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技術 癌患者における骨成長を促進するためのアクチビン−ACTRIIAアンタゴニストおよびその使用

出願人 アクセルロンファーマ,インコーポレイテッド
発明者 ノフジョンシーラジャスビールクマールラビンドラ
出願日 2020年7月22日 (6ヶ月経過) 出願番号 2020-125207
公開日 2020年10月29日 (3ヶ月経過) 公開番号 2020-176139
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 微生物による化合物の製造 医薬品製剤 ペプチド又は蛋白質 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 直線プロファイル 心発生 組み合わせ設定 X線吸収 コロイド分 トンネル形成 飽和効果 安全評価
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年10月29日)のものです。
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図面 (20)

課題

骨成長の促進および骨密度の増加、ならびに多発性骨髄腫処置のための、組成物および方法の提供。

解決手段

少なくとも10-7MのKDでアクチビン受容体IIa型(ActRIIa)リガンドと結合するおよび)細胞におけるActRIIaシグナル伝達阻害する効果を有する、アクチビン受容体IIa型(ActRIIa)タンパク質免疫グロブリンFc部分との融合タンパク質を含む薬学的組成物。本開示は、骨の成長または石灰化の増加を刺激する薬剤を同定する方法を提供する。

概要

背景

発明の背景
骨粗鬆症から骨折にまでわたる骨の障害は、有効な薬学的薬剤がほとんど存在しない、
病理学的状態のセットを表す。その代りに、処置は、固定、運動、および食事の変化を含
む身体的介入および行動的介入に焦点を当てている。多様な骨障害を処置することを目的
とした、骨成長を促進し、骨塩密度を増加させる治療剤を有することは、有益であろう。

骨成長および石灰化は、二つの細胞型破骨細胞および骨芽細胞活性に依存している
が、軟骨細胞および血管系の細胞も、これらの過程の重大な局面に参与する。発達的には
骨形成は、二つの機序軟骨内骨化および膜内骨化を通して起こる。前者は、縦方向
骨形成を担い、後者は、頭蓋骨のような位相幾何学的に平行な骨の形成を担う。軟骨内
化は、骨芽細胞、破骨細胞、血管系の形成、およびその後の石灰化の鋳型として役立つ成
長板における軟骨構造の連続的な形成および分解を必要とする。膜内骨化においては、骨
は、結合組織において直接形成される。いずれの過程も、骨芽細胞の浸潤およびその後の
基質沈着を必要とする。

骨折およびその他の構造的な骨の破損は、少なくとも表面的には、軟骨組織の形成およ
びその後の石灰化を含む、骨形成の発達的な事象系列に類似している過程を通して治癒
する。骨折治癒の過程は、二つの方式で起こり得る。直接的な、または一次の骨治癒は、
カルス形成なしで起こる。間接的な、または二次の骨治癒は、カルス前駆体段階を伴い起
こる。骨折の一次治癒は、密接に癒着した破損を横切る機械連続性再形成を含む。適
当な条件の下で、破損周囲の骨を吸収する細胞が、トンネル形成(tunnelling)吸収応答
を示し、血管の貫入およびその後の治癒のための経路確立する。骨の二次治癒は、炎症
軟質カルス形成、カルス石灰化、およびカルスリモデリングの過程をたどる。炎症段階
においては、損傷の部位における骨膜および骨内膜の血管の破損によって、血腫および出
血形成が起こる。炎症細胞がその区域侵入する。軟質カルス形成段階においては、細胞
が、新たな管、繊維芽細胞、細胞内材料、および支持細胞を作製し、骨折片間の空間にお
いて肉芽組織を形成する。破損を横切った臨床的癒合が、繊維組織または軟骨組織(軟質
カルス)により確立される。骨芽細胞が形成され、軟質カルスの石灰化を媒介し、次いで
、それが層板骨交換され、正常なリモデリング過程を受ける。

骨折およびその他の物理的な骨構造の破損に加え、骨塩量および骨量損失は、多様な
条件により引き起こされ得、著しい医学的問題をもたらすことがある。骨量の変化は、個
体の一生を通して比較的予測可能な方式で起こる。およそ30までは、両方の骨が、
軟骨内成長板の直線的な成長および放射状の成長を通して最大量へと成長する。(骨梁
、例えば、椎骨および骨盤のような扁平骨については)およそ30歳以降、(皮質骨、例え
ば、四肢に見出される長骨については)およそ40歳以降、男女両方において、緩徐な骨損
失が起こる。女性においては、おそらく閉経後エストロゲン欠損により、実質的な骨損
失の最終期も起こる。この期の間に、女性は、皮質骨から10%、海綿コンパートメント
ら25%の骨量をさらに失うかもしれない。進行的骨損失が、骨粗鬆症のような病理学
状態をもたらすか否かは、概して、個体の初期骨量および悪化条件が存在するか否かに依
る。

骨損失は、正常な骨リモデリング過程におけるアンバランスとして特徴付けられること
もある。健康な骨は、絶えずリモデリングを受けている。リモデリングは、破骨細胞によ
る骨の吸収により開始する。次いで、吸収された骨は、骨芽細胞によるコラーゲン形成お
よびその後の石灰化を特徴とする新たな骨組織に交換される。健康な個体において、吸収
および形成の速度は、バランスが保たれている。骨粗鬆症は、骨量および骨石灰化の全体
的な減少をもたらす吸収へのシフトにより特徴付けられる慢性進行性の状態である。臨
床的な骨減少症若年成人の骨の平均値と比べて、1より大きいが2.5より小さい標準偏差
だけ低い骨塩密度)が、ヒトにおける骨粗鬆症に先行する。世界中で、およそ7500万人が
骨粗鬆症のリスクを有している。

従って、破骨細胞と骨芽細胞との間の活性のバランスを制御する方法は、骨折およびそ
の他の骨傷害の治癒を促進するためにも、骨量および骨石灰化の損失に関連した骨粗鬆症
のような障害の処置のためにも有用であり得る。

骨粗鬆症に関しては、エストロゲン、カルシトニンオステオカルシンビタミンK
の併用、または高用量の食事カルシウムが、全て、治療的介入として使用されている。骨
粗鬆症のためのその他の治療アプローチには、ビスホスホネート副甲状腺ホルモン
カルシウム受容体刺激薬(calcimimetics)、スタチンアナボリックステロイドラン
タン塩およびストロンチウム塩、ならびにフッ化ナトリウムが含まれる。しかしながら、
そのような治療薬は、しばしば、望ましくない副作用に関連している。

従って、骨成長および石灰化の促進のための組成物および方法を提供することが、本開
示の目的である。

概要

骨成長の促進および骨密度の増加、ならびに多発性骨髄腫の処置のための、組成物および方法の提供。少なくとも10-7MのKDでアクチビン受容体IIa型(ActRIIa)リガンドと結合するおよび)細胞におけるActRIIaシグナル伝達阻害する効果を有する、アクチビン受容体IIa型(ActRIIa)タンパク質免疫グロブリンFc部分との融合タンパク質を含む薬学的組成物。本開示は、骨の成長または石灰化の増加を刺激する薬剤を同定する方法を提供する。なし

目的

従って、骨成長および石灰化の促進のための組成物および方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

本明細書に記載の発明。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本願は、2007年2月9日出願の米国仮出願第60/900,580号;2007年5月31日出願の第60/93
2,762号;2007年6月26日出願の第60/937,365号;および2007年10月25日出願の第61/000,5
28号の恩典を主張するものである。上記参照された出願の教示は、全て、参照により本明
細書に組み入れられる。

背景技術

0002

発明の背景
骨粗鬆症から骨折にまでわたる骨の障害は、有効な薬学的薬剤がほとんど存在しない、
病理学的状態のセットを表す。その代りに、処置は、固定、運動、および食事の変化を含
む身体的介入および行動的介入に焦点を当てている。多様な骨障害を処置することを目的
とした、骨成長を促進し、骨塩密度を増加させる治療剤を有することは、有益であろう。

0003

骨成長および石灰化は、二つの細胞型破骨細胞および骨芽細胞活性に依存している
が、軟骨細胞および血管系の細胞も、これらの過程の重大な局面に参与する。発達的には
骨形成は、二つの機序軟骨内骨化および膜内骨化を通して起こる。前者は、縦方向
骨形成を担い、後者は、頭蓋骨のような位相幾何学的に平行な骨の形成を担う。軟骨内
化は、骨芽細胞、破骨細胞、血管系の形成、およびその後の石灰化の鋳型として役立つ成
長板における軟骨構造の連続的な形成および分解を必要とする。膜内骨化においては、骨
は、結合組織において直接形成される。いずれの過程も、骨芽細胞の浸潤およびその後の
基質沈着を必要とする。

0004

骨折およびその他の構造的な骨の破損は、少なくとも表面的には、軟骨組織の形成およ
びその後の石灰化を含む、骨形成の発達的な事象系列に類似している過程を通して治癒
する。骨折治癒の過程は、二つの方式で起こり得る。直接的な、または一次の骨治癒は、
カルス形成なしで起こる。間接的な、または二次の骨治癒は、カルス前駆体段階を伴い起
こる。骨折の一次治癒は、密接に癒着した破損を横切る機械連続性再形成を含む。適
当な条件の下で、破損周囲の骨を吸収する細胞が、トンネル形成(tunnelling)吸収応答
を示し、血管の貫入およびその後の治癒のための経路確立する。骨の二次治癒は、炎症
軟質カルス形成、カルス石灰化、およびカルスリモデリングの過程をたどる。炎症段階
においては、損傷の部位における骨膜および骨内膜の血管の破損によって、血腫および出
血形成が起こる。炎症細胞がその区域侵入する。軟質カルス形成段階においては、細胞
が、新たな管、繊維芽細胞、細胞内材料、および支持細胞を作製し、骨折片間の空間にお
いて肉芽組織を形成する。破損を横切った臨床的癒合が、繊維組織または軟骨組織(軟質
カルス)により確立される。骨芽細胞が形成され、軟質カルスの石灰化を媒介し、次いで
、それが層板骨交換され、正常なリモデリング過程を受ける。

0005

骨折およびその他の物理的な骨構造の破損に加え、骨塩量および骨量損失は、多様な
条件により引き起こされ得、著しい医学的問題をもたらすことがある。骨量の変化は、個
体の一生を通して比較的予測可能な方式で起こる。およそ30までは、両方の骨が、
軟骨内成長板の直線的な成長および放射状の成長を通して最大量へと成長する。(骨梁
、例えば、椎骨および骨盤のような扁平骨については)およそ30歳以降、(皮質骨、例え
ば、四肢に見出される長骨については)およそ40歳以降、男女両方において、緩徐な骨損
失が起こる。女性においては、おそらく閉経後エストロゲン欠損により、実質的な骨損
失の最終期も起こる。この期の間に、女性は、皮質骨から10%、海綿コンパートメント
ら25%の骨量をさらに失うかもしれない。進行的骨損失が、骨粗鬆症のような病理学
状態をもたらすか否かは、概して、個体の初期骨量および悪化条件が存在するか否かに依
る。

0006

骨損失は、正常な骨リモデリング過程におけるアンバランスとして特徴付けられること
もある。健康な骨は、絶えずリモデリングを受けている。リモデリングは、破骨細胞によ
る骨の吸収により開始する。次いで、吸収された骨は、骨芽細胞によるコラーゲン形成お
よびその後の石灰化を特徴とする新たな骨組織に交換される。健康な個体において、吸収
および形成の速度は、バランスが保たれている。骨粗鬆症は、骨量および骨石灰化の全体
的な減少をもたらす吸収へのシフトにより特徴付けられる慢性進行性の状態である。臨
床的な骨減少症若年成人の骨の平均値と比べて、1より大きいが2.5より小さい標準偏差
だけ低い骨塩密度)が、ヒトにおける骨粗鬆症に先行する。世界中で、およそ7500万人が
骨粗鬆症のリスクを有している。

0007

従って、破骨細胞と骨芽細胞との間の活性のバランスを制御する方法は、骨折およびそ
の他の骨傷害の治癒を促進するためにも、骨量および骨石灰化の損失に関連した骨粗鬆症
のような障害の処置のためにも有用であり得る。

0008

骨粗鬆症に関しては、エストロゲン、カルシトニンオステオカルシンビタミンK
の併用、または高用量の食事カルシウムが、全て、治療的介入として使用されている。骨
粗鬆症のためのその他の治療アプローチには、ビスホスホネート副甲状腺ホルモン
カルシウム受容体刺激薬(calcimimetics)、スタチンアナボリックステロイドラン
タン塩およびストロンチウム塩、ならびにフッ化ナトリウムが含まれる。しかしながら、
そのような治療薬は、しばしば、望ましくない副作用に関連している。

0009

従って、骨成長および石灰化の促進のための組成物および方法を提供することが、本開
示の目的である。

0010

一部分、本開示は、骨塩密度を増加させ、骨成長を促進し、かつ/または骨強度を増加
させるために、アクチビンまたはActRIIaアンタゴニスト活性を有する分子(「アクチビ
アンタゴニスト」および「ActRIIaアンタゴニスト」、集合的に「アクチビン-ActRIIa
」アンタゴニスト)が使用され得ることを証明する。特に、本開示は、可溶型のActRIIa
が、アクチビン-ActRIIaシグナル伝達阻害剤として作用し、インビボで骨塩密度、骨成
長、および骨強度の増加を促進することを証明する。骨成長を促進するかまたは骨損失を
阻害する大部分の薬学的薬剤は、抗異化剤(一般的に「異化剤」とも呼ばれる)(例えば
、ビスホスホネート)または同化剤(例えば、適切に投薬された場合の副甲状腺ホルモン
PTH)のいずれかとして作用するが、可溶性ActRIIaタンパク質は、二重の活性を示し、抗
異化効果および同化効果の両方を有する。従って、本開示は、骨塩密度を増加させ、かつ
骨成長を促進するために、アクチビン-ActRIIaシグナル伝達経路のアンタゴニストが使用
され得ることを確立する。可溶性ActRIIaは、アクチビンアンタゴニズム以外の機序を通
して骨に影響を与えているかもしれないが、にも関わらず、本開示は、望ましい治療剤が
アクチビン-ActRIIaアンタゴニスト活性に基づき選択され得ることを証明する。従って、
ある種の態様において、本開示は、骨粗鬆症のような低い骨密度もしくは低い骨強度に関
連した障害を処置するため、または骨折を有する患者のようなその必要のある患者におい
て骨成長を促進するため、例えば、アクチビン結合ActRIIaポリペプチド、抗アクチビン
抗体、抗ActRIIa抗体、アクチビンまたはActRIIaにより標的とされる低分子およびアプタ
マー、ならびにアクチビンおよびActRIIaの発現を減少させる核酸を含む、アクチビン-Ac
tRIIaアンタゴニストを使用する方法を提供する。本開示は、さらに、アクチビン-ActRII
aアンタゴニストが、多発性骨髄腫腫瘍および乳房腫瘍により引き起こされた骨傷害の防
止および/または修復において有効であることを証明し、さらに、アクチビン-ActRIIaア
ンタゴニストが、多発性骨髄腫における腫瘍負荷を減じることを証明する。可溶性ActRII
aポリペプチドは、一貫して測定可能筋肉量の増加を引き起こすことなく、骨成長を促
進する。

0011

ある種の局面において、本開示は、アクチビンと結合する可溶性アクチビン結合ActRII
aポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。ActRIIaポリペプチドは、アクチビン結合
ActRIIaポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的調製物として製剤化さ
れ得る。好ましくは、アクチビン結合ActRIIaポリペプチドは、1mM未満、または100、10
、もしくは1nM未満のKDでアクチビンと結合する。任意で、アクチビン結合ActRIIaポリ
プチドは、GDF11および/またはGDF8より選択的にアクチビンに結合し、好ましくは、GDF
11および/またはGDF8より少なくとも10倍、20倍、または50倍低いKDでアクチビンに結合
する。特定の作用機序拘束されることは望まないが、GDF11/GDF8阻害と比べたアクチビ
ン阻害に対するこの程度の選択性は、一貫して測定可能な筋肉に対する効果を伴わない、
骨に対する選択的な効果を説明することが予想される。多くの態様において、ActRIIaポ
ペプチドは、骨に対する望ましい効果を達成する用量で、15%未満、10%未満、または
5%未満の筋肉の増加を引き起こすよう選択されるであろう。好ましくは、組成物は、サ
イズ排除クロマトグラフィにより査定されるように、その他のポリペプチド成分に関して
、少なくとも95%純粋であり、より好ましくは、組成物は少なくとも98%純粋である。そ
のような調製物において使用するためのアクチビン結合ActRIIaポリペプチドは、SEQID
NO:2、3、7、もしくは12より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはSEQ
ID NO:2、3、7、12、もしくは13より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、9
0%、95%、97%、もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドのような
、本明細書に開示されたもののいずれであり得る。アクチビン結合ActRIIaポリペプチド
には、C末端の10〜15アミノ酸(「テール」)を欠いている、SEQID NO:1〜3より選択さ
れる配列またはSEQID NO:2の配列の少なくとも10、20、または30アミノ酸を含むものの
ような、天然ActRIIaポリペプチドの機能性断片が含まれ得る。

0012

可溶性アクチビン結合ActRIIaポリペプチドは、天然に存在するActRIIaポリペプチドと
比べて、アミノ酸配列に(例えば、リガンド結合ドメインに)一つまたは複数の改変を含
んでいてもよい。改変されたActRIIaポリペプチドの例は、参照により本明細書に組み入
れられるWO2006/012627の59〜60頁に提供される。アミノ酸配列の改変は、例えば、哺乳
動物細胞昆虫細胞、もしくはその他の真核細胞において産生される場合、ポリペプチド
グリコシル化を改変するかもしれないし、または天然に存在するActRIIaポリペプチド
と比べてポリペプチドのタンパク質切断を改変するかもしれない。

0013

アクチビン結合ActRIIaポリペプチドは、1個のドメインとしてのActRIIaポリペプチド
(例えば、ActRIIaのリガンド結合部分)と、改良された薬物動態、より容易な精製、特
定の組織へのターゲティング等のような望ましい特性を提供する1個または複数個の付加
的なドメインとを有する融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質のドメイン
は、インビボ安定性インビボ半減期、取り込み/投与、組織局在または分布タンパク
質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および/または精製のうちの一つまたは複
数を増強し得る。二量体化または多量体化は、増加したリガンド結合親和性を提供し得る
。アクチビン結合ActRIIa融合タンパク質は、免疫グロブリンFcドメイン野生型もしく
変異体)、または血清アルブミン、または改良された薬物動態、改良された溶解度、も
しくは改良された安定性のような望ましい特性を提供するその他のポリペプチド部分を含
み得る。典型的には、ActRIIa-Fc融合タンパク質は、ホモダイマー複合体として作製され
るであろう。任意で、ActRIIa-Fc融合体は、Fcドメインと細胞外ActRIIaドメインとの間
に位置する比較的非組織的なリンカーを含む。この非組織的リンカーは、ActRIIaの細胞
外ドメインのC末端にあるおよそ15アミノ酸の非組織的領域(「テール」)に相当しても
よいし、または比較的二次構造のない1、2、3、4、もしくは5アミノ酸、もしくは5〜15、
20、30、50アミノ酸、もしくはそれ以上の長さの人工配列、またはその両方の混合物であ
ってもよい。リンカーはグリシン残基およびプロリン残基に富んでいてもよく、例えば、
トレオニンセリンおよびグリシンの単一配列またはトレオニン/セリンおよびグリシン
反復配列を含有していてもよい(例えば、TG4またはSG4の一重配列または反復配列)。
融合タンパク質は、エピトープタグFLAGタグ、ポリヒスチジン配列、およびGST融合体
のような精製サブシーケンスを含んでいてもよい。任意で、可溶性ActRIIaポリペプチド
は、以下のものより選択される、一つまたは複数の修飾されたアミノ酸残基を含む:グリ
コシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビ
オチン化アミノ酸、脂質部分コンジュゲートされたアミノ酸、および有機誘導体化剤
コンジュゲートされたアミノ酸。薬学的調製物は、骨障害を処置するために使用される化
合物のような一つまたは複数の付加的な化合物を含んでいてもよい。好ましくは、薬学的
調製物は、発熱性物質を実質的に含まない。一般に、患者における不都合免疫応答の可
能性を減じるため、ActRIIaタンパク質の天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動物
細胞株においてActRIIaタンパク質が発現されることが好ましい。ヒト細胞株およびCHO細
胞株は、成功裡に使用されており、その他の一般的な哺乳動物発現系が有用であろうこと
が予想される。

0014

本明細書に記載されるように、ActRIIa-Fcと名付けられたActRIIaタンパク質は、GDF8
および/またはGDF11と比べて選択的なアクチビンとの結合、高親和性リガンド結合、お
よび動物モデルにおける2週間を越える血清半減期を含む望ましい特性を有する。ある種
の態様において、本発明は、ActRIIa-Fcポリペプチド、およびそのようなポリペプチドと
薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的調製物を提供する。

0015

ある種の局面において、本開示は、可溶性アクチビン結合ActRIIaポリペプチドをコー
ドする核酸を提供する。単離されたポリヌクレオチドは、上記のような可溶性アクチビン
結合ActRIIaポリペプチドのコーディング配列を含み得る。例えば、単離された核酸は、A
ctRIIaの細胞外ドメイン(例えば、リガンド結合ドメイン)をコードする配列、ならびに
ActRIIaの膜貫通ドメインおよび/または細胞質ドメインの一部または全部をコードする
が、膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインの内部に位置するか、または細胞外ドメイン
と細胞質ドメインもしくは膜貫通ドメインとの間に位置する終止コドンをコードするであ
ろう配列を含み得る。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、SEQID NO:4もしくは5の
ような全長ActRIIaポリヌクレオチド配列、または部分的に短縮されたバージョンを含み
得る。該単離されたポリヌクレオチドは、さらに、3'末端の少なくとも600ヌクレオチド
前にあるか、またはポリヌクレオチドの翻訳が全長ActRIIaの短縮された部分と任意で融
合された細胞外ドメインを生じるように位置付けられた転写終結コドンを含む。好ましい
核酸配列はSEQID NO:14である。本明細書に開示された核酸は、発現のためプロモーター
と機能的に連結されてもよく、本開示は、そのような組換えポリヌクレオチド形質転換
された細胞を提供する。好ましくは、細胞はCHO細胞のような哺乳動物細胞である。

0016

ある種の局面において、本開示は、可溶性アクチビン結合ActRIIaポリペプチドを作成
する方法を提供する。そのような方法は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のよ
うな適当な細胞において本明細書に開示された核酸(例えば、SEQID NO:4、5、または14
)のいずれかを発現させることを含み得る。そのような方法は、(a)可溶性ActRIIa発現
構築物で形質転換された細胞を可溶性ActRIIaポリペプチドの発現に適している条件の下
で培養すること;および(b)そのように発現された可溶性ActRIIaポリペプチドを回収
ることを含み得る。可溶性ActRIIaポリペプチドは、粗画分、部分精製された画分、また
は高度に精製された画分として回収され得る。精製は、例えば、プロテインAクロマト
ラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ(例えば、Qセファロース)、疎水性相互作用
ロマトグラフィ(例えば、フェニルセファロース)、サイズ排除クロマトグラフィ、およ
陽イオン交換クロマトグラフィのうちの一つ、二つ、または三つ、またはそれ以上を任
意の順序で含む一連の精製工程により達成され得る。

0017

ある種の局面において、可溶性アクチビン結合ActRIIaポリペプチドのような、本明細
書に開示されたアクチビン-ActRIIaアンタゴニストは、対象における骨成長の促進および
骨密度の増加のための方法において使用され得る。ある種の態様において、本開示は、低
い骨密度に関連した障害を処置するため、またはその必要のある患者において骨成長を促
進するための方法を提供する。方法は、有効量のアクチビン-ActRIIaアンタゴニストをそ
の必要のある対象へ投与することを含み得る。ある種の局面において、本開示は、本明細
書に記載されるような障害または状態の処置を目的とする医薬を作製するためのアクチビ
ン-ActRIIaアンタゴニストの使用を提供する。

0018

ある種の局面において、本開示は、骨の成長または石灰化の増加を刺激する薬剤を同定
する方法を提供する。方法は、(a)アクチビンまたはActRIIaポリペプチドのリガンド結
合ドメインと結合する試験薬剤を同定すること;および(b)骨の成長または石灰化に対
する薬剤の効果を評価することを含む。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
[1]
CHO細胞から発現されたActRIIa-Fc融合タンパク質を含む薬学的組成物であって、ActRI
Ia-Fc融合タンパク質が、ジスルフィド結合により連結された二つのSEQID NO:7のポリペ
プチドから形成された二量体であり、但し、該ポリペプチドの一方または両方が、SEQ ID
NO:7に示されるものと比べ、アミノ末端またはカルボキシ末端において1箇所、複数のア
ミノ酸が少なくてもよく、かつ二量体が3〜5個のシアル酸部分を有する、薬学的組成物。
[2]
二量体が4個のシアル酸部分を有する、[1]記載の薬学的調製物。
[3]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、静脈内または皮下に投与された場合に、正常で健康なヒ
トにおいて平均25〜32日の血清半減期および等価な生物学的利用能を有する、[1]記載
の薬学的調製物。
[4]
皮下投与に適している、[1]記載の薬学的調製物。
[5]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、他のタンパク質成分に関して少なくとも90%純粋である
、[1]記載の薬学的調製物。
[6]
有効量のActRIIa-Fc融合タンパク質をヒト患者に投与する工程を含む、ヒト患者におけ
る癌に関連した骨損失を処置または防止する方法。
[7]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、以下からなる群より選択される、[6]記載の方法:
(a)SEQ IDNO:2と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)SEQ IDNO:3と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
(c)SEQ IDNO:2の少なくとも50個の連続するアミノ酸を含むポリペプチド。
[8]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、以下の特徴のうちの一つまたは複数を有する、[7]記
載の方法:
(i)少なくとも10-7MのKDでActRIIaリガンドと結合する;および
(ii)細胞におけるActRIIaシグナル伝達を阻害する。
[9]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル
化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分とコンジュゲートされ
たアミノ酸、および有機誘導体化剤とコンジュゲートされたアミノ酸より選択される一つ
または複数の修飾されたアミノ酸残基を含む、[6]記載の方法。
[10]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、SEQID NO:3のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のア
ミノ酸配列を含む、[7]記載の方法。
[11]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、SEQID NO:3のアミノ酸配列と少なくとも95%同一のア
ミノ酸配列を含む、[7]記載の方法。
[12]
ActRIIa-Fc融合タンパク質がSEQID NO:3のアミノ酸配列を含む、[7]記載の方法。
[13]
ActRIIa-Fc融合タンパク質がSEQID NO:2のアミノ酸配列を含む、[7]記載の方法。
[14]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、各々SEQID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも90%同一
のアミノ酸配列を含む二つのポリペプチドから形成された二量体であり、かつActRIIa-Fc
融合タンパク質が3個以上のシアル酸部分を含む、[6]記載の方法。
[15]
ActRIIa-Fc融合タンパク質がSEQID NO:2のアミノ酸配列を含む、[14]記載の方法。
[16]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が3〜5個のシアル酸部分を含む、[15]記載の方法。
[17]
患者の骨格筋量の10%未満の増加を引き起こす、[6]記載の方法。
[18]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、患者において少なくとも200ng/mLの血清濃度に達するよ
う投与される、[6]記載の方法。
[19]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、患者において少なくとも1000ng/mLの血清濃度に達する
よう投与される、[18]記載の方法。
[20]
ActRIIa-Fc融合タンパク質がSEQID NO:7のアミノ酸配列を有する、[6]記載の方法。
[21]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、正常で健康なヒトにおいて15〜40日の血清半減期を有す
る、[6]記載の方法。
[22]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、週に1回以下の頻度で患者に投与される、[20]記載の
方法。
[23]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、月に1回以下の頻度で患者に投与される、[20]記載の
方法。
[24]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、3ヶ月に1回以下の頻度で患者に投与される、[20]記載
の方法。
[25]
患者が、抗骨吸収治療を受容中であるか、またはActRIIa-Fc融合タンパク質の投与前
1年以内に受容したことがある、[6]〜[24]のいずれか一項記載の方法。
[26]
吸収剤が、ビスホスホネート剤、RANKリガンドアンタゴニスト、およびオステオプロ
テジェリンアンタゴニストからなる群より選択される、[25]記載の方法。
[27]
放射線治療細胞障害剤、または化学療法剤をヒト患者へ投与する工程をさらに含む、
[6]〜[24]のいずれか一項記載の方法。
[28]
患者が多発性骨髄腫を有する、[6]〜[24]のいずれか一項記載の方法。
[29]
有効量のアクチビン-ActRIIaアンタゴニストを、その必要のある対象に投与する工程を
含む、癌に関連した骨損失を処置または防止する方法。
[30]
アクチビン-ActRIIaアンタゴニストが、アクチビンアンタゴニストポリペプチドまたは
ActRIIaアンタゴニストポリペプチドである、[29]記載の方法。
[31]
アクチビン-ActRIIaアンタゴニストが、
(a)抗アクチビン抗体;および
(b)抗ActRIIa抗体
からなる群より選択される抗体である、[29]記載の方法。
[32]
対象が多発性骨髄腫を有する、[29]記載の方法。
[33]
有効量のActRIIa-Fc融合タンパク質を患者に投与する工程を含む、患者における骨成長
の促進および骨吸収の阻害のための方法であって、ActRIIa-Fc融合タンパク質が、各々SE
Q ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む二つのポリペプチ
ドから形成された二量体であり、かつActRIIa-Fc融合タンパク質が、3個以上のシアル酸
部分を含む、方法。
[34]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、SEQID NO:2のアミノ酸配列を含む、[33]記載の方法

[35]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が3〜5個のシアル酸部分を含む、[34]記載の方法。
[36]
患者の骨格筋量の10%未満の増加を引き起こす、[33]記載の方法。
[37]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、患者において少なくとも200ng/mLの血清濃度に達するよ
う投与される、[33]記載の方法。
[38]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、SEQID NO:7のアミノ酸配列を有する、[33]記載の方
法。
[39]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が正常で健康なヒトにおいて15〜40日の血清半減期を有する
、[33]記載の方法。
[40]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、週に1回以下の頻度で患者に投与される、[33]記載の
方法。
[41]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、月に1回以下の頻度で患者に投与される、[33]記載の
方法。
[42]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、3ヶ月に1回以下の頻度で患者に投与される、[33]記載
の方法。
[43]
患者が、ActRIIa-Fc融合タンパク質の投与前の1年以内に抗吸収治療を受容したことが
ある、[33]記載の方法。
[44]
患者が、ActRIIa-Fc融合タンパク質の投与時に抗吸収治療を受容中である、[33]記載
の方法。
[45]
患者が、抗吸収剤をさらに受容する、[33]記載の方法。
[46]
抗吸収剤がビスホスホネート剤である、[43]〜[45]のいずれか一項記載の方法。
[47]
抗吸収剤が、RANKリガンドアンタゴニストまたはオステオプロテジェリンアンタゴニス
トである、[43]〜[45]のいずれか一項記載の方法。
[48]
有効量のActRIIa-Fc融合タンパク質を患者に投与する工程を含む、ヒト患者における多
発性骨髄腫を処置または防止する方法。
[49]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、以下からなる群より選択される、[48]記載の方法:
(a)SEQ IDNO:2と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)SEQ IDNO:3と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
(c)SEQ IDNO:2の少なくとも50個の連続するアミノ酸を含むポリペプチド。
[50]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、以下の特徴のうちの一つまたは複数を有する、[49]記
載の方法:
(i)少なくとも10-7MのKDでActRIIaリガンドと結合する;および
(ii)細胞におけるActRIIaシグナル伝達を阻害する。
[51]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル
化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分とコンジュゲートされ
たアミノ酸、および有機誘導体化剤とコンジュゲートされたアミノ酸より選択される一つ
または複数の修飾されたアミノ酸残基を含む、[48]記載の方法。
[52]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、SEQID NO:3のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のア
ミノ酸配列を含む、[49]記載の方法。
[53]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、SEQID NO:3のアミノ酸配列と少なくとも95%同一のア
ミノ酸配列を含む、[49]記載の方法。
[54]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、SEQID NO:3のアミノ酸配列を含む、[49]記載の方法

[55]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、SEQID NO:2のアミノ酸配列を含む、[49]記載の方法

[56]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、各々SEQID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも90%同一
のアミノ酸配列を含む二つのポリペプチドから形成された二量体であり、かつActRIIa-Fc
融合タンパク質が3個以上のシアル酸部分を含む、[48]記載の方法。
[57]
ActRIIa-Fc融合タンパク質がSEQID NO:2のアミノ酸配列を含む、[56]記載の方法。
[58]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が3〜5個のシアル酸部分を含む、[57]記載の方法。
[59]
患者の骨格筋量の10%未満の増加を引き起こす、[48]記載の方法。
[60]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、患者において少なくとも1000ng/mLの血清濃度に達する
よう投与される、[48]記載の方法。
[61]
ActRIIa-Fc融合タンパク質がSEQID NO:7のアミノ酸配列を有する、[48]記載の方法

[62]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、正常で健康なヒトにおいて15〜40日の血清半減期を有す
る、[48]記載の方法。
[63]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、週に1回以下の頻度で患者に投与される、[61]記載の
方法。
[64]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、月に1回以下の頻度で患者に投与される、[61]記載の
方法。
[65]
ActRIIa-Fc融合タンパク質が、3ヶ月に1回以下の頻度で患者に投与される、[61]記載
の方法。
[66]
ヒト患者における癌に関連した骨損失の処置または防止を目的とする医薬の製造のため
の、ActRIIa-Fc融合タンパク質の使用。
[67]
ヒト患者における癌に関連した骨損失の処置または防止において使用するための、ActR
IIa-Fc融合タンパク質。
[68]
癌に関連した骨損失の処置または防止を目的とする医薬の製造のための、アクチビン-A
ctRIIaアンタゴニストの使用。
[69]
ヒト患者における癌に関連した骨損失の処置または防止において使用するための、アク
ビン-ActRIIaアンタゴニスト。
[70]
患者における骨成長の促進および骨吸収の阻害を目的とする医薬の製造のためのActRII
a-Fc融合タンパク質の使用であって、ActRIIa-Fc融合タンパク質が、各々SEQID NO:2の
アミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む二つのポリペプチドから形成さ
れた二量体であり、かつActRIIa-Fc融合タンパク質が3個以上のシアル酸部分を含む、使
用。
[71]
患者における骨成長の促進および骨吸収の阻害において使用するためのActRIIa-Fc融合
タンパク質であって、各々SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸
配列を含む二つのポリペプチドから形成された二量体であり、かつ3個以上のシアル酸部
分を含む、ActRIIa-Fc融合タンパク質。
[72]
ヒト患者における多発性骨髄腫の処置または防止を目的とする医薬の製造のための、Ac
tRIIa-Fc融合タンパク質の使用。
[73]
ヒト患者における多発性骨髄腫の処置または防止において使用するための、ActRIIa-Fc
融合タンパク質。

図面の簡単な説明

0019

CHO細胞において発現されたActRIIa-hFcの精製を示す。単一の明確なピークとして精製されたタンパク質。
BiaCore(商標アッセイにより測定されるような、ActRIIa-hFcのアクチビンおよびGDF-11との結合を示す。
A-204レポーター遺伝子アッセイの模式図を示す。図は(Dennleret al, 1998,EMBO 17:3091-3100に記載された)レポーターベクター:pGL3(CAGA)12を示す。CAGA12モチーフは、TGF-β応答性遺伝子(PAI-1遺伝子)に存在し、従って、このベクターはSmad2および3を通してシグナル伝達する因子のため一般に役に立つ。
A-204レポーター遺伝子アッセイにおけるGDF-8シグナル伝達に対するActRIIa-hFc(菱形)およびActRIIa-mFc(四角)の効果を示す。いずれのタンパク質も、ピコモル濃度で、GDF-8により媒介されるシグナル伝達の実質的な阻害を示した。
A-204レポーター遺伝子アッセイにおけるGDF-11シグナル伝達に対するActRIIa-hFcの三つの異なる調製物の効果を示す。
12週間の処理期間の前(上パネル)および後(下パネル)の、対照処理BALB/cマウスおよびActRIIa-mFc処理BALB/cマウスのDEXA画像の例を示す。より白い陰影は増加した骨塩密度を示す。
12週間の期間中のBALB/cマウスにおける骨塩密度に対するActRIIa-mFcの効果の定量化を示す。処理は、対照(菱形)、2mg/kgのActRIIa-mFcの投薬(四角)、6mg/kgのActRIIa-mFcの投薬(三角)、および10mg/kgのActRIIa-mFcの投薬(丸)であった。
12週間の期間中のBALB/cマウスにおける骨塩量に対するActRIIa-mFcの効果の定量化を示す。処理は、対照(菱形)、2mg/kgのActRIIa-mFcの投薬(四角)、6mg/kgのActRIIa-mFcの投薬(三角)、および10mg/kgのActRIIa-mFcの投薬(丸)であった。
6週間の期間後の卵巣切除C57BL6マウス(OVX)または偽手術C57BL6マウス(SHAM)における骨梁骨の骨塩密度に対するActRIIa-mFcの効果の定量化を示す。処理は、対照(PBS)または10mg/kgのActRIIa-mFcの投薬(ActRIIa)であった。
12週間の期間中の卵巣切除(OVX)C57BL6マウスにおける骨梁骨に対するActRIIa-mFcの効果の定量化を示す。処理は、対照(PBS;白色バー)または10mg/kgのActRIIa-mFcの投薬(ActRIIa;黒色バー)であった。
6または12週間の処理期間後の偽手術C57BL6マウスにおける骨梁骨に対するActRIIa-mFcの効果の定量化を示す。処理は、対照(PBS;白色バー)または10mg/kgのActRIIa-mFcの投薬(ActRIIa;黒色バー)であった。
12週間の処理中の卵巣切除マウスにおける骨密度のpQCT分析の結果を示す。処理は、対照(PBS;白色バー)またはActRIIa-mFc(黒色バー)であった。y軸:mg/ccm。
12週間の処理中の偽手術マウスにおける骨密度のpQCT分析の結果を示す。処理は、対照(PBS;白色バー)またはActRIIa-mFc(黒色バー)であった。y軸:mg/ccm。
12週間の処理後の全身DEXA分析(A)および大腿骨エクスビボ分析(B)を示す。明るい区域は、高い骨密度の区域を示す。
12週間の処理後の大腿骨の中央骨幹のエクスビボpQCT分析を示す。処理は媒体対照(PBS、黒色バー)およびActRIIa-mFc(白色バー)であった。左4本のバーは全骨密度を示し、右4本のバーは皮質骨密度を示す。4本のバーからなる各セットのうち最初の一対のバーは、卵巣切除マウスからのデータを表し、第二の一対のバーは、偽手術マウスからのデータを表す。
12週間の処理後の大腿骨の中央骨幹のエクスビボpQCT分析および骨幹骨量を示す。処理は媒体対照(PBS、黒色バー)またはActRIIa-mFc(白色バー)であった。左4本のバーは全骨量を示し、右4本のバーは皮質骨量を示す。4本のバーからなる各セットのうち最初の一対のバーは、卵巣切除マウスからのデータを表し、第二の一対のバーは、偽手術マウスからのデータを表す。
大腿骨の中央骨幹および大腿骨皮質の厚さのエクスビボpQCT分析を示す。処理は対照(PBS、黒色バー)およびActRIIa-mFc(白色バー)であった。左4本のバーは骨内膜周囲長を示し、右4本のバーは骨膜周囲長を示す。4本のバーからなる各セットのうち最初の一対のバーは、卵巣切除マウスからのデータを表し、第二の一対のバーは、偽手術マウスからのデータを表す。
12週間の処理後の大腿骨の機械的試験の結果を示す。処理は対照(PBS、黒色バー)およびActRIIa-mFc(白色バー)であった。左2本のバーは卵巣切除マウスからのデータを表し、最後の2本のバーは、偽手術マウスからのデータを表す。
骨梁骨体積に対するActrIIa-mFcの効果を示す。
遠位大腿骨における骨梁構造に対するActrIIa-mFcの効果を示す。
皮質骨に対するActrIIa-mFcの効果を示す。
骨の機械的強度に対するActrIIa-mFcの効果を示す。
三つの異なる投薬量での骨特徴に対する異なる用量のActRIIa-mFcの効果を示す。
ActRIIa-mFcが二重異化抗吸収活性を有することを示す骨組織形態計測を示す。
付加的な組織形態計測データを示す。
未処理マウスおよび腫瘍保持マウスからのマウス大腿骨の画像、ならびに多発性骨髄腫モデルにおける骨形態に対するActRIIa-mFc処理の効果を示す。多発性骨髄腫腫瘍(5T2)を保持しているマウスは、正常マウス(無処理)に比べて、骨における著しい形成および分解を示す。ActRIIa-mFcによる処理は、この効果を排除する。
ActRIIa-hFcが静脈内(IV)投与されるか皮下(SC)投与されるかに関わらず、曲線下面積(AUC)とActRIIa-hFcの投与用量とが直線的な相関を有する、実施例5に記載されたヒト臨床試験からの結果を示す。
IV投与またはSC投与された患者におけるActRIIa-hFcの血清レベルの比較を示す。
異なる用量レベルのActRIIa-hFcに応答した骨アルカリホスファターゼ(BAP)レベルを示す。BAPは同化骨成長のマーカーである。
マウスにおけるActRIIa-mFc(RAP-011)およびビスホスホネート剤(ゾレドロネート)の協同的な効果を示す。

0020

発明の詳細な説明
1.概説
トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)スーパーファミリーは、共通の配列エレ
ントおよび構造モチーフ共有する種々の増殖因子を含む。これらのタンパク質は、脊椎
動物および無脊椎動物多種多様細胞種に対して生物学的効果を及ぼすことが知られて
いる。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生期にパターン形成および組織特異化
において重要な機能を果たし、脂肪生成筋形成軟骨形成心発生造血神経発生
および上皮細胞分化をはじめとする様々な分化過程に影響し得る。このファミリーは、そ
のメンバーが多様な、多くの場合相補的な効果を有する2つの一般的分類:BMP/GDF分類お
よびTGF-β/アクチビン/BMP10分類に分割される。TGF-βファミリーのメンバーの活性を
操作することで、生物に顕著な生理的変化をもたらし得る場合が多い。例えば、Piedmont
eseおよびBelgianBlueウシ品種は、筋肉量の顕著な増加をもたらす、GDF8(ミオスタチン
とも称される)遺伝子の機能喪失変異を有する。Grobetet al., Nat Genet. 1997, 17(1)
:71-4。さらに、ヒトでは、GDF8の不活性対立遺伝子が、筋肉量の増加、および報告によ
れば並外れた強さと関連している。Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8。

0021

アクチビンは二量体ポリペプチド増殖因子であり、TGF-βスーパーファミリーに属する
。2つの密に関連したβサブユニットホモ二量体/ヘテロ二量体(βAβA、βBβB、およ
びβAβB)である3つの主要なアクチビン型(A、B、およびAB)が存在する。ヒトゲノムは、
主に肝臓で発現するアクチビンCおよびアクチビンEもコードする。TGF-βスーパーファ
リーの中で、アクチビンは、卵巣および胎盤細胞においてホルモン産生を刺激し得る、神
経細胞生存を支持し得る、細胞種に応じて正にまたは負に細胞周期の進行に影響し得る
、および少なくとも両生類において中胚葉の分化を誘導し得る、独特でかつ多機能
因子である(DePaoloet al., 1991, Proc SocEp Biol Med. 198:500-512;Dyson et al.,
1997, CurrBiol. 7:81-84;Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963)。さら
に、刺激したヒト単球白血病細胞から単離された赤芽球分化誘導因子(EDF)が、アクチ
ビンAと同一であることが見出された(Murataet al., 1988, PNAS, 85:2434)。アクチビ
ンAは、骨髄において赤血球生成の天然の正の制御因子として作用することが示唆された
。いくつかの組織において、アクチビンシグナル伝達は、その関連ヘテロ二量体、イン
ビンによって拮抗される。例えば、下垂体から卵胞刺激ホルモン(FSH)が放出される過程
において、アクチビンはFSHの分泌および合成を促進し、インヒビンはFSHの分泌および合
成を防止する。アクチビンの生物活性を制御し得るおよび/またはアクチビンに結合し得
るその他のタンパク質には、フォリスタチン(FS)、フォリスタチン関連タンパク質(FSRP)
、およびα2-マクログロブリンが含まれる。

0022

TGF-βシグナルI型およびII型セリン/スレオニンキナーゼ受容体ヘテロ複合体によ
って媒介され、この複合体はリガンド刺激に際して下流のSmadタンパク質をリン酸化およ
び活性化する(Massague,2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178)。これらのI型お
よびII型受容体は、全て、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、および予測されるセリン/スレオニン特異性を有する細胞質ドメインか
ら構成される膜貫通タンパク質である。I型受容体はシグナル伝達に必須であり;II型受
容体は、リガンドとの結合およびI型受容体の発現に必要である。I型およびII型アクチビ
ン受容体は、リガンド結合後に安定した複合体を形成し、II型受容体によってI型受容体
がリン酸化される。

0023

2つの関連したII型受容体、ActRIIaおよびActRIIbが、アクチビンのII型受容体として
同定されている(Mathewsand Vale, 1991, Cell 65:973-982;Attisano et al., 1992, C
ell 68: 97-108)。ActRIIaおよびActRIIbは、アクチビンに加えて、BMP7、Nodal、GDF8、
およびGDF11を含むいくつかの他のTGF-βファミリータンパク質生化学的に相互作用
得る(Yamashitaet al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226;Lee and McPherron, 2001,
Proc.Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311;Yeo and Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-95
7;Oh et al., 2002,Genes Dev. 16:2749-54)。ALK4はアクチビン、特にアクチビンAの
主要なI型受容体であり、ALK-7も同様にアクチビン、特にアクチビンBの受容体として機
能し得る。

0024

本明細書において証明されるように、GDF8またはGDF11のような他のTGF-βファミリー
メンバーと比べて、アクチビンAとの結合における実質的な優先を示す可溶性ActRIIaポリ
ペプチド(sActRIIa)は、インビボで骨成長を促進し、かつ骨密度を増加させるのに有効
である。特定の機序に拘束されることは望まないが、これらの研究において使用された特
定のsActRIIa構築物により示された極めて強いアクチビン結合(ピコモル解離定数)のた
め、sActRIIaの効果は主としてアクチビンアンタゴニスト効果により引き起こされると予
想される。機序にかかわらず、ActRIIa-アクチビンアンタゴニストが正常マウス、骨粗鬆
症のマウスモデル、および多発性骨髄腫のマウスモデルにおいて骨密度を増加させること
は、本明細書に提示されたデータから明白である。骨は動的な組織であり、成長または収
縮および密度の増加または減少が、骨を生じ石灰化を刺激する因子(主として、骨芽細胞
)および骨を破壊脱石灰化する因子(主として、破骨細胞)のバランスに依ることに注
意すべきである。骨成長および石灰化は、生産的な因子の増加により、破壊的な因子の減
少により、またはその両方により増加し得る。「骨成長を促進する」および「骨石灰化を
増加させる」という用語は、骨における観察可能物理的変化をさし、骨の変化が起こる
機序に関しては中性であるものとする。

0025

本明細書に記載された研究において使用された骨粗鬆症および骨成長/密度のマウスモ
デルは、ヒトにおける効力を高度に予測すると考えられ、従って、この開示は、ヒトにお
いて骨成長を促進し、かつ骨密度を増加させるために、ActRIIaポリペプチドおよびその
他のアクチビン-ActRIIaアンタゴニストを使用する方法を提供する。アクチビン-ActRIIa
アンタゴニストには、例えば、アクチビン結合性の可溶性ActRIIaポリペプチド、アクチ
ビン(特に、アクチビンのAサブユニットまたはBサブユニット、βAまたはβBとも呼ばれ
る)と結合し、ActRIIa結合を妨害する抗体、ActRIIaと結合し、アクチビン結合を妨害す
る抗体、アクチビンまたはActRIIaとの結合のため選択された非抗体タンパク質(そのよ
うなタンパク質の例、ならびにそのような非抗体アフィニティ結合試薬の設計および選択
の方法については、例えば、WO/2002/088171、WO/2006/055689、およびWO/2002/032925を
参照のこと)、ならびにしばしばFcドメインに添付されるアクチビンまたはActRIIaとの
結合のため選択されたランダム化ペプチドが含まれる。アクチビンまたはActRIIaとの結
合活性を有する異なる二つのタンパク質(またはその他の部分)、特に、I型(例えば、
可溶性I型アクチビン受容体結合部位およびII型(例えば、可溶性II型アクチビン受容
体)結合部位をそれぞれ阻止するアクチビン結合剤が、二機能性結合分子作出するため
一緒に連結され得る。アクチビン-ActRIIaシグナル伝達軸を阻害する核酸アプタマー
低分子、およびその他の薬剤。インヒビン(即ち、インヒビンアルファサブユニット)(
しかし、インヒビンは全ての組織において普遍的にアクチビンに拮抗するのではない)、
フォリスタチン(例えば、フォリスタチン-288およびフォリスタチン-315)、FSRP、アク
チビンC、アルファ(2)-マクログロブリン、ならびにM108A(108位におけるメチオニン
アラニンへの変化)変異体アクチビンAを含む、様々なタンパク質が、アクチビン-ActRII
aアンタゴニスト活性を有する。一般に、アクチビンのオルタナティブな型、特に、I型受
容体結合ドメインに改変を有するものは、II型受容体と結合することができ、活性三元
合体を形成することができず、従って、アンタゴニストとして作用する。さらに、アクチ
ビンA、B、C、もしくはE、または特にActRIIaの発現を阻害するアンチセンス分子、siRNA
、またはリボザイムのような核酸は、アクチビン-ActRIIaアンタゴニストとして使用され
得る。好ましくは、使用されるアクチビン-ActRIIaアンタゴニストは、TGFβファミリー
の他のメンバーと比べて、特に、GDF8およびGDF11と比べて、アクチビンにより媒介され
るシグナル伝達の阻害のための選択性を示すであろう。可溶性ActRIIbタンパク質はアク
チビンと結合するが、野生型タンパク質はGDF8/11に対するアクチビン結合における有意
な選択性を示さず、予備実験は、このタンパク質が骨に対する所望の効果を提供しない一
方、実質的な筋肉成長も引き起こすことを示唆している。しかしながら、異なる結合特性
を有する改変型のActRIIbが同定されており(例えば、参照により本明細書に組み入れるW
O2006/012627、pp.55-59を参照のこと)、これらのタンパク質は、骨に対する所望の効果
を達成するかもしれない。未処理ActRIIbまたは改変型ActRIIbは、第二のアクチビン選択
的結合剤とのカップリングによりアクチビンに対する追加的な特異性を与えられるかもし
れない。

0026

本明細書で使用する用語は一般に、本発明の状況および各用語が用いられる特定の状況
における、当技術分野での通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそ
れらの作製および使用方法の記載に際して、実施者にさらなる手引きが提供されるように
、特定の用語を以下または本明細書の他所で考察する。用語のいかなる使用の範囲または
意味も、その用語が用いられる特定の状況から明らかになると考えられる。

0027

「約」および「およそ」は一般に、測定の性質または精度を前提として測定された量の
許容可能な誤差の程度を意味するものとする。典型的には、例示的な誤差の程度は、所与
の値または値域の20パーセント(%)以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内であ
る。

0028

または、特に生物系においては、「約」および「およそ」という用語は、所与の値の1
オーダー以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内の値を意味し得る。本明細書
で示す数量は、特記されない限り近似値であり、明確に記載されない場合でも、「約」ま
たは「およそ」という用語が推測され得ることを意味する。

0029

本発明の方法は、野生型配列と1つまたは複数の変異体(配列変種)をはじめとする、配
列を相互に比較する段階を含み得る。そのような比較は典型的に、例えば当技術分野にお
いて周知である配列アライメントプログラムおよび/またはアルゴリズム(数例を挙げると
、例えば、BLASTFASTA、およびMEGALIGN)を用いた、ポリマー配列のアライメントを含
む。変異が残基の挿入または欠失を含むアライメントにおいて、配列アライメントは、挿
入または欠失残基を含まないポリマー配列中に「ギャップ」(典型的には、ダッシュ記号
または「A」で表される)を導入することを当業者は容易に理解し得る。

0030

相同な」という用語は、その文法形態および綴り変化形のすべてにおいて、同じ生
物種のスーパーファミリーに由来するタンパク質、および異なる生物種に由来する相同タ
ンパク質を含む、「共通の進化起源」を有する2つのタンパク質間の関係を指す。この
ようなタンパク質(およびそれらをコードする核酸)は、パーセント同一性の点からであれ
、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、それらの
配列類似性に反映される配列相同性を有する。

0031

「配列類似性」という用語は、その文法形態のすべてにおいて、共通の進化の起源を共
有する可能性があるかまたはない核酸またはアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を
指す。

0032

しかし、一般的な使用および本出願において、「相同な」という用語は、「高度に」な
どの副詞で修飾される場合には、配列類似性を指し得、共通の進化の起源と関連する場合
もあればそうでない場合もある。

0033

2.ActRIIaポリペプチド
ある種の局面において、本発明はActRIIaポリペプチドに関する。本明細書において使
用されるように、「ActRIIa」という用語は、任意の種に由来するアクチビン受容体IIa型
(ActRIIa)タンパク質のファミリー、および変異誘発またはその他の修飾によりそのよ
うなActRIIaタンパク質から派生したバリアントをさす。本明細書において、ActRIIaの言
及は、現在同定されている型のいずれかの言及であると理解される。ActRIIaファミリー
のメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合性細胞外ドメイン、膜
貫通ドメイン、および予測されるセリン/トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメ
ンから構成される膜貫通型タンパク質である。

0034

「ActRIIaポリペプチド」という用語には、ActRIIaファミリーメンバーの任意の天然に
存在するポリペプチドのみならず、有用な活性を保持しているそれらの任意のバリアント
(変異体、断片、融合体、およびペプチドミメティック型を含む)も含むポリペプチドが
含まれる。例えば、ActRIIaポリペプチドには、ActRIIaポリペプチドの配列と少なくとも
約80%同一の配列を有する、好ましくは、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、ま
たはそれ以上の同一性を有する任意の公知のActRIIaの配列に由来するポリペプチドが含
まれる。例えば、本発明のActRIIaポリペプチドは、ActRIIaタンパク質および/またはア
クチビンと結合し、それらの機能を阻害し得る。好ましくは、ActRIIaポリペプチドは、
骨成長および骨石灰化を促進する。ActRIIaポリペプチドの例には、ヒトActRIIa前駆体ポ
リペプチド(SEQID NO:1)ならびに可溶性ヒトActRIIaポリペプチド(例えば、SEQ ID N
O:2、3、7、および12)が含まれる。

0035

ヒトActRIIa前駆体タンパク質配列は以下の通りである。

0036

シグナルペプチドには下線が引かれており;細胞外ドメインは太字で示され、可能性の
あるN結合型グリコシル化部位には、二重下線が引かれている。

0037

プロセシング後のヒトActRIIa可溶性(細胞外)ポリペプチド配列は以下の通りである

0038

細胞外ドメインC末端「テール」には下線が引かれている。「テール」が欠失した配列
(Δ15配列)は以下の通りである。

0039

ヒトActRIIa前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下の通りである(Genbank登録
番号NM_001616のヌクレオチド164-1705)。

0040

ヒトActRIIa可溶性(細胞外)ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである

0041

特定の態様において、本発明は可溶性ActRIIaポリペプチドに関する。本明細書におい
て記載されるように、「可溶性ActRIIaポリペプチド」という用語は、一般に、ActRIIaタ
ンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドをさす。「可溶性ActRIIaポリペプチド」
という用語には、本明細書において使用されるように、ActRIIaタンパク質の任意の天然
に存在する細胞外ドメインのみならず、その任意のバリアント(変異体、断片、およびペ
プチドミメティック型を含む)も含まれる。アクチビン結合ActRIIaポリペプチドとは、
アクチビン、特に、アクチビンAA、AB、またはBBと結合する能力を保持しているものであ
る。好ましくは、アクチビン結合ActRIIaポリペプチドは、1nM以下の解離定数でアクチビ
ンAAと結合するであろう。ヒトActRIIa前駆体タンパク質のアミノ酸配列は以下に提供さ
れる。ActRIIaタンパク質の細胞外ドメインは、アクチビンと結合し、一般に可溶性であ
り、従って、可溶性アクチビン結合ActRIIaポリペプチドと名付けられ得る。可溶性アク
チビン結合ActRIIaポリペプチドの例には、SEQID NO:2、3、7、12、および13に例示され
可溶性ポリペプチドが含まれる。SEQ ID NO:7はActRIIa-hFcと呼ばれ、実施例において
さらに説明される。可溶性アクチビン結合ActRIIaポリペプチドのその他の例には、ActRI
Iaタンパク質の細胞外ドメインに加えてシグナル配列、例えば、ミツバチメリチンリーダ
ー配列(SEQID NO:8)、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)リーダー(SEQ ID
NO:9)、未改変ActRIIaリーダー(SEQID NO:10)が含まれる。SEQ ID NO:13に例示され
たActRIIa-hFcポリペプチドはTPAリーダーを使用する。

0042

ActRIIaポリペプチドの機能的に活性な断片は、ActRIIaポリペプチドをコードする核酸
の対応する断片から組み換えにより作製されたポリペプチドをスクリーニングすることに
より入手され得る。さらに、断片は、従来のメリフィールド固相f-Mocまたはt-Boc化学
ような当技術分野において公知の技術を使用して化学合成されてもよい。断片は、(組み
換えまたは化学合成により)作製され、ActRIIaタンパク質またはアクチビンにより媒介
されるシグナル伝達のアンタゴニスト(阻害剤)として機能し得るペプチジル断片を同定
するために試験され得る。

0043

ActRIIaポリペプチドの機能的に活性なバリアントは、ActRIIaポリペプチドをコードす
る対応する変異誘発核酸から組み換えにより作製された修飾されたポリペプチドのライブ
ラリーをスクリーニングすることにより入手され得る。バリアントは、作製され、ActRII
aタンパク質またはアクチビンにより媒介されるシグナル伝達のアンタゴニスト(阻害剤
)として機能し得るものを同定するために試験され得る。ある種の態様において、ActRII
aポリペプチドの機能的なバリアントは、SEQID NO:2または3より選択されるアミノ酸配
列と少なくとも75%同一のアミノ酸配列を含む。ある種の場合において、機能的バリア
トは、SEQ IDNO:2または3より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、
95%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を有する。

0044

機能的バリアントは、治療効力の増強または安定性(例えば、エクスビボの貯蔵寿命
よびインビボのタンパク質分解に対する抵抗性)のような目的のため、ActRIIaポリペプ
チドの構造を修飾することにより製造され得る。アクチビン結合を保持するよう選択され
た場合、そのような修飾されたActRIIaポリペプチドは、天然に存在するActRIIaポリペプ
チドの機能的等価物と見なされる。修飾されたActRIIaポリペプチドは、例えば、アミノ
酸の置換、欠失、または付加によっても作製され得る。例えば、単発的ロイシンイソ
ロイシンまたはバリンとの交換、アスパラギン酸グルタミン酸との交換、トレオニンの
セリンとの交換、またはあるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との同様の交換(例え
ば、保存的変異)は、得られる分子の生物学的活性に対して主要な効果をもたらさないで
あろうと予想することは合理的である。保存的交換とは、側鎖に関して関連しているアミ
ノ酸のファミリー内で行なわれるものである。ActRIIaポリペプチドのアミノ酸配列の変
化が機能的ホモログをもたらすか否かは、バリアントActRIIaポリペプチドの、野生型Act
RIIaポリペプチドと同様の様式で細胞における応答を生じる能力を査定することにより、
容易に決定され得る。

0045

ある態様において、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を変更するための、ActRII
aポリペプチドの特定の変異を意図する。そのような変異は、O結合またはN結合グリコ
ル化部位などの、1つまたは複数のグリコシル化部位を導入または排除するように選択さ
れ得る。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は一般に、適切な細胞グリコシル化酵素
によって特異的に認識されるトリペプチド配列、アスパラギン-X-スレオニン(またはア
スパラギン-X-セリン)(「X」は任意のアミノ酸)を含む。改変はまた、(O結合グリコシル
化部位のための)野生型ActRIIaポリペプチドの配列に対する1つまたは複数のセリンまた
スレオニン残基の付加、またはそれらによる置換によってなされ得る。グリコシル化認
識部位の第1位または第3位アミノ酸の一方または両方における種々のアミノ酸置換または
欠失(および/または第2位におけるアミノ酸欠失)により、改変トリペプチド配列で非グリ
コシル化が生じる。ActRIIaポリペプチド上の糖質部分の数を増大させる別の手段は、Act
RIIaポリペプチドへのグリコシド化学的または酵素的結合による。使用する結合様式
応じて、糖は(a)アルギニンおよびヒスチジン;(b)遊離カルボキシル基;(c) システイ
ンなどの遊離スルフヒドリル基;(d) セリン、スレオニン、またはヒロドキシプロリン
どの遊離ヒドロキシル基;(e)フェニルアラニンチロシン、またはトリプトファンなど
芳香族残基;または(f)グルタミンアミド基に結合され得る。これらの方法は、1987
年9月11日に刊行された国際公開公報第87/05330号、およびAplinand Wriston (1981) CR
C Crit. Rev.Biochem., pp. 259-306に記載されており、これらは参照により本明細書に
組み入れられる。ActRIIaポリペプチド上に存在する1つまたは複数の糖質部分の除去は、
化学的および/または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、例えば、化合物
トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物へのActRIIaポリペプチドの曝露を含
み得る。この処理によって、アミノ酸配列をそのままにしつつ、連結糖(N-アセチルグル
サミンまたはN-アセチルガラクトサミン)を除く大部分またはすべての糖が切断される
。化学的脱グリコシル化はさらに、Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys.
259:52、およびEdgeet al. (1981) Anal. Biocehm. 118:131により記載されている。Ac
tRIIaポリペプチド上の糖質部分の酵素的切断は、Thotakuraet al. (1987) Meth. Enzym
ol. 138:350に記載されているように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコ
シダーゼを使用することによって達成され得る。哺乳動物、酵母昆虫、および植物細胞
はすべて、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターン
導入し得るため、ActRIIaポリペプチドの配列は、使用する発現系の種類に応じて適切に
調節することができる。一般に、ヒトにおいて使用するためのActRIIaタンパク質は、HEK
293またはCHO細胞株のような、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株で発現され
るが、他の哺乳動物発現細胞株、グリコシル化酵素が操作された酵母細胞株、および昆虫
細胞も同様に有用であると考えられる。

0046

本開示はさらに、ActRIIaポリペプチドの変異体、特にコンビナトリアル変異体のセッ
ト、および切断変異体を作製する方法を意図する;コンビナトリアル変異体のプールは、
機能的変種配列を同定するのに特に有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリ
ーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用
し得るか、または全体として新規な活性を有するActRIIaポリペプチド変種を作製するこ
とであってよい。種々のスクリーニングアッセイ法を以下に提供するが、そのようなアッ
セイ法を用いて変種を評価することができる。例えば、ActRIIaポリペプチド変種は、Act
RIIaリガンドに結合する能力、ActRIIaリガンドのActRIIaポリペプチドに対する結合を妨
害する能力、またはActRIIaリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を妨げる能力
に関してスクリーニングされ得る。

0047

ActRIIaポリペプチドまたはそのバリアントの活性は、細胞に基づくアッセイまたはイ
ビボアッセイにおいても試験され得る。例えば、骨生成または骨破壊関与する遺伝子
の発現に対する変異型ActRIIaポリペプチドバリアントの効果が査定され得る。これは、
必要に応じて、一つまたは複数の組換えActRIIaリガンドタンパク質(例えば、アクチビ
ン)の存在下で実施され得、細胞が、ActRIIaポリペプチドおよび/またはそのバリアン
トを産生するよう、そして、任意で、ActRIIaリガンドを産生するようトランスフェクト
され得る。同様に、ActRIIaポリペプチドはマウスまたはその他の動物に投与され得、密
度または体積のような一つまたは複数の骨特性が査定され得る。骨折の治癒速度も評価さ
れ得る。二重エネルギX線吸収測定法(DEXA)は、動物における骨密度を査定するため
のよく確立されている非侵襲的、定量的な技術である。ヒトにおいて、中枢DEXA系は、脊
および骨盤における骨密度を評価するために使用され得る。これらは、全体の骨密度の
最適な予測法である。末梢DEXA系は、例えば、手、手首足首、および足の骨を含む末梢
骨における骨密度を評価するために使用され得る。CATスキャンを含む伝統的なX線画像
ステムは、骨成長および骨折治癒を評価するために使用され得る。骨の機械的強度も評価
され得る。

0048

天然に存在するActRIIaポリペプチドに比べて選択的な、または一般に増加した効力を
有するコンビナトリアルに由来するバリアントが製造され得る。同様に、変異誘発は、対
応する野生型ActRIIaポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを
与えることができる。例えば、改変されたタンパク質は、未改変ActRIIaポリペプチドの
破壊または不活化をもたらすタンパク質分解またはその他の細胞過程に対して、より安定
に、またはより不安定にされ得る。そのようなバリアント、およびそれらをコードする遺
伝子は、ActRIIaポリペプチドの半減期をモジュレートすることによりActRIIaポリペプチ
ドレベルを改変するために利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的
効果を与えることができ、患者体内の組換えActRIIaポリペプチドレベルのより厳密な制
御を可能にすることができる。Fc融合タンパク質においては、タンパク質の半減期を改変
するため、リンカー(もしあれば)および/またはFc部分において、変異が作成され得る

0049

それぞれが潜在的ActRIIaポリペプチド配列の少なくとも一部を含むポリペプチドのラ
イブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーにより、コンビナトリアルライブラリ
ーを作製する。例えば、潜在的ActRIIaポリペプチドヌクレオチド配列の縮重セットが個
々のポリペプチドとして、またはより大きな融合タンパク質のセットとして(例えば、フ
ァージディスプレイ用に)発現され得るように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝
子配列に酵素的に連結し得る。

0050

潜在的相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製し得る、多くの方
法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を自動DNA合成機で行い、次いでこの合成遺伝
子を発現用の適当なベクターに連結することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成に
ついては、当技術分野で周知である(例えば、Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3;Ita
kura et al., (1981)Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules,
ed. AGWalton, Amsterdam: Elsevier pp273-289;Itakura et al., (1984) Annu. Rev.
Biochem.53:323;Itakura et al., (1984) Science 198:1056;Ike et al., (1983) Nu
cleic Acid Res.11 :477を参照されたい)。他のタンパク質の定方向進化に、このような
技法が使用されている(例えば、Scott et al., (1990) Science 249:386-390;Roberts e
t al., (1992)PNAS USA 89:2429-2433;Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406
Cwirlaet al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382;ならびに米国特許第5,223,409号、
同第5,198,346号、および同第5,096,815号を参照されたい)。

0051

または、他の形態の突然変異誘発法を利用して、コンビナトリアルライブラリーを作製
することができる。例えば、例としてアラニンスキャン突然変異誘発法などを用いて(Ruf
et al.,(1994) Biochemistry 33:1565-1572;Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 26
9:3095-3099;Balintet al., (1993) Gene 137:109-118;Grodberg et al., (1993) Eur
. J. Biochem.218:597-601;Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892
;Lowmanet al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838;およびCunningham et al., (1
989) Science244:1081-1085)、リンカースキャン突然変異誘発法により(Gustin et al.,
(1993)Virology 193:653-660;Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652
;McKnightet al., (1982) Science 232:316);飽和突然変異誘発法により(Meyers et a
l., (1986)Science 232:613);PCR突然変異誘発法により(Leung et al., (1989) Method
Cell Mol Biol1:11-19);または化学的突然変異誘発法などを含むランダム突然変異
発法により(Milleret al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHLPres
s, Cold SpringHarbor, NY;およびGreener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7
:32-34)、ActRIIaポリペプチド変種を作製し、スクリーニングによりライブラリーから単
離することができる。切断(生理活性)型のActRIIaポリペプチドを同定するのであれば、
リンカースキャン突然変異誘発法が、特に組み合わせ設定において魅力的な方法である。

0052

当技術分野において、点突然変異および切断により作製したコンビナトリアルライブラ
リーの遺伝子産物をスクリーニングするため、およびさらには特定の性質を有する遺伝子
産物に関してcDNAライブラリーをスクリーニングするための、多様な技法が周知である。
このような技法は一般的に、ActRIIaポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発で作
製した遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適応できる。大きな遺伝子ライブラリ
ーのスクリーニングに最も広汎に用いられている技法は、典型的に、遺伝子ライブラリー
複製可能な発現ベクタークローニングする段階、得られたベクターのライブラリーで
適切な細胞を形質転換する段階、および、所望の活性を検出すれば検出された産物の遺伝
子をコードするベクターを比較的容易に単離できるような条件下で、コンビナトリアル遺
伝子を発現させる段階を含む。好ましいアッセイには、アクチビン結合アッセイおよびア
クチビン媒介性細胞シグナル伝達アッセイが含まれる。

0053

ある態様において、本発明のActRIIaポリペプチドは、ActRIIaポリペプチド中に天然に
存在する翻訳後修飾に加えて、翻訳後修飾をさらに含み得る。そのような修飾には、これ
らに限定されないが、アセチル化カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、
およびアシル化が含まれる。結果として、改変ActRIIaポリペプチドは、ポリエチレン
リコール、脂質、多糖または単糖、およびリン酸などの、非アミノ酸要素を含み得る。そ
のような非アミノ酸要素がActRIIaポリペプチドの機能性に及ぼす影響は、他のActRIIaポ
ペプチド変種に関して本明細書中に記載したように試験することができる。ActRIIaポ
リペプチドが、細胞内で新生型のActRIIaポリペプチドの切断によって産生される場合、
翻訳後プロセシングはまた、タンパク質の正確な折りたたみおよび/または機能にも重要
であり得る。異なる細胞(CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3、またはHEK293など)は
、特定の細胞機構およびそのような翻訳後活性の特徴的な機構を有し、ActRIIaポリペプ
チドの正確な修飾およびプロセシングを確実にするよう選択され得る。

0054

ある局面において、ActRIIaポリペプチドの機能的変種または改変型は、ActRIIaポリペ
プチドの少なくとも一部および1つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質を
含む。このような融合ドメインの周知の例には、非限定的に、ポリヒスチジン、Glu-Glu
、グルタチオSトランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG、
免疫グロブリン重鎖定常領域(Fc)、マルトース結合タンパク質(MBP)、またはヒト血清
ルブミンが含まれる。融合ドメインは、所望の特定を付与するように選択され得る。例え
ば、いくつかの融合ドメインは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク
質の単離に特に有用である。アフィニティー精製を目的とする場合には、グルタチオン
アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルト結合樹脂など、アフィニティークロマトグラ
フィーのための関連した充填剤を使用する。このような充填剤の多くは「キット」の形態
で入手することができ、例えばPharmacia GST精製システム、および(HIS6)融合パートナ
ーと共に使用して有用であるQIAexpress(商標)システム(Qiagen)などがある。別の例とし
て、融合ドメインは、ActRIIaポリペプチドの検出が容易になるよう選択され得る。その
ような検出ドメインの例には、種々の蛍光タンパク質(例えば、GFP)、ならびに、特異的
抗体が入手可能な、通常短いペプチド配列である「エピトープタグ」が含まれる。特異的
モノクローナル抗体が容易に入手できる周知のエピトープタグには、FLAG、インフルエン
ウイルスヘムアグルチニン(HA)、およびc-mycタグが含まれる。場合によっては、融合
ドメインは、関連したプロテアーゼが融合タンパク質を部分消化し、そこから組換えタン
パク質を遊離させることを可能にする、第Xa因子またはトロンビンなどのプロテアーゼ切
断部位を有する。次いで、遊離したタンパク質を、その後のクロマトグラフィー分離によ
り融合ドメインから単離することができる。特定の好ましい態様において、ActRIIaポリ
ペプチドは、インビボでActRIIaポリペプチドを安定化するドメイン(「安定化」ドメイン
)に融合される。「安定化」とは、これが破壊の減少によるのか、腎臓による排除の減少
によるのか、または他の薬物動態学的効果によるのかにかかわらず、血清半減期を延長
せるいかなるものも意味する。免疫グロブリンのFc部分との融合は、広範なタンパク質に
対して所望の薬物動態学的特性を付与することが知られている。同様に、ヒト血清アル
ミンとの融合も所望の特性を付与し得る。選択され得る他の種類の融合ドメインには、多
量体化(例えば、二量体化、四量体化)ドメインおよび(所望の通りに、骨成長または筋肉
成長のさらなる促進などの、さらなる生物学的機能を付与する)機能的ドメインが含まれ
る。

0055

具体例として、本発明は、Fcドメインに融合された、ActRIIaの可溶性細胞外ドメイン
を含む、融合タンパク質を提供する(例えば、SEQID NO:6)。

0056

任意で、Fcドメインは、Asp-265、リジン322、およびAsn-434などの残基における1つま
たは複数の変異を有する。ある場合において、これらの変異(例えば、Asp-265変異)の1つ
または複数を有する変異体Fcドメインは、野生型Fcドメインと比較して、Fcγ受容体に結
合する能力が低い。その他の場合において、これらの変異(例えば、Asn-434変異)の1つま
たは複数を有する変異体Fcドメインは、野生型Fcドメインと比較して、MHCクラスI関連Fc
受容体(FcRN)に結合する能力が高い。

0057

融合タンパク質の異なる要素は、所望の機能性に合致する任意の様式で配列され得るこ
とが理解される。例えば、ActRIIaポリペプチドは異種ドメインのC末端側に配置されても
よいし、または異種ドメインがActRIIaポリペプチドのC末端側に配置されてもよい。ActR
IIaポリペプチドドメインと異種ドメインは融合タンパク質内で隣接する必要はなく、さ
らなるドメインまたはアミノ酸配列を、いずれかのドメインのC末端もしくはN末端側に、
またはそれらのドメインの間に含めることも可能である。

0058

ある態様において、本発明のActRIIaポリペプチドは、ActRIIaポリペプチドを安定化し
得る1つまたは複数の修飾を含む。例えば、そのような修飾は、ActRIIaポリペプチドのイ
ビトロ半減期を延長させる、ActRIIaポリペプチドの循環半減期を延長させる、またはA
ctRIIaポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。そのような安定化修飾には、非限定
的に、融合タンパク質(例えば、ActRIIaポリペプチドおよび安定化ドメインを含む融合タ
ンパク質を含む)、グリコシル化部分の改変(例えば、ActRIIaポリペプチドに対するグリ
コシル化部位の付加を含む)、および糖質部分の改変(例えば、ActRIIaポリペプチドから
の糖質部分の除去を含む)が含まれる。融合タンパク質の場合、ActRIIaポリペプチドは、
IgG分子(例えば、Fcドメイン)などの安定化ドメインに融合される。本明細書で使用する
「安定化ドメイン」という用語は、融合タンパク質の場合における融合ドメイン(例えば
、Fc)を指すのみならず、糖質部分などの非タンパク質性修飾またはポリエチレングリコ
ールなどの非タンパク質性ポリマーもまた含む。

0059

ある態様において、本発明は、他のタンパク質から単離された、またはさもなくば他の
タンパク質を実質的に含まない、単離および/または精製型のActRIIaポリペプチドを提供
する。ActRIIaポリペプチドは、一般に組み換え核酸による発現により産生される。

0060

3.ActRIIaポリペプチドをコードする核酸
ある局面において、本発明は、本明細書に開示する断片、機能的変種、および融合タン
パク質をはじめとするActRIIaポリペプチド(例えば、可溶性ActRIIaポリペプチド)のいず
れかをコードする単離および/または組換え核酸を提供する。例えば、SEQID NO:4は天然
のヒトActRIIa前駆体ポリペプチドをコードし、SEQID NO:5はプロセッシングされたActR
IIaの細胞外ドメインをコードする。本核酸は、一本鎖であってもまたは二本鎖であって
もよい。そのような核酸は、DNAまたはRNA分子であり得る。これらの核酸は、例えば、Ac
tRIIaポリペプチドを作製する方法において、または直接的な治療物質として(例えば、遺
伝子治療アプローチにおいて)使用され得る。

0061

ある局面において、ActRIIaポリペプチドをコードする本核酸は、SEQID NO:4または5
の変種である核酸を含むことがさらに理解される。変種ヌクレオチド配列は、例えば対立
遺伝子変種のような、1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失によって異
なる配列を含む。

0062

ある態様において、本発明は、SEQID NO:4または5と少なくとも80%、85%、90%、95%、
97%、98%、99%、または100%同一である単離または組換え核酸配列を提供する。当業者で
あれば、SEQID NO:4または5と相補的な核酸配列およびSEQ ID NO:4または5の変種もまた
、本発明の範囲内に入ることを理解すると考えられる。さらなる態様において、本発明の
核酸配列は、単離されても、組換えであっても、および/もしくは異種核酸配列と融合さ
れても、またはDNAライブラリー中に存在してもよい。

0063

他の態様において、本発明の核酸はまた、SEQID NO:4もしくは5に示されるヌクレオ
ド配列に高ストリンジェント条件下ハイブリダイズするヌクレオチド配列、SEQ ID NO:
4もしくは5の相補配列、またはそれらの断片を含む。上記のように、当業者は、DNAハイ
ブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件を変更できることを容易に
理解すると考えられる。当業者は、DNAハイブリダイゼーションを促進する適切なストリ
ンジェンシー条件を変更できることを容易に理解すると考えられる。例えば、約45℃にて
6.0 x塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)でハイブリダイゼーションを行い、その
後50℃にて2.0x SSCで洗浄を行い得る。例えば、洗浄段階塩濃度は、50℃における約2
.0 x SSCという低ストリンジェンシーから、50℃における約0.2xSSCという高ストリン
ジェンシーまでの範囲で選択され得る。さらに、洗浄段階の温度は、室温、約22℃におけ
る低ストリンジェンシー条件から、約65℃における高ストリンジェンシー条件まで上げる
ことができる。温度および塩の両方を変更することも可能であるし、またはその他の変数
を変更して温度または塩濃度を一定に維持してもよい。1つの態様において、本発明は、
室温における6 xSSCおよびその後の室温における2 x SSCでの洗浄という低ストリンジェ
ンシー条件でハイブリダイズする核酸を提供する。

0064

遺伝暗号の縮重により、SEQID NO:4または5に記載の核酸とは異なる単離された核酸も
また、本発明の範囲内である。例えば、多くのアミノ酸は2つ以上のトリプレットにより
指定される。同じアミノ酸を特定するコドン、または同義コドン(例えば、CAUおよびCAC
はヒスチジンに関して同義コドンである)は、タンパク質のアミノ酸配列に影響しない「
サイレント」変異を生じ得る。しかし、本タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすDN
A配列多型が、哺乳動物細胞間に存在すると考えられる。当業者は、特定のタンパク質を
コードする核酸の1つまたは複数のヌクレオチド(ヌクレオチドの約3〜5%まで)におけるこ
れらの変異が、自然の対立遺伝子変異に起因して、所与の種の個体間に存在し得ることを
認識すると考えられる。任意の、および全てのそのようなヌクレオチド変異および生じる
アミノ酸多型も、本発明の範囲内である。

0065

ある態様において、本発明の組換え核酸は、発現構築物内で1つまたは複数の制御ヌク
レオチド配列に機能的に連結され得る。制御ヌクレオチド配列は一般に、発現に使用する
宿主細胞に適したものである。種々の宿主細胞に関して、多くの種類の適切な発現ベクタ
ーおよび適切な制御配列が当技術分野において公知である。典型的に、そのような1つま
たは複数の制御ヌクレオチド配列には、非限定的に、プロモーター配列、リーダーまたは
シグナル配列、リボソーム結合部位転写開始および終結配列翻訳開始および終結配列
、ならびにエンハンサーまたは活性化配列が含まれ得る。本発明では、当技術分野におい
て公知である構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが意図される。プロモーター
は天然のプロモーターであっても、または2つ以上のプロモーターのエレメントを組み合
わせたハイブリッドプロモーターであってもよい。発現構築物はプラスミドなどのエピ
ーム上にあって細胞内に存在し得るか、または発現構築物は染色体内に挿入され得る。好
ましい態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択
マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は当技術分野において周知であり、使用する
宿主細胞によって異なる。

0066

本発明のある局面において、本核酸は、少なくとも1つの制御配列に機能的に連結され
たActRIIaポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターとして提供さ
れる。制御配列は当技術分野において認識されており、ActRIIaポリペプチドの発現を指
示するように選択される。したがって、制御配列という用語は、プロモーター、エンハン
サー、およびその他の発現調節エレメントを含む。例示的な制御配列は、Goeddel; Gene
ExpressionTechnology: Methodsin Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (199
0)に記載されている。例えば、これに機能的に連結された場合にDNA配列の発現を調節す
る多種多様な発現調節配列のいずれかを、これらのベクター中で使用して、ActRIIaポリ
ペプチドをコードするDNA配列を発現させることができる。そのような有用な発現調節配
列には、例えば、SV40の初期および後期プロモーター、tetプロモーター、アデノイル
スまたはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、RSVプロモーター、lac系、trp系
、TACまたはTRC系、発現がT7RNAポリメラーゼにより方向付けられるT7プロモーター、フ
ァージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の調節領域
、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーター、酸性ホスファ
ーゼのプロモーター(例えば、Pho5)、酵母α-接合因子のプロモーター、バキュロウイル
ス系の多角体プロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの
遺伝子発現を調節することが公知の他の配列、ならびにそれらの種々の組み合わせが含ま
れる。発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、および/または発
現が所望されるタンパク質の種類などの要因に依存し得ることが理解されるべきである。
さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、およびベクターによってコ
ードされる、抗生物質マーカーなどの任意の他のタンパク質の発現もまた考慮すべきであ
る。

0067

本発明の組換え核酸は、クローン化遺伝子またはその一部を、原核細胞、真核細胞(酵
母、トリ、昆虫、または哺乳動物)、またはその両方での発現に適したベクター中に連結
することによって作製され得る。組換えActRIIaポリペプチドを産生させるための発現媒
体には、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、適切なベクターには、大腸
菌などの原核細胞における発現用の以下の種類のプラスミドが含まれる:pBR322由来プラ
スミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pBTac由来プラスミド、およびpUC由
来プラスミド。

0068

いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を容易にするための原
核生物配列、および真核細胞中で発現される1つまたは複数の真核生物転写単位の両方を
含む。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVne
o、pMSG、pSVT7、pko-neo、およびpHyg由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクシ
ンに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらベクターのいくつかは、原核細胞お
よび真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、pBR322などの
細菌プラスミドの配列を用いて修飾される。または、ウシパピローマウイルス(BPV-1)ま
たはエプスタイン・バーウイルス(pHEBo、pREP由来、およびp205)などのウイルスの派生
物を、真核細胞におけるタンパク質一過性発現に使用することができる。他のウイルス(
レトロウイルスを含む)発現系の例は、下記の遺伝子治療送達系の説明において見出す
とができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換で用いられる様々な方法が、当
技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方に適した他の発現系、なら
びに一般的な組換え手順については、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed.
, ed. bySambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 20
01)を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系を使用して、組換えポリ
ペプチドを発現させることが望ましいと考えられる。そのようなバキュロウイルス発現系
の例には、pVL由来ベクター(pVL1392、pVL1393、およびpVL941など)、pAcUW由来ベクタ
ー(pAcUW1など)、およびpBlueBac由来ベクター(β-gal含有pBlueBacIIIなど)が含まれる

0069

好ましい態様において、Pcmv-Scriptベクター(Stratagene, La Jolla, Calif.)、pcDNA
4ベクター(Invitrogen,Carlsbad, Calif.)、およびpCI-neoベクター(Promega, Madison,
Wisc.)などのベクターは、CHO細胞において本ActRIIaポリペプチドが産生されるように
設計される。明らかなように、本遺伝子構築物を用いて、例えば精製を目的として融合タ
ンパク質または変種タンパク質をはじめとするタンパク質を産生させるために、培養で増
殖させた細胞中で本ActRIIaポリペプチドを発現させることができる。

0070

本開示はまた、本ActRIIaポリペプチドの1つまたは複数のコード配列(例えば、SEQID
NO:4または5)を含む組換え遺伝子トランスフェクションした宿主細胞に関する。宿主
胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、本発明のActRIIaポリペプ
チドは、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現系を使用す
る)、酵母、または哺乳動物細胞において発現され得る。他の適切な宿主細胞は当業者に
周知である。

0071

従って、本発明は、さらに、本発明のActRIIaポリペプチドを作製する方法に関する。
例えば、ActRIIaポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主
細胞が、ActRIIaポリペプチドの発現が起こることを可能にする適切な条件の下で培養さ
れ得る。ActRIIaポリペプチドが分泌され、ActRIIaポリペプチドを含有している細胞およ
培地の混合物から単離され得る。または、ActRIIaポリペプチドは、細胞質または膜画
分に保持され、細胞が採集され、溶解させられ、タンパク質が単離されるかもしれない。
細胞培養物は宿主細胞、培地、およびその他の副産物を含んでいる。細胞培養に適してい
る培地は当技術分野において周知である。本発明のActRIIaポリペプチドは、イオン交換
クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、限外濾過電気泳動、ActRIIaポリペプ
チドの特定のエピトープに対して特異的な抗体を用いたイムノアフィニティ精製、および
ActRIIaポリペプチドと融合したドメインと結合する薬剤を用いたアフィニティ精製(例
えば、プロテインAカラムがActRIIa-Fc融合体を精製するために使用され得る)を含む、
タンパク質を精製するための当技術分野において公知の技術を使用して、細胞培養培地
宿主細胞、またはその両方から単離され得る。好ましい態様において、ActRIIaポリペプ
チドは、その精製を容易にするドメインを含有している融合タンパク質である。好ましい
態様において、精製は、例えば、以下のもののうちの三つ以上を任意の順序で含む一連の
カラムクロマトグラフィ工程により達成される:プロテインAクロマトグラフィ、Qセファ
ロースクロマトグラフィ、フェニルセファロースクロマトグラフィ、サイズ排除クロマト
グラフィ、および陽イオン交換クロマトグラフィ。精製は、ウイルス濾過および緩衝液
換で完了し得る。本明細書において証明されるように、ActRIIa-hFcタンパク質は、サイ
ズ排除クロマトグラフィにより決定されるような>95%の純度およびSDS PAGEにより決定
されるような>98%の純度にまで精製された。このレベルの純度は、マウスにおける骨に
対する望ましい効果、ならびにマウス、ラット、および非ヒト霊長類における許容される
安全性プロファイルを達成するのに十分であった。

0072

別の態様においては、組換えActRIIaポリペプチドの所望の部分のN末端における、ポリ
-(His)/エンテロキナーゼ切断部位配列のような精製リーダー配列をコードする融合遺伝
子によって、Ni2+金属樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる、発現され
た融合タンパク質の精製が可能になる。その後、エンテロキナーゼによる処理で精製リー
ダー配列を除去し、精製されたActRIIaポリペプチドを提供することができる(例えば、Ho
chuli et al., (1987)J. Chromatography 411:177;およびJanknecht et al., PNAS USA
88:8972を参照されたい)。

0073

融合遺伝子を作製する技法は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコード
する種々のDNA断片の連結は、連結のための平滑末端または付着末端、適切な末端をもた
らすための制限酵素消化、必要に応じた付着末端の充填平滑化、望ましくない結合を回避
するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素による連結を使用する、従来の技法
に従って行われる。別の態様では、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む従来の技法によ
り合成され得る。または、2つの連続した遺伝子断片の間に相補的な突出部を生じるアン
カープライマーを用いて遺伝子断片のPCR増幅を行うことができ、その後アニーリング
せて、キメラ遺伝子配列を作製することもできる(例えば、Current Protocols in Molecu
lar Biology,eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992を参照されたい)。

0074

4.代替的なアクチビンおよびActRIIaのアンタゴニスト
本明細書に提示されたデータは、アクチビン-ActRIIaシグナル伝達のアンタゴニストが
骨成長および骨石灰化を促進するために使用され得ることを証明する。可溶性ActRIIaポ
リペプチド、特に、ActrIIa-Fcが好ましいアンタゴニストであり、そのようなアンタゴニ
ストはアクチビンアンタゴニズム以外の機序を通して骨に影響を与えるかもしれないが(
例えば、アクチビン阻害は、ある薬剤の、TGF-βスーパーファミリーのその他のメンバー
をおそらく含むある範囲の分子の活性を阻害する傾向の指標となり得、そのような集合的
な阻害は骨に対する所望の効果に通じるかもしれない)、抗アクチビン(例えば、A、B、
C、またはE)抗体、抗ActRIIa抗体、ActRIIaの産生を阻害するアンチセンス、RNAi、もし
くはリボザイム核酸、およびアクチビンまたはActRIIaのその他の阻害剤、特に、アクチ
ビン-ActRIIa結合を妨害するものを含む、その他の型のアクチビン-ActRIIaアンタゴニス
トも有用であると予想される。

0075

ActRIIaポリペプチド、(例えば、可溶性ActRIIaポリペプチド)と特異的に反応性であ
り、ActRIIaポリペプチドと競争的にリガンドに結合するか、またはActRIIaにより媒介さ
れるシグナル伝達を阻害する抗体が、ActRIIaポリペプチド活性のアンタゴニストとして
使用され得る。同様に、アクチビンAポリペプチドと特異的に反応性であり、ActRIIa結合
を妨害する抗体が、アンタゴニストとして使用され得る。

0076

ActRIIaポリペプチドまたはアクチビンポリペプチドから得られた免疫原を使用するこ
とにより、抗タンパク質/抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を標準的な手順に
より作製することができる(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow a
nd Lane (ColdSpring Harbor Press: 1988)を参照されたい)。マウス、ハムスター、ま
たはウサギなどの哺乳動物を、ActRIIaポリペプチドの免疫原性形態、抗体応答を誘発し
得る抗原性断片、または融合タンパク質で免疫化し得る。タンパク質またはペプチドに免
疫原性を付与する技法として、担体との結合または当技術分野で周知の他の技法が含まれ
る。ActRIIaまたはアクチビンポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で
投与することができる。免疫化の進行は、血漿または血清中抗体力価を検出することに
よりモニターし得る。その免疫原を抗原とし、標準的なELISA法または他の免疫測定法
用いることで、抗体レベルを評価し得る。

0077

ActRIIaポリペプチドの抗原性調製物で動物を免疫化した後、抗血清を得ることができ
、必要に応じて、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル
抗体を作製するには、免疫した動物から抗体産生細胞(リンパ球)を回収し、標準的な体細
胞融合手順により骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞創出
し得る。このような技法は当技術分野で周知であり、これには、例えばハイブリドーマ
法(Kohlerand Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497により最初に開発された)、ヒト
B細胞ハイブリドーマ技法(Kozbaret al., (1983) Immunology Tody, 4: 72)、およびヒ
トモノクローナル抗体を作製するためのEBV-ハイブリドーマ技法(Cole et al., (1985) M
onoclonalAntibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96)が含まれる
。ハイブリドーマ細胞は、ActRIIaポリペプチドと特異的に反応する抗体の産生について
免疫化学的にスクリーニングすることができ、このようなハイブリドーマ細胞を含む培養
物からモノクローナル抗体を単離することができる。

0078

本明細書で使用する「抗体」という用語は、本ポリペプチドとやはり特異的に反応する
その断片を包含することを意図している。抗体は慣用的技法を用いて断片化することがで
き、それらの断片を、抗体全体について上記と同様に有用性に関してスクリーニングする
ことができる。例えば、F(ab)2断片は、抗体をペプシンで処理することにより生成するこ
とができる。得られたF(ab)2断片をジスルフィド架橋還元するように処理して、Fab
片を生成することができる。本発明の抗体は、抗体の少なくとも1つのCDR領域によって付
与されるActRIIaまたはアクチビンポリペプチドに対する親和性を有する、二重特異性
一本鎖、キメラヒト化、および完全ヒト分子を包含することをさらに意図している。抗
体は、これに結合されて検出され得る標識(例えば、標識は、放射性同位体蛍光化合物
、酵素、または酵素補因子であってよい)をさらに含み得る。

0079

ある種の態様において、抗体は組換え抗体である。この用語には、CDRグラフト抗体ま
たはキメラ抗体、ライブラリーから選択された抗体ドメインから組み立てられたヒトまた
はその他の抗体、単鎖抗体、および単一ドメイン抗体(例えば、ヒトVHタンパク質または
ラクだVHHタンパク質)を含む、一部、分子生物学の技術により製造された任意の抗体が
包含される。ある種の態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体であり、ある種
の態様において、本発明は、新規の抗体を製造するための利用可能な方法を作成する。例
えば、ActRIIaポリペプチドまたはアクチビンポリペプチドに特異的に結合するモノクロ
ナル抗体を製造する方法は、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な量の抗原ポリペ
プチドを含む免疫原性組成物をマウスに投与すること、マウスから抗体産生細胞(例えば
脾臓由来の細胞)を入手し、抗体産生ハイブリドーマを入手するため抗体産生細胞を骨
腫細胞と融合させること、および抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマを同定するため、抗体産生ハイブリドーマを試験することを含み得る。
入手された後、ハイブリドーマは、細胞培養物中で、任意で、ハイブリドーマに由来する
細胞が抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するような培養条件で、繁殖
せられ得る。モノクローナル抗体は、細胞培養物から精製され得る。

0080

抗体に関して用いる場合の形容詞「〜に特異的に反応する」は、当技術分野において一
般的に理解されているように、抗体が、関心対象の抗原(例えば、ActRIIaポリペプチド)
と関心対象以外の他の抗原との間で十分に選択的であること、抗体が、少なくとも、特定
の種類の生物試料中の関心対象の抗原の存在の検出に有用であることを意味することを意
図している。治療用途など、この抗体を用いる特定の方法においては、より高度の結合特
異性が望ましいと考えられる。モノクローナル抗体は、一般に(ポリクローナル抗体と比
較して)、所望の抗原と交差反応性ポリペプチドとを効果的に識別する一層強い傾向を有
する。抗体:抗原相互作用の特異性に影響を及ぼす1つの特徴は、抗体の抗原に対する親
和性である。所望の特異性が種々の親和性の範囲で達成され得るが、一般に好ましい抗体
は、約10-6、10-7、10-8、10-9、またはそれ未満の親和性(解離定数)を有する。アクチビ
ンとActRIIaとの間の極めて強い結合を鑑みると、抗アクチビン抗体または抗ActRIIa抗体
中和は、一般に10-10以下の解離定数を有することが予想される。

0081

加えて、所望の抗体を同定するために抗体をスクリーニングするのに用いる技法は、得
られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、抗体を溶液中の抗原と結合させるために
用いるのであれば、溶液結合を試験することが望ましいと考えられる。抗体および抗原間
の相互作用を試験して、特定の所望の抗体を同定するためには、多様な技法が利用可能で
ある。そのような技法には、ELISA法、表面プラズモン共鳴結合アッセイ法(例えば、Biac
ore(商標)結合アッセイ法、BiacoreAB, Uppsala, Sweden)、サンドイッチアッセイ法(
例えば、IGENInternational, Inc., Gaithersburg, Marylandの常磁性ビーズシステム)
ウエスタンブロット法免疫沈降アッセイ法、および免疫組織化学法が含まれる。

0082

アクチビンまたはActRIIaのアンタゴニストである核酸化合物カテゴリーの例には、
アンチセンス核酸RNAi構築物、および触媒性核酸構築物が含まれる。核酸化合物は、一
本鎖であってもよいし、または二本鎖であってもよい。二本鎖化合物は、鎖の一方または
他方が一本鎖である突出または非相補性の領域を含んでいてもよい。一本鎖化合物は、化
合物が、二重ヘリックス構造の領域を含む、いわゆる「ヘアピン」または「ステムループ
」構造を形成することを意味する、自己相補性領域を含んでいてもよい。核酸化合物は、
全長ActRIIa核酸配列またはアクチビンβAもしくはアクチビンβB核酸配列の1000ヌクレ
オチド以下、500ヌクレオチド以下、250ヌクレオチド以下、100ヌクレオチド以下、また
は50、35、30、25、22、20、もしくは18ヌクレオチド以下からなる領域と相補的なヌクレ
オチド配列を含み得る。相補性領域は、好ましくは、少なくとも8ヌクレオチドであり、
任意で、少なくとも10または少なくとも15ヌクレオチド、任意で、15〜25ヌクレオチドで
あろう。相補性領域は、コーディング配列部分のような、標的転写物イントロン、コー
ディング配列、または非コーディング配列の内部にあり得る。一般に、核酸化合物は、約
8〜約500ヌクレオチドまたは塩基対長という長さを有し、任意で、長さは約14〜約50ヌク
レオチドであろう。核酸は、DNA(特に、アンチセンスとして使用するため)、RNA、また
はRNA:DNAハイブリッドであり得る。いずれの鎖も、DNAおよびRNAの混合物を含んでいて
もよく、DNAまたはRNAのいずれかとして容易に分類され得ない修飾型を含んでいてもよい
。同様に、二本鎖化合物はDNA:DNA、DNA:RNA、またはRNA:RNAであり得、いずれかの鎖が
、DNAおよびRNAの混合物を含んでいてもよく、DNAまたはRNAのいずれかとして容易に分類
され得ない修飾型を含んでいてもよい。核酸化合物は、骨格ヌクレオチド間結合を含む
天然核酸における糖リン酸部分)または塩基部分(天然核酸のプリン部分もしくはピリ
ジン部分)への一つまたは複数の修飾を含む、多様な修飾のうちのいずれかを含んでいて
もよい。アンチセンス核酸化合物は、好ましくは、約15〜約30ヌクレオチドの長さを有し
、血清における安定性、細胞における安定性、または経口送達される化合物の場合には
吸入される化合物についてはのような、化合物が送達される可能性が高い場所におけ
る安定性のような特徴を改良するために一つまたは複数の修飾をしばしば含有しているで
あろう。RNAi構築物の場合、標的転写物に相補的な鎖は、一般に、RNAまたはその修飾で
あろう。他方の鎖はRNA、DNA、またはその他の変種であり得る。二本鎖または一本鎖の「
ヘアピン」RNAi構築物の二重鎖部分は、好ましくは、18〜40ヌクレオチド長という長さを
有し、任意で、それがダイサー基質として作用する限り、約21〜23ヌクレオチド長という
長さを有するであろう。触媒性または酵素性の核酸は、リボザイムまたはDNA酵素であり
得、修飾された型を含有していてもよい。核酸化合物は、生理学的条件下で、かつナン
ンスまたはセンスの制御がほとんどまたは全く効果を有しないような濃度で、細胞と接触
させられた場合、約50%、75%、90%、またはそれ以上、標的の発現を阻害し得る。核酸
化合物の効果を試験するための好ましい濃度は、1、5、および10mMである。核酸化合物は
、例えば、骨成長および石灰化に対する効果についても試験され得る。

0083

5.スクリーニングアッセイ法
ある局面において、本発明は、アクチビン-ActRIIaシグナル伝達経路のアゴニストまた
はアンタゴニストである化合物(物質)を同定するためのActRIIaポリペプチド(例えば、可
溶性ActRIIaポリペプチド)およびアクチビンポリペプチドの使用に関する。このスクリ
ニングを通じて同定される化合物は、インビトロにおいて骨の成長または石灰化を調節す
る能力を評価するために、試験することができる。任意で、これらの化合物は、インビボ
において組織増殖を調節する能力を評価するために、動物モデルでさらに試験することが
できる。

0084

アクチビンおよびActRIIaポリペプチドを標的とすることで組織増殖を調節する治療剤
をスクリーニングするための多くのアプローチが存在する。ある態様においては、化合物
ハイスループットスクリーニングを行い、骨に及ぼすアクチビン媒介性またはActRIIa
媒介性効果撹乱する物質を同定することができる。ある態様においては、アッセイを行
い、アクチビンに対するActRIIaポリペプチドの結合を特異的に阻害するかまたは減少さ
せる化合物をスクリーニングおよび同定する。または、アッセイを行って、アクチビンに
対するActRIIaポリペプチドの結合を増強する化合物を同定し得る。さらなる態様におい
て、化合物は、アクチビンまたはActRIIaポリペプチドと相互作用する能力により同定さ
れ得る。

0085

様々なアッセイ形式が十分であり、本開示に照らして、本明細書に明確に記載していな
いものであっても当業者により理解されると考えられる。本明細書に記載するように、本
発明の試験化合物(物質)は、任意のコンビナトリアル化学法によって作製され得る。また
は、本化合物は、インビボまたはインビトロで合成される天然生体分子であってよい。組
織増殖の調節因子として作用する能力について試験しようとする化合物(物質)は、例えば
、細菌、酵母、植物、または他の生物によって産生され得るか(例えば、天然物)、化学的
に生成され得るか(例えば、ペプチド模倣体を含む小分子)、または組換えによって産生さ
れ得る。本発明の意図する試験化合物には、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプ
チド、ペプチド模倣体、糖類、ホルモン、および核酸分子が含まれる。ある態様において
試験物質は、約2,000ダルトン未満の分子量を有する小有機分子である。

0086

本発明の試験化合物は、単一の分離した実体として提供され得るか、またはコンビナト
リアル化学によって作製されるような、より複雑なライブラリーの形態で提供され得る。
これらのライブラリーは、例えば、アルコールハロゲン化アルキルアミンアミド
エステルアルデヒドエーテル、およびその他の種類の有機化合物を含み得る。試験化
合物の試験系への提示は、単離形態であってもよいし、または特に最初のスクリーニング
段階では化合物の混合物としてでもよい。任意で、化合物は他の化合物で任意で誘導体化
され、化合物の単離を容易にする誘導体基を含み得る。誘導体基の非限定的な例には、ビ
オチン、フルオレセインジゴキシゲニン緑色蛍光タンパク質同位元素、ポリヒス
ジン、磁気ビーズ、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、光活性化架橋剤、またはこ
れらの任意の組み合わせが含まれる。

0087

化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログ
ムでは、所与の期間内に調査する化合物数を最大限にするために、ハイスループットアッ
セイが望ましい。精製または半精製タンパク質を用いて導かれ得るような無細胞系で行う
アッセイ法は、試験化合物によって媒介される分子標的の変化の迅速な生成および比較的
容易な検出が可能になるよう作製できるという点で、「初期」スクリーニングとして好ま
しい場合が多い。さらに、試験化合物の細胞毒性または生物学的利用能の影響は一般にイ
ンビトロ系では無視することができ、その代わりアッセイは、ActRIIaポリペプチドとア
クチビンとの間の結合親和性の変化として示され得る、分子標的に及ぼす薬物の効果に主
に焦点が当てられ得る。

0088

単なる例であるが、本発明の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心対象の化合物
を、通常アクチビンに結合し得る単離および精製されたActRIIaポリペプチドと接触させ
る。次いで、化合物およびActRIIaポリペプチドの混合物に対して、ActRIIaリガンドを含
む組成物を添加する。ActRIIa/アクチビン複合体の検出および定量化により、ActRIIaポ
リペプチドとアクチビンとの間の複合体形成を阻害する(または増強する)際の化合物の有
効性を決定する手段が提供される。化合物の有効性は、様々な濃度の試験化合物を用いて
得られるデータから用量反応曲線を作製することにより評価し得る。さらに、対照アッセ
イを同様に行って、比較のための基準を提供し得る。例えば、対照アッセイでは、単離お
よび精製されたアクチビンを、ActRIIaポリペプチドを含む組成物に添加し、ActRIIa/ア
クチビン複合体の形成を試験化合物の非存在下で定量化する。一般に、反応物を混合し得
る順序は変更でき、また同時に混合できることが理解される。さらに、精製タンパク質の
代わりに細胞抽出物および溶解物を使用して、適切な無細胞アッセイ系を提供することも
可能である。

0089

ActRIIaポリペプチドとアクチビンとの間の複合体形成は、様々な技法により検出する
ことができる。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、放射標識(例えば、32P、35S、1
4C、または3H)、蛍光標識(例えば、FITC)、または酵素標識したActRIIaポリペプチドまた
はアクチビンなどの、検出可能に標識したタンパク質を用いて、免疫測定法によりまたは
クロマトグラフィー検出により定量化することができる。

0090

ある態様において、本発明は、ActRIIaポリペプチドとその結合タンパク質との間の相
互作用の程度を直接または間接的に測定する際の、蛍光偏光アッセイ法および蛍光共鳴
ネルギー移動(FRET)アッセイ法の使用を意図する。さらに、光導波路(PCT出願国際公開公
報第96/26432号および米国特許第5,677,196号)、表面プラズモン共鳴(SPR)、表面荷電
ンサー、および表面力センサーに基づくようなその他の様式の検出も、本発明の多くの態
様と適合する。

0091

さらに、本発明は、ActRIIaポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用を破
壊するかまたは増強する物質を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ法」として
も公知の相互作用捕捉アッセイ法の使用を意図する。例えば、米国特許第5,283,317号;Z
ervos et al.(1993) Cell 72:223-232;Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-
12054;Bartel etal. (1993) Biotechniques 14:920-924;およびIwabuchi et al. (199
3) Oncogene8:1693-1696を参照されたい)。特定の態様において、本発明は、ActRIIaポ
リペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物(例えば、小分子
またはペプチド)を同定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を意図する。例
えば、Vidal andLegrain, (1999) Nucleic AcidsRes 27:919-29;Vidal and Legrain,
(1999) TrendsBiotechnol 17:374-81;ならびに米国特許第5,525,490号;同第5,955,280
号;および同第5,965,368号を参照されたい。

0092

ある態様において、本化合物は、本発明のActRIIaまたはアクチビンポリペプチドと相
互作用する能力により同定される。化合物とActRII aまたはアクチビンポリペプチドとの
間の相互作用は、共有結合であってもまたは非共有結合であってもよい。例えば、そのよ
うな相互作用は、光架橋、放射標識リガンド結合、およびアフィニティークロマトグラフ
ィーをはじめとするインビトロの生化学的方法を用いて、タンパク質レベルで同定され得
る(JakobyWB et al., 1974, Methodsin Enzymology 46: 1)。ある場合において、化合
物は、アクチビンまたはActRIIaポリペプチドに結合する化合物を検出するアッセイ法な
どの、ある機構に基づくアッセイ法でスクリーニングされ得る。これは固相または流体相
結合事象を含み得る。または、アクチビンまたはActRIIaポリペプチドをコードする遺伝
子をレポーターシステム(例えば、β-ガラクトシダーゼルシフェラーゼ、または緑色蛍
光タンパク質)と共に細胞にトランスフェクションし、好ましくはハイスループットスク
リーニングによりライブラリーに対して、またはライブラリーの個々のメンバーを用いて
スクリーニングすることができる。例えば自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ
法など、他の機構に基づく結合アッセイ法を用いることも可能である。結合アッセイは、
ウェルビーズ、もしくはチップに固定されるか、または固定化抗体によって捕獲される
か、またはキャピラリー電気泳動によって分離された標的を用いて行うことができる。結
合した化合物は通常、比色または蛍光または表面プラズモン共鳴を用いて検出され得る。

0093

ある局面において、本発明は、骨形成を調節する(促進または阻害する)および骨量を増
大させる方法および物質を提供する。したがって、同定される任意の化合物を、インビト
ロまたはインビボにおいて細胞または組織全体で試験して、骨の成長または石灰化を調節
する能力を確認することができる。当技術分野において周知である種々の方法を、この目
的に使用することができる。

0094

例えば、ActRIIaまたはアクチビンポリペプチドまたは試験化合物が骨または軟骨の成
長に及ぼす影響は、細胞に基づくアッセイ法でMsx2の誘導、または骨芽前駆細胞の骨
胞への分化を測定することによって決定され得る(例えば、Daluiski et al., Nat. Genet
. 2001, 27(1):84-8;Hinoet al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9を参照されたい)。細
胞に基づくアッセイ法の別の例は、間葉系前駆細胞および骨芽細胞において、本ActRIIa
またはアクチビンポリペプチドおよび試験化合物の骨形成活性解析する段階を含む。例
えば、アクチビンまたはActRIIaポリペプチドを発現する組換えアデノウイルス構築
て、多能性間葉系前駆細胞C3H10T1/2細胞、前骨芽C2C12細胞、および骨芽TE-85細胞を感
染させた。次いで、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、および基質石灰化の誘
導を測定することにより、骨形成活性を決定する(例えば、Cheng et al., J bone Joint
Surg Am. 2003,85-A(8):1544-52を参照されたい)。

0095

本発明は、骨または軟骨の成長を測定するためのインビボアッセイも企図する。例えば
、Namkung-Matthaiet al., Bone, 28:80-86 (2001)は、骨折後の初期の骨修復が研究さ
れるラット骨粗鬆症モデルを開示している。Kubo et al., Steroid Biochemistry & Mole
cular Biology,68:197-202 (1999)も、骨折後の後期の骨修復が研究されるラット骨粗鬆
症モデルを開示している。Andersson et al., J. Endocrinol. 170:529-537は、マウスを
卵巣切除し、それによりマウスが実質的な骨塩量および骨塩密度を失い、骨梁骨が骨塩
度のほぼ50%を失う、マウス骨粗鬆症モデルを記載している。骨密度は、副甲状腺ホルモ
ンのような因子の投与により卵巣切除マウスにおいて増加し得る。ある種の局面において
、本発明は、当技術分野において公知の骨折治癒アッセイを利用する。これらのアッセイ
には、骨折技術、組織学的分析、および生体力学的分析が含まれ、例えば、米国特許第6,
521,750号(これは、骨折を引き起こすため、そして骨折の程度および修復過程を測定す
るための実験プロトコルの開示のため、参照により完全に組み入れられる)に記載されて
いる。

0096

6. 例示的な治療的使用
ある種の態様において、本発明のアクチビン-ActRIIaアンタゴニスト(例えば、ActRII
aポリペプチド)は、例えば、破損を通したものであってもよいし、損失を通したもので
あってもよいし、または脱石灰化を通したものであってもよい骨傷害に関連している疾患
または状態を処置または防止するために使用され得る。本明細書において証明されるよう
に、アクチビン-ActRIIaアンタゴニスト、特に、ActRIIa-Fc構築物は、癌に関連した骨損
失の処置または防止において有効である。ある種の態様において、本発明は、治療的に有
効な量のアクチビン-ActRIIaアンタゴニスト、特に、ActRIIaポリペプチドを個体に投与
することを通して、その必要のある個体における骨傷害を処置または防止する方法を提供
する。ある種の態様において、本発明は、治療的に有効な量のアクチビン-ActRIIaアンタ
ゴニスト、特に、ActRIIaポリペプチドを個体に投与することを通して、その必要のある
個体における骨成長または石灰化を促進する方法を提供する。これらの方法は、好ましく
は、動物、より好ましくはヒトの治療的および予防的な処置を目標としている。ある種の
態様において、本開示は、低い骨塩密度または減少した骨強度に関連した障害の処置のた
めのアクチビン-ActRIIaアンタゴニスト(特に、可溶性ActRIIaポリペプチドおよびアク
チビンまたはActRIIaを標的とする中和抗体)の使用を提供する。

0097

本明細書において使用されるように、障害または状態を「防止する」治療薬とは、統計
的な試料において、未処置対照試料に比べて処置された試料における障害もしくは状態
の発生を低下させるか、または未処置の対照試料に比べて障害もしくは状態の開始を遅延
させるか、またはそれらの一つもしくは複数の症状の重度を低下させる化合物をさす。「
処置する」という用語は、本明細書において使用されるように、指定された状態の予防、
または確立後の状態の寛解もしくは排除を含む。いずれの場合にも、防止または処置は、
医師により提供される診断、および治療剤の投与の意図された結果において識別され得る

0098

本開示は、骨および/もしくは軟骨形成を誘導する、骨減少を防止する、骨石灰化を増
大させる、または骨の脱石灰化を防止する方法を提供する。例えば、本アクチビン-ActRI
Iaアンタゴニストは、ヒトおよびその他の動物において骨粗鬆症を治療する、ならびに骨
折および軟骨欠損を治癒する上で用途を有する。ActRIIaまたはアクチビンポリペプチド
は、骨粗鬆症の発症に対する保護対策として、無症候性低骨密度と診断される患者におい
て有用であり得る。

0099

1つの特定の態様において、本発明の方法および組成物は、ヒトおよびその他の動物に
おける骨折および軟骨欠損の治癒において医学的有用性を見出し得る。本方法および組成
物はまた、閉鎖骨折および開放骨折の減少において、ならびにまた人工関節定着の改善
において予防的用途を有し得る。骨形成剤により誘導される新規骨形成は、先天性の、外
傷によって誘発される、または腫瘍切除によって誘発される頭蓋顔面欠損の修復に寄与し
、また美容整形手術にも有用である。ある場合において、本アクチビン-ActRIIaアンタゴ
ニストは、骨形成細胞誘引する環境を提供し得、骨形成細胞の増殖を促進し得、または
骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導し得る。本発明のアクチビン-ActRIIaアンタゴニスト
はまた、骨粗鬆症の治療に有用であり得る。

0100

本発明の方法および組成物は、骨粗鬆症(二次性骨粗鬆症を含む)、副甲状腺機能亢進
クッシング病パジェット病甲状腺中毒症慢性下痢状態もしくは吸収障害、尿細管
アシドーシス、または神経性食欲不振症のような、骨損失を特徴とするか、または骨損
失を引き起こす状態に適用され得る。

0101

骨粗鬆症は、様々な因子により引き起こされ得るか、または様々な因子に関連し得る。
女性であること、特に、閉経後の女性であること、低体重を有すること、および座位の多
生活様式を送ることは、全て、骨粗鬆症(骨折リスクに通じる骨塩密度の損失)のリス
ファクターである。以下のプロファイルのいずれかを有する者は、ActRIIaアンタゴニ
ストによる処置の候補となり得る:エストロゲンまたはその他のホルモン補充治療を受け
ていない閉経後の女性;腰部骨折または喫煙個人歴または母系歴を有する者;高身長
5フィート7インチ超)であるかまたは痩せ形(125ポンド未満)である閉経後の女性;骨
損失に関連した臨床症状を有する男性;Prednisone(商標)のような副腎皮質ステロイド
、Dilantin(商標)およびある種のバルビツール酸のような様々な抗痙攣薬物治療、また
は高用量甲状腺補充薬を含む、骨損失を引き起こすことが公知の薬物治療を使用している
者;1型糖尿病肝疾患腎疾患、または骨粗鬆症の家族歴を有する者;高い骨代謝回転
(例えば、尿試料中の過剰のコラーゲン)を有する者;甲状腺機能亢進症のような甲状腺
状態を有する者;ごく軽度の外傷の後に骨折を経験した者;脊椎骨折X線証拠または骨
粗鬆症のその他の兆候を有したことがある者。

0102

上述のように、骨粗鬆症は、もう一つの障害に関連した状態として、またはある種の薬
物治療の使用からも起こり得る。薬物またはもう一つの医学的状態に起因する骨粗鬆症は
、二次性骨粗鬆症として公知である。クッシング病として公知の状態においては、身体に
より産生された過剰量のコルチゾールが、骨粗鬆症および骨折をもたらす。二次性骨粗鬆
症に関連した最も一般的な薬物治療は、副腎により天然に産生されるホルモン、コルチゾ
ールと同様に作用する薬物のクラスである副腎皮質ステロイドである。(甲状腺により産
生される)適度のレベルの甲状腺ホルモンは、骨格の発達に必要とされるが、過剰の
ホルモンは次第に骨量を減少させることがある。アルミニウムを含有している制酸剤
、腎臓の問題を有する者、特に、透析を受けている者により高用量で摂取された場合、骨
損失に通じることがある。二次性骨粗鬆症を引き起こし得るその他の薬物治療には、発作
を防止するために使用されるフェニトイン(Dilantin)およびバルビツール酸;いくつか
の型の関節炎、癌、および免疫障害のための薬物であるメトトレキサート(Rheumatrex、
Immunex、FolexPFS);いくつかの自己免疫疾患を処置するため、そして臓器移植患者
おける免疫系を抑制するために使用される薬物であるシクロスポリン(Sandimmune、Neor
al);前立腺癌および子宮内膜症を処置するために使用される黄体形成ホルモン放出ホル
モンアゴニスト(Lupron,Zoladex);抗凝血薬物治療であるヘパリン(Calciparine、Li
quaemin);ならびに高コレステロールを処置するために使用されるコレスチラミン(Que
stran)およびコレスチポール(Colestid)が含まれる。癌療法に起因する骨損失は、広
範に認識されており、癌治療誘導骨損失(CTIBL)と呼ばれる。骨転移は、アクチビン-Ac
tRIIaアンタゴニストによる処置により修正され得る骨内の空洞を作出することがある。

0103

好ましい態様において、本明細書に開示されたアクチビン-ActRIIaアンタゴニスト、特
に、可溶性ActRIIaは、癌患者において使用され得る。ある種の腫瘍(例えば、前立腺
乳房、多発性骨髄腫、または副甲状腺機能亢進を引き起こす任意の腫瘍)を有する患者は
、腫瘍誘導骨損失のみならず、骨転移および治療剤による骨損失の高いリスクを有する。
そのような患者は、骨損失または骨転移の証拠がない場合ですらアクチビン-ActRIIaアン
タゴニストにより処置され得る。患者は、骨損失または骨転移の証拠についてモニタリン
グされ、指標がリスクの増加を示唆した場合に、アクチビン-ActRIIaアンタゴニストで処
置され得る。一般に、DEXAスキャンが骨密度の変化を査定するために利用され、骨リモ
リングの指標が骨転移の可能性を査定するために使用され得る。血清マーカーがモニタリ
ングされ得る。骨特異アルカリホスファターゼ(BSAP)は、骨芽細胞に存在する酵素であ
る。BSAPの血中レベルは、骨転移および骨リモデリングの増加をもたらすその他の状態を
有する患者において増加する。オステオカルシンおよびプロコラーゲンのペプチドも骨形
成および骨転移に関連している。BSAPの増加は、前立腺癌により引き起こされた骨転移を
有する患者において検出され、比較的程度は低いが、乳癌からの骨転移においても検出さ
れている。骨形成タンパク質7(BMP-7)レベルは、骨に転移した前立腺癌において高いが
膀胱癌皮膚癌肝臓癌、または肺癌による骨転移においては高くない。I型カルボ
シ末端テロペプチドICTP)は、骨の吸収の間に形成されるコラーゲンに見出される架橋
である。骨は絶えず分解され再形成されているため、ICTPは全身に見出されるであろう。
しかしながら、骨転移の部位において、そのレベルは正常な骨の区域よりも有意に高くな
るであろう。ICTPは、前立腺癌、肺癌、および乳癌による骨転移において高レベルに見出
される。もう一つのコラーゲン架橋、I型N末端テロペプチド(NTx)は、骨代謝回転の間
にICTPと共に産生される。NTxの量は、肺癌、前立腺癌、および乳癌を含む多くの異なる
型の癌により引き起こされた骨転移において増加する。また、NTxのレベルは骨転移の進
行により増加する。従って、このマーカーは、転移を検出するためにも、疾患の程度を測
定するためにも使用され得る。吸収のその他のマーカーには、ピリジノリンおよびデオキ
シピリジノリンが含まれる。吸収マーカーまたは骨転移マーカーの増加は、患者における
アクチビン-ActRIIaアンタゴニスト治療の必要性を示す。

0104

アクチビン-ActRIIaアンタゴニストは、その他の薬学的薬剤と共同投与され得る。共同
投与は、単一の共同製剤の投与により、同時投与により、または別々の時点での投与によ
り達成され得る。アクチビン-ActRIIaアンタゴニストは、他の骨活性剤と共に投与された
場合、特に有利であるかもしれない。患者は、共同で、アクチビン-ActRIIaアンタゴニス
トを受容し、カルシウム補助剤ビタミンD、適切な運動、および/または、いくつかの
場合、その他の薬物治療を摂取することから利益を得るかもしれない。その他の薬物治療
の例には、ビスホスホネート(アレンドロネートイバンドロネート、およびリセドロネ
ート)、カルシトニン、エストロゲン、副甲状腺ホルモン、ならびにラロキシフェンが含
まれる。ビスホスホネート(アレンドロネート、イバンドロネート、およびリセドロネー
ト)、カルシトニン、エストロゲン、ならびにラロキシフェンは、骨リモデリングサイク
ルに影響を与え、抗吸収薬物治療として分類される。骨リモデリングは、骨吸収および骨
形成という二つの別個の段階からなる。抗吸収薬物治療は、骨リモデリングサイクルの骨
吸収部分を遅くするか、または中止するが、サイクルの骨成形部分を遅くすることはない
。その結果として、新たな形成が骨吸収より大きな速度で継続し、骨密度が次第に増加し
得る。副甲状腺ホルモンの一つの型、テリパラチドは、骨リモデリングサイクルにおける
骨形成の速度を増加させる。アレンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の防止(1日5mgまたは
週1回35mg)および処置(1日10mgまたは週1回70mg)の両方のために承認されている。ア
レンドロネートは、骨損失を低下させ、骨密度を増加させ、脊椎、手首、および腰部の骨
折のリスクを低下させる。アレンドロネートは、グルココルチコイド(即ち、プレドニゾ
ンおよびコルチゾン)の長期使用の結果としての男性および女性におけるグルココルチコ
イド誘導骨粗鬆症の処置のため、そして男性における骨粗鬆症の処置のためにも承認され
ている。アレンドロネート+ビタミンDは、閉経後の女性における骨粗鬆症の処置のため
(週1回70mg+ビタミンD)、そして骨粗鬆症を有する男性において骨量を改善するための
処置のために承認されている。イバンドロネートは、閉経後骨粗鬆症の防止および処置の
ために承認されている。月1回の錠剤(150mg)として摂取されるイバンドロネートは、毎
月同一の日に摂取されるべきである。イバンドロネートは、骨損失を低下させ、骨密度を
増加させ、脊椎骨折のリスクを低下させる。リセドロネートは、閉経後骨粗鬆症の防止お
よび処置のために承認されている。毎日(5mg用量)または週1回(35mg用量またはカル
ウムと共に35mg用量)摂取されるリセドロネートは、骨損失を遅くし、骨密度を増加させ
、脊椎および非脊椎の骨折のリスクを低下させる。リセドロネートは、グルココルチコイ
ド(即ち、プレドニゾンまたはコルチゾン)の長期使用に起因するグルココルチコイド誘
導骨粗鬆症を防止および/または処置するための男性および女性による使用のために承認
されている。カルシトニンは、カルシウム調節および骨代謝に関与している天然に存在す
るホルモンである。閉経後5年を超えた女性において、カルシトニンは骨損失を遅くし、
脊髄の骨密度を増加させ、骨折に関連した疼痛を軽減し得る。カルシトニンは、脊髄骨折
のリスクを低下させる。カルシトニンは、注射剤(毎日50〜100IU)または点鼻剤(毎日2
00IU)として入手可能である。エストロゲン治療(ET)/ホルモン治療HT)は、骨粗鬆
症の防止のために承認されている。ETは、骨損失を低下させ、脊椎および腰部の両方にお
いて骨密度を増加させ、閉経後の女性における腰部および脊髄の骨折のリスクを低下させ
ることが示されている。ETは、最も一般的には、毎日およそ0.3mgの低用量または毎日0.6
25mgの標準用量を送達する錠剤または皮膚貼付剤の形態で投与され、70歳以降に開始され
た場合ですら有効である。エストロゲンは、単独で摂取された場合、女性の子宮裏打ち
癌(子宮内膜癌)の発症リスクを増加させることがある。このリスクを排除するため、医
提供者は、完全な子宮を有する女性にはエストロゲンと組み合わせてホルモン、プロゲ
スチンを処方する(ホルモン補充療法またはHT)。ET/HTは、閉経症状を軽減し、骨の健
康に対する有益な効果を有することが示されている。副作用には、出血、乳房圧痛、気
分障害、および胆嚢疾患が含まれ得る。ラロキシフェン、1日60mgは、閉経後骨粗鬆症の
防止および処置のために承認されている。それは、潜在的な短所なしにエストロゲンの有
益な効果を提供するために開発された選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)
と呼ばれる薬物のクラスに属する。ラロキシフェンは、骨量を増加させ、脊椎骨折のリス
クを低下させる。ラロキシフェンが腰部およびその他の非脊椎の骨折のリスクを低下させ
ることを証明するデータは、未だ入手されていない。副甲状腺ホルモンの一つの型、テリ
パラチドは、閉経後の女性および骨折の高いリスクを有する男性における骨粗鬆症の処置
のために承認されている。この薬物治療は、新たな骨形成を刺激し、骨塩密度を有意に増
加させる。閉経後の女性において、脊椎、腰部、足、肋骨、および手首における骨折低下
が認められた。男性においては、骨折低下は脊椎において認められたが、その他の部位で
の骨折低下を評価するデータは十分に存在しなかった。テリパラチドは最長24ヶ月、毎日
の注射として自己投与される。

0105

7.薬学的組成物
ある種の態様において、本発明のアクチビン-ActRIIaアンタゴニスト(例えば、ActRII
aポリペプチド)は、薬学的に許容される担体を用いて製剤化される。例えば、ActRIIaポ
リペプチドは、単独で、または薬学的製剤治療用組成物)の成分として投与され得る。
本発明の化合物は、ヒト医学または獣医学において使用するための任意の便利な方式での
投与のために製剤化され得る。

0106

ある種の態様において、本発明の治療法は、組成物の全身投与またはインプラントもし
くは装置としての局所投与を含む。投与される場合、本発明において使用するための治療
用組成物は、発熱性物質を含まない生理学的に許容される形態をとる。上記のような組成
物に任意で含まれていてもよいActRIIaアンタゴニスト以外の治療的に有用な薬剤は、本
発明の方法において、本発明の化合物(例えば、ActRIIaポリペプチド)と共に同時にま
たは連続的に投与され得る。

0107

典型的には、ActRIIaアンタゴニストは、非経口的に、特に、静脈内または皮下に投与
されるであろう。非経口投与に適している薬学的組成物には、抗酸化剤緩衝剤静菌剤
、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化剤もしくは濃化
剤を含有していてもよい、一つまたは複数の薬学的に許容される無菌の等張の水性もしく
非水性の液剤分散剤懸濁剤もしくは乳剤、または使用直前に無菌の注射可能な液剤
もしくは分散剤へと再構成され得る無菌の散剤と組み合わせられた一つまたは複数のActR
IIaポリペプチドが含まれ得る。本発明の薬学的組成物において利用され得る適当な水性
および非水性の担体の例には、水、エタノール、(グリセロールプロピレングリコール
ポリエチレングリコール等のような)ポリオール、およびそれらの適当な混合物、オリ
ーブ油のような植物油、ならびにオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが含
まれる。適度の流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材料の使用により、分
散剤の場合には必要とされる粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により、維持さ
れ得る。

0108

さらに、組成物は、カプセル化されてもよいし、または標的組織部位(例えば、骨)へ
の送達のための形態で注射されてもよい。ある種の態様において、本発明の組成物は、標
組織部位(例えば、骨)に一つまたは複数の治療用化合物(例えば、ActRIIaポリペプ
チド)を送達し、発達中の組織のための構造を提供することができ、かつ身体に最適に吸
収されることができるマトリックスを含み得る。例えば、マトリックスは、ActRIIaポリ
ペプチドの徐放を提供し得る。そのようなマトリックスは、他の移植される医学的適用の
ため現在使用されている材料から形成され得る。

0109

基質材料の選択は、生体適合性生分解性機械的特性美容上の外観、および界面特
性に基づく。本組成物の特定の用途により、適切な製剤が決まる。組成物に利用可能な基
質は、生分解性であり化学的に規定された硫酸カルシウムリン酸三カルシウムヒドロ
シアパタイトポリ乳酸、およびポリ無水物であってよい。他の可能な材料は、生分解
性であり生物学的に十分規定されたもの、例えば骨または皮膚コラーゲンである。さらな
る基質は、純粋なタンパク質または細胞外基質成分からなる。他の可能な基質は、非生分
解性であり化学的に規定されたもの、例えば、焼結ヒドロキシアパタイトバイオガラス
アルミン酸、または他のセラミックスである。基質は、ポリ乳酸およびヒドロキシアパ
タイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムのように、上記種類の材料のいずれか
の組み合わせからなってもよい。バイオセラミックは、孔径、粒径、粒形、および生分解
性を変更するために、カルシウム-アルミン酸-リン酸などの組成および加工処理において
改変することができる。

0110

ある態様において、本発明の方法は、例えば、カプセル剤カシェ剤丸剤、錠剤、ロ
ゼンジ剤(香味基材、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムを使
用)、粉末剤顆粒剤の形態で、または水性液体もしくは非水液体中の溶液もしくは懸濁
液として、または水中油型もしくは油中水型乳濁液として、またはエリキシル剤もしくは
シロップ剤として、またはトローチ剤(ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよ
びアラビアゴムなどの不活性基材を使用)として、および/または洗口剤などとして投与
され得、それぞれ所定量の物質を有効成分として含む。物質はまた、巨丸剤舐剤、また
ペースト剤として投与され得る。

0111

経口投与用固形剤形(カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末剤、顆粒剤など)におい
ては、本発明の1つまたは複数の治療化合物を、1つまたは複数の薬学的に許容される担体
と混合し得るが、担体は、例えば、クエン酸ナトリウムもしくは第二リン酸カルシウム
および/または以下のうちのいずれかである:(1)充填剤または増量剤、例えば澱粉、ラ
クトース、スクロース、グルコースマンニトール、および/またはケイ酸など;(2) 結
合剤、例えばカルボキシメチルセルロースアルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリ
ドン、スクロース、および/またはアラビアゴムなど;(3)湿潤剤(humectant)、例えばグ
セロールなど;(4)崩壊剤、例えば寒天炭酸カルシウムジャガイモまたはタピオカ
澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなど;(5)溶液遅延剤、例え
パラフィンなど;(6)吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物など;(7)浸潤剤
(wetting agent)、例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど;(
8)吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土など;(9)潤滑剤、例えばタルク
ステアリン酸カルシウムステアリン酸マグネシウム固形ポリエチレングリコール、ラ
ウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物など;ならびに(10)着色剤。カプセル剤
、錠剤、および丸剤の場合、薬学的組成物はまた緩衝剤を含み得る。同様の種類の固形組
成物はまた、ラクトースまたは乳糖、および高分子量ポリエチレングリコールなどのよう
な賦形剤を用いて、軟および硬ゼラチンカプセル剤の充填剤として使用することもできる

0112

経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、
懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。液体剤形は、有効成分に加えて、
例えば水または他の溶媒などの当技術分野で通常用いられる不活性希釈剤エチルアルコ
ール、イソプロピルアルコール炭酸エチルエチルアセテートベンジルアルコール
安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油(特に、綿実油
ラッカセイ油トウモロコシ油胚芽油、オリーブ油ヒマシ油、およびゴマ油)、グ
リセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビ
ンの脂肪酸エステルなどの可溶化剤および乳化剤、ならびにそれらの混合物を含み得る。
経口組成物は、不活性希釈剤に加えて、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤香味剤
着色剤、香料剤、および保存剤などの補助剤もまた含み得る。

0113

懸濁液は、活性化合物に加えて、エトキシル化イソステアリルアルコールポリオキシ
エチレンソルビトールおよびソルビタンエステル微結晶セルロースメタ水酸化アルミ
ニウム、ベントナイト、寒天、およびトラガカントゴム、ならびにこれらの混合物などの
懸濁剤を含み得る。

0114

本発明の組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含み得
る。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベンクロロブタノールソルビン酸フェ
ノールなどを含めることにより、微生物の作用の予防を確実にすることも可能である。糖
類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることもまた望ましいと考えられる。
さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる物質を
含めることで、注射用薬剤形態の吸収を延長することも可能である。

0115

投与計画は、主治医が、本発明の本化合物(例えば、ActRIIaポリペプチド)の作用を変
化させる様々な要因を考慮した上で決定されることが理解される。様々な要因には、これ
らに限定されないが、形成が所望される骨重量、骨密度損失の程度、骨損傷の部位、損傷
した骨の状態、患者の年齢性別、および食習慣、骨損傷をもたらし得る任意の疾患の重
症度、投与期間、ならびに他の臨床上の要因が含まれる。任意で、用量は、再構成に用い
る基質の種類および組成物中の化合物の種類に応じて変化し得る。他の既知の増殖因子を
最終的な組成物に加えることもまた、投与量に影響し得る。進展は、例えば、X線(DEXA
を含む)、組織形態学的測定、およびテトラサイクリン標識により、骨の成長および/ま
たは修復を定期的に評価することでモニターすることができる。

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