインビボで抗白血病効果を示す。 (29A) MM1S Luc +を注入したマウスモデルのIVISイメージング。 NSGマウスに、致死量以下の照射を行い、ルシフェラーゼ発現MM1S多発性骨髄腫細胞を静脈注射して、測定可能な腫瘍形成を誘導した。 3日後、マウスに5x106 個のBC1cCAR T細胞またはコントロールGFP T細胞を静脈注射した。 3、6、8および11日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングで解析した。(29B) BC1cCAR T細胞はMM1S腫瘍増殖を制御する。 BC1cCAR T細胞を注入したマウスで測定した平均光強度を、GFPコントロールT細胞注入マウスの平均光強度と比較した。(29C) BC1cCAR T細胞は、マウス生存率を改善する。マウスの生存率を測定し、2つのグループ間で比較し、log-rank mantel-cox検定の実施により、生存率が有意に改善された。
BCMA-CARおよびBC1 cCAR T細胞は、異種移植マウスモデルにおいてBCMAおよびCS1を発現するK562細胞の混和物に著しい抗白血病効果を示す。 BCMAを発現するルシフェラーゼ陽性K562細胞を、CS1を発現するルシフェラーゼ陽性K562細胞と4:1の比で混和する。その後、致死量以下の照射の24時間後に混合したK562細胞(0.5×106細胞)を静脈内(1日目)に注射した。 3日後、BCMA CAR T細胞、BC1cCAR T細胞またはコントロールT細胞を各マウスに1コースで静脈注射した(各群についてn = 5)。背側の腫瘍量は、3、7、10および12日目にIVISイメージングシステムを用いて測定した。7日目にBCMAマウス#3は大きな腫瘍を有する。 10日目に背側をコントロール群と比較すると、BCMA = 47.7%少ない腫瘍量、cCAR = 53.8%少ない腫瘍量を示す。 12日目の結果(腹側視野のみ)背側においてBCMA対コントロール= 43.8%少ない腫瘍量、cCAR対対照= 60.7%少ない腫瘍量を示す。
BCMAおよびBC1 cCAR T細胞でのin vivoでの腫瘍量の有意な減少。BCMA CAR T細胞またはcCAR(BC1 cCAR)で処置したマウスにおける、コントロールと比較した経時的減少率
NK-92細胞へのBC1cCAR形質導入。(30A) BC1cCARのモジュラー設計は、前述したように構成されています。(30B) NK-92細胞表面上のCAR発現。このコンストラクトをウイルス上清と共に48時間インキュベートすることでNK-92細胞に形質導入し、F(ab)’抗体検出で標識することによりCARタンパク質の表面発現を検出。形質導入された集団を囲み、コントロールNK-92細胞と比較する。
NK-92細胞へのBC1cCAR形質導入。(30A) BC1cCARのモジュラー設計は、前述したように構成されています。(30B) NK-92細胞表面上のCAR発現。このコンストラクトをウイルス上清と共に48時間インキュベートすることでNK-92細胞に形質導入し、F(ab)’抗体検出で標識することによりCARタンパク質の表面発現を検出。形質導入された集団を囲み、コントロールNK-92細胞と比較する。
BC1cCAR NK-92抗腫瘍特性特性評価。(31A) BC1cCAR NK細胞はミエローマ細胞株および原発性細胞を溶解する。 BC1cCAR NK-92細胞を、原発性MM7-G腫瘍細胞に加えて、U266、RPMI-8226、およびMM1S骨髄腫細胞株に対してインキュベートした。共培養は、5:1のE:T比で2時間かけて実施し、集団を分離するために抗CS1および抗BCMA抗体で標識した。腫瘍集団は円で囲まれている。 MM7-G原発腫瘍細胞をNK-92細胞と区別するために細胞サイトトラッカー色素(CMTMR)で染色し、丸で囲んだ。 BC1cCAR NK-92細胞傷害活性の要約が棒グラフで提示される (31B) 。 (31C) BC1cCAR NK-92細胞の抗原特異的活性について、人工的にBCMAを発現させたK562 (BCMAxpK562)およびCS1を発現しているK562(CS1xpK562)細胞を用いて試験した。共培養は、5:1のE:T比で4時間かけて行った。 K562集団はCMTMRで先に染色し、フローサイトメトリープロット上で、丸で囲んだ。棒グラフは抗腫瘍活性の要約を視覚化したものである。
BC1cCAR NK-92抗腫瘍特性の特性評価。(31A) BC1cCAR NK細胞はミエローマ細胞株および原発性細胞を溶解する。 BC1cCAR NK-92細胞を、原発性MM7-G腫瘍細胞に加えて、U266、RPMI-8226、およびMM1S骨髄腫細胞株に対してインキュベートした。共培養は、5:1のE:T比で2時間かけて実施し、集団を分離するために抗CS1および抗BCMA抗体で標識した。腫瘍集団は円で囲まれている。 MM7-G原発腫瘍細胞をNK-92細胞と区別するために細胞サイトトラッカー色素(CMTMR)で染色し、丸で囲んだ。 BC1cCAR NK-92細胞傷害活性の要約が棒グラフで提示される (31B) 。 (31C) BC1cCAR NK-92細胞の抗原特異的活性について、人工的にBCMAを発現させたK562 (BCMAxpK562)およびCS1を発現しているK562(CS1xpK562)細胞を用いて試験した。共培養は、5:1のE:T比で4時間かけて行った。 K562集団はCMTMRで先に染色し、フローサイトメトリープロット上で、丸で囲んだ。棒グラフは抗腫瘍活性の要約を視覚化したものである。
BC1cCAR NK-92抗腫瘍特性の特性評価。(31A) BC1cCAR NK細胞はミエローマ細胞株および原発性細胞を溶解する。 BC1cCAR NK-92細胞を、原発性MM7-G腫瘍細胞に加えて、U266、RPMI-8226、およびMM1S骨髄腫細胞株に対してインキュベートした。共培養は、5:1のE:T比で2時間かけて実施し、集団を分離するために抗CS1および抗BCMA抗体で標識した。腫瘍集団は円で囲まれている。 MM7-G原発腫瘍細胞をNK-92細胞と区別するために細胞サイトトラッカー色素(CMTMR)で染色し、丸で囲んだ。 BC1cCAR NK-92細胞傷害活性の要約が棒グラフで提示される (31B) 。 (31C) BC1cCAR NK-92細胞の抗原特異的活性について、人工的にBCMAを発現させたK562 (BCMAxpK562)およびCS1を発現しているK562(CS1xpK562)細胞を用いて試験した。共培養は、5:1のE:T比で4時間かけて行った。 K562集団はCMTMRで先に染色し、フローサイトメトリープロット上で、丸で囲んだ。棒グラフは抗腫瘍活性の要約を視覚化したものである。
異なるBAFF-CARコンストラクトの作製および特性評価。(32A) T細胞表面上の L45-BAFF-28 CAR発現。 L45-BAFF-28 CARをT細胞に形質導入し、F(ab)’抗体を用いて表面発現を評価した。ゲーティングはコントロールと比較した。 (32B) CAR発現のリーダー配列に対する依存性。異なるリーダー配列を用いたBAFF-CARコンストラクトにおいて形質導入における効率を改善できるかどうかをテストした。 F(ab)’抗体を用いて細胞表面上の検出を評価し、形質導入された集団を丸で囲んだ。 (32C) CAR発現の構造設計に対する依存性。さらなるBAFF-CARコンストラクト上に含まれる異なるリーダー配列および構造設計(追加ユニット)を検証し、CAR形質導入が改善され得るかどうかを決定するために使用した。形質導入された集団は、コントロールT細胞と比較して、線で囲まれ、ゲーティングされている。 CSF-BAFF-28 41BBLは、CSFリーダー配列を有する4-1BBL(41BBL)を共発現するBAFF CARである。 CSF-BAFF-28 IL-15RAは、CSFリーダー配列とIL-15 / IL-15SUS(IL-15RA)を共発現するBAFF CARである。
異なるBAFF-CARコンストラクトの作製および特性評価。(32A) T細胞表面上の L45-BAFF-28 CAR発現。 L45-BAFF-28 CARをT細胞に形質導入し、F(ab)’抗体を用いて表面発現を評価した。ゲーティングはコントロールと比較した。 (32B) CAR発現のリーダー配列に対する依存性。異なるリーダー配列を用いたBAFF-CARコンストラクトにおいて形質導入における効率を改善できるかどうかをテストした。 F(ab)’抗体を用いて細胞表面上の検出を評価し、形質導入された集団を丸で囲んだ。 (32C) CAR発現の構造設計に対する依存性。さらなるBAFF-CARコンストラクト上に含まれる異なるリーダー配列および構造設計(追加ユニット)を検証し、CAR形質導入が改善され得るかどうかを決定するために使用した。形質導入された集団は、コントロールT細胞と比較して、線で囲まれ、ゲーティングされている。 CSF-BAFF-28 41BBLは、CSFリーダー配列を有する4-1BBL(41BBL)を共発現するBAFF CARである。 CSF-BAFF-28 IL-15RAは、CSFリーダー配列とIL-15 / IL-15SUS(IL-15RA)を共発現するBAFF CARである。
異なるBAFF-CARコンストラクトの作製および特性評価。(32A) T細胞表面上の L45-BAFF-28 CAR発現。 L45-BAFF-28 CARをT細胞に形質導入し、F(ab)’抗体を用いて表面発現を評価した。ゲーティングはコントロールと比較した。 (32B) CAR発現のリーダー配列に対する依存性。異なるリーダー配列を用いたBAFF-CARコンストラクトにおいて形質導入における効率を改善できるかどうかをテストした。 F(ab)’抗体を用いて細胞表面上の検出を評価し、形質導入された集団を丸で囲んだ。 (32C) CAR発現の構造設計に対する依存性。さらなるBAFF-CARコンストラクト上に含まれる異なるリーダー配列および構造設計(追加ユニット)を検証し、CAR形質導入が改善され得るかどうかを決定するために使用した。形質導入された集団は、コントロールT細胞と比較して、線で囲まれ、ゲーティングされている。 CSF-BAFF-28 41BBLは、CSFリーダー配列を有する4-1BBL(41BBL)を共発現するBAFF CARである。 CSF-BAFF-28 IL-15RAは、CSFリーダー配列とIL-15 / IL-15SUS(IL-15RA)を共発現するBAFF CARである。
L45-BAFF-28 CAR Tの抗腫瘍特性の特徴付け。 L45-BAFF-28 CAR T細胞は、MM1S腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を有する。 L45-BAFF-28 CAR T細胞を、MM1S骨髄腫細胞に対して3:1のE:T比で48時間培養した。繰り返しサンプルが表示されます。細胞傷害活性は棒グラフにて要約されている。
異なるBAFF-CARコンストラクトおよび強化による抗腫瘍活性の特性評価。 (34A) MM1S細胞に対するBAFF-CARコンストラクト。 L8-BAFF-28IL-15 / IL-15sushiおよびL8-BAFF-28-41BBL CARをMM1S腫瘍細胞に対して5:1のE:T比で24時間培養した。腫瘍集団は線で囲まれている。 (34B) SP53細胞に対するBAFF-CARコンストラクト。 CARおよびL45-BAFF-28 CARの両方を、E:T比5:1でSp53腫瘍細胞(B系統)に対して24時間培養した。(34C) 細胞傷害活性の要約棒グラフ。
異なるBAFF-CARコンストラクトおよび強化による抗腫瘍活性の特性評価。 (34A) MM1S細胞に対するBAFF-CARコンストラクト。 L8-BAFF-28IL-15 / IL-15sushiおよびL8-BAFF-28-41BBL CARをMM1S腫瘍細胞に対して5:1のE:T比で24時間培養した。腫瘍集団は線で囲まれている。 (34B) SP53細胞に対するBAFF-CARコンストラクト。 CARおよびL45-BAFF-28 CARの両方を、E:T比5:1でSp53腫瘍細胞(B系統)に対して24時間培養した。(34C) 細胞傷害活性の要約棒グラフ。
異なるBAFF-CARコンストラクトおよび強化による抗腫瘍活性の特性評価。 (34A) MM1S細胞に対するBAFF-CARコンストラクト。 L8-BAFF-28IL-15 / IL-15sushiおよびL8-BAFF-28-41BBL CARをMM1S腫瘍細胞に対して5:1のE:T比で24時間培養した。腫瘍集団は線で囲まれている。 (34B) SP53細胞に対するBAFF-CARコンストラクト。 CARおよびL45-BAFF-28 CARの両方を、E:T比5:1でSp53腫瘍細胞(B系統)に対して24時間培養した。(34C) 細胞傷害活性の要約棒グラフ。
cCARコンストラクトを示す略図。コンストラクトは、P2Aペプチドによって連結されたCARの2つのモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。このP2Aペプチドが開裂すると、cCARはそれぞれ分かれ、BCMAおよび/またはCD19を発現する標的に関与する。 2つのユニットCARは、異なるまたは同じ共刺激ドメインを使用する。共刺激ドメインは、4-1BBまたはCD28であり得るが、これに限定されない。
BCMA CARユニットの特性評価。(36A) BCMA CARは、BCMA + MM1S細胞を効果的に減少させる。 BCMA CARをT細胞に形質導入し、MM1S腫瘍細胞と共培養した。 CS1 CARも作製され、その強さのために使用されました。 MM1S細胞は、BCMAおよびCS1の両方に対して有意に二重陽性である。共培養は、48時間にわたって実施し、BCMAおよびCS1抗体を用いて腫瘍の中心を同定した。線で囲まれた集団は、培養後の残留MM1S腫瘍細胞を表す。(36B) BCMA CARは、BCMA +原発腫瘍細胞を効果的に溶解する。(36B) BCMA CARおよびCS1 CARも、原発性MM7-G骨髄腫患者細胞に対するその抗腫瘍特性について評価された。 MM7-G集団は、多数がBCMA + CS1 +集団であり、少数であるが有意なCS1 +集団も存在する。 BCMA CARおよびCS1 CARの両方をタンデムに使用して、細胞毒性を評価するためにBCMAおよび細胞トラッカー(CMTMR)により腫瘍集団をCAR細胞と区別した。
BCMA CARユニットの特性評価。(36A) BCMA CARは、BCMA + MM1S細胞を効果的に減少させる。 BCMA CARをT細胞に形質導入し、MM1S腫瘍細胞と共培養した。 CS1 CARも作製され、その強さのために使用されました。 MM1S細胞は、BCMAおよびCS1の両方に対して有意に二重陽性である。共培養は、48時間にわたって実施し、BCMAおよびCS1抗体を用いて腫瘍の中心を同定した。線で囲まれた集団は、培養後の残留MM1S腫瘍細胞を表す。(36B) BCMA CARは、BCMA +原発腫瘍細胞を効果的に溶解する。(36B) BCMA CARおよびCS1 CARも、原発性MM7-G骨髄腫患者細胞に対するその抗腫瘍特性について評価された。 MM7-G集団は、多数がBCMA + CS1 +集団であり、少数であるが有意なCS1 +集団も存在する。 BCMA CARおよびCS1 CARの両方をタンデムに使用して、細胞毒性を評価するためにBCMAおよび細胞トラッカー(CMTMR)により腫瘍集団をCAR細胞と区別した。
CD19CARの特性評価。(37A) CD19CARユニットの設計。(37B)ウェスタンブロット。 HEK-293T細胞に、コントロールベクター(レーン1)およびCD19-2G(レーン2)のレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、上清を除去し、細胞も回収した。細胞をウエスタンブロットのために溶解し、マウス抗ヒトCD3z一次抗体およびヤギ抗マウスHRP二次抗体でプローブした。 C. PMBCバフィコートT細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞に、コントロールベクター(左)、あるいはL8-CD19-2G(右)レンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を採取し、ビオチンと結合したヤギ抗マウスFab2またはヤギIgG抗体と共に30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、懸濁させ、ストレプトアビジン-PEおよびマウス抗ヒトCD3-PerCpで30分間染色した。細胞を洗浄し、2%ホルマリンに懸濁し、フローサイトメトリーで分析してCAR効率を測定した。(N=2)
CD19CARの特性評価。(37A) CD19CARユニットの設計。(37B) ウェスタンブロット。 HEK-293T細胞に、コントロールベクター(レーン1)およびCD19-2G(レーン2)のレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、上清を除去し、細胞も回収した。細胞をウエスタンブロットのために溶解し、マウス抗ヒトCD3z一次抗体およびヤギ抗マウスHRP二次抗体でプローブした。 C. PMBCバフィコートT細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞に、コントロールベクター(左)、あるいはL8-CD19-2G(右)レンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を採取し、ビオチンと結合したヤギ抗マウスFab2またはヤギIgG抗体と共に30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、懸濁させ、ストレプトアビジン-PEおよびマウス抗ヒトCD3-PerCpで30分間染色した。細胞を洗浄し、2%ホルマリンに懸濁し、フローサイトメトリーで分析してCAR効率を測定した。(N=2)
CD19CARの特性評価。(37A) CD19CARユニットの設計。(37B) ウェスタンブロット。 HEK-293T細胞に、コントロールベクター(レーン1)およびCD19-2G(レーン2)のレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、上清を除去し、細胞も回収した。細胞をウエスタンブロットのために溶解し、マウス抗ヒトCD3z一次抗体およびヤギ抗マウスHRP二次抗体でプローブした。 C. PMBCバフィコートT細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞に、コントロールベクター(左)、あるいはL8-CD19-2G(右)レンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を採取し、ビオチンと結合したヤギ抗マウスFab2またはヤギIgG抗体と共に30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、懸濁させ、ストレプトアビジン-PEおよびマウス抗ヒトCD3-PerCpで30分間染色した。細胞を洗浄し、2%ホルマリンに懸濁し、フローサイトメトリーで分析してCAR効率を測定した。(N=2)
異なるリーダー配列を用いたcompound CD19CAR T細胞の発現。 (38A) 異なるリーダー配列を有する融合タンパク質を発現するようにCARコンストラクトは設計された。(38B) PMBCバフィコートT細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞に、コントロールベクター(左)、HA-CD19-2G(上の中央)、IL2-CD19-2G(右上)、L8-CD19-2G(下の中央左)、L45-CD19-2G中右)またはCSF-CD19-2GCAR(右下)のいずれかのレンチウイルス上清を用いて形質導入された。 3日間のインキュベーション後、細胞を採取し、ビオチンと結合したヤギ抗マウスFab2またはヤギIgG抗体と共に30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、懸濁させ、ストレプトアビジン-PEおよびマウス抗ヒトCD3-PerCpで30分間染色した。細胞を洗浄し、2%ホルマリンに懸濁し、フローサイトメトリーで分析してCAR効率を測定した。 (N=2)
異なるリーダー配列を用いたcompound CD19CAR T細胞の発現。 (38A) 異なるリーダー配列を有する融合タンパク質を発現するようにCARコンストラクトは設計された。(38B) PMBCバフィコートT細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞に、コントロールベクター(左)、HA-CD19-2G(上の中央)、IL2-CD19-2G(右上)、L8-CD19-2G(下の中央左)、L45-CD19-2G中右)またはCSF-CD19-2GCAR(右下)のいずれかのレンチウイルス上清を用いて形質導入された。 3日間のインキュベーション後、細胞を採取し、ビオチンと結合したヤギ抗マウスFab2またはヤギIgG抗体と共に30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、懸濁させ、ストレプトアビジン-PEおよびマウス抗ヒトCD3-PerCpで30分間染色した。細胞を洗浄し、2%ホルマリンに懸濁し、フローサイトメトリーで分析してCAR効率を測定した。 (N=2)
異なるCD19 scFv配列を用いたT細胞上のCD19CARの発現。(39A) 異なるscFv配列を有する融合タンパク質を発現するようにCARコンストラクトを設計した。 (39B) PMBCバフィコートT細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。コントロールベクター(左)、L8-CD19-2G(中央)、IL2-CD19-2G(右上)またはL8-CD19b-BB-2G(右)のレンチウイルス上清のいずれかを用いて細胞に形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を採取し、ビオチンと結合したヤギ抗マウスFab2またはヤギIgG抗体と共に30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、懸濁させ、ストレプトアビジン-PEおよびマウス抗ヒトCD3-PerCpで30分間染色した。細胞を洗浄し、2%ホルマリンに懸濁し、フローサイトメトリーで分析してCAR効率を測定した。(N=2)
L8-CD19-2GおよびCD19b-BB CAR T細胞は、一晩の共培養においてSP53腫瘍細胞を溶解する。コントロール(左)、L8-CD19-2G(中央)またはL8-CD19b-BB-2G(右)レンチウイルス上清のいずれかで形質導入された活性化PMBC T細胞をSP53細胞と2:1(上)および5:1(下)、でのエフェクター:標的細胞比でインキュベートした。 37℃で24時間インキュベートした後、サンプルを洗浄し、抗ヒトCD3-PerCpおよび抗ヒトCD19-APCで染色し、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。 SP53細胞のみと細胞溶解の要約が右端に示されている。(N=2)
L8-CD19-2GおよびCD19b-BB CAR T細胞は、一晩の同時培養においてJeKo-1腫瘍細胞を溶解する。コントロール(左)、L8-CD19-2G(中央)またはL8-CD19b-BB-2G(右)レンチウイルス上清のいずれかで形質導入された活性化PMBC T細胞をJeCo-1細胞と2:1(top )および5:1(下部)、エフェクター:標的細胞の比でインキュベートした。 37℃で24時間インキュベートした後、サンプルを洗浄し、抗ヒトCD3-PerCpおよび抗ヒトCD19-APCで染色し、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。右端にはJeKo-1細胞のみと細胞溶解の概要が示されている。(N=2) 。
L8-CD19-2GおよびL8-CD19b-BB-2G CAR T細胞は、一晩の共培養でAML患者細胞を溶解する。コントロール(左)、L8-CD19-2G(中央)またはL8-CD19b-BB-2G(右)レンチウイルス上清のいずれかで形質導入された活性化PMBC T細胞をCMTMR染色したAMLを有する患者の細胞と、 2:1(上)および5:1(下)、エフェクター:標的細胞での比率でインキュベートした。 37℃で24時間インキュベートした後、サンプルを洗浄し、抗ヒトCD3-PerCpおよび抗ヒトCD19-APCで染色し、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。予め染色された患者細胞のみと細胞溶解の概要が右端に示されている。(N=2) 。
L8-CD19-2GおよびL8-CD19b-BB-2G CAR T細胞は、CD19 +患者細胞を減少させる。コントロール(左)、L8-CD19-2G、(中央)またはL8-CD19b-BB-2G(右)レンチウイルス上清のいずれかを形質導入した活性化PMBC T細胞を、CMTMR染色したB-ALLを有する患者由来の細胞と共にインキュベートした。 L8-CD19b-BB-2G T細胞を患者細胞と1:1の比で一晩インキュベートし(上)、L8-CD19b-BB-2GT細胞を患者細胞と共に5:1の比で40時間インキュベートした(下)。この37℃でのインキュベーション後、サンプルを洗浄し、抗ヒトCD3-PerCpおよび抗ヒトCD19-APCで染色し、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。事前に染色された患者細胞のみが右端に示されている。 (N=2)。
cCARコンストラクトを示す略図。コンストラクトは、P2Aペプチドによって連結されたCARの2つのモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。このP2Aペプチドが開裂すると、cCARは別れ、BCMAおよび/またはCD19bを発現する標的に関与する。 2つのユニットCARは、異なるまたは同じ共刺激ドメインを使用する。共刺激ドメインは、4-1BBまたはCD28であり得る。
異なるBAFF-CARコンストラクトの作製および特性評価。 (45A) L45-BAFF-28 CARをT細胞に形質導入し、F(ab) '抗体を用いて表面発現を評価した。ゲーティングはコントロールと比較した。(45B) 異なるリーダー配列を用いたBAFF-CARコンストラクトを試験し、形質導入における効率を改善できるかどうかを判断した。F(ab) '抗体を用いて表面検出で評価し、形質導入された集団を線で囲んだ。 (45C) 異なるリーダー配列およびコンストラクトの設計(追加ユニット)を含む、さらなるBAFF-CARコンストラクトを検証し、CAR形質導入率が改善できるかどうかを決定するために使用した。形質導入された集団は、コントロールT細胞と比較して、線で囲まれ、ゲーティングされている。 CSF-BAFF-28 41BBLは、CSFリーダー配列を有する4-1BBL(41BBL)を共発現するBAFF CARである。 CSF-BAFF-28IL-15 / IL-15sushiは、CSFリーダー配列を有するとIL-15 / IL-15sushiを共発現するBAFF CARである。
異なるBAFF-CARコンストラクトの作製および特性評価。 (45A) L45-BAFF-28 CARをT細胞に形質導入し、F(ab) '抗体を用いて表面発現を評価した。ゲーティングはコントロールと比較した。(45B) 異なるリーダー配列を用いたBAFF-CARコンストラクトを試験し、形質導入における効率を改善できるかどうかを判断した。F(ab) '抗体を用いて表面検出で評価し、形質導入された集団を線で囲んだ。 (45C) 異なるリーダー配列およびコンストラクトの設計(追加ユニット)を含む、さらなるBAFF-CARコンストラクトを検証し、CAR形質導入率が改善できるかどうかを決定するために使用した。形質導入された集団は、コントロールT細胞と比較して、線で囲まれ、ゲーティングされている。 CSF-BAFF-28 41BBLは、CSFリーダー配列を有する4-1BBL(41BBL)を共発現するBAFF CARである。 CSF-BAFF-28IL-15 / IL-15sushiは、CSFリーダー配列を有するとIL-15 / IL-15sushiを共発現するBAFF CARである。
異なるBAFF-CARコンストラクトの作製および特性評価。 (45A) L45-BAFF-28 CARをT細胞に形質導入し、F(ab) '抗体を用いて表面発現を評価した。ゲーティングはコントロールと比較した。(45B) 異なるリーダー配列を用いたBAFF-CARコンストラクトを試験し、形質導入における効率を改善できるかどうかを判断した。F(ab) '抗体を用いて表面検出で評価し、形質導入された集団を線で囲んだ。 (45C) 異なるリーダー配列およびコンストラクトの設計(追加ユニット)を含む、さらなるBAFF-CARコンストラクトを検証し、CAR形質導入率が改善できるかどうかを決定するために使用した。形質導入された集団は、コントロールT細胞と比較して、線で囲まれ、ゲーティングされている。 CSF-BAFF-28 41BBLは、CSFリーダー配列を有する4-1BBL(41BBL)を共発現するBAFF CARである。 CSF-BAFF-28IL-15 / IL-15sushiは、CSFリーダー配列を有するとIL-15 / IL-15sushiを共発現するBAFF CARである。
L45-BAFF-28 CAR T細胞は、MM1S腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を有する。 L45-BAFF-28 CAR Tの抗腫瘍特性の特性評価。 (46A) (46B) から要約したインビトロでのBAFF CAR細胞傷害活性。(46B) L45-BAFF-28 CAR T細胞は、MM1S腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を有する。 L45-BAFF-28 CAR T細胞を、MM1S骨髄腫細胞に対して3:1のE:T比で48時間培養した。重複したサンプルが表示されます。
L45-BAFF-28 CAR T細胞は、MM1S腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を有する。 L45-BAFF-28 CAR Tの抗腫瘍特性の特性評価。 (46A) (46B) から要約したインビトロでのBAFF CAR細胞傷害活性。(46B) L45-BAFF-28 CAR T細胞は、MM1S腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を有する。 L45-BAFF-28 CAR T細胞を、MM1S骨髄腫細胞に対して3:1のE:T比で48時間培養した。重複したサンプルが表示されます。
異なるBAFF-CARコンストラクトおよび増強を用いた抗腫瘍活性の特性評価。 (47A) L8-BAFF-28IL-15 / IL-15sushiおよびL8-BAFF-28 4-1BBL CARを5:1 のE:T比でMM1S腫瘍細胞に対して24時間培養した。腫瘍集団は線で囲まれている。(47B) 上述の両方のCARおよびL45-BAFF-28 CARをSp53腫瘍細胞(B系統)に対して5:1のE:T比で24時間培養した。
CRISPR / Cas9干渉システム。 sgRNAおよびCas9ピューロマイシンの発現は、それぞれU6プロモーターおよびSFFVプロモーターによって駆動される。 Cas9は、E2A自己切断配列によってピューロマイシン耐性遺伝子に連結されている。
血液悪性腫瘍を標的とするCAR TまたはNK細胞の作製ステップ
CRISPR / Cas9レンチウイルスシステムを用いた安定したCD45ノックダウンNK-92細胞の作製および細胞の選別。フローサイトメトリー分析により、NK-92細胞の表面上のCD45発現レベルを示した(左パネル)。 sgCD45B CRISPRをNK-92細胞に形質導入した後、形質導入細胞を、ピューロマイシンを含む培地中で数週間培養した。 CD45陰性NK-92細胞を、CD45抗体を用いて決定し、選別した。安定なNK45i-92(CD45ノックダウン)NK-92細胞の純度を、フローサイトメトリー分析(右パネル)により決定した。このデータは、我々がNK45i-92細胞の作製と取得に成功したことを示している。
野生型、GFP形質導入NK-92またはNK45i-92NK細胞の細胞増殖曲線。 NK-92細胞におけるCD45ノックダウン(KD)に起因する細胞増殖の効果を評価するために、NK-92(●)、GFP形質導入NK-92(■)およびNK45i-92(▲)を24ウェルプレートに播種してから48時間および96時間後に細胞数を計数した。IL-2は48時間の時点に添加した。 (n = 3回の独立した重複実験を 行った)。データは平均+ S.Dである。これらのデータは、NK-92上のCD45受容体をノックダウンしても、非形質導入NK-92細胞またはGFP形質導入NK-92細胞と比べ同様の細胞増殖曲線を示すことを示した。24ウェルプレート、n = 3回の独立した重複実験、IL-2は48時の間時点に添加した。
CCRF-CEM(標的:T)およびGFP NK-92細胞またはGFP NK45i-92細胞(エフェクター:E)、5:1(E:T)比率で16時間でのインキュベーションによる共培養アッセイ。 (51A) CCRF-CEMのみ培養(左パネルの青色のドット)、CCRF-CEMおよびコントロールGFP形質導入NK-92細胞(中央パネル)またはGFP NK45i-92細胞(右パネル)を共培養したフローサイトメトリーによる分析。 全パネル中の青色の点は、残存する標的CCRF-CEM細胞を示し、赤色のドットは共培養アッセイにおけるエフェクター細胞を示す。全てのインキュベーションタイムは6時間であり、エフェクターT細胞:標的細胞の比は5:1であった。全て重複実験で行った。(51B) 棒グラフは、GFP形質導入NK45i-92細胞による細胞溶解のパーセントを、CCRF-CEMとの共培養アッセイにおいてコントロールGFP形質導入NK92細胞との結果を比較して示している。これらのデータは、NK-92細胞におけるCD45のノックダウンは、GFP-コントロールNK-92細胞と比較して、CCRF-CEM細胞に対する殺傷活性に有意差を示さないことを示唆する。
CCRF-CEM(標的:T)およびGFP NK-92、CD5CAR NK-92またはCD5CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)と5:1(E:T)の比および16時間のインキュベーションでの共培養アッセイ。 (52A) 右から左に向かって、CCRF-CEMのみ(左パネル)およびCCRF-CEMとコントロールGFP NK-92細胞(左中央パネル)、CD5CAR NK-92細胞(右中央パネル)、CD5CAR NK45iらとの共培養アッセイ。全てのパネル中の青色の点は、残存する標的CCRF-CEM細胞を示し、赤色のドットは共培養アッセイでのエフェクター細胞を示す。インキュベーション時間は16時間であり、エフェクターT細胞:標的細胞の比は5:1であった。全て重複実験で行った 。(52B)棒グラフは、CCRF-CEMとの共培養アッセイにおけるコントロールGFP NK92細胞と比較した、CD5CAR NK-92細胞またはCD5CAR NK45i-92細胞による細胞溶解率を示す。データは平均+ S.Dである。 CD5CAR NK細胞およびCD5CAR NK45i-92細胞の両方とも、コントロールGFP NK-92細胞と比較して、CD5陽性CCRF-CEMに対して100%近い細胞殺傷活性を示す。これらのデータは、CD5CAR NK細胞およびCD5CAR NK45i-92細胞が、GFPコントロールNK-92細胞と比較してCD5を発現するCCRF-CEM細胞をin vitro共培養アッセイで効果的に溶解することができ、CD45のノックダウンが NK-92細胞における殺傷活性への細胞機能に対し影響を及ぼさないことを示す。
CD45CARコンストラクトの構成およびその発現。 (53A) CD45CARレンチウイルスベクターの模式図。 CD45CARコンストラクトは、リーダー配列、抗CD45scFv、ヒンジドメイン(H)、膜貫通ドメイン(TM)、2つの共刺激ドメイン(CD28および4-1BB)を含むモジュール化されたシグナル伝達ドメインであり、第3世代CARと定義され、細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータを含む。 (53B)HEK-293FT細胞にGFP(レーン1)およびCD45CAR(レーン2)のレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、上清を除去し、細胞を回収した。細胞をウエスタンブロット用に溶解し、マウス抗ヒトCD3z抗体でプローブした。
NK45i-92細胞へのCD45CARの形質導入およびCD45CAR形質導入細胞の選別。フローサイトメトリー分析によって、CD45CARレンチウイルスをNK45i-92細胞に形質導入した後、NK45i-92上のCD45CARの発現レベル(右パネルでの青丸で囲まれている領域)をNK45i-92細胞(左パネル)と比較検討した。 CD45CAR発現NK45i-92細胞を選別し、細胞表面上のCD45発現レベルをフローサイトメトリー分析により決定した。細胞表面上に約87%のCD45CAR発現していることがフローサイトメトリー分析によって検出された。
CCRF-CEM(標的:T)およびGFP NK-92またはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)と5:1(E:T)比で、16時間のインキュベーションの共培養アッセイ。 (55A) CCRF-CEMおよびコントロールのGFP形質導入NK-92細胞(左パネル)またはCD45CAR NK45i-92細胞(右パネル)との共培養におけるフローサイトメトリー分析。全てのパネル中の青い点は、残存標的CCRF-CEM細胞を示し、赤色のドットは共培養アッセイにおけるエフェクターNK-92細胞を示す。インキュベーションタイムは16時間であり、エフェクターT細胞:標的細胞の比率は5:1である。全て重複実験で行った 。(55B) 棒グラフは、CCRF-CEMとの共培養アッセイにおけるCD45CAR NK45i-92細胞による細胞溶解率を、 コントロールGFP NK92細胞との結果で比較して示している。データは平均+ S.Dである。 CD45CAR NK45i-92細胞は、コントロールGFP NK-92細胞と比較して、CCRF-CEM細胞に対して約70%の細胞溶解度を示す。これらのデータは、CD45CAR NK45i-92細胞がGFP-コントロールNK-92細胞と比較してCD45を発現するCCRF-CEM細胞をin vitro共培養アッセイで効果的に溶解することを示唆している。
Jurkat細胞(標的:T)およびGFP-コントロールまたはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)を5:1または2:1(E:T)比で6時間のインキュベーションでの共培養アッセイ。 (56A) Jurkat細胞をCMTMR細胞トラッカー色素で染色した後、フローサイトメトリー解析を行った。これらのデータは、Jurkat細胞がCD45陽性(左パネル)であり、かつ、ほぼ CD56陰性細胞(右パネル)であることを示す。(56Bと56C) Jurkat細胞(標的:T)およびコントロールまたはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)を用いた共培養アッセイでのフローサイトメトリーによる解析。共培養アッセイの比率は、5:1 (56B) または2:1 (56C) (E:T)で行った。左パネルは、コントロールGFPまたはCD45CAR NK45i-92細胞と5:1(E:T)比の共培養において、右のパネルは、コントロールGFPまたはCD45CAR NK45i-92細胞との2: 1(E:T)比率の結果である。パネル中の青い点は、共培養アッセイ後の、残りの標的Jurkat細胞を示し、赤色の点は、共培養アッセイでのエフェクター細胞を示す。インキュベーションタイムは6時間であった。全て重複実験で行った。(56C) 棒グラフは、5:1または2:1(E:T)比率におけるコントロールGFP NK92細胞と比較したCD45CAR NK45i-92細胞による細胞溶解率を示す。データは平均+ S.Dである。 CD45CAR NK45i-92細胞は、コントロールGFP NK-92細胞と比較して、Jurkat細胞に対して約60%の細胞溶解率を、両条件において示す。このデータは、CD45CAR NK45i-92細胞が、GFPコントロールNK-92細胞と比較して細胞表面上のCD45を発現するJurkat細胞をin vitro共培養アッセイで効果的に溶解することを示唆している。
Jurkat細胞(標的:T)およびGFP-コントロールまたはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)を5:1または2:1(E:T)比で6時間のインキュベーションでの共培養アッセイ。 (56A) Jurkat細胞をCMTMR細胞トラッカー色素で染色した後、フローサイトメトリー解析を行った。これらのデータは、Jurkat細胞がCD45陽性(左パネル)であり、かつ、ほぼ CD56陰性細胞(右パネル)であることを示す。(56Bと56C) Jurkat細胞(標的:T)およびコントロールまたはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)を用いた共培養アッセイでのフローサイトメトリーによる解析。共培養アッセイの比率は、5:1 (56B) または2:1 (56C) (E:T)で行った。左パネルは、コントロールGFPまたはCD45CAR NK45i-92細胞と5:1(E:T)比の共培養において、右のパネルは、コントロールGFPまたはCD45CAR NK45i-92細胞との2: 1(E:T)比率の結果である。パネル中の青い点は、共培養アッセイ後の、残りの標的Jurkat細胞を示し、赤色の点は、共培養アッセイでのエフェクター細胞を示す。インキュベーションタイムは6時間であった。全て重複実験で行った。(56C) 棒グラフは、5:1または2:1(E:T)比率におけるコントロールGFP NK92細胞と比較したCD45CAR NK45i-92細胞による細胞溶解率を示す。データは平均+ S.Dである。 CD45CAR NK45i-92細胞は、コントロールGFP NK-92細胞と比較して、Jurkat細胞に対して約60%の細胞溶解率を、両条件において示す。このデータは、CD45CAR NK45i-92細胞が、GFPコントロールNK-92細胞と比較して細胞表面上のCD45を発現するJurkat細胞をin vitro共培養アッセイで効果的に溶解することを示唆している。
Jurkat細胞(標的:T)およびGFP-コントロールまたはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)を5:1または2:1(E:T)比で6時間のインキュベーションでの共培養アッセイ。 (56A) Jurkat細胞をCMTMR細胞トラッカー色素で染色した後、フローサイトメトリー解析を行った。これらのデータは、Jurkat細胞がCD45陽性(左パネル)であり、かつ、ほぼ CD56陰性細胞(右パネル)であることを示す。(56Bと56C) Jurkat細胞(標的:T)およびコントロールまたはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)を用いた共培養アッセイでのフローサイトメトリーによる解析。共培養アッセイの比率は、5:1 (56B) または2:1 (56C) (E:T)で行った。左パネルは、コントロールGFPまたはCD45CAR NK45i-92細胞と5:1(E:T)比の共培養において、右のパネルは、コントロールGFPまたはCD45CAR NK45i-92細胞との2: 1(E:T)比率の結果である。パネル中の青い点は、共培養アッセイ後の、残りの標的Jurkat細胞を示し、赤色の点は、共培養アッセイでのエフェクター細胞を示す。インキュベーションタイムは6時間であった。全て重複実験で行った。(56C) 棒グラフは、5:1または2:1(E:T)比率におけるコントロールGFP NK92細胞と比較したCD45CAR NK45i-92細胞による細胞溶解率を示す。データは平均+ S.Dである。 CD45CAR NK45i-92細胞は、コントロールGFP NK-92細胞と比較して、Jurkat細胞に対して約60%の細胞溶解率を、両条件において示す。このデータは、CD45CAR NK45i-92細胞が、GFPコントロールNK-92細胞と比較して細胞表面上のCD45を発現するJurkat細胞をin vitro共培養アッセイで効果的に溶解することを示唆している。
GFP-NK-92細胞(標的:T)および非形質導入NK-92細胞またはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)と5:1または2:1(E:T)比率で6時間のインキュベーションでの共培養アッセイ。(57A) GFPコントロールNK-92細胞を用いたフローサイトメトリー解析。これらのデータは、GFPコントロールNK-92細胞の約99%がGFP陽性細胞(緑色の点)であることを証明している。(57B) GFPコントロールNK-92細胞(標的:T)および非形質導入の、あるいはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)を用いた共培養アッセイにおけるフローサイトメトリー解析。共培養アッセイの比は、5:1 (57A) または2:1(E:T)(57C) で行った。左パネルは、非形質導入またはCD45CAR NK45i-92細胞と5:1(E:T)比率での共培養において、右パネルは非形質導入またはCD45CAR NK45i-92細胞との2: 1(E:T)比率での共培養を示している。パネル中の緑色の点は、共培養アッセイによって残存した標的GFP NK-92細胞を示し、赤色のドットは共培養アッセイ後のエフェクター細胞を示す。インキュベーション時間は6時間であった。全て重複実験で行った。 (57C)棒グラフは、5:1または2:1(E:T)比率での非形質導入NK-92細胞と比較した、CD45CAR NK45i-92細胞によるGFP NK-92細胞の細胞溶解率を示す。データは平均+ S.Dである。 CD45CAR NK45i-92細胞は、非形質導入NK-92細胞と比較して、GFP NK-92細胞に対して2:1(E:T)比率で約20%の、5:1(E:T)比で約55%のGFP 92細胞を溶解することを示した。このデータは、CD45CAR NK45i-92細胞が、非形質導入NK-92細胞と比較して細胞表面上のCD45を発現するGFP NK-92細胞をin vitro共培養アッセイで効果的に溶解することを示唆する。
GFP-NK-92細胞(標的:T)および非形質導入NK-92細胞またはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)と5:1または2:1(E:T)比率で6時間のインキュベーションでの共培養アッセイ。(57A) GFPコントロールNK-92細胞を用いたフローサイトメトリー解析。これらのデータは、GFPコントロールNK-92細胞の約99%がGFP陽性細胞(緑色の点)であることを証明している。(57B) GFPコントロールNK-92細胞(標的:T)および非形質導入の、あるいはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)を用いた共培養アッセイにおけるフローサイトメトリー解析。共培養アッセイの比は、5:1 (57A) または2:1(E:T)(57C) で行った。左パネルは、非形質導入またはCD45CAR NK45i-92細胞と5:1(E:T)比率での共培養において、右パネルは非形質導入またはCD45CAR NK45i-92細胞との2: 1(E:T)比率での共培養を示している。パネル中の緑色の点は、共培養アッセイによって残存した標的GFP NK-92細胞を示し、赤色のドットは共培養アッセイ後のエフェクター細胞を示す。インキュベーション時間は6時間であった。全て重複実験で行った。 (57C)棒グラフは、5:1または2:1(E:T)比率での非形質導入NK-92細胞と比較した、CD45CAR NK45i-92細胞によるGFP NK-92細胞の細胞溶解率を示す。データは平均+ S.Dである。 CD45CAR NK45i-92細胞は、非形質導入NK-92細胞と比較して、GFP NK-92細胞に対して2:1(E:T)比率で約20%の、5:1(E:T)比で約55%のGFP 92細胞を溶解することを示した。このデータは、CD45CAR NK45i-92細胞が、非形質導入NK-92細胞と比較して細胞表面上のCD45を発現するGFP NK-92細胞をin vitro共培養アッセイで効果的に溶解することを示唆する。
GFP-NK-92細胞(標的:T)および非形質導入NK-92細胞またはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)と5:1または2:1(E:T)比率で6時間のインキュベーションでの共培養アッセイ。(57A) GFPコントロールNK-92細胞を用いたフローサイトメトリー解析。これらのデータは、GFPコントロールNK-92細胞の約99%がGFP陽性細胞(緑色の点)であることを証明している。(57B) GFPコントロールNK-92細胞(標的:T)および非形質導入の、あるいはCD45CAR NK45i-92細胞(エフェクター:E)を用いた共培養アッセイにおけるフローサイトメトリー解析。共培養アッセイの比は、5:1 (57A) または2:1(E:T)(57C) で行った。左パネルは、非形質導入またはCD45CAR NK45i-92細胞と5:1(E:T)比率での共培養において、右パネルは非形質導入またはCD45CAR NK45i-92細胞との2: 1(E:T)比率での共培養を示している。パネル中の緑色の点は、共培養アッセイによって残存した標的GFP NK-92細胞を示し、赤色のドットは共培養アッセイ後のエフェクター細胞を示す。インキュベーション時間は6時間であった。全て重複実験で行った。 (57C)棒グラフは、5:1または2:1(E:T)比率での非形質導入NK-92細胞と比較した、CD45CAR NK45i-92細胞によるGFP NK-92細胞の細胞溶解率を示す。データは平均+ S.Dである。 CD45CAR NK45i-92細胞は、非形質導入NK-92細胞と比較して、GFP NK-92細胞に対して2:1(E:T)比率で約20%の、5:1(E:T)比で約55%のGFP 92細胞を溶解することを示した。このデータは、CD45CAR NK45i-92細胞が、非形質導入NK-92細胞と比較して細胞表面上のCD45を発現するGFP NK-92細胞をin vitro共培養アッセイで効果的に溶解することを示唆する。
CD45b-BBまたはCD45b-28のNK45i-92細胞への形質導入およびCD45b-BBまたはCD45b-28 NK45i-92形質導入細胞の選別。CDb-BBの共刺激ドメインは4-1BBであり、CD45b-28の共刺激ドメインはCD28である。CD45b-BBまたはCD45b-28レンチウイルスをNK45i-92細胞に形質導入した後、NK45i-92上のCD45b-BB CARまたはCD45b-28 CARの 発現レベル(中間パネルで、青で囲まれた領域)を NK45i-92細胞(左パネル)と比較してフローサイトメトリー分析で決定した。 CD45b-BBまたはCD45b-28 CARを発現するNK45i-92細胞を選別し、CD45b-BBまたはCD45b-28の細胞上の発現レベルをフローサイトメトリー分析によって決定した。フローサイトメトリー解析により、細胞表面上に約74%のCD45b-BB CAR または約82%のCD45b-28 CARが発現していることが検出された。
REH細胞(標的:T)およびGFP NK-92細胞、CD45CAR NK45i-92細胞、CD45b-BB NK45i-92細胞またはCD45b-28 NK45i-92細胞(エフェクター:E)と、 5:1(E:T)比率で20時間のインキュベーションでの共培養アッセイ。上段はREH 細胞のみ(左パネル)、 REH細胞およびコントロールGFP形質導入NK-92細胞(第2左パネル)、CD45CAR NK45i-92細胞(中央パネル)、CD45b-BB NK45i-92細胞(左パネルから4番目)またはCD45b-28 NK45i-92細胞(右パネル)らの共培養でのフローサイトメトリーによる解析。全パネル中の青い点は、共培養アッセイ後の残存した標的REH細胞を示し、赤色のドットは、共培養アッセイ後のエフェクターGFPまたはCARs-NK-92細胞を示す。インキュベーションタイムはすべて20時間であり、エフェクターNK細胞:標的細胞の比率は5:1である。全て重複実験で行った。 下の棒グラフは、REH細胞との共培養アッセイにおけるコントロールGFP NK92細胞と比較した、CD45CAR NK45i-92細胞、CD45b-BB NK45i-92細胞またはCD45b-28 NK45i-92細胞による細胞溶解率を示す。データは平均+ S.Dである。コントロールGFP NK-92細胞と比較して CD45CAR NK45i-92細胞は約76%の細胞を溶解し、CD45b-BB NK45i-92細胞は約79%の細胞溶解度を示し、CD45b-28 NK45i-92細胞は REH細胞に対して100%細胞溶解を示す。これらのデータは、GFP コントロールNK92細胞 と比較し3つの全てのCD45CARsがCD45を発現するB細胞とみなすREH細胞をインビトロ共培養アッセイにおいて効果的に溶解することを示唆している。
U937細胞(標的:T)およびGFP NK-92細胞またはCD45b-28 NK45i-92細胞と2:1(E:T)比率、20時間での共培養アッセイ。FA、U937細胞(単球白血病細胞株)のみ(左パネル)、U937細胞およびコントロールGFP形質導入NK-92細胞(中央パネル)またはCD45b-28 NK45i-92細胞(右パネル)との共培養におけるフローサイトメトリー分析。全パネル中の青い点は、残存する標的のU937細胞を示し、赤色ドットは、共培養アッセイにおけるエフェクターであるGFPまたはCD45b-28 NK45i-92細胞を示す。インキュベーション時間は6時間であり、エフェクターNK細胞:標的細胞の比率は2:1であった。 FB、棒グラフは、U937細胞との共培養アッセイにおけるCD45b-28 NK45i-92細胞による細胞溶解のパーセントを、コントロールGFP NK92細胞と比較して示す。 CD45b-28 NK45i-92は、コントロールGFP NK-92細胞と比較して、U937細胞に対する約81%の細胞溶解を示す。
MOLM-13細胞(標的:T)およびGFP NK-92細胞またはCD45b-28 NK45i-92細胞との5:1(E:T)比で20時間での共培養アッセイ。 GA、MOLM13細胞(単球白血病細胞株)のみ(左パネル)、 MOLM13細胞およびコントロールGFP形質導入NK-92細胞(中央パネル)またはCD45b-28 NK45i-92細胞(右パネル)との共培養におけるのフローサイトメトリー分析。全てのパネル中の青い点は、残存する標的MOLM13細胞を示し、赤色ドットは共培養アッセイによるエフェクターであるFPまたはCD45b-28 NK45i-92細胞を示す。インキュベーション時間は20時間であり、エフェクターNK細胞:標的細胞の比率は5:1である。 GB、棒グラフは、MOLM13細胞との共培養アッセイにおけるCD45b-28 NK45i-92細胞による細胞溶解のパーセントを、コントロールGFP NK92細胞と比較して示す。 CD45b-28 NK45i-92は、コントロールGFP NK-92細胞と比較して、MOLM13細胞に対して約91.6%の細胞溶解を示す。
Jeko-1細胞(標的:T)およびGFP NK-92細胞またはCD45b-28 NK45i-92細胞と2:1(E:T)比で6時間での共培養アッセイ。 HA、Jeko-1細胞(マントル細胞リンパ腫)のみ(左パネル)、Jeko-1細胞およびコントロールGFP形質導入NK-92細胞(中央パネル)またはCD45b-28 NK45i-92細胞(右パネル)との共培養によるフローサイトメトリー分析。全てのパネルの青い点は、残存する標的Jeko-1細胞を示し、赤色の点は、共培養アッセイでのエフェクターであるGFPまたはCD45b-28 NK45i-92細胞を示す。インキュベーション時間は6時間であり、エフェクターNK細胞:標的細胞の比は2:1であった。 HB、棒グラフは、Jeko-1細胞との共培養アッセイにおけるCD45b-28 NK45i-92細胞による細胞溶解のパーセントを、コントロールGFP NK92細胞と比較して示す。 CD45b-28 NK45i-92は、コントロールGFP NK-92細胞と比較して、Jeko-1細胞に対して約44.6%の細胞溶解を示す。
SP53細胞(標的:T)およびGFP NK-92細胞またはCD45b-28 NK45i-92細胞を2:1(E:T)比で6時間インキュベートする共培養アッセイ。IA、SP53細胞(マントル細胞リンパ腫細胞株)のみ(左パネル)、Jeko-1細胞およびコントロールGFP形質導入NK-92細胞(中央パネル)またはCD45b-28 NK45i-92細胞と共培養したフローサイトメトリー分析。全パネル中の青い点は、残存する標的SP53細胞を示し、赤色のドットは、共培養アッセイでのエフェクターであるGFPまたはCD45b-28 NK45i-92細胞を示す。インキュベーション時間は6時間であり、エフェクターNK細胞:標的細胞の比は2:1であった。IB、棒グラフは、SP53細胞との共培養アッセイにおいてCD45b-28 NK45i-92細胞による細胞溶解のパーセントを、コントロールGFP NK92細胞と比較して示す。 CD45b-28 NK45i-92は、コントロールGFP NK-92細胞と比較して、SP53細胞に対して約45%の細胞溶解を示す。
48時間の共培養におけるCD34(+)臍帯血幹細胞消滅ヒト臍帯血に由来するCD34(+)幹細胞を、コントロールまたはCD45b-28 CAR NK細胞のいずれかと48時間、2:1の低比率(エフェクター:標的)で標識する前に共培養した。 CD34(+) 細胞の約96%がコントロールと比較して消去された。
P2Aによって結びついている図はcCAR-Tおよび4-1BBLまたはIL-15 / IL-15sushiの両方が単一構造であることを示す。コンストラクトは、CARおよびエンハンサーである4-1BBLの発現を促進するSFFVプロモーターからなる。リンカーが開裂されると、CD45 CAR(またはCD45b CAR)および4-1BBLまたはIL-15 / IL-15sushが分裂し、CD45を発現する標的に関与する。 CD45 CAR T細胞は、CD28のみならず4-1BBリガンド(4-1BBLまたはCD137L)またはIL-15 / IL-15sushiを介した共刺激を受けた。 CD3-zetaシグナル伝達ドメインは、このCAR-Tのアセンブリを完了する。
フローサイトメトリー分析による、CD45b-28-2G-4-1BBL CAR形質導入NK45i-92細胞上の表面CD45b CAR発現レベルの決定。左パネル(NK92細胞)および中央パネル(GFP-NK92)は、ネガテイブコントロールであり、右パネルは、ScFv領域に対するヤギ抗マウスF(AB ')2-PEを用いて標識されたCD45b CARの表面発現を示した(青色の曲線で囲まれている)。形質導入された細胞は、細胞表面上に86.99%のCD45b-CARを発現した。
フローサイトメトリー分析による、CD45b-28-2G-IL15 / IL-15sushi CARを形質導入したNK45i-92細胞上の表面CD45b CAR発現レベルの決定。左パネル(NK92細胞)および中央パネル(GFP-NK92)はネガティブコントロールを示し、右および右パネルは、ScFv領域に対するヤギ抗マウスF(AB ')2-PEを用いて標識したCD45b CARの表面発現を示した(青色の曲線で囲まれている)。CD45b-28-2G IL15RA CD45b-28-2G-IL-15 / IL-15sushiウイルス形質導入細胞は、ネガティブコントロールと比較して細胞表面上にCD45b-CARを55.96%発現した。
TまたはNK細胞におけるコンストラクトおよびその発現を説明するための模式図。(59A) CAR(第3世代)およびIL-15アルファ受容体のIL-15/sushiドメインの組合せは、発現ベクター上にあり、それらの発現はSFFVプロモーターによって誘導される。 IL-15/sushiを含むCARは、P2A自己切断配列と結びついている。 IL-15/sushi部分は、IL-2シグナルペプチドがIL-15に融合された部位と構成され、26アミノ酸ポリ-プロリンリンカーを介してsushiドメインと連結される。(59B) CARおよびIL-15/sushiは、TまたはNK細胞上に存在する。
CD4IL-15 / IL-15sushiの発現。(60A) HEK-293FT細胞に、GFP(レーン1)およびCD4IL-15 / IL-15sushi CAR(レーン2)のレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、上清を除去し、マウス抗ヒトCD3z抗体を用いたウェスタンブロットのために細胞を回収した。(60B) トランスフェクトされたHEK-293FT細胞由来のGFP(左)またはCD4IL-15 / IL-15sushi-CAR(右)ウイルス上清のいずれかでHEK-293細胞に形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を採取し、ヤギ抗マウスF (Ab’) 2で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
CD4IL-15 / IL-15sus CARのNK細胞への形質導入。トランスフェクトされたHEK-293FT細胞由来のGFP(左)またはCD4 IL-15 / IL-15sushi CAR(右)ウィルス上清のいずれかでNK-92細胞に形質導入した。2回目の形質導入は最初の形質導入の24時間後に行われた。 2回目の形質導入の24時間に、細胞を回収し、洗浄し、新鮮な培地およびIL-2を含む組織培養プレートに移した。 3日間のインキュベーション後、細胞を採取し、ヤギ抗マウスF (Ab’) 2抗体またはヤギIgG(コントロール)を用いて1:250希釈で30分間染色した。細胞を洗浄し、ストレプトアビジン-PEコンジュゲートを用い、1:500で染色し、洗浄し、2%ホルマリンで懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。
CD4IL15RACAR(CD4IL-15 / IL-15sushi)のT細胞への形質導入。左はウェスタンブロットの結果です。 HEK-293FT細胞に、GFP(レーン1)およびCD4IL15RA-CAR(レーン2)のレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、上清を除去し、マウス抗ヒトCD3ゼータ抗体を用いたウェスタンブロットのために細胞を回収した。右はCD4IL15RACARの発現を示している。臍帯血バフィーコート由来の活性化したT細胞に、トランスフェクトされたHEK-293FT細胞由来のGFP(左)または濃縮CD4IL15RACAR(右)ウイルス上清のいずれかで形質導入した。 2回目の形質導入は、最初の形質導入24時間後に行った。 2回目の形質導入の24時間後、細胞を回収し、洗浄し、新鮮な培地およびIL-2を含む組織培養プレートに移した。 3日間のインキュベーション後、GFP(左)またはCD4IL15RA CAR(右)のいずれかを形質導入した細胞を回収し、ヤギ抗マウスF (Ab’) で染色した。細胞を洗浄し、ストレプトアビジン-PEコンジュゲートで1:500の希釈率で染色し、洗浄し、2%ホルマリンで懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。
CD4CAR NK-92細胞およびCD4IL-15 / IL-15sushi CAR NK-92細胞は、共培養においてKARPAS 299 T白血病細胞を殺傷する。(63A) GFPコントロール(右上)、CD4CAR(左下)、またはCD4IL-15 / IL-15sushi(右下)レンチウイルス上清のいずれかを形質導入したNK-92細胞を、5:1の比でKARPAS 299細胞と共にインキュベートした。 4時間の共培養後、細胞をマウス抗ヒトCD4(APC)およびCD3(PerCp)抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した(N = 2)。左上のパネルは、ラベルされたKarpas 299細胞のみを示す。溶解した標的細胞のパーセンテージをグラフに示す(63B)。
CD4CAR NK-92細胞およびCD4IL-15 / IL-15sushi CAR NK-92細胞は、共培養においてKARPAS 299 T白血病細胞を殺傷する。(63A) GFPコントロール(右上)、CD4CAR(左下)、またはCD4IL-15 / IL-15sushi(右下)レンチウイルス上清のいずれかを形質導入したNK-92細胞を、5:1の比でKARPAS 299細胞と共にインキュベートした。 4時間の共培養後、細胞をマウス抗ヒトCD4(APC)およびCD3(PerCp)抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した(N = 2)。左上のパネルは、ラベルされたKarpas 299細胞のみを示す。溶解した標的細胞のパーセンテージをグラフに示す(63B)。
CD4CAR NK-92細胞およびCD4IL-15 / IL-15sushi CAR NK-92細胞は、共培養においてMOLT4 T白血病細胞を殺傷する。 GFPコントロール(左)、CD4CAR(中央)、またはCD4IL-15 / IL-15sushi(右から2番目)レンチウイルス上清のいずれかで形質導入されたNK-92細胞を、MOLT4細胞とエフェクター:標的を1:1または2: 1の比率でインキュベートした。一晩の共培養後、細胞をマウス抗ヒトCD4(APC)およびCD56(PerCp)抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した(N = 2)。右上のパネルは、標識MOLT4細胞のみを示す。標的細胞の溶解率をグラフに示す。
CD4CARおよびCD4IL-15 / IL-15sushi CAR T細胞は、インビボで抗白血病効果を示す。 NSGマウスを致死量以下で照射し、測定可能な腫瘍形成を誘導する為、翌日に静脈内(尾静脈)にルシフェラーゼ発現MOLM13細胞を注射した (65A)。 MOLM-13細胞はほぼ100%CD4 +である。 3日後、マウスに1コースの8x10 6 CD4CAR、またはCD4IL-15 / IL-15sushi CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞を静脈注射した。 3、6、9、および11日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングにより解析した (65B)。
CD4CARおよびCD4IL-15 / IL-15sushi CAR T細胞は、インビボで抗白血病効果を示す。 NSGマウスを致死量以下で照射し、測定可能な腫瘍形成を誘導する為、翌日に静脈内(尾静脈)にルシフェラーゼ発現MOLM13細胞を注射した (65A)。 MOLM-13細胞はほぼ100%CD4 +である。 3日後、マウスに1コースの8x10 6 CD4CAR、またはCD4IL-15 / IL-15sushi CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞を静脈注射した。 3、6、9、および11日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングにより解析した (65B)。
(65C) ベクターコントロールT 細胞を注射したマウスとCD4CARおよびCD4IL-15/IL-15sushi T細胞を注射マウスについて測定した平均光強度を比較し、残りの腫瘍量と相関して溶解率を決定した。(65D) マウスの生存率を測定し、3つのグループ間で比較した。
(65C) ベクターコントロールT 細胞を注射したマウスとCD4CARおよびCD4IL-15/IL-15sushi T細胞を注射マウスについて測定した平均光強度を比較し、残りの腫瘍量と相関して溶解率を決定した。(65D) マウスの生存率を測定し、3つのグループ間で比較した。
CD4IL15 / IL-15sushi CAR NK細胞は、インビボでのストレス条件下において強力な抗白血病活性を示す。NSGマウスを致死量以下で照射し、測定可能な腫瘍形成を誘導する為に、翌日、ルシフェラーゼ発現Jurkat細胞をNSGマウスに静脈内(尾静脈)注射した (66A) 。ジャーカット細胞のCD4 +は60%未満のである。 3日後、マウスに、1コース、8x10 6 のCD4CAR、またはCD4IL-15 / IL-15 sushi CAR NK細胞、あるいはベクターコントロールNK細胞を静脈注射した。 3、7、10、および14日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングを行った (66B)。
CD4IL15 / IL-15sushi CAR NK細胞は、インビボでのストレス条件下において強力な抗白血病活性を示す。NSGマウスを致死量以下で照射し、測定可能な腫瘍形成を誘導する為に、翌日、ルシフェラーゼ発現Jurkat細胞をNSGマウスに静脈内(尾静脈)注射した (66A) 。ジャーカット細胞のCD4 +は60%未満のである。 3日後、マウスに、1コース、8x10 6 のCD4CAR、またはCD4IL-15 / IL-15 sushi CAR NK細胞、あるいはベクターコントロールNK細胞を静脈注射した。 3、7、10、および14日目に、マウスにRediJect D-Luciferinを皮下注射し、IVISイメージングを行った (66B)。
ベクターコントロールNK注射マウス とCD4CARおよびCD4IL-15 / IL-15sushi NK注射マウスでの平均光強度と比較し、残りの腫瘍量と相関して溶解率を定量した。
ベクターコントロールNK注射マウス とCD4CARおよびCD4IL-15 / IL-15sushi NK注射マウスでの平均光強度と比較し、残りの腫瘍量と相関して溶解率を定量した。
図66に記載したものと同様の結果を示すCD4I-15 / IL-15sushi CAR NK細胞によるJurkat腫瘍細胞の強力な溶解を実証するin vivoでの実験の繰り返し。
図66に記載したものと同様の結果を示すCD4I-15 / IL-15sushi CAR NK細胞によるJurkat腫瘍細胞の強力な溶解を実証するin vivoでの実験の繰り返し。
分泌されたIL-15 / IL-15sushiがCARおよび隣接する非形質導入細胞へ及ぼす影響。 CD4CARまたはCD4IL15RA(CD4IL-15 / IL-15sushi)のいずれかを安定に発現するNK-92細胞を、GFPを安定に発現するNK-92細胞と50:50の比率で混合した。これらの細胞を、IL-2を添加したものまたはIL-2を添加しなかった状態で共培養した。(68A) IL-2を添加しないで0日目(共培養の開始)および7日目に20倍率蛍光顕微鏡撮影した写真。 (68B) IL-2の共存下または非存在下で共培養したNK-92細胞において、実験全体を通して計算された総細胞数(14日目まで)。
分泌されたIL-15 / IL-15sushiがCARおよび隣接する非形質導入細胞へ及ぼす影響。 CD4CARまたはCD4IL15RA(CD4IL-15 / IL-15sushi)のいずれかを安定に発現するNK-92細胞を、GFPを安定に発現するNK-92細胞と50:50の比率で混合した。これらの細胞を、IL-2を添加したものまたはIL-2を添加しなかった状態で共培養した。(68A) IL-2を添加しないで0日目(共培養の開始)および7日目に20倍率で蛍光顕微鏡で撮影した写真。 (68B) IL-2の共存下または非存在下で共培養したNK-92細胞において、実験全体を通して計算された総細胞数(14日目まで)。
NK-92細胞増殖に対する分泌IL-15およびIL-15 / IL-15sushiの効果の比較。 CD4IL-15 / IL-15sushi、CD4 IL-15、およびコントロール形質導入NK-92細胞を、通常のNK細胞培地中で250, 000細胞からIL-2の非存在下で6日間培養した。 形質導入された両方の細胞は表面CAR発現が10%であったが、 CD4IL15-IL15sushi形質導入NK-92細胞は、6日目にCD4 IL-15で形質導入したNK-92細胞よりも約3倍高く増殖することができた。4日目で、CD4 IL-15により形質導入されたNK-92細胞の増殖は、コントロールよりもわずかに高かったが、CD4 IL-15 / IL15sushiにより形質導入されたNK-92細胞より有意に低かった。この研究は、NK-92細胞増殖の促進におけるIL-15 / IL-15sushiの共発現機能複合体の重要性を特定している。
Tregを標的とするTreg CAR Tコンストラクトを示す模式図。コンストラクトは、P2Aペプチドによって連結されたキメラ抗原レセプターの2つのユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。各ユニットは、CD45リーダーペプチド配列(シグナルペプチド)を含む。リンカーが開裂すると、ペプチドの2つのユニットが分割され、CD4およびCD25を発現する標的に関与する。 CD4キメラ抗原レセプターポリペプチドユニットは、シグナルペプチド、CD4抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメインおよびCD3ゼータ鎖を含む。 CD25キメラ抗原レセプターポリペプチドユニットは、シグナルペプチド、CD25抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン(単数または複数)を含む。 Treg CARは、CD4またはCD25抗原を有する細胞を最小限に抑えながら、CD4およびCD25を共発現する細胞の溶解活性を増強することができる。
CD4ゼータCD25 CARの特性評価。(71A) CD4ゼータCD25 CARは、48時間に及ぶウイルスインキュベーションを介してT細胞に形質導入され、F(ab)’抗体で染色されてCAR表面発現をアッセイした。線で囲まれた集団は、形質導入された細胞を表す。(71B) C4-25z CAR(CD4ゼータCD25 CAR、Treg CAR)は、構造機能を検証するためにCD4およびCD25抗体を用いて特性を評価した。最も関連性の高い2つの集団、すなわちCD4 + CD25+およびCD4- CD25+が囲まれている。二重陽性集団および他の表現型のグループの消失は、隣接する棒グラフに要約される。
CD4ゼータCD25 CARの特性評価。(71A) CD4ゼータCD25 CARは、48時間に及ぶウイルスインキュベーションを介してT細胞に形質導入され、F(ab)’抗体で染色されてCAR表面発現をアッセイした。線で囲まれた集団は、形質導入された細胞を表す。(71B) C4-25z CAR(CD4ゼータCD25 CAR、Treg CAR)は、構造機能を検証するためにCD4およびCD25抗体を用いて特性を評価した。最も関連性の高い2つの集団、すなわちCD4 + CD25+およびCD4- CD25+が囲まれている。二重陽性集団および他の表現型のグループの消失は、隣接する棒グラフに要約される。
CD4zetaCD25 CAR T細胞は、主にCD4およびCD25を共発現する細胞を標的とする。PMBCバフィコートT細胞を活性化し3日後、コントロールベクター(左)、CD4CAR(中央)またはCD4ゼータCD25(右)レンチウイルス上清のいずれかを形質導入し、その後、T細胞を採取し、マウス抗ヒトCD25-PEおよびマウス抗ヒトCD4-APC と30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、2%ホルマリン中に懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。
CD5CAR-52のコンストラクトを示す略図。コンストラクトは、CD5CARおよびCD52表面抗原の共発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。 P2Aのリンカーの開裂による。 CD5キメラ抗原レセプターポリペプチドユニットは、シグナルペプチド、CD5抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、CD28およびCD3ゼータ鎖の共刺激ドメインからなる。 CD5ペプチドは、シグナルペプチド、CD52抗原認識ドメイン(抗CD52 scFv)、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン(CD28由来)からなる。
液中のCD5CAR-52T細胞の消失を判定するための実験計画。NSGマウスを致死量以下で照射し、 CD5CAR-52T細胞(5×106細胞)を、各マウスに静脈内注射した。約24時間後、PBSまたは0.1mg / kgのCAMPATHをI.Pで投与(腹腔内注射)。 N = 3である。 6時間後および24時間後、末梢血を各マウスから採取し、CD3およびCD45の抗体を用いて標識して、CAMPATH処置による急性期応答として、CAR-T細胞の消失を判定した。 5日後、各マウスから全血を採取し、CAR-T細胞の持続性を判定するためにCD3およびCD45抗体を用いて標識した。フローサイトメトリー分析を用いてCAR-T細胞を定量した。
CAMPATH処置の有無による、6時間後および24時間後の末梢血中のCD5CAR-52 Tの消失。フローサイトメトリー分析は、CAMPATH処置の有無による、マウスの末梢血におけるCD5CAR-52T細胞(青色のドット)の持続性を示す。血液試料をCD3およびCD45の抗体で標識して、CD5CAR-52T細胞を検出した。CAR-T細胞の未注入(左パネル)での血液サンプルは、CD3およびCD45陽性細胞を示さなかった(ネガティブコントロール)。 0.1mg / kgの CAMPATHを注射したマウスは、6時間(左から2番目のパネル)および24時間(右から2番目のパネル)後のCAMPATH未処置マウスと比較して、6時間(中央のパネル)および24時間(右のパネル)後で血液中からCD5CAR-52 T細胞が消失した。 N = 3である。これらの結果は、CAMPATH処置が短時間の間に血液からCAR-T細胞を除去できることを示唆している。
CAMPATH処置の有無による5日後の、全血におけるCD5CAR-52 Tの消失。フローサイトメトリー分析は、CAMPATH処置の有無による、マウスの全血サンプルにおけるCD5CAR-52T細胞(青色のドット)の持続性を示す。血液試料をCD3およびCD45の抗体で標識して、CD5CAR-52 T細胞の持続性を検出した。CAR-T細胞の未注入(左パネル)からの血液サンプルはCD3およびCD45陽性細胞を示さなかった(ネガティブコントロール)。 0.1mg / kgのCAMPATH処置マウスは、5日後の全血試料中においてCAMPATH非注射マウス(中央パネル)と比較して、CD5CAR-52T細胞が消失した(右パネル)。これらの結果から、また、CAMPAT治療がCAR-T細胞を血液から除去できると期待される。
それぞれ示された容量を用いて、HEK293細胞にEF1-GFPまたはSFFV-GFPウイルス上清のいずれかで、6ウェル組織培養プレートを用い、10%FBSを含むDMEM中で形質導入した。培地は翌交換された。形質導入48時間後に細胞を10倍率でGFPによりEVOS蛍光顕微鏡で可視化した。
前の図の容量を使用して、EF1-GFPまたはSFFV-GFPウイルス上清のいずれかを形質導入したHEK293細胞をトリプシン処理し回収し、ホルマリン中に懸濁させ、FITCチャネルを用いたフローサイトメトリー分析によりGFP +細胞の割合を同定した。
低用量あるいは高容量のEF1-GFPまたはSFFV-GFPウイルス上清のいずれかを用い形質導入した活性化された臍帯血バフィーコートT細胞を、形質導入後7、14、21および28日後のGFP +細胞の割合を測定するため、トリプシン処理し、細胞をホルマリン中に懸濁させ、FITCチャネルを用いてフローサイトメトリーにより解析した。(76A) 低または高用量のウイルス上清のいずれかで形質導入された細胞についてのGFP + T細胞の割合。(76B) 高用量のEF1-GFP上清で形質導入されたGFP + T細胞の割合と少量のSFFV-GFP上清で形質導入されたT細胞におけるGFP +細胞のパーセントとの比較。(50μLのSFFV-GFPおよび1mLのEF1-GFP上清を使用した)。(N=2) 。
悪性形質細胞におけるリガンド受容体相互作用APRILリガンドは、TAC1またはBCMAに結合する。BAFFリガンドは、TAC1、BCMA、またはBAFF-Rに結合する
分泌IL-15/IL-15sushi を共発現するCARによる腫瘍の除去のステップ。78A、腫瘍およびその微小環境。腫瘍微小環境において、マクロファージ、T細胞、樹状細胞およびNK細胞は、腫瘍に対する免疫応答細胞であり、それらは可溶性細胞外ドメインのIL-15RAと複合体を形成する低レベルの不安定な内在性IL-15を分泌する。この複合体はより安定な分子を形成し、免疫細胞の生存および増殖を大きく促進する。腫瘍微小環境において、癌細胞は、癌を含む特定の事象中に免疫系を抑制するのに主要な役割を果たすと考えられている膜貫通タンパク質であるプログラム細胞死リガンド-1(PD-L1)を発現する。 PD-L1は、活性化T細胞、B細胞、および骨髄細胞上に見いだされるその受容体PD-1に結合し、これらの細胞免疫活性を抑制する。78B、CAR TまたはNK細胞は、腫瘍微小環境にエンハンサーを運ぶための担体であり得る。 CAR TまたはNK細胞は、分泌型融合タンパク質であるIL-15/IL-15sushi融合体を共発現するように設計される。 78C、操作されたCAR TまたはNK細胞は、標的腫瘍細胞(サブセットまたはすべての細胞のいずれか)に結合する。 78D、腫瘍微小環境におけるCAR TまたはNK細胞の癌細胞への標的化、CAR標的抗原への結合、および腫瘍細胞の溶解および増殖したCAR TまたはNK細胞から可溶性IL-15/IL-15sushi 融合の大量分泌の誘発。可溶性IL-15/IL-15sushi融合物は安定であり、CAR T / NK細胞およびそれらの隣接腫瘍免疫応答細胞への予期せぬ強力な免疫調節として機能する。分泌されたIL-15/IL-15sushiタンパク質は、他のT細胞、樹状細胞、マクロファージおよびNK細胞の腫瘍微小環境への輸送に関与し、これは、1)CAR TまたはNK細胞が非標的化癌細胞を排除できないという欠陥を補うことによって腫瘍細胞を溶解する。2)CAR T / NK細胞の持続性および抗腫瘍活性を増強する。 IL-15/IL-15sushi の過剰発現は、免疫応答を抑制するPD-L1能力を圧倒する。好ましくは、このCAR療法は、PD-L1、CTLA-4阻害剤を含むがこれに限定されないチェックポイント阻害剤の投与と相乗的に使用して、より有効性を増すことができる。
B細胞から形質細胞への成長時の表面マーカーが示されている。 BAFFおよびAPRILの両方が受容体、BCMAおよびTACIに結合する。 BAFFはBAFF-R受容体にも結合する。
IL-2シグナルペプチドの異なる種間でのタンパク質配列アライメント
BAFF細胞外ドメインの異なる種間でのタンパク質配列アライメント。
IgE産生およびアレルギー性炎症のモデル。IgE抗体は、活性化されたB細胞から最初に産生され、IgE形質細胞に分化する。 IgEは形質細胞から放出され、マスト細胞好塩基球または好酸球に存在するFceR1受容体複合体に結合し、アレルギー性メディエーターの放出を引き起こす。 CARは、IgEを産生する形質細胞およびアレルギー性メディエーター放出の原因である好塩基球または好酸球を標的または消去するように設計できる。
FcER1A CARコンストラクトの構成。 FcER1A CARコンストラクトには、リーダー配列、FcER1Aの細胞外ドメイン、ヒンジドメイン(H)、膜貫通ドメイン(TM)、共刺激ドメイン(CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない)および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータを含む。
異なる種間でのFcER1A細胞外ドメインのタンパク質配列アラインメント。ターゲットは、FcER1Aの表面露出領域の一部を含んでもよい。
FcER1A CARは、IgE産生細胞であるU266形質細胞を標的にして溶解する。コントロールとFcER1A CAR T細胞を、5:1のE:T比でBCMAに対して厳密に陽性である骨髄腫細胞株-U266(Celltracker CMTMRで事前に染色)とインキュベートした。共培養は、48時間でのインキュベーションタイムで、分析用にCD3およびBCMA抗体を使用したflow cytometry acquisitionでセットアップした。青い集団はBCMA + U266細胞を示す。
抗FcER1AまたはFcER1複合体CARコンストラクトの構成。 FcER1AまたはFcER1複合体CARコンストラクトは、リーダー配列、FcER1AまたはFcER1複合体に対するscFv、ヒンジドメイン(H)、膜貫通ドメイン(TM)、共刺激ドメイン(CD28または4-1BBが含まれるが、これらに限定されない)および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータを含む。
cCARコンストラクトの概略図。コンストラクトは、P2A切断ペプチドによってリンクされたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターが含まれる。 P2Aリンカーが開裂すると、cCARは分かれ、CD19および/またはCD123を発現する標的に結合する。 CARの各ユニットは、抗原に対するscFv、ヒンジドメイン(H)、膜貫通ドメイン(TM)、共刺激ドメイン(CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない)および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータチェーンを保有する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインには、CD19 CARセグメント上の4-1BBおよびCD123 CAR上のCD28領域が含まれえるが、これらに限定されない。
CAR発現:CD19b-123-2G。末梢血単核細胞に、コントロールベクター(中央)またはCD19b CD123-2G(cCAR)CARレンチウイルスベクター(右)のいずれかを形質導入した。回復の48時間後、CAR表現型を検出するために、細胞を抗マウスF(Ab’)2-ビオチン抗体で標識した。形質導入されなかった活性化T細胞は左側に示されている。
共培養:CD19bCD123 CAR T対KG1-a、16/48時間。 CD19bCD123-2G cCARは、共培養アッセイでCD123発現KG1-腫瘍細胞株を消去できる。共培養実験は、エフェクター対標的比5:1で16時間と48時間で行われ、マウス抗ヒトCD3pPerCpとマウス抗ヒトCD123-APCのフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイには、ターゲット細胞(KG1-a)対コントロール(左)、cCAR(中央)、T細胞、またはターゲット細胞のみ(右)が含まれる。 N = 2。
共培養:CD19bCD123 CAR T対K562-CD19xp、16/48時間。 CD19bCD123-2G cCARは、共培養アッセイでCD19を発現するK562腫瘍細胞株を消去できる。共培養実験は、エフェクター対標的比5:1で16時間と48時間で行われ、マウス抗ヒトCD3pPerCpとマウス抗ヒトCD19-PEのフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイには、ターゲット細胞(CD19抗原を人工的に発現させたK562腫瘍細胞)対コントロール(左)、cCAR(中央)、T細胞、またはターゲット細胞のみ(右)が含まれる。 N = 2。
共培養:CD19bCD123 CAR T対SP53、16時間。 CD19bCD123-2G cCARは、共培養アッセイでCD19発現SP53マントル細胞リンパ腫細胞株を消去することができる。共培養実験は、エフェクター対標的比5:1で16時間行い、マウス抗ヒトCD3pPerCpおよびマウス抗ヒトCD19-PEのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイには、ターゲット細胞(SP53)対コントロール(左)、またはcCAR(中央)、T細胞、またはターゲット細胞のみ(右)が含まれる。 N = 2。
CD19b-CD123 cCARマウスは、AML腫瘍モデルで腫瘍の成長を効果的に制御できます。 NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、24時間後に1 x 10 6個のルシフェラーゼ発現MOLM-13細胞を静脈内注射し(1日目)、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍注射の3日後、マウスにコントロールまたはCD19b-CD123 CAR T細胞の10 x 106細胞を注射した。 6、8、11日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。腫瘍強度は、ルシフェリンシグナル(光子/秒)として定量化される。
CD19bCD123 CAR T細胞は、in vivoマウスモデル生存曲線でMOLM13腫瘍細胞を溶解する。MOLM13腫瘍細胞を注射したNSGマウスは、CD19b-CD123 CAR T細胞で治療した場合、有意に長く生存する。測定可能な腫瘍形成を誘発するためにMOLM13細胞を静脈内注射した致死量未満の照射を受けた10匹のNSGマウスのうち半分には3日後にCD19b-CD123 CAR T細胞を静脈内注射し、残りの半分にはベクターコントロールT対照細胞を注射した。前述されたIVISイメージング実験の後、重度病気の症状についてマウスを毎日観察し、動きが大きく損なわれると安楽死させた。すべてのコントロールマウスは18日目までに死亡したが、CD19b-CD123 CAR T処置マウスはコントロールマウスよりも15日まで長く生存した(図84B)。グループ間のこの違いは、Mantel-Cox検定(0.0031)およびGehan-Breslow-Wilcoxon検定(P = 0.0043)で有意であることが示された。
CD19bCD123 CAR T細胞は、in vivoマウスモデルでREH腫瘍細胞を溶解する。 CD19bCD123 CAR T細胞は、in vivoで長期に渡り抗腫瘍効果を示す。 NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、1.0 x 10 6個のルシフェラーゼ発現REH細胞を静脈内注射して(0日目)、測定可能な腫瘍形成を誘導させた。腫瘍細胞の注射の3日後に開始し、マウスに1コース10 x 106 個のCD19bCD123 CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞を静脈内注射した。マウスに16日目にRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。
cCAR-Tコンストラクトを示す概略図。コンストラクトには、P2A自己切断ペプチドによってリンクされたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFV強力なプロモーターが含まれる。リンカーが開裂すると、cCARは別れ、BCMA(CD269)および/またはCD19bを発現する標的に結合する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインには、BCMA CARユニット上の4-1BBおよびCD19b CARユニット上のCD28領域が含まれ得るが、これらに限定されない。
cCAR、CD19b-BB-2G、CD269-2Gレンチウイルスベクターで形質導入されたT細胞の形質導入効率。 CARレンチウイルスで形質導入された末梢血由来T細胞の発現。末梢血T細胞は、コントロールベクター、CD269CD19b-2G(cCAR)、CD269-2GまたはCD19b-BB-2G CARレンチウイルスベクターのいずれかで形質導入される。レンチウイルスベクターのCD269CD19b-2Gには、CD269およびCD19抗原の両方を標的とするCD269-2GおよびCD19b-BB-2Gの2ユニットのCARが含まれている。回復の48時間後、CAR表現型を検出するために、細胞を抗マウスF(Ab’)2-ビオチン抗体で標識した。パネル1(左)には、形質導入されていない細胞が含まれる。パネル2(左から2番目)はCD269-CD19b-2G cCAR T細胞を示し、パネル3(右から2番目)および4(右端)はCD269-2G CARおよびCD19b-BB 2G CAR T細胞の発現データを示す。
BCMA-CD19b cCAR T細胞は、CD19発現K562細胞を溶解する。共培養実験は、エフェクター対標的比5:1で16時間行い、マウス抗ヒトCD3pPerCpおよびマウス抗ヒトCD19-PEのフローサイトメトリーにより直接分析しました。各アッセイは、コントロールT細胞(左端)、cCAR(左から2番目)、BCMA-2G CAR(右から2番目)、またはCD19b-BB-2G CAR(右端)T細胞のいずれかと標的細胞(人工的にCD19抗原を発現するK562腫瘍細胞(K19)を含む共培養。標的細胞のみ(K-19xp)が下部に示されているN = 2。
BCMA-CD19b cCAR T細胞はBCMA発現K562細胞を溶解する。共培養実験は、エフェクター対標的比5:1で16時間行い、マウス抗ヒトCD3pPerCpおよびマウス抗ヒトBCMA-APCのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイには、標的細胞(BCMA抗原を人工的に発現するK562腫瘍細胞(k-BCMA)と、Control(左から2番目)、cCAR(左から2番目)、CD269-2G CAR(右から2番目)、CD19b-BB-2G CAR (右から遠い)T細胞のいずれかを含む。標的細胞のみ、BCMA-K(下)、N = 2。
CARは、自身の標的エピトープのみを特異的に溶解する。 BCMA-CD19b cCAR T細胞が野生型K562細胞を溶解しないことを示す図。共培養実験は、エフェクター対標的比5:1で16時間行い、マウス抗ヒトCD3pPerCpおよびマウス抗ヒトBCMA-APCのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイには、標的細胞(CD19抗原を発現しないK562野生型腫瘍細胞(A)、CD269抗原(B)、またはwt(C)対コントロール(左端)、cCAR(左から2番目)、CD269-2G(中央)、CD19b-BB-2G CAR(右から2番目)T細胞を含む。標的細胞のみ(K562野生型、右端)N = 2。
BCMA-CD19b cCARは、CD19およびBCMAの人工抗原を発現するK562細胞の混合を、〜E:T = 5:2で溶解する。コントロールおよびBCMA-CD19b cCAR細胞を、CD19(K-19)またはBCMA(K-BCMA)のいずれかを発現するK562細胞とインキュベートした。 K-19およびK-BCMA細胞を1:1の比率(105:105細胞)で混合し、次にコントロールまたはT細胞を最終のE:T比率が5:2となるよう加えた。培養物を24時間および48時間インキュベートし、CD3、BCMA、およびCD19抗体を使用して、フローサイトメトリーにより、培養中の残留標的抗原集団を定量した。紫色の集団はBCMA-CD19 + CD3- K-19細胞を示し、青緑の集団はBCMA + CD19-CD3- K-BCMA細胞を表す。 N = 2。
BCMA-CD19b cCAR T細胞は、BCMA +多発性骨髄腫細胞株MM1Sを溶解できる。コントロールおよびBCMA-CD19b CAR細胞をBCMAに対して厳密に陽性である骨髄腫細胞株-MM1Sと5:1のE:T比でインキュベートした。共培養は、24及び48時間でのインキュベーションタイムでセットアップし、CD3およびBCMA抗体を使用したしたflow cytometry acquisitionで分析した。紫色の集団はBCMA + MM1S細胞を示す。 N = 2
BCMA-CD19b cCARはMM1Sを高効率で溶解する。コントロール、CD19bおよびBCMA-CD19b CAR細胞を骨髄腫細胞株-MM1S(Celltracker(CMTMR)で予め染色、E:T比2:1および5:1でBCMAに対して厳密に陽性である)とインキュベートした。共培養は、48時間でのインキュベーションタイムでセットアップし、CD3およびBCMA抗体を使用したflow cytometry acquisitionで分析した。青色の集団はBCMA + MM1S細胞を表す。
BCMA-CD19b cCARは、RPMI-8226多発性骨髄腫細胞を高効率で溶解する。コントロール、CD19bおよびBCMA-CD19b CAR細胞を、2:1および5:1のE:T比でBCMAに厳密に陽性である骨髄腫細胞株RPMI-8226(Celltracker CMTMRで事前に染色)とともにインキュベートした。共培養は、48時間のインキュベーションタイムでセットアップし、CD3およびBCMA抗体を使用したflow cytometry acquisitionで分析した。青い集団はBCMA + RPMI-8226細胞を表す。
BCMA-CD19b cCARは、高効率でU266を溶解する。コントロール、CD19bおよびBCMA-CD19b CAR細胞は、2:1および5:1のE:T比でBCMAに厳密に陽性である骨髄腫細胞株U266(Celltracker CMTMRで予め染色)とインキュベートした。共培養は、48時間のインキュベーションタイムでセットアップし、CD3およびBCMA抗体を使用したflow cytometry acquisitionで分析した。青い集団はBCMA + U266細胞を表す。
BCMA-CD19b cCAR T細胞は、混合腫瘍集団、骨髄腫細胞およびB-ALL細胞を溶解できる。コントロールおよびBCMA-CD19b CAR細胞をCD19 + REHREH細胞とBCMA + RPMI-8226細胞の混合物と共にインキュベートした。共培養は、E:T比を増やし、24時間のインキュベーションタイムでセットアップし、CD3、CD19、およびBCMA抗体を使用したflow cytometry acquisitionで分析した。紫色の集団はBCMA + RPMI-8226細胞、青色の集団はREHREH細胞を表す。 N = 2。 BCMA-CD19b cCAR T細胞は、自己免疫疾患に関連する形質細胞およびB細胞集団を消去するために使用できる。
BCMA-CD19b cCAR T細胞は、混合腫瘍集団、骨髄腫細胞およびB-ALL細胞を溶解できる。コントロールおよびBCMA-CD19b CAR細胞をCD19 + REH細胞と少数のBCMA + RPMI-8226細胞の混合物とともにインキュベートした。共培養は、E:T比を増やし、48時間のインキュベーションタイムでセットアップし、CD3、CD19、BCMA抗体を使用したflow cytometry acquisitionで分析した。紫色の集団はBCMA + RPMI-8226細胞、青色の集団はREH細胞を表す。 N = 2。 REH(REH)はCD19 + B-ALL細胞株で、RPMI-8226はBCMAを発現する骨髄腫細胞株である。
CD269-CD19b cCAR T細胞は、原発性骨髄腫細胞MM7-Gを標的にすることができる。 BCMA-CD19b cCARは、原発性骨髄腫細胞MM7-Gを溶解する。コントロールおよびBCMA-CD19b CAR細胞をBCMA + MM7-G原発性骨髄腫細胞サブセットとともにインキュベートした。 MM7-G細胞はCMTMR Celltracker色素で事前に染色された。共培養は、2:1および5:1のE:T比で24時間のインキュベーションタイムで、CD3およびBCMA抗体を使用したflow cytometry acquisitionで解析した。丸で囲まれた集団はBCMA + MM7-G細胞を表す。 CD19bおよびBCMAシングルCARとの比較が提示される。
BCMA-CD19b cCARマウスは、混合腫瘍集団の成長を制御できる。 BCMA-CD19b cCARは、in vivoで混合抗原腫瘍細胞集団を溶解する。 NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、24時間後に、1×106個のルシフェラーゼ発現CD19 + REHおよびBCMA + MM1S細胞を含む1:1混合液を静脈内注射して(1日目)、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍注射の3日後、マウスに10×106個のコントロール、BCMA-CD19b cCAR T細胞のいずれかの細胞を注射した。 6、8、11日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。腫瘍強度は、ルシフェリンシグナル(光子/秒)として定量化される。
BCMA-CD19b cCARマウスは、混合腫瘍集団の成長を制御できる(腹側)。 BCMA-CD19b cCARは、in vivoで混合抗原腫瘍細胞集団を溶解する。 NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、24時間後に、1×106個のルシフェラーゼ発現CD19 + REHおよびBCMA + MM1S細胞を含む1:1混合液を静脈内注射して(1日目)、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍注射の3日後、マウスに10 x 106個のコントロール、CD269-CD19b cCAR、T細胞のいずれかを注射した。 6、8、11日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。腫瘍強度は、ルシフェリンシグナル(光子/秒)として定量化される。
BCMAおよびCS1(BC1cCAR)の2つのCARユニットを持つ、cCAR-Tコンストラクトの模式図。コンストラクトには、P2Aペプチドによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターが含まれている。リンカーが開裂すると、cCARは別れ、BCMA(CD269)および/またはCS1(CD319またはSlamf7)を発現する標的に結合する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインには、 BCMACARとCS1 CARの両方のセグメントと上で4-1BBが含まれえるが、これに限定されない。 cCARのBCMA CARユニットは、BCMA-A7D-28-2G CARとBCMA-C11D-28-2G CARのいずれかのグループから選択できる。 cCARのCS1 CARユニットは、CS1-mu34-28-2G CAR、CS1-mu90-28-2G CAR、およびCS1-hu63-28-2G CARのいずれかのグループから選択できる。
BCMA-CS1 cCAR T細胞の持続性と腫瘍減少の分析。compound CAR(BCMA-CS1 cCARが作製され、その機能が上記で特徴付けられた(図24から29)。潜在的な抗原逃避または複数の抗原腫瘍集団のモデルを作るために、致死量以下の照射したNSGマウスにBCMAまたはCS1のいずれかを発現するルシフェラーゼ発現K562細胞を静脈内に注射した異種マウスモデルを設計した。BCMAおよびCS1発現K562細胞(BCMA-K562およびCS1-K562)は、ピューロマイシンセレクション後の発現でさらに選別され、安定した均質な単一抗原集団として確立された。BCMAとCS1を発現するK562細胞は注射前にそれぞれ4:1の比率で混合され、潜在的な抗原エスケープとしてモデル化した。BCMAおよびCS1発現するK562細胞は、全血および肝臓組織サンプルは、屠殺時にCS1-K562実験グループのマウスから採取され、CD3、CD45 、CS1抗体を使用して、腫瘍およびCAR T細胞の残留性スクリーニングする。このような代表的な2つの流れ図を示す。 すべてのコントロールと cCARマウスは、それぞれの治療グループで各マウスで同じ傾向を示した(n = 19)。T細胞集団が多く、腫瘍集団がみられないcCAR処置(図89B)と比較した場合、コントロールマウスは、T細胞集団が非常に少ないかまったくないといったT細胞の残存が少なく(青)、見かけ上のCS1-K562腫瘍集団(紫色)を示た。 BCMA-K562実験グループについても同様の実験条件と採取が行われ、cCAR処置マウスで腫瘍の消去とT細胞の持続性の同様の傾向が観察された(図89C)。
BCMA-CS1 cCAR T細胞の持続性と腫瘍減少の分析。compound CAR(BCMA-CS1 cCARが作製され、その機能が上記で特徴付けられた(図24から29)。潜在的な抗原逃避または複数の抗原腫瘍集団のモデルを作るために、致死量以下の照射したNSGマウスにBCMAまたはCS1のいずれかを発現するルシフェラーゼ発現K562細胞を静脈内に注射した異種マウスモデルを設計した。BCMAおよびCS1発現K562細胞(BCMA-K562およびCS1-K562)は、ピューロマイシンセレクション後の発現でさらに選別され、安定した均質な単一抗原集団として確立された。BCMAとCS1を発現するK562細胞は注射前にそれぞれ4:1の比率で混合され、潜在的な抗原エスケープとしてモデル化した。BCMAおよびCS1発現するK562細胞は、全血および肝臓組織サンプルは、屠殺時にCS1-K562実験グループのマウスから採取され、CD3、CD45 、CS1抗体を使用して、腫瘍およびCAR T細胞の残留性をスクリーニングする。このような代表的な2つの流れ図を示す。 すべてのコントロールと cCARマウスは、それぞれの治療グループで各マウスで同じ傾向を示した(n = 19)。T細胞集団が多く、腫瘍集団がみられないcCAR処置(図89B)と比較した場合、コントロールマウスは、T細胞集団が非常に少ないかまったくないといったT細胞の残存が少なく(青)、見かけ上のCS1-K562腫瘍集団(紫色)を示た。 BCMA-K562実験グループについても同様の実験条件と採取が行われ、cCAR処置マウスで腫瘍の消去とT細胞の持続性の同様の傾向が観察された(図89C)。
CARレンチウイルスを形質導入した末梢血由来T細胞の発現。末梢血T細胞にコントロールベクター(右下)、BCMA-A7D-28-2G、BCMA-C11D-28-2G、CS1-mu34-28-2G、CS1-mu90-28-2GまたはCS1-hu63-28-2G CARレンチウイルスベクターのいずれかを形質導入した。回復の48時間後、CAR表現型を検出するために、細胞を抗マウスF(Ab’)2-ビオチン抗体で標識した。左上には、形質導入されていない細胞が含まれている。中央上部および右端のパネルはそれぞれBCMA-A7D-2GおよびBCMA-C11D-2G CAR T細胞を示し、下の右2番目および右端はそれぞれCS1-mu34、CS1-mu90およびCS1-hu63 CAR Tの発現データを示す。
CD123 または CD33 または両方の抗原を標的とする CD123b-CD33b cCAR、cCAR-Tコンストラクトの概略図。コンストラクトには、P2Aペプチドによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターが含まれてる。リンカーが開裂すると、cCARは分かれ、C123および/またはCD33を発現する標的と結合する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインには、CD123 CARユニット上の4-1BBおよび33b CARユニット上のCD28が含まれ得るが、これらに限定されない。
CD123bCD33b CAR T細胞の発現。 PMBCバフィーコートT細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞にコントロールベクター(中央)またはCD123b CD33b CAR(右)レンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用にラベル付けした。活性化前のPMBC(左)も、形質導入細胞と同じ方法で同じ抗体で同じ手順で標識された。
CD123bCD33b CAR T細胞は、共培養アッセイでCD33発現MOLM13腫瘍細胞株を消去できる。共培養実験は、エフェクターと標的の比率2:1または5:1で16時間行われ、CD33およびCD3のフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイには、MOLM13標的細胞とコントロール(左)、CD123bCD33b CAR T細胞(中央)および標的細胞のみ(右)が含まれる。右下のプロットは、MOLM13細胞のCD33およびCD123表現型を示す。
CD123bCD33b CAR T細胞は、共培養アッセイでCD33発現U937腫瘍細胞株を消去することができる。 CD123bCD33b-2G CAR T細胞はCD33 + / CD123- U937細胞を消去させる。共培養実験は、エフェクターと標的の比率2:1または5:1で16時間行われ、CD33およびCD3のフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイには、U937標的細胞とコントロール(左)、CD123bCD33b CAR T細胞(中央)および標的細胞のみ(右)が含まれる。右下のプロットは、U937細胞のCD33およびCD123表現型を示す。
CD123bCD33b CAR T細胞は、共培養アッセイでCD33とCd123を発現するAML患者細胞(PT-1)を消去することができる。共培養実験は、エフェクターと標的の比率が2:1と5:1で24時間行われ、CD3とCD33のフローサイトメトリーによって直接分析された。アッセイには、AML患者細胞対コントロール(左)、CD123 CD33 CAR T細胞(中央)および標的細胞のみ(右端)が含まれる。
CD123bCD33b CAR T細胞は、共培養アッセイでCD123とCD19を発現するB-ALL患者細胞(PT-2)を消去することができる。 B-ALL14-BM(PT2)。共培養実験は、エフェクターと標的の比率2:1で24時間行われ、CD3およびCD123のフローサイトメトリーによって直接分析された。アッセイには、B-ALL患者細胞対コントロール(左)、CD123 CD33 CAR T細胞(中央)および標的細胞のみ(右端)が含まれる。
CD123-CD33-28-2G cCAR(cCAR)T細胞は、CD33発現標的細胞を選択的かつ強力に溶解できる。 CD123b-CD33b-28-2G がCD33特異的集団を消去。 (A)cCAR T細胞を、CD33を発現するように形質導入されたT-ALL細胞株Jurkatとともにインキュベートした。CD33を発現するJurkat(Jurkat xp33)はJurkat集団全体のごく一部を構成するが、コントロールと比較し、cCAR T細胞は24時間培養後、 2:1のE:T比でも、CD33陰性Jurkate細胞ではなくCD33を発現する標的細胞を完全に消去することができた。 CD33 +Jurkate細胞の枯渇を示すフロープロット(紫色)。Jurkate細胞はサイトトラッカー(CMTMR-PE)で予め標識されている。 (B)cCAR処置(ピンク)対コントロール(灰色)後のCD33 +細胞集団の消失のヒストグラム視覚化。 (C)共培養後のcCARによるCD33 + Jurkat細胞溶解のグラフによる要約。
CD123b-CD33b-2G cCAR T細胞はCD34 + AML白血病芽球を消去させる。白血病性芽球は、CD34発現に対してゲートされ、その後、集団は%gatedの割合として示された。 AML-18-G細胞(ヒトAMLサンプル)は、ほぼ独占的にCD34 +白血病芽球であった。原発性AML CD34 +バルク疾患の消去は、FACSを介して分析された。 N = 2
CD123b-CD33b-2G cCAR T細胞は、ヒト白血病幹細胞(AML-18-G初代細胞)を消去させる。白血病幹細胞は、最初にCD34発現についてゲートされ、次に集団が隔離され、CD34およびCD38発現において分析された。ゲーティングにより、CD34陽性集団の両方のタイプ、CD34 + CD38-およびCD34 + CD38 +は、残存細胞の合計%で分析されるように、cCARによって本質的に消去されることが明らかとなった。 CD34 + / CD38-白血病幹細胞は特に消去された。
CD123b-CD33b-2G cCAR T細胞は、CD123を発現しているヒトB-ALL初代細胞を標的にして消去することができる。 CD19CAR再発の場合のCD34 + / CD123 +白血病細胞の枯渇。初代B-ALL細胞の消去をテストするために、CD123b-CD33b-2G cCARコンストラクトを使用して共培養を実施した。共培養は、さまざまなE:T比(2:1および5:1および10:ここに示す)で行われ、集団分析のために抗体の組み合わせで染色された。 CD34、CD38、CD33、CD123、およびCD19マーカーを分析し、CD19CAR治療後のB-ALL再発の可能性がある細胞を隔離し、フローサイトメトリーによりCD34 + / CD123 +でもあったCD19 +細胞とCD19-細胞の混合物(青で囲んだ)として示した。cCAR T細胞によるこの集団の枯渇は図に示されている。ピンクの集団はCD34 +細胞を表すが、CD123、CD19、CD33については同時に陰性である。 N = 2
腫瘍細胞の消去におけるCD123b-CD33b-2G cCAR T細胞の顕著な効果。共培養は、0.25:1エフェクター:標的細胞から10:E:T比までE:T比を増加させて設定された。共培養物を一晩インキュベートし、サイトトラッカー(CMTMR色素)で事前に標識して、エフェクター細胞から腫瘍集団を隔離した。標的腫瘍細胞の消去を測定するために、フローサイトメトリー分析を実施した
CD123b-CD33b CAR T細胞は、CD33抗原を発現する細胞株に対してin vivoで抗腫瘍効果を示す。 NSGマウスに致死量以下の照射を行い、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現U937細胞を静脈内注射し(0日目)、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の3日後に開始し、マウスに10 x 106 個のCD123b-CD33b CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞のコースを静脈内注射した。 3日目と6日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。 (91L)背面図; (91M)腹側図。
CD123b-CD33b CAR T細胞は、CD33抗原を発現する細胞株に対してin vivoで抗腫瘍効果を示す。 NSGマウスに致死量以下の照射を行い、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現U937細胞を静脈内注射し(0日目)、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の3日後に開始し、マウスに10 x 106 個のCD123b-CD33b CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞のコースを静脈内注射した。 3日目と6日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。 (91L)背面図; (91M)腹側図。
CD123b-CD33b CAR T細胞は、CD33とCD123抗原の両方を発現する細胞株に対してin vivoで抗腫瘍効果を示す。 NSGマウスに致死量以下の照射を行い、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現U937細胞を静脈内注射し(0日目)、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の3日後から、マウスに10 x 106 個のCD123bCD33b CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞のコースを静脈内注射した。 3日目と6日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。 (91N)背面図 (91O)腹側図。
CD123b-CD33b CAR T細胞は、CD33とCD123抗原の両方を発現する細胞株に対してin vivoで抗腫瘍効果を示す。 NSGマウスに致死量以下の照射を行い、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現U937細胞を静脈内注射し(0日目)、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の3日後から、マウスに10 x 106 個のCD123bCD33b CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞のコースを静脈内注射した。 3日目と6日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。 (91N)背面図 (91O)腹側図。
cCAR-Tコンストラクトの模式図。コンストラクトには、P2Aペプチドによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターが含まれる。リンカーが開裂すると、cCARは別れ、CD33および/またはCLL-1を発現する標的と結合します。新規cCARコンストラクトして、コンストラクトの活性化ドメインには、CD33 CARセグメント上の4-1BBおよびCLL-1 CARセグメント上のCD28領域が含まれ得るが、これらに限定されない。
cCAR-Tコンストラクトの模式図。コンストラクトには、P2Aペプチドによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターが含まれる。リンカーが開裂すると、cCARは分裂し、CD4および/またはCD123を発現する標的に結合する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインには、CD4セグメント上の4-1BBおよびCD123 CARセグメント上のCD28領域が含まれ得るが、これらに限定されない。
TまたはNK細胞におけるコンストラクトおよびその発現を説明するための概略図。 A)CAR(第3世代を含むがこれに限定されない)、およびIL-15α受容体のsushiドメイン(IL-15sushiと呼ぶ)の組み合わせは、発現ベクター上で組み立てられ、その発現はSFFVプロモーターによって駆動さる。IL-15/IL-15 sushiを含むCARは、P2A自己切断配列と結びついている。IL-15/sushi部分は、IL-2シグナルペプチドがIL-15に融合された部位で構成され、26アミノ酸ポリ - プロリンリンカーを介してIL-15アルファ受容体のドメインと連結される。B) CARおよびIL-15/IL-15 sushiは、TまたはNK細胞上に存在する。
IL-15 / IL_15sushiアンカーを備えたCARを示す概略図。 A)コンストラクトは、P2Aペプチドにより連結されたCARとIL-15/IL-15sushiアンカー(アンカーとも呼ぶ) anchorの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。このP2Aペプチドが切断されると、IL-15 / IL-15アンカーCARはCARとIL-15 / IL-15suchiアンカーに分割される。アンカーのIL-15/sushi部分は、IL-2シグナルペプチドがIL-15に融合された部位で構成され、26アミノ酸ポリ - プロリンリンカーを介してIL-15アルファ受容体のsushiドメインと連結される。CARとアンカーの両方は、ヒンジ(H)領域、膜貫通ドメイン(TM)を含む。 CARにはscFv、共刺激ドメイン(CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない)および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖もあるが、アンカーにはこれらのコンポーメントを負わない。 B)IL-15 / IL-15sushiは、TまたはNK細胞の表面に固定される。
CARエンハンサーコンストラクトを示す概略図。コンストラクトには、CARとP2Aペプチドで連結されたエンハンサーである4-1BBL(CD137L)の発現を促進するSFFVプロモーターが含まる。このP2Aペプチドが開裂されると、4-1BBLを持つCARコンストラクトはCARポリペプチド完全長の4-1BBLタンパク質に分割される。 CARには、リーダー配列とscFv、ヒンジ(H)領域、膜貫通ドメイン(TM)が含まれる。 CARには、共刺激ドメイン(CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない)および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖もあるが、4-1BBLはこれらのコンポーメントを負わない。 4-1BBLは、CD28または4-1BBとT細胞活性化または抗腫瘍活性の相乗効果を提供する(ただし、これに限定されない)。
CARエンハンサーコンストラクトを示す概略図。コンストラクトには、CARおよびP2Aペプチドによって連結されたエンハンサーIL-15の発現を駆動するSFFVプロモーターが含まれる。このP2Aペプチドが開裂すると、IL-15を含むCARコンストラクトはCARポリペプチドと完全長のIL-15タンパク質に分割される。 CARには、リーダー配列とscFv、ヒンジ(H)領域、膜貫通ドメイン(TM)が含まれる。 CARには共刺激ドメイン(CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない)および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖もあるが、IL-15ははこれらのコンポーメントを負わない。 IL-15は、CD28または4-1BBとT細胞の活性化または増殖または抗腫瘍活性の相乗効果をもたらす。 IL-15のIL-15シグナルペプチドは、IL-15分泌の高い効率が得られる強力なシグナルペプチドであるIL-2シグナルペプチド(リーダー配列)で置き換えられる。
CD4-3G-IL-15 / IL-15suhi-およびCD4-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーの作製と、FACS解析によるNK92細胞上でのそれらの発現。 CD4-3G、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushi-およびCD4-3G-IL-15 / IL-15アンカー(CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカー)CARレンチウイルスを使用してNK92細胞に形質導入し、その表面CAR発現(上段のパネルにて青色で囲まれている)は選別され、非形質導入またはGFP形質導入NK92細胞(陰性対照)と比較し、F(Ab’)2表面染色およびCD56抗体染色によるフローサイトメトリー分析により決定された。形質導入されたNK92細胞 CAR発現レベルは、形質導入されていないNK92細胞と比較し、CD4-3G-(78.3%)、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushi(97.1%)、またはCD4-3G-IL-15 / IL-15アンカー(93.4%)を示した。
共培養アッセイによる、CARおよび非形質導入隣接細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の効果の比較し。 CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiまたはCD4-3G-IL15 / IL-15アンカーCARが安定的に形質導入された選別NK92細胞(図97Aを参照)は、IL-2の非存在下では増殖できないCD4-3G CARまたはGFPレンチウイルスで安定して形質導入されNK92細胞(未掲載データ)と比較し、IL-2の非存在下でも同様の速度で増殖する。この研究は、CAR形質導入NK-92細胞増殖の促進におけるIL-15 / IL-15sushiまたはIL-15 / IL-15アンカーの共発現機能複合体の重要性を指摘している。図97B細胞培養培地にIL-2を加えずにGFP-NK92細胞とCD4CARs-NK92細胞を使用した共培養細胞増殖分析。次に、非形質導入隣接細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の影響をテストした。 CD4-3GまたはCD4-3G-IL-15 / IL-15sushiまたはCD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーCARを安定的に発現する選別されたNK-92細胞を、GFP + NK-92細胞と50:50の比率で混合しました。これらの細胞は、IL-2を添加した、またはIL-2を添加しないで共培養しました。 IL2の有無にかかわらず共培養されたNK-92細胞について、実験全体(10日目まで)で計算された総細胞数。共培養CD4-3GまたはCD4-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーCAR形質導入細胞またはGFP-NK92細胞は、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushi CAR-NK92と共培養した場合と比較して増殖が少ない。図97C、CD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushi形質導入またはCD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーNK92細胞と共培養したGFP-NK92細胞の割合のFACS分析。フローサイトメトリー分析を使用し、CARおよび非形質導入隣接細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の影響を比較。GFP+ NK細胞の割合はバックグラウンドレベルまで大幅に減少し( 3.27%)、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiと共培養した場合、GFP + NK細胞の割合は高レベル(25.87%)のままであった。図97D、CD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushi形質導入またはCD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーNK92細胞と共培養したGFP-NK92細胞の日数依存的な割合。フローサイトメトリー分析による、CARおよび非形質導入近接NK92細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の影響の要約。 GFP + NK92細胞は、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーCAR-NK92と比較してCD4-3G-IL-15 / IL-15sushi CAR形質導入NK-92との共培養時に、IL-2の非存在下での共培養で有意に長い生存を示した。これらの研究は、IL-15 / IL-15sushi複合体の分泌がCAR細胞とその隣接する非CAR細胞に大きな影響を与えることをす。対照的に、IL-15 / IL-15sushiアンカーはCAR細胞に対してIL-15 / IL-15sushiの分泌と同様の効果があったが、隣接する非CAR細胞への効果は限定的であった。
共培養アッセイによる、CARおよび非形質導入隣接細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の効果の比較し。 CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiまたはCD4-3G-IL15 / IL-15アンカーCARが安定的に形質導入された選別NK92細胞(図97Aを参照)は、IL-2の非存在下では増殖できないCD4-3G CARまたはGFPレンチウイルスで安定して形質導入されNK92細胞(未掲載データ)と比較し、IL-2の非存在下でも同様の速度で増殖する。この研究は、CAR形質導入NK-92細胞増殖の促進におけるIL-15 / IL-15sushiまたはIL-15 / IL-15アンカーの共発現機能複合体の重要性を指摘している。図97B細胞培養培地にIL-2を加えずにGFP-NK92細胞とCD4CARs-NK92細胞を使用した共培養細胞増殖分析。次に、非形質導入隣接細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の影響をテストした。 CD4-3GまたはCD4-3G-IL-15 / IL-15sushiまたはCD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーCARを安定的に発現する選別されたNK-92細胞を、GFP + NK-92細胞と50:50の比率で混合しました。これらの細胞は、IL-2を添加した、またはIL-2を添加しないで共培養しました。 IL2の有無にかかわらず共培養されたNK-92細胞について、実験全体(10日目まで)で計算された総細胞数。共培養CD4-3GまたはCD4-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーCAR形質導入細胞またはGFP-NK92細胞は、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushi CAR-NK92と共培養した場合と比較して増殖が少ない。図97C、CD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushi形質導入またはCD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーNK92細胞と共培養したGFP-NK92細胞の割合のFACS分析。フローサイトメトリー分析を使用し、CARおよび非形質導入隣接細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の影響を比較。GFP+ NK細胞の割合はバックグラウンドレベルまで大幅に減少し( 3.27%)、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiと共培養した場合、GFP + NK細胞の割合は高レベル(25.87%)のままであった。図97D、CD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushi形質導入またはCD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーNK92細胞と共培養したGFP-NK92細胞の日数依存的な割合。フローサイトメトリー分析による、CARおよび非形質導入近接NK92細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の影響の要約。 GFP + NK92細胞は、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーCAR-NK92と比較してCD4-3G-IL-15 / IL-15sushi CAR形質導入NK-92との共培養時に、IL-2の非存在下での共培養で有意に長い生存を示した。これらの研究は、IL-15 / IL-15sushi複合体の分泌がCAR細胞とその隣接する非CAR細胞に大きな影響を与えることをす。対照的に、IL-15 / IL-15sushiアンカーはCAR細胞に対してIL-15 / IL-15sushiの分泌と同様の効果があったが、隣接する非CAR細胞への効果は限定的であった。
共培養アッセイによる、CARおよび非形質導入隣接細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の効果の比較し。 CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiまたはCD4-3G-IL15 / IL-15アンカーCARが安定的に形質導入された選別NK92細胞(図97Aを参照)は、IL-2の非存在下では増殖できないCD4-3G CARまたはGFPレンチウイルスで安定して形質導入されNK92細胞(未掲載データ)と比較し、IL-2の非存在下でも同様の速度で増殖する。この研究は、CAR形質導入NK-92細胞増殖の促進におけるIL-15 / IL-15sushiまたはIL-15 / IL-15アンカーの共発現機能複合体の重要性を指摘している。図97B細胞培養培地にIL-2を加えずにGFP-NK92細胞とCD4CARs-NK92細胞を使用した共培養細胞増殖分析。次に、非形質導入隣接細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の影響をテストした。 CD4-3GまたはCD4-3G-IL-15 / IL-15sushiまたはCD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーCARを安定的に発現する選別されたNK-92細胞を、GFP + NK-92細胞と50:50の比率で混合しました。これらの細胞は、IL-2を添加した、またはIL-2を添加しないで共培養しました。 IL2の有無にかかわらず共培養されたNK-92細胞について、実験全体(10日目まで)で計算された総細胞数。共培養CD4-3GまたはCD4-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーCAR形質導入細胞またはGFP-NK92細胞は、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushi CAR-NK92と共培養した場合と比較して増殖が少ない。図97C、CD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushi形質導入またはCD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーNK92細胞と共培養したGFP-NK92細胞の割合のFACS分析。フローサイトメトリー分析を使用し、CARおよび非形質導入隣接細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の影響を比較。GFP+ NK細胞の割合はバックグラウンドレベルまで大幅に減少し( 3.27%)、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiと共培養した場合、GFP + NK細胞の割合は高レベル(25.87%)のままであった。図97D、CD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushi形質導入またはCD4CAR-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーNK92細胞と共培養したGFP-NK92細胞の日数依存的な割合。フローサイトメトリー分析による、CARおよび非形質導入近接NK92細胞に対するIL-15 / IL-15sushiおよびIL-15 / IL-15sushiアンカーの分泌の影響の要約。 GFP + NK92細胞は、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーCAR-NK92と比較してCD4-3G-IL-15 / IL-15sushi CAR形質導入NK-92との共培養時に、IL-2の非存在下での共培養で有意に長い生存を示した。これらの研究は、IL-15 / IL-15sushi複合体の分泌がCAR細胞とその隣接する非CAR細胞に大きな影響を与えることをす。対照的に、IL-15 / IL-15sushiアンカーはCAR細胞に対してIL-15 / IL-15sushiの分泌と同様の効果があったが、隣接する非CAR細胞への効果は限定的であった。
細胞培養培地にIL-2を含まないトランスウェル共培養アッセイを用いた、CD4CARs-NK92細胞と共培養したGFP-NK92細胞の細胞増殖分析。チャンバー(トランスウェル)培養アッセイを使用して、CARおよび非形質導入隣接細胞に対するIL-15 / IL-15sushiの分泌およびIL-15 / IL-15sushiアンカーの効果の比較。この効果が分泌タンパク質のみによるものなのか、共培養細胞間の相互作用によるものなのかをさらに判断するために、GFP NK92細胞をCD4-3GまたはCD4-3G-IL-15 / IL15sushまたはCD4-3G-IL-15 / IL-15sushアンカーCAR NK92細胞、または非形質導入NK92細胞の下のチャンバーで培養する実験を考案した。この状況下において、細胞ではなくタンパク質のみが、2つの培養物を隔てる膜の間を通過できる。 IL-2の非存在下でのGFP-NK92細胞の数を2日目から10日目までカウントした。一方、NK-92細胞またはCD4-3GまたはCD4-30-IL-15 / IL15sushアンカーCARで形質導入されたNK-92細胞の上部チャンバー内のGFP NK92細胞は10日目までに死滅し、CD4-IL-15 / IL-15sushi CARで形質導入されたNK92細胞上のGFP NK 92細胞は、10日目までに生存および増殖し、それがCD4-3G-IL-15 / IL-15sushi NK92細胞によって分泌されたIL-15 / IL-15sushiタンパク質であることを示し、それらは細胞間の直接の接触ではなく、細胞を生かした。このモデルでは、上部チャンバーは腫瘍微小環境を表しており、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushi NK細胞からのIL-15 / IL-15sushiの分泌によりT細胞またはNK細胞の生存が改善される。 IL-15 / IL-15アンカーは、形質導入されたNK92細胞の成長に大きな影響を与え、形質導入されていない隣接細胞での直接的な細胞間相互作用の程度は少ない。言い換えれば、IL-15 / IL-15アンカーは、形質導入されていない隣接細胞に対して限られた効果しかない。
IL-15 / IL-15sushiの分泌、IL-15 / IL-15sushiアンカー及びIL-15の分泌によるin vivoでのCARへの有効性に対する影響の比較。ルシフェラーゼ発現Jurkate細胞(1x106細胞)を、致死量以下の照射後の24時間後に静脈内注射した(1日目)。約50%のJurkate細胞がCD4を発現した。 6日目と9日目に、5x106個のコントロールGFP-、CD4-3G-、CD4-3G-IL15 / IL-15sush、IL-15 / IL-15sushiアンカーおよび分泌IL-15(IL-2シグナルペプチドを持つ)CAR -NK92細胞を各マウスに静脈内注射した(各グループでn = 2)。 1匹のCD4-3G-IL-15 / IL-15sushi NK92処置マウスは、注射処置(NK92細胞の塊)により死亡した。IVIS分析に基づき、IL-15 / IL-15shshi、CD4-3G-IL-15sushアンカー、およびIL-15(IL-2シグナルペプチドを含む)を備えたすべてのCD4-3G CARは、GFPまたはCD4-3G コントロールよりも強力な抗白血病効果を示した。これらのCARの中で、IL-15 / IL-15 sushiを備えたCD4-3G CARは、IVIS分析に基づき他のバージョンのCD4-3G CARよりも優れた効果を示した。興味深いことに、CD4-3G-IL-15 / IL-15sushiアンカーNK92処置マウスでは、腫瘍量が徐々に少なくなりました。 %数は、GFPコントロールと比較した腫瘍減少の%を示す。
CD45b-28-4-1BBL-NK92およびCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi-NK92細胞の作製。 前記で説明された(図57Dおよび57E)、4-1BBL(CD45b-28-4-1BBL)およびIL-15/IL-15sushi (CD45b-28-IL-15/IL-15sushi)を備えた、このCAR、 CD45b-28 CARが作製された。 CD45b-28、CD4-3G-4-1BBLおよびCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi-CARレンチウイルスを使用してNK92細胞を形質導入し、その表面CAR発現(上段のパネル上で青色で囲まれている)が選別され、F (Ab’) 2表面染色およびCD56抗体染色を用いたフローサイトメトリー分析により、非形質導入またはGFP形質導入NK92細胞(陰性対照)と比較して決定された。
細胞培養培地中外因性IL2の存在下または非存在下でのCD45b-28-IL-15 / IL-15suhi-NK92細胞の細胞増殖の解析。 NK-92細胞の増殖に対するIL-15 / IL-15 / IL-15sushi複合体の分泌または4-1BBLの共発現での効果の比較。 CD45b-28 CARには、IL-15 / IL-15sushi(CD45b-28-IL-15 / IL-15sush)または4-1BBL(CD45b-28-4-1BBL)が備わる。非形質導入、GFP形質導入、ソートされたCD45b-28-、ソートされたCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi、またはソートされたCD45b-28-4-1BBL形質導入NK92-細胞の細胞増殖曲線をIL-2の非存在下またはIL-2の存在下で比較する。 CD45b-28-IL-15 / IL-15sushiを安定的に形質導入し、ソートされたNK92細胞間では、IL-2の非存在下と存在下で細胞増殖に有意な差はない。 しかしながら、CD45b-28-4-1BBLなどの4-1BBLを備えたCARを安定的に形質導入し、ソートされたNK92細胞は、IL2の非存在下では増殖することができない。この研究は、4-1BBLの共発現がCAR形質導入NK-92細胞の増殖をサポートしないという重要な問題を指摘する。
IL-15 / IL-15 / IL-15sushi複合体の分泌または4-1BBLの共発現による抗腫瘍活性に対する効果の比較。ルシフェラーゼを発現するMOLM-13細胞(1x106細胞)を致死量以下の照射の24時間後に静脈内に注射した(1日目)。 4日目と5日目に、5x106のコントロールGFP-、CD45b-28-、CD45b-CAR-28-4-1BBL-またはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR -NK92細胞を各マウスに静脈内注射した(各グループn = 2)。 1匹のコントロールNK92処置マウスおよび1匹のCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi NK92処置マウスは、注射過程で死亡した。図98C、CD45b-28--NK92細胞は、in vivo異種移植マウスモデルでMOLM-13(ヒト急性単球性白血病)細胞株に対して有意な抗白血病効果を示せなかった。 3、7、9日目にIVISイメージングシステムを使用して、背側の腫瘍量を測定した。コントロールNK92細胞処置マウスとCD45b-28 CAR NK92処置マウスの両方で、IVISイメージング解析による腫瘍量の違いは見られなかった。しかしながら、4-1BBL(CD45b-28-4-1BBL)またはIL-15 / IL-15sushi(CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi)を備えたCD45b-28 CARは、生体内頑強持続的な抗腫瘍活性を示した(図98D)。 3、7、9日目にIVISイメージングシステムを用い、背側の腫瘍量を測定した。コントロールNK92細胞処理マウスとCD45b-CAR-28-NK92処理マウスの両方で、IVISイメージ解析による腫瘍量の違いは見られなかった。図98E、7日目および9日目でのコントロールと比較した、CD45b-28-4-1BBL-またはCD45b-CAR-28-IL-15 / IL-15sushi-NK92細胞で処置したマウスの腫瘍量(MOLM-13細胞)の抑制率。4-1BBLはIL-15 / IL-15sushiを分泌するのとは異なり、in vitroでNK-92細胞の生存または増殖を伴うことができなかったが(図98B)、4-1BBLはin vivo においてCAR抗腫瘍作用の強力なエンハンサーとして示すことができた(図98Dおよび98E)。
IL-15 / IL-15 / IL-15sushi複合体の分泌または4-1BBLの共発現による抗腫瘍活性に対する効果の比較。ルシフェラーゼを発現するMOLM-13細胞(1x106細胞)を致死量以下の照射の24時間後に静脈内に注射した(1日目)。 4日目と5日目に、5x106のコントロールGFP-、CD45b-28-、CD45b-CAR-28-4-1BBL-またはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR -NK92細胞を各マウスに静脈内注射した(各グループn = 2)。 1匹のコントロールNK92処置マウスおよび1匹のCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi NK92処置マウスは、注射過程で死亡した。図98C、CD45b-28--NK92細胞は、in vivo異種移植マウスモデルでMOLM-13(ヒト急性単球性白血病)細胞株に対して有意な抗白血病効果を示せなかった。 3、7、9日目にIVISイメージングシステムを使用して、背側の腫瘍量を測定した。コントロールNK92細胞処置マウスとCD45b-28 CAR NK92処置マウスの両方で、IVISイメージング解析による腫瘍量の違いは見られなかった。しかしながら、4-1BBL(CD45b-28-4-1BBL)またはIL-15 / IL-15sushi(CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi)を備えたCD45b-28 CARは、生体内で頑強で持続的な抗腫瘍活性を示した(図98D)。 3、7、9日目にIVISイメージングシステムを用い、背側の腫瘍量を測定した。コントロールNK92細胞処理マウスとCD45b-CAR-28-NK92処理マウスの両方で、IVISイメージ解析による腫瘍量の違いは見られなかった。図98E、7日目および9日目でのコントロールと比較した、CD45b-28-4-1BBL-またはCD45b-CAR-28-IL-15 / IL-15sushi-NK92細胞で処置したマウスの腫瘍量(MOLM-13細胞)の抑制率。4-1BBLはIL-15 / IL-15sushiを分泌するのとは異なり、in vitroでNK-92細胞の生存または増殖を伴うことができなかったが(図98B)、4-1BBLはin vivo においてCAR抗腫瘍作用の強力なエンハンサーとして示すことができた(図98Dおよび98E)。
IL-15 / IL-15 / IL-15sushi複合体の分泌または4-1BBLの共発現による抗腫瘍活性に対する効果の比較。ルシフェラーゼを発現するMOLM-13細胞(1x106細胞)を致死量以下の照射の24時間後に静脈内に注射した(1日目)。 4日目と5日目に、5x106のコントロールGFP-、CD45b-28-、CD45b-CAR-28-4-1BBL-またはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR -NK92細胞を各マウスに静脈内注射した(各グループn = 2)。 1匹のコントロールNK92処置マウスおよび1匹のCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi NK92処置マウスは、注射過程で死亡した。図98C、CD45b-28--NK92細胞は、in vivo異種移植マウスモデルでMOLM-13(ヒト急性単球性白血病)細胞株に対して有意な抗白血病効果を示せなかった。 3、7、9日目にIVISイメージングシステムを使用して、背側の腫瘍量を測定した。コントロールNK92細胞処置マウスとCD45b-28 CAR NK92処置マウスの両方で、IVISイメージング解析による腫瘍量の違いは見られなかった。しかしながら、4-1BBL(CD45b-28-4-1BBL)またはIL-15 / IL-15sushi(CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi)を備えたCD45b-28 CARは、生体内で頑強で持続的な抗腫瘍活性を示した(図98D)。 3、7、9日目にIVISイメージングシステムを用い、背側の腫瘍量を測定した。コントロールNK92細胞処理マウスとCD45b-CAR-28-NK92処理マウスの両方で、IVISイメージ解析による腫瘍量の違いは見られなかった。図98E、7日目および9日目でのコントロールと比較した、CD45b-28-4-1BBL-またはCD45b-CAR-28-IL-15 / IL-15sushi-NK92細胞で処置したマウスの腫瘍量(MOLM-13細胞)の抑制率。4-1BBLはIL-15 / IL-15sushiを分泌するのとは異なり、in vitroでNK-92細胞の生存または増殖を伴うことができなかったが(図98B)、4-1BBLはin vivo においてCAR抗腫瘍作用の強力なエンハンサーとして示すことができた(図98Dおよび98E)。
super CAR を作製するためにP2AおよびT2Aにより連結するこの図式は、単一のコンストラクトに4-1BBLとIL-15 / IL-15sushiを備えたCARを示す。コンストラクトには、CAR、4-1BBL、IL-15 / IL-15sushiの3つのセグメントの発現を駆動するSFFVプロモーターが含まれる。リンカー(P2AおよびT2A)が切断されると、CAR、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushiが開裂し、標的に関与する。 CARには、scFv、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン(CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない)および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖がある。 4-1BBLまたはIL-15 / IL-sushi、またはその両方により、TまたはNK細胞の活性化とCD28または4-1BBとの持続性または抗腫瘍活性の相乗効果が得られる。
super CAR を作製するためにP2AおよびT2Aにより連結するこの図式は、単一のコンストラクトに4-1BBLとIL-15 / IL-15sushiを備えたCARを示す。コンストラクトには、CAR、4-1BBL、IL-15 / IL-15sushiの3つのセグメントの発現を駆動するSFFVプロモーターが含まれる。リンカー(P2AおよびT2A)が切断されると、CAR、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushiが開裂し、標的に関与する。 CARには、scFv、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン(CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない)および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖がある。 4-1BBLまたはIL-15 / IL-sushi、またはその両方により、TまたはNK細胞の活性化とCD28または4-1BBとの持続性または抗腫瘍活性の相乗効果が得られる。
CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR-NK92細胞は、in vivo異種移植マウスモデルでJurkat(ヒト急性T細胞白血病)細胞株に対し著しい抗白血病効果を示す。ルシフェラーゼ発現Jurkat細胞(1x106細胞)は、致死量以下の照射の24時間後に静脈内注射(1日目)された。 4日目と7日目に、5x106のコントロールGFP-CD45b-28-またはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞を各マウスに静脈内注射した(各グループn = 2)。 3、6、9、11、14、および20日目に、IVISイメージングシステムを使用して、背側および腹側の腫瘍量を測定した。コントロールNK92細胞またはCD45b-28 CAR NK92細胞で処置されたマウスと比較し、CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞で処置されたマウスは、腫瘍量がはるかに少なかった。図99B、in vivo異種移植マウスモデルでJurkat(ヒト急性T細胞白血病)細胞株に対するコントロール、CD45b-28-、またはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞で処置したマウス間の抗白血病効果のtotal flux values(光子/秒)での比較。背側と腹側の両方のtotal fluxレベルは、コントロールNK92細胞(グラフの黒い線)およびCD45b-28-NK92細胞(グラフの赤い線)処置マウスで時間依存的に増大した。一方、CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞処置マウス(グラフの青い線)は、コントロールおよびCD45b-CAR-28-NK92細胞を注射したマウスと比較して、腫瘍の進行を大幅に抑制することを示した。図99C、9、11、14、20日目のコントロールと比較した、CD45b-28 CARまたはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞で処置されたマウスの腫瘍(Jurkat細胞)の抑制率。
CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR-NK92細胞は、in vivo異種移植マウスモデルでJurkat(ヒト急性T細胞白血病)細胞株に対し著しい抗白血病効果を示す。ルシフェラーゼ発現Jurkat細胞(1x106細胞)は、致死量以下の照射の24時間後に静脈内注射(1日目)された。 4日目と7日目に、5x106のコントロールGFP-CD45b-28-またはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞を各マウスに静脈内注射した(各グループn = 2)。 3、6、9、11、14、および20日目に、IVISイメージングシステムを使用して、背側および腹側の腫瘍量を測定した。コントロールNK92細胞またはCD45b-28 CAR NK92細胞で処置されたマウスと比較し、CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞で処置されたマウスは、腫瘍量がはるかに少なかった。図99B、in vivo異種移植マウスモデルでJurkat(ヒト急性T細胞白血病)細胞株に対するコントロール、CD45b-28-、またはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞で処置したマウス間の抗白血病効果のtotal flux values(光子/秒)での比較。背側と腹側の両方のtotal fluxレベルは、コントロールNK92細胞(グラフの黒い線)およびCD45b-28-NK92細胞(グラフの赤い線)処置マウスで時間依存的に増大した。一方、CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞処置マウス(グラフの青い線)は、コントロールおよびCD45b-CAR-28-NK92細胞を注射したマウスと比較して、腫瘍の進行を大幅に抑制することを示した。図99C、9、11、14、20日目のコントロールと比較した、CD45b-28 CARまたはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞で処置されたマウスの腫瘍(Jurkat細胞)の抑制率。
CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR-NK92細胞は、in vivo異種移植マウスモデルでJurkat(ヒト急性T細胞白血病)細胞株に対し著しい抗白血病効果を示す。ルシフェラーゼ発現Jurkat細胞(1x106細胞)は、致死量以下の照射の24時間後に静脈内注射(1日目)された。 4日目と7日目に、5x106のコントロールGFP-CD45b-28-またはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞を各マウスに静脈内注射した(各グループn = 2)。 3、6、9、11、14、および20日目に、IVISイメージングシステムを使用して、背側および腹側の腫瘍量を測定した。コントロールNK92細胞またはCD45b-28 CAR NK92細胞で処置されたマウスと比較し、CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞で処置されたマウスは、腫瘍量がはるかに少なかった。図99B、in vivo異種移植マウスモデルでJurkat(ヒト急性T細胞白血病)細胞株に対するコントロール、CD45b-28-、またはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞で処置したマウス間の抗白血病効果のtotal flux values(光子/秒)での比較。背側と腹側の両方のtotal fluxレベルは、コントロールNK92細胞(グラフの黒い線)およびCD45b-28-NK92細胞(グラフの赤い線)処置マウスで時間依存的に増大した。一方、CD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞処置マウス(グラフの青い線)は、コントロールおよびCD45b-CAR-28-NK92細胞を注射したマウスと比較して、腫瘍の進行を大幅に抑制することを示した。図99C、9、11、14、20日目のコントロールと比較した、CD45b-28 CARまたはCD45b-28-IL-15 / IL-15sushi CAR NK92細胞で処置されたマウスの腫瘍(Jurkat細胞)の抑制率。
CD19b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞の発現。上図はCD19b-IL-15 / IL-15sushiの構成を示している。末梢血(PB)から分離されたT細胞は、コントロールまたはCD19b-IL15 / IL15sushiコンストラクトのいずれかを発現するレンチウイルスで形質導入される。。 CARの形質導入率をアッセイするためにCD3およびF(ab)’抗体を使用したフローサイトメトリーが行われ、形質導入された集団は青色で表示されている。 N = 2。
CD19b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、CD19 + Sp53細胞を効率的に減少させる。 CD19b-IL15 / IL15sushiは、Sp53標的細胞の強力な溶解を成し遂げる。共培養実験は、エフェクターと標的の比率が1:1から5:1の範囲で24時間行われ、マウス抗ヒトCD3pPerCpおよびマウス抗ヒトCD19-PEを用いたフローサイトメトリーにより直接分析された。各アッセイには、コントロールまたはCAR T細胞のいずれかとインキュベートした標的細胞(Sp53、すべてCD19 +)が含まれる。 N = 2。
図100Bの結果から細胞傷害活性を要約した棒グラフ。
IVIS分析は、背側野(図100 D)と腹側野(図100E)の両方で実行された。 CD19b-IL15 / IL15sushi CAR処置マウスは、発光量ごとに最大10%の腫瘍量の大幅な減少を示し、これは、IL-15 / IL-15sushiを備えたCARがより強力な抗腫瘍活性を有するという我々の期待と一致する(図100Dおよび100E )。
IVIS分析は、背側野(図100 D)と腹側野(図100E)の両方で実行された。 CD19b-IL15 / IL15sushi CAR処置マウスは、発光量ごとに最大10%の腫瘍量の大幅な減少を示し、これは、IL-15 / IL-15sushiを備えたCARがより強力な抗腫瘍活性を有するという我々の期待と一致する(図100Dおよび100E )。
CAMPATH処置の有無によるCD4CAR T細胞の消失。実験デザイン(101A)および末梢血で操作された血液中のCD4CAR T細胞の消失を決定(101Bおよび101C)。 CD4CAR-T細胞(10x106個の細胞)を、致死量以下で照射した各NSGマウス(合計6匹のマウス)に静脈内注射した。翌日、PBSまたは0.1mg / kgのCAMPATHをI.P(腹腔内注射)で、それぞれ3匹のマウスに投与(N = 3)。 6時間および24時間後、末梢血を各マウスから採取し、CD3およびCD45抗体を使用して標識して、CAMPATH処置によるCD4CAR T細胞の消失を急性期反応として測定した。
CAMPATH処置の有無によるCD4CAR T細胞の消失。実験デザイン(101A)および末梢血で操作された血液中のCD4CAR T細胞の消失を決定(101Bおよび101C)。 CD4CAR-T細胞(10x106個の細胞)を、致死量以下で照射した各NSGマウス(合計6匹のマウス)に静脈内注射した。翌日、PBSまたは0.1mg / kgのCAMPATHをI.P(腹腔内注射)で、それぞれ3匹のマウスに投与(N = 3)。 6時間および24時間後、末梢血を各マウスから採取し、CD3およびCD45抗体を使用して標識して、CAMPATH処置によるCD4CAR T細胞の消失を急性期反応として測定した。
CAMPATH処置の有無によるCD4CAR T細胞の消失。実験デザイン(101A)および末梢血で操作された血液中のCD4CAR T細胞の消失を決定(101Bおよび101C)。 CD4CAR-T細胞(10x106個の細胞)を、致死量以下で照射した各NSGマウス(合計6匹のマウス)に静脈内注射した。翌日、PBSまたは0.1mg / kgのCAMPATHをI.P(腹腔内注射)で、それぞれ3匹のマウスに投与(N = 3)。 6時間および24時間後、末梢血を各マウスから採取し、CD3およびCD45抗体を使用して標識して、CAMPATH処置によるCD4CAR T細胞の消失を急性期反応として測定した。
操作されたCD4CAR T細胞の「安全スイッチ」としてのCAMPATH治療の効果の要約。 A、CAMPATH注射後6時間および48時間の末梢血におけるCD4CAR T細胞の消失。 B、CAMPATH注入後5日目のマウス全血および肝臓におけるCD4CAR T細胞の消失。 C、さまざまな組織における操作されたCAR T細胞の消失の分析。
BCMA CARは、リーダー配列、BCMA抗原に対するscFv、ヒンジドメイン(H)、膜貫通ドメイン(TM)、共刺激ドメイン(4-1BB)および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータ(上記参照)を含むモジュール化されたシグナル伝達ドメインとして構築さた。 BCMA-IL-15 / IL-15sushiは、IL-15 / IL-15sushiを備えたBCMA CARである(図103)。
BCMA-IL15 / IL15sushi CAR T細胞の発現。末梢血(PB)から分離されたT細胞は、ベクターコントロールまたはBCMA-IL15 / IL15sushiコンストラクトのいずれかを発現するレンチウイルスで形質導入された。 CARの形質導入率をアッセイするためにCD3およびF(ab)’抗体を使用したフローサイトメトリーが行われ、形質導入された集団は青色で表示されている。 N = 2。
BCMA-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、CD19 +細胞に対する低レベルの抗腫瘍活性の証拠を示す。 BCMA-IL15 / IL15sushiは、いくつかのCD19 + SP53細胞を標的とする。共培養実験は、エフェクターと標的の比率が1:1から5:1の範囲で24時間行われ、マウス抗ヒトCD3pPerCpおよびマウス抗ヒトCD19-PEを用いたフローサイトメトリーにより直接分析された。各アッセイには、ベクターコントロールまたはCAR T細胞のいずれかとインキュベートした標的細胞(Sp53、すべてCD19 +)が含まれる。 N = 2。
図105Bの結果から細胞傷害活性を要約した棒グラフ。
GD3 CARコンストラクトの構成。 GD2 CARコンストラクトは、リーダー配列、GD2 scFv、ヒンジドメイン(H)、膜貫通ドメイン(TM)、共刺激ドメイン(CD28または4-1BB)および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータを含むモジュール化されたシグナル伝達ドメインである。
GD3 CARコンストラクトの構成。 GD3 CARコンストラクトは、リーダー配列、GD3 scFv、ヒンジドメイン(H)、膜貫通ドメイン(TM)、共刺激ドメイン(CD28または4-1BB)および細胞内シグナル伝達ドメイン CD3ゼータを含むモジュール化されたシグナリングドメインである。
ヒトT細胞におけるGD2 CAR表面発現。活性化された末梢血単核細胞に、ベクターコントロール(左)またはGD2CAR(右)レンチウイルスベクターのいずれかを導入した。回復の48時間後、CAR表現型を検出するために、細胞を抗マウスF(Ab’)2-ビオチン抗体で標識した。
マウス抗ヒトGD2およびCD56で標識されたY79細胞のみでは、GD2の発現がほぼすべての網膜脂肪腫Y79細胞で見られる。 (N = 2)。
Y79網膜芽細胞腫細胞はGD2CAR T細胞と24時間共培養された。 GD2CAR T細胞は、24時間の共培養アッセイでGD2発現Y79網膜芽細胞腫細胞株を効率的に溶解することができる。共培養実験は、エフェクターと標的の比率が1:2から2:1の範囲で24時間行われ、CD56とGD2のフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイは、Y79標的細胞とコントロールT細胞(上段)、およびGD2CAR T細胞(下段)からなる。
Y79網膜芽細胞腫細胞はGD2CAR T細胞と24時間共培養された。 GD2CAR T細胞は、共培養アッセイでGD2発現Y79網膜芽細胞腫細胞株を消去することがでる。共培養実験は、エフェクターと標的の比率が5:1〜20:1の範囲で24時間行われ、CD56とGD2のフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイは、Y79標的細胞とコントロールT細胞(上段)、およびGD2CAR T細胞(下段)からなる。すべてN = 2である。
Y79網膜芽細胞腫細胞は、GD2CAR T細胞と72時間共培養された。 GD2CAR T細胞は、72時間の共培養アッセイでGD2発現Y79網膜芽細胞腫細胞株を消去することができる。共培養実験は、エフェクター対標的比1:2から2:1の範囲で72時間行われ、CD56およびGD2のフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイは、Y79標的細胞とコントロールT細胞(上段)、およびGD2CAR T細胞(下段)からなる。
GD2CAR T細胞は、共培養アッセイでGD2発現Y79網膜芽細胞腫細胞株を消去することができる。共培養実験はエフェクターとターゲットの比率が5:1〜20:1の範囲で72時間行われ、CD56とGD2のフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイは、Y79標的細胞とコントロールT細胞(上段)、およびGD2CAR T細胞(下段)からなる。すべてN = 2である。
1:2から20:1の比率で、24時間および72時間の共培養後、GD2CAR T細胞によって溶解されたY79腫瘍細胞の割合の要約。 (N = 2)
形質導入およびGD2CAR NK-92細胞の選別。 (A)NK-92細胞に、コントロール(左)またはGD2CAR(右)レンチウイルス上清を形質導入した。回復後、CAR表現型を検出するために、ヤギ抗マウスF(Ab’)2-抗体で細胞を標識した。 (B)GD2CAR + NK細胞はFACS Ariaでソートされた。 10日間の回復と拡大後、CAR表現型の検出のために、ベクターコントロール(左)または選別されたGD2CAR(右)NK細胞を抗マウスF (Ab’) 2-抗体で標識した。
Y79神経芽腫細胞株に対する抗GD2 CAR NK-92細胞。 GD2 CAR NK-92細胞は、GD2 +神経芽腫細胞株Y79に対して抗腫瘍活性を示す。 Y79神経芽細胞腫細胞は、サイトトラッカー(CMTMR)色素で予め標識され、さまざまなE:T比のコントロールNK-92または抗GD2 CAR NK-92細胞とともに24時間培養された。 GD2陽性Y79細胞集団は紫色であり、デュアルCMTMR + GD2 +表現型を示します。溶解率は棒グラフにまとめられている(右)。
投与量を増やすと、細胞毒性の増大と相関する。 2:1〜10:1の比率でGD2CAR NK-92細胞によって溶解されたY79腫瘍細胞の割合の要約は、投与量の増加が細胞毒性の増大と相関することを示す。
GD2-GD3 cCARコンストラクトの概略図。このコンストラクトは、P2A切断ペプチドによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。 P2Aリンカーが切断されると、cCARは開裂し、GD2および/またはGD3を発現する標的に関与する。 CARの各ユニットは、抗原に対するscFv、ヒンジドメイン(H)、膜貫通ドメイン(TM)、共刺激ドメイン(CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない)および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータ鎖を保有する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインには、GD2 CARセグメント上の4-1BBおよびGD3 CAR上のCD28領域が含まれるが、これらに限定されない。

0027

本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)構成、その作製方法および使用方法を提供する。

0028

キメラ抗原レセプター(CAR)ポリペプチドは、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。

0029

第1世代CARは、細胞内シグナル伝達ドメインとしてCD3zを含むが、第2世代CARは、様々なタンパク質由来の少なくとも1つの単一共刺激ドメインを含む。共刺激ドメインの例には、CD28、CD2、4-1BB(CD137、あるいは「4-BB」とも呼ばれる)、およびOX-40(CD124)が含まれるが、これらに限定されない。第3世代のCARには、CD28、4-1BB、CD134(OX-40)、CD2および/またはCD137(4-1BB)などの2つの共刺激ドメインが含まれるが、これらに限定されない。

0030

本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は交互に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基を有する化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列とすることができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合された2つ以上のアミノ酸を有する任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書中で使用される場合、短鎖、一般に当該技術分野では例えばペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも言及されており、そして長鎖、一般に当該技術分野ではタンパク質と呼ばれ、それには多くの種類が存在する、これら両者について言及する。 「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマーヘテロダイマー、ポリペプチドの改変体、改変ポリペプチド、誘導体類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド組換えペプチド合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。

0031

「シグナルペプチド」は、輸送および局在化指向するペプチド配列、そしてある細胞オルガネラ小胞体など)および/または細胞表面に結合することができるいかなるペプチドを含むペプチド配列。本明細書において、「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は互換的に使用される。

0032

シグナルペプチドは、本開示において、細胞膜および細胞表面への輸送を指示し、正確な局在を提供する、如何なる分泌タンパク質または膜貫通タンパク質のペプチド、ポリペプチドである。特に、本開示のシグナルペプチドは、本開示における細胞膜へ指示する本開示のポリペプチドであり、それらポリペプチドの細胞外部分が細胞表面に提示され、膜貫通部分が原形質膜に及んでおり、活性ドメイン細胞質部分、または細胞の内部に存在する。

0033

この実施例では、シグナルペプチドは、小胞体(ER)を通過した後に切断される、すなわち切断可能なシグナルペプチドである。この実施例では、シグナルペプチドは、I型II型III型またはIV型ヒトタンパク質である。この実施例では、シグナルペプチドは、免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドを含む。

0034

この実施例では、シグナルペプチドは、ヒトCD45(UniProtKB/ Swiss-Protアクセッション番号P08575)由来のシグナルペプチドを含む。CD45シグナルペプチドは、23アミノ酸長(MYLWLKLLAFGFAFLDTEVFVTG)である。いくつかの実施例では、シグナルペプチドは、CD45シグナルペプチドの機能的断片であり得るかもしれない。機能的断片は、添付のポリペプチドが細胞膜および細胞表面に向けるCD45シグナルペプチドの少なくとも10アミノ酸の断片を含む。ヒトCD45シグナルペプチドの断片の例には、MYLWLKLLAFG、FAFLDTEVFVTG、およびLKLLAFGFAFLDTEが含まれる。

0035

ヒトCD45シグナルペプチドの機能的等価物もまた考えられる。本明細書中で使用される場合、「機能的等価物」は、前述の配列位置の少なくとも1つにおいて、具体的に言及された以外のアミノ酸置換を示すが、依然として野生型CD45シグナルペプチドに関して同一または類似の性質を示す突然変異がもたらされる突然変異体として理解される。機能的等価物には、ヒトCD45シグナルペプチド、その機能的フラグメント、またはその機能的同等物と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドが含まれる。

0036

機能的等価物には、他の種由来の相同タンパク質由来のCD45シグナルペプチドも含まれる。これらのシグナルペプチドの例には、マウスCD45由来のシグナルペプチド(MGLWLKLLAFGFALLDTEVFVTG)、ラットCD45由来のシグナルペプチド(MYLWLKLLAFSLALLGPEVFVTG)、ヒツジCD45由来のシグナルペプチド(MTMYLWLKLLAFGFAFLDTAVSVAG)、チンパンジーCD45由来のシグナルペプチド(MYLWLKLLAFGFAFLDTEVFVTG)、およびサルCD45由来のシグナルペプチド(MTMYLWLKLLAFGFAFLDTEVFVAGが含まれる。

0037

別の実施例では、シグナルペプチドは以下の配列が含まれる、MX1LWLKLLAFX2X3AX4LX5X6X7VX8 VX9G、それらはX1、 X2、X3、 X4、X5、X6、X7、X8、そしてX9がそれぞれ独立してY、G、S、F、L、D、P、T、E、またはA.である。この実施例ではX1 は Y または G、 X2 はG またはS、X3 と X4 は独立してF または L、X5 は D あるいは G、 X6 は P または T、 X7 はE またはA、 X8 はF または S、そして X9 はA またはT.

0038

この実施例では、シグナルペプチドは、ヒトCD8a由来のシグナルペプチド(MALPVTALLLPLALLLHAARP)を含む。いくつかの実施例において、シグナルペプチドは、CD8aシグナルペプチドの機能的断片であり得るかもしれない。機能的断片は、添付のポリペプチドが細胞膜および細胞表面に向けるCD8aシグナルペプチドの少なくとも10アミノ酸の断片を含む。ヒトCD8aシグナルペプチドの断片の例としては、MALPVTALLLALALHAHAA、MALPVTALLLP、PVTALLLPLALL、およびLLLPLALLLHAARPが挙げられる。

0039

別の実施例では、シグナルペプチドは、ヒトCD8b由来のシグナルペプチド(MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSV)を含む。いくつかの実施例では、シグナルペプチドは、CD8bシグナルペプチドの機能的断片であってもよい。機能的断片は、添付のポリペプチドを細胞膜および細胞表面に向けるCD8bシグナルペプチドの少なくとも10アミノ酸の断片を含む。ヒトCD8bシグナルペプチドのフラグメントの例には、MRPRLWLLLAAQ、RLWLLLAAQLTVLHG、およびLWLLLAAQLTVLHGNSVが含まれる。

0040

ヒトCD8a またはCD8bシグナルペプチドの機能的等価物もまた考えられる。本明細書中で使用される場合、「機能的等価物」は、前述の配列位置の少なくとも1つにおいて、具体的に言及された以外のアミノ酸置換を示すが、依然として野生型CD8a またはCD8bシグナルペプチドに関して同一または類似の性質を示す突然変異がもたらされる突然変異体として理解される。機能的等価物には、ヒトCD8シグナルペプチド、その機能的フラグメント、またはその機能的同等物と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドが含まれる。

0041

機能的等価物には、他の種由来の相同タンパク質由来のCD8aおよびCD8bシグナルペプチドも含まれる。

0042

この実施例では、シグナルペプチドは、ヒトIL-2由来のシグナルペプチドを含む。 IL-2シグナルペプチドは23アミノ酸長(MYRMQLLSCIALSLALVTNS)である。いくつかの実施例では、シグナルペプチドは、IL-2シグナルペプチドの機能的断片であるかもしれない。機能的断片は、添付のポリペプチドを細胞膜および細胞表面に導くIL-2シグナルペプチドの少なくとも10アミノ酸の断片を含む。ヒトIL-2シグナルペプチドのフラグメントの例には、MYRMQLLSCIAL、QLLSCIALSLALおよびSCIALSLALVTNSが含まれる。

0043

ヒトIL-2シグナルペプチドの機能的等価物もまた考えられる。本明細書中で使用される場合、「機能的等価物」は、前述の配列位置の少なくとも1つにおいて、具体的に言及された以外のアミノ酸置換を示すが、依然として野生型IL-2シグナルペプチドに関して同一または類似の性質を示す突然変異がもたらされる突然変異体として理解される。機能的等価物には、ヒトIL-2シグナルペプチド、その機能的フラグメント、またはその機能的同等物と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドが含まれる。

0044

機能的等価物には、他の種由来の相同タンパク質由来のIL-2シグナルペプチドも含まれる。たとえば、図80を参照する。

0045

別の実施例では、シグナルペプチドは以下の配列が含まれる、MYX1X2QLX3SCX4X5LX6LX7LX8X9X10X11、それらはX1 、X2 、X3、X4、X5、X6、X7、X8 、X9, X10 、そしてX11がそれぞれ独立してR、K、S、M、I、V、L、A、I、T 、N 、S またはGである。この実施例ではX1 は R、K または S、 X2 はM、I または V、X3 は L あるいは A、 X4と X5は独立してI、A、V または T、X6 は S あるいは T、 X7 はA または V、 X8 、X9、X10そしてはX11は独立してV、L、T、A、N、S、 または Gである。

0046

「抗原認識ドメイン」には、標的の抗原、受容体、ペプチドリガンド、またはタンパク質リガンドに選択的であるかまたは標的とするポリペプチドに選択的なポリペプチドが含まれる。

0047

抗原認識ドメインは、リガンド結合および/またはシグナル伝達に関連する、如何なる多種多様な細胞外ドメインまたは分泌タンパク質のいずれかから得ることができる。抗原認識ドメインは、Ig軽鎖の一部と結合したIg重鎖の一部を含み、標的抗原に特異的に結合する一本鎖断片可変(scFv)として構成し得る。 抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であってもよく、または標的抗原に特異的に結合する任意のタイプであってもよい。別の実施例において、抗原認識ドメインは、受容体またはリガンドでもあり得る。 特定の実施例では、標的抗原は特定の疾患状態に特異的であり、疾患状態とは、compound CAR構造上の少なくとも1つのキメラ受容体構造によって認識され得るどんな種類の細胞表面抗原かもしれない。 特定の実施例では、キメラ受容体は、特定のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が存在するか、または作製することができる、如何なる癌に関するものであり得る。特に、神経芽腫肺小細胞癌メラノーマ卵巣癌腎細胞癌結腸癌、ホジキンリンパ腫および小児急性リンパ芽球性白血病などの癌は、キメラ受容体に特異的な抗原を有する。

0048

いくつかの実施例では、抗原認識ドメインは、限定されるものではないが、高親和性で様々な特異的標的に結合するように操作できる非抗体タンパク質スカフォールド、例えばセンチリンのような、非抗体タンパク質スカフォールドであり得る。センチリンはヒトコンセンサステネイシンFN3ドメインに基づく足場タンパク質であり、通常はCAR分子のscFv分子よりも小さい。

0049

標的特異的抗原認識ドメインは、好ましくは、標的の抗原に対する抗体または標的の抗原に結合するペプチド、または標的の抗原に結合する抗体に結合するペプチドまたはタンパク質、または標的上の受容体に結合するペプチドまたはタンパク質リガンド(成長因子、サイトカイン、またはホルモンを含むが、これらに限定されない)、または標的上 に結合するペプチドまたはタンパク質リガンドに結合する受容体に由来するドメイン(増殖因子受容体サイトカイン受容体またはホルモンレセプターを含むが、これらに限定されない)を標的とすることができる抗原結合ドメインを含む。

0050

この実施例では、抗原認識ドメインは、標的に対して(選択的な)のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む。

0051

別の実施例では、抗原認識ドメインは、ラクダ科単一ドメイン抗体またはその一部を含む。この実施例では、ラクダ科単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物に見出される重鎖抗体、またはVHH抗体を含む。ラクダのVHH抗体(例えば、ラクダ、ヒトコブラクダラマ、およびアルパカ)は、ラクダ科単鎖抗体の可変断片を指し(Nguyenら、2001; Muyldermans、2001参照)、また、ラクダの、ラクダ由来の組み換えVHH抗体、またはラクダのVHH合成抗体からの単離されたVHH抗体を含む。

0052

別の実施例では、抗原認識ドメインには、モノクローナル抗体の結合可変領域である単鎖断片可変(scFv)が含まれる。scFvには、1つの軽鎖と重鎖抗体が含まれている。特定の実施形態では、抗原認識ドメインには2つの異なる重鎖ドメイン(VHH)が含まれる。各重鎖ドメインは、同じ抗原または異なる抗原の異なるエピトープに結合する。一実施形態では、抗原認識ドメインは単一の重鎖ドメインを含む。

0053

別の実施例では、抗原認識ドメインは、それらの同族受容体に関与するリガンドを含む。 一例として、APRILは、TAC1受容体またはBCMA受容体に結合するリガンドである。 本明細書中に開示される発明によれば、抗原認識ドメインは、APRILまたはそのフラグメントを含む。 さらなる例として、BAFFは、BAFF-R受容体またはBCMA受容体に結合するリガンドである。本明細書中に開示される発明によれば、抗原認識ドメインは、BAFFまたはその断片を含む。別の実施例において、抗原認識ドメインはヒト化される。

0054

抗原認識ドメインは、その配列内にいくつかの可変性を含み、依然として本明細書に開示される標的に対して選択的であり得ることが理解される。 したがって、抗原認識ドメインのポリペプチドは、本明細書中に開示される抗原認識ドメインポリペプチドと少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも80%、または少なくとも70%同一であり、依然として本明細書中に記載され、本開示の範囲内にあると考えられる。

0055

標的にはインターロイキン6受容体、NY-ESO-1、アルファフェトプロテイン(AFP)、グリピカン-3(GPC3)、BCMA、BAFF-R、TACI、LeY、CD5、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD22、CD33、CD41、CD61、CD64、CD68、CD117、CD123、CD138、CD267、CD269、CD38、Flt3受容体、CS1、CD45、ROR1、PSMA、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2/neu、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、α-フェトプロテイン、CA19-9、CA72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART- 1, CD30、 EGFRvIII、免疫グロビンkappa and lambda、 CD38、 CD52、CD3、CD4、 CD8、CD5、CD7、CD2そしてCD138らが含まれる。

0056

別の実施例では、標的は任意の部分のインターロイキン6受容体、NY-ESO-1、アルファフェトプロテイン(AFP)、グリピカン-3(GPC3)、BCMA、BAFF-R、TACI、LeY、CD5、CD13、CD14、CD15、 CD19、CD20、CD22、CD33、CD41、CD61、CD64、 CD68、CD117、CD123、CD138、CD267、CD269、CD38、Flt3受容体、CS1、CD45、TACI、ROR1、PSMA、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2 / neu、 MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、α-フェトプロテイン、CA19-9、CA72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、CD30、EGFRvIII、免疫グロビンkappa and lambda、 CD38、 CD52、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2およびCD138ら任意のタンパクを含む。

0057

この実施例では、標的はインターロイキン6受容体、NY-ESO-1、アルファフェトプロテイン(AFP)、グリピカン-3(GPC3)、BCMA、BAFF-R、TACI、LeY、CD5、CD13、CD14、CD15、 CD19、CD20、CD22、CD33、CD41、CD61、CD64、 CD68、CD117、CD123、CD138、CD267、CD269、CD38、Flt3受容体、CS1、CD45、TACI、ROR1、PSMA、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2 / neu、 MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、α-フェトプロテイン、CA19-9、CA72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、CD30、EGFRvIII、免疫グロビンkappa and lambda、 CD38、 CD52、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2およびCD138ポリペプチドの露出表面部位を含む。

0058

例えば、図81に示すように、ターゲットはBAFFの表面露出領域を含む。ターゲットはBAFFの表面露出領域の一部を含むことができる。例えば、BAFFの一部には、ヒトBAFFの1~200、1~100、50~150、または100~200の残基が含まれる。

0059

別の実施例では、標的抗原は、ヒトパピローマウイルス(HPV)またはEBVエプスタインバーウイルス)抗原由来のE6およびE7などのその一部またはその表面露出領域等のウイルス性または真菌性の抗原含む。

0060

別の実施例では、標的抗原は、FcER1A、FCER1、およびIgEを含む。FCER1は、アルファ鎖(FcER1A)、ベータ鎖、および2つのガンマ鎖を含む高親和性Ig Eを受容体である。標的は細胞表面に存在していてもよい。細胞の例として、形質細胞、マスト細胞、好塩基球または好酸球が含まれまる。

0061

一実施形態では、標的はFcER1Aの細胞外ドメインを含む。標的には、FcER1A細胞外ドメインの断片または部分も含まれる。例えば、標的には、ヒトFcER1Aの残基1-178、1-100、50-150、または100-178が含まれる。
別の実施例では、標的には、FCER1受容体の細胞外ドメインが含まれる。
この実施例では、配列番号24を含むTACI抗原認識ドメイン。
この実施例では、配列番号25を含むBCMA抗原認識ドメイン 。
この実施例では、配列番号26を含むCS1抗原認識ドメイン 。
この実施例では、配列番号27を含むBAFF-R抗原認識ドメイン
この実施例では、配列番号28を含むCD33抗原認識ドメイン 。
この実施例では、配列番号29を含むCD123抗原認識ドメイン 。
この実施例では、配列番号30を含むCD19抗原認識ドメイン 。
この実施例では、配列番号31を含むCD20抗原認識ドメイン 。
別の実施例では、配列番号32を含むCD20抗原認識ドメイン 。
この実施例では、配列番号33を含むCD22抗原認識ドメイン 。
この実施例では、配列番号34を含むCD45抗原認識ドメイン 。
この実施例では、配列番号35を含むCD4抗原認識ドメイン 。
この実施例では、配列番号36を含むCD25抗原認識ドメイン 。

0062

ヒンジ領域は、例えば、キメラ抗原受容体、および少なくとも1つの共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない配列の間に位置する。ヒンジ配列は、例えば、ヒトまたはその一部を含む任意の属からの任意の適切な配列から得ることができる。そのようなヒンジ領域は当該技術分野において公知である。この実施例では、ヒンジ領域は、CD-8アルファ、CD28、4-1BB、OX40、CD3-ゼータ、T細胞レセプターαまたはβ鎖、CD3ゼータ鎖、CD28、CD3ε、 CD45、CD4 、CD5、 CD8、 CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、それらの機能的誘導体、およびそれらの組み合わせを含むヒトタンパクのヒンジ領域を含む。

0063

この実施例では、ヒンジ領域はCD8ヒンジ領域を含む。

0064

いくつかの実施例では、ヒンジ領域は、免疫グロブリン(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、およびIgD)から選択されるものを含むが、これに限定されない。

0065

膜貫通ドメインは、細胞膜に及ぶ疎水性ポリペプチドを含む。特に、膜貫通ドメインは、細胞膜の一方の側(細胞外)から細胞膜の向こう側(細胞内または細胞質)に及ぶ。

0066

膜貫通ドメインは、アルファヘリックスまたはベータバレルの形状で、またはそれらの組み合わせであり得る。膜貫通ドメインは、多くの膜貫通セグメント、各アルファ-ヘリックスベータシート、またはそれらの組み合わせを有するポリトピックタンパク質を含む。

0067

この実施例では、CARの構造のドメインの1つに もともと関連する膜貫通ドメインが使用される。別の実施例では、 同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとそのような ドメインの結合を避けるため、あるいは、レセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、膜貫通ドメインは選択またはアミノ酸置換によって修飾される。

0068

例えば、膜貫通ドメインは、T細胞レセプターαまたはβ鎖の膜貫通ドメイン、CD3ゼータ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、 CD64、CD80、CD86、CD68、CD134、CD137、ICOS、CD41、CD154、それらの機能的誘導体、およびこれらの組み合わせが含まれる。

0069

この実施例では、膜貫通ドメインは、ドメインのアミノ酸残基の25%超、50%超または75%超がロイシンおよびバリンなどの疎水性残基であるように人工的に設計される。この実施例では、フェニルアラニントリプトファンおよびバリンの三つ組合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。

0070

この実施例では、膜貫通ドメインはCD8膜貫通ドメインである。別の実施例では、膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインである。そのような膜貫通ドメインは当該分野で公知である。

0071

シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインは、免疫細胞を活性化する、あるいは少なくも少なくともいくつかの局面の免疫細胞シグナル伝達経路を活性化するためのポリペプチドを含む。

0072

この実施例では、シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ、共通FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcイプシロンRib)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DNAX活性化タンパク質10(DAP10)、DNAX活性化タンパク質12(DAP12)、それらの活性断片、それらの機能的誘導体、およびそれらの組み合わせを含む、それら機能的シグナル伝達ドメインのポリペプチドを含む。そのようなシグナル伝達ドメインは当該分野で公知である。

0073

この実施例では、CARポリペプチドは、1つ、あるいは1つ以上の共刺激ドメインを含む。この実施例では、共刺激ドメインは、IL-15受容体alpha、 IL-15 受容体alpha細胞質ドメイン、B7-1/CD80、 CD28; B7-2/CD86、 CTLA-4、B7-H1/PD-L1、ICOS、 B7-H2、 PD-1、 B7-H3、 PD-L2、B7-H4、PDCD6、BTLA、4-1BB/TNFRSF9/CD137、CD40 Ligand/TNFSF5、4-1BB Ligand/TNFSF9、GITR/TNFRSF18、BAFF/BLyS/TNFSF13B、 GITR Ligand/TNFSF18、BAFF R/TNFRSF13C、HVEM/TNFRSF14、CD27/TNFRSF7、LIGHT/TNFSF14、CD27 Ligand/TNFSF7、OX40/TNFRSF4、CD30/TNFRSF8、OX40 Ligand/TNFSF4、CD30 Ligand/TNFSF8、TACI/TNFRSF13B、 CD40/TNFRSF5、B4/CD244/SLAMF4、CD84/SLAMF5、BLAME/SLAMF8、 CD229/SLAMF3、 CD2, CD27、CRACC/SLAMF7、CD2F-10/SLAMF9、NTB-A/SLAMF6、CD48/SLAMF2、 SLAM/CD150、 CD58/LFA-3、 Ikaros、CD53、 Integrin alpha 4/CD49d、CD82/Kai-1、 Integrin alpha 4 beta 1、CD90/Thy1、ntegrin alpha 4 beta 7/LPAM-1、 CD96; LAG-3、 CD160、 LMIR1/CD300A、 CRTAM、TCL1A、 DAP12、TIM-1/KIM-1/HAVCR、Dectin-1/CLEC7A、 TIM-4、DPPIV/CD26、TSLP、 EphB6、TSLP R、そしてHLA-DR、OX40、 CD30、CD40、 PD-1、CD7、CD258、ナチュラルキラーグループ2メンバーC(NKG2C)、ナチュラルキラーグループ2メンバーD(NKG2D)、B7-H3 あるいはCD83、ICAM-1、LFA-1(CD11a / CD18)、ICOS、および4-1BB(CD137)の少なくとも1つに結合するリガンド、CDS、ICAM-1、 LFA-1 (CD1a/CD18)、 CD40、CD27、 CD7、B7-H3、 NKG2C、 PD-1、ICOS、その活性断片、その機能的誘導体、およびそれらの組み合わせを含めたタンパク質由来の機能的シグナル伝達ドメインである。

0074

本明細書中で使用される場合、少なくとも1つの共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインは、細胞内ドメインとしてまとめて言及しているかもしれない。本明細書中で使用される場合、ヒンジ領域および抗原認識は、細胞外ドメインとしてまとめて言及しているかもしれない。

0075

本開示はさらに、上記のキメラ抗原レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

0076

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。ポリヌクレオチドは、DNAおよびRNAが含まれる。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される場合、核酸およびポリヌクレオチドは同様の意味でもある。当業者であれば、核酸がポリヌクレオチドであり、これを加水分解してモノマー「ヌクレオチド」にすることができるという一般的な知識を有する。モノマーヌクレオチドを加水分解してヌクレオシドにすることができる。本明細書中で使用される ポリヌクレオチドは 、すなわち例えば、組換えライブラリーまたは細胞からの通常のクローニング技術およびポリメラーゼ連鎖反応PCR)などの合成手段によるクローニング、当技術分野利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるがこれに限定されない。

0077

CARをコードするポリヌクレオチドは、いかなる従来の方法によって、特定のCARのアミノ酸配列から容易に調製される。アミノ酸配列をコードする塩基配列は前述のNCBI RefSeq IDから、または GenBenkのアクセッション番号から各ドメインのアミノ酸配列を 取得することができ、本発明の核酸は、標準的な分子生物学および/または化学的手順により調製することができる。例えば、塩基配列を元に、ポリヌクレオチドを合成することができ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いてcDNAライブラリーから得られたDNA断片を 組み合わせることで、本発明のポリヌクレオチドを調製することができる。

0078

この実施例では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子 、発現カセットまたはクローニングカセットの一部である。

0079

上記のポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングすることができる。 「ベクター」は、単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドを細胞の内部に届けるために使用される構成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、ファージミドコスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない多数のベクターが当該分野で公知である。ウイルスには、ファージ、ファージ誘導体が含まれる。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどの核酸の細胞への移動を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクターアデノ随伴ウイルスベクターレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。この実施例では、ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、組み込みベクター、および配列決定ベクターが含まれる。

0080

この実施例では、ベクターはウイルスベクターである。この実施例では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。一実施形態では、操作された細胞は、ポリヌクレオチド配列を発現するためにウイルスに形質導入される。

0081

哺乳動物細胞への遺伝子導入のための多くのウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクターに挿入され、当該分野で既知の技術を用いてレトロウイルス粒子パッケージングされる。次いで、組換えウイルスを単離し、in vivoまたはex vivoのいずれかの手段で患者の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系が当該分野で公知である。いくつかの実施例では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当該分野で既知である。この実施例では、レンチウイルスベクターが使用される。

0082

ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えばSambrookら(2001、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York)および他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルスアデノ随伴ウイルスヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生命体において機能する複製起点プロモーター配列好都合制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つ以上の選択マーカーを含む(例えば、WO 01/96584; WO 01/29058;および米国特許第6,326,193号)。

0083

レンチウイルスベクターは、高い効率でヒトT細胞に遺伝子を導入する能力に関してよく知られているが、ベクターにコードされた遺伝子の発現は、その発現を促進する内部プロモーターに依存する。強力なプロモーターは、追加の共刺激ドメインまたは増殖性サイトカインをコードする遺伝子を有する増加したCARの構成サイズが等量の発現を保証しないため、第3世代または第4世代のCARの作製に特に重要である。異なる強度および細胞型特異性を有する様々なプロモーターが存在する。 CAR T細胞を用いる遺伝子治療は、T細胞が十分なCAR本体を発現し、長期間にわたり発現を維持する能力に依存している。EF1αプロモーターはCAR発現のために一般的に選択されている。

0084

本開示は、T細胞またはNK細胞における高レベルの遺伝子発現のための強力なプロモーターを含む発現ベクターを提供する。さらなる実施例において、本発開示は、T細胞またはNK細胞におけるCARsの高レベル発現に有用な強力なプロモーターを提供する。特定の実施例では、SFFVプロモーターと関連した強力なプロモーターは、発現ベクターに選択的に導入されることで、 T細胞またはNK細胞において高レベルの発現を獲得し、長期間にわたって発現を維持することができる。CARs、T細胞共刺激因子およびサイトカインが発現されたものを免疫療法に使用する 。

0085

適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに連結された操作されうる任意のポリヌクレオチド配列で高レベルの発現を誘導することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子-1a(EF-1a)である。しかしながら、シミアンウイルス40SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルスHIV)長末端反復LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン- バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーターミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されることなく、他の構成的プロモーター配列も使用される。さらに、本開示は構成性プロモーターの使用に限定されるべきではなく、誘導性プロモーターも本開示の一部として考慮される。誘導性プロモーターの使用することで、連結されたポリヌクレオチド配列の発現を望む場合、発現をオンにすることができる分子スイッチあるいは発現が望ましくない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

0086

キメラ抗原レセプターポリヌクレオチドの発現は、例えば、限定されるものではないが、SFFV(脾臓フォーカス形成ウイルス)(例えば、配列番号23)またはヒト伸長因子11α(EF)プロモーター、CAG(CMVエンハンサーを有するニワトリβ-アクチンプロモーター)プロモーター、ヒト伸長因子1α(EF)プロモーターが利用される。低強度/低発現プロモーターの例としては、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター、ユビキチンC(UBC)プロモーター、およびホスホグリセレートキナーゼ1(PGK)プロモーター、またはその一部を含め、限定されるものではないが、それらを含め利用される。キメラ抗原受容体の誘導性発現は、例えば、限定されるものではないがTRE3GV(全ての世代、好ましくは第3世代を含むTet応答エレメント)を含めたテトラサイクリン応答性プロモーター、誘導性プロモーター(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)またはその一部またはそれらの組み合わせを含むこれらが 使われることで、目的を達成するかもしれない。

0087

好ましい実施例では、プロモーターは、SFFVプロモーターまたはその誘導体である。予想外にも、SFFVプロモーターは、本開示において、形質導入された細胞においてより強い発現およびより高い持続性を示すことが発見されている。

0088

「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含む。発現のための他の要素は、宿主細胞によってまたはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド(例えば、であるかまたはリポソームに含まれる)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)など、当技術分野で公知のものすべてが含まれる。発現ベクターは、バイシストニックまたはマルチシストロン発現ベクターであり得る。バイシストロニックまたはマルチシストロン発現ベクターは、(1)各オープンリーディングフレームに融合された複数のプロモーター、(2)遺伝子間スプライシングシグナルの挿入、発現が単一のプロモーターによって誘導される遺伝子の融合、(3)遺伝子間でのタンパク質分解切断部位の挿入(自己切断ペプチド)、 そして(iv)遺伝子間に内部リボソーム進入部位(IRES)の挿入などが含まれる。

0089

この実施例では、本開示は、少なくとも1つのキメラ抗原レセプターポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有する操作された細胞を提供する。

0090

「遺伝子操作された細胞」は、遺伝子、DNAまたはRNA配列、またはタンパク質もしくはポリペプチドの付加または修飾によって、修飾、形質転換、または操作される任意の生体の、如何なる細胞を意味する。本開示の単離された細胞、宿主細胞、および遺伝子操作された細胞は、キメラ抗原レセプターまたはキメラ抗原レセプター複合体をコードするDNAまたはRNA配列を含有すし、キメラ受容体を細胞表面に発現するNK細胞およびT細胞のような、単離された免疫細胞を含む 。例えば、NK細胞を活性化またはTリンパ球活性した単離された宿主細胞および操作された細胞は、 癌の治療および感染性疾患の治療のために使用され得る。

0091

この実施例では、操作された細胞は免疫調節細胞を含む。免疫調節細胞には、CD4 T細胞(ヘルパーT細胞)、CD8 T細胞(細胞傷害性T細胞、CTL)、および記憶T細胞またはT記憶幹細胞などのT細胞が含まれる。別の実施例において、T細胞には、ナチュラルキラーT細胞(NK T細胞)が含まれる。

0092

この実施例では、操作された細胞はナチュラルキラー細胞を含む。ナチュラルキラー細胞は当該分野でよく知られている。この実施例では、ナチュラルキラー細胞には、NK-92細胞などの細胞株が含まれる。NK細胞株のさらなる例には、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS細胞、およびNKL細胞などが含まれる。

0093

NK細胞は、GvHDのリスクなしに抗腫瘍効果をもたらし、T細胞と比較して短命である。したがって、NK細胞は、癌細胞を破壊した直後に枯渇されるため、改変された細胞を 取り除くために、CARの構成上での誘導性自殺遺伝子導入の必要性を減らすであろう。

0094

本開示によれば、驚くべきことに、NK細胞は、本明細書中に開示されるキメラ抗原レセプターポリペプチドを含み、発現するように操作さることで、その後、容易に利用可能な細胞であることが見出された。

0095

同種異系または自己NK細胞は、急速な免疫応答を誘導するが、その寿命が限られているため血液循環系から比較的急速に消失する。従って、驚くべきことに、出願人らは CAR細胞に基づく療法を使用した場合の、持続的な副作用の懸念が減少することを発見した。

0096

本発明の1つの側面によれば、 本発明に従ってNK細胞は、増殖させ、CARポリヌクレオチドをトランスフェクトされることができる。 NK細胞は、臍帯血、末梢血、iPS細胞および胚性幹細胞から得ることができる。本発明の1つの側面によれば、NK-92細胞は、増殖させ、CARをトランスフェクトさせ得るかもしれない。 NK-92は、ナチュラルキラー(NK)細胞の特色および特徴を有する持続的に増殖する細胞株である(Arai、Meagherら、2008)。 NK-92細胞株はIL-2依存性があり、安全であり(Arai、Meagher et al。2008)、且つ実現可能であることが証明されている。 CAR発現NK-92細胞は、フィーダー細胞との共培養の有無に関わらず、血清フリー培地中で増殖させることができる。目的のCARを保有するNK-92細胞の純粋な集団は、選別することで得ることができる。

0097

この実施例では、操作された細胞は、MHC認識に関与するTCR(T細胞受容体)の構成要素を不活性化するために修飾された、ドナーから得られた同種異系T細胞を含む。その結果として、TCR欠損T細胞は移植片対宿主病(GVHD)を引き起こさないであろう。

0098

いくつかの実施例において、操作された細胞は、細胞表面抗原の発現を妨げるように修飾されるのかもしれない。例えば、 操作された細胞は、その発現および細胞表面上の存在を妨げるよう、ネイティブCD45遺伝子を欠失させるように遺伝子改変されるかもしれない。

0099

いくつかの実施例では、操作された細胞は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはプラスミドなどのベクター上に組み込まれ得る誘導性自殺遺伝子(「安全スイッチ」)または安全スイッチの組み合わせをもつ。 「安全スイッチ」の導入はcompound CARの安全性の側面を大幅に向上させ、 標的腫瘍または標的外の 腫瘍毒性を制限する。 「安全スイッチ」は、カスパーゼ9遺伝子、チミジンキナーゼシトシンデアミナーゼ(CD)またはシトクロムP450などの誘導性自殺遺伝子であり、しかしこれに限定されない。望ましくない改変T細胞を排除するための他の安全スイッチは、T細胞におけるCD20またはCD52またはCD19または切断型表皮成長因子受容体の発現を含む。すべての可能な安全スイッチが考えられており、本発明で盛り込まれている。

0100

いくつかの実施例では、自殺遺伝子は、操作された細胞ゲノムに組み込まれる。

0101

この実施例では、本開示は、CD45キメラ抗原レセプターポリヌクレオチドを有する操作細胞を提供する。この実施例では、CD45 CARポリペプチドは、配列番号13を含み 、ポリヌクレオチド配列SEQID NO 14に対応する。別の実施例では、CD45 CARポリペプチドは配列番号15を含み 、ポリヌクレオチド配列SEQ ID NO 16に対応する。別の実施例では、CD45 CARポリペプチドは、配列番号 17を含み 、ポリヌクレオチド配列SEQ ID NO 18に対応する。

0102

特定の実施例では、操作された細胞は、P2A切断配列を介してIL15 / IL-15sushiに連結されたCD45 CARを含む。この実施例を提供するポリペプチドは、SEQID NO 43および対応するポリヌクレオチド配列SEQ ID NO 44を含む。

0103

特定の実施例では、操作された細胞は、P2A切断配列を介して4-1BBL(CD137L)に連結されたCD45 CARを含む。この実施例を提供するポリペプチドは、SEQID NO 42および対応するポリヌクレオチド配列SEQ ID NO 41を含む。

0104

一実施形態では、操作された細胞は、CD22抗原認識ドメインを有するキメラ抗原受容体ポリペプチドで構成されるCD22 CARを含む。一実施形態では、この操作された細胞は、配列番号130のポリペプチドおよび配列番号131に対応するポリヌクレオチドを含む。

0105

Multiple CARユニット
この実施例では、本開示は、少なくとも2つの異なる、または別個のCAR単位を有する操作された細胞を提供する。 2つのCARユニットは、完全なCARユニットまたは不完全なCARユニットであってもよい。本明細書中で使用される場合、「異なるCARポリペプチド」および「異なるCARポリペプチド単位」は互換的に使用される。

0106

本開示は、CARユニットまたは完全なCARユニットと定義するシグナルペプチド、抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および少なくとも1つの共刺激ドメインを有するキメラ抗原レセプターポリペプチドを提供する。本明細書で使用されるように、不完全CARユニットは、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたは少なくとも1つの共刺激ドメインを有するポリペプチドを含む。不完全なCARユニットは、シグナル伝達ドメインおよび少なくとも1つの共刺激ドメインを含まないが、一方または他方を含まない。

0107

この実施例では、本開示は、第1の抗原認識ドメインおよび共刺激ドメイン(第1の不完全CARユニット)を有する第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドを、そして第2の抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメイン(第2の不完全なCARユニット)を有する第2のキメラ抗原レセプターポリペプチドを有する操作細胞を提供する、その点で第1の抗原認識ドメインは第2の抗原認識ドメインとは異なる。

0108

したがって、2つの不完全なCARユニットを有する操作された細胞は、両方の標的抗原が抗原認識ドメインに結合した場合にのみ完全に活性化される。この戦略は、標的が各不完全CARユニットの抗原認識ドメインに結合されるまで、操作された細胞が完全に活性化されないという点で、付加された特異性を提供する。

0109

さらなら実施例において、操作された細胞は2つの不完全なCARユニットを有し、抗原認識ドメインの1つは、ビオチン、HIS、MYC、HA、アガロース、V5、マルトース、GST、GFP、CD52、CD20,4-1BB、またはCD28に特異的であり、結合することができるかもしれない。

0110

本明細書中で使用される場合、compound CAR(cCAR)またはmultiple CARは、少なくとも2つの異なるキメラ抗原レセプターポリペプチドを有する操作された細胞を指す。本明細書で用いられる「異なるキメラ抗原レセプターポリペプチド」は、ユニークな抗原認識ドメイン、シグナルペプチド、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの補助刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを有する。したがって、2つのユニークなキメラ抗原レセプターポリペプチドは、異なる抗原認識ドメインを有するであろう。シグナルペプチド、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインは、2つの異なるキメラ抗原レセプターポリペプチド間で同じであっても異なっていてもよい。本明細書で使用されるように、キメラ抗原レセプター(CAR)単位は、異なるキメラ抗原レセプターポリペプチド、またはそれを同様にコードするポリヌクレオチドを指す。

0111

本明細書中で使用される場合、ユニークな抗原認識ドメインは、標的に特異的である、または単一の標的または標的の単一のエピトープを標的にするかの一つでもある。

0112

いくつかの実施例では、compound CARは同じ抗原を標的とする。例えば、cCARは、単一の抗原の異なるエピトープまたは異なる部分を標的とする。いくつかの実施例では、compound CARに存在するそれぞれのCARユニットは、同様または異なる疾患状態における、異なる抗原を標的とする、あるいは、疾患状態によって引き起こされる副作用に特異的な異なる抗原を標的とする。

0113

いくつかの実施例では、compound CARは2つの異なる抗原を標的とする。

0114

様々なCARユニットを有するcompound CARsの作成は大変挑戦的である、(1)CAR-CAR相互作用が有害な影響を及ぼすかもしれず、適切なCAR設計がこの悪影響を相殺する鍵である、(2)単一構成のcompound CARは発現カセットの長さを増加させる可能性がある、その結果、ウイルス力価およびタンパク質発現レベルの低下を引き起こすかもしれない、(3)単一のベクター内にmultiple CARsを発現させる為の戦略を選択するため、様々なCARボディ要素を含む適切な設計が必要である、(4)CARのさらなるユニットを有するcompound CARに対して強力なプロモーターは特に重要である、 (5)CARのヒンジ領域は、各CARユニット間のヒンジ領域の相互作用が好ましくは回避されるように設計する必要がある、(6)細胞で発現する2つまたはそれ以上CARユニットが毒性作用を引き起こすかもしれない(CARとCAR の相互作用)。出願人は、新規且つ驚くべきCARの組成物並びに、これらのハードルを克服する 方法を提供する。

0115

この実施例では、本開示は、multiple CARユニットを有する操作された細胞を提供する。これにより、単一の操作された細胞が複数の抗原を標的とすることが可能になる。複数の表面マーカーまたは抗原を同時にmultiple CAR単位で標的とすることにより、耐性クローンの選択が妨げられ、腫瘍の再発が減少する。 様々なドメインおよび活性化部位を含む個々のcomponent CARを用いたMultiple CAR T細胞免疫療法はいずれの悪性腫瘍に対してもまだ展開されていない 。

0116

本発明のひとつの側面では、cCARは、複数の CARユニットを含む。いくつかの実施例では、cCARは、少なくとも2つのCARユニットを含む。別の実施例において、cCARは、少なくとも3つのCARユニットを含む。別の実施例において、cCARは、少なくとも4つのユニットを含む。

0117

一実施形態では、本開示は、それぞれが異なる抗原認識ドメインを有する少なくとも2つの別個のキメラ抗原受容体ポリペプチドを有する操作された細胞を提供する。

0118

この実施例では、少なくとも2つの異なるキメラ抗原レセプターポリペプチドを有する操作細胞は、T細胞である。 T細胞は、細胞表面抗原を発現しないように操作することができる。例えば、T細胞は、CD45細胞表面抗原を発現しないように操作することができる。

0119

好ましい実施例では、少なくとも2つの異なるキメラ抗原レセプターポリペプチドを有する操作細胞は、末梢血または臍帯血から単離された初代NK細胞であり、またNK-92細胞であり、疾患または癌を有する任意の哺乳類に「既製品」として投与される。

0120

この実施例では、操作された細胞は、(i)第1の抗原認識ドメイン、第1のシグナルペプチド、第1のヒンジ領域、第1の膜貫通ドメイン、第1の共刺激ドメイン、および第1のシグナル伝達ドメインを含む第1のキメラ抗原レセプターポリペプチド、(ii)第2の抗原認識ドメイン、第2のシグナルペプチド、第2のヒンジ領域、第2の膜貫通ドメイン、第2の共刺激ドメイン、および第2のシグナル伝達ドメインを含む第2のキメラ抗原レセプターポリペプチド。第1の抗原認識ドメインは、第2の抗原認識ドメインとは異なる。

0121

好ましい実施例おいて、 各操作されたCARユニットポリヌクレオチドは、相同組換えを回避するために異なるヌクレオチド配列を有する。

0122

この実施例において、第1の抗原認識ドメインの標的は、ROR1、PSMA、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2 / neu、IL13Ra2、Met、メソセリン、EGFR、EGFRvIII、MUC16 、NKG2Dリガンド、サイログロブリン、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART- 1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、免疫グロブリンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受容体、TACI、 CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2、CD45、CD70 CD138、インターロイキン6受容体、NY-ESO-1、アルファフェトプロテイン(AFP)、グリピカン-3(GPC3)、BAFF-R、BCMA、TACI、LeY、 CD4、CD5、CD13、CD14、CD15 CD19、CD20、CD22、CD33、CD41、CD61、CD64、CD68、CD117、CD123、CD138、CD267、CD269、CD38、Flt3受容体、CLL-1、およびCS1からなるグループより選ばれる、そして、2番目の認識ドメインのターゲットは、ROR1、PSMA、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2 / neuからなるグループから選択されます。 、IL13Ra2、Met、メソセリン、EGFR、EGFRvIII、MUC16、NKG2Dリガンド、サイログロブリン、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、 NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、免疫グロブリンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD19、CD20 、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受容体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2、CD45、CD70およびCD138からなるグループより選ばれる。

0123

この実施例では、操作された細胞はCD19抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原レセプターポリペプチドおよびCD20認識ドメインを有する第2のキメラ抗原レセプターポリペプチドを含む。この実施例では、この操作された細胞は、配列番号3のポリペプチドと配列番号4に対応するポリヌクレオチドを含む。

0124

この実施例では、操作された細胞は、CD19抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原レセプターポリペプチドおよびCD22抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原レセプターポリペプチドを含む。この実施例では、この操作された細胞は、配列番号5のポリペプチドと配列番号6に対応するポリヌクレオチドを含む。

0125

この実施例では、操作された細胞は、CD19抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原レセプターポリペプチドおよびCD123抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原レセプターポリペプチドを含む。この実施例では、この操作された細胞は、配列番号7のポリペプチドと配列番号8に対応するポリヌクレオチドとを含む。

0126

一実施形態では、操作された細胞は、BCMA抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびCD19抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む。

0127

一実施形態では、操作された細胞は、BAFFR抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびCD19抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む。

0128

一実施形態では、操作された細胞は、BCMA抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびCS1抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む。

0129

一実施形態では、操作された細胞は、CD33抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびCLL-1抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む。

0130

一実施形態では、操作された細胞は、CD4抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびCLL-1抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む。

0131

一実施形態では、操作された細胞は、CD4抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびCD123抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む。

0132

一実施形態では、操作された細胞は、CD19抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびCS-1抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む。

0133

この実施例では、操作された細胞は、CD33抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原レセプターポリペプチドおよびCD123抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原レセプターポリペプチドを含む。この実施例では、この操作された細胞は、配列番号9のポリペプチドと配列番号10に対応するポリヌクレオチドとを含む。別の実施例では、この操作された細胞は、配列番号11のポリペプチドと配列番号12に対応するポリヌクレオチドを含む。

0134

この実施例では、操作された細胞は、BAFF-R抗原認識ドメインを有する第1のキメラ抗原レセプターポリペプチドおよびCS1抗原認識ドメインを有する第2のキメラ抗原レセプターポリペプチドを含む。

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