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技術 生物製剤の製造のためのユニバーサル自己調節性哺乳動物細胞株プラットフォーム

出願人 ロンザリミテッド
発明者 ヤング,ローベルトオキャラハン,ピーター,マイケルペイン,トーマス
出願日 2018年6月15日 (2年5ヶ月経過) 出願番号 2019-569214
公開日 2020年8月13日 (3ヶ月経過) 公開番号 2020-523990
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 ペプチド又は蛋白質 微生物による化合物の製造
主要キーワード 基礎回路 現場組み立て 発熱性材料 単一制御 サーベイヤ 発酵ユニット リアクターユニット 気泡ポンプ
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図面 (16)

課題・解決手段

レプレッサーポリペプチドを使用して、条件の変更に応じて、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド転写率を低減する、遺伝制御回路細胞及び方法が開示される。

概要

背景

組換え治療用タンパク質は、細胞発現系、例えば、哺乳動物細胞発現系において一般に発現される。2014年に、市販の承認された生物学的製剤総数は、212であり、FDAによって市販のための承認された治療用製品の56%は、哺乳動物細胞株において製造されている。しかし、製造と関連する高コストが、世界的な医療経皮の増大に寄与している。

さらに、次世代融合タンパク質多量体糖タンパク質又は次世代抗体などの次世代タンパク質生物製剤(NGB)は、複雑な及び/又は非天然構造を有することが多く、モノクローナル抗体などの分子よりも発現することがより困難であるとわかっている。現在の宿主細胞株は、NGBの効率的な合成及び分泌のための経路進化させておらず、その結果、大幅に低減された増殖、低い生産性となり、生成物品質(PQ)性状の悪い製品となることも多い。したがって、これらのNGBは、発現することが困難と考えられ、これでは、生産性及び生成物品質は、臨床的及び商業的要求を満たさない。したがって、最終生成物品質を維持しながら、組換え生物学的治療薬を迅速に、効率的に、及び費用効率的に開発し、製造する必要性が高まっている。

哺乳動物細胞株を使用する組換えタンパク質の合成のための現在の遺伝子発現系は、細胞培養条件又は宿主細胞の代謝に関わらず、構成的に活性であり、組換えタンパク質生成物遺伝子転写を指示する。このような系は、生成物遺伝子転写を、内因性宿主細胞タンパク質について生じるように宿主細胞株の細胞内状態と調整することができず、特に、NGBについて細胞ストレス及び不十分な生成物結果につながる。NGBが、本発明者らの現在の細胞株及び遺伝子発現系を限界に達せさせているので、組換えタンパク質生成物遺伝子の転写を宿主細胞の全体的な代謝とより良好に調整する必要がある。これは、細胞ストレスのレベル下げ、本発明者らの哺乳動物細胞工場の、高レベルの、正しい生成物品質性状(例えば、グリコシル化プロフィール、正しいフォールディング構造など)を有する生成物を生成する既存の能力をより良好に利用するのに役立つであろう。

哺乳動物宿主細胞株が、高レベルの組換えタンパク質生成物、特に、NGBを構成的に合成するように制約される場合又はタンパク質を発現することが困難である場合、フォールディングされていないタンパク質応答(UPR)と呼ばれる細胞ストレス経路が、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積によって活性化される。これは、細胞が十分な時間、現在のタンパク質負荷を正しくプロセシングし、フォールディングすることを可能にするための、タンパク質翻訳全般的な全体的低下につながる。このようなストレス応答の活性化は、組換えタンパク質生成物の全体的な収量に対してだけでなく、望ましいPQプロファイルに対しても阻害性である。

[発明の概要
一態様では、本開示は、レプレッサーポリペプチド(例えば、ヌクレアーゼ活性(dCas9)を欠くCas9タンパク質のバージョン(CRISPR−Cas9遺伝子編集系に由来する))を使用して、状態の変化(例えば、細胞ストレスの増大)に応じて、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド転写率を低減する遺伝制御回路を特徴とする。状態の変化に応じて、状態依存性遺伝子プロモーターは、レプレッサーポリペプチド遺伝子の転写率を増大する。生じたレプレッサーポリペプチドは、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドと、又は遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドに作動可能に連結された制御エレメントと結合する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドがCas9のバージョンを含む場合には、レプレッサーポリペプチドは、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド又はそれに作動可能に連結された制御エレメントに対して相同性を有する少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)の同時発現のために、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドと、又は遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドに作動可能に連結された制御エレメントと結合する。レプレッサーポリペプチドが、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド又はそれに作動可能に連結された制御エレメントと結合している場合には、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドの転写率が低減され、治療用ポリペプチドの細胞内mRNAコピー数の低下につながる。いくつかの実施形態では、状態の変化は、細胞ストレスの変化、例えば、細胞ストレスの増大又はストレスがない状況からストレスがある状況への移行であり、細胞ストレスの変化は、哺乳動物UPRの活性化であるが、その他の細胞ストレス応答もこの使用のために充てることができる。一実施形態では、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドは、hCMVプロモーターの制御下で転写されるが、その他のプロモーターを使用してもよい(例えば、mCMV及びハイブリッドCMVプロモーター)。遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド転写率を低減することによって、宿主細胞での外因性治療用ポリペプチドの生合成負荷が低減され、それによって、初期細胞ストレス応答を軽減する。この方法で、宿主細胞株は、組換えタンパク質生成物遺伝子の転写率を自己調節し、初期細胞ストレス応答の長期活性化を避けることができる。ひとたび、初期ストレス応答が軽減されると、外因性治療用ポリペプチドの転写率は、経時的に抑制解除される。細胞が、細胞の生合成能をより良好に利用するために、組換え遺伝子発現を、細胞の生理学的状況全体と最適に調整するので、これは、組換えタンパク質の収率の全体的な増大を経時的にもたらし得る。

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントを含む遺伝制御回路を特徴とし、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、遺伝制御回路は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む細胞、例えば、CHO細胞を特徴とし、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10又はそれより多い制御エレメントを含む。一実施形態では、全シグナル伝達経路は、本明細書において開示される方法を使用して経路において単一節を制御することによって制御される。いくつかの実施形態では、全シグナル伝達経路は、例えば、経路の異なる配列を調節する異なるプロモーターを使用することによってシグナル伝達経路の複数の代謝分岐を制御することによって制御される。したがって、本発明の方法は、自己調節性細胞においていくつかの層の制御を提供する。例えば、翻訳伸長開始因子は、複数の経路を制御できるグローバル節点の一例である。或いは、ローカル節点の一例として、組換え抗体重鎖ポリペプチドのAsn297と付着しているグリカンガラクトース残基を付加し、ガラクトース及びシアル酸残基の両方を有するN−グリカンを作製するのに必要である酵素ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がある。

一態様では、本開示は、挿入部位、例えば、制限部位又はSSI部位に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む細胞、例えば、CHO細胞を特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む細胞、例えば、CHO細胞を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、第1の制御エレメント、例えば、挿入部位、例えば、制限部位又はSSI部位に作動可能に連結された第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む細胞、例えば、CHO細胞を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む1又は複数の核酸を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、キットは、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、挿入部位、例えば、制限部位に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む1つ又は複数の核酸を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、キットは、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、治療用ポリペプチドを作製する方法であって、a)外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む細胞、例えば、CHO細胞を獲得するステップであって、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少されるステップと、b)細胞を治療用ポリペプチドを作製することを可能にする条件下で培養し、それによって治療用ポリペプチドを作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、a)の細胞は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、治療用ポリペプチドを作製する方法であって、a)細胞、例えば、CHO細胞を獲得するステップと、b)細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターをコードする第1の核酸配列を形成又は提供するステップと、c)細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターをコードする第2の核酸を形成又は提供するステップとを含み、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少されるステップと、d)細胞を治療用ポリペプチドを作製するのを可能にする条件下で培養し、それによって、治療用ポリペプチドを作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、さらに任意選択で、c)とd)の間に、細胞中で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターをコードする第3の核酸を形成又は提供するステップを含むさらなるステップを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、治療用ポリペプチドを作製する方法であって、a)細胞、例えば、CHO細胞を獲得するステップと、b)細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターをコードする第1の核酸配列を形成又は提供するステップと、c)細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターをコードする第2の核酸を形成又は提供するステップと、任意選択で、d)細胞中で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメントをコードする第3の核酸を形成又は提供するステップであって、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少されるステップと、e)細胞を治療用ポリペプチドを作製することを可能にする条件下で培養し、それによって治療用ポリペプチドを作製するステップとを含む方法を特徴とする。実施形態では、ステップa〜dを任意の順序で実施できる。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む核酸を特徴とし、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、核酸は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、挿入部位、例えば、制限部位に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む核酸を特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、核酸は、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本発明の開示は、本開示の細胞を作製する方法であって、a)細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターをコードする第1の核酸配列を形成又は提供するステップと、b)細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターをコードする第2の核酸を形成又は提供するステップであって、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少又は増加され、それによって、細胞を作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターをコードする第3の核酸配列を形成又は提供することを含むステップc)をさらに含む。実施形態では、ステップa〜cは任意の順序で実施できる。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本発明の開示は、目的生成物品質性状を有するポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチドの経済的に増強された収量をもたらすことが可能な細胞を作製する方法であって、a)細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターをコードする第1の核酸配列を形成又は提供するステップと、b)細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターをコードする第2の核酸を形成又は提供するステップであって、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少又は増大され、それによって、目的生成物品質性状を有するポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチドの経済的に増強された収量をもたらすことが可能な細胞を作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターをコードする第3の核酸配列を形成又は提供することを含むステップc)をさらに含む。実施形態では、ステップa〜cを任意の順序で実施できる。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

一態様では、本発明の開示は、表1〜4から選択される外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された表5から選択される第1の制御エレメントと、Cas9ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された表6から選択される第2の制御エレメントと、構成的に発現される1又は複数のgRNA配列とを含み、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される細胞を特徴とする。

一態様では、本発明の開示は、1又は複数の細胞が、第1の条件を含み、1又は複数の細胞が、第2の条件を含む、本明細書において記載される複数の細胞を特徴とする。

概要

レプレッサーポリペプチドを使用して、条件の変更に応じて、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドの転写率を低減する、遺伝制御回路、細胞及び方法が開示される。なし

目的

本発明の方法は、自己調節性細胞においていくつかの層の制御を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメントと、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメントと、任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメントとを含む細胞であって、i)第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベル活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有するか、又はii)第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、治療用ポリペプチドの発現は、第2の条件の存在下で、例えば、可逆性に調節される、細胞。

請求項2

挿入部位に作動可能に連結された第1の制御エレメントと、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメントと、任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメントとを含む細胞であって、i)第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有するか、又はii)第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、治療用ポリペプチドの発現は、第2の条件の存在下で、例えば、可逆性に調節される、細胞。

請求項3

前記第2、第3、又は第2及び第3の制御エレメントが、第Nの条件下で第Nのレベルの活性を有し、Nが、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、前記治療用ポリペプチドの発現が、第Nの条件の存在下で、これまでの条件下での治療用ポリペプチドの発現に対して調節される、請求項1又は2に記載の細胞。

請求項4

(a)前記第1の制御エレメント及び外因性治療用ポリペプチドをコードする配列が、第1の核酸に配置され、前記第2の制御エレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列が、第2の核酸に配置され、(i)前記第3の制御エレメント及び1又は複数のgRNAをコードする配列が、前記第1の核酸に配置されるか、(ii)前記第3の制御エレメント及び1又は複数のgRNAをコードする配列が、前記第2の核酸に配置されるか、又は(iii)前記第3の制御エレメント及び1又は複数のgRNAをコードする配列が、第3の核酸に配置され;又は(b)前記第1の制御エレメント、前記外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、前記第2の制御エレメント及び前記レプレッサーポリペプチドをコードする配列が、同一の核酸に配置され、(i)前記第3の制御エレメント及び1又は複数のgRNAをコードする配列が、前記第1の制御エレメント、前記外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、前記第2の制御エレメント及び前記レプレッサーポリペプチドをコードする配列と同一の核酸に配置されるか、又は(ii)前記第3の制御エレメント及び1又は複数のgRNAをコードする配列が、前記第1の制御エレメント、前記外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、前記第2の制御エレメント及び前記レプレッサーポリペプチドをコードする配列とは別個の核酸に配置される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞。

請求項5

1又は複数の核酸が、(a)安定な発現に適したベクター、例えば、プラスミド、又は(b)一過性の発現に適したベクター内に含まれる、請求項4に記載の細胞。

請求項6

(a)1又は複数の核酸が、同一ベクター内に含まれるか、(b)各核酸が、異なるベクターに含まれるか、(c)1又は複数の核酸が、単一染色体内に含まれるか、又は(d)各核酸が異なる染色体内に含まれる、請求項5に記載の細胞。

請求項7

(a)前記第1の核酸が、ベクター内に含まれ、前記第2の核酸が、染色体内に含まれるか、(b)前記第1の核酸が、染色体内に含まれ、前記第2の核酸が、ベクター内に含まれるか、(c)前記第1の核酸が、ベクター内に含まれ、前記第2の核酸が、染色体内に含まれ、前記第3の核酸が、ベクター内に含まれるか、(d)前記第1の核酸が、染色体内に含まれ、前記第2の核酸が、ベクター内に含まれ、前記第3の核酸が、ベクター内に含まれるか、(e)前記第1の核酸が、ベクター内に含まれ、前記第2の核酸が、染色体内に含まれ、前記第3の核酸が、染色体内に含まれるか、又は(f)前記第1の核酸が、染色体内に含まれ、前記第2の核酸が、ベクター内に含まれ、前記第3の核酸が、染色体内に含まれる、請求項4に記載の細胞。

請求項8

ストレス応答が、前記第2の制御エレメント又は前記第3の制御エレメントからのレプレッサーポリペプチドの発現を誘導する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の細胞。

請求項9

前記レプレッサーポリペプチドが、前記治療用ポリペプチドの発現を阻害する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の細胞。

請求項10

前記第1の制御エレメントが、前記レプレッサーポリペプチドに対して応答性である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の細胞。

請求項11

前記第1の制御エレメントが、第1のプロモーターエレメントを含み、前記第1のプロモーターエレメントが、レプレッサーポリペプチドの不在下で、以下の特性:a)構成的である、b)調節される、又はc)細胞の増殖の第1の段階で第1のレベルの発現及び増殖の第2の段階で第2のレベルの発現を有するのうち1つを有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の細胞。

請求項12

前記第1のプロモーターエレメントが、表5から選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の細胞。

請求項13

前記治療用ポリペプチドが、融合タンパク質マルチドメインポリペプチド、二重特異性抗体分子多重特異性抗体分子、多重特異性分子及び/又はリガンド及び抗体分子を含む分子を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の細胞。

請求項14

前記治療用ポリペプチドが、表1〜4から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の細胞。

請求項15

前記第2の制御エレメント又は前記第3の制御エレメントが、表5若しくは表6から選択されるか、又は表5若しくは表6から選択される配列と比較して0、1、2若しくは3つの塩基置換を有する配列を含むプロモーターを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の細胞。

請求項16

(a)前記第2の制御エレメントが、第2のプロモーターエレメントを含み、前記第2のプロモーターエレメントが、構成的であり、前記第3の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する第3のプロモーターエレメントを含むか、又は(b)前記第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する第2のプロモーターエレメントを含み、前記第3の制御エレメントが、第3のプロモーターエレメントを含み、前記第3のプロモーターエレメントが構成的である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の細胞。

請求項17

(a)前記第2の制御エレメント又は第3の制御エレメントが、1つ又は複数の熱ショックエレメント(HSE)、cAMP応答エレメント(CRE)、抗酸化薬応答エレメント(ARE)又は小胞体応答エレメント(ERSE)を含むか、(b)前記第2の制御エレメント又は第3の制御エレメントが、熱ショック応答又はフォールディングされていないタンパク質応答(UPR)のエレメントによって調節されるか、(c)前記第2の制御エレメント又は第3の制御エレメントが、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積によって調節されるか、(d)前記第2の制御エレメント又は第3の制御エレメントが、Xbp1応答プロモーターエレメントを含むか、(e)前記第2の制御エレメント又は第3の制御エレメントが、Grp78プロモーターエレメントを含むか、又は(f)前記第2の制御エレメント又は第3の制御エレメントが、ATF6応答プロモーターエレメント、ATF4応答プロモーターエレメント、NRF2応答プロモーターエレメント又はHsf1応答プロモーターエレメントを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の細胞。

請求項18

前記レプレッサーポリペプチドが、前記外因性治療用ポリペプチドの活性、レベル又は発現の低減をもたらす、請求項1〜17のいずれか一項に記載の細胞。

請求項19

前記レプレッサーポリペプチドが、標的核酸配列、例えば、制御エレメント、例えば、プロモーターと特異的に結合する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の細胞。

請求項20

(a)前記レプレッサーポリペプチドが、前記外因性治療用ポリペプチドの転写の低減をもたらすか、(b)前記レプレッサーポリペプチドが、前記外因性治療用ポリペプチドの翻訳を低減するか、(c)前記レプレッサーポリペプチドが、前記外因性治療用ポリペプチドをコードする核酸と、又は前記外因性治療用ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている前記第1のプロモーターと結合するか、(d)(a)及び(b)、(e)(a)及び(c)、(f)(b)及び(c)又は(g)(a)、(b)及び(c)、請求項1〜19のいずれか一項に記載の細胞。

請求項21

前記レプレッサーポリペプチドが、(a)Cas9分子、(b)天然に存在するCas9と比較して、修飾された切断活性を有するCas9分子、(c)HNH及びRuvCドメインのうち一方又は両方において切断活性を欠くCas9分子、(d)dCas9分子、又は(e)前記外因性治療用ポリペプチドの抑制を増強する異種レプレッサードメインをさらに含むCas9分子を含み、任意選択で、異種レプレッサードメインが、Kox1のKRAB(クリュッペル関連ボックス)ドメイン、HP1αのCS(クロシャドウ(chromoshadow))ドメイン、Hes1のWPRWドメイン及びmSin3相互作用ドメインの4連鎖状コピー(SID4X)からなる群から選択される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の細胞。

請求項22

前記Cas9分子が、gRNAと複合体形成すると、配列特異的様式で標的核酸:(a)非翻訳配列、(b)第1の制御エレメント又は(c)外因性治療用ポリペプチドをコードする配列と結合する、請求項21に記載の細胞。

請求項23

前記細胞が、第3の制御エレメントに作動可能に連結された第NのgRNAをコードする第Nの配列をさらに含み、Nが2、3、4、5、6、7、8、9又は10である、請求項1〜22のいずれか一項に記載の細胞。

請求項24

前記第3の制御エレメントが、前記第2の制御エレメント又は前記第1の制御エレメントのさらなるコピーである、請求項1〜23のいずれか一項に記載の細胞。

請求項25

前記第3の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、gRNAの発現が、第2の条件の存在下で調節される、請求項1〜24のいずれか一項に記載の細胞。

請求項26

前記第3の制御エレメントが、以下の特性:a)構成的である、b)調節される、又はc)細胞の増殖の第1の段階で第1のレベルの発現及び増殖の第2の段階で第2のレベルの発現を有するのうち1つを有する、請求項1〜25のいずれか一項に記載の細胞。

請求項27

前記第2のレベルの活性が、前記第1のレベルの活性よりも大きい、請求項1〜26のいずれか一項に記載の細胞。

請求項28

前記第1の条件/第2の条件対が、第1のレベルのストレス及び第2のレベルのストレス、第1のレベルのフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチド(例えば、サイトゾルにおける、又は小胞体(ER)における)及び第2のレベルのフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチド(例えば、サイトゾルにおける、又は小胞体(ER)における)、第1のレベルのフォールディングされた外因性治療用ポリペプチド及び第2のレベルのフォールディングされた外因性治療用ポリペプチド、第1のレベルのタンパク質凝集及び第2のレベルのタンパク質凝集、外因性治療用ポリペプチドでの第1のレベルの第1のグリコシル化パターン及び外因性治療用ポリペプチドでの第2のレベルの第1のグリコシル化パターン、外因性治療用ポリペプチドでのあるレベルの第1のグリコシル化パターン及び外因性治療用ポリペプチドでのあるレベルの第2のグリコシル化パターン、第1のレベルの細胞生存力及び第2のレベルの細胞生存力、第1のレベルの熱ショック応答(HSR)の活性化及び第2のレベルのHSRの活性化、第1のレベルのフォールディングされていないタンパク質応答(UPR)の活性化及び第2のレベルのUPRの活性化、第1のレベルの遊離ERシャペロン及び第2のレベルの遊離ERシャペロン、第1の温度及び第2の温度、第1のレベルの酸化ストレス及び第2のレベルの酸化ストレス、第1のレベルのERCa+2及び第2のレベルのERCa+2、第1のER酸化状態及び第2のER酸化状態、第1の細胞エネルギーレベル及び第2の細胞エネルギーレベル、第1のATPレベル及び第2のATPレベル第1のグルコースレベル及び第2のグルコースレベル、第1のレベルの活性化されたHsf1ポリペプチド及び第2のレベルの活性化されたHsf1ポリペプチド、第1のレベルのリン酸化された三量体Hsf1ポリペプチド及び第2のレベルのリン酸化された三量体Hsf1ポリペプチド、第1のレベルの活性Xbp1ポリペプチド及び第2のレベルの活性化されたXbp1ポリペプチド、第1のレベルのATF4ポリペプチド及び第2のレベルのATF4ポリペプチド、第1のレベルのNRF2ポリペプチド及び第2のレベルのNRF2ポリペプチド、並びに第1のレベルのATF6ポリペプチド及び第2のレベルのATF6ポリペプチドからなる群から選択される、請求項1〜27のいずれか一項に記載の細胞。

請求項29

ストレス応答が、レプレッサーポリペプチドの発現を誘導し、前記レプレッサーポリペプチドが、前記治療用ポリペプチドの発現を阻害する、請求項1〜28のいずれか一項に記載の細胞。

請求項30

前記第2の条件で、前記外因性治療用ポリペプチドの発現が、前記第1の条件での発現と比較して、少なくとも5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%低減される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の細胞。

請求項31

外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメントと、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメントと、任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメントとを含む核酸であって、i)前記第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有するか、又はii)前記第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第2の条件の存在下で調節される、核酸。

請求項32

挿入部位に作動可能に連結された第1の制御エレメントと、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメントと、任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメントとを含む核酸であって、i)前記第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有するか、又はii)前記第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、前記挿入部位は、前記外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第2の条件の存在下で調節される、核酸。

請求項33

請求項1〜30のいずれか一項に記載の細胞又は請求項31若しくは32に記載の核酸を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキット

請求項34

請求項1〜30のいずれか一項に記載の細胞を作製する方法であって、a)細胞において、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメントをコードする第1の核酸配列を形成又は提供するステップと、b)細胞において、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメントをコードする第2の核酸を形成又は提供するステップと、c)任意選択で、細胞において、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメントをコードする第3の核酸を形成又は提供するステップとを含み、i)前記第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有するか、又はii)前記第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第2の条件の存在下で調節され、それによって細胞を作製する、方法。

請求項35

治療用ポリペプチドを作製する方法であって、a)請求項1〜30のいずれか一項に記載の細胞を獲得するステップと、b)前記治療用ポリペプチドの作製を可能にする条件下で細胞を培養するステップとを含み、それによって前記治療用ポリペプチドを作製する、方法。

請求項36

治療用ポリペプチドを作製する方法であって、a)細胞を獲得するステップと、b)細胞において、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメントをコードする第1の核酸配列を形成又は提供するステップと、c)細胞において、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメントをコードする第2の核酸を形成又は提供するステップと、d)任意選択で、細胞において、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメントをコードする第3の核酸を形成又は提供するステップとを含む方法であって、i)前記第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有するか、又はii)前記第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第2の条件の存在下で調節されるステップと、e)前記治療用ポリペプチドの作製を可能にする条件下で細胞を培養するステップとを含み、それによって、治療用ポリペプチドを作製する、方法。

請求項37

請求項1〜30のいずれか一項に記載の細胞と培養培地とを含む反応混合物であって、前記培養培地が、前記治療用ポリペプチドを発現するのに適している、反応混合物。

請求項38

外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメントと、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメントと、任意選択で、1又は複数のgRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメントとを含む遺伝制御回路であって、i)前記第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有するか、又はii)前記第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第2の条件の存在下で調節される、遺伝制御回路。

請求項39

表1〜4から選択される外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表5から選択される第1の制御エレメントと、Cas9ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表6から選択される第2の制御エレメントと構成的に発現される1又は複数のgRNA配列とを含む細胞であって、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第2の条件の存在下で調節される、細胞。

請求項40

表1〜4から選択される外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表5から選択される第1の制御エレメントと、Cas9ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表5から選択される第2の制御エレメントと1又は複数のgRNA配列に作動可能に連結された、表6から選択される第3の制御エレメントとを含む細胞であって、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第2の条件の存在下で調節される、細胞。

請求項41

1又は複数の細胞が、第1の条件を含み、1又は複数の細胞が、第2の条件を含む、請求項1〜30、39及び40のいずれか一項に記載の複数の細胞。

技術分野

0001

本発明は、細胞ストレス応答する遺伝制御回路を使用して細胞及び細胞株によって、生成物、例えば、組換えタンパク質発現を調節する方法及び組成物に関する。

背景技術

0002

組換え治療用タンパク質は、細胞発現系、例えば、哺乳動物細胞発現系において一般に発現される。2014年に、市販の承認された生物学的製剤総数は、212であり、FDAによって市販のための承認された治療用製品の56%は、哺乳動物細胞株において製造されている。しかし、製造と関連する高コストが、世界的な医療経皮の増大に寄与している。

0003

さらに、次世代融合タンパク質多量体糖タンパク質又は次世代抗体などの次世代タンパク質生物製剤(NGB)は、複雑な及び/又は非天然構造を有することが多く、モノクローナル抗体などの分子よりも発現することがより困難であるとわかっている。現在の宿主細胞株は、NGBの効率的な合成及び分泌のための経路進化させておらず、その結果、大幅に低減された増殖、低い生産性となり、生成物品質(PQ)性状の悪い製品となることも多い。したがって、これらのNGBは、発現することが困難と考えられ、これでは、生産性及び生成物品質は、臨床的及び商業的要求を満たさない。したがって、最終生成物品質を維持しながら、組換え生物学的治療薬を迅速に、効率的に、及び費用効率的に開発し、製造する必要性が高まっている。

0004

哺乳動物細胞株を使用する組換えタンパク質の合成のための現在の遺伝子発現系は、細胞培養条件又は宿主細胞の代謝に関わらず、構成的に活性であり、組換えタンパク質生成物遺伝子転写を指示する。このような系は、生成物遺伝子転写を、内因性宿主細胞タンパク質について生じるように宿主細胞株の細胞内状態と調整することができず、特に、NGBについて細胞ストレス及び不十分な生成物結果につながる。NGBが、本発明者らの現在の細胞株及び遺伝子発現系を限界に達せさせているので、組換えタンパク質生成物遺伝子の転写を宿主細胞の全体的な代謝とより良好に調整する必要がある。これは、細胞ストレスのレベル下げ、本発明者らの哺乳動物細胞工場の、高レベルの、正しい生成物品質性状(例えば、グリコシル化プロフィール、正しいフォールディング構造など)を有する生成物を生成する既存の能力をより良好に利用するのに役立つであろう。

0005

哺乳動物宿主細胞株が、高レベルの組換えタンパク質生成物、特に、NGBを構成的に合成するように制約される場合又はタンパク質を発現することが困難である場合、フォールディングされていないタンパク質応答(UPR)と呼ばれる細胞ストレス経路が、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積によって活性化される。これは、細胞が十分な時間、現在のタンパク質負荷を正しくプロセシングし、フォールディングすることを可能にするための、タンパク質翻訳全般的な全体的低下につながる。このようなストレス応答の活性化は、組換えタンパク質生成物の全体的な収量に対してだけでなく、望ましいPQプロファイルに対しても阻害性である。

0006

[発明の概要
一態様では、本開示は、レプレッサーポリペプチド(例えば、ヌクレアーゼ活性(dCas9)を欠くCas9タンパク質のバージョン(CRISPR−Cas9遺伝子編集系に由来する))を使用して、状態の変化(例えば、細胞ストレスの増大)に応じて、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド転写率を低減する遺伝制御回路を特徴とする。状態の変化に応じて、状態依存性遺伝子プロモーターは、レプレッサーポリペプチド遺伝子の転写率を増大する。生じたレプレッサーポリペプチドは、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドと、又は遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドに作動可能に連結された制御エレメントと結合する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドがCas9のバージョンを含む場合には、レプレッサーポリペプチドは、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド又はそれに作動可能に連結された制御エレメントに対して相同性を有する少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)の同時発現のために、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドと、又は遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドに作動可能に連結された制御エレメントと結合する。レプレッサーポリペプチドが、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド又はそれに作動可能に連結された制御エレメントと結合している場合には、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドの転写率が低減され、治療用ポリペプチドの細胞内mRNAコピー数の低下につながる。いくつかの実施形態では、状態の変化は、細胞ストレスの変化、例えば、細胞ストレスの増大又はストレスがない状況からストレスがある状況への移行であり、細胞ストレスの変化は、哺乳動物UPRの活性化であるが、その他の細胞ストレス応答もこの使用のために充てることができる。一実施形態では、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドは、hCMVプロモーターの制御下で転写されるが、その他のプロモーターを使用してもよい(例えば、mCMV及びハイブリッドCMVプロモーター)。遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド転写率を低減することによって、宿主細胞での外因性治療用ポリペプチドの生合成負荷が低減され、それによって、初期細胞ストレス応答を軽減する。この方法で、宿主細胞株は、組換えタンパク質生成物遺伝子の転写率を自己調節し、初期細胞ストレス応答の長期活性化を避けることができる。ひとたび、初期ストレス応答が軽減されると、外因性治療用ポリペプチドの転写率は、経時的に抑制解除される。細胞が、細胞の生合成能をより良好に利用するために、組換え遺伝子発現を、細胞の生理学的状況全体と最適に調整するので、これは、組換えタンパク質の収率の全体的な増大を経時的にもたらし得る。

0007

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントを含む遺伝制御回路を特徴とし、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、遺伝制御回路は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0008

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む細胞、例えば、CHO細胞を特徴とし、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10又はそれより多い制御エレメントを含む。一実施形態では、全シグナル伝達経路は、本明細書において開示される方法を使用して経路において単一節を制御することによって制御される。いくつかの実施形態では、全シグナル伝達経路は、例えば、経路の異なる配列を調節する異なるプロモーターを使用することによってシグナル伝達経路の複数の代謝分岐を制御することによって制御される。したがって、本発明の方法は、自己調節性細胞においていくつかの層の制御を提供する。例えば、翻訳伸長開始因子は、複数の経路を制御できるグローバル節点の一例である。或いは、ローカル節点の一例として、組換え抗体重鎖ポリペプチドのAsn297と付着しているグリカンガラクトース残基を付加し、ガラクトース及びシアル酸残基の両方を有するN−グリカンを作製するのに必要である酵素ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がある。

0009

一態様では、本開示は、挿入部位、例えば、制限部位又はSSI部位に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む細胞、例えば、CHO細胞を特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0010

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む細胞、例えば、CHO細胞を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0011

一態様では、本開示は、第1の制御エレメント、例えば、挿入部位、例えば、制限部位又はSSI部位に作動可能に連結された第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む細胞、例えば、CHO細胞を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0012

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む1又は複数の核酸を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、キットは、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0013

一態様では、本開示は、挿入部位、例えば、制限部位に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む1つ又は複数の核酸を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、キットは、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0014

一態様では、本開示は、治療用ポリペプチドを作製する方法であって、a)外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む細胞、例えば、CHO細胞を獲得するステップであって、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少されるステップと、b)細胞を治療用ポリペプチドを作製することを可能にする条件下で培養し、それによって治療用ポリペプチドを作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、a)の細胞は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0015

一態様では、本開示は、治療用ポリペプチドを作製する方法であって、a)細胞、例えば、CHO細胞を獲得するステップと、b)細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターをコードする第1の核酸配列を形成又は提供するステップと、c)細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターをコードする第2の核酸を形成又は提供するステップとを含み、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少されるステップと、d)細胞を治療用ポリペプチドを作製するのを可能にする条件下で培養し、それによって、治療用ポリペプチドを作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、さらに任意選択で、c)とd)の間に、細胞中で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターをコードする第3の核酸を形成又は提供するステップを含むさらなるステップを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0016

一態様では、本開示は、治療用ポリペプチドを作製する方法であって、a)細胞、例えば、CHO細胞を獲得するステップと、b)細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターをコードする第1の核酸配列を形成又は提供するステップと、c)細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターをコードする第2の核酸を形成又は提供するステップと、任意選択で、d)細胞中で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメントをコードする第3の核酸を形成又は提供するステップであって、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少されるステップと、e)細胞を治療用ポリペプチドを作製することを可能にする条件下で培養し、それによって治療用ポリペプチドを作製するステップとを含む方法を特徴とする。実施形態では、ステップa〜dを任意の順序で実施できる。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0017

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む核酸を特徴とし、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、核酸は、さらに任意選択で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0018

一態様では、本開示は、挿入部位、例えば、制限部位に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターを含む核酸を特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、核酸は、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0019

一態様では、本発明の開示は、本開示の細胞を作製する方法であって、a)細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターをコードする第1の核酸配列を形成又は提供するステップと、b)細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターをコードする第2の核酸を形成又は提供するステップであって、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少又は増加され、それによって、細胞を作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターをコードする第3の核酸配列を形成又は提供することを含むステップc)をさらに含む。実施形態では、ステップa〜cは任意の順序で実施できる。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0020

一態様では、本発明の開示は、目的生成物品質性状を有するポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチドの経済的に増強された収量をもたらすことが可能な細胞を作製する方法であって、a)細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターをコードする第1の核酸配列を形成又は提供するステップと、b)細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターをコードする第2の核酸を形成又は提供するステップであって、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少又は増大され、それによって、目的生成物品質性状を有するポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチドの経済的に増強された収量をもたらすことが可能な細胞を作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中で、1又は複数の(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多い)gRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターをコードする第3の核酸配列を形成又は提供することを含むステップc)をさらに含む。実施形態では、ステップa〜cを任意の順序で実施できる。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0021

一態様では、本発明の開示は、表1〜4から選択される外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された表5から選択される第1の制御エレメントと、Cas9ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された表6から選択される第2の制御エレメントと、構成的に発現される1又は複数のgRNA配列とを含み、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される細胞を特徴とする。

0022

一態様では、本発明の開示は、1又は複数の細胞が、第1の条件を含み、1又は複数の細胞が、第2の条件を含む、本明細書において記載される複数の細胞を特徴とする。

図面の簡単な説明

0023

図1A図1B図1C及び図1Dは、状態、例えば、細胞ストレスに応じて組換え又は治療用ポリペプチド生成物遺伝子の転写を調節する遺伝制御回路の設計原理の模式図を示す図である。図1Aでは、組換えタンパク質の生成がストレス/毒性を誘導し、これはレプレッサーの生成を活性化し、それによって組換え又は治療用ポリペプチド発現の直接阻害を伴う。図1Bでは、図1Aにおける得られた組換え又は治療用ポリペプチド発現の阻害が、ストレス/毒性を最終的に排除し、レプレッサーの活性化を除去し、間接的に組換え又は治療用ポリペプチド発現の受動的増大につながる。事実上、この系は、宿主細胞においてストレス/毒性を誘導する特定のレベル付近の組換え又は治療用ポリペプチド発現の経時的周期的変動つながり得る(図1C)。制御のさらなる任意選択の層を、細胞ストレス/毒性が軽減されると活性になる組換え又は治療用ポリペプチド発現の正のアクチベーターを含むこの基礎回路に適用することができる(図1D)。
図1A図1B図1C及び図1Dは、状態、例えば、細胞ストレスに応じて組換え又は治療用ポリペプチド生成物遺伝子の転写を調節する遺伝制御回路の設計原理の模式図を示す図である。図1Aでは、組換えタンパク質の生成がストレス/毒性を誘導し、これはレプレッサーの生成を活性化し、それによって組換え又は治療用ポリペプチド発現の直接阻害を伴う。図1Bでは、図1Aにおける得られた組換え又は治療用ポリペプチド発現の阻害が、ストレス/毒性を最終的に排除し、レプレッサーの活性化を除去し、間接的に組換え又は治療用ポリペプチド発現の受動的増大につながる。事実上、この系は、宿主細胞においてストレス/毒性を誘導する特定のレベル付近の組換え又は治療用ポリペプチド発現の経時的周期的変動につながり得る(図1C)。制御のさらなる任意選択の層を、細胞ストレス/毒性が軽減されると活性になる組換え又は治療用ポリペプチド発現の正のアクチベーターを含むこの基礎回路に適用することができる(図1D)。
図1A図1B図1C及び図1Dは、状態、例えば、細胞ストレスに応じて組換え又は治療用ポリペプチド生成物遺伝子の転写を調節する遺伝制御回路の設計原理の模式図を示す図である。図1Aでは、組換えタンパク質の生成がストレス/毒性を誘導し、これはレプレッサーの生成を活性化し、それによって組換え又は治療用ポリペプチド発現の直接阻害を伴う。図1Bでは、図1Aにおける得られた組換え又は治療用ポリペプチド発現の阻害が、ストレス/毒性を最終的に排除し、レプレッサーの活性化を除去し、間接的に組換え又は治療用ポリペプチド発現の受動的増大につながる。事実上、この系は、宿主細胞においてストレス/毒性を誘導する特定のレベル付近の組換え又は治療用ポリペプチド発現の経時的周期的変動につながり得る(図1C)。制御のさらなる任意選択の層を、細胞ストレス/毒性が軽減されると活性になる組換え又は治療用ポリペプチド発現の正のアクチベーターを含むこの基礎回路に適用することができる(図1D)。
図1A図1B図1C及び図1Dは、状態、例えば、細胞ストレスに応じて組換え又は治療用ポリペプチド生成物遺伝子の転写を調節する遺伝制御回路の設計原理の模式図を示す図である。図1Aでは、組換えタンパク質の生成がストレス/毒性を誘導し、これはレプレッサーの生成を活性化し、それによって組換え又は治療用ポリペプチド発現の直接阻害を伴う。図1Bでは、図1Aにおける得られた組換え又は治療用ポリペプチド発現の阻害が、ストレス/毒性を最終的に排除し、レプレッサーの活性化を除去し、間接的に組換え又は治療用ポリペプチド発現の受動的増大につながる。事実上、この系は、宿主細胞においてストレス/毒性を誘導する特定のレベル付近の組換え又は治療用ポリペプチド発現の経時的周期的変動につながり得る(図1C)。制御のさらなる任意選択の層を、細胞ストレス/毒性が軽減されると活性になる組換え又は治療用ポリペプチド発現の正のアクチベーターを含むこの基礎回路に適用することができる(図1D)。
図2は、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメント、例えば、フォールディングされていないタンパク質応答(UPR)活性化プロモーターから制御されるレプレッサーポリペプチド、例えば、dCas9の不在下で構成的である、第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメント、例えば、hCMVプロモーターによって駆動される組換え又は治療用ポリペプチド(rP)転写を示す例示的遺伝制御回路を表す図である。この例では、rPを合成する時に起こり得るUPRの活性化時に、レプレッサーポリペプチド、例えば、dCas9が生成される。gRNAと組み合わせて、dCas9は、UPRストレス応答が軽減されるまで、hCMVプロモーターと結合し、rP生成を阻害する。
図3Aは、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメント、例えば、構成的mCMVプロモーターから制御される、レプレッサーポリペプチド、例えば、dCas9の不在下で構成的である、第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメント、例えば、hCMVプロモーターによって駆動されるGFP転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、構成的に発現されたdCas9は、gRNA1、2又は3(hCMVに対して特異的であり、U6プロモーターから構成的に生成される)と組み合わせて、hCMVプロモーターと結合し、GFP発現を阻害する。図3Bは、hCMV−eGFPを安定に発現するCHO細胞であって、1)空の発現ベクターUTC)、2)dCas9をコードする発現ベクター又は3)dCas9をコードする発現ベクター及びhCMVに対する特異性を有する3つのgRNAをコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトされたCHO細胞のGFP蛍光を示すフローサイトメトリーヒストグラムを表す図である。
図3Aは、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメント、例えば、構成的mCMVプロモーターから制御される、レプレッサーポリペプチド、例えば、dCas9の不在下で構成的である、第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメント、例えば、hCMVプロモーターによって駆動されるGFP転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、構成的に発現されたdCas9は、gRNA1、2又は3(hCMVに対して特異的であり、U6プロモーターから構成的に生成される)と組み合わせて、hCMVプロモーターと結合し、GFP発現を阻害する。図3Bは、hCMV−eGFPを安定に発現するCHO細胞であって、1)空の発現ベクター(UTC)、2)dCas9をコードする発現ベクター又は3)dCas9をコードする発現ベクター及びhCMVに対する特異性を有する3つのgRNAをコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトされたCHO細胞のGFP蛍光を示すフローサイトメトリーヒストグラムを表す図である。
図4Aは、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメント、例えば、構成的mCMVプロモーターによって制御されるレプレッサーポリペプチド、例えば、dCas9の不在下で構成的である、2つの別個の第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメント、例えば、hCMVプロモーターによって駆動されるMab HC及びMab LC転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、構成的に発現されたdCas9は、gRNA1、2又は3(hCMVに対して特異的であり、U6プロモーターから構成的に生成される)と組み合わせて、hCMVプロモーターと結合し、Mab HC及びMab LC発現を阻害する。図4Bは、トランスフェクションの3、4若しくは5日後の、DNAなし、dCas9をコードする発現ベクター又はdCas9及びhCMVに対して特異性を有する1つ、2つ若しくは3つのgRNAをコードする発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトされたCHO細胞から得たhCMV−Mabレベルのグラフを表す図である。
図4Aは、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメント、例えば、構成的mCMVプロモーターによって制御されるレプレッサーポリペプチド、例えば、dCas9の不在下で構成的である、2つの別個の第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメント、例えば、hCMVプロモーターによって駆動されるMab HC及びMab LC転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、構成的に発現されたdCas9は、gRNA1、2又は3(hCMVに対して特異的であり、U6プロモーターから構成的に生成される)と組み合わせて、hCMVプロモーターと結合し、Mab HC及びMab LC発現を阻害する。図4Bは、トランスフェクションの3、4若しくは5日後の、DNAなし、dCas9をコードする発現ベクター又はdCas9及びhCMVに対して特異性を有する1つ、2つ若しくは3つのgRNAをコードする発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトされたCHO細胞から得たhCMV−Mabレベルのグラフを表す図である。
図5Aは、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメント、例えば、フォールディングされていないタンパク質応答(UPR)ストレス誘導性Grp78プロモーターから制御されるレプレッサーポリペプチド、例えば、dCas9の不在下で構成的である第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメント、例えば、hCMVプロモーターによって駆動されるGFP転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、UPRストレスは、dCas9の発現を促進し、これは、gRNA1、2又は3(hCMVに対して特異的であり、U6プロモーターから構成的に生成される)と組み合わせて、hCMVプロモーターと結合し、GFP発現を阻害する。図5Bは、hCMV−eGFPを安定に発現するCHO細胞であって、1)空の発現ベクター(WT)、2)Grp78プロモーター下にdCas9をコードする発現ベクター(Grp78 dCas9制御)又は3)Grp78プロモーター下にdCas9をコードする発現ベクター及びhCMVプロモーターに対して特異性を有するgRNAをコードする発現ベクターのいずれかを用いて一過性にトランスフェクトされており、400ng/mLツニカマイシン(TM)を用いて処理されている、又はTMを用いて処理されていない(0TM)CHO細胞のGFP蛍光を示すフローサイトメトリーデータのグラフを表す図である。
図5Aは、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメント、例えば、フォールディングされていないタンパク質応答(UPR)ストレス誘導性Grp78プロモーターから制御されるレプレッサーポリペプチド、例えば、dCas9の不在下で構成的である第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメント、例えば、hCMVプロモーターによって駆動されるGFP転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、UPRストレスは、dCas9の発現を促進し、これは、gRNA1、2又は3(hCMVに対して特異的であり、U6プロモーターから構成的に生成される)と組み合わせて、hCMVプロモーターと結合し、GFP発現を阻害する。図5Bは、hCMV−eGFPを安定に発現するCHO細胞であって、1)空の発現ベクター(WT)、2)Grp78プロモーター下にdCas9をコードする発現ベクター(Grp78 dCas9制御)又は3)Grp78プロモーター下にdCas9をコードする発現ベクター及びhCMVプロモーターに対して特異性を有するgRNAをコードする発現ベクターのいずれかを用いて一過性にトランスフェクトされており、400ng/mLツニカマイシン(TM)を用いて処理されている、又はTMを用いて処理されていない(0TM)CHO細胞のGFP蛍光を示すフローサイトメトリーデータのグラフを表す図である。
図6A図6Cは、CHO宿主細胞株における一過性の組換えタンパク質発現に対する遺伝制御回路の影響を示す図である。図6Aは、発現ベクターに含有される遺伝制御回路を示す図であり、dCas9遺伝子は、Grp78プロモーター下にあり、hCMVプロモーターに対して特異性を有する3つのgRNA配列(gRNA1、2及び3)は各々、別個の構成的U6プロモーター下にある(gRNA123回路)。このベクターバリアントは、gRNA1、2及び3配列の代わりにgRNA14配列を含有していた(sgRNA14回路)。図6Bは、いくつかの発現が困難である組換えタンパク質をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の、制御回路を含有する安定なCHOプールから生成された組換えタンパク質濃度を示す図である。組換えタンパク質濃度は、一過性トランスフェクションの6日後に決定した。親のCHO細胞株は、遺伝制御回路を欠く。エラーバーは、2連で実施したブリツモマブベクターを用いる親の細胞株のトランスフェクションを除くすべてのデータ点の3連のトランスフェクションの標準偏差を表す。図6Cは、高度凝集性Mab H9K7をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の制御回路を含有する安定なCHOプールから生成された、6日目の組換えタンパク質濃度を示す図である。トランスフェクションの24時間後に、一過性トランスフェクションフラスコの半量を、0.1μg/mLの濃度のUPR−インデューサーツニカマイシン(TM)を用いて処置した。エラーバーは、3連のトランスフェクションの標準偏差を表す。
図6A図6Cは、CHO宿主細胞株における一過性の組換えタンパク質発現に対する遺伝制御回路の影響を示す図である。図6Aは、発現ベクターに含有される遺伝制御回路を示す図であり、dCas9遺伝子は、Grp78プロモーター下にあり、hCMVプロモーターに対して特異性を有する3つのgRNA配列(gRNA1、2及び3)は各々、別個の構成的U6プロモーター下にある(gRNA123回路)。このベクターのバリアントは、gRNA1、2及び3配列の代わりにgRNA14配列を含有していた(sgRNA14回路)。図6Bは、いくつかの発現が困難である組換えタンパク質をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の、制御回路を含有する安定なCHOプールから生成された組換えタンパク質濃度を示す図である。組換えタンパク質濃度は、一過性トランスフェクションの6日後に決定した。親のCHO細胞株は、遺伝制御回路を欠く。エラーバーは、2連で実施したブリナツモマブベクターを用いる親の細胞株のトランスフェクションを除くすべてのデータ点の3連のトランスフェクションの標準偏差を表す。図6Cは、高度凝集性Mab H9K7をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の制御回路を含有する安定なCHOプールから生成された、6日目の組換えタンパク質濃度を示す図である。トランスフェクションの24時間後に、一過性トランスフェクションフラスコの半量を、0.1μg/mLの濃度のUPR−インデューサーツニカマイシン(TM)を用いて処置した。エラーバーは、3連のトランスフェクションの標準偏差を表す。
図6A図6Cは、CHO宿主細胞株における一過性の組換えタンパク質発現に対する遺伝制御回路の影響を示す図である。図6Aは、発現ベクターに含有される遺伝制御回路を示す図であり、dCas9遺伝子は、Grp78プロモーター下にあり、hCMVプロモーターに対して特異性を有する3つのgRNA配列(gRNA1、2及び3)は各々、別個の構成的U6プロモーター下にある(gRNA123回路)。このベクターのバリアントは、gRNA1、2及び3配列の代わりにgRNA14配列を含有していた(sgRNA14回路)。図6Bは、いくつかの発現が困難である組換えタンパク質をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の、制御回路を含有する安定なCHOプールから生成された組換えタンパク質濃度を示す図である。組換えタンパク質濃度は、一過性トランスフェクションの6日後に決定した。親のCHO細胞株は、遺伝制御回路を欠く。エラーバーは、2連で実施したブリナツモマブベクターを用いる親の細胞株のトランスフェクションを除くすべてのデータ点の3連のトランスフェクションの標準偏差を表す。図6Cは、高度凝集性Mab H9K7をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の制御回路を含有する安定なCHOプールから生成された、6日目の組換えタンパク質濃度を示す図である。トランスフェクションの24時間後に、一過性トランスフェクションフラスコの半量を、0.1μg/mLの濃度のUPR−インデューサーツニカマイシン(TM)を用いて処置した。エラーバーは、3連のトランスフェクションの標準偏差を表す。
図7A及び図7Bは、図6A図6Cに記載されるようないくつかの発現が困難である組換えタンパク質をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の制御回路を含有する安定なCHOプールによって合成されたタンパク質の組換えタンパク質凝集のレベルを示す図である。組換えタンパク質凝集のレベルは、Obrezanovaら MAbs. 2015年;7巻(2号):352〜63頁に記載されるように、オリゴマー検出アッセイODA)によって細胞培養上清サンプルから決定した。このアッセイを使用して、タンパク質凝集の減少は、450nmでの吸光度の減少によって表される。図7Aは、図6Bにおいて濃度についてアッセイされた細胞培養上清サンプルの凝集データを示し、図7Bは、図6Cにおいて濃度についてアッセイされた細胞培養上清サンプルの凝集データを示す。
図7A及び図7Bは、図6A図6Cに記載されるようないくつかの発現が困難である組換えタンパク質をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の制御回路を含有する安定なCHOプールによって合成されたタンパク質の組換えタンパク質凝集のレベルを示す図である。組換えタンパク質凝集のレベルは、Obrezanovaら MAbs. 2015年;7巻(2号):352〜63頁に記載されるように、オリゴマー検出アッセイ(ODA)によって細胞培養上清サンプルから決定した。このアッセイを使用して、タンパク質凝集の減少は、450nmでの吸光度の減少によって表される。図7Aは、図6Bにおいて濃度についてアッセイされた細胞培養上清サンプルの凝集データを示し、図7Bは、図6Cにおいて濃度についてアッセイされた細胞培養上清サンプルの凝集データを示す。

0024

定義
本明細書において引用されるありとあらゆる特許、特許出願及び刊行物開示内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。本発明は特定の態様を参照して開示されているが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、その他の当業者によって本発明のその他の態様及び変法考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのこのような態様及び同等の変法を含むと解釈されるように意図される。

0025

別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用できるが、適した方法及び材料を以下に記載する。本明細書において記載されるすべての刊行物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、その全文が参照により組み込まれる。さらに、材料、方法及び実施例は、単に例示であって制限であるように意図されない。見出し、小見出し又は番号付き若しくは文字付き要素、例えば、(a)、(b)、(i)などは、単に読みやすさのために提示されている。この文書における見出し又は番号付き若しくは文字付き要素の使用は、ステップ若しくは要素が、アルファベット順に実施されること又はステップ若しくは要素が必ずしも互いに別個であることを必要としない。本発明のその他の特徴、目的及び利点は、図面の説明から及び特許請求の範囲から明らかとなろう。本明細書において使用される技術用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためのものであって、制限であるように意図されないということも理解されるべきである。

0026

詞「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、1つ又は1つより多い(すなわち、少なくとも1つの)冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書において使用される。例として、「1つの細胞」は、1つの細胞又は1つより多い細胞を意味し得る。

0027

本明細書において、用語「遺伝制御回路」とは、遺伝子発現エレメント、例えば、タンパク質をコードする配列、制御エレメント又はプロモーターエレメントの配列を指し、遺伝制御回路は、組換え又は治療用ポリペプチド生成物をコードする少なくとも1つのタンパク質をコードする配列を含み、遺伝制御回路は、組換え又は治療用ポリペプチド生成物の発現を条件依存性に調節するその他の遺伝子発現エレメントを含む。一実施形態では、遺伝制御回路は、組換え又は治療用ポリペプチド生成物をコードする少なくとも1つのタンパク質をコードする配列の代わりに、1又は複数のタンパク質をコードする配列の挿入のための適した挿入部位、例えば、制限部位、組換え標的部位又はランディングパッドを含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝制御回路は、単一核酸分子の連続部分、単一核酸分子の複数の別個の部分を含み得る、又は1つより多い核酸分子にわたって分布していることもある。

0028

本明細書において、用語「制御エレメント」とは、コード配列、例えば、遺伝子の発現を調節(例えば、増大又は減少)するのに適した核酸を指す。制御エレメントは、プロモーター配列エンハンサー配列又はプロモーター及びエンハンサー配列の両方を含み得る。制御エレメントは、連続する核酸配列、不連続の核酸配列(その他のコーディング又は非コーディング核酸配列によって中断された配列)又は両方を含み得る。単一制御エレメントは、単一核酸又は1つより多い核酸に含まれ得る。一実施形態では、制御エレメントは、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列の配列5’又は3’を含み得る。一実施形態では、制御エレメントは、遺伝子、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の1つ又は複数のイントロン内に配列を含み得る。一実施形態では、制御エレメントは、部分的に又はその全体で、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列の配列5’又は3’内に含まれ得る。一実施形態では、制御エレメントは、部分的に又はその全体で、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列内に含まれ得る。一実施形態では、制御エレメントは、部分的に又はその全体で、遺伝子、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の1つ又は複数のイントロン内に含まれ得る。一実施形態では、単一制御エレメントは、i)遺伝子、例えば、組換え、治療用若しくはレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子に対して近位の(例えば、隣接する又は内部に含有される)又はii)(例えば、個別及び別個の核酸に配置された、10若しくはそれより多い、100若しくはそれより多い、1000若しくはそれより多い又は10,000若しくはそれより多い塩基によってわけられた)遺伝子、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子に対して遠位の核酸配列を含み得る。

0029

本明細書において、用語「プロモーターエレメント」とは、コード配列とプロモーターエレメントを作動可能に連結することが、コード配列の発現をもたらすような、天然に存在する又は遺伝子操作されたプロモーターに由来する十分な配列を有する配列を指す。例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターエレメントは、CMVプロモーターのすべて又は活性断片、例えば、任意選択で、イントロンA及び/又はUTR配列を含む、CMVプロモーターのすべて又は活性断片を含む。一実施形態では、CMVプロモーターエレメントは、天然に存在する又は遺伝子操作されたバリアントCMVプロモーターに由来するわずか5、10、20、30、50又は100のヌクレオチドで異なる。一実施形態では、CMVプロモーターエレメントは、天然に存在する又は遺伝子操作されたバリアントCMVプロモーターに由来するそのヌクレオチドのわずか1、5、10又は50%で異なる。遺伝子操作されたプロモーターは、合成(天然に存在しない)配列を含むプロモーターである。一実施形態では、遺伝子操作されたプロモーターは、天然に存在する転写調節エレメント(例えば、Brownら Biotechnology and Bioengineering、111巻、8号、2014年、8月に記載のとおり)の天然に存在しない再配列を含む。一実施形態では、本開示の細胞、核酸及び方法において使用するためのプロモーターエレメントは、遺伝子操作されたプロモーター、例えば、合成(天然に存在しない)配列を含むプロモーターに由来する十分な配列を有し、コード配列をプロモーターエレメントに作動可能に連結することは、コード配列の発現をもたらす。本明細書において使用されるプロモーターエレメントは、構成的であり、調節され、抑制可能であり、強い、弱い又はプロモーターエレメントが含むプロモーター配列のその他の特性であり得る。一実施形態では、プロモーターエレメントは、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列の配列5’又は3’を含み得る。一実施形態では、プロモーターエレメントは、遺伝子、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の1つ又は複数のイントロン内に配列を含み得る。一実施形態では、プロモーターエレメントは、部分的に又はその全体で、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列の配列5’又は3’内に含まれ得る。一実施形態では、プロモーターエレメントは、部分的に又はその全体で、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列内に含まれ得る。一実施形態では、プロモーターエレメントは、部分的に又はその全体で、遺伝子、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の1つ又は複数のイントロン内に含まれ得る。

0030

本明細書において、用語「作動可能に連結された」とは、ポリペプチドをコード核酸配列と制御エレメント間の関係を指し、ポリペプチドをコードする配列と制御エレメントは、それらが、制御エレメントがポリペプチドをコードする配列の発現を調節するのに適した方法で配置されている場合に作動可能に連結される。したがって、異なる制御エレメントについて、作動可能に連結されたとは、制御エレメントに対して、ポリペプチドをコードする配列の異なる配置を構成する。例えば、ポリペプチドをコードする配列は、プロモーターエレメント及びポリペプチドをコードする配列が、同一核酸に互いに近位に配置される場合に、プロモーターエレメントを含む制御エレメントに作動可能に連結され得る。別の例では、ポリペプチドをコードする配列は、エンハンサー配列及びポリペプチドをコードする配列が、同一核酸で適した数の塩基だけ離れて配置される場合又はさらに個別及び別個の核酸に配置される場合に、遠位に作動するエンハンサー配列を含む制御エレメントに作動可能に連結され得る。挿入部位、例えば、制限部位、ランディングパッド又はSSI部位はまた、挿入部位に挿入されたポリペプチドをコードする配列が、制御エレメントに作動可能に連結される場合に、制御エレメントに作動可能に連結され得る。

0031

本明細書において、用語「内因性」とは、生物、細胞、組織又は系に由来する、又はその内側で天然に生成された任意の材料を指す。

0032

本明細書において、用語「組換え標的部位」は、ターゲッティングされた組換えにとって必須である、リコンビナーゼ一緒にそれを可能にする、及びこのような組換えの位置を規定するヌクレオチドのストレッチである。

0033

本明細書において、遺伝子、例えば、組換え、例えば、治療用、レプレッサー、又は選択マーカー、ポリペプチドをコードする遺伝子の「両端に位置する」又は「両端に位置している」遺伝子とともに使用される用語「組換え標的部位」とは、組換え標的部位が前記遺伝子の5’及び3’に位置していることを意味し、それは、一方の標的部位が、対象の遺伝子コード配列の5’に位置し、もう一方の標的部位が3’に位置することを意味する。組換え標的部位は、対象の遺伝子コード配列に直接隣接して位置する場合も、規定の距離に位置する場合もある。両端に位置する配列、特に、組換え標的部位の両端に位置するものは、フォワード又はリバース配向で位置し、好ましくは、両方ともフォワードであり、又は好ましくは、両方ともリバース配向にある。

0034

本明細書において、用語「外因性」とは、生物、細胞、組織又は系に導入される、又はその外側で生成された任意の材料を指す。したがって、「外因性核酸」とは、生物、細胞、組織又は系に導入される、又はその外側で生成される核酸を指す。一実施形態では、外因性核酸の配列は、外因性核酸が導入される生物、細胞、組織又は系の内側で天然に生成されない、又は天然に見出されることができない。同様に、「外因性ポリペプチド」とは、例えば、外因性核酸配列からの発現によって外因性ポリペプチドが導入される生物、細胞、組織又は系の内側で天然に生成されない、又は天然に見出されることができないポリペプチドを指す。

0035

本明細書において、用語「異種」とは、異なる種に由来する生物、細胞、組織又は系に導入される場合のある種に由来する任意の材料を指す。

0036

本明細書において、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、同義的に使用され、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)又はそれらのDNA又はRNAの組合せ及び一本鎖又は二本鎖の形態のいずれかのそのポリマーを指す。用語「核酸」として、限定されるものではないが、遺伝子、cDNA又はmRNAが挙げられる。一実施形態では、核酸分子は、合成(例えば、化学的に合成されたもの又は人工)又は組換えである。具体的に制限されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチド類似体又は誘導体を含有する分子を包含し、天然に存在する又は天然に存在しないヌクレオチドと同様の方法で代謝される。特に断りのない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子オルソログ、SNP及び相補的配列並びに明確に示された配列も暗に包含する。具体的には、1つ又は複数の選択された(又はすべての)コドンの第3の位置が、混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって縮重コドン置換を達成することができる(Batzerら、Nucleic Acid Res. 19巻:5081頁(1991年);Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260巻:2605〜2608頁(1985年);及びRossoliniら、Mol. Cell. Probes 8巻:91〜98頁(1994年))。

0037

本明細書において、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって共有結合によって連結されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも2個のアミノ酸を含有しなくてはならず、タンパク質又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限は課されない。一実施形態では、タンパク質は、1つより多い、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれより多いポリペプチドを含むことができ、各ポリペプチドが、共有結合又は非共有結合相互作用によって別のものと会合している。ポリペプチドは、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって互いに接合された2つ又はそれより多いアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書において、この用語は、一般に、当技術分野で、例えば、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと呼ばれる短鎖と、一般に、当技術分野で、多数の種類があるタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指す「ポリペプチド」として、例えば、中でも、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。

0038

本明細書において、「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」とは、本明細書において記載される細胞によって生成され得るポリペプチドを指す。組換えポリペプチドは、ポリペプチドをコードする配列の少なくとも1つのヌクレオチド又はポリペプチドの発現を制御する配列の少なくとも1つのヌクレオチドが、遺伝子工学(細胞の、又は前駆体細胞の)によって形成されたものである。例えば、少なくとも1つのヌクレオチドが変更された、例えば、細胞に導入された又は遺伝子操作された再配列の生成物である。例えば、組換えポリペプチドはまた、治療用ポリペプチドでもある。

0039

本明細書において、「治療用ポリペプチド」とは、治療用ポリペプチドを生成するように修飾又は遺伝子操作されている細胞によって生成される、例えば、発現される、ヒト又は動物の健康又は医薬に対して有用性を有するポリペプチドを指す。一実施形態では、治療用ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド又は天然に存在しないポリペプチド、例えば、合成ポリペプチドである。一実施形態では、治療用ポリペプチドの部分は、天然に存在し、治療用ポリペプチドの別の部分は、天然に存在しない。一実施形態では、治療用ポリペプチドは、組換えポリペプチドである。一実施形態では、治療用ポリペプチドは、診断的又は前臨床的使用に適している。別の実施形態では、治療用ポリペプチドは、治療的使用に、例えば、疾患の治療に適している。一実施形態では、治療用ポリペプチドは、表1〜4から選択される。いくつかの実施形態では、修飾又は遺伝子操作された細胞は、発現を制御する、又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む。その他の実施形態では、修飾又は遺伝子操作された細胞は、例えば、細胞において治療用ポリペプチドの発現又は構築を制御する核酸ではないその他の分子を含む。

0040

本明細書において、「レプレッサーポリペプチド」とは、レプレッサーポリペプチドを生成するように修飾又は遺伝子操作されている細胞によって生成される、例えば、発現される、別のポリペプチド(例えば、治療用ポリペプチド)の発現を制御するポリペプチドを指す。一実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド又は天然に存在しない ポリペプチド、例えば、合成ポリペプチドである。一実施形態では、レプレッサーポリペプチドの部分は天然に存在し、レプレッサーポリペプチドの別の部分は、天然に存在しない。一実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、組換えポリペプチドである。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、治療用ポリペプチドの発現を減少させる。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、治療用ポリペプチドの発現を完全に排除する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドの発現は調節される。例えば、レプレッサーポリペプチドは、ある条件のセット下で高度に発現され、別の条件のセット下では、レプレッサーポリペプチドの発現は阻害される、例えば、減少される又は完全に排除される。

0041

本明細書において、「活性のレベル」とは、制御エレメント又はプロモーターエレメントによって誘導される発現の強度の尺度を指す。例えば、制御エレメントは、制御エレメントに作動可能に連結されたコード配列が強力に発現されるような高レベルの活性を有し得る。

0042

本明細書において、「条件」とは、制御エレメント又はプロモーターエレメントの活性のレベルに影響を及ぼし得る、細胞及び/又は環境パラメータの値を指す。条件が、細胞及び環境パラメータの1つの値を含む場合も、条件が細胞及び環境パラメータの1つの値を1つより多い(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれより多い)値を含む場合もある。例えば、制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し得る。細胞及び環境パラメータとして、それだけには限らないが、1つ又は複数のポリペプチドのレベル、1つ又は複数のポリペプチドのコンパートメント局在されたレベル(例えば、核、細胞質又は小胞体に局在する)、細胞シグナル伝達経路、例えば、ストレス応答、フォールディングされていないタンパク質応答、熱ショック応答などの活性化のレベル、シグナル伝達分子(例えば、Ca+2、cAMPグルコースATPなど)のレベル、温度、pH、細胞周期増殖期培養物細胞密度及び栄養素利用能が挙げられる。

0043

Cas9分子又はCas9ポリペプチドは、その用語が本明細書において使用される場合、ガイドRNA(gRNA)分子と相互作用し得る、gRNA分子協力して、標的ドメイン及びPAM配列を含む部位に真っすぐ進む又は局在する分子又はポリペプチドを指す。Cas9分子及びCas9ポリペプチドは、それらの用語が本明細書において使用される場合、天然に存在するCas9分子及び遺伝子操作された、変更された若しくは修飾されたCas9分子又は例えば、少なくとも1個のアミノ酸残基だけ参照配列から異なるCas9ポリペプチド、例えば、最も類似した天然に存在するCas9分子又は配列を含む。例示的Cas9分子又はCas9ポリペプチド配列は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるWO2015/157070に見ることができる。Cas9分子又はCas9ポリペプチドは、DNA切断及びニッキング活性及びその他を有するCas9分子、例えば、DNAをはっきりとは切断又はニッキングしないdCas9分子又はdCas9ポリペプチドを含む。

0044

概要
一態様では、本開示は、細胞又は環境条件の変化、例えば、細胞ストレス応答、例えば、フォールディングされていないタンパク質応答(UPR)の変化に応じて、組換え又は治療用タンパク質生成物遺伝子(単数又は複数)の転写率を微調整するための細胞又は細胞株を作製する遺伝制御回路、核酸、細胞、方法並びに方法を提供する。遺伝制御回路のための本開示の一般的な設計原則の例は、図1A及び図1Bに表わされている。この限定されない概略例では、組換えタンパク質生成物の生成は、ストレス/毒性を誘導し、これは、レプレッサーポリペプチドの生成を活性化し、それによって、組換えポリペプチド生成物発現を阻害する。ストレスシグナルの除去は、レプレッサーポリペプチドの発現を不活性化する。阻害の軽減は、組換えポリペプチド生成物生成の再活性化を伴う。

0045

生成物
高収量の生成物、例えば、外因性治療用ポリペプチドを生成可能である細胞又は細胞株を同定、選択又は製造するための遺伝制御回路、細胞及び方法が本明細書において提供される。本開示によって包含される生成物として、それだけには限らないが、細胞において生成、例えば、発現され得る分子、核酸、ポリペプチド(例えば、組換え及び/又は治療用ポリペプチド)又はそのハイブリッドが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、生成物を生成するように遺伝子操作される、又は修飾される。このような修飾として、生成物の生成を制御する、又はそれをもたらす分子を導入することが挙げられる。例えば、細胞は、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を導入することによって修飾され、細胞は、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドの生成、例えば、発現及び分泌に適した条件下で培養される。別の例では、細胞が、例えば、非修飾細胞において、内因性に生成されるレベル又は量よりも高いレベル又は量のポリペプチドを生成するように、細胞は、細胞によって内因性に発現されるポリペプチドの発現を制御、例えば、増大する外因性核酸を導入することによって修飾する。実施形態では、本明細書において記載される方法によって同定、選択又は作製された細胞又は細胞株は、医学的状態障害又は疾患の治療において有用な生成物、例えば、組換えポリペプチドを生成する。医学的状態、障害又は疾患の例として、それだけには限らないが、代謝的疾患又は障害(例えば、代謝酵素欠乏症)、内分泌障害(例えば、ホルモン欠乏症)、止血血栓症造血障害の障害、胃腸障害免疫調節(例えば、免疫不全)、不妊症移植がん及び感染性疾患が挙げられる。

0046

組換えポリペプチドは、外因性タンパク質、例えば、細胞によって天然に発現されないタンパク質である。組換えポリペプチドは、例えば、薬物スクリーニングにとって有用な治療用タンパク質又は診断用タンパク質であり得る。治療用又は診断用タンパク質は、抗体分子、例えば、抗体又は抗体断片、融合タンパク質、ホルモン、サイトカイン増殖因子、酵素、糖タンパク質、リポタンパク質リポータータンパク質治療用ペプチド又はその構造的及び/若しくは機能的断片又はこれらのいずれかのハイブリッドであり得る。実施形態では、生成物、例えば、外因性治療用ポリペプチドは、複数のポリペプチド鎖、例えば、重鎖及び軽鎖を含む抗体又は抗体断片を含む。

0047

一実施形態では、生成物、例えば、組換えポリペプチドは、抗体分子である。本明細書において包含される生成物は、イメージング技術にとって有用な診断用抗体分子、例えば、モノクローナル抗体又はその抗体断片及び対象への投与に適した、例えば、疾患又は障害の治療にとって有用な治療用抗体分子である。抗体分子は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質又はポリペプチド配列である。一実施形態では、抗体分子は、全長抗体又は抗体断片である。抗体及びマルチフォーマットタンパク質は、ポリクローナル又はモノクローナル、複数鎖若しくは一本鎖又は無傷免疫グロブリンであり得、天然供給源に、又は組換え供給源型に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体は、ヒト又はヒト化抗体であり得る。一実施形態では、抗体は、IgAIgGIgD又はIgE抗体である。一実施形態では、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4抗体である。

0048

「抗体断片」とは、無傷の抗体又はその組換えバリアントの少なくとも1つの部分を指し、抗体断片の、抗原などの標的の認識及び特異的結合を付与するのに十分である、無傷の抗体の抗原結合ドメイン、例えば、抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例として、それだけには限らないが、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片、scFv抗体断片、直鎖抗体、sdAb(VL又はVHのいずれか)などの単一ドメイン抗体ラクダ科動物VHHドメイン及びヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片などの抗体断片から形成された多特異性抗体並びに抗体の単離されたCDR又はその他のエピトープ結合断片が挙げられる。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシディ(maxibodies)、ミニボディ(minibodies)、ナノボディ(nanobodies)、細胞内抗体、二特異性抗体、トリアボディ(triabodies)、テトラボディ(tetrabodies)、v−NAR及びビス−scFv(例えば、Hollinger and Hudson、Nature Biotechnology 23巻:1126〜1136頁、2005年を参照のこと)に組み込まれ得る。抗原結合断片はまた、フィブロネクチンIII型(Fn3)などのポリペプチドをベースとするスキャフォールドグラフトされてもよい(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第6,703,199号を参照のこと)。

0049

実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、例えば、ボトックス(BOTOX)、ミオブロック(Myobloc)、ニューロブロック(Neurobloc)、ジスポート(Dysport)(又はボツリヌス神経毒のその他の血清型)、アルグルコシダーゼアルファダプトマイシン、YH−16、コリオゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクスインターロイキン−2、アルデスロイキン、テセロリン(teceleulin)、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ−n3(注射)、インターフェロンアルファ−nl、DL−8234、インターフェロンサントリー(Suntory)(ガンマ−1a)、インターフェロンガンマチモシンアルファ1、タソネルミン、デジファブ(DigiFab)、ヴィペラタブ(ViperaTAb)、エキタブ(EchiTAb)、クロファブ(CroFab)、ネシリチド、アバタセプト、アレフセプト、Rebif、エプトテルミンアルファ、テリパラチドカルシトニンエタネルセプトヘモグロビングルタマー250(ウシ)、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼカルペリチド、組換えヒト上皮成長因子DWP401、ダルベポエチンアルファエポエチンオメガエポエチンベータエポエチンアルファデシルジン、レピルジン、ビバリルジンノナコグアルファ、モノニン(Mononine)、エプタコグアルファ(活性化型)、組換え第VIII因子+VWF、リコンビナート(Recombinate)、組換え第VIII因子、第VIII因子(組換え型)、アルフンメート(Alphnmate)、オクトコグアルファ、第VIII因子、パリフルミン、インキナーゼ(Indikinase)、テネクテプラーゼアルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、rFSH、hpFSH、ミカファンギン、ペグフィルグラスチムレノグラスチムナルトグラスチムセルモレリン、グルカゴンエキセナチドプラムリンチド、イングルセラーゼ(iniglucerase)、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン(Leucotropin)、モルグラモスチム(molgramostirn)、酢酸トリプトレリンヒストレリン(Hydron)、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、リュープロリドATRIGEL)、リュープロリド(DUROS)、ゴセレリン、ユートロピン(Eutropin)、ソマトロピンメカセルミン、エンルファビルチド(enlfavirtide)、Org−33408、インスリングラルギンインスリングルリジン、インスリン(吸入)、インスリンリスプロ、インスリンデテルミル(deternir)、インスリン(RapidMist)、メカセルミンリンファベート、アナキンラ、セルモロイキン、99 mTc−アプシチド、ミエロピド(myelopid)、ベタセロン(Betaseron)、酢酸グラチラマー、ゲポン(Gepon)、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロンビリブ(Bilive)、インスリン(組換え型)、組換えヒトインスリンインスリンアスパルト、メカセルミン(mecasenin)、ロフェロン(Roferon)−A、インターフェロン−アルファ2、アルファフェロン(Alfaferone)、インターフェロンアルファコン−1、インターフェロンアルファ、アボネックス(Avonex)の組換えヒト黄体形成ホルモンドルナーゼアルファ、トラフェルミンジコノチドタルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ(Zemaira)、CTC−111、シャバック(Shanvac)−B、オクトレオチドランレオチドアンスチム(ancestirn)、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅、ラスブリカーゼラニビズマブアクチムン(Actimmune)、PEG−イントロン、トリコミン(Tricomin)、組換えヒト副甲状腺ホルモンPTH)1−84、エポエチンデルタトランスジェニック抗トロンビンIII、グランジトロピン(Granditropin)、ビトラーゼ(Vitrase)、組換えインスリン、インターフェロン−アルファ、GEM−21S、バプレオチド(vapreotide)、イデュルスルファーゼ、オマパトリラート(omnapatrilat)、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴール、グルカルピダーゼ、ヒト組換えC1エステラーゼ阻害剤ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド、VGV−1、インターフェロン(アルファ)、ルシナクタントアビプタジル(aviptadil)、イカチバントエカランチドオミガナン(omiganan)、オーログラブ(Aurograb)、酢酸ペキシガナン(pexigananacetate)、ADI−PEG−20、LDI−200、デガレリクスシントレデリンベスドトクス(cintredelinbesudotox)、ファブルド(Favld)、MDX−1379、ISAtx−247、リラグルチド、テリパラチド、チファコギン(tifacogin)、AA4500、T4N5リポソームローションカツマキソマブ、DWP413、ART−123、クリサリン(Chrysalin)、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ(amediplase)、コリフォリトロピンアルファ、TH−9507、テデュグルチドジアミド(Diamyd)、DWP−412、成長ホルモン、組換えG−CSF、インスリン、インスリン(テクノスフェア(Technosphere))、インスリン(AERx)、RGN−303、DiaPep277、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ−n3、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、AMG−531、MBP−8298、キセレセプト(Xerecept)、オペバカン(opebacan)、AISVAX、GV−1001、リンフォスキャン(LymphoScan)、ランピルナーゼ(ranpirnase)、リポキシサン(Lipoxysan)、ルスプルチド(lusupultide)、MP52、シプロイセル−T、CTP−37、インセジア(Insegia)、ビテスペン、ヒトトロンビントロンビン、TransMID、アルフィメプラーゼ(alfimeprase)、プリカーゼ(Puricase)、テルリプレシン、EUR−1008M、組換えFGF−I、BDM−E、ロチガプチド、ETC−216、P−113、MBI−594AN、デュラマイシン、SCV−07、OPI−45、エンドスタチンアンギオスタチン、ABT−510、ボーマンバーク(Bowman Birk)阻害剤、XMP−629、99 mTc−Hynic−アネキシンV、カハラリドF、CTCE−9908、テベレリクス(teverelix)、オザレリクス(ozarelix)、ロミデプシン(rornidepsin)、BAY−504798、インターロイキン4、PRX−321、ペプスキャン(Pepscan)、イボタデキン(iboctadekin)、rhラクトフェリン、TRU−015、IL−21、ATN−161、シレンギチド、アルブフェロン(Albuferon)、ビファシックス(Biphasix)、IRX−2、オメガインターフェロン、PCK−3145、CAP−232、パシレオチド、huN901−DMI、SB−249553、オンコバックス(Oncovax)−CL、オンコバックス−P、BLP−25、CerVax−16、MART−1、gp100、チロシナーゼ、ネミフィチド(nemifitide)、rAAT、CGRP、ペグスネルセプト(pegsunercept)、チモシンベータ4、プリチデプシン、GTP−200、ラモプラニン、GRASPA、OBI−1、AC−100、サケカルシトニン(エリゲン)、エキサモレリン(examorelin)、カプロモレリン、カルデバ(Cardeva)、ベラフェルミン(velafermin)、131I−TM−601、KK−220、T−10、ウラリチド、デペレスタット(depelestat)、ヘマタイド、クリサリン、rNAPc2、組換え第VIII因子(PEG化リポソームの)、bFGF、PEG化組換えスタフィロキナーゼバリアント、V−10153、ソノリスプロリーゼ(SonoLysis Prolyse)、ニューロバックス(NeuroVax)、CZEN−002、rGLP−1、BIM−51077、LY−548806、エキセナチド(徐放、Medisorb)、AVE−0010、GA−GCB、アボレリン(avorelin)、ACM−9604、リナクロチドアセタート(linaclotid eacetate)、CETi−1、Hemospan、VAL、速効型インスリン注射用ビアデル(Viadel))、インスリン(エリゲン)、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ、マルチカイン(Multikine)、RG−1068、MM−093、NBI−6024、AT−001、PI−0824、Org−39141、Cpn10、タラクトフェリン(talactoferrin)、rEV−131、rEV−131、組換えヒトインスリン、RPI−78M、オプレルベキン、CYT−99007 CTLA4−Ig、DTY−001、バラテグラスト(valategrast)、インターフェロンアルファ−n3、IRX−3、RDP−58、タウフェロン(Tauferon)、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ(Merispase)、アルカリ(alaline)ホスファターゼ、EP−2104R、Melanotan−II、ブレメラノチド、ATL−104、組換えヒトマイクロプラスミン、AX−200、SEMAX、ACV−1、Xen−2174、CJC−1008、ダイノルフィンA、SI−6603、LABGHRH、AER−002、BGC−728、ALTU−135、組換えノイラミニダーゼ、Vacc−5q、Vacc−4x、Tatトキソイド、YSPSL、CHS−13340、PTH(1−34)(ノバソーム(Novasome))、オスタボリン(Ostabolin)−C、PTH類似体、MBRI−93.02、MTB72F、MVA−Ag85A、FARA04、BA−210、組換えペストFIV、AG−702、OxSODrol、rBetV1、Der−p1/Der−p2/Der−p7、PR1ペプチド抗原突然変異体rasワクチン、HPV−16 E7リポペプチドワクチン、ラビリンチン(labyrinthin)、WT1−ペプチド、IDD−5、CDX−110、ペントリス(Pentrys)、ノレリン(Norelin)、CytoFab、P−9808、VT−111、イクロカプチド(icrocaptide)、テルベルミン(telbermin)、ルピントリビル(rupintrivir)、レチクローズ(reticulose)、rGRF、HA、アルファ−ガラクトシダーゼA、ACE−011、ALTU−140、CGX−1160、アンジオテンシン、D−4F、ETC−642、APP−018、rhMBL、SCV−07、DRF−7295、ABT−828、ErbB2特異的免疫毒素、DT3SSIL−3、TST−10088、PRO−1762、コンボトックス(Combotox)、コレシストキニン−B/ガストリン受容体結合ペプチド、111In−hEGF、AE−37、トラスニズマブ(trasnizumab)−DM1、アンタゴニストG、IL−12、PM−02734、IMP−321、rhIGF−BP3、BLX−883、CUV−1647、L−19ベースのra、Re−188−P−2045、AMG−386、DC/1540/KLH、VX−001、AVE−9633、AC−9301、NY−ESO−1(ペプチド)、NA17.A2ペプチド、CBP−501、組換えヒトラクトフェリン、FX−06、AP−214、WAP−8294A、ACP−HIP、SUN−11031、ペプチドYY[3−3
6]、FGLLアタシセプト、BR3−Fc、BN−003、BA−058、ヒト副甲状腺ホルモン1−34、F−18−CCR1、AT−1100、JPD−003、PTH(7−34)(ノバソーム(Novasome))、デュラマイシン、CAB−2、CTCE−0214、GlycoPEG化エリスロポエチン、EPO−Fc、CNTO−528、AMG−114、JR−013、第XIII因子アミノカンジン(aminocandin)、PN−951、716155、SUN−E7001、TH−0318、BAY−73−7977、テベレリックス(teverelix)、EP−51216、hGH、OGP−I、シフビルチド(sifuvirtide)、TV4710、ALG−889、Org−41259、rhCC10、F−991、チモペンチン、r(m)CRP、肝選択的インスリン、スバリン(subalin)、L19−IL−2融合タンパク質、エラフィン、NMK−150、ALTU−139、EN−122004、rhTPO、トロンボポエチン受容体アゴニスト、AL−108、AL−208、神経成長因子アンタゴニスト、SLV−317、CGX−1007、INNO−105、テリパラチド(エリゲン)、GEM−OS1、AC−162352、PRX−302、LFn−p24融合物、EP−1043、gpE1、gpE2、MF−59、hPTH(1−34)、768974、SYN−101、PGN−0052、アビスクミン(aviscumnine)、BIM−23190、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、エンカスチム(enkastim)、APC−8024、GI−5005、ACC−001、TTS−CD3、血管をターゲッティングするTNF、デスモプレシン、オネルセプト(onercept)及びTP−9201がある。

0050

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、アダリムマブヒュミラ)、インフリキシマブレミケード商標))、リツキシマブリツキサン(商標)/MAB THERA(商標))エタネルセプト(エンブレル(商標))、ベバシズマブアバスチン(商標))、トラスツズマブヘルセプチン(商標))、ペグフィルグラスチム(pegrilgrastim)(ニューラスタ(NEULASTA)(商標))又はバイオシミラー及びバイオベターを含む任意のその他の適したポリペプチドである。

0051

その他の適したポリペプチドは、以下に、及び米国特許出願公開第2016/0097074号の表1に列挙されたものである:

0052

0053

実施形態では、ポリペプチドは、表2に示されるような、ホルモン、血液凝固凝固因子、サイトカイン/増殖因子、抗体分子、融合タンパク質、タンパク質ワクチン又はペプチドである。

0054

0055

実施形態では、タンパク質は、表3に示されるような多重特異性タンパク質、例えば、二重特異性抗体である。

0056

0057

0058

いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、がん細胞によって発現された抗原である。いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原である。いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、HER2、CD20、9−O−アセチルGD3、βhCG、A33 抗原、CA19−9マーカー、CA−125マーカー、カルレティキュリンカルボアンヒドラーゼ(carboanhydrase)IX(MN/CA IX)、CCR5、CCR8、CD19、CD22、CD25、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD63、CD70、CC123、CD138、癌胎児抗原CEA;CD66e)、デスモグレイン4、E−カドヘリンネオエピトープエンドシアリン(endosialin)、エフリンA2(EphA2)、上皮成長因子受容体(EGFR)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、ErbB2、胎児アセチルコリン受容体線維芽細胞活性化抗原(FAP)、フコシルGM1、GD2、GD3、GM2,ガングリオシドGD3、Globo H、糖タンパク質100、HER2/neu、HER3、HER4、インスリン様成長因子受容体1、Lewis−Y、LG、Ly−6、黒色腫特異的コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSCP)、メソテリン、MUCl、MUC1バリアント(例えばMUC1 A、B、C、D、X、Y、Z、REP又はSEC)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16、ミュラー管抑制因子MIS)受容体II型形質細胞抗原ポリSA、PSCA、PSMA、ソニックヘッジホッグ(SHH)、SAS、STEAP、sTn抗原、TNF−アルファ前駆体及びそれらの組合せから選択される。

0059

いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、活性化受容体であり、2B4(CD244)、α4β1インテグリンβ2インテグリン、CD2、CD16、CD27、CD38、CD96、CDlOO、CD160、CD137、CEACAMl(CD66)、CRTAM、CSl(CD319)、DNAM−1(CD226)、GITR(TNFRSF18)と、KIR、NKG2C、NKG2D、NKG2Eの活性化形態、1つ又は複数の天然細胞毒性受容体、NTB−A、PEN−5及びそれらの組合せから選択され、任意選択で、β2インテグリンは、CD11a−CD18、CD11b−CD18又はCD11c−CD18を含み、任意選択で、KIRの活性化形態は、KlR2DSl、KIR2DS4又はKIR−Sを含み、任意選択で、天然細胞毒性受容体は、NKp30、NKp44、NKp46又はNKp80を含む。

0060

いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、阻害性受容体であり、KIR、ILT2/LIR−l/CD85jと、KIR、KLRG1、LAIR−1、NKG2A、NKR−P1A、Siglec−3、Siglec−7、Siglec−9の阻害性形態及びそれらの組合せから選択され、任意選択で、KIRの阻害性形態は、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2又はKIR−Lを含む。

0061

いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、活性化受容体であり、CD3、CD2(LFA2、OX34)、CD5、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD40L、CD84(SLAMF5)、CD137(4−1BB)、CD226、CD229(Ly9、SLAMF3)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD319(CRACC、BLAME)、CD352(Lyl08、NTBA、SLAMF6)、CRTAM(CD355)、DR3(TNFRSF25)、GITR(CD357)、HVEM(CD270)、ICOS、LIGHT、LTβR(TNFRSF3)、OX40(CD134)、NKG2D、SLAM(CD150、SLAMF1)、TCRα、TCRβ、TCRδγ、TIM1(HAVCR、KIM1)及びそれらの組合せから選択される。

0062

いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、阻害性受容体であり、PD−1(CD279)、2B4(CD244、SLAMF4)、B71(CD80)、B7Hl(CD274、PD−L1)、BTLA(CD272)、CD160(BY55、NK28)、CD352(Ly108、NTBA、SLAMF6)、CD358(DR6)、CTLA−4(CD152)、LAG3、LAIR1、PD−1H(VISTA)、TIGIT(VSIG9、VSTM3)、TIM2(TIMD2)、TIM3(HAVCR2、KIM3)及びそれらの組合せから選択される。

0063

その他の例示的治療用又は診断用タンパク質として、それだけには限らないが、Leaderら、「Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification」、Nature Reviews Drug Discovery、2008年、7号:21〜39頁(参照により本明細書に組み込まれる)の表1〜10に記載される任意のタンパク質、又は本明細書において記載される組換えポリペプチドの任意のコンジュゲート、バリアント、類似体若しくは機能的断片が挙げられる。

0064

その他の組換え生成物として、それだけには限らないが、DARPins、アフィボディ及びアドネクチンなどの非抗体スキャフォールド又は代替タンパク質スキャフォールドが挙げられる。このような非抗体スキャフォールド又は代替タンパク質スキャフォールドは、1又は2又はそれより多い、例えば、1、2、3、4又は5又はそれより多い異なる標的又は抗原を認識又は結合するように遺伝子操作することができる。

0065

核酸
また、核酸、例えば、生成物、例えば、本明細書において記載される組換えポリペプチドをコードする外因性核酸が本明細書において提供される。所望の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組換え方法を使用して、例えば、標準技術を使用して、遺伝子を発現する細胞から得たライブラリーをスクリーニングすることによって、それを含むと知られているベクターから核酸配列を導き出すことによって、又はそれを含有する細胞及び組織から直接単離することなどによって得ることができる。或いは、組換えポリペプチドをコードする核酸を、クローニングするのではなく合成によって製造してもよい組換えDNA技術及びテクノロジーは、当技術分野で高度に進歩しており、十分に確立されている。したがって、本明細書において記載される組換えポリペプチドのアミノ酸配列の知識を有する当業者であれば、組換えポリペプチドをコードするであろう核酸配列を容易に想起又は作製できる。

0066

組換えポリペプチドの発現は、通常、組換えポリペプチド又はその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結すること及び構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物又は原核生物における複製及び組込みに適したものであり得る。通常のクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節にとって有用な転写及び翻訳ターミネーター開始配列及びプロモーターなどのその他の調節エレメントを含有する。

0067

実施形態では、生成物、例えば、外因性治療用ポリペプチドは、複数のポリペプチド鎖、例えば、重鎖及び軽鎖を含む抗体又は抗体断片を含む。複数のポリペプチド鎖を含む外因性治療用ポリペプチドをコードする核酸配列は、一緒に配置される(例えば、同一核酸に配置された、各ポリペプチド鎖をコードする配列)ことも別個に配置される(例えば、異なる核酸に配置された、各ポリペプチド鎖をコードする配列)こともある。複数のポリペプチド鎖を含む外因性治療用ポリペプチドをコードする配列は、単一の制御エレメント、例えば、第1の制御エレメントに、又は個別の、別個の制御エレメントに作動可能に連結されていてもよい(例えば、各ポリペプチド鎖をコードする配列が、その自身の第1の制御エレメントに作動可能に連結されている)。複数のポリペプチド鎖を含む外因性治療用ポリペプチドをコードする配列が、個別の、別個の制御エレメントに作動可能に連結されている一実施形態では、制御エレメントのうち1つ又は複数(例えば、1、2、3、4、5、6又はすべて)は、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有してもよく、制御エレメントのうち1つ又は複数(例えば、1、2、3、4、5、6又はそれより多く)は、構成的であり得る。

0068

組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、いくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸をそれだけには限らないが、プラスミドファージミドファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むベクターにクローニングすることができる。特に対象とするベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター及びシーケンシングベクターが挙げられる。実施形態では、発現ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に提供することができる。ウイルスベクターテクノロジーは、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら、2012年、MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL、1〜4巻、 Cold Spring Harbor Press、NY)に、及びその他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとして、それだけには限らないが、レトロウイルスアデノウイルスアデノ随伴ウイルスヘルペスウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。一般に、適したベクターは、少なくとも1種の生物において機能的な複製起点、プロモーターエレメント及び任意選択でエンハンサーエレメントを含む制御エレメント、好都合制限エンドヌクレアーゼ部位及び1又は複数の選択マーカーを含有する(例えば、国際公開第01/96584号、同01/29058号及び米国特許第6,326,193号)。ウイルスに由来するベクターは、それらが、導入遺伝子の長期間の安定な組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にするので、長期間の遺伝子導入を達成するための適したツールである。

0069

ベクターはまた、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子由来)、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にするエレメント(例えば、SV40起源及びColE1又は当技術分野で公知のその他のもの)及び/又は選択を可能にするエレメント、例えば、選択マーカー又はリポーター遺伝子を含み得る。

0070

考慮されるベクターは、ポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチド又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列を挿入するのに適した挿入部位を含み得る。

0071

挿入部位は、制限エンドヌクレアーゼ部位を含み得る。

0072

挿入部位は、組換え標的部位を含んでもよく、組換え標的部位は、ポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチド又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列の両端に位置する。一実施形態では、組換え標的部位は、lox部位である。組換え標的部位がlox部位である場合には、宿主細胞は、クロスオーバー又は組換え事象を達成するためにCreリコンビナーゼの存在及び発現を必要とする。

0073

一実施形態では、組換え標的部位は、FRT部位である。組換え標的部位が、FRT部位(cite)である場合には、宿主細胞は、クロスオーバー又は組換え事象を達成するためにFLP(FLPリコンビナーゼ)の存在及び発現を必要とする。

0074

挿入部位は、短い、およそ25bpの独特な配列及び/又は制限部位が両端に位置するランディングパッド、例えば、DNAの部分、例えば、選択マーカーを含み得る。考慮される材料及び方法は、当技術分野で公知の、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第62/460,420号におけるランディングパッド部位特異的組込み技術を含む。

0075

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号17、18、19又はそれらの相同体の単離されたヌクレオチド配列のうち少なくとも1つ(例えば、1、2又はそれより多く)を含む。一実施形態では、ベクターは、それ自身、その5’及び3’末端に各1つの組換え標的部位が位置する選択マーカーをコードする少なくとも1つの配列を含み、配列番号17又は18又はその相同な配列のヌクレオチド配列の少なくとも1つは、選択マーカーをコードする配列の3’末端に位置する。一実施形態では、ベクターは、それ自身、その5’及び3’末端に各1つの組換え標的部位が位置する、選択マーカーをコードする少なくとも1つの配列を含み、配列番号19又はその相同な配列において与えられるような少なくとも1つのヌクレオチド配列は、選択マーカーをコードする配列の5’末端に位置する。

0076

第1の制御エレメント
一実施形態では、生成物、例えば、ポリペプチド、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、ポリペプチド、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドの発現の転写開始を可能にするポリメラーゼ動員の原因となる第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメントをさらに含む。第1の制御エレメントは、遠位エレメント、例えば、ポリペプチドをコードする配列から少し離れた、例えば、数塩基の長さ離れたポリペプチドの発現を調節するエレメント及び近位エレメント、例えば、ポリペプチドをコードする配列に近接した、又はその内部の位置に幾分か起因して、ポリペプチドの発現を調節するエレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントは、構成的制御エレメントである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントは、調節される制御エレメント、例えば、内因性又は外因性ポリペプチドによって調節される制御エレメントである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメントは、第1の条件、例えば、細胞の増殖の第1の段階、例えば、対数増殖下で第1のレベルの活性及び第2の条件、例えば、細胞の増殖の第2の段階、例えば、対数未満の増殖を有する相、例えば、増殖安定相下で第2のレベルの活性を有する。一実施形態では、本明細書において記載される方法に適した制御エレメントは、普通、エンハンサーと会合して、多量の転写を駆動し、ひいては、標的外因性mRNAの多量のコピー送達する。一実施形態では、第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメントは、両方とも、その由来する同名ウイルス又はプロモーターに由来する、サイトメガロウイルス(CMV)主要前初期プロモーター(Xia、Bringmannら2006年)及びSV40プロモーター(Chernajovsky、Moryら1984年)を含む。いくつかのその他のあまり一般的ではないウイルスプロモーターが、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復配列(RSV−LTR)及びモロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)LTRを含む発現ベクター中に含めると転写を駆動するように成功裏に使用されてきた(Papadakis、Nicklinら2004年)。別の実施形態では、特定の内因性哺乳動物プロモーターを利用して、対象の遺伝子の構成的転写を駆動できる(Pontiller、Grossら2008年)。CHO特異的チャイニーズハムスター延長因子1−アルファ(CHEF1α)プロモーターが、ウイルスベースの配列の高収量の代替物を提供してきた(Deer、Allison 2004年)。いくつかの実施形態では、組換え、例えば、治療用ポリペプチドの転写を駆動するために使用される第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメントとして、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、アクチンプロモーター(例えば、β−アクチンプロモーター)、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーター、サイクリンT1プロモーター、CAGプロモーターRNAポリメラーゼIII U3プロモーター、シクロフィリン(cyclophillin)プロモーター、オートグラファカリフォルニアニュークリア(Autographa californica nuclear)多核体病ウイルス(AcNPV)P10プロモーター、β3−ガラクトシルトランスフェラーゼ5(β3GAL−T5)プロモーター、Fer1プロモーター、CMV−EF1αプロモーターなどの複合プロモーター及び基本プロモーター及び3部分複合プロモーターを挙げることができる。前記プロモーターエレメントは、表5にまとめられており、当技術分野で公知である。本発明は、特定のプロモーター又はプロモーターに制限されないということが考慮される。国際公開第2004/009823号、同2006/111387号及び同2014044845号(参照によりその全文が本明細書に組み込まれる)に記載されるプロモーター及び転写制御機序もまた、第1の及び/又は第2の制御エレメントに関連して考慮される。いくつかの実施形態では、第1の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントは、合成(天然に存在しない)配列を含む遺伝子操作されたプロモーターである。例えば、第1の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントは、Brownら、Biotechnology and Bioengineering、111巻、8号、2014年8月に記載されるプロモーターを含み得る。

0077

0078

第2の制御エレメント
一実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントをさらに含み、第2の制御エレメントは、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現の転写開始を可能にするポリメラーゼの動員の原因となる。第2の制御エレメントは、遠位エレメント、例えば、ポリペプチドをコードする配列から少し離れた、例えば、数塩基の長さ離れた、又は個別及び別個の核酸上のポリペプチドの発現を調節するエレメント並びに近位エレメント、例えば、ポリペプチドをコードする配列に近接した、又はその内部の位置に幾分か起因して、ポリペプチドの発現を調節するエレメントを含み得る。一実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、構成的制御エレメントである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、調節される制御エレメント、例えば、内因性又は外因性ポリペプチドによって調節されるプロモーターである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0079

いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2のレベルの活性は、第1のレベルの活性に対して、例えば、高く又は低く調節される。

0080

いくつかの実施形態では、第1の条件及び第2の条件の対は、ストレスの第1の、例えば、低いレベル及びストレスの第2の、例えば、高いレベル;フォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第1の、例えば、低いレベル及びフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第2の、例えば、高いレベル;サイトゾルにおけるフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第1の、例えば、低いレベル及びサイトゾルにおけるフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第2の、例えば、高いレベル;小胞体(ER)におけるフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第1の、例えば、低いレベル及びERにおけるフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第2の、例えば、高いレベル;熱ショック応答(HSR)の活性化の第1の、例えば、低いレベル及びHSRの活性化の第2の、例えば、高いレベル;フォールディングされていないタンパク質応答(UPR)の活性化の第1の、例えば、低いレベル及びUPRの活性化の第2の、例えば、高いレベル;ERシャペロン、例えば、BiPの第1の、例えば、高いレベル及びERシャペロン、例えば、BiPの第2の、例えば、低いレベル;第1の、例えば、低い温度及び第2の、例えば、高い温度;酸化ストレスの第1の、例えば、低いレベル及び酸化ストレスの第2の、例えば、高いレベル;ER Ca2+の第1の、例えば、高いレベル及びER Ca2+の第2の、例えば、低いレベル;ER酸化状態の第1の、例えば、より多い酸化レベル及びER酸化状態の第2の、例えば、より少ない酸化レベル;第1の、例えば、高い細胞エネルギーレベル及び第2の、例えば、低い細胞エネルギーレベル;第1の、例えば、高いATPレベル及び第2の、例えば、低いATPレベル;第1の、例えば、高いグルコースレベル及び第2の、例えば、低いグルコースレベル;活性化されたHsf1ポリペプチドの第1の、例えば、低いレベル及び活性化されたHsf1ポリペプチドの第2の、例えば、高いレベル;リン酸化された三量体Hsf1ポリペプチドの第1の、例えば、低いレベル及びリン酸化された三量体Hsf1ポリペプチドの第2の、例えば、高いレベル;活性な、例えば、スプライシングされたXbp1ポリペプチドの第1の、例えば、低いレベル及び活性な、例えば、スプライシングされたXbp1ポリペプチドの第2の、例えば、高いレベル;ATF4ポリペプチドの第1の、例えば、低いレベル及びATF4ポリペプチドの第2の、例えば、高いレベル;NRF2ポリペプチドの第1の、例えば、低いレベル及びNRF2ポリペプチドの第2の、例えば、高いレベル;並びにATF6(例えば、ATF6α又はATF6β)ポリペプチドの第1の、例えば、低いレベル及びATF6(例えば、ATF6α又はATF6β)ポリペプチドの第2の、例えば、高いレベルを含むリストから選択できる。

0081

いくつかの実施形態では、第2の制御エレメントは、第Nの条件下で第Nのレベルの活性を有し、Nは、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより大きく、第Nの条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が、これまでの条件(例えば、条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など)下での治療用ポリペプチドの発現に対して調節される、例えば、減少又は増大される。本明細書において列挙された第1及び第2の条件の各対について、さらなる第N(例えば、第3、第4、第5など)の条件が考慮され、さらなる第Nの条件は、さらなる関連条件である。例えば、ストレスの第1の、例えば、低いレベル及びストレスの第2の、例えば、高いレベルが上記で列挙され、ストレスのさらなる第Nの(例えば、第3、第4、第5など)(例えば、低い又は高い)レベルも、活性の対応する第Nのレベルとともに考慮される。

0082

いくつかの実施形態では、第1の条件は、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現を阻害する。いくつかの実施形態では、第2の条件は、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現を誘導する。いくつかの実施形態では、第2の条件は、ポリペプチド、例えば、レプレッサーポリペプチドの発現を誘導し、レプレッサーポリペプチドは、別のポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチドの発現を阻害する。いくつかの実施形態では、第2の条件下で、外因性治療用ポリペプチドの発現、例えば、転写レベルは、第1の条件での発現と比較して、少なくとも5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%低減される。

0083

いくつかの実施形態では、第2の制御エレメントは、第1の条件下で、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現を誘導せず(例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドは、明らかには発現されない)、第2の条件下でポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現を誘導する(例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドは、明らかに発現される)。明らかな発現は、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの検出可能な(例えば、当技術分野で公知の方法によって)蓄積又はポリペプチド、例えば、組換え若しくはレプレッサーポリペプチドをコードするmRNAの検出可能な蓄積であり得る。

0084

いくつかの実施形態では、第2の制御エレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性、第2の条件下で第2のレベルの活性及び第3の条件下で第3のレベルの活性を有する。第1のレベルの活性は、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの明らかな発現の欠如をもたらし得る。第2のレベルの活性は、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの明らかな発現をもたらし得る。活性の第3のレベルは、第2のレベルの活性に対する、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現の調節(例えば、増大又は減少を)をもたらし得る。

0085

いくつかの実施形態では、第2の制御エレメントは、第Nの条件下で第Nのレベルの活性を有し、Nは、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより大きく、第Nの条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が、これまでの条件(例えば、条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など)下での治療用ポリペプチドの発現に対して調節される、例えば、減少又は増大される。一実施形態では、第2の制御エレメントの第Nのレベルの活性は、第Nの条件の周期的変動に基づいて周期的に変動する。例えば、細胞ストレスの第1のレベルである第1の条件及び細胞ストレスの第2のレベルである第2の条件を仮定すると、第2の制御エレメントは、第1のレベルの活性及び第2のより高いレベルの活性を有し得る(例えば、この例示的第2の制御エレメントは、細胞ストレスに比例する活性を有する)。第2のより高いレベルの活性は、ポリペプチド、例えば、レプレッサーポリペプチドの発現を増大することができ、これは蓄積すると、組換え又は治療用ポリペプチドの発現を変更する、例えば、減少させる。組換え又は治療用ポリペプチドの発現の変化、例えば、減少は、第3の条件(例えば、細胞ストレスの第2のレベルよりも低い、細胞ストレスの第3のレベル)を作り出す。第3の条件は、第2の制御エレメントの活性の対応する第3のレベルを有し、本実施例において、その第3のレベルの活性は、第2のレベルの活性に対して減少されることもあり、レプレッサーポリペプチドの発現の減少をもたらす。第3の条件下でのレプレッサーポリペプチド発現の減少は、組換え又は治療用ポリペプチドの発現の増大につながることもあり、第4の条件を作り出す(例えば、細胞ストレスの第3のレベルよりも高い細胞ストレスの第4のレベル)など。いくつかの実施形態では、条件の周期的変動に関連した第2の制御エレメントの活性の周期的変動は、経時的に、平衡、例えば、第Nの条件及び第N+1の条件での第2の制御エレメントの活性の相違が無視できる状況に近づき得る。一実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、1つ又は複数の(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い):熱ショックエレメント(HSE)であって、配列番号8〜11に対応する1つ又は複数の配列を含むHSE、cAMP応答エレメント(CRE)であって、配列番号12に対応する配列を含むCRE、抗酸化薬応答エレメント(ARE)であって、配列番号13に対応する配列を含むARE、小胞体ストレス応答エレメント(ERSE)であって、配列番号14に対応する配列を含むERSEを含む。いくつかの実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、当技術分野で公知の関連コンセンサス配列に対してゼロ、1つ、2つ、3つ又は4つ又は5つの置換を含む配列を含む、1つ又は複数の(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い)HSE、CRE、ARE又はERSEを含み得る。いくつかの実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、表6に列挙されたコンセンサス配列を含む、1つ又は複数の(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い)HSE、CRE、ARE又はERSEを含み得る。いくつかの実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、表6に列挙された又は当技術分野で公知の対応するコンセンサスに対して、ゼロ、1つ、2つ、3つ又は4つ又は5つの置換を含む配列を含む1つ又は複数の(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い)HSE、CRE、ARE又はERSEを含み得る。本発明は、特定のプロモーター又はプロモーターに制限されないということは考慮される。

0086

0087

いくつかの実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、熱ショック応答又はフォールディングされていないタンパク質応答(UPR)のエレメントによって調節される、例えば、活性化される、1つ又は複数の(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い)エレメントを含む。いくつかの実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積によって調節される、例えば、活性化される、1つ又は複数の(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い)エレメントを含む。いくつかの実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、1つ又は複数の(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い)Xbp1応答プロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、1つ又はそれより多い(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い)ATF6応答プロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、1つ又は複数の(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い)ATF4応答プロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、1つ又は複数の(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い)NRF2応答プロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントは、1つ又は複数の(例えば、2つ、3つ、4つ又はそれより多い)Hsf1応答プロモーターエレメントを含む。

0088

第3の制御エレメント
いくつかの実施形態では、本発明の同一物を含む細胞、ベクター、核酸及びキット及び方法は、第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、1又は複数のgRNA(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多いgRNA)をコードする核酸配列をさらに含む、又は使用する。第3の制御エレメントは、1又は複数のgRNAの発現の転写開始を可能にするポリメラーゼの動員の原因となる。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターエレメントは、複数のgRNAをコードする配列に作動可能に連結され、複数のgRNA及び/又は複数のgRNAをコードする配列は、各々、参照により本明細書に組み込まれる、Gao,Y.及びY.Zhao(2014年).J Integr Plant Biol 56巻(4号):343〜349頁;Martick、M.ら(2008年).Nature 454巻(7206号):899〜902頁;Xie,K.ら(2015年).Proc Natl Acad Sci U S A 112巻(11号):3570〜3575頁;Nissim,L.ら(2014年). Mol Cell 54巻(4号):698〜710頁;並びにPort,F.及びS.L.Bullock(2016年).「Augmenting CRISPR applications in Drosophila withtRNA−flanked sgRNAs.」Nat Meth [先行オンライン公開]に記載されるように提供し、製造し、配置し、処理することができる。第3の制御エレメントは、遠位エレメント、例えば、1又は複数のgRNAをコードする配列から少し離れた、例えば、数塩基の長さ離れた、又は個別及び別個の核酸上のポリペプチドの発現を調節するエレメント並びに近位エレメント、例えば、1又は複数のgRNAをコードする配列に近接した、又はその内部の位置に幾分か起因して、1又は複数のgRNAの発現を調節するエレメントを含み得る。一実施形態では、1又は複数のgRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターエレメントは、構成的制御エレメントである。いくつかの実施形態では、1又は複数のgRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターエレメントは、調節される制御エレメント、例えば、内因性又は外因性ポリペプチドによって調節されるプロモーターである。いくつかの実施形態では、第3の制御エレメント、例えば、1又は複数のgRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3のプロモーターエレメントは、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有する。

0089

いくつかの実施形態では、1又は複数のgRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターエレメントは、本明細書において記載される第1の制御エレメントのコピーである。いくつかの実施形態では、1又は複数のgRNAをコードする配列に作動可能に連結された第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターエレメントは、本明細書において記載される第2の制御エレメントのコピーである。

0090

いくつかの実施形態では、第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターエレメントは、合成(天然に存在しない)配列を含む遺伝子操作されたプロモーターである。例えば、第3の制御エレメント、例えば、第3のプロモーターエレメントは、BrownらBiotechnology and Bioengineering、111巻、8号、2014年8月に記載されるようなプロモーターを含み得る。

0091

本明細書において記載されるベクターは、プロモーターに加えて、コアプロモーターに近接して、上記のようなエンハンサー領域;特定のヌクレオチドモチーフ領域をさらに含み。これは、転写因子を動員して転写の速度を上方制御できる(Riethoven 2010年)。プロモーター配列と同様に、これらの領域は、ウイルスに由来することが多く、hCMVなどのプロモーター配列及びSV40エンハンサー配列内に包含されるか、又はさらにアデノウイルス由来配列などに含まれることもある(Gaillet、Gilbertら2007年)。

0092

その他の核酸特徴
一実施形態では、生成物、例えば、ポリペプチド、例えば、本明細書において記載される組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。一実施形態では、選択マーカーは、グルタミンシンセターゼ(GS)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、例えば、メトトレキサート(MTX)に対する耐性を付与する酵素又は抗生物質マーカー、例えば、ハイグロマイシンネオマイシン(G418)、ゼオシン(zeocin)、ピューロマイシン又はブラストサイジンなどの抗生物質に対する耐性を付与する酵素を含む。別の実施形態では、選択マーカーは、セレキシス(Selexis)選択系(例えば、Selexis SAから市販されている、SUREtechnology Platform(商標)及びSelexis Genetic Elements(商標))又はカタラント(Catalant)選択系を含む、又はそれと適合する。

0093

一実施形態では、本明細書において記載される組換え生成物をコードする核酸配列を含むベクターは、本明細書において記載される組換え生成物をコードする核酸配列を含む細胞(単数又は複数)を同定するのに有用である選択マーカーを含む。別の実施形態では、選択マーカーは、本明細書において記載されるような、組換え生成物をコードする核酸配列のゲノムへの組込みを含む細胞(単数又は複数)を同定するのに有用である。組換えタンパク質をコードする核酸配列を組み込んでいる細胞(単数又は複数)の同定は、生成物を安定に発現する細胞又は細胞株の選択及び遺伝子操作にとって有用であり得る。

0094

使用するのに適したベクターは、市販されており、これとして、Lonza Biologics、PLCから入手可能な、GS発現系(商標)、GS Xceed(商標)遺伝子発現系又はポテジェント(Potelligent)(登録商標)CHOK1SVテクノロジーと関連するベクター、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるFanら、Pharm.Bioprocess.(2013年);1巻(5号):487〜502頁に記載されるようなベクターが挙げられる。GS発現ベクターは、GS遺伝子又はその機能的断片(例えば、GSミニ遺伝子)と、1つ又は複数の、例えば、1、2又は3つ又はそれより多い、対象の遺伝子、例えば、本明細書において記載される組換えポリペプチドをコードする核酸の発現のための高効率転写カセットとを含む。ミニ遺伝子は、GS遺伝子の単一イントロン及び約1kbの3’端に位置するDNAを含有し、SV40後期プロモーターから転写される。一実施形態では、GSベクターは、SV40Lプロモーター及び1つ又は2つのポリAシグナルに作動可能に連結されたGS遺伝子を含む。別の実施形態では、GSベクターは、SV40Eプロモーター並びにSV40イントロンスプライシング及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたGS遺伝子を含む。このような実施形態では、例えば、対象の遺伝子又は本明細書において記載される組換えポリペプチドの発現のための転写カセットは、hCMV−MIEプロモーター及び第1のイントロンを含むhCMV−MIE遺伝子由来の5’非翻訳配列を含む。その他のベクターを、GS発現ベクターに基づいて構築することができ、例えば、これでは、その他の選択マーカーを、本明細書において記載される発現ベクターにおいてGS遺伝子と置換する。

0095

本明細書において記載される方法において使用するのに適したベクターとして、それだけには限らないが、pcDNA3.1/Zeo、pcDNA3.1/CAT、pcDNA3.3TOPO(Thermo Fisher、これまではInvitrogen);pTarget、HaloTag(Promega);pUC57(GenScript);pFLAG−CMV(Sigma−Aldrich);pCMV6(Origene);pEE12又はpEE14(Lonza Biologics)又はpBK−CMV/pCMV−3Tag−7/pCMV−Tag2B(Stratagene)などのその他の市販のベクターが挙げられる。

0096

細胞
組換えタンパク質又はポリペプチド、例えば、治療用ポリペプチドは、組換えDNA技術によって製造され、宿主細胞によって発現されることができ、宿主細胞(例えば、CHO細胞)から精製される、又は流体、例えば、宿主細胞が培養される細胞培地中に分泌され、流体から精製されることができる。高収率で、適当な品質の組換えタンパク質又はポリペプチドを生成可能な細胞は、当技術分野において高度に望ましい。組換え、例えば、治療用ポリペプチドを作製する、細胞、細胞を作製する方法、方法及びそれに関連するキットは、生存力が改善された細胞、高生産性細胞を作製して、高収率の組換え、例えば、治療用ポリペプチド生成物を得る、又は組換えポリペプチド生成物の高品質な調製物、例えば、多量の正しくフォールディングされたタンパク質、少量の凝集したタンパク質、所望のグリコシル化パターン若しくは所望のレベルのグリコシル化を含む組換えポリペプチド生成物の調製物を提供するために有用である。組換え、例えば、治療用ポリペプチドを作製する、細胞、細胞を作製する方法、方法及びそれに関連するキットは、効率的な細胞株の開発、多量の組換え治療用ポリペプチド生成物及び患者における治療的使用のための高い等級の品質に対する需要がある場合に、組換え、例えば、治療用ポリペプチドの製造にとって特に有用である。

0097

細胞及び細胞培養
一態様では、本開示は、生成物、例えば、本明細書において記載されるような組換え又は治療用ポリペプチドを生成する細胞又は細胞株を評価、分類、同定、選択又は作製する方法に関する。別の態様では、本開示は、生産性及び生成物品質が改善された、例えば、高められた細胞又は細胞株を評価、分類、同定、選択又は作製する方法及び組成物に関する。

0098

実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。その他の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞以外の細胞である。一実施形態では、細胞は、マウスラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、サル、類人猿イヌウマフェレット又はネコに由来する。実施形態では、細胞は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞はげ歯類細胞、例えば、ハムスター細胞、マウス細胞又はラット細胞である。別の実施形態では、細胞は、アヒルオウム魚類昆虫、植物、真菌又は酵母に由来する。一実施形態では、細胞は、古細菌である。一実施形態では、細胞は、放線菌類の種、例えば、結核菌である。

0099

一実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。一実施形態では、細胞は、CHO−K1細胞、CHOK1SV細胞、DG44CHO細胞、DUXB11 CHO細胞、CHO−S、CHO GSノックアウト細胞、CHOK1SV FUT8ノックアウト細胞、CHOZN又はCHO由来細胞である。CHO GSノックアウト細胞(例えば、GSKO細胞)は、例えば、CHO−K1SV GSノックアウト細胞(Lonza Biologics,Inc.)である。CHO FUT8ノックアウト細胞は、例えば、ポテリジェント(登録商標)CHOK1SV FUT8ノックアウト(Lonza Biologics、PLC.)である。

0100

一実施形態では、細胞は、部位特異的組込み(SSI)宿主細胞である。一実施形態では、SSI宿主細胞は、内因性Fer1L4遺伝子を含み、外因性ヌクレオチド配列は、前記Fer1L4遺伝子に組み込まれている。いくつかの実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの対象の遺伝子コード配列、例えば、治療用、レプレッサー又は選択マーカーポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも2つの組換え標的部位を含む。いくつかの実施形態では、組換え標的部位は、少なくとも1つの対象の遺伝子コード配列の両端に位置する。その他の実施形態では、組換え標的部位は、少なくとも1つの対象の遺伝子コード配列に隣接し、両端に位置しない。いくつかの実施形態では、対象の遺伝子コード配列は、少なくとも1つの選択マーカー遺伝子を含む。

0101

一実施形態では、SSI宿主細胞は、それ自身、その5’及び3’末端に各1つの組換え標的部位が両端に位置する、外因性ヌクレオチド配列、すなわち、少なくとも1つの、組換え、例えば、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列の存在を特徴とし、配列番号17又は18又はその相同な配列のヌクレオチド配列の少なくとも1つは、宿主細胞のゲノムに組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の3’末端に位置する。一実施形態では、SSI宿主細胞は、それ自身、その5’及び3’末端に各1つの組換え標的部位が両端に位置する、外因性ヌクレオチド配列、すなわち、組換え、例えば、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列の存在を特徴とし、配列番号19又はその相同な配列において与えられるような少なくとも1つのヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の5’末端に位置する。

0102

一実施形態では、細胞は、部位特異的組込み(SSI)宿主細胞である。一実施形態では、SSI宿主細胞は、それ自身、その5’及び3’末端に各1つの組換え標的部位が両端に位置する、外因性ヌクレオチド配列、すなわち、選択マーカーをコードする少なくとも1つの配列の存在を特徴とし、配列番号17又は18又はその相同な配列のヌクレオチド配列の少なくとも1つは、宿主細胞のゲノムに組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の3’末端に位置する。一実施形態では、SSI宿主細胞は、それ自身、その5’及び3’末端に各1つの組換え標的部位が両端に位置する、外因性ヌクレオチド配列、すなわち、選択マーカーをコードする少なくとも1つの配列の存在を特徴とし、配列番号19又はその相同な配列において与えられるような少なくとも1つのヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の5’末端に位置する。

0103

別の実施形態では、細胞は、HeLa、HEK293、HT1080、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHKベビーハムスター腎臓細胞)、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、Y0、EB66、C127、L細胞、COS、例えば、COS1及びCOS7、QC1−3、CHOK1、CHOK1SV、ポテリジェント(商標)(CHOK1SV FUT8−KO)、CHO GSノックアウト、Xceed(商標)(CHOK1SV GS−KO)、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11及びCHOZN又はそれに由来する任意の細胞である。

0104

一実施形態では、真核細胞幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚幹細胞ESC)、成体幹細胞誘導多能性幹細胞(iPSC)、組織特異的幹細胞(例えば、造血幹細胞)及び間葉系幹細胞MSC)を含む多能性幹細胞であり得る。

0105

一実施形態では、細胞は、本明細書において記載される細胞のいずれかの分化形態である。一実施形態では、細胞は、培養中の任意の一次細胞に由来する細胞である。

0106

実施形態において、細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞、などの肝細胞又は非実質細胞である。例えば、細胞は、付着可能代謝適格ヒト肝細胞、付着可能誘導適格ヒト肝細胞、付着可能キアリストトランスポーターサーティファイド(Qualyst Transporter Certified)(商標)ヒト肝細胞、懸濁液適格ヒト肝細胞(10人のドナー及び20人のドナーのプールされた肝細胞を含む)、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星状細胞、イヌ肝細胞(単一及びプールされたビーグル肝細胞を含む)、マウス肝細胞(CD−1及びC57BI/6肝細胞を含む)、ラット肝細胞(スプラーグ−ドーリー(Sprague−Dawley)、ウィスターハン(Wistar Han)及びウィスター(Wistar)肝細胞を含む)、サル肝細胞(カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む)、ネコ肝細胞(ドメスティックショートヘア(Domestic Shorthair)肝細胞を含む)及びウサギ肝細胞(ニュージーランドホワイト(New Zealand White)肝細胞を含む)であり得る。例示的肝細胞は、Triangle Research Labs、LLC、6 Davis Drive Research Triangle Park、米国、ノースカロライナ州27709から市販されている。

0107

一実施形態では、真核細胞は、例えば、酵母細胞(例えば、ピキア(Pichia)属(例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア・クルイベリ(Pichia kluyveri)及びピキア・アングスタ(Pichia angusta))、コマテラ(Komagataella)属(例えば、コマガテラ・パストリス(Komagataella pastoris)、コマガテラ・シュードパストリス(Komagataella pseudopastoris)又はコマガテラ・ファフィー(Komagataella phaffii))、サッカロミセス(Saccharomyces)属(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)、セレビシエ(cerevisiae)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ウバルム(Saccharomyces uvarum))、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属(例えば、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロミセス・マルシナス(Kluyveromyces marxianus))、カンジダ(Candida)属(例えば、カンジダ・ウチリス(Candida utilis)、カンジダ・カカオイ(Candida cacaoi)、カンジダ・ボイジニー(Candida boidinii))、ゲオトリクム(Geotrichum)属(例えば、ゲオトリクム・ファーメンタンス(Geotrichum fermentans))、ハンゼヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ヤロウィアリポリティカ(Yarrowia lipolytica)又はシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などの低級真核細胞である。種ピキア・パストリスが好ましい。ピキア・パストリス株の例として、X33、GS115、KM71、KM71H及びCBS7435がある。

0108

一実施形態では、真核細胞は、真菌細胞(例えば、アスペルギルス属(Aspergillus)の種(A.ニガー(niger)、A.フミガツス(fumigatus)、A.オリゼ(orzyae)、A.ミデュラ(nidula)など)、アクレモニウム属(Acremonium)の種(A.サーモフィルム(thermophilum)など)、ケトミウム属(Chaetomium)の種(C.サーモフィルム(thermophilum)など)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)の種(C.サーモフィル(thermophile)など)、コルディセプス属(Cordyceps)の種(C.militarisなど)、コリナスカス属(Corynascus)の種、クテノミセス属(Ctenomyces)の種、フザリウム属(Fusarium)の種(F.オキシスポラム(oxysporum)など)、グロメレラ属(Glomerella)の種(G.グラミニコラ(graminicola)など)、ヒポクレア属(Hypocrea)の種(H.ジェコリナ(jecorina)など)、マグナポルサ属(Magnaporthe)の種(M.オルジエ(orzyae)など)、ミセリオフトラ属(Myceliophthora)の種(M.サーモフィル(thermophile)など)、ネクトリア属(Nectria)の種(N.ヘアトコッカ(heamatococca)など)、ニューロスポラ属(Neurospora)の種(N.クラッサ(crassa)など)、ペニシリウム属(Penicillium)の種、スポロトリクム属(Sporotrichum)の種(S.サーモフィル(thermophile)など)、チエラビア属(Thielavia)の種(T.テレストリス(terrestris)、T.ヘテロリカ(heterothallica)など)、トリコデルマ属(Trichoderma)の種(T.リーゼイ(reesei)など)又はバーティシリウム属(Verticillium)の種(V.ダーリア(dahlia)など)である。

0109

一実施形態では、真核細胞は、昆虫細胞(例えば、Sf9、ミミック(Mimic)(商標)Sf9、Sf21、ハイファイブ(High Five)(商標)(BT1−TN−5B1−4)又はBT1−Ea88 cells)、藻類細胞(例えば、アンフォラ属(Amphora)の種、バシラリオフィセアエ属(Bacillariophyceae)の種、ドナリエラ属(Dunaliella)の種、クロレラ属(Chlorella)の種、クラミドモナス属(Chlamydomonas)の種、シアノフィタ属(Cyanophyta)の種(シアノバクテリア)、ナンノクロロプシス属(Nannochloropsis)の種、スピルリナ属(Spirulina)の種又はオクロモナス属(Ochromonas)の種のもの)又は植物細胞(例えば、単子葉植物(例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ又はセタリア属(Setaria)の種)に由来する、又は双子葉植物(例えば、キャッサバジャガイモダイズトマトタバコアルファルファニセリガネコケ(Physcomitrella patens)又はアラビドプシス属(Arabidopsis)の種に由来する細胞である。

0110

一実施形態では、細胞は、細菌細胞又は原核細胞である。

0111

実施形態では、原核細胞は、グラム陽性細胞である。s such asバチルス属(Bacillus)の種、ストレプトミセス属(Streptomyces)の種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)の種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)の種又はラクトバチルス属(Lactobacillus)の種である。使用できるバチルス属の種として、例えば、B.スブチリス(subtilis)、B.アミロリケファシエンス(amyloliquefaciens)、B.リケニフォルミス(licheniformis)、B.ナット(natto)又はB.メガテリウム(megaterium)がある。実施形態では、細胞は、B.スブチリス3NA及びB.スブチリス168などのB.スブチリスである。バチルス属の種は、例えば、Bacillus Genetic Stock Center、Biological Sciences 556、484ウエスト第12アベニュー、オハイオ州、コロンバス43210−1214から入手することができる。

0112

一実施形態では、原核細胞は、グラム陰性細胞、例えば、TG1、TG2、W3110、DH1、DHB4、DH5a、HMS 174、HMS174(DE3)、NM533、C600、HB101、JM109、MC4100、XL1−Blue及びOrigamiなどのサルモネラ属(Salmonella)の種又は大腸菌(Escherichia coli)並びに大腸菌B株に由来するもの、例えば、BL−21若しくはBL21(DE3)又はBL21(DE3)pLysSなどであり、そのすべては市販されている。

0113

適した宿主細胞は、例えば、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH、ドイツ、ブラウンシュヴァイク)又はAmerican Type Culture Collection(ATCC)などの培養物コレクションから市販されている。

0114

一実施形態では、細胞は、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、例えば、組換えポリペプチド、例えば、表1〜4から選択される組換えポリペプチドを発現する本明細書において記載された細胞のいずれか1である。

0115

一実施形態では、細胞培養は、バッチ培養、フェド−バッチ培養、ドローアンドフィル(draw and fill)培養又は連続培養として実施する。一実施形態では、細胞培養は、懸濁培養である。一実施形態では、細胞又は細胞培養物を、組換えポリペプチドの発現のためにin vivoに入れる、例えば、モデル生物又はヒト対象に入れる。

0116

一実施形態では、培養培地は、血清不含である。血清不含、タンパク質不含及び化学的に定義された動物成分不含(CDACF)培地は、例えば、Lonza Biologicsから市販されている。

0117

哺乳動物細胞株のための適した培地及び培養方法は、例えば、米国特許第5,633,162号に記載されるように当技術分野で周知である。実験用フラスコ又は低密度細胞培養のための、及び特定の細胞種の必要性に適応している標準細胞培養培地の例として、例えば、Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培地(Morre,G.、The Journal of the American Medical Association、199巻、519〜520頁.1967年)、L−15培地(Leibovitz,A.ら、Amer. J. of Hygiene、78巻、1号173頁〜、1963年)、「ダルベッコ改変イーグル培地」(DMEM)、イーグル最小必須培地MEM)、ハムF12培地(Ham,R.ら、Proc.Natl.Acad.Sc.53巻、288頁〜1965年)又はアルブミントランスフェリン及びレシチンを欠くイスコフ改変DMEM(Iscovesら、J.Exp.med.1巻、923頁〜、1978年)がある。例えば、ハムF10又はF12培地は、CHO細胞培養のために特別に設計された。CHO細胞培養に特別に適応されたその他の培地は、欧州特許第481791号に記載されている。このような培養培地にウシ胎児血清(FBS、ウシ胎児血清FCSとも呼ばれる)を補給してもよく、後者は過剰のホルモン及び成長因子の天然供給源を提供することが知られている。哺乳動物細胞の細胞培養は、今日では、科学教本及びマニュアルに十分に記載される通常の操作であり、例えば、R.Ian Fresney、Culture of Animal cells、a manual、第4版、Wiley−Liss/N.Y.、2000年に詳細に述べられている。

0118

その他の適した培養方法は、当業者に公知であり、組換えポリペプチド生成物及び利用される宿主細胞に応じて変わり得る。細胞によって発現されるべき組換え又は治療用ポリペプチドの発現及び生成に適した条件を決定又は最適化することは、当業者の技術の範囲内である。

0119

一態様では、細胞又は細胞株は、生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む。一実施形態では、細胞又は細胞株は、生成物、例えば、治療薬又は診断薬を発現する。所望のポリペプチド又はタンパク質を発現するように細胞を遺伝子改変又は遺伝子操作するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、トランスフェクション、形質導入(例えば、ウイルス形質導入)又はエレクトロポレーションが挙げられる。

0120

核酸、例えば、本明細書において記載される外因性核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿リポフェクション微粒子銃マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び/又は外因性核酸を含む細胞を製造する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrookら、2012年、MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL、1〜4巻、Cold Spring Harbor Press、NY)を参照のこと。

0121

核酸、例えば、本明細書において記載される外因性核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための化学的手段として、高分子複合体ナノカプセルミクロスフェアビーズなどのコロイド分散系並びに水中油型エマルジョンミセル混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。in vitro及びin vivoで送達媒体として使用するための例示的コロイド系として、リポソーム(例えば、人工膜小胞)がある。ターゲッティングされるナノ粒子を用いるポリヌクレオチドの送達又はその他の適したサブミクロンサイズの送達系などの、核酸の最先端のターゲッティング送達のその他の方法が利用可能である。

0122

実施形態では、外因性核酸の、宿主細胞の核酸、例えば、宿主細胞のゲノム又は染色体核酸への組込みが望まれる。外因性核酸の、宿主細胞のゲノムへの組込みが起こったか否かを調べる方法として、GS/MSX選択方法を挙げることができる。GS/MSX選択方法は、細胞からのタンパク質の高レベル発現を選択するために、組換えGS遺伝子によるグルタミン栄養要求性補完を使用する。手短には、GS/MSX選択方法は、グルタミンシンセターゼをコードする核酸を、組換えポリペプチド生成物をコードする外因性核酸を含むベクターに含めることを含む。メチオニンスルホキシミン(MSX)の投与によって、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチド及びGSの両方をコードする外因性核酸を、ゲノム中に安定に組み込んでいる細胞が選択される。GSは、一部の宿主細胞、例えば、CHO細胞によって内因性に発現されることがあるので、宿主ゲノム中に組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチド生成物をコードする外因性核酸を安定に組み込んでいる高生成細胞を同定するために、MSXを用いる選択の濃度及び期間を最適化することができる。GS選択及びその系は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるFanら、Pharm.Bioprocess.(2013年);1巻(5号):487〜502頁にさらに記載されている。

0123

外因性核酸を宿主細胞ゲノム中に安定に組み込んでいる細胞を同定及び選択するためのその他の方法は、それだけには限らないが、外因性核酸にリポーター遺伝子を含めること及び細胞におけるリポーター遺伝子の存在の評価並びに外因性核酸のPCR解析及び検出を含み得る。

0124

一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞(例えば、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第1の制御エレメント、例えば、第1のプロモーターエレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第2の制御エレメント、例えば、第2のプロモーターエレメントを含む細胞であって、第2の制御エレメントが、第1の条件下で第1のレベルの活性及び第2の条件下で第2のレベルの活性を有し、第2の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少される、細胞)は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて唯一の選択方法を使用して選択された細胞よりも高い又はより一貫した収量のタンパク質生成物を生成可能である。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけの細胞と比較して、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍又は10倍又はそれより多い生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを生成する。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞は、生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけの細胞と比較して、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍又はそれよりも増大される期間又は細胞継代数の間、生成する。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけの細胞と比較して、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200又は300%のより正しくフォールディングされた生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを生成する。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけの細胞と比較して、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%のあまり凝集していないタンパク質又は生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを生成する。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけの細胞と比較して、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200又は300%のよりグリコシル化された生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを生成する。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製され、生成物を生成するために使用される細胞の集団は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけであり、生成物を生成するために使用された細胞と比較して、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200又は300%より生存可能である。

0125

細胞の評価、分類、選択又は同定
一態様では、本開示は、細胞、例えば、候補細胞を、生成物生成、例えば、組換え又は治療用ポリペプチド生成の能力について評価する方法を特徴とする。このような評価の結果は、高生成細胞又は細胞株である細胞又は細胞株を作製するための細胞の選択又は同定にとって有用な情報を提供し得る。別の実施形態では、本明細書において記載される評価に応じて、細胞又は細胞株を、例えば、高生成能力を有する細胞又は細胞株として分類できる。

0126

高生成細胞又は細胞株は、参照細胞又は本明細書において記載された方法によって選択又は作製されていなかった細胞と比較して、高収量の組換え又は治療用ポリペプチド生成物を生成可能である。一実施形態では、高生成細胞株は、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L又は100g/L又はそれより多い生成物、例えば、組換えポリペプチド生成物を生成可能である。一実施形態では、高生成細胞株は、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L又は100g/L又はそれより多い生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチド生成物を生成する。生成される生成物の量は、細胞種、例えば、種及び発現されるべき組換え又は治療用ポリペプチドに応じて変わり得る。例として、高生成細胞は、例えば、本明細書において記載されるように、少なくとも1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L又は25g/L又はそれより多い組換え又は治療用ポリペプチドを生成可能である。

0127

生成物が発現することが困難である実施形態では、高生成細胞は、より低い濃度の生成物、例えば、0.1g/L、0.5g/L又は1g/L未満を生成し得るが、生産性は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む核酸を含まない細胞について観察されるものよりも高い又は増大される。例えば、同定又は選択された細胞によって生成される生成物のレベル、量(amount)又は量(quantity)は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む細胞を含まない細胞によって生成されるレベル、量(amount)又は量(quantity)と比較して、例えば、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍又は100倍又はそれより多く増大される。

0128

細胞を評価するための本明細書において記載される方法は、細胞機能と関連する1つ又は複数のパラメータに対するレプレッサーポリペプチドの効果を評価することを含む。細胞機能と関連するパラメータとして、それだけには限らないが、細胞生存、培養生存力、増殖する能力、生成物を生成する能力及びタンパク質分解が挙げられる。実施形態では、細胞機能に関連するパラメータに対するレプレッサーポリペプチドの効果を調べるために、例えば、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む核酸を含む細胞が、細胞機能と関連するパラメータの1つの増大又は減少をもたらすか否かを調べるために、細胞機能と関連する1つ又は複数のパラメータに対するレプレッサーポリペプチドの発現の効果の値を、参照値と比較する。一実施形態では、細胞機能と関連するパラメータのうち1つ又は複数の増大又は減少の決定に応じて、細胞生成株として開発するために細胞を選択又は同定できる。一実施形態では、細胞機能と関連するパラメータのうち1つ又は複数の増大又は減少の決定に応じて、高生成細胞、例えば、高収量の生成物を生成可能な細胞として細胞を同定できる。

0129

本明細書において記載される実施形態のいずれかでは、参照値は、参照細胞、例えば、所定の生産性を有する細胞の細胞機能と関連するパラメータに対するレプレッサーポリペプチドの効果の値であり得る。或いは、又はさらに、本明細書において記載される実施形態のいずれかにおいて、参照値は、試験されている同一細胞の細胞機能と関連するパラメータの値であることもあり、これでは、細胞は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む核酸を含まない、例えば、細胞を、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む核酸と接触させる前にパラメータの値を測定した、又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む核酸と接触させていない細胞の別個のアリコート

0130

一実施形態では、細胞生存力、例えば、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現を存続する細胞の数又は量を決定又は定量化することによって、細胞生存を測定できる。細胞生存の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後に残る、細胞、例えば、無傷の細胞又は生細胞の数の1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍又は5倍又はそれより多い増大を含む。或いは、細胞生存の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後のアポトーシス細胞数の1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又はそれより多い減少を含む。細胞生存又はアポトーシスを検出するための方法、例えば、アネキシンVアッセイ、生存細胞濃度(IVC)の時間積分、最大生存細胞濃度及び細胞特異的生産性率は、当技術分野で公知である。

0131

一実施形態では、生細胞、例えば、培養物又は細胞の集団中の生細胞又は生存力と関連する特徴、例えば、増殖マーカー、無傷のDNAを有する細胞若しくはアポトーシスマーカーを示さない細胞の数又は量を決定又は定量化することによって、培養生存力を測定できる。培養生存力の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後に残る、細胞、例えば、無傷の細胞又は生細胞の数の1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2、3倍、4倍又は5倍又はそれより多い増大を含む。培養生存力を調べる方法は、当技術分野で公知である。培養生存力を評価するその他の方法として、それだけには限らないが、トリパンブルー排除法と、それに続いて、血球計算器又はVi−CELL(Beckman−Coulter)を使用してカウントすることが挙げられる。培養生存力を評価するその他の方法は、生存バイオマスを調べることを含むことがあり、高周波インピーダンス又は静電容量を使用すること(例えば、Carvell及びDowd、2006年、Cytotechnology、50巻:35〜48頁)又はラマン分光法を使用すること(例えば、Morettoら、2011年、American Pharmaceutical Review、14巻)を含む。

0132

一実施形態では、細胞の数、細胞倍加又は細胞の成長速度を定量化又はカウントすることによって、細胞の増殖する能力を測定できる。或いは、例えば、フローサイトメトリー解析による細胞のゲノム含量(例えば、複製しているDNA)の解析によって、又は細胞周期に関与している増殖マーカー、例えば、Ki67、リン酸化サイクリン−CDK複合体の存在の解析によって、増殖している細胞を同定できる。増殖する能力の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後の、細胞の数又は増殖マーカーを発現する細胞の数の1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍又は5倍又はそれより多い増大を含む。或いは、増殖する能力の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後の、細胞の倍加又は成長速度の1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍又は5倍又はそれより多い増大を含む。培養生存力を調べる方法は、当技術分野で公知である。

0133

本明細書において提供される方法は、組換え又は治療用ポリペプチド、例えば、生成物を生成するための改善された能力を有する細胞又は細胞株を同定、選択又は作製するのに有用である。一実施形態では、本明細書において提供される方法はまた、組換え又は治療用ポリペプチドの改善された品質をもたらす細胞又は細胞株を同定、選択又は作製するのに有用である。

0134

一実施形態では、生成される生成物の量又は濃度を調べる又は定量化することによって、細胞の、生成物を生成する能力を測定できる。生成物を生成する能力の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後のタンパク質生成の1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍又は5倍又はそれより多い増大を含む。

0135

一実施形態では、適切にフォールディングされた生成物、機能的生成物又は非凝集生成物の量又は濃度を調べる又は定量化することによって、生成物、例えば、発現された組換え又は治療用ポリペプチドの品質を測定できる。細胞によって生成される生成物の品質の上昇は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後の適切にフォールディングされた生成物、機能的生成物又は非凝集生成物、例えば、発現された組換え又は治療用ポリペプチドの量又は濃度の1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍又は5倍又はそれより多い上昇を含む。

0136

一実施形態では、正しいグリコシル化プロフィール、マクロ不均一性(すなわち、部位占有率)及びグリコシル化の一貫性を有する生成物の量又は濃度を調べる又は定量化することによって、生成物、例えば、発現された組換え又は治療用ポリペプチドの品質を測定できる。細胞によって生成される生成物の品質の上昇は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後の、グリコシル化プロフィールを有する、部位占有率の増大した、又はグリコシル化の一貫性が増大した生成物の量又は濃度の1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍又は5倍又はそれより多い上昇を含む。

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